專利名稱：耶爾森氏菌屬菌株km1和由其制備的低溫堿性脂肪酶及其純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一株低溫細(xì)菌菌株，即低》顯細(xì)菌菌 株耶爾森氏菌屬(rei^j'Ws sp. ) KMl,以及由該菌株作原料純化而得的耐有機(jī)溶 劑的低溫堿性脂肪酶，和其分離純化方法。
背景技術(shù)：
月旨肪酶(Lipase, EC 3.1.1.3)是一類在油-水界面上催化天然油脂(甘油三 脂)降解為甘油和游離脂肪酸的酶。低溫脂肪酶普遍由低溫微生物分泌產(chǎn)生，酶的 最適反應(yīng)溫度一般均低于4(TC，而在(TC仍具較高酶活。相對于高溫和中溫脂肪酶 而言，低溫脂肪酶有更寬的pH適應(yīng)范圍，腿一步拓寬了其工業(yè)應(yīng)用范圍。
低溫脂肪酶由于在低溫下具有良好的催化活性和低溫適應(yīng)性，弓胞了各國科學(xué) 家們的廣泛關(guān)注。目前所用的洗滌劑大都需在中溫甚至高溫下才能有效去除油污， 皿織物有一定的破壞作用，若采用含低纟顯脂肪酶的洗滌劑，不但能在低溫下有效 去除油污，節(jié)約能源，而且不會破壞織物。利用低纟顯脂肪酶進(jìn)行皮革低溫催化脫脂 時，不需加熱和添加其它脫脂劑，不會造成環(huán)境污染，也能最大限度地保持皮革的
天然外觀，既節(jié)約了會^源，又保證了皮革的質(zhì)量。在歐洲、日本與美國，低溫脂肪 酶己開始用于洗滌劑工業(yè)。
低溫脂肪酶由于具剤氐溫高催化活性，耐有機(jī)溶劑以艦熱敏感等特點，成為 了近年來酶學(xué)研究的一個熱點，在食品、洗滌、制藥、脂類加工、低溫環(huán)境修復(fù)等 工業(yè)上有著巨大的應(yīng)用潛力。對低溫脂肪酶純化研究，將為我國低溫脂肪酶的基礎(chǔ) 及應(yīng)用性研究提供一定的參考。
現(xiàn)有技術(shù)中未有低溫細(xì)菌菌株耶爾森氏菌屬(rei^'7W'a sp. ) KM1，以及由該 菌株作原料純化而得的耐有機(jī)溶劑的低溫堿性脂肪酶，和其分離純化方法的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一株高產(chǎn)堿性脂肪酶的低溫細(xì)菌菌株。
本發(fā)明的另一 目的在于提供由上述菌株產(chǎn)生的耐有機(jī)溶劑的低溫堿性脂肪酶
4及其分離純化方法。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案
低溫細(xì)菌耶爾森氏菌屬(rei^/m'asp. ) KM1，其保藏號為CGMCC No. 2637。 由低溫細(xì)菌耶爾森氏菌屬(&7^'/^ sp. ) KM1菌株產(chǎn)生的耐有機(jī)溶齊啲低溫 減性脂肪酶。
該低溫堿性脂肪酶具有以下酶學(xué)性質(zhì)
(1) 純化的耶爾森氏菌屬(Iferw'/7ia印.)KM1菌株所產(chǎn)低溫脂肪酶最適酶活 溫度為37。C;
(2) 最適pH為9. 0，在pH7. 2-10. 0保持穩(wěn)定；
(3) 低溫脂肪酶的分子量為34. 3 Kda;
(4) 低溫脂肪酶能耐受50%-80%的部分有機(jī)溶齊1丄如甲醇、乙醇及DMSO。 低溫堿性脂肪酶，以耶爾森氏菌屬(ife^'m'a印.)KM1菌株為原料，由下述
純化方纟去獲得
(1) 制備粗酶液耶爾森氏菌屬Ofe2^V7&印.)KM1菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件為溫 度13"C， pH7.2，培養(yǎng)時間52小時，將發(fā)酵液離心，取上清即為粗酶液；
(2) 硫酸銨沉淀粗酶液加硫酸銨至30-40%飽和度，離心取上清，繼續(xù)加硫酸 銨至70_80%飽和度，離心棄上清，沉淀在磷酸鹽緩沖液中透析過夜；
(3) S印hacry"HRS-100層析將透析的酶液離心，上清進(jìn)行濃縮，上樣于磷酸 鹽緩沖液預(yù)平衡過的S印hacry11 HRS-100層析柱，洗脫，收集酶活性部分，濃縮冷 凍保存；
(4) Superdex G-75層析將濃縮的目的蛋白經(jīng)離心處理后，上樣于磷酸鹽緩沖 液預(yù)平衡過的Superdex G-75層析柱，洗脫，收集酶活性部分，透析過夜，即為純 酶。
