專利名稱：：重組海參溶菌酶的生產(chǎn)方法及由其制得的重組海參溶菌酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用生物技術(shù)生產(chǎn)重組海參溶菌酶的方法，屬于分子生物學(xué)制藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。.本發(fā)明還涉及利用該方法生產(chǎn)出來(lái)的重組海參溶菌酶。
背景技術(shù)：
：溶菌酶是一種能水解粘多糖的堿性酶，它能催化細(xì)菌細(xì)胞壁中粘多糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的(3-l，4糖苷鍵的水解，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌死亡。它廣泛存在于自然界動(dòng)植物和微生物的組織、體液及分泌物中，在生物機(jī)體的免疫防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。對(duì)于缺少特異性免疫的無(wú)脊椎動(dòng)物而言，抗菌效應(yīng)尤為重要，而無(wú)脊椎動(dòng)物組織中分布最廣泛的抗菌蛋白即是溶菌酶。不僅如此，溶菌酶還作為無(wú)脊椎動(dòng)物的一種重要的消化酶，通過(guò)分解微生物來(lái)獲得生長(zhǎng)所需的部分C、N源。溶菌酶作為天然的抗菌劑、免疫增強(qiáng)劑和防腐劑目前廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及飼料等行業(yè)。近年來(lái)隨著海洋生物魚(yú)類、蝦類、貝類以及海珍品，如海參、鮑魚(yú)等養(yǎng)殖產(chǎn)量的快速增長(zhǎng)，隨之而來(lái)的是海水養(yǎng)殖生產(chǎn)中的品質(zhì)退化、養(yǎng)殖水平低、疾病泛濫及環(huán)境污染等問(wèn)題。目前在水產(chǎn)品養(yǎng)殖以及畜禽生產(chǎn)中使用抗生素帶來(lái)的問(wèn)題也越來(lái)越受到人們的關(guān)注，一是耐藥性問(wèn)題，二是藥物殘留問(wèn)題，其副作用是不可忽視的，人們不希望以犧牲人類健康為代價(jià)換取海產(chǎn)品、畜禽產(chǎn)品生產(chǎn)性能的提高。因此，采用該基因工程菌生產(chǎn)的溶菌酶是一種天然無(wú)毒的酶制品，它對(duì)大部分水生動(dòng)物和畜禽動(dòng)物即是體內(nèi)自身的免疫因子，又可作為養(yǎng)殖生產(chǎn)中的抑菌劑，降解和殺死常見(jiàn)的致病菌。所以，該溶菌酶可以代替抗生素應(yīng)用于養(yǎng)殖生產(chǎn)中，可以取得安全、品質(zhì)好、功效高的海產(chǎn)品和畜禽產(chǎn)品。目前溶菌酶主要從蛋清中提取，由于來(lái)源有限，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，溶菌酶產(chǎn)量十分有限，價(jià)格居高不下，難以滿足越來(lái)越大的市場(chǎng)需求。因此用基因工程手段表達(dá)溶菌酶成為很重要的手段。前期的研究者利用RT-PCR和RACEPCR技術(shù)，從海參(幼'c/zo^"a/7ow'cw)體壁中克隆得到一種溶菌酶基因(GenBank:EF036468);并通過(guò)生物信息軟件分析得到關(guān)于其編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)信息("海參i型溶菌酶基因及其編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)"，中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2007年7月，23(7):542547)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明在上述研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，提供一種利用生物技術(shù)生產(chǎn)重組海參溶菌酶的方法。本發(fā)明提供一種重組海參溶菌酶的生產(chǎn)方法，是將海參溶菌酶基因(SEQIDNO.l)連接到真核表達(dá)載體pPIC9K中構(gòu)建重組質(zhì)粒，并將所形成的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到畢赤酵母SMD1168中，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，然后經(jīng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂層析柱純化后得到重組溶菌酶。上述方法中所述的海參溶菌酶基因(SEQIDNO.l)是通過(guò)從海參腸組織中提取RNA，再通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得。