專利名稱：禾谷鐮孢菌鑒定及其對(duì)多菌靈產(chǎn)生中等抗藥性水平確認(rèn)的一管檢測(cè)法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是禾谷鐮孢菌鑒定及其是否對(duì)多菌靈產(chǎn)生中等抗藥性(即，中抗)水平確認(rèn)一管(即， 在一個(gè)PCR反應(yīng)管中)檢測(cè)法，屬于植物病原菌抗藥性亞群體的檢測(cè)方法，專用于檢測(cè)抗多菌靈 等苯并咪唑類殺菌劑的未谷鐮孢菌。
二背景技術(shù)：
小麥赤霉病是由禾谷鐮孢菌(Gibberella zeae,無性態(tài)Fusarium graminearum)引起的一種 世界性病害，嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。長(zhǎng)期以來采用苯并咪唑類殺菌劑或以這類藥劑為主的復(fù) 配劑進(jìn)行化學(xué)防治。苯并咪唑類殺菌劑作為一類髙效、廣譜內(nèi)吸性殺菌劑在生產(chǎn)上應(yīng)用，解決了保 護(hù)性殺菌劑的環(huán)境毒性問題，提高了人類控制該病害的能力。苯并咪唑類殺菌劑包括多菌靈、苯菌 靈、噻菌靈、甲基硫菌靈等。這些殺菌劑具有相同的抗菌譜和抗菌機(jī)制，它們也具有相同的抗藥性 機(jī)制，相互之間存在正交互抗藥性。由于這類藥劑的高度專化性，作用位點(diǎn)單一，加上施用頻率高， 使用20年后許多植物病原真菌群體中就會(huì)出現(xiàn)抗藥性亞群體，使藥劑防治完全失去效果。對(duì)苯并咪
唑類藥劑的殺菌機(jī)制和抗藥性機(jī)制研究表明，藥劑主要是結(jié)合在病菌的e-微管蛋白上從而阻止細(xì)胞
的有絲分裂,達(dá)到抑制病菌生長(zhǎng)的目的。己有的對(duì)幾種植物病原菌的分子生物學(xué)研究表明,病菌對(duì)苯 并咪唑類殺菌劑的抗藥性自然突變體主要是其P-微管蛋白196 202位氨基酸的改變,這些改變使該 蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象發(fā)生改變，從而阻止了藥劑與靶標(biāo)結(jié)合，使病菌表現(xiàn)抗藥性。在人工誘變菌株中除 上述位點(diǎn)外還涉及其它一些位點(diǎn),如165,257等的氨基酸變異。通過定點(diǎn)突變也確認(rèn)了198和200位氨
基酸類型與抗感性密切相關(guān)。但是未谷鐮孢菌對(duì)多菌靈的抗藥性機(jī)制并非像其它絲狀真菌一樣由e
-微管蛋白198位等氨基酸突變所致。
早期檢測(cè)病原群體中抗藥性亞群體/抗藥性基因的頻率，及早實(shí)施抗藥性治理策略，是延緩抗藥 性亞群體的發(fā)展，防止抗藥性病害流行危害最有效的措施。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法需要分離培養(yǎng)病原菌， 然后在含藥培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再根據(jù)藥劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)的效應(yīng)鑒別抗藥性。這種對(duì)藥劑的敏感性測(cè)定方 法通常需要幾周時(shí)間，工作量大，測(cè)定樣本數(shù)量有限，難以早期發(fā)現(xiàn)抗藥性亞群體的存在，也不能 用于當(dāng)年的抗藥性短期預(yù)測(cè)。在抗藥性機(jī)制研究基礎(chǔ)上，根據(jù)基因點(diǎn)突變的原理，應(yīng)用核酸技術(shù)如 寡核苷酸一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ASO-PCR技術(shù))等檢測(cè)病原真菌對(duì)多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑的抗藥 性，則能快速、準(zhǔn)確檢測(cè)大量樣本，使在早期檢測(cè)低頻率的抗藥性基因成為可能。
三
發(fā)明內(nèi)容
