專利名稱：：一種鏈霉菌發(fā)酵三七皂苷制備20(S)-人參皂苷Rh₁的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物、醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種鏈霉菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化各種三七皂苷中的三醇組人參皂苷、制備20(5>人參皂苷RJn(6-(9-;5-D-吡喃葡萄糖基-20CS)-原人參三醇，以下簡稱Rh。的工藝。特別提供一株人工馴化的弗氏鏈霉菌(浙取o，cw/rac/^NTGA-334)菌株，以及用該菌株在發(fā)酵罐中發(fā)酵轉(zhuǎn)化各種三七皂苷、分離提取Rln的工藝。
背景技術(shù)：
：人體代謝實(shí)驗(yàn)表明，人參皂苷口服后，在胃液、膽汁的作用下僅發(fā)生了輕微的氧化作用，不能被降解，只有在腸道菌的作用下，糖苷鍵才發(fā)生斷裂，形成了一系列代謝產(chǎn)物。最新的藥理學(xué)研究表明被吸收入血并發(fā)揮活性的不是人參皂苷本身，而是經(jīng)腸道菌群代謝轉(zhuǎn)化后的代謝產(chǎn)物(TawabMA，"aZ:Z>wgMeto&￡fepos，2003，31(8),1065-1071)。目前普遍認(rèn)為Rhi是天然三醇組人參皂苷在體內(nèi)代謝后的主要活性產(chǎn)物之一，而Rg!、Re和R,等可能是天然前體藥物。近年來的體內(nèi)體外試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Rh！除了具有抗腫瘤活性外(KimYS,era/:Mcra&o/說ofec/wo/,2008,18(6),1109-1114;王毅，等^茵,資學(xué)染,泉2003,19(4)，248-252;陳聲武，等^#乂學(xué)學(xué)叛「度學(xué)樹，2003,29(1),25-28.)，還具有抗炎、抗過敏(ShinYW，e〖a/:P/a"to2006,72(4)，376-378;ParkEK,Wa/:zlrc/z^//ergyT)mMw"o/,2003,133(2),113-120;ParkYC,Wa/:歷ocAewMo/5/o//W，1996，40(4),751-757.)、免疫調(diào)節(jié)(王毅，等^房凍發(fā)學(xué)^11,2007,23(1)，46-52;王毅，等秀學(xué)學(xué)嚴(yán)2002,37(12)，927-929.)以及弱植物雌激素等藥理活性(BaeEA，Wa/:歷o//VzanwSw〃，2005，28(10)，1903-1908;LeeYJ,"a/:SferaW5!'oc/zemMo/￡/o/，2003，84(4)，463-468.)，因此對它的研究越來越受到重視。在制備小組分人參皂苷和人參皂苷代謝物的方法中，經(jīng)典的化學(xué)法(化學(xué)合成、酸水解或堿裂解)不可避免地產(chǎn)生一些副反應(yīng)，如差向異構(gòu)化、水合和羥基化(HanBH,e〖a/:尸to"toA&c/,1982,44(3),146-149;ChenY，Wa/:C/^/wP/zar附1987，35(4)，1653-1655);通過酶轉(zhuǎn)化三醇組人參皂苷來制備Rhi，具有轉(zhuǎn)化率高和操作簡便的優(yōu)點(diǎn)(KoSR,Wa/:尸/awto2003,69(3)，285-286;KoSR,Wa/:C7zemi^ar附￡w//，2003，51(4)，404-408;KoSR，"a/:說osc/萬/o"c/wo/歷oc/jew,2000,64(12)，2739-2743.)，但價格昂貴，存在酶源不便、成本高的問題，因此應(yīng)用受到限制。涉及鏈霉菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化各種三七皂苷中的三醇組人參皂苷、大批量制備RlM的研究，國內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報道。
