專利名稱：煙草受體類似蛋白激酶基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及煙草受體類似蛋白激酶基因，其獲取方法以及在抗黑脛病病菌轉(zhuǎn)基因煙草植株中的應(yīng)用。技術(shù)背景
煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。由于煙草以煙葉為收獲對象，病害對煙草產(chǎn)量和品質(zhì)的影響更為嚴(yán)重。煙草黑脛病由VanBredadeHaan于1896年發(fā)現(xiàn)于印度尼西亞的爪哇，它是世界煙草生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的病害之一。它是由煙草黑脛病菌(戶 to/7/^ora; ams淑ca/w/coft;3加e)引起的一種煙草毀滅性土傳真菌病害，主要侵染煙草根部及莖基部，是煙草的主要病害之一[孔凡玉,朱賢朝，石金開，等.我國煙草侵染性病害發(fā)生趨勢及防治對策.中國煙草,1995(1):31-34.]。該病廣泛地分布于世界煙草種植區(qū)，在我國除黑龍江省尚無發(fā)現(xiàn)之外，其余各植煙省區(qū)均有發(fā)生，平均發(fā)病率為5 % 12 %，嚴(yán)重田塊高達(dá)75 % ，甚至造成絕收[陳瑞泰,朱賢朝，王智發(fā),等.全國16個主產(chǎn)煙省(區(qū))煙草侵染性病害調(diào)研報告，中國煙草科學(xué),1997(4):1-7.和蘇德成.煙草病蟲害.北京:中國財經(jīng)出版社，1992:87-92.]。
煙草黑脛病屬于高溫高濕型病害，其發(fā)生主要與氣溫和降雨量有關(guān)。南方煙區(qū)黑脛病發(fā)生與平均氣溫關(guān)系密切， 一般高于22t:易發(fā)生。對于煙草黑脛病的防治措施主要有種植抗病品種，合理輪作，適時早艦使用化學(xué)農(nóng)藥等潔紅艷，殿銀煙草黑脛病的發(fā)生規(guī)律及防治技術(shù)研究初報.中國煙草,1993， (3) : 20- 21.]
種植抗病品種是最經(jīng)濟(jì)，有效的防治病害的方法。目前，對煙草黑脛病抗病品種的選育，多采用常規(guī)育種，效率底，成效甚微，尚未培育出優(yōu)質(zhì)高抗煙草品種。將生物工程與傳統(tǒng)育種相結(jié)合可以加快育種進(jìn)程，快速改良作物抗病性。
本專利所克隆的受體類似蛋白激酶(AW L/D基因，是蛋白質(zhì)激酶中的一種。蛋白激酶在信號傳導(dǎo)過程中起著重要作用，而受體蛋白激酶是蛋白激酶中的重要一類,也是信號分子的重要受體。受體激酶包含有多個基因家族。在識別與轉(zhuǎn)導(dǎo)膜外信號方面發(fā)揮著重要的作用。蛋白、激酶主要是通過催化受體蛋白的可逆磷酸化來傳遞各類信號的。植物受體激酶具有酪氨酸的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，但含有絲氨膨蘇氨酸蛋白激 酶基因的序列特征。受體蛋白激酶參與了植物許多由激素和胞外環(huán)境信號引起的生 理生化過程，如，自交不親和、調(diào)節(jié)胚乳和花粉的發(fā)育、花的脫落、油菜素類固醇 信號反應(yīng)、環(huán)境脅迫及植物抗病等。在已克隆的抗病基因中水稻的義""、擬南芥的
尸5S7、大麥的i PC 7、番茄的戶7D都含有受體蛋白激酶保守結(jié)構(gòu)域。
植物受體類似蛋白激酶依其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分為三類第一類含有受體類似激酶區(qū) 與一個N端胞外S區(qū)；第二類除了受體類似激酶區(qū)外還有一個富含亮氨酸重復(fù)；第 三類只含有激酶區(qū)，沒有明顯的配基結(jié)合區(qū)，但其功能的發(fā)揮也需要一段保守氨基 酸序列。己克隆的番茄尸7U、大麥的^G/基因?qū)儆诘谌惣っ富颍?0所編碼 的129 224位氨基酸參與了病原物的識別及與無毒基因v4vr尸to的相互作用。i^G/ 基因編碼兩個激酶區(qū)，具體作用機(jī)理還不清楚。分析克隆的煙草受體類似蛋白激酶 基因編碼的氨基酸，它只含有一個保守的蛋白激酶區(qū)，與番茄的P7U結(jié)構(gòu)非常相似， 煙草受體類似蛋白激酶基因(M化iO與尸7D的功能區(qū)(129 224氨基酸)非常保 守，可能它們在與病原物的相互作用中有相似的作用機(jī)理。
