專利名稱：一種增加滇紫草培養(yǎng)細胞紫草素含量的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用超聲波增加滇紫草培養(yǎng)細胞紫草素含量的方法。
技術背景滇紫草(Omwwc^am'cwtowmBur. etFr.)主產云南，是云南省本地常用中草藥，屬紫 草科(Boraginaceae)植物，其根藥用。主要有效成分為紫草素及其衍生物，這些成分不但 具有抗菌、抗炎、抗癌等多種藥理作用，而且還作為天然色素廣泛用于醫(yī)藥、化妝品和印 染工業(yè)。目前，滇紫草的野生資源破壞嚴重，市場上供需矛盾凸顯。而利用植物細胞大規(guī) 模培養(yǎng)技術在反應器中直接培養(yǎng)細胞獲得藥用次生代謝產物是將來生產植物藥最直接、最 有效的手段。開展細胞培養(yǎng)技術來生產藥用次生代謝產物，首先要獲得一種能快速增殖細 胞的方法，以保證高效的生產效率，縮短生長周期，降低生產成本。超聲波在生物學和醫(yī)學診斷治療上的應用已經有幾十年歷史，前人的一些研究結果表 明低強度的超聲波刺激能夠影響細胞的生長，使細胞膜和細胞器的形態(tài)發(fā)生變化，這些變 化可導致細胞代謝和膜通透性的改變。已有許多研究表明超聲波能夠提高酶以及微生物細 胞在反應器中的生物轉化效率，但是生物反應過程中超聲波的影響機理仍然不十分清楚， 大多數情況下認為是超聲波的機械刺激強化了生物轉化過程中傳質和混合，甚至提高了酶 的活性，使細胞內代謝反應更加旺盛。過去有關超聲波生物學效應的研究大多集中于人和 動物細胞及微生物，應用于植物細胞的研究較少。 發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種能有效提高滇紫草離體培養(yǎng)細胞紫草素含量的方法。該方法的操作步驟如下1) 滇紫草細胞的繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基為MS基礎培養(yǎng)基+NAA1.0mg/L + 2，4-D 0.2mg/L，培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25土1 。C，滇紫草細胞接種于繼代培養(yǎng) 基后，避光培養(yǎng)，培養(yǎng)周期28-30天；滇紫草細胞繼代培養(yǎng)的目的是為了獲得足夠細胞生 物量用于研究超聲波對細胞紫草素合成的影響；2) 滇紫草細胞超聲波處理a. 用超聲波清洗器來實現對細胞的超聲刺激作用；b. 將繼代培養(yǎng)10天的細胞接種在裝有40mL含lmg/L激動素(KT)的M10液體培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25士1 °C，搖床轉速110r/min，暗培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)周期為 12 d;c.在細胞培養(yǎng)過程的第2—6天中，選取超聲波功率80—200W、超聲波處理時間1 —5 min，對滇紫草培養(yǎng)細胞進行超聲波刺激；3) 超聲波刺激后繼續(xù)培養(yǎng)，直到完成12天的培養(yǎng)周期；4) 紫草素含量的測定取培養(yǎng)的滇紫草細胞培養(yǎng)液，3500r/min離心20min，回收的 沉淀物為鮮細胞，將鮮細胞轉移至三角瓶中，加入一定量的石油醚(沸點30—60 。C)，用 超聲細胞破碎儀進行細胞破碎，然后在室溫下振蕩(110r/min)提取24 h，提取液用于測 定細胞中紫草素的含量。紫草素呈紅棕色，用分光光度計測量，在520nm處有最大吸收峰。繪制標準曲線，得 到C二187.85X—2.09， R=0.9995，其中C為石油醚溶液中的紫草素濃度(mg/L)， X為該 測定溶液的吸光度值，R為相關系數。S= (CNV/W) X100%; P=1000SW其中，S為紫草素含量(％)， P為紫草素產量(mg/L)， W為愈傷組織干重(g/L)， V 為萃取液體積(L)， N為稀釋倍數。(該測定方法為現有技術)本發(fā)明內容的關鍵點在于1.超聲波功率的選?。?.超聲波處理時間的確定；3.超 聲波處理時刻的選取。以上關鍵點如能把握好，可以顯著提高細胞紫草素的含量。本發(fā)明操作簡便，效果良好，擴展性強，文中所述的超聲波細胞處理法可運用到植物細胞大規(guī)模生物反應器上，用來提高有效次生代謝產物含量。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不是對本發(fā)明的限制。 實施例h1) 滇紫草細胞的繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基為MS基礎培養(yǎng)基+ NAA 1.0 mg/L + 2,4-D 0.2 mg/L，培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25士1 °C，滇紫草細胞接種于繼代培養(yǎng)基 后，避光培養(yǎng)；2) 將繼代培養(yǎng)10天的滇紫草細胞接種在裝有40mL含lmg/L激動素(KT)的M10液 體培養(yǎng)基的100mL三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25士1 °C，搖床轉速IIO r/min，暗培養(yǎng)；3) 在培養(yǎng)的第2天，對懸浮培養(yǎng)細胞施加功率為80W、時長為5 min的超聲波刺激， 如