具體做法是①?gòu)谋镜匦迈r海參中取出海參腸組織，提取總RAN，并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增海參溶菌酶的cDNA保守區(qū)域，反轉(zhuǎn)錄所使用的簡(jiǎn)并引物為HS1-15'-ATGGA(CT)GT(GC)GG(CAT)TC(AT)CT(AG)TCGTGTG-3'HS1-25'-GCCGTTGTG(TAG)ATACGGGCAAA(AG)TC-3'②擴(kuò)增海參溶菌酶蛋白基因cDNA片段5'末端，所使用的反轉(zhuǎn)錄引物RT-Primer(帶磷酸標(biāo)記)和兩對(duì)巢式PCR引物序列如下RT-Primer5'—(P)TACGGGCAAAATCC—3'HS1-S15'—ACCTTTGACTGCGGTGAAC—3'服隱S25'—GCAACCTATGCCCGTCTA—3'HS1-A15'陽(yáng)陽(yáng)CCATCCAGACTACCTCCCTT—3'HS1陽(yáng)A25'國(guó)-GCATCCTGCCAGTAGCCT—3'③擴(kuò)增海參溶菌酶蛋白基因cDNA3'末端，所使用的引物序列如下HS1-GSP15'—GGATGTGGGTTCTCTATCGTGTG-墨3'HS1-GSP25'—TAGGCTGAAGGGAGGTAGTCTGG—3'上述方法中重組質(zhì)粒的構(gòu)建是通過(guò)PCR、酶切將溶菌酶基因(SEQIDNO.1)連接到真核表達(dá)載體pPIC9K中，其中PCR使用特異性引物HS1-7和HSl-8，引物兩端分別引入EcoRI和NotI限制性酶切位點(diǎn)腦-75，--一GCAGAATTCATGCAAGTTCCTTCTGATTGC—-3'HS1-85，—--AAGn'TGCGGCCGCTCAGITGTTGC1CAT-—-3'PCR循環(huán)參數(shù)為50°C30min，94°C2min;94°C30s，40°C30s，72°C1.5min，5個(gè)循環(huán)；94°C30s，55°C30s，72°C1.5min，30個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸10min;回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用EcoRl和NotI酶切，然后與經(jīng)同樣酶酶切的酵母表達(dá)載體pPIC9K相連接形成重組質(zhì)粒。上述方法通過(guò)下述步驟將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到畢赤酵母SMD1168中將重組質(zhì)粒DNA用BglII酶解，用電擊法將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至酵母菌SMD1168屮，并涂布于MD固體培養(yǎng)板上，30'C培養(yǎng)23天；將長(zhǎng)出的菌落轉(zhuǎn)至含有4mg/mlG418的YPD固體培養(yǎng)基上進(jìn)行進(jìn)一步篩選，將選出的高拷貝轉(zhuǎn)化菌株接種至混有溶壁微球菌的BMMY固體培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)67天，觀察不同菌株對(duì)溶壁微球菌的抑菌活性，篩選高活性的重組菌株。上述方法中重組畢赤酵母SMD1168的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)及重組溶菌酶的純化工藝為將重組畢赤酵母SMD1168先在BMGY液體培養(yǎng)基中，3(TC搖瓶培養(yǎng)，250轉(zhuǎn)/分鐘；當(dāng)OD值達(dá)到9.0士0.5時(shí)，更換培養(yǎng)基，用原培養(yǎng)物10%體積的BMMY培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；每24h添加甲醇，保持甲醇濃度0.5%(v/v)，4天后結(jié)束培養(yǎng)，離心收集培養(yǎng)液上清；將該培養(yǎng)液上清透析去離子，再經(jīng)過(guò)CM-SephroseFF陽(yáng)離子交換樹(shù)脂層析柱，用0.05MpH8.0Tris-HCl連續(xù)洗脫，留取活性峰液，再透析去離子，然后將透析過(guò)的洗脫液在凍干機(jī)上凍干，得到重組溶菌酶干粉。