煙草中克隆的抗病基因只有抗煙草花葉病的TV基因[Dinesh-Kumar,S.P., Tham,W.H. and Baker,B丄Structure-fonction analysis of the tobacco mosaic virus resistance gene N.尸rac. Ato/. ^c"d 5b'. C/SA, 2000,97 (26): 14789-14794 .]。黑脛病 抗性基因的克隆還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是克隆一個煙草受體類似蛋白激酶基因OVri ZJO cDNA的全長序列，以此設(shè)計出一對的特異性弓l物利用RT-PCR方法，檢測 該基因在接菌黑脛病病菌后的抗性野生煙草W ^pe^"不同時期根中的表達(dá)情況。
技術(shù)方案
為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明^l共了如下的技術(shù)方案 煙草受體類似蛋白激酶基因，簡稱A/ri L尺基因，它具有附圖l所述的ftt序列。
煙草受體類似蛋白激酶基因，由下述方法獲取利用其它作物中已克隆的激酶 類抗病基因保守域設(shè)計引物，從野生煙草iV,^"^中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收預(yù)期大小的片段，將回收的片段連入pGEM-T easy Vector (Promega)，測序；測序結(jié)果經(jīng)手 工去除載體序列后，在NCBI的非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTx分析;將BLASTx 分析結(jié)果與激酶類有關(guān)的6條序列用DNAstar進(jìn)行連續(xù)開放閱讀框(ORF)分析， 發(fā)現(xiàn)3條具有連續(xù)的ORF;用具有連續(xù)ORF的3條序列設(shè)計特異引物，分析其在 接菌黑脛病病菌后的野生煙草A^/w^z根組織中不同時期的表達(dá)情況，利用受黑 脛病病菌誘導(dǎo)表達(dá)序列設(shè)計兩條5' RACE弓胸與兩條3' RACE弓胸，以接菌黑脛 病病菌后9d的A^/7e"^根組織為材料，獲得其全長cDNA。 該基因的RT-PCR引物為
F: 5'—AAGACAGGGCTTTTGCTTGA—3'
R: 5'—GCCCACAAGATTGGGATCTA—3'
5'RACE所用引物
GSP1: 5'_AGATGCGGATGGTGGAACTG—3' GSP2: 5'—AAGACCTTGTCGGGACTCAG—3' 3'RACE所用引物
GSP1: 5'—GTTTACTCGTTCGGTGTTGT—3' GSP2: 5'—GAATGGGCAATGAAGAAGAC—3'
煙草受體類似蛋白激酶基因用作為耙基因。 抗黑脛病病菌轉(zhuǎn)基因煙草，是由煙草受體類似蛋白激酶基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的
方法將該基因?qū)霟煵?，在黑脛病病菌誘導(dǎo)后特異過量表達(dá)，獲得的轉(zhuǎn)基因植株。 煙草受體類似蛋白激酶基因在制備抗黑脛病病菌轉(zhuǎn)基因煙草中的應(yīng)用。 煙草受體類似蛋白激M因(見附圖l)，長度為1467bp ，序列為SEQIDNO. 1，
如下
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGGAAGCTTTTAGGGGTAAT GAGAGGGAGAGACGCACAATAACTATCCAAAGTCCCCCTGCACAGTATGAC TTATCACTCTCTCATCTTCTCCAATCTCTAATCTCCAATGTTCTGGAAATAGCC GGGAGCAGCTTTCCCCAGTCAAAAGATATATGGATTCCTTTATCTGGTAACGG TGGCACTCCACTCCATACACCATGGGAAGCAAGCATTCAAAGGGAACAACT TCCATAAGTGATGCTTCAAACTCGAATTATCGTGTTCCTATTGAGAATTATCGA
