專利名稱：三疣梭子蟹抗菌肽基因及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從三疣梭子蟹(尸om/"w加'ft^e""/aft^)中克隆的I型 Crustin抗菌肽基因，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
中國是全球最大的水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，水產(chǎn)品總產(chǎn)量(捕撈+養(yǎng)殖)占全球35%， 其中水產(chǎn)品養(yǎng)殖產(chǎn)量約占全球的70%， 2005年水產(chǎn)品產(chǎn)量達(dá)5181萬噸。其中海 水產(chǎn)品2854萬噸，占總產(chǎn)量的55%，捕撈約1022萬噸，人工養(yǎng)殖產(chǎn)品約1888 萬噸。隨著全球?qū)λa(chǎn)品的消費(fèi)逐年增加，國內(nèi)消費(fèi)增長勢頭迅猛，另一方面 全球海洋捕撈資源衰退，供給逐步轉(zhuǎn)向以養(yǎng)殖水產(chǎn)品為主，中國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)在 全球消費(fèi)中越來越重要。人工養(yǎng)殖比例逐年提高，1978年人工養(yǎng)殖比例占26%， 2005年人工養(yǎng)殖比例達(dá)61%。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，由于高密度養(yǎng)殖、 養(yǎng)殖水域富營養(yǎng)化、生態(tài)環(huán)境惡化等原因使得水產(chǎn)養(yǎng)殖品種頻頻發(fā)生各種疾病， 經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，已成為21世紀(jì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要制約因素。據(jù)初步統(tǒng)計(jì)， 目前危害水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的病害已達(dá)400 500種，大多數(shù)病害是由病毒、細(xì)菌、 真菌等微生物所引起的。而傳統(tǒng)的抗微生物藥物及飼料添加劑一一抗生素，由 于耐藥性病原菌的形成，以及食品安全性等公共衛(wèi)生上問題的提出，目前在世 界各國養(yǎng)殖業(yè)中的使用都受到嚴(yán)格限制，如歐盟自2006年1月1日起，全面禁 止食品動(dòng)物使用抗生素促生長飼料添加劑，因此尋找安全的抗生素替代物、開 發(fā)安全高效的新型抗微生物免疫增強(qiáng)劑或能增強(qiáng)養(yǎng)殖品種機(jī)體免疫力的詞料添 加劑成為研究的熱點(diǎn)，也是我國養(yǎng)殖業(yè)、飼料行業(yè)健康、持續(xù)發(fā)展首要解決的 課題之一。
近年來，隨著對養(yǎng)殖動(dòng)物的自身免疫機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物體液中富含多種體液免疫因子如凝集素、防御素、抗菌肽及多種行使調(diào)控作用的蛋白因 子等。養(yǎng)殖品種自身來源的體液免疫因子由于其特殊的作用機(jī)制，不存在食品 安全問題與環(huán)境問題，并對養(yǎng)殖品種具有促生長、增強(qiáng)免疫力的功能，還可通 過基因工程技術(shù)大量發(fā)酵生產(chǎn)，不存在藥源問題，成為替代傳統(tǒng)抗生素作為綠 色飼料添加劑及抗感染藥劑的理想選擇，是當(dāng)前飼料添加劑領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
Crustins最早由Relf等在青蟹(C ra'm waewa^中分離鑒定，后續(xù)研究表明 Crustins普遍存在于甲殼類(蟹、對蝦、龍蝦、螯蝦等)中，主要由甲殼類血淋 巴細(xì)胞合成，分子量7 14kDa，等電點(diǎn)pl7.0 8.7。甲殼類Crustins以其C末 端的WAP (whey acidic protein)結(jié)構(gòu)域?yàn)闃?biāo)志，與甲殼類中發(fā)現(xiàn)的其它富含Cys 的抗菌肽區(qū)分開來，如同樣富含Cys但不含WAP結(jié)構(gòu)域的甲殼類抗菌肽 defensins、penaeidins等。WAP結(jié)構(gòu)域是由8個(gè)保守的Cys位點(diǎn)形成四個(gè)二硫鍵， 構(gòu)成一個(gè)緊密結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)又被稱作4DSC結(jié)構(gòu)(four-disulphide core)。含 有WAP結(jié)構(gòu)域的蛋白廣泛存在于其它生物類群中，如哺乳動(dòng)物的 antileukoproteinases、 elafms、 trappins等，這些含WAP結(jié)構(gòu)域蛋白一般都是小
分子分泌蛋白，具有蛋白酶抑制劑、個(gè)體生長調(diào)節(jié)、組織分化調(diào)節(jié)等生理功能。 目前發(fā)現(xiàn)的Crustins均由信號肽和成熟肽兩部分組成，信號肽區(qū)域長16 24 Aa， 與其它類型抗菌肽如cathelicidins、 defensins的保守性相比，Crustins信號肽保守 性較差，而成熟肽區(qū)域相對保守些。根據(jù)信號肽與成熟肽C末端之間結(jié)構(gòu)的差 別，可將Crustins分為三個(gè)亞型