低溫堿性脂肪酶的純化方法，以耶爾森氏菌屬(yerw'm'a sp. ) KM1菌株為原 料，包括
(1)制備粗酶液耶爾森氏菌屬(re2^'7^sp. ) KM1菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件為溫 度13'C， pH7.2，培養(yǎng)時間52小時，將發(fā)酵液離心，取上清即為粗酶液；(2) 硫酸銨沉淀粗酶液加硫酸銨至30-40%飽和度，離心取上清，繼續(xù)加硫酸 銨至70-80%飽和度，離心棄上清，沉淀在磷酸鹽緩沖液中透析過夜；
(3) S印hacry"HRS-IOO層析將透析的酶液離心，上清進(jìn)行濃縮，上樣于磷酸 鹽緩沖液預(yù)平衡過的S印hacryM HRS-100層析柱，洗脫，收集酶活性部分，濃縮冷 凍保存；
(4) Superdex G-75層析將濃縮的目的蛋白經(jīng)離心處理后，上樣于磷酸鹽緩沖 液預(yù)平衡過的Superdex G-75層析柱，洗脫，收集酶活性部分，透析過夜，即為純
上述的純化方法，步驟(1)中發(fā)酵^[牛優(yōu)化；步驟(2)中分離純化所用的緩沖液為 25mM磷酸鹽緩沖液，pH7.0-8.0;步驟(4)中所得純酶進(jìn)一步電泳純化，分離膠濃度 為12.5%，濃縮膠濃度為5°丄
本發(fā)明提供的低溫細(xì)菌分離自一家屠宰場的冷庫中。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征、生理生 化特征及16S rRNA基因序列結(jié)果，將其鑒定為的耶爾森氏菌屬(re/^'m'a sp.) 的一個菌株，命名為耶爾森氏菌屬(ye7^VLZ'a sp. ) KM1。該菌產(chǎn)酶的pH范圍是 4.0-9.5，最適pH為7.2;產(chǎn)酶的溫度范圍是4-37°C，最適產(chǎn)酶溫度為13°C;產(chǎn)酶 時間范圍為18-66小時，最佳產(chǎn)酶時間為54小時。
本發(fā)明的新菌株耶爾森氏菌屬(rersj'm'a sp. ) KM1已經(jīng)于2008年8月26日 在"中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心"(中國北京)保藏， 保藏號為CGMCC No. 2637。


圖1為KM1菌株產(chǎn)生的低MI旨肪酶的反應(yīng)溫度和相對酶活關(guān)系曲線； 圖2為KM1菌株產(chǎn)生的低溫脂肪酶的熱穩(wěn)定性曲線；
圖3為KM1菌株產(chǎn)生的低MI旨肪酶的反應(yīng)pH和相對酶活關(guān)系及pH穩(wěn)定性曲線; 具體實駄式 實施例1:
小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(化2^'/7& e/^eroco^'"ca) KM1菌株的分離篩選
及鑒定小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(i^57Vw'se/7^r^70力'"ca) KM1菌株，分離自昆明東 站屠宰場的冷庫。菌株篩選培養(yǎng)基為(g/L):胰蛋白胨，10;酵母提取物，5; NaCl， 10;橄欖油乳化液，2%;瓊脂，20; pH7. 0-7. 2。
采用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定方法對耶爾森氏菌屬(rer幻'/L 'a sp. ) KM1菌株進(jìn)行鑒定。 該菌的形態(tài)學(xué)特征如下菌落為圓形，邊緣整齊，濕潤，乳白色，粘稠，易挑??； 細(xì)胞為短桿狀，革蘭氏陰性菌。產(chǎn)酶的pH范圍是4.0-9.5，最適pH為7.2;產(chǎn)酶 的溫度范圍是4-37"C，最適產(chǎn)酶溫度為13'C;產(chǎn)酶時間范圍為18-66小時，最佳 產(chǎn)酶時間為54小時。該菌生理生化特征如下能以葡萄糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇、 丙二酸鹽和西蒙氏枸櫞酸鹽作為唯一碳源生長，不能以乳糖和衛(wèi)矛醇作為唯一碳源 生長，不能利用尿素，不能產(chǎn)生H2S，賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶和苯丙氨酸脫 羧酶反應(yīng)為陰性。