5TCATTGGAAAAGGTGGCTTTGGAAATGTTTACAGGGGTGTTATGTGTGATGG
CTCAAAGGTGGCCCTGAAAAGGCTTAATTCTGAGTCCCGACAAGGTCTTAG
AGAGTTCCGAACAGAAATTGAGATGCTCTCTCAGTTCCACCATCCGCATCTG
GTTTCATTGATTGGGTATTGTGATGAAAACAACGAGATGATTCTAGTTnTGA
GTACATGGAGAATGGGAACCTCAAGAGTCATTTGTATGGGTCAGATCTACCC
AGTATGGGCTGGGAGCAGAGGCTGGAGATATGCATCGGGGCAGCCAGAGGT
CTGCTCTACCTTCATACTGGCTATGCCAATGCAGTTATACACCGCGATGTCAA
GTCCGCAAACATATTGCTTGATGAGAACTTTGTGGCAAAGGTTGCTGATTTTG
GAGTATCCAAGACAGGGCTTTTGCTTGATCAAACCCATATGAGCACAAGGGT
GGTTGGAACTCTTGGCTACATTGATCCTGAATATTTTAGAAACGGACGGCTTT
CAAAAAAATCTGATGTTTACTCGTTCGGTGTTGTTTTATTAGAAGTTCTTTGT
GCTAGGCCTACAGTAGGCAACTTAGTTGAATGGGCAATGAAGAAGACAGGA
CAACTAGAACAAATCATAGATCCCAATCTTGTGGGCAAAATAAAACCAGATT
CCCTCAGGAAGTTTCGAGAAACAGCAGAGAAATGTGTAGCTATTTATGGTGA
AGATAGGCCATCAATGGGTGATGTGCTGTGGAGTCTGGAGTATGCACTTCATC
TCCAAGAGTCTGTCATTCATGATAATCCTGAAGAAAACAGTACTATCCCTATT
GGCGAGCTGTCTCCGCAAGTCAATGATTTCAGTCATATTAATGCCAGTGCTTC
TACTTCTCATATCTGGATGATCTCATCAAATTCGGGTGATCTCTCTGATGATAA
GTCCTACTCCTATGGTAGATAACTAAGTGAAGACGGTACAGACTGTCCTTAG
GTGTTTGTTAATTCCATTTTTTTTCATGGATCATCATCATATGAAGATTGATTAT
GAA。其中劃線部分為推測的最大開放讀碼框。 A/ri Zi:基因的RT-PCR引物為 F: 5'—AAGACAGGGCTTTTGCTTGA—3' R: 5'—GCCCACAAGATTGGGATCTA—3' 5'RACE所用引物
GSPh 5'—AGATGCGGATGGTGGAACTG—3'GSP2: 5'—AAGACCTTGTCGGGACTCAG—3' 3'RACE所用引物
GSP1: 5'—GTTTACTCGTTCGGTGTTGT—3' GSP2: 5'—GAATGGGCAATGAAGAAGAC—3'
本發(fā)明克隆受體類似蛋白激酶基因(AW2ZJO的技術(shù)路線是
1. 禾傭其它作物中已克隆的激酶類抗病基因保守域設(shè)計引物，緒生煙草 A^戸"必中進(jìn)行PCR擴(kuò)增?；厥疹A(yù)期大小的片段，將回收的片段連入pGEM-T easy Vector (Promega)。挑取10個陽性克隆測序。
2. 領(lǐng),結(jié)果經(jīng)手工去除載體序列后，在NCBI的非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行 BLASTx分析。
3. 將BLASTx分析結(jié)果與激酶類有關(guān)的6條序列用DNAstar進(jìn)行連續(xù)開放 閱讀框(ORF)分析，發(fā)現(xiàn)3條具有連續(xù)的ORF。
4. 用具有連續(xù)ORF的3條序列設(shè)計特異弓胸。分析其在接菌黑脛病病菌后 的野生煙草Wm戸^b根組織中不同時期的表達(dá)情況。其中有一條受黑脛病病菌誘 導(dǎo)表達(dá)(圖l)。
5. 禾擁該序列設(shè)計兩條5'RACE弓胸與兩條3'RACE引物，以接菌黑脛病 病菌后9d的A^^^根組織為材料，獲得其全長cDNA。.