根據(jù)上文所述的重組海參溶菌酶的生產(chǎn)方法，本發(fā)明所述的方法的最為優(yōu)選的技術(shù)方案是這樣的①獲取海參溶菌酶基因，包括從海參腸組織屮提取總RAN，并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增海參溶菌酶的cDNA保守區(qū)域、擴(kuò)增海參溶菌酶基因cDNA片段5'末端及3'末端的步驟，其中擴(kuò)增海參溶菌酶的cDNA保守區(qū)域的反轉(zhuǎn)錄過(guò)程所使用的簡(jiǎn)并引物為HS1陽(yáng)15'-ATGGA(CT)GT(GC)GG(CAT)TC(AT)CT(AG)TCGTGTG-3'HS1-25'-GCCGTTGTG(TAG)ATACGGGCAAA(AG)TC-3'擴(kuò)增海參溶菌酶基因cDNA片段5'末端，所使用的反轉(zhuǎn)錄引物RT-Primer(帶磷酸標(biāo)記)和兩對(duì)巢式PCR引物序列如下7RT-Primer5'—(P)TACGGGCAAAATCC墨-3'HS1-S15'--ACCTTTGACTGCGGTGAAC—3'HS1陽(yáng)S25'—GCAACCTATGCCCGTCTA—3'腦-A15'—CCATCCAGACTACCTCCCTT—3'HS1-A25'畫(huà)-GCATCCTGCCAGTAGCCT—3'擴(kuò)增海參溶菌酶基因cDNA3'末端，所使用的引物為HS1-GSP15'—GGATGTGGGTTCTCTATCGTGTG—3'HS1-GSP25'—TAGGCTGAAGGGAGGTAGTCTGG—3'②重組質(zhì)粒的構(gòu)建通過(guò)PCR、酶切將步驟①獲得的溶菌酶基因(SEQIDNO.O連接到真核表達(dá)載體pPIC9K中，其中PCR使用特異性引物HS1-7和HSl-8，引物兩端分別引入EcoRI和NotI限制性酶切位點(diǎn)HS1國(guó)75，一-GCAGAATTCATGCAAGTTCCTTCTGATTGC—3'HS1-85，一-AAGTTTGCGGCCGCTCAGTTGTTGCTCAT—3，PCR循環(huán)參數(shù)為50°C30min，94°C2min;94°C30s，40°C30s，72°C1.5min，5個(gè)循環(huán)；94°C30s，55°C30s，72°C1.5min，30個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸10min;回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用EcoRI和NotI酶切，然后與經(jīng)同樣酶酶切的酵母表達(dá)載體pPIC9K相連接形成重組質(zhì)粒；③重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及重組菌株的篩選將重組質(zhì)粒DNA用BglU酶解，用電擊法將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至酵母菌SMD1168中，并涂布于MD固體培養(yǎng)板上，3(TC培養(yǎng)23天；將長(zhǎng)出的菌落轉(zhuǎn)至含有4mg/mlG418的YPD固體培養(yǎng)基上進(jìn)行進(jìn)一步篩選，將選出的髙拷貝轉(zhuǎn)化菌株接種至混有溶壁微球菌的BMMY固體培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)67天，觀察不同菌株對(duì)溶壁微球菌的抑菌活性，篩選高活性的重組菌株；重組菌株的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)及重組溶菌酶的純化將步驟③篩選得到的重組畢赤酵母SMD1168先在BMGY液體培養(yǎng)基中，3(TC搖瓶培養(yǎng)，250轉(zhuǎn)/分鐘；當(dāng)OD值達(dá)到9.0±0.5時(shí)，更換培養(yǎng)基，用原培養(yǎng)物10%體積的BMMY培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；每24h添加甲醇，保持甲醇濃度0.5%(v/v)，4天后結(jié)朿培養(yǎng)，離心收集培養(yǎng)液上清；將該培養(yǎng)液十.清透析去離子，再經(jīng)過(guò)CM-SephroseFF陽(yáng)離子交換樹(shù)脂層析柱，用0.05MpH8.0Tris-HCl連續(xù)洗脫，留取活性峰液，再透8析去離子，然后將透析過(guò)的洗脫液在凍干機(jī)上凍干，得到重組溶菌酶干粉。對(duì)由上述方法制得的重組海參溶菌酶進(jìn)行了相關(guān)的生物學(xué)活性分析，發(fā)現(xiàn)該酶具有很強(qiáng)的廣譜抗菌作用，對(duì)常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌均具有明顯的抑菌作用，尤其是對(duì)海水養(yǎng)殖和畜禽生產(chǎn)中常見(jiàn)的致病細(xì)菌和弧菌殺菌力極強(qiáng)。并且發(fā)現(xiàn)該重組海參溶菌酶比直接從海參組織中提取的溶菌酶活性提高了30%;與雞蛋清溶菌酶相比，抑菌譜范圍要廣很多，尤其對(duì)于雞蛋清溶菌酶不能作用的革蘭氏陰性菌抑菌效果更明顯。這是在本方案設(shè)計(jì)之初所未曾預(yù)料到的。當(dāng)然，本發(fā)明的方法采用該基因工程菌生產(chǎn)溶菌酶適合大規(guī)模培養(yǎng)和分離提取，生產(chǎn)工藝不復(fù)雜，設(shè)備要求簡(jiǎn)單，生產(chǎn)周期短，成本比較低，無(wú)環(huán)境污染。