根據(jù)形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征及16S rRNA基因序列結(jié)果，將其鑒定為的耶 爾森氏菌屬(rerw'm'a sp.)的一個菌株，命名為耶爾森氏菌屬(lfer幻'm'a sp.) 腿。
該新菌株耶爾森氏菌屬(fe^'"ia印.)KM1已經(jīng)于2008年8月26日在"中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心"(中國北京)保藏，保藏 號為CGMCC No. 2637。
實施例2:
低溫脂肪酶的純化
(1) 制備粗酶液耶爾森氏菌屬Ofez^Vw'a印.)KM1菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條f牛為溫 度13t:， pH7.2， ±咅養(yǎng)時間52小時。將發(fā)酵液離心，取上清即為粗酶液。
(2) 硫酸銨沉淀粗酶液加硫酸銨至30-40%飽和度，離心取上清，繼續(xù)加硫酸 按至70-80%飽和度，離心棄上清，沉淀在25mM， pH7. 0-8. 0的磷酸鹽緩沖液中透 析過夜。
(3) S印hacry11 HRS-100層析將透析的酶液離心，上清進(jìn)行濃縮，上樣于25mM， pH7. 0-8. 0的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡過的S印hacry11 HRS-100層析柱，流速為
0. 4ml/min，洗脫，收集酶活性部分，用10KDa的濃縮管于4*€離心收^||液，冷凍保存。檢測蛋白濃度及酶活性，酶的純化倍數(shù)為23. 2倍，回收率為30.2%。 (4) Superdex G-75層析將濃縮的目的蛋白經(jīng)離心處理后，上樣于25mM， pH7. 0-8. 0的磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡過的Superdex G-75層析柱，流速為0. 4ml/min， 用25 mM， pH7. 0-8. 0的磷酸鹽緩沖液洗脫，檢測蛋白濃度及酶活性，收集酶活性 部分，用10KDa的濃縮管于4t:離心收集濃縮液。將濃縮的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳 分析，分離膠濃度為12.5%，濃縮膠濃度為5%，得到單一條帶，表明純化的低溫 脂肪酶已經(jīng)達(dá)到電泳純，分子量為34.3 1(0&。
后酶的純化倍數(shù)為26倍，回收 率為10. 3%。
低溫堿性脂肪酶活性的測定采用中華人民共和國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(中華人民共和國 輕工業(yè)部，1993)。低溫堿性脂肪酶的水解活力單位定義為以低溫堿性脂肪酶水 解油脂，每分鐘產(chǎn)生lmol低溫堿性脂肪酸的酶量，定義為一個脂肪酶活力單位。 蛋白質(zhì)濃度的測定采用LOWRY法進(jìn)行測定(LOWRY. OH, 1951)。 SDS-PAGE垂直凝膠電泳按Laeramli法進(jìn)行(Lae咖li U K， 1970)。
實施例3:
低溫脂肪酶的憐性 ①最適酶活鵬
將酶液加到磷酸鹽緩沖液(25 mM磷酸鹽緩沖液，pH7.2)中，以,B為底物， 在0-7(TC范圍內(nèi)不同溫度下測定KMl菌株所產(chǎn)脂肪酶的酶活。結(jié)果如圖l所示，表 明該低溫脂肪酶的最適酶活溫度為37。C， (TC仍有近20%的活性，當(dāng)溫度超過4(TC 時，酶活性急劇下降，達(dá)到7(TC時殘余酶活性不到鄉(xiāng)。，這一結(jié)果表明該脂肪酶具 剤氐溫酶的典型特征，即酶的反應(yīng)溫度低。
②熱穩(wěn)定性