6. 對AW ZX基因進(jìn)行了初步的生物信息學(xué)分析。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果-
本發(fā)明煙草受體類似蛋白激酶基因(A/ri^/D是從接菌黑脛病病菌后的的煙草 根組織中經(jīng)侯選基因與RACE技術(shù)方法得到的。因其僅在黑脛病病菌處理后9d表 達(dá)，且該基因編碼產(chǎn)物與植物防衛(wèi)反應(yīng)過程中的蛋白高度同源，因此以該基因為耙 基因?qū)煵葸M(jìn)行轉(zhuǎn)化，在一定程度上可有效的提高煙草的黑脛病抗性，因而具有一 定的經(jīng)濟(jì)及社會效益。以此基因為耙基因，通過基因工程的方法改良目前煙草黑脛 病的抗性，為煙草的抗病育種提供基因資源，盡快培育高抗黑脛病的煙草品種，并 應(yīng)用于煙葉生產(chǎn)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在
(1)利用已克隆的同類基因的保守域克隆與目的基因的相關(guān)片段，通過cD末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)，克隆其全長cDNA。在克隆全長cDNA的眾多方法 中，該方法費(fèi)用少、快速而且高效。
(2) 本發(fā)明所克隆的基因編碼受體類似蛋白激酶，從現(xiàn)有的資料可知，受體 類似蛋白激酶基因是一類基因家族，它們不僅在植物正常的生理過程中發(fā)揮著重要 的功能，而且是植物識別病原菌引發(fā)抗病信號傳導(dǎo)的主要基因之一。因此本發(fā)明所 克隆的基因與煙草的抗病性有著直接的關(guān)系。
(3) 以此基因作為耙基因?qū)煵葸M(jìn)行轉(zhuǎn)化，理論上可直接有效地提高其黑脛 病抗性，獲得高抗黑脛病的煙草品種，極大地減少因黑脛病病害引起的煙葉生產(chǎn)的 損失，帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益。
(4) 目前轉(zhuǎn)基因的外源基因大部分來源于微生物，這類轉(zhuǎn)基因作物對安全性 評價要求嚴(yán)格。本發(fā)明的基因來源于煙草，再導(dǎo)入煙草不存在安全性評價問題。與 煙草抗病相關(guān)的基因目前國內(nèi)外申請的專利很少，本發(fā)明可提高中國煙草禾4fF水平 在國際同行中的地位。
(5) 通過該基因的功能預(yù)測，表明該基因是一個在黑脛病病菌誘導(dǎo)后特異表 達(dá)的基因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將該基因?qū)霟煵?，使其過量表達(dá)，獲得的轉(zhuǎn)基 因植株將在黑脛病病菌侵染煙草時大量表達(dá)，有望達(dá)到大大提高煙草抗黑脛病的目 的。


下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以 此來限定本發(fā)明。
圖l煙草受體類似蛋白激酶基因(AW LiD序列表；
圖2 RT-PCR檢測受體類似蛋白激酶基因(AW^L/D在接菌黑脛病病菌菌后 A^pwdb根組織中不同時期表達(dá)特點(diǎn)，0d， 3d， 6d， 9d， 12d分別表示接菌黑脛病 病菌后的時間。圖l中EFla為組成性表達(dá)基因，作為內(nèi)標(biāo)，證明RNA模板的一 致性；li iX表示目的基因；
圖3受體類似蛋白激酶基因(A^ZX)預(yù)測的氨基,列與已克隆的其他作 物中的激酶類基因或序列的進(jìn)化樹。AAB47421為番茄戶7D基因；AAT70497為桃 樹S位點(diǎn)類似受體蛋白激酶基因；BAD37843為水稻S受體激酶PK3類似前體；AAD44031為大麥?zhǔn)荏w類似蛋白激酶基因；AAK20741為小麥^33; AAB82755
為水稻義a"基因；AAM81980為大麥7^67基因。
具體實施例方式
實施例l:煙草受體類似蛋白激酶基因(AW ZZ)的獲取及表達(dá) 1、禾U用其它作物中已克隆的激酶類抗病基因保守序列