本發(fā)明附圖1幅，即實(shí)施例1中制得的重組海參溶菌酶干粉的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。具體實(shí)施例方式1、重組海參溶菌酶的制備步驟l:海參溶菌酶的克隆和序列分析(1)從本地新鮮海參中取出海參腸組織，用TRIZOLREAGENT(Invitrogen)試劑從中提取總RNA;用TaKaRaOneStepRNAPCRKit(AMV)擴(kuò)增海參溶菌酶的cDNA保守區(qū)域。根據(jù)已知不同生物種類的溶菌酶基因的序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，序列如下HS1-15'-ATGGA(CT)GT(GC)GG(CAT)TC(AT)CT(AG)TCGTGTG-3'HS1-25'-GCCGTTGTG(TAG)ATACGGGCAAA(AG)TC-3'首先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件為50'C，30min;在進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94°C，2min;94°C，30s;40°C，30s;72°C，1.5min循環(huán)5次;接著94。C，30s;55°C，30s;72°C，L5min循環(huán)28次。將PCR產(chǎn)物回收，并將其連接到載體pMD18-T上，在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5a)中表達(dá)，通過(guò)藍(lán)白斑篩選帶有目的基因的質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序檢測(cè)為溶菌酶部分cDNA序列。(2)根據(jù)上述測(cè)序的海參溶菌酶cDNA序列及5'FullRACEPCRKit試劑盒要求，設(shè)計(jì)l個(gè)反轉(zhuǎn)錄引物RT-Primer(帶磷酸標(biāo)記)和兩對(duì)巢式PCR引物，序列如下RT-Primer5'陽(yáng)-(P)TACGGGCAAAATCC--3'HS1-S15'—ACCTTTGACTGCGGTGAAC—3'服-S25'—GCAACCTATGCCCGTCTA--3'HS1-A15'—CCATCCAGACTACCTCCCTT-3'HS1-A25'—GCATCCTGCCAGTAGCCT—3'按照TaKaRa5'FullRACEPCRKit試劑盒推薦方法，擴(kuò)增海參溶菌酶蛋白基因cDNA片段5'末端；(3)根據(jù)克隆得到的溶菌酶基因cDNA片段及TaKaRa3，F(xiàn)ullRACEPCRKit試劑盒要求設(shè)計(jì)兩個(gè)上游引物，序列如下HS1-GSP15'—GGATGTGGGTTCTCTATCGTGTG-畫(huà)3'HS1-GSP25'--TAGGCTGAAGGGAGGTAGTCTGG-3'按照TaKaRa3'FullRACEPCRKit試劑盒推薦方法，擴(kuò)增海參溶菌酶蛋白基因cDNA3'末端。測(cè)定所得的海參溶菌酶基因cDNA的全序列為SEQIDNO.l，序列全長(zhǎng)713bp，包括5'非編碼區(qū)(UTR)246bp，3'UTR29bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度438bp,編碼145個(gè)氨基酸;在3'端的非編碼區(qū)中有真核基因polyA加尾信號(hào)序列AATAAA的出現(xiàn)。經(jīng)SignalP軟件分析，推測(cè)氨基酸序列N端具有20個(gè)氨基酸的信號(hào)肽MIPQITRSVLLLLIVMAASG，從而可以判定其為胞外表達(dá)的效應(yīng)分子；成熟肽包含125個(gè)氨基酸，分子式為C6。2H921N169018QS13，預(yù)測(cè)分子量為14kDa，理論等電點(diǎn)為7.65。經(jīng)同源性比較和分子發(fā)育分析，推斷所克隆的海刺參溶菌酶為i型溶菌酶。步驟2:重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化參照克隆得到的海參溶菌酶cDNA設(shè)計(jì)一對(duì)用于真核表達(dá)的特異性引物HS1-7和HSl-8，引物兩端分別引入EcoRI和NotI限制性酶切位點(diǎn)。HS1-75，----GCAGAATTCATGCAAGTTCCTTCTGATTGC-—3'腦-85，-—AAGTTTGCGGCCGCTCAGTTGTTGCTCAT—陽(yáng)-3'用TaKaRaonestepRNAPCRKit(AMV)進(jìn)行RT-PCR。PCR循環(huán)參數(shù)為50。C30min，94。C2min;94°C30s，40°C30s，72。C1.5min，5個(gè)循環(huán)；94°C30s，55。C30s，72。C1.5min，30個(gè)循環(huán);最后72。C延伸10min。