I型信號肽與WAP之間存在一個(gè)序列長度多變、富含Cys的結(jié)構(gòu)域，但 結(jié)構(gòu)域中Cys的數(shù)量不超過6個(gè)，因此僅能形成一個(gè)4DSC類似結(jié)構(gòu)域，而不 能形成完整的4DSC結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域的一致框架一般為一C—X(3)—C—X(8 一12)—C一C—X(16—17)—C一X(6)—C—X(9 —10)—。 I型Crustins主要存在于蟹、龍蟲下和螯蝦中。
II型II型Crustins主要發(fā)現(xiàn)于對蝦中，不僅有一個(gè)富含Cys結(jié)構(gòu)域，而且 鄰近信號肽區(qū)還有一個(gè)大約40 80 Aa的Gly富集區(qū)。Gly富集區(qū)在不同種中 Gly數(shù)量變化較大， 一般在20 50個(gè)之間，在對蝦中一般以5 8個(gè)VGGGLG 重復(fù)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，但在Pe"M^ 中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)Type II crustin (EF523614)
中，其Gly富集區(qū)的22個(gè)Gly殘基不是以VGGGLG重復(fù)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)的。
III型III型Crustins不僅缺乏II型的Gly富集區(qū)，而且也沒有I型和II型 中的Cys富集區(qū)，因此某些文獻(xiàn)中不把它歸為Cmstins，而稱之為SWD (single-whey domain)蛋白、chelonianin-like蛋白或antileukoproteinase-like蛋白。 有關(guān)III型Crustins目前研究的還較少，僅發(fā)現(xiàn)于戶.Mo"o^tow，丄.Fa""am&， MarsMpe"agwsy'a/ o"/cjAS， Fe朋era/ e"aews c/z/"ms7's等對蟲下中。
用已報(bào)道的三種類型Crustins及其它一些非Crustins具WAP結(jié)構(gòu)域蛋白構(gòu) 建系統(tǒng)樹顯示:I型和II型各獨(dú)立聚合為分枝，而III型Crustins與非甲殼類WAP 結(jié)構(gòu)域蛋白，如人分泌型亮氨酸蛋白酶抑制劑(SLPI， X04502)、人抗白血球蛋 白酶抑制劑(ALPI， P03973)、鼠SLPI (AF151982)等聚為一枝。
Crustins作為甲殼類直接抗菌防御因子的證據(jù)來源于研究Crustins在不同組 織中的表達(dá)以及實(shí)驗(yàn)感染研究。研究表明大多數(shù)Crustins在血淋巴細(xì)胞中是高水 平的組成型表達(dá)，在其它器官，如腮、心臟、腸也檢測到編碼Crustins轉(zhuǎn)錄體表 達(dá)，但這些器官中有豐富的血管分布，因此在這些器官中檢測到Crustins轉(zhuǎn)錄體 是否是由于血淋巴干擾所造成的目前還不清楚；同時(shí)研究表明Crustins —般均有 較好的抗菌活性。例如Relf等報(bào)道C. mae加s Carcinin對龍蝦致病菌A v/nVfara v"r /7CW7""、兩株海洋菌尸/a"ococcws 5pp,禾口一株H"鹽菌M /w&w均具有抗菌活 性；Supungul P等(2008)報(bào)道重組尸.wo"odo" Crustin (D766060)對5". awews 、S. /"/ae有很強(qiáng)的抑菌活性而對A vzW&m 、 M /wteus無效，但另一種重組P. wo"ofifo" Type II Crustins(EF654658)對G+菌和G-菌均有很強(qiáng)的抗菌活性，包括 A vzV7^ara var /zcww^z'以及另兩禾中致病G'菌五.co// 363、 K /wrveyz'; Haug等(2006) 報(bào)道蜘蛛蟹K araweus Crustins對谷氣酸棒桿菌C g/wtomfc訓(xùn)的半致死濃度僅為 3 mM; Zhang (2007)等報(bào)道中國對蟲下F. c/^e"w^重組crustins對S. aweus、 M /wfe船及三種Bacillus的半致死濃度也僅為2 8mM; Type III Crustins功能報(bào) 道較少，僅見AmparyupP等(2008)黑虎蝦_P. mo"o^ w III型crustin重組蛋白 具有抗菌活性，同時(shí)也是蛋白酶subtilisin A的競爭性抑制劑。就目前的研究結(jié) 果顯示Crustins廣泛的抗菌譜似乎與序列多態(tài)性有關(guān)，由于不同Crustins異構(gòu) 體抑菌差異沒有被研究，不同異構(gòu)體間是否有協(xié)同增效作用還不清楚。雖然 Crustins的抗菌機(jī)制目前不明，但WAP結(jié)構(gòu)域與抗菌活性密切相關(guān)，如Zhang 等報(bào)道的一個(gè)Type II型F. c/7/恥似^ Crustin沒有WAP，無抗菌活性；當(dāng)蛇毒 WAP抗菌蛋白Cys殘基被還原和烷化后，也丟失抗菌活性，因此WAP完整結(jié) 構(gòu)可能是Crustins抗菌活性必需的。哺乳動(dòng)物WAP與絲氨酸蛋白酶抑制劑活性 相關(guān)，通過將其抑制環(huán)插入蛋白酶活性位點(diǎn)口袋干擾催化亞基，WAP蛋白酶抑 制劑活性位點(diǎn)特征為4DSC結(jié)構(gòu)第二個(gè)Cys緊連著一個(gè)Met,而在脊椎動(dòng)物具有 抗菌活性的WAP蛋白中，Met被堿性氨基酸或疏水氨基酸所取代，并且Met 也極少出現(xiàn)在Crustins的WAP結(jié)構(gòu)域中。另外，甲殼類Crustins除了抗菌及免 疫調(diào)節(jié)功能之外，在甲殼類再生組織中也檢測到Crustins的表達(dá)，可能與機(jī)體修 復(fù)功能相關(guān)。