發(fā)明內(nèi)容為了簡便、高效、規(guī)模化發(fā)酵制備Rh,，本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)化微生物是一株由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏的弗氏鏈霉菌(&w;tom少c"/ra&aeNTGA-334)菌株，菌株保藏編號為CGMCCNo.2074，保藏日期為2007年6月7日。該菌株已申請專利保護(hù)(專利申請?zhí)?007100660ll.X)。在本發(fā)明鏈霉菌發(fā)酵各種三七皂苷制備Rlu的方法中，弗氏鏈霉菌(5^卬/o;^c^/ra^fleNTGA-334)菌株經(jīng)過長時間的馴化培養(yǎng)后對營養(yǎng)的要求不高，可在高氏一號、ISP2、腐質(zhì)酸或天門冬酰胺培養(yǎng)基上生長。在本發(fā)明弗氏鏈霉菌(S加ptom3;c"/rad促NTGA-334)發(fā)酵各種三七皂苷制備Rh!的方法中，各種三七皂苷投料量比例為0.1~10%(w/v);發(fā)酵溫度1850。C，通氣比0.1~10(v/v)，攪拌速率10900r/min，發(fā)酵時間5h~200h。產(chǎn)物提取過程中添加0.1~30%(w/v)的AmberliteXAD~16或D101大孔吸附樹脂，10900r/min，18~50°C處理1h~10h。在本發(fā)明弗氏鏈霉菌OS^e^owjcw戶a^"eNTGA-334)發(fā)酵各種三七皂苷制備Rh!的方法中，可以通過全自動發(fā)酵罐發(fā)酵各種三七皂苷產(chǎn)生Rln，經(jīng)過柱層析分離后得到RlM的單體，測定其一維。H、13CNMR)和二維(HMQC、COSY、HMBC、ROESY和HMQC-TOCSY)核磁共振波譜、質(zhì)譜(MS)。通過詳細(xì)分析各種譜圖數(shù)據(jù)，并與文獻(xiàn)報道20(5)-人參皂苷Rh!的譜圖數(shù)據(jù)相比較，確證本發(fā)明所得到的人參皂苷R1m結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)報道20(5)-人參皂苷Rhi(6-O-y-D-吡喃葡萄糖基-20(5)-原人參三醇)的結(jié)構(gòu)一致，具有如下的結(jié)構(gòu)式(式1),其具體的&、"CNMR化學(xué)位移見表1。21式1本發(fā)明中釆用的三七總皂苷中Rb,含量29.7%、Rg,含量28.5%;三醇組人參皂苷中Rg,含量為64.3%、Rh含量為9.50/。。表1RlH的核磁共振分析數(shù)據(jù)(溶劑吡啶~^)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>圖1是20(5)-人參皂苷Rln的分子結(jié)構(gòu)圖。具體實(shí)施例方式在本發(fā)明實(shí)施例中所用的弗氏鏈霉菌0S加/^o/^c"々a力"eNTGA-334)發(fā)酵各種三七皂苷、制備Rlu的方法中，發(fā)酵步驟是:在發(fā)酵罐中接種培養(yǎng)5~24h后，調(diào)整通氣比0.110(v/v);之后根據(jù)Rlu含量的動態(tài)監(jiān)測，將發(fā)酵溫度調(diào)整為18~50°C，pH2~8，攪拌速率10~900r/min。產(chǎn)物收集步驟為在發(fā)酵罐中添加0.1~30%(w/v)的AmberliteXAD16或DIOI大孔吸附樹脂，18~50°C、10~900r/min處理1h~10h。發(fā)酵液經(jīng)過固液分離所得菌絲體和大孔吸附樹脂在乙醇中超聲提取lh24h。提取液減壓蒸去乙醇，經(jīng)正相與反相硅膠色譜分離、減壓濃縮、真空干燥后獲得RIm較高純度產(chǎn)品。實(shí)施例1將弗氏鏈霉菌(S/re;to/^ces，acA'aeNTGA-334)從高氏1號斜面轉(zhuǎn)接到含有1%(w/v)三七總皂苷的ISP2種子培養(yǎng)基中，28。C培養(yǎng)12h;然后接種到含有2500g三七總皂苷的60L腐質(zhì)酸培養(yǎng)基中，在100L發(fā)酵罐中28。C進(jìn)行發(fā)酵。36h后調(diào)整提高通氣比為1:3(v/v),攪拌速率調(diào)整為400r/min。48h后調(diào)整發(fā)酵溫度至42°C,5%(w/v)氨水動態(tài)調(diào)整pH=5.0。60h發(fā)酵結(jié)束，按5。/。(w/v)加入AmberiiteXAD16大孔吸附樹脂，攪拌處理2h后放罐。發(fā)酵液經(jīng)濾布過濾得濕重3912g沉淀物，用30L乙醇(95%)超聲提取2h并濾布過濾，濾渣再用1L乙醇(95%)洗滌5次。乙醇提取液減壓濃縮干后得粗提取物1416.6g，經(jīng)過硅膠與反相硅膠柱層析分離、減壓濃縮、真空干燥后獲得Rhi白色粉末283.16g，經(jīng)過HPLC檢測純度為74.01%，摩爾轉(zhuǎn)化率70.76%。