經(jīng)PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用EcoRl和NotI酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，與經(jīng)同樣酶酶切的酵母表達(dá)載體pPIC9K相連接。篩選重組質(zhì)粒。提取質(zhì)粒DNA，用BglII酶解質(zhì)粒DNA，用電擊法將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至酵母菌SMD1168中，并涂布于MD固體培養(yǎng)板上，置30。C中培養(yǎng)23天。將長(zhǎng)出的菌落轉(zhuǎn)至含有高濃度的G418(4mg/ml)的YPD固體培養(yǎng)基上進(jìn)行進(jìn)一步篩選，得到高拷貝的轉(zhuǎn)化菌株。將此類酵母菌株接種至混有溶壁微球菌的BMMY固體培養(yǎng)基中，30'C培養(yǎng)一周左右，觀察不同菌株對(duì)溶壁微球菌的抑菌活性，篩選高活性的海參溶菌酶表達(dá)菌株。步驟3:重組海參溶菌酶的濃縮純化含海參溶菌酶基因的酵母菌株先在BMGY液體培養(yǎng)基中，3(TC搖瓶培養(yǎng)，250轉(zhuǎn)/分鐘。當(dāng)OD值達(dá)到9.0左右時(shí)，更換培養(yǎng)基，用原培養(yǎng)物1/10體積的BMMY培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。每24h添加甲醇，保持甲醇濃度在0.5%，4天后結(jié)束培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液上清，用于海參溶菌酶的純化制備。取培養(yǎng)液上清，裝入透析袋中，去離子水透析去鹽，《C透析24h;透析過(guò)的培養(yǎng)上清用0.45pm的濾膜過(guò)濾，然后用NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0。以每升培養(yǎng)液10毫升CM-SephroseFF裝柱，用0.05MpH8.0Tris-HCl平衡柱子58個(gè)柱床體積。將培養(yǎng)液以10100ml/min的流速上柱。上樣結(jié)束后，用0.05MpH8.0Tris-HCl洗脫未結(jié)合蛋白，共洗脫4個(gè)柱床體積。用含有0.150.2MNaCl的0.05MpH8.0Tris-HCl溶液洗脫。將洗脫液對(duì)去離子水4"C透析24h。將透析過(guò)的洗脫液在凍干機(jī)上凍干，得到重組海參溶菌酶干粉；12。/。SDS-PAGE鑒定蛋白質(zhì)，結(jié)果如附圖1所示。2、重組海參溶菌酶活性測(cè)定采用濁度法測(cè)定上述制得的溶菌酶活性用60mmol/L、pH6.2的磷酸緩沖液配制一定濁度(A45(T0.60.7)的溶壁微球菌(Mkrococc^丄"W/e汰"c^)為底物,取O.lmL酶液加入2.5mL底物(20°C)中，在波長(zhǎng)450nm處讀取反應(yīng)體系3min內(nèi)每隔15s的吸光度。以AJ4Wmin變化0.001個(gè)吸光度值為一個(gè)活性單位。酶活力=AA450nm/lminx0.001x0.1mL(A八4w:lmin內(nèi)吸光度的變化)。在不同的溫度和pH條件下，對(duì)重組海參溶菌酶進(jìn)行了生物學(xué)分析。最適作用pH值為6.5，最適作用溫度為35。C45"C。重組海參溶菌酶酶活力為55U/mg;同樣方法測(cè)定直接從海參組織中提取的溶菌酶酶活力為40U/mg,前者比后者酶活性提高了37.50/。。113、重組海參溶菌酶抑菌譜的測(cè)定采用管碟法測(cè)定重組海參溶菌酶的抑菌圈大小，以其半徑(mm)來(lái)表示。取革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌(Stop/^/ococc^flwe船)，溶壁微球菌(M/cracoccws—6xie汰f/cws)，枯草芽包桿菌(Jac飾"M6"&)，以及革蘭氏陰性菌大腸桿菌(五sc/7en'c/7/aco/》，志賀菌(57;/ge//fl^p)，副溶血弧菌(W6n'o/flra/zaewo/;^/c附)，lf弧菌(F/7n》Wan'wm)，銅綠假單胞菌(7^ewt/owo"(xyaemg/"ora),嗜水氣單胞菌(J養(yǎng)基中37°C,200r/min過(guò)夜培養(yǎng)，稀釋至OD,為0.001左右。取100以上所選菌液于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中涂勻后，放入無(wú)菌牛津杯，于牛津杯中加入重組海參溶菌酶酶液100^iL(蛋白含量約10pg)，37'C過(guò)夜培養(yǎng)，測(cè)量抑菌圈。取重組海參溶菌酶和雞蛋清溶菌酶(做對(duì)照)，測(cè)定兩個(gè)樣品對(duì)9種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌圈大小。