(atgggaagcaagtattccaaggcaacaaattccataaatgatgctt ctaacttgagttatggcattccttttgaaaattatcgagttccttttgtagatt tggaggaagcaactaacaactttgatgacaagtttttcattggagagggtg gatttgggaaggtttacaggggtgtntgcgtgatggaacaaaggtcgccct gaaaaagcataaacgtgagtcctcacaaggtattgaagagttcgaaacaga aattgagattctctcattttgcagccatccgcatctggtttcattgataggatt ctgtgatgaaagaaatgagatgattctaatttatgactacatggagaatggga acctcaagagccatttgtatggctcagatctacccactatgagcatgagctgg gagcagaggctggagatatgcataggggcg6ccagaggtcttcactaccttc atactaacggagttatacatcgtgatgtcaagtgtacaaacatattgcttgat gagaattttgtgccaaaaattactgattttggaatatctaagacaatgcccga
CCCCTGAATATGCTTTGTGGGGACAGCTGACAGAAAAATCTGATGTTTATTCT TTCGGTGTTGTTTTATTCGAAGTTCTTTGTGCTAGGCCTGCCCTATATCnrCA GAGATGATGAGTTCTGATGATGAGACGCAGAAGATGGGACAGTTGGAACAA ATTGTAGATCCCGCTATTGCGGCCAAAATAAGACCAGAGTCCCTCAGGATGT TTGGAGAAACAGCGATGAAATGCTTAGCTCCGTCTAGTAAAAATAGGCCATC AATGGGTGATGTGCTGTGGAAACTGGAGT，引物用下劃線標(biāo)出)，設(shè)計引物， 從煙草A/^^^中進(jìn)行PCR擴(kuò)增?；厥?10bp片段，將回收的片段連入pGEM-T easy Vector (Promega)。挑取10個陽性克隆送寶生物工程有限公司測序。
2、 測序結(jié)果經(jīng)手工去除載體序列后，在NCBI的非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行 BLASTx分析。
3、 將BLASTx分析結(jié)果與激酶類有關(guān)的6條序列用DNAstar進(jìn)行連續(xù)開放閱讀框(ORF)分析，發(fā)現(xiàn)3條具有連續(xù)的ORF (>1
ATGGGAAGCAAGTATTCCAACGGAACAACCATAAGTGCTGCTTCAAACT TGAGTTATCGCGTTCCGTTTCCAGCTTTGCTGGAAGCAACTAGCAACTTCGA CGAGAGHTGGTCATTGGAATAGGTGGCTTTGGGAAGGTATACAGGGGTGTT TTGTGTGATGGCACTAAGGTGGCCGTGAAAAGGGGTAATCCCAAGTCCCAA CAAGGTCTTGCAGAGTTCCGAACGGAAATTGAGATGCTTTCACAGTTCCGCC ATCGGCATCTGGTTTCATTGATGGGATACTGTGATGAAAAAAATGAGATGATT CTAGTTTATGAGTACATGGAGAATGGGACCCTCAAGAGCCATTTGTATGGTTC AGATCTCCCGAGTATGAGCTGGAAGCAAAGGCTGGAGATATGCATCGGGTCA GCCAGAGGTCTGCACTACCTTCATACTGGTTACGCTAAAGCCGTTATACATCG CGATGCCAAGTCTGCAAACATATTGCTCGACGAGAGTTTTATGGCAAAAGTT GCTGATTTTGGTCTATCGAAGACAGGGCCTGAGCTTGATCAAACCCATGTTA GCACGGCCGTAAAAGGAAGCTTTGGCTACCTAGATCCTGAATATTTTAGAAG ACAACAGCTCACAGAAAAATCTGATGTTTATTCTTTTGGTGTTGTTTTATTTG AAGTTCTTTGTGCTAGGCCTGTCATAGATCCATCTCTTCCGAGGGAGATGGTC AACTTAGCTGAATGGGCTATGAAGTGGCAGAAGAAAGGACAATTGGAACAA ATCATAGATCCCAATCTTAAAGGCAAGATAAGACCAGATTCCCTTAGGAAGTT TGGAGAAACGGCGGAGAAATGTTTAGCTGATTTTGGTGTTGACAGACCATCA ATGGGTGATGTGCTGTGGAAACT
>2