3技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供禾谷鐮孢菌鑒定及其是否對(duì)多菌靈產(chǎn)生中等抗藥性水平的一種 快速檢測(cè)方法。針對(duì)未谷鐮孢菌抗多菌靈的檢測(cè)基因設(shè)計(jì)特異性引物檢測(cè)，有時(shí)會(huì)因其他植物病原 菌與該基因非特異性結(jié)合而誤判。現(xiàn)有研究中尚沒有在一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,簡(jiǎn)稱PCR)體系中，同時(shí)評(píng)價(jià)待測(cè)樣品是否為未谷鐮孢菌及其是否對(duì)多菌靈產(chǎn)生中斷抗藥 性水平的方法。
技術(shù)方案提取的基因組DNA或病?？芍苯佑糜贏SO-PCR禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈中抗水平菌株的基 因檢測(cè)，其^-微管蛋白基因，長(zhǎng)度為1713bp,相應(yīng)的編碼/32-微管蛋白的447個(gè)氨基酸，檢測(cè)基因包 含中抗菌株A-微管蛋白基因編碼的第167位氨基酸的抗藥性突變位點(diǎn)Phe(TTT)密碼字突變?yōu)?Tyr(TAT)密碼字。編碼167位氨基酸的密碼子發(fā)生點(diǎn)突變導(dǎo)致對(duì)多菌靈的中等抗藥性水平，占田間突 變類型的99.5%。
(1) 設(shè)計(jì)特異性的引物檢測(cè)未谷鐮孢菌；
(2) 設(shè)計(jì)特異性的引物檢測(cè)對(duì)多菌靈中等抗性的引物；
(3) 在一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,簡(jiǎn)稱PCR)體系中(即，在一個(gè) PCR反應(yīng)管中)，同時(shí)加入特異性檢測(cè)禾谷鐮孢菌種類和多菌靈抗藥性水平的兩對(duì)引物，在 同一個(gè)PCR反應(yīng)程序控制下與待測(cè)樣品的核基因組結(jié)合，擴(kuò)增，電泳檢測(cè)，可同時(shí)評(píng)價(jià)待 測(cè)樣品是否為禾谷鐮孢菌及其是否對(duì)多菌靈產(chǎn)生中等抗藥性水平。
有益效果本發(fā)明未谷鐮孢菌鑒定及其對(duì)多菌靈產(chǎn)生中等抗藥性水平確認(rèn)一管檢測(cè)法，具有如下 優(yōu)點(diǎn)和積極效果
(1) 本發(fā)明是國(guó)際上首次報(bào)道在一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,簡(jiǎn)稱 PCR)體系中，同時(shí)加入特異性檢測(cè)禾谷鐮孢菌(/^ ^"附§^附/蛇0^附，有性態(tài)6沾& ;//0
種類和多菌靈抗藥性水平的兩對(duì)引物，與待測(cè)樣品的核基因組結(jié)合，擴(kuò)增，電泳檢 觀"可同時(shí)評(píng)價(jià)待測(cè)樣品是否為未谷鐮孢菌及其是否產(chǎn)生對(duì)多菌靈中等抗藥性水平，為今 后禾谷鐮孢菌的多菌靈抗藥性菌株檢測(cè)提供技術(shù)支撐。
(2) 目前國(guó)內(nèi)其他研究單位均采用菌絲生長(zhǎng)法檢測(cè)禾谷鐮孢菌抗藥性，但該方法涉及采樣、分 離培養(yǎng)需要3d和室內(nèi)大量的藥劑敏感性測(cè)定實(shí)驗(yàn)至少要6天，周期較長(zhǎng)，工作繁瑣，費(fèi)時(shí) 費(fèi)力。
(3) 隨著殺菌劑抗藥性分子機(jī)制研究的深入，利用分子生物學(xué)技術(shù)的檢測(cè)方法快速、簡(jiǎn)便、有 效地檢測(cè)殺菌劑抗性成為研究熱點(diǎn)。本發(fā)明從基因組的提取到ASO-PCR整個(gè)檢測(cè)過程只需 6h即可，且操作簡(jiǎn)單易學(xué)。因此AS0-PCR技術(shù)使快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)和監(jiān)測(cè)田間抗藥性菌株成為可能，且方法簡(jiǎn)便便于基層工作人員掌握。這對(duì)及時(shí)了解抗藥性病原群體的發(fā)展動(dòng)態(tài)， 及時(shí)、合理地指導(dǎo)科學(xué)用藥，有效治理抗藥性，以及降低成本和減少環(huán)境污染具有現(xiàn)實(shí)意 義。