結(jié)果如表l所示表1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>結(jié)果可見(jiàn)，該重組海參溶菌酶對(duì)革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌均有抑制作用，尤其對(duì)海產(chǎn)品中常見(jiàn)的革蘭氏陰性致病菌副溶血弧菌和銅綠假單胞菌有明顯的抑制作用。而市場(chǎng)上普遍銷售的雞蛋清溶菌酶對(duì)革蘭氏陰性菌和金黃色葡萄球菌基本沒(méi)有抑菌作用，僅對(duì)幾種革蘭氏陽(yáng)性菌起到一定的抑制作用。說(shuō)明本發(fā)明的重組海參溶菌酶具有很廣的抑菌譜，其對(duì)革蘭氏陰性菌的特殊抑菌能力在海參養(yǎng)殖過(guò)程中起到重要作用。SEQUENCELISTING<110〉大連工業(yè)大學(xué)<120>重組海參溶菌酶的生產(chǎn)方法及由其制得的重組海參溶菌酶<130>N/A<160>1<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>713<212>DNA<213>Stichopusjaponicus<400>1atgatgttgccattagaaacaagacacattaggtgttatatatcttttagacaatgtacc60tttgaatgattatttttaagggggcgcagtcgccacgtaagctggatggtttcagatatt120tcctgagacgcacaatacatttctctgacgtcaagattcgtgacgtcactcagcaatttt180tgacgaacatctgcgacagtataagtgaacgatcattaaacatagttgtagcagatcgcg240ccgaccatgattccacaaataactagatcggttttgctccttctcatcgttatggcagcg300tctggacaagttccttctgattgcctaaagtgcatctgttttgtagagtccacttgcact36013ataccttccccactgtgtcatatggatgtgggttctctatcgtgtggtccttaccaaatc420aaactaggctactggcaggatgctaggctgaagggaggtagtctggatggagattggcag楊aaatgttcagcaacctttgactgcggtgaacgggctgtacagggttatatggcacggtac540gcaacctatgcccgtctagagcataatcctacctgtgaggattttgcccgtatacacaac600ggcggaccaaatgggttcaagaatccagcagctgaaaaatattggttgagagtgaagaaa660tgtcttgacatgagcaacaactgaacaaacctcaacttaataaaaaaaaaaaa71權(quán)利要求1、一種重組海參溶菌酶的生產(chǎn)方法，其特征在于該方法是將海參溶菌酶基因(SEQIDNO.1)連接到真核表達(dá)載體pPIC9K中構(gòu)建重組質(zhì)粒，并將所形成的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到畢赤酵母SMD1168中，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，然后經(jīng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂層析柱純化后得到重組溶菌酶。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組海參溶菌酶的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的海參溶菌酶基因(SEQIDNO.l)是通過(guò)從海參腸組織中提取RNA，再通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得，包括如下步驟①?gòu)谋镜匦迈r海參中取出海參腸組織，提取總RAN，并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增海參溶菌酶的cDNA保守區(qū)域，反轉(zhuǎn)錄所使用的簡(jiǎn)并引物為HS1陽(yáng)l5'-ATGGA(CT)GT(GC)GG(CAT)TC(AT)CT(AG)TCGTGTG-3'HS1-25'-GCCGTTGTG(TAG)ATACGGGCAAA(AG)TC-3'②擴(kuò)增海參溶菌酶蛋白基因cDNA片段5'末端，所使用的反轉(zhuǎn)錄引物RT-Primer(帶磷酸標(biāo)記)和兩對(duì)巢式PCR引物序列如下RT-Primer5'—(P)TACGGGCAAAATCC—3'HS1-S15'—ACCTTTGACTGCGGTGAAC--3'HS1-S25'—GCAACCTATGCCCGTCTA--3'HS1-A15'—CCATCCAGACTACCTCCCTT—3'HS1-A25'-GCATCCTGCCAGTAGCCT-隱3'③擴(kuò)增海參溶菌酶蛋白基因cDNA3'末端，所使用的引物序列如下HS1-GSP15'—GGATGTGGGTTCTCTATCGTGTG-誦3'HS1國(guó)GSP25'-TAGGCTGAAGGGAGGTAGTCTGG—3'。