專利名稱：甘蔗白條病菌檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物保護領域，尤其是一種甘蔗白條病菌檢測方法。
背景技術：
甘蔗白條病是由細菌白條黃單胞(義"W/za朋"w a/M^朋s)弓I致的世界性甘 蔗重要病害，廣泛分布于美國、加拿大等多個國家和地區(qū)。該病害主要通過帶 菌種莖進行遠距離傳播，是國內外重要的檢疫對象
目前，甘蔗白條病的檢測方法主要有選擇性培養(yǎng)基分離鑒定法、酶聯(lián)免疫 吸附測定法、酶免疫分析法、組織印跡法等。但是，這些方法在檢測時間、靈 敏度、穩(wěn)定性等方面存在不足，且檢測特異性不強。

發(fā)明內容
本發(fā)明提出一種甘蔗白條病菌的檢測方法，該方法能有效提高甘蔗白條病 菌的快速檢測，使檢測更準確、靈敏、特異性更強。 本發(fā)明包括以下步驟
1、 分別采用打氣泵吹汁法和高速離心法提取甘蔗汁液和甘蔗白條病菌檢測 樣本中的模板DNA;
2、 利用甘蔗白條病菌的特異性引物進行聚合酶鏈式反應PCR;
3、 用瓊脂糖凝膠電泳擴增檢測反應產物，出現(xiàn)目標電泳條帶即可確定檢測 樣本中有甘蔗白條病菌存在，所說的目標電泳條帶是指600bp (堿基對)擴增帶。
本發(fā)明提供的甘蔗白條病菌檢測方法，為甘蔗品種/材料交換病害的檢測提 供了技術關鍵，可有效防止該病害隨引進的甘蔗品種/材料傳播蔓延，對甘蔗生 產造成嚴重威脅；完善了甘蔗白條病菌PCR檢測方法，聚合酶鏈式反應PCR檢 測方法克服了選擇性培養(yǎng)基分離鑒定法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、酶免疫分析法 或組織印跡法等現(xiàn)有檢測方法花費時間長，靈敏度、穩(wěn)定性較差，檢測特異性 不強等不足，大大提高了檢測效率和檢測的準確性。


圖1是本發(fā)明的實施例中不同甘蔗樣品PCR檢測結果拍照示意圖。
具體實施例方式具體步驟如下.
1、 提取甘蔗汁液每個待測甘蔗樣本取5 6條蔗莖，每條蔗莖截取中下
部莖節(jié)，用砍刀切成12 18cm左右長，每取一個樣品后均用70%的酒精消毒砍 刀，再用打氣泵吹1.5 2.5ml左右的甘蔗汁于離心管內，置于冰上，帶回室內 放于-18 20。C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> 2、 提取檢測模板DNA:
取保存的甘蔗汁液解凍，置于離心機上，轉速為13000rpm/min離心3min， 棄清液；于離心沉淀物中加1000nL滅菌水，置于離心機上，轉速為13000rpm/min 離心3min，棄清液；于離心沉淀中加1000pL滅菌水，置于離心機上，轉速為 13000rpm/min離心3min，棄上清；加20-200jiL滅菌水，于-18 20。C保存?zhèn)溆茫?br> 3、 用甘蔗白條病菌的特異性弓I物進行聚合酶鏈式反應PCR:
1) 特異性引物序列Forward primer XAF:5，CCTGGTGATGACGCTGGGTT， Reverse primer XAR: 5'CGATCAGCGATGCACGCAGT;
2) 反應體系2.5pL10X緩沖液(buffer), 2單25mM氯化鎂(MgCL2)，
0. 5pLXAF (20pM)， 0.5pLXAR (20pM)， l.OpL 10mM三磷酸脫氧核糖核苷酸 混合液(dNTPs)， 0.2pL Taq聚合酶(5.0U/pL)， l.O^L模板(DNA)， 17.3|iL 滅菌水(H20)，總體積為25pL;
3) 反應參數(shù)PCR反應參數(shù)為95。C 5min; 94°C 45sec， 65°C lmin， 72°C lmin(lst10 cycles), 2min(2nd10 cycles), 3min(3rd10 cycles), 30個循環(huán)；72°C lOmin。
4、 反應產物電泳檢測
用1%瓊脂糖凝膠電泳對反應產物進行擴增檢測，并用凝膠成像分析系統(tǒng) 觀察拍照電泳擴增結果。
實施例國外甘蔗品種白條病的PCR檢測
1、 材料
從法國引進的甘蔗品種/材料ISD28、 CP92-1641、 CP94-1綱、KZ9424、 SP803280、 SP813250、 VMC9509、 VMC9588和VMC95105，每個待測甘蔗樣 本取5 6條蔗莖，每條蔗莖截取中下部莖節(jié)，用砍刀切成15cm左右長，每取 一個樣品后均用70%的酒精消毒砍刀，再用打氣泵吹2ml左右的甘蔗汁于離心管 內，置于冰上，帶回室內放于-18。C冰箱保存?zhèn)溆谩?、 提取檢測模板DNA