ATGGGAAGCAAGTATTCCAAGGGAACAACTTCCATAAGTGATGCTCCAA ACTCGAATTATCGCGTTCCTATTGAGAATTATCGAGTTCCTTTTGCAGCTTTGC AGGAAGCAACTAACGACTTTGATGAGAGTTTGGTCATTGGAAAAGGTGGCT TTGGAAATGTTTACAGGGGTGTnTGTGTGACGGCACAAAGGTGGCCCTGA AAAGGCITAATGCTGCATCCCGACAAGGTCTTGCAGAGTTCCGAACAGAAAT TGAGATGCTCTCTCAGTTCCGTCATCCGCATCTGGTTTCATTGATTGGATACTG TGATGAAAACAACGAGATGATTCTAGTnTTGAGTACATGGAGAATGGGAACCTCAAGAGTCATTTGTATGGGTCAGATCTACCCAGTATGGGCTGGGAGCAGA GGCTGGAGATATGCATCGGGGCAGCCAGAGGTCTGCACTACCTTCATACTGG CTATGTCAATGCAGCTATACATCGTGATGTCAAGTCTGCAAACATATTGCTTGA TGAGAAnTTGTTGCAAAAGTTACTGATTTTGGGCTATCCAAGATAGGGCTTG AGCTTGATCAAACCCATATTAGCACAACTACAAGGGTGGTTGGAACTTTTGG CTACATTGATCCTGAATATTATAGAAACGGACGGCTTTCAGAAAAATCTGATG TTTACTCTTTCGGTGTTGTTTTATTAGAAGTTCTTTGTGCTAGGCCTACAGTAG TCAGCTTAACTGAATGGGGAAATAAGAAGAAGGGACAACTGGAACAAATCA TAGATCCCAATCTTGTGGGCAAAATAAGACCAGATTCCCTCCGGAAGTTTGG AGAAATAGCAGAGAAATGCATAGCTATTTATGGTGAAGATAGGCCATCAATG GGTGATGTGCTGTGGAAAT >3
TGGGAAGCAAGTATTCCAAGGGAACAACTTCCATAAGTGATGCTTCAAA CTCGAATTATCGTGTTCCTATTGAGAATTATCGAGTTCCnTTGCAGATTTGCA GGAAGCAACTAACGACTTTGACGAGAGTTrGGTCAlTGGAAAAGGTGGCTT TGGAAATGTTTACAGGGGTGTTATGTGTGATGGCTCAAAGGTGGCCCTGAAA AGGCTTAATTCTGAGTCCCGACAAGGTCTTAGAGAGTTCCGAACAGAAATTG AGATGCTCTCTCAGTTCCACCATCCGCATCTGGTTTCATTGATTGGGTATTGTG ATGAAAACAACGAGATGATTCTAGTTTTTGAGTACATGGAGAATGGGAACCT CAAGAGTCATTTGTATGGGTCAGATCTACCCAGTATGGGCTGGGAGCAGAGG CTGGAGATATGCATCGGGGCAGCCAGAGGTCTGCTCTACCTTCATACTGGCTA TGCCAATGCAGTTATACACCGCGATGTCAAGTCCGCAAACATATTGCTTGATG AGAACTTTGTGGCAAAGGTTGCTGATTTTGGAGTATCCAAGACAGGGCTnT GCTTGArCAAACCCArATGAGCACAAGGGTGGTTGGAACTCTTGGCTACATT GATCCTGAATATTTTAGAAACGGACGGCTTTCAAAAAAATCTGATGTTTACTC GTTCGGTGTTGTnTATTAGAAGTTCTTTGTGCTAGGCCTACAGTAGGCAACT TAGTTGAATGGGCAATGAAGAAGACAGGACAACTAGAACAAATCATAGATCAGCAGAGAAATGTGTAGCTATTTATGGTGAAGATAGGCCATCAATGGTGATGT GCTGTGGAAACTA)。
4、 用具有連續(xù)ORF的3條序列設(shè)計特異引物。分析其在接菌黑脛病病菌后的 野生煙草Ww/7e"必根組織中不同時期的表達(dá)情況。其中有一條
>3