Stoss等報(bào)道小龍蝦(尸."^m)嗅覺器官再生上皮組織中檢測到 PET-15的表達(dá)；Durica等報(bào)道在招潮蟹(C. ，p7a組)再生斷肢中檢測到Crustins (DW176897)的表達(dá)。綜上所述，甲殼類Crustins由于其功能、結(jié)構(gòu)上的優(yōu)勢， 極具應(yīng)用開發(fā)價(jià)值，因而近年來研究報(bào)道也較多。三疣梭子蟹隸屬于甲殼綱、十足目、梭子蟹科、梭子蟹屬，分布于中國、 日本及朝鮮等海域，是一種大型海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)蟹類，因其生長快，肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng) 豐富而深受國內(nèi)外消費(fèi)者喜愛。沿海地區(qū)僅浙江省自上世紀(jì)八十年代末開始養(yǎng) 殖以來，發(fā)展就異常迅猛，目前在浙江的舟山、寧波等地，已初步建立了梭子
蟹圍塘養(yǎng)殖示范園區(qū)和梭子蟹產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖基地，2007年全省三疣梭子蟹養(yǎng)殖面 積達(dá)到58320畝，產(chǎn)量26404噸，產(chǎn)值超過20億元，已成為浙江省主導(dǎo)養(yǎng)殖品 種之一。梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)己在當(dāng)?shù)貪O業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、漁民轉(zhuǎn)產(chǎn)、實(shí)現(xiàn)漁農(nóng)民增收中 發(fā)揮重要作用。但隨著梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，梭子蟹病害也和其它養(yǎng)殖品種一 樣，呈現(xiàn)逐年上升趨勢，如弧菌病、爛鰓病、甲殼潰瘍病、牛奶病等，給梭子 蟹養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失，成為制約產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的一種重要因素。因此，急需 開發(fā)無公害梭子蟹自身免疫因子來源的免疫增強(qiáng)劑或飼料添加劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種從三疣梭子蟹(Pw^mw的Yz^^cw/aft^)中克隆 的I型crustin抗菌肽基因。該基因可與釀酒酵母等構(gòu)建真核表達(dá)載體建立高 效表達(dá)I型crustin的基因工程菌株，體外大量生產(chǎn)三疣梭子蟹I型crustin 抗菌肽，作為飼料免疫添加劑可替代傳統(tǒng)飼料中的某些抗生素，還可以作為替 代某些耐藥性抗生素的有效抗菌藥物。
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。 三疣梭子蟹的I型crustin抗菌肽基因，所說的三疣梭子蟹crustin抗菌肽基
因cDNA不包括polyA共有565nt，其中含有5'端非編碼區(qū)(5' UTR)長75nt， l個(gè)閱讀框長330nt， 3，非編碼區(qū)(3， UTR)長160nt，其GenBank序列號為 FJ467931 ，全長cDNA序列如下
10 20 30 40 5060
g33a3g3gc3 gaacssgscs ctgtggtggs cscscctgct ctcaccsscg tcttcctc33
70 80 90 100 110
120
gaatctatag agataatgaa gatgcagact gtaatagcca tggcagttgt ggctaccatt
130 140 150 160 170
180
gtggccstgs cagasgcstc cctsgtactt ccatscccag gtctggattg tssgtsctgg
190 200 210 220 230
240
tgc33ggacs 3Ctscg3t33 scsctsctgc cgtggcccsc C3ggscgtsc
Ct3tCC3CCt
250 260 270 280 290
300
tataccgagc gctctggtaa atgtcctccg gtccgtgcta catgtactgg tgtcaggtca
310 320 330 340 350
360
cgcctaccaa agttgtgtcc ccatgatggt gcttgtgact ttccaagcas gtgctgttat<image>image see original document page 13</image>Met Lys Met Gin Thr Val lie Ala Met Ala Val Val 12
get acc att gtg gcc atg aca gaa gca tec cta gta ctt cca tac cca 159 Ala Thr lie Val Ala Met Thr Glu Ala Ser Leu Val Leu Pro Tyr Pro 28
ggt ctg gat tgt aag tac tgg tgc aag gac aac tac gat aaa cac tac 207 Gly Leu Asp Cys Lys Tyr Trp Cys Lys Asp Asn Tyr Asp Lys His Tyr 44
tgc cgt ggc cca cca gga cgt acc tat cca cct tat acc gag cgc tct 255
Cys Arg Gly Pro Pro Gly Arg Thr Tyr Pro Pro Tyr Thr Glu Arg Ser 60