取保存的甘蔗汁液解凍，13000rpm離心3min，棄清液，于離心沉淀中加 1000pL滅菌水，13000rpm離心3min，棄清液，于離心沉淀中加1000pL滅菌水， 13000rpm離心3min，棄上清，加20-200jliL滅菌水，于-20。C保存?zhèn)溆茫?br> 3、 用甘蔗白條病菌的特異性引物進行聚合酶鏈式反應PCR
1) 特異性引物序列Forward primer XAF:5，CCTGGTGATGACGCTGGGTT， Reverse primer XAR: 5,CGATCAGCGATGCACGCAGT;
2) 反應體系2.5nL10X緩沖液(buffer), 2.0pL25mM氯化鎂(MgCL2)， 0.5juLXAF (20mM)， 0.5pLXAR (20pM)， l.OpL 10mM三磷酸脫氧核糖核苷酸 混合液(dNTPs)， 0.2pL Taq聚合酶(5.0U4iL)， l.O)iL模板(DNA)， 17.3pL 滅菌水(H20)，總體積為25^L;
3) 反應參數(shù)PCR反應參數(shù)為95。C 5min; 94°C 45sec， 65°C lmin， 72°C lmin(lst10 cycles), 2min(2nd10 cycles), 3min(3rd10 cycles), 30個循環(huán)；72°C lOmin。
4、 反應產物電泳檢測
用1%瓊脂糖凝膠電泳對反應產物進行擴增檢測，并用凝膠成像分析系統(tǒng)觀 察拍照電泳擴增結果。
對法國引進的9個甘蔗品種/材料ISD28、 CP92-1641、 CP94-1100、 KZ9424、 SP803280、 SP813250、 VMC9509、 VMC9588和VMC95105的DNA、陽性對照 (澳大利亞提供)和陰性對照(滅菌水)的PCR反應產物進行電泳檢測，結果 顯示陽性對照出現(xiàn)明顯的特異片段(600bp)，陰性對照和所檢測樣品均未出現(xiàn) 相同的條帶，結果顯示見圖l。
圖1中，泳道l: 100bpDNA標準分子量，分別為2000bp， 1000bp， 750 bp， 500 bp， 250bp;
泳道2 4:陽性對照，600bp; 泳道5:陰性對照；
泳道6~14分別為樣品ISD28、 CP92-1641、 CP94-1100、 KZ9424、 SP803280、 SP813250、 VMC9509、 VMC9588和VMC95105DNA。
權利要求
1、一種甘蔗白條病菌的檢測方法，其特征在于有以下步驟1)、分別采用打氣泵吹汁法和高速離心法提取甘蔗汁液和甘蔗白條病菌檢測樣本中的模板DNA；2)、用甘蔗白條病菌的引物進行聚合酶鏈式反應；3)、反應產物經電泳擴增檢測，出現(xiàn)目標電泳條帶即可確定檢測樣本中有甘蔗白條病菌存在。
2、 根據(jù)權利要求l所述的甘蔗白條病菌的檢測方法，其特征是進行聚合酶鏈式反應的引物為甘蔗白條病菌的特異性引物。
3、 根據(jù)權利要求l所述的甘蔗白條病菌的檢測方法，其特征是采用瓊脂糖 凝膠電泳擴增檢測反應產物，目標電泳條帶是指堿基對600bp擴增帶。
全文摘要
一種甘蔗白條病菌的檢測方法，1)分別采用打氣泵吹汁法和高速離心法提取甘蔗汁液和甘蔗白條病菌檢測樣本中的模板DNA；2)用甘蔗白條病菌的引物進行聚合酶鏈式反應；3)反應產物經電泳擴增檢測，出現(xiàn)目標電泳條帶即可確定檢測樣本中有甘蔗白條病菌存在，本發(fā)明為甘蔗品種/材料交換病害的檢測提供了技術關鍵，可有效防止該病害隨引進的甘蔗品種/材料傳播蔓延，聚合酶鏈式反應PCR檢測方法克服了選擇性培養(yǎng)基分離鑒定法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、酶免疫分析法或組織印跡法等現(xiàn)有檢測方法花費時間長，靈敏度、穩(wěn)定性較差，檢測特異性不強等不足，大大提高了檢測效率和檢測的準確性。
文檔編號C12Q1/68GK101434996SQ20081023374
公開日2009年5月20日 申請日期2008年12月22日 優(yōu)先權日2008年12月22日
發(fā)明者盧文潔, 吳才文, 李文鳳, 羅志明, 范源洪, 黃應昆 申請人:云南省農業(yè)科學院甘蔗研究所