TGGGAAGCAAGTATTCCAAGGGAACAACTTCCATAAGTGATGCTTCAAA CTCGAATTATCGTGTTCCTATTGAGAATTATCGAGTTCCTTTTGCAGATTTGCA GGAAGCAACTAACGACTTTGACGAGAGTTTGGTCATTGGAAAAGGTGGCTT TGGAAATGTTTACAGGGGTGTTATGTGTGATGGCTCAAAGGTGGCCCTGAAA AGGCTTAATTCTGAGTCCCGACAAGGTCTTAGAGAGTTCCGAACAGAAATTG AGATGCTCTCTCAGTTCCACCATCCGCATCTGGTTTCATTGATTGGGTATTGTG ATGAAAACAACGAGATGATTCTAGTTTTTGAGTACATGGAGAATGGGAACCT CAAGAGTCATTTGTATGGGTCAGATCTACCCAGTATGGGCTGGGAGCAGAGG CTGGAGATATGCATCGGGGCAGCCAGAGGTCTGCTCTACCTTCATACTGGCTA TGCCAATGCAGTTATACACCGCGATGTCAAGTCCGCAAACATATTGCTTGATG AGAACTTTGTGGCAAAGGTTGCTGATTTTGGAGTATCCAAGACAGGGCmT GCTTGATCAAACCCATATGAGCACAAGGGTGGTTGGAACTCTTGGCTACATT GATCCTGAATATTTTAGAAACGGACGGCTTTCAAAAAAATCTGATGnTACTC GTTCGGTGTTGTnTATTAGAAGTTCTTTGTGCTAGGCCTACAGTAGGCAACT TAGTTGAATGGGCAATGAAGAAGACAGGACAACTAGAACAAATCATAGATC CCAATCTTGTGGGCAAAATAAAACCAGATTCCCTCAGGAAGTTTCGAGAAAC AGCAGAGAAATGTGTAGCTATTTATGGTGAAGATAGGCCATCAATGGTGATGT GCTGTGGAAACTA)受黑脛病病菌誘導(dǎo)表達(dá)(圖2)。
5、 禾l擁該序列設(shè)計兩條5'RACE弓l物與兩條3'RACE引物，以接菌黑脛病病 菌后9d的iV^pen^根組織為材料，獲得其全長cDNA (附圖l所示的序列表)。
6、 對AW ZX基因進(jìn)行了初步的生物信息學(xué)分析。
6.1以此基因的最大ORF推斷的氨基,列經(jīng)BLAST。
(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)功能比較，該基因與番茄PTO蛋白具有68%的一致性，78。/。的相似性(E值:4e-119)。 6. 2用Expasy pI/Mw程序
(http:〃us. expasy. org/tools/pi—tool, html)對AW L《預(yù)測的氨基酸 序列進(jìn)行了一級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，該基因理論上的等電點(diǎn)p^5.49，分子量 Mw^40,83Da。
6.3 ProtComp Version 6 (http://linuxl.softbeny.com/berry.phtml )禾口 WoLF PSORT (http://wolfysort.org/)預(yù)測AW L/:定位于細(xì)胞質(zhì)，TMpred (http:〃www.ch.embnet.oiB/software/TMPRED—form.html)預(yù)測它含有一段跨膜區(qū) (138 162位氨基酸)。
6. 4禾,ScanProsite(http:〃www. expasy. org/tools/scanprosite/)禾M)^ 搜索M，皿預(yù)測的氨基,歹啲保守基元，發(fā)現(xiàn)其41-304位為蛋白質(zhì)激酶區(qū)。
6.5同源關(guān)系樹分析(MEGA4軟件)(圖2), AW ZX與番茄的P7D遺傳 距，近，戶70與A/ri L尺相似，只含有一個激酶區(qū)。
7、通過該基因的功能預(yù)測，表明該基因是一個在黑脛病病菌誘導(dǎo)后特異表
達(dá)的基因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將該基ia導(dǎo)入煙草，使其過量表達(dá)，獲得的轉(zhuǎn)基
因植株將在黑脛病病菌侵染煙草時大量表達(dá)，有望達(dá)到大大提高煙草抗黑脛病的目 的。
序列表
<110>云南省煙草科學(xué)研究所
<120>煙草受體類似蛋白激M因及其應(yīng)用
<130>
<140>
<141>
<160> 1
<170> Patentln version 3.1 10> SEQ ID NO.l 11> 1467 12> DNA