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組海參溶菌酶的生產(chǎn)方法，其特征在于重組質(zhì)粒的構(gòu)建是通過(guò)PCR、酶切將溶菌酶基因(SEQIDNO.l)連接到真核表達(dá)載體pPIC9K中，其中PCR使用特異性引物HS1-7和HSl-8，引物兩端分別引入EcoRI和NotI限制性酶切位點(diǎn)HS1-75，一-GCAGAATTCATGCAAGTTCCTTCTGATTGC-—-3'HS1國(guó)85，--—AAGTTTGCGGCCGCTCAGTTGTTGCTCAT畫(huà)-畫(huà)-3'PCR循環(huán)參數(shù)為50°C30min，94°C2min;94°C30s，40°C30s，72°C1.5min，5個(gè)循環(huán)；94°C30s，55°C30s，72°C1.5min，30個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸10min;回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用EcoRI和NotI酶切，然后與經(jīng)同樣酶酶切的酵母表達(dá)載體pPIC9K相連接形成重組質(zhì)粒。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組海參溶菌酶的生產(chǎn)方法，其特征在于通過(guò)下述步驟將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到畢赤酵母SMD1168中將重組質(zhì)粒DNA用BglII酶解，用電擊法將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至酵母菌SMD1168中，并涂布于MD固體培養(yǎng)板上，30。C培養(yǎng)23天；將長(zhǎng)出的菌落轉(zhuǎn)至含有4mg/mlG418的YPD固體培養(yǎng)基上進(jìn)行進(jìn)一歩篩選，將選出的高拷貝轉(zhuǎn)化菌株接種至混有溶壁微球菌的BMMY固體培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)67天，觀察不同菌株對(duì)溶壁微球菌的抑菌活性，篩選高活性的重組菌株。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組海參溶菌酶的生產(chǎn)方法，其特征在于重組畢赤酵母SMD1168的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)及重組溶菌酶的純化工藝為將重組畢赤酵母SMD1168先在BMGY液體培養(yǎng)基中，3(TC搖瓶培養(yǎng)，250轉(zhuǎn)/分鐘；當(dāng)OD值達(dá)到9.0±0.5時(shí)，更換培養(yǎng)基，用原培養(yǎng)物10%體積的BMMY培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；每24h添加甲醇，保持甲醇濃度0.5%(v/v)，4天后結(jié)束培養(yǎng)，離心收集培養(yǎng)液上清；將該培養(yǎng)液上清透析去離子，再經(jīng)過(guò)CM-SephroseFF陽(yáng)離子交換樹(shù)脂層析柱，用0.05MpH8.0Tris-HCl連續(xù)洗脫，留取活性峰液，再透析去離子，然后將透析過(guò)的洗脫液在凍干機(jī)上凍干，得到重組溶菌酶干粉。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組海參溶菌酶的生產(chǎn)方法，其特征在于該方法包括如下步驟①獲取海參溶菌酶基因，包括從海參腸組織中提取總RAN，并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增海參溶菌酶的cDNA保守區(qū)域、擴(kuò)增海參溶菌酶基因cDNA片段5'末端及3'末端的步驟，其中擴(kuò)增海參溶菌酶的cDNA保守區(qū)域的反轉(zhuǎn)錄過(guò)程所使用的簡(jiǎn)并引物為腦-15'-ATGGA(CT)GT(GC)GG(CAT)TC(AT)CT(AG)TCGTGTG-3'HS1-25'-GCCGTTGTG(TAG)ATACGGGCAAA(AG)TC-3'擴(kuò)增海參溶菌酶基因cDNA片段5'末端，所使用的反轉(zhuǎn)錄引物RT-Primer(帶磷酸標(biāo)記)和兩對(duì)巢式PCR引物序列如下RT-Primer5'—(P)TACGGGCAAAATCC—3'HS1-S15'—ACCTTTGACTGCGGTGAAC-陽(yáng)3'HS1-S2S'—GCAACCTATGCCCGTCTA—S'HS1