圖1所示，細胞經超聲波刺激后，繼續(xù)培養(yǎng)，直到完成12天的培養(yǎng)周期。4)培養(yǎng)結束后測定細胞紫草素的含量為1.1%，比不經過任何超聲刺激的對照組提高 了20%。實施例2:1 )滇紫草細胞的繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基為MS基礎培養(yǎng)基+NAA 1.0 mg/L + 2,4-D 0.2 mg/L，培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25士1 。C，滇紫草細胞接種于繼代培養(yǎng)基 后，避光培養(yǎng)；2) 將繼代培養(yǎng)10天的滇紫草細胞接種在裝有40mL含lmg/L激動素(KT)的M10液 體培養(yǎng)基的100mL三角瓶中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為25士1 °C，搖床轉速IIOr/min，暗培養(yǎng)；3) 在培養(yǎng)的第4天，對懸浮培養(yǎng)細胞施加功率為100W、時長為2min的超聲波刺激， 細胞經超聲波刺激后，繼續(xù)培養(yǎng)，直到完成12天的培養(yǎng)周期；4) 培養(yǎng)結束后測定細胞紫草素的含量為1.2%，比不經過任何超聲刺激的對照組提高 了31%。實施例3:1) 滇紫草細胞的繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基為MS基礎培養(yǎng)基+NAA 1.0 mg/L + 2,4-D 0.2 mg/L，培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25土1 °C，滇紫草細胞接種于繼代培養(yǎng)基 后，避光培養(yǎng)；2) 將繼代培養(yǎng)10天的滇紫草細胞接種在裝有40mL含lmg/L激動素(KT)的M10液 體培養(yǎng)基的100mL三角瓶中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為25士1 °C，搖床轉速IIOr/min，暗培養(yǎng)；3) 在培養(yǎng)的第6天，對懸浮培養(yǎng)細胞施加功率為200W、時長為lmin的超聲波刺激， 細胞經超聲波刺激后，繼續(xù)培養(yǎng)，直到完成12天的培養(yǎng)周期；4) 培養(yǎng)結束后測定細胞紫草素的含量為1.3%，比不經過任何超聲刺激的對照組提高 了42%。 M10培養(yǎng)基成分如下表成分濃度(mg/L)成分濃度(mg/L)KN03680NaH2P04*2H2019Na2S042000CuCl2，2H200.15CaCl2500NaFe-EDTA2H3B031.6Sucrose50000Inositol100Kinetin (KT)權利要求
1、一種增加滇紫草培養(yǎng)細胞紫草素含量的方法，其特征在于該方法的操作步驟包括1)滇紫草細胞的繼代培養(yǎng)使用繼代培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)，pH值5.6，溫度25±1℃，滇紫草細胞接種于繼代培養(yǎng)基后，避光培養(yǎng)；2)將繼代培養(yǎng)10天的滇紫草細胞接種在裝有40mL含1mg/L激動素的M10液體培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25±1℃，搖床轉速110r/min，暗培養(yǎng)；3)在細胞培養(yǎng)過程的第2-6天中，選取超聲波功率80-200W、超聲波處理時間1-5min，對滇紫草培養(yǎng)細胞進行超聲波刺激；4)超聲波刺激后繼續(xù)培養(yǎng)，直到完成12天的培養(yǎng)周期。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種增加滇紫草培養(yǎng)細胞紫草素含量的方法。其操作步驟主要包括1.滇紫草細胞的繼代培養(yǎng)；2.滇紫草細胞的液體培養(yǎng)和超聲波處理過程；3.紫草素含量測定過程。利用超聲波對懸浮培養(yǎng)的滇紫草細胞進行刺激，是提高細胞紫草素含量的有效手段。本發(fā)明操作簡便，效果良好，擴展性強，可運用到植物細胞大規(guī)模生物反應器上，用來提高有效次生代謝產物含量。
文檔編號C12N5/04GK101402939SQ200810233580
公開日2009年4月8日 申請日期2008年11月17日 優(yōu)先權日2008年11月17日
發(fā)明者暢 劉, 劉迪秋, 鋒 葛, 陳朝銀 申請人:昆明理工大學