13> Mcoriawa邵entfo 20>
21> gene 22> (1)..(1467) 23> <400> 1
aagcagtggt atcaacgcag agtacgcggg gaagctttta ggggtaatga gagggagaga 60
13c七atccaaagC3gtatgacttatcactctctcatcttc:tc:120
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1權(quán)利要求
1、煙草受體類似蛋白激酶基因，簡稱NrRLK基因，它具有附圖1所述的堿基序列。
2、 煙草受體類似蛋白激酶基因，由下述方法獲取利用其它作物中已克隆 的激酶類抗病基因保守域設(shè)計引物，從野生煙草iV.^pe"^中進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 回收預(yù)期大小的片段，將回收的片段連入pGEM-T easy Vector (Promega)，測序； 測序結(jié)果經(jīng)手工去除載體序列后，在NCBI的非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTx 分析；將BLASTx分析結(jié)果與激酶類有關(guān)的6條序列用DNAstar進(jìn)行連續(xù)開放 閱讀框(ORF)分析，發(fā)現(xiàn)3條具有連續(xù)的ORF，用具有連續(xù)ORF的3條序列 設(shè)計特異引物，分析其在接菌黑脛病病菌后的野生煙草W,印e/^"根組織中不同 時期的表達(dá)情況，利用受黑脛病病菌誘導(dǎo)表達(dá)序列設(shè)計兩條5'RACE引物與兩 條3'RACE引物，以接菌黑脛病病菌后9d的iV.^/^^fe根組織為材料，獲得其 全長cDNA。
3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的煙草受體類似蛋白激酶基因，其特征在于 該基因的RT-PCR引物為F: 5'—AAGACAGGGCTTTTGCTTGA—3' R: 5'—GCCCACAAGATTGGGATCTA—3'5'RACE所用引物 GSP1: 5'—AGATGCGGATGGTGGAACTG—3' GSP2: 5'—AAGACCTTGTCGGGACTCAG—3'3'RACE所用引物 GSP 1:5'—GTTTACTCGTTCGGTGTTGT—3' GSP2: 5'—GAATGGGCAATGAAGAAGAC—3'。
4、 權(quán)利要求1或2或3所述煙草受體類似蛋白激酶基因用作為靶基因。
5、 抗黑脛病病菌轉(zhuǎn)基因煙草，是由權(quán)利要求l所述煙草受體類似蛋白激酶 基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將該基因?qū)霟煵?，在黑脛病病菌誘導(dǎo)后特異過量 表達(dá)，獲得的轉(zhuǎn)基因植株。
6、 權(quán)利要求1或2或3所述煙草受體類似蛋白激酶基因在制備抗黑脛病病 菌轉(zhuǎn)基因煙草中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及煙草受體類似蛋白激酶基因的克隆，屬于植物基因工程領(lǐng)域。克隆了一個煙草受體類似蛋白激酶(NrRLK)基因cDNA的全長序列。以此設(shè)計出一對NrRLK基因特異引物用半定量PCR(RT-PCR)方法，檢測其在接菌黑脛病菌后的抗性野生煙草N.rependa不同時期根中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示該基因只在黑脛病侵染后9天表達(dá)。對該基因編碼的理論氨基酸序列進(jìn)行分析表明，該蛋白可能參與了植物的防衛(wèi)反應(yīng)，故該基因可能與黑脛病抗性有直接的關(guān)系。以此基因為靶基因，通過基因工程的方法改良目前煙草黑脛病的抗性，培育高抗黑脛病的煙草品種，應(yīng)用于煙葉生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/10GK101550420SQ20081023363
公開日2009年10月7日 申請日期2008年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月25日
發(fā)明者盧秀萍, 徐照麗, 焦芳嬋, 肖炳光, 陳學(xué)軍, 高玉龍 申請人:云南省煙草科學(xué)研究所