(4)直接從田間采集回來的病穗用ASO-PCR檢測(cè)整個(gè)過程只需6h，檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)99%，達(dá)到對(duì) 多菌靈中等抗藥性菌株的快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)。
五具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l采用PCR方法對(duì)^鐮孢菌對(duì)多菌靈抗藥性中抗菌沐險(xiǎn)測(cè)
擴(kuò)增體系50nL中含dNTP0,2nM,上游引物和下游引物均為lnM， Taq (申能博彩生物技術(shù)有 限公司)2,5U，模板DNA100ng， 10 X buffer (IO^iM Tris-HCl， 50mM KC1) 5|uL，用d2H20補(bǔ)足 至50nL。擴(kuò)增條件94°C 5min; 94°C 60s, 56°C 60s, 72'C 60s, 35次循環(huán)；72°C 15min。
通過設(shè)計(jì)特異性的探針上游引物MBCF(5' -TCCCCGATCGCATGATGGCCACCTA-3')下游引 物MBCR(5' -CTTTCGCAGATCCGAGTTGAGCTGT-3')，對(duì)田間中抗菌株(Codon167 TTT— TAT) 進(jìn)行了檢測(cè)(圖l)，該探針對(duì)中抗菌株具有很好的特異性。
實(shí)施例2對(duì)禾谷鐮孢菌特異性檢測(cè)的結(jié)果與分析
擴(kuò)增體系50nL中含dNTP(X2nM,上游引物和下游引物均為lpM, Taq (申能博彩生物技術(shù)有 限公司)2.5U，模敵DNA100ng， 10 X buffer (10, Tris-HCl， 50mMKCl) 5pL，用d2H20補(bǔ)足至 50pL。擴(kuò)增條件為94°C 5min; 94°C 45s， 56°C 45s， 72°C 45s， 35次循環(huán)；72°C 15min。
引物對(duì)FGa/FGb對(duì)禾谷鐮孢菌具有很強(qiáng)的特異性。將引物對(duì)FGa (5'-AGTCCAAAATGTCCCGATGC-3') /FGb (5，-GCTGGGACCTGAGAAGTA-3，)用于26種其他 不同菌種菌株后，均無條帶(圖2)。
實(shí)施例3采用一管法進(jìn)行^鐮孢菌及其對(duì)多菌靈的敏感性的測(cè)試
50nL擴(kuò)增體系中含上述兩對(duì)弓I物FGa/FGb和MBCR/MBCF使反應(yīng)體系中弓I物濃度均為1 pM, dNTP 0.2pM, Taq (申能博彩生物技術(shù)有限公司)2.5U,模板DNA100 ng, 10Xbuffer (lO^M Tris-HCl, 50mMKCl)5nL，用d2H20補(bǔ)足至50nL。擴(kuò)增條件為94°C 5min; 94°C 45s， 56°C 45s， 72°C 45s, 35次循環(huán)；72°C 15min。取5pLPCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖TBE膠上電泳，通過熒光成像系統(tǒng)觀察(圖 3)。
經(jīng)引物對(duì)FGa/FGb擴(kuò)增后，模板NT-21、 NT-29均有明顯條帶(小的電泳條帶)，而水稻惡苗病 (G. fujikuroi)無條帶，說明NT-21、 NT-29均屬禾谷鐮孢菌，而水稻惡苗病(G. fujikuroi)非禾谷鐮孢菌。 經(jīng)引物對(duì)MBCR/MBCF擴(kuò)增后，NT-29有明顯條帶，而NT-21無條帶(大的電泳條帶)，說明NT-21 對(duì)多菌靈抗藥性基因Codonl67存在突變，而NT-29無突變，但引物對(duì)MBCR/MBCF能夠與水稻惡 苗病(G.ftijikuroi)非特異性結(jié)合，出現(xiàn)條帶。因此表明，在一個(gè)PCR反應(yīng)管及同一個(gè)控制程序下，引 物對(duì)FGa/FGb、 MBCR/MBCF可同時(shí)用于測(cè)試禾谷鐮孢菌及其對(duì)多菌靈的敏感性。