將酶液加到磷酸鹽緩沖液(25 mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.2)中，并在不同纟鵬的 恒溫水浴中保溫，在不同的時間(0-90min,取樣間隔為15min)取樣，然后按照 標(biāo)準(zhǔn)的酶活性測定方法測定酶活。鵬對酶穩(wěn)定性的影響表示為在一定時間后殘存 酶活性所占原來酶活性的百分比，KM1菌株所產(chǎn)低溫脂肪酶的熱穩(wěn)定曲線如圖2所 示，表明該低溫脂肪酶在低溫下a3。C和25t:)保持穩(wěn)定的酶活性，而在37。C下保溫60 min，殘留酶活性為最大酶活性的50%，這說明該酶的熱穩(wěn)定很差，符號 低溫酶的特征。 ③最適pH
用pH5. 0至pHll. 0的不同的緩沖液稀釋酶液，分別加入相應(yīng)pH的,B底物， 在37。C下測定酶活力，結(jié)果如圖3所示，表明KM1菌株所產(chǎn)的低溫脂肪酶在pH9. 0 時的酶活性最高。
pH穩(wěn)定性
將酶液加到不同pH的緩沖液中，并在4r保溫10小時，在不同的時間取樣， 然后按照標(biāo)準(zhǔn)的酶活性測定方法測定酶活。pH對酶穩(wěn)定性的影響表示為在一定時間 后殘存酶活性所占原來酶活性的百分比，KM1菌株所產(chǎn)低溫脂肪酶的pH穩(wěn)定性如圖 3所示，表明KM1菌株所產(chǎn)的低溫脂肪酶在pH7. 2-10. 0保持穩(wěn)定。
⑤ 有機(jī)溶劑對酶活性的影響
將酶液加到不同濃度(0-80%)的有機(jī)溶劑中，并在4"C保溫10小時，有機(jī)溶 劑分別為甲醇、乙醇、乙腈和二甲基亞砜(DMSO)。以,B為底物，有機(jī)溶劑對酶 活性的影響表示為在一定時間后殘存酶活性所占原來酶活性的百分比，有機(jī)溶劑對 KM1菌株所產(chǎn)低溫脂肪酶的影響如表1所示，低濃度的有機(jī)溶劑(10%)對該低溫月旨 肪酶有激活作用，而且當(dāng)甲醇的濃度達(dá)到50%時，KM1菌株所產(chǎn)低纟顯脂肪酶仍然保 留62.4%的活性，因此該酶是制備生物柴油的良好材料。KM1菌株所產(chǎn)低溫脂肪酶 對有機(jī)溶劑的耐受性使得其在有機(jī)化工合成工業(yè)具有一定的應(yīng)用潛力。
⑥ 酶促反應(yīng)動力學(xué)
將酶液加到磷酸鹽緩沖液中，在不同的底物濃度(,B為0. 4-4. OmM，間隔為 O.頓)和》鵬梯度下(4-6(TC)保溫IO min，測定相應(yīng)酶活。將不同溫度下，利 用底物濃度的倒數(shù)和反應(yīng)速率的倒數(shù)做曲線，計算相應(yīng)的他和Jcat，并計算出活 化能(泡)。如表2所示，表明KM1菌株所產(chǎn)的低溫脂肪酶的Jn在37。C時最小，說 明在37'C時酶與底物的結(jié)合能力最強(qiáng)，而且在4-37r，隨著溫度升高，Jn逐漸降 低，這是低溫酶具有的典型特征。KM1菌株所產(chǎn)的低溫脂肪酶的壓值為31.0 KJ， mo1—1，高于目前報道的很多低溫酶的值，這進(jìn)一步表明純化的脂肪酶為典型的低溫酶。
表l有機(jī)^IJ對KM1菌株所產(chǎn)低MI旨肪酶的影響
_相對活力(％)_
有機(jī)總u濃度(％) _^_^_^_
乙腈 101.4 13.2 0 0
甲醇 144.5 106.9 62.4 16.8
乙醇 114.5 65.5 44.5 19.1
二甲基亞砜 105 96 53.3 39.8
表2在不同的底物濃度和M梯度下的酶活和活化能
ATm(mmol' L-1)H(腿ol化'S-1)五a(KJ-mor1)
420.810.25x1041.19x102
1318.890.53x1042.81xl02
2517.250鄰x1045.68x102
1.03x10431.0
3716.586.21 x102
5017.960.75x1044.18x102
6018.070.70x1043.88x10權(quán)利要求
1、低溫細(xì)菌菌株耶爾森氏菌屬(Yersinia sp.)KM1，其保藏號為CGMCCNo.2637。
2、 低溫堿性脂肪酶，由低溫細(xì)菌菌株耶爾森氏菌屬(rerw'/7J'a印.)KMl產(chǎn)生。
3、 如權(quán)利要求2所述的低溫堿性脂肪酶，具有以下酶學(xué)性質(zhì)(1) 最適酶活溫度為37。C;(2) 最適pH為9. 0，在pH7. 2-10. 0保持穩(wěn)定;(3) 低溫脂肪酶的分子量為34. 3 Kda;(4) 低溫脂肪酶能耐受50%-80%的部分有機(jī)溶齊1』，如甲醇、乙醇及DMS0。