ggt aaa tgt cct ccg gtc cgt get aca tgt act ggt gtc agg tea cgc 303
Gly Lys Cys Pro Pro Val Arg Ala Thr Cys Thr Gly Val Arg Ser Arg 76
cta cca aag ttg tgt ccc cat gat ggt get tgt gac ttt cca age aag 351 Leu Pro Lys Leu Cys Pro His Asp Gly Ala Cys Asp Phe Pro Ser Lys 92
tgc tgt tat gac gcc tgt gtg gag cac cac gta tgc aag act cct gat 399 Cys Cys Tyr Asp Ala Cys Val Glu His His Val Cys Lys Thr Pro Asp 108
ttc tac taa acaatcattg aaccagactg aagatgaaaa tttttcacca
448
14Phe Tyr 氺氺氺
110
attttgctta caaactttac agagatgata ttctcttaaa acattgattt atggttatgc 508
tattctatat tcatttgtaa acaatataac aaaataataa acgcaattgt atccgtgaaa 568
580
所說的3'-RACE有義鏈簡并引物crustin Fl為包括起始密碼子ATG的起始密 碼子后+238堿基起共17bp。
所說的5'-RACE反義鏈特異引物crustinRl為終止密碼子TAA后第45個(gè)堿 基起共18bp。
所說的5'-RACE反義鏈特異引物cmstinR2為終止密碼子TAA前第20個(gè)堿 基開始，即從基因+310位開始共23bp。
三疣梭子蟹的I型crustin抗菌肽基因的克隆方法，步驟為
(1) 設(shè)計(jì)有義鏈簡并引物crustinFl: 5，-GTN TGY GCN CAY GAY GG-3，， 與逆轉(zhuǎn)錄引物上的IVb Primer M4: 5，-GTTTTC CCAGTC ACG AC-3，配合，以 三疣梭子蟹血淋巴細(xì)胞總RNA模板，通過3，-RACE技術(shù)克隆三疣梭子蟹的I 型crustin抗肽基菌因mRNA 3'端209nt基因片段，不包括引物及PolyA;
(2) 根據(jù)獲得的I型crustin抗肽基菌因3，端209nt基因片段設(shè)計(jì)特異引物 反義鏈引物cmstinRl: 5'- CTG TAA AGT TTG TAA GCA畫3'和crustinR2: 5'-TTAGTAGAAATCAGGAGTCTTGC -3'， 5'端有義鏈引物使用大連寶生物公司5，-Full RACE kit 試齊U盒自帶的5'RACE Outer Primer : 5'-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA -3' ， 5'RACE Inner Primer : 5'-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG-3'，以三疣梭子蟹血淋巴 細(xì)胞總RNA模板，按5'-Ful1 RACE kit操作總RNA去磷酸化處理、"去帽子"反 應(yīng)、5'RACE Adaptor的連接、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、嵌套PCR，從三疣梭子蟹血淋巴細(xì) 胞中擴(kuò)增出三疣梭子蟹的I型crustin抗菌肽基因完整5'UTR及編碼區(qū)在內(nèi)的 408nt的目的片段；
(3)將3，-RACE及5'RACE的測序結(jié)果進(jìn)行拼接和堿基校對，最終得到三 疣梭子蟹的I型cmstin抗菌肽基因的全長cDNA序列。
本發(fā)明以三疣梭子蟹血淋巴細(xì)胞總RNA為模板，參考已報(bào)道的甲殼類crustins 的基因序列，通過優(yōu)化選擇設(shè)計(jì)簡并引物，利用3' RACE、 5' RACE等分子生 物學(xué)技術(shù)手段，成功克隆到三疣梭子蟹I型crustin cDNA全長序列，該基因?qū)儆?甲殼類crustins基因家族的新組員。該基因其前體序列與Imjongjirak等報(bào)道的青 蟹(5by〃a/ "ra/wamoyaz'"， Genbank accession: ABY20727) 、 Burgess乎艮道的岸 蟹(Cara'mw畫ems， Genbank accession: CAH25401 ) crustins基因氨基酸序歹U 同源性分別達(dá)到69%和63%。且前體中信號肽與成熟肽之間的剪切位點(diǎn)一致， 為TEA—S/RL;推導(dǎo)的三疣梭子蟹I型crustin成熟肽與其它I型crustins —樣， 由N端富含Cys結(jié)構(gòu)域和C端完整WAP結(jié)構(gòu)域組成。通過文獻(xiàn)檢索證實(shí)該類 結(jié)構(gòu)crustin多肽具有抗G+、 G'菌作用，且具蛋白酶抑制劑及免疫調(diào)節(jié)功能活性， 對動(dòng)物無毒，可通過基因工程方式構(gòu)建原核或真核基因工程菌株，高效表達(dá)具 生理活性的重組蛋白，大量生產(chǎn)。作為飼料免疫添加劑可替代傳統(tǒng)飼料中的某 些抗生素，用于海水養(yǎng)殖業(yè)，實(shí)現(xiàn)綠色養(yǎng)殖，減少乃至消除抗生素在水產(chǎn)品中 的蓄積，提高水產(chǎn)品質(zhì)量；也可以作為某些耐藥性抗生素的有效替代品，用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中耐藥性細(xì)菌的防治藥物。


圖1是三疣梭子蟹血淋巴細(xì)胞總RNA電泳圖； 圖2是三疣梭子蟹血淋巴3， -RACE電泳圖； 圖3是三疣梭子蟹血淋巴5， -RACE電泳圖。
具體實(shí)施例方式