實(shí)施例2將弗氏鏈霉菌(^r印tom少c^,a^aeNTGA-334)從高氏1號斜面轉(zhuǎn)接到含有1%(w/v)人參三醇組皂苷的ISP2培養(yǎng)基培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)12h;然后接種到含有1000g人參三醇組皂苷的60L腐質(zhì)酸培養(yǎng)基中，在100L發(fā)酵罐中28。C進(jìn)行發(fā)酵。36h后調(diào)整提高通氣比為1:2，攪拌速率調(diào)整為350r/min。48h后調(diào)整發(fā)酵溫度至38°C，5%(w/v)氨水動態(tài)調(diào)整pH-5.0。60h發(fā)酵結(jié)束，按1%(w/v)加入AmberliteXAD16大孔吸附樹脂，攪拌處理4h后放罐。發(fā)酵液經(jīng)濾布過濾得濕重2023g沉淀物，用20L乙醇(95%)超聲提取2h并濾布過濾，濾渣再用1L乙醇(95%)洗滌5次。乙醇提取液減壓濃縮干后得粗提取758.4g，經(jīng)過硅膠與反相硅膠柱層析分離、減壓濃縮、真空干燥后獲得R&白色粉末592.39g，經(jīng)過HPLC檢測R1m純度為75.32%。摩爾轉(zhuǎn)化率86.97%。權(quán)利要求1.一株由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏的弗氏鏈霉菌(StreptomycesfradiaeNTGA-334)菌株，菌株保藏編號為CGMCCNo.2074，保藏日期為2007年6月7日。2.—種用權(quán)利要求1所述菌株在發(fā)酵罐中發(fā)酵轉(zhuǎn)化各種三七皂苷中的三醇組人參皂苷、制備20(S)-人參皂苷Rln(6-O-;8-D-吡喃葡萄糖基-20(5)-原人參三醇，式l)的方法21式l其特征在于(1)所述培養(yǎng)基為高氏一號、ISP2、腐質(zhì)酸(HSG培養(yǎng)基)或天門冬酰胺培養(yǎng)基。(2)培養(yǎng)基中各種三七皂苷投料量比例為0.1~10%(w/v);發(fā)酵溫度18~50°C，0.1~35%(w/v)氨水動態(tài)調(diào)節(jié)pH=2~8，通氣比0.1-10(v/v)，攪拌速率10-900r/min，發(fā)酵時間5h~200h。(3)在產(chǎn)物提取過程中添加0.1~30%(w/v)的AmberliteXAD-16或D101大孔吸附樹脂，10~900r/min，18-50°C處理1h~10h。發(fā)酵液經(jīng)過固液分離所得菌絲體和大孔吸附樹脂在乙醇中超聲提取1h24h。(4)弗氏鏈霉菌(&reptomyces/ra&aeNTGA-334)菌株發(fā)酵各種三七皂苷(三七總皂苷及三醇組人參皂苷)，得到20(5)-人參皂苷Rln。全文摘要一株保藏編號為CGMCCNo.2074的弗氏鏈霉菌(StreptomycesfradiaeNTGA-334)菌株，以及用該菌株在發(fā)酵罐中發(fā)酵轉(zhuǎn)化各種三七皂苷中的三醇組人參皂苷，制備20(S)-人參皂苷Rh₁(6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人參三醇)的方法。培養(yǎng)基選用高氏一號、ISP2、腐質(zhì)酸(HSG培養(yǎng)基)以及天門冬酰胺培養(yǎng)基。在發(fā)酵過程中，各種三七皂苷投料量比例為0.1～10％(w/v)，發(fā)酵溫度18～50℃，0.1～35％(w/v)氨水動態(tài)調(diào)節(jié)pH＝2～8，通氣比0.1～10(v/v)，攪拌速率10～900r/min，發(fā)酵時間5h～200h，大孔吸附樹脂0.1～30％(w/v)。本發(fā)明為規(guī)?；l(fā)酵轉(zhuǎn)化各種三七皂苷、制備20(S)-人參皂苷Rh₁提供一株性狀穩(wěn)定、營養(yǎng)要求簡單、生長良好的鏈霉菌菌株、實(shí)用簡便的發(fā)酵罐發(fā)酵及分離提取工藝。用該菌株及該工藝來規(guī)模制備20(S)-人參皂苷Rh₁，生產(chǎn)成本低、雜質(zhì)少，產(chǎn)物得率高。文檔編號C12N1/20GK101508965SQ20081023348公開日2009年8月19日申請日期2008年10月27日優(yōu)先權(quán)日2008年10月27日發(fā)明者(請求不公開姓名)申請人:昆明諾唯金參生物工程有限責(zé)任公司