4、 權(quán)利要求2的低i^堿性脂肪酶，以耶爾森氏菌屬(re/^'m'a sp. ) KM1菌株 為原料，由下述純化方法獲得(1) 制備粗S每液耶爾森氏菌屬(re/^'m'a印.)KM1菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件為溫 度13'C， pH7.2，培養(yǎng)時間52小時，將發(fā)酵液離心，取上清即為粗酶液；(2) 硫酸銨沉淀粗酶液加硫酸銨至30-40%飽和度，離心取上清，繼續(xù)加硫酸 銨至70-80%飽和度，離心棄上清，沉淀在磷酸鹽緩沖液中透析過夜；(3) S印hacry"HRS-100層析將透析的酶液離心，上清進(jìn)行濃縮，上樣于磷酸 鹽緩沖液預(yù)平衡過的S印hacry11 HRS-100層析柱，洗脫，收集酶活性部分，濃縮冷 凍保存；(4) Superdex G-75層析將濃縮的目的蛋白經(jīng)離心處理后，上樣于磷酸鹽緩沖 液預(yù)平衡過的Superdex G-75層析柱，洗脫，收集酶活性部分，透析過夜，即為純
5、 權(quán)利要求2低^^堿性脂肪酶的純化方法，以耶爾森氏菌屬(re/^'m'asp.) KM1菌株為原料，其步驟包括(1) 制備粗酶液耶爾森氏菌屬(Ferw^'ssp. ) KMl菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件為溫 度13。C， pH7.2，培養(yǎng)時間52小時，將發(fā)酵液離心，取上清即為粗酶液；(2) 硫酸銨沉淀粗酶液加硫酸銨至30-40%飽和度，離心取上清，繼續(xù)加硫酸 銨至70-80%飽和度，離心棄上清，沉淀在磷酸鹽緩沖液中透析過夜；(3) S印hacrymHRS-100層析將透析的酶液離心，上清進(jìn)行、MI，上樣于磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡過的S印hacry11服S-IOO層析柱，洗脫，收集酶活性部分，濃縮冷 凍保存；(4) Superdex G-75層析將濃縮的目的蛋白經(jīng)離心處理后，上樣于磷酸鹽緩沖 液預(yù)平衡過的Superdex G_75層析柱，洗脫，收集酶活性部分，透析過夜，即為純 酶。
6、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的純化方法，其特征在于在步驟l沖發(fā)酵條件的優(yōu)化。
7、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的純化方法，其特征在于在在步驟(2)中分離純化所用 的緩沖液為25 mM磷酸鹽緩沖液，pH7. 0-8. 0。
8、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的純化方法，其特征在于在進(jìn)一步將步驟(3)《導(dǎo)到的純 酶樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，分離膠濃度為12.5%，濃縮膠濃度為5%。
全文摘要
本發(fā)明公開了低溫細(xì)菌菌株耶爾森氏菌屬(Yersinia sp.)KM1，以及由其產(chǎn)生的耐有機(jī)溶劑的低溫堿性脂肪酶，和其分離純化方法。純化方法包括發(fā)酵上清液的硫酸銨沉淀、用10KDa的超濾管進(jìn)行離心濃縮及進(jìn)行Sephacry^TM HRS-100層析，最后進(jìn)行Superdex G-75層析，最終得到電泳純的低溫堿性脂肪酶。本發(fā)明純化的低溫堿性酶作用溫度低、具有較寬的pH適應(yīng)范圍、對有機(jī)溶劑高耐受性，因此在洗滌劑、食品加工、制藥、生物柴油制造等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。
文檔編號C12N1/20GK101486979SQ20081023362
公開日2009年7月22日 申請日期2008年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月24日
發(fā)明者井申榮, 季秀玲, 林連兵, 陳貴元, 魏云林 申請人:昆明理工大學(xué)