1.三疣梭子蟹血淋巴細(xì)胞總RNA的提取
選健康三疣梭子蟹斷肢采血10ml，加入10ml抗凝劑(NaCl 8.2g、葡萄糖 19.8g、檸檬酸6.3g、檸檬酸鈉7.6g、 EDTA3.7g， pH7.4，加蒸留水定容至1L， 121。C滅菌15min)， 3000rpm離心5min，棄上清，用marine saline洗滌沉淀一次 (NaC133.9g、 CaCl2 2.95g、 KC10.90g、 Na2HP04 0.2g、 Tris-堿6.05g， pH7.4， 加水定容至1L， 12rC滅菌15分鐘)，加入0.5 ml Trizol，用槍頭抽吸混勻，用 1 ml針筒，6#針頭抽吸勻衆(zhòng)液兩次以剪切基因組DNA后移入1.5ml Eppendoff 管(DEPC處理)，力卩100ul氯仿/異戊醇(24 : 1)，劇烈震蕩混勻30sec， 12,000 rpm室溫離心5 min，將上清液(約450 ul)轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中，力B 150 ul 無水乙醇，混勻后轉(zhuǎn)移到.UNIQ-10柱中，室溫放置2min， 8,000 rpm室溫離心 lmin，棄去收集管中的廢液，將柱放回收集管中，加入450 ul的RPE Solution, 10,000 rpm室溫離心30 sec，再用450 ul的RPE Solution洗滌一次，10,000 rpm 室溫離心15sec，小心取出柱，放到無菌RNAase-free的1.5ml離心管里，在柱 內(nèi)膜的中央小心加入50ulDEPC-H20，室溫或55 8(TC放置2min， 10，000rpm， 離心管內(nèi)的溶液為RNA樣品，測OD，和OD26()/28()，于1%的 瓊脂糖凝膠檢測，如圖l所示。
172. 3' RACE
2. 1 cDNA第一鏈合成
取總RNAlug，加入試劑盒自帶的Oligo dT-Adaptor Primer (5uM) lul， 5 XM-MLV buffer 2ul， dNTP Mixture (各10mM) lul， RNase Inhibitor (40U/ul) 0.25ul， Reverse Transcriptase M-MLV (RNaseH-) (200U/ul) 0.25ul，加RNase Free dH20至總體積10ul。 42。C反應(yīng)60min， 75°C 15min滅活Reverse Transcriptase M-MLV，置于冰上。
2.2 PCR
根據(jù)已報(bào)道的甲殼類cmstin氨基酸序列和核酸序列ClustalW結(jié)果，選取靠 近C端的比較保守區(qū)域設(shè)計(jì)有義鏈簡并引物crustin Fl: 5'- GTN TGY GCN CAY GAYGG-3'。反義鏈引物用試劑盒自帶引物Mn Primer M4: 5，-GTTTTCCCA GTCACGAC-3'。 DNA聚合酶使用大連寶生物公司ExTaq酶。反應(yīng)體系如下 上述1的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2ul， lx cDNA Dilution Buffer II 8ul， 10x PCR Buffer 4ul， MgCK25mM) 3ul，弓l物crustin Fl (10uM) 2ul，弓l物M13 Primer M4 (10uM) 2uM， TaKaRa五x 7b《(5 U/pl) 0.5ul， dH20 28.5 ul。反應(yīng)條件，94。C預(yù)變性3min; 94。C變性lmin， 40。C退火lmin， 72。C延伸lmin， 5個(gè)循環(huán)；94。C變性lmin， 55 。C退火lmin， 72。C延伸lmin， 35個(gè)循環(huán)；72。C后延伸10min。 1%瓊脂糖凝膠 電泳檢測得到約260nt的特異cDNA擴(kuò)增帶，如圖2所示。 2.3目的片斷割膠回收與T載體克隆測序
PCR產(chǎn)物跑1X瓊脂糖凝膠電泳，割取目的帶，用小量膠回收試劑盒(上海華 舜生物試劑公司，W5212)進(jìn)行純化回收。將PCR回收產(chǎn)物連接入pMD 19-T Vector (大連寶生物公司)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入以E co"DH5 a菌株制備的感受態(tài)細(xì)胞 中，用X-gal、 IPTG、 Amp系統(tǒng)篩選目的克隆子，PCR法檢測重組成功克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后用柱式小量質(zhì)粒提取試劑盒(上海生工)抽提質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒作為模
板，引物B0012: 5'陽CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'、 B0014: 5，畫AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3，進(jìn)行雙向測序。測序結(jié)果校正后翻譯成氨基酸序列，在NCBI網(wǎng)站(http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov/)通過blast檢索同源基因，結(jié)果顯示與與青蟹6"cy〃aparawamom/" crustins蛋白C末端同源性最高，達(dá)到84%。
3. 5' RACE
3.1全長mRNA 5'加接頭及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)3. 1. 1三疣梭子蟹總RNA去磷酸化處理