5附困說明
圖l 禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈抗藥性基因Codon"" (TTT— TAT)突變的檢測(cè)結(jié)果。泳道1 11為屮抗菌 株，12 17為敏感菌株。
圖2未谷鐮孢菌特異性檢測(cè)結(jié)果。
(引物對(duì)均為FGa/FGb,泳道1 27分別對(duì)應(yīng)水稻惡苗病(G >/i')fcura/)、辣椒黑點(diǎn)病(C. ca;w/d)、小 麥全蝕病(G gra柳'w"var)、西瓜枯萎病(F oj^sporww)、柑桔干腐病(F mo",7!/ome)、棉花枯萎病(F ox"porwM)、番茄早疫病(A so/aw')、油菜菌核病(S. sc/eTOrion n)、番茄灰霉病(5. cz'werea、梨 腐爛病(C. cflA^o^ema)、蘋果斑點(diǎn)落葉病(P附aZ/)、青菜黑斑病04 6ra訓(xùn)'cae)、香蕉炭疽病(C miwae)、 梨輪紋病(M fowa加faiO、葡萄灰霉病(A c&erea)、水稻黑霉病(JV. wyzae)、西瓜蔓枯病(M附e/o"")、 蘆筍莖枯病(P osparag0、黃瓜黑星病(C.c"c"weW"M加)、柑桔青霉病CP Wcoft'a"ae)、辣椒根腐病(K /a"'')、黃瓜立枯病(兄so/an/)、大蒜葉枯病(S. 6o吵o/m0、茄子褐紋病(P ve:ca/w)、香蕉炭疽病(C. WM5ae)、甜菜褐斑病(C. 6erico/a)、稻瘟病(P gr&ea))
圖3采用一管法測(cè)試禾谷鐮孢菌及其對(duì)多菌靈的敏感性
(泳道l 3分別對(duì)應(yīng)模板水稻惡苗病(G/"力Jbwi')、和未谷鐮孢菌對(duì)多菌靈的抗藥性菌株NT-29和 未谷鐮孢菌對(duì)多菌靈的敏感菌株NT-21)
權(quán)利要求
1、在一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，簡(jiǎn)稱PCR)體系中(即，在一個(gè)PCR反應(yīng)管中)，同時(shí)加入能夠特異性檢測(cè)禾谷鐮孢菌(Gibberella zeae，無性態(tài)Fusarium graminearum)及其是否對(duì)多菌靈產(chǎn)生中等抗藥性水平的兩對(duì)引物，以待測(cè)樣品的核基因組為模板，擴(kuò)增，電泳，電泳結(jié)果可同時(shí)評(píng)價(jià)待測(cè)樣品是否為禾谷鐮孢菌及其是否對(duì)多菌靈產(chǎn)生中等抗藥性水平。特異性檢測(cè)禾谷鐮孢菌的引物FGa(5’-AGTCCAAAATGTCCCGATGC-3’)和FGb(5’-GCTGGGACCTGAGAAGTA-3’)特異性檢禾谷鐮孢菌樣品對(duì)多菌靈產(chǎn)生中等抗藥性水平的引物MBCF(5′-TCCCCGATCGCATGATGGCCACCTA-3′)和MBCR(5′-CTTTCGCAGATCCGAGTTGAGC TGT-3′)。
全文摘要
本發(fā)明是禾谷鐮孢菌(Gibberella zeae，無性態(tài)Fusarium graminearum)檢測(cè)及其對(duì)多菌靈產(chǎn)生中等抗藥性水平確認(rèn)的一管檢測(cè)法，專門用于禾谷鐮孢菌菌株及其對(duì)多菌靈產(chǎn)生中等抗藥性的特異性檢測(cè)。該法可以從田間采集回來的病穗、病組織和病殘?bào)w上的病原菌采用ASO-PCR檢測(cè)，整個(gè)過程只需6h，檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)99％。該法具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101475983SQ20081023508
公開日2009年7月8日 申請(qǐng)日期2008年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月17日
發(fā)明者周明國(guó), 王建新, 陳長(zhǎng)軍 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 被以下專利引用 (2),