-A15'-CCATCCAGACTACCTCCCTT國(guó)-3'HS1-A25'--GCATCCTGCCAGTAGCCT—3'擴(kuò)增海參溶菌酶基因cDNA3'末端，所使用的引物為HS1-GSP15'—GGATGTGGGTTCTCTATCGTGTG—3'HS1-GSP25'—TAGGCTGAAGGGAGGTAGTCTGG—3'②重組質(zhì)粒的構(gòu)建通過(guò)PCR、酶切將步驟①獲得的溶菌酶基因(SEQIDNO.l)連接到真核表達(dá)載體pPlC9K中，其中PCR使用特異性引物HSl-7和HSl-8，引物兩端分別引入EcoRI和NotI限制性酶切位點(diǎn)HS1-75，一-GCAGAATTCATGCAAGTTCCTTCTGATTGC----3'HSl-85'—陽(yáng)AAGTTTGCGGCCGCTCAGTTGTTGCTCAT—-3，PCR循環(huán)參數(shù)為50°C30min，94°C2min;94°C30s，40°C30s，72°C、1.5min，5個(gè)循環(huán)；94°C30s，55°C30s，72°C1.5min，30個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸10min;回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用EcoRl和NotI酶切，然后與經(jīng)同樣酶酶切的酵母表達(dá)載體pPIC9K相連接形成重組質(zhì)粒；③重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及重組菌株的篩選將重組質(zhì)粒DNA用BglII酶解，用電擊法將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至酵母菌SMD1168中，并涂布于MD固體培養(yǎng)板上，3(TC培養(yǎng)、23天；將長(zhǎng)出的菌落轉(zhuǎn)至含有4mg/mlG418的YPD固體培養(yǎng)基上進(jìn)行進(jìn)一歩篩選，將選出的高拷貝轉(zhuǎn)化菌株接種至混有溶壁微球菌的BMMY固體培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)67天，觀察不同菌株對(duì)溶壁微球菌的抑菌活性，篩選高活性的重組菌株；④重組菌株的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)及重組溶菌酶的純化將歩驟③篩選得到的重組畢赤酵母SMD1168先在BMGY液體培養(yǎng)基中，3(TC搖瓶培養(yǎng)，250轉(zhuǎn)/分鐘；當(dāng)OD值達(dá)到9.0±0.5時(shí)，更換培養(yǎng)基，用原培養(yǎng)物10%體積的BMMY培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；每24h添加甲醇，保持甲醇濃度0.5%(v/v)，4天后結(jié)束培養(yǎng)，離心收集培養(yǎng)液上清；將該培養(yǎng)液上清透析去離子，再經(jīng)過(guò)CM-SephroseFF陽(yáng)離子交換樹(shù)脂層析柱，用0.05MpH8.0Tris-HCl連續(xù)洗脫，留取活性峰液，再透祈去離子，然后將透析過(guò)的洗脫液在凍干機(jī)上凍干，得到重組溶菌酶干粉。7、根據(jù)權(quán)利要求16中任一權(quán)利要求所述的重組海參溶菌酶的生產(chǎn)方法所制得的重組海參溶菌酶。全文摘要一種重組海參溶菌酶的生產(chǎn)方法及由其制得的重組海參溶菌酶，該方法是將海參溶菌酶基因(SEQIDNO.1)連接到真核表達(dá)載體pPIC9K中構(gòu)建重組質(zhì)粒，并將所形成的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到畢赤酵母SMD1168中，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，然后經(jīng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂層析柱純化后得到重組溶菌酶。本發(fā)明的方法采用該基因工程菌生產(chǎn)溶菌酶適合大規(guī)模培養(yǎng)和分離提取，生產(chǎn)工藝不復(fù)雜，設(shè)備要求簡(jiǎn)單，生產(chǎn)周期短，成本比較低，無(wú)環(huán)境污染。所制得的重組海參溶菌酶比直接從海參組織中提取的溶菌酶活性提高了30％；與雞蛋清溶菌酶相比，抑菌譜范圍要廣很多，尤其對(duì)于雞蛋清溶菌酶不能作用的革蘭氏陰性菌抑菌效果更明顯。文檔編號(hào)C12N1/19GK101423840SQ20081022978公開(kāi)日2009年5月6日申請(qǐng)日期2008年12月15日優(yōu)先權(quán)日2008年12月15日發(fā)明者叢麗娜,朱蓓薇,楊冠科,王秀霞,董秀萍,谷躍峰,明郝申請(qǐng)人:大連工業(yè)大學(xué)