使用Alkaline Phosphatase (CIAP)對Total RNA中裸露的5'磷酸基團(tuán)進(jìn)行去磷酸反應(yīng)，按下列組份配制去磷酸反應(yīng)液總RNA2ug， RNase Inhibitor(40 U4d)1 (jj， 1 Ox Alkaline Phosphatase Buffer (MgCl2 Free) 5 pi， Alkaline Phosphatase(Calf intestine) (16U/|_il) 0.6 (il，加RNase Free dH20至總體積50 pl。 50。C反應(yīng)l小時(shí)后向反應(yīng)液中加入20(il的3MCH3COONa(pH5.2) ， 130 ^d的RNaseFreedH20充分混勻，加入200pl的苯酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1)，充分混勻后13，000xg室溫離心5分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入200(il的氯仿，充分混勻后13,000xg室溫離心5分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入2pl的NACarrier后均勻混合，加入200 pl的異丙醇，充分混勻后，冰上冷卻10分鐘，13,000xg4。C離心20分鐘，棄上清，加入500(ol的70。/。冷乙醇(RNase Free dH20配制)漂洗，13,000xg4。C離心5分鐘，棄上清后干燥，加入7 |il的RNase Free dH20溶解沉淀，得到CIAP-treatedRNA。3丄2 "去帽子"反應(yīng)
使用Tobacco Acid Pyrophosphatase (TAP)去掉m認(rèn)A的5'帽子結(jié)構(gòu)，保留
19一個(gè)磷酸基團(tuán)，按下列組份配制"去帽子"反應(yīng)液CIAP-treatedRNA7nl， RNaseInhibitor (40 U/pl) 1 fil， 10xTAP Reaction Buffer 1 (il， Tobacco AcidPyrophosphatase (0.5 U/|il) 1 |il，總體積10ul。 37。C反應(yīng)l小時(shí)，此反應(yīng)液為CIAP/TAP-treatedRNA。取5 pl用于5'RACE Adaptor連接反應(yīng)，剩余的5 (il保存于-80°C 。
3.1.3 5 ^RACE Adaptor的連接
首先配制下列反應(yīng)液CIAP/TAP-treated RNA 5 (xl， 5'RACE Adaptor( 15 |iM)1^1， RNase Free dH20 4 jal， 65。C保溫5分鐘后冰上放置2分鐘，然后加入下列試劑RNase Inhibitor (40 U/pl) 1 (il， 5xRNA Ligation Buffer 8 |il， 40% PEG#600020|il， T4RNALigase (40U/(il) 1 pi, 16。C反應(yīng)l小時(shí)后向反應(yīng)液中加入20 ^的3MCH3COONa (pH5.2) ， 140 fil的RNase Free dH20充分混勻，加入200 (il的苯酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1)，充分混勻后13,000xg室溫離心5分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入200(il的氯仿，充分混勻后13,000xg室溫離心5分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入2^il的NACarrier后均勻混合，加入200nl的異丙醇，充分混勻后，冰上冷卻10分鐘，13,000xg4'C離心20分鐘，棄上清。加入500|11的70%冷乙醇(RNaseFreedH20配制)漂洗，13，000xg4。C離心5分鐘，棄上清后千燥，加入6)il的RNaseFreedH20溶解沉淀，得到LigatedRNA。
3丄4反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
按下列組份配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液LigatedRNA6 u 1， oligo(dT) primer (50 uM) 0.5 pl，5XM-MLVBuffer2 P 1， dNTP( 10 mM each) 1 u 1 ， RNase Inhibitor(40 U/卩1) 0.25 u 1 ， Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-) (200 U/" 1)0.25 ul，總體積10ul。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下30°C lOmin， 42°C 1 hr， 70°C 15min，反應(yīng)結(jié)束后可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，或?qū)⒎磻?yīng)液保存于-2(TC。 3.2PCR反應(yīng)
根據(jù)獲得的三疣梭子蟹crustin基因片段，設(shè)計(jì)兩個(gè)反義鏈引物crustinRl: 5'-CTGTAAAGTTTGTAAGCA-3'(位于crustin 3,-UTR末端)和crustinR2: 5'陽 TTAGTAGAAATCAGGAGTCTTGC-3'(位于crustin C末端)，有義鏈引物為試劑 盒自帶的5'RACE Outer Primer: 5'- CATGGCTACATGCTGACAGCCTA -3', 5'RACE Inner Primer: 5'畫
CGCGGATCC AC AGCCTACTGATGATC AGTCGATG-3'。
3.2.1 Outer PCR反應(yīng)
按下列組份配制Outer PCR反應(yīng)液反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2pl， 1 xcDNA Dilution Buffer II ,， 10x PCR Buffer (Mg2+Free) 4 jil， MgCl2 (25 mM) 3 pl， TaKaRa五x腳 (5 U/^il) 0.25 pl， crustinRl (10 [iM) 2 fil， 5TIACE Outer Primer (10 jiM) 2 |il ，加dH20至總體積50 (il。反應(yīng)條件94。C預(yù)變性3min; 94。C變性30sec， 55 。C退火30sec， 72。C延伸30sec， 20個(gè)循環(huán);72。C后延伸10min。
3.2.2 inner PCR反應(yīng)
按下列組份配制Inner PCR反應(yīng)液Outer PCR反應(yīng)液1 |al， 10x PCR Buffer (Mg2+ Free) 5 (il， MgCl2 (25 mM) 4 jil， dNTP Mixture (2.5 mM each) 4 (il， TaKaRa & ~ ( 5 U/|il) 0.5 (il ， crustinR2 (10 一 ) 2 |il ， 5 'RACE Inner Primer (10 pM) 2 |il，加dH20至總體積50 (il。反應(yīng)條件94。C預(yù)變性3min; 94°C 變性30sec， 55。C退火30sec， 72。C延伸30sec， 30個(gè)循環(huán)；72。C后延伸10min。 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到約約400nt的特異cDNA擴(kuò)增帶，如圖3所示。 3.3目的片斷割膠回收與T載體克隆測序 inner PCR反應(yīng)液跑1 %的瓊脂糖回收膠，割目的帶用上海生工小量膠回收試劑盒回收克隆進(jìn)pMD19-T Vector (大連寶生物公司)測序。得至'j405nt的三疣梭 子蟹crustin完整的5'UTR和CDS。 4.序列分析與基因確定
擴(kuò)增獲得的cDNA產(chǎn)物由上海invitrogen生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA核苷酸 序列測定，為保證準(zhǔn)確都挑三個(gè)克隆子正反雙向測序。序列同源性比對和相似 性搜索用NCBI BLAST在線進(jìn)行；多序列比對用ClustalW;以blast2軟件輔助進(jìn)行 序列拼接；信號肽預(yù)測用SignalP3.0 Server在線分析。
權(quán)利要求
1. 三疣梭子蟹的I型crustin抗菌肽基因，其特征在于，所說的三疣梭子蟹crustin抗菌肽基因cDNA不包括polyA共有565nt，其中含有5’端非編碼區(qū)(5’UTR)長75nt，1個(gè)閱讀框長330nt，3’非編碼區(qū)(3’UTR)長160nt，其GenBank序列號為FJ467931，全長cDNA序列如下10 20 30 40 5060gaaaagagca gaacaagaca ctgtggtgga cacacctgct ctcaccaacgtcttcctcaa70 80 90100110120gaatctatag agata<u>atg</u>aa gatgcagact gtaatagcca tggcagttgtggctaccatt 130140150 160 170180gtggccatga cagaagcatc cctagtactt ccatacccag gtctggattgtaagtactgg 190200210220230240tgcaaggaca actacgataa acactactgc cgtggcccac caggacgtacctatccacct 250260270 280 290300tataccgagc gctctggtaa atgtcctccg gtccgtgcta catgtactggtgtcaggtca 310320330340350360cgcctaccaa agttgtgtcc ccatgatggt gcttgtgact ttccaagcaagtgctgttat 370380390400 410420gacgcctgtg tggagcacca cgtatgcaag actcctgatt tctacacaatcattgaa 430440450460470480ccagactgaa gatgaaaatt tttcaccaat tttgcttaca aactttacagagatgatatt 490500510520530540ctcttaaaac attgatttat ggttatgcta ttctatattc atttgtaaacaatataacaa 550560570580aat<u>aataaa</u>c gcaattgtat ccgtgaaaaa aaaaaaaaaa
2.如權(quán)利要求1所述的三疣梭子蟹的I型crustin抗菌肽基因，其特征在于，所說的三疣梭子蟹的I型crustin抗菌肽cDNA推導(dǎo)編碼氨基酸序列如下<formula>formula see original document page 3</formula>CPHDGACDFP SKCCYDACVE HHVCKTPDFY * 。 ------
3.如權(quán)利要求1所述的三疣梭子蟹的I型cmstin抗菌肽基因，其特征在于，所說的三疣梭子蟹的I型crustin抗菌肽cDNA讀碼框及推導(dǎo)蛋白質(zhì)氨基酸序列如下gaaaagagca gaacaagaca ctgtggtgga cacacctgct ctcaccaacg tcttcctcaa 60gaatctatag agata atg朋g atg cag act gta ata gcc atg gca gtt gtg Met Lys Met Gin Thr Val lie Ala Met Ala Val Val get acc att gtg gcc atg aca gaa gca tec eta gta ctt cca tac cca 159 Ala Thr lie Val Ala Met Thr Glu Ala Ser Leu Val Leu Pro Tyr Pro 28ggt ctg gat tgt aag tac tgg tgc aag gac aac tac gat aaa cac tac 207 Gly Leu Asp Cys Lys Tyr Trp Cys Lys Asp Asn Tyr Asp Lys His Tyr 44tgc cgt ggc cca cca gga cgt acc tat cca cct tat acc gag cgc tct 255.Cys Arg Gly Pro Pro Gly Arg Thr Tyr Pro Pro Tyr Thr Glu Arg Ser 60ggt aaa tgt cct ccg gtc cgt get aca tgt act ggt gtc agg tea cgc 303Gly Lys Cys Pro Pro Val Arg Ala Thr Cys Thr Gly Val Arg Ser Arg 76eta cca aag ttg tgt ccc cat gat ggt get tgt gac ttt cca age aag Leu Pro Lys Leu Cys Pro His Asp Gly Ala Cys Asp Phe Pro Ser Lys<formula>formula see original document page 5</formula>
4. 如權(quán)利要求1所述的三疣梭子蟹的I型crustin抗菌肽基因，其特征在于， 所說的3'-RACE有義鏈簡并引物crustin Fl為包括起始密碼子ATG的起始密碼 子后+238堿基起共17bp。
5. 如權(quán)利要求1所述的三疣梭子蟹的I型crustin抗菌肽基因，其特征在于， 所說的5'-RACE反義鏈特異引物crustinRl為終止密碼子TAA后第45個(gè)堿基起 共18bp。
6. 如權(quán)利要求1所述的三疣梭子蟹的I型cmstin抗菌肽基因，其特征在于， 所說的5'-RACE反義鏈特異引物crustinR2為終止密碼子TAA前第20個(gè)堿基開始，即從+310位開始共23bp。
7.如權(quán)利要求1~6的任意一項(xiàng)所述的三疣梭子蟹的I型crustin抗菌肽基因 的克隆方法，其特征在于，步驟為(1) 設(shè)計(jì)有義鏈簡并弓I物crustin F1: 5 ，- GTN TGY GCN CAY GAY GG -3 ，， 與逆轉(zhuǎn)錄引物上的Mu Primer M4: 5，-GTTTTC CCAGTC ACGAC-3，配合，以 三疣梭子蟹血淋巴細(xì)胞總RNA模板，通過3'-RACE技術(shù)克隆三疣梭子蟹的I 型crustin抗肽基菌因mRNA 3，端209nt基因片段，不包括引物及polyA;(2) 根據(jù)獲得的I型crustin抗肽基菌因3'端209nt基因片段設(shè)計(jì)特異引物 反義鏈引物crustinRl: 5'- CTG TAA AGT TTG TAA GCA -3'和cmstinR2: 5'-TTAGTAGAAATCAGGAGTCTTGC -3'， 5，端有義鏈引物使用大連寶生物公司 5，-Full RACE kit 試齊U盒自帶的5'RACE Outer Primer : 5'-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA -3' ， 5'RACE Inner Primer : 5'-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG-3'，以三疣梭子蟹血淋巴 細(xì)胞總RNA模板，按5'-Ful1 RACE kit操作總脂A去磷酸化處理、"去帽子"反 應(yīng)、5HACE Adaptor的連接、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、嵌套PCR，從三疣梭子蟹血淋巴細(xì) 胞中擴(kuò)增出三疣梭子蟹的I型crustin抗菌肽基因完整5'UTR及編碼區(qū)在內(nèi)的 408nt的目的片段；(3) 將3，-RACE及5'RACE的測序結(jié)果進(jìn)行拼接和堿基校對，最終得到三 疣梭子蟹的I型crustin抗菌肽基因的全長cDNA序列。
全文摘要
三疣梭子蟹抗菌肽基因及其克隆方法，所說的三疣梭子蟹crustin抗菌肽基因cDNA不包括polyA共有565nt，其中含有5’端非編碼區(qū)(5’UTR)長75nt，1個(gè)閱讀框長330nt，3’非編碼區(qū)(3’UTR)長160nt，其GenBank序列號為FJ467931。本發(fā)明成功克隆到三疣梭子蟹I型crustin cDNA全長序列，可通過基因工程方式構(gòu)建原核或真核基因工程菌株，高效表達(dá)具生理活性的重組蛋白，大量生產(chǎn)。作為飼料免疫添加劑可替代傳統(tǒng)飼料中的某些抗生素，用于海水養(yǎng)殖業(yè)，實(shí)現(xiàn)綠色養(yǎng)殖，減少乃至消除抗生素在水產(chǎn)品中的蓄積，提高水產(chǎn)品質(zhì)量；也可以作為某些耐藥性抗生素的有效替代品，用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中耐藥性細(xì)菌的防治藥物。
文檔編號C12N15/12GK101508992SQ20081023364
公開日2009年8月19日 申請日期2008年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月27日
發(fā)明者智 廖, 王建鑫, 王日昕, 望 申, 戈 石 申請人:浙江海洋學(xué)院