專利名稱：黃顙魚性染色體特異分子標(biāo)記及遺傳性別鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)領(lǐng)域中的魚類遺傳性別鑒定和性別控制技術(shù)， 更具體涉及一種黃顙魚性染色體特異分子標(biāo)記及遺傳性別鑒定方法。本發(fā)明 在黃顙魚的性別控制和全雄苗種的培育中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)在其它 魚類性別控制和單性苗種生產(chǎn)中也具有應(yīng)用前景。
背景技術(shù)：
一
黃顙魚[尸eJ^eoM riAS /WwVi-3c0 (Richardson)]是具有較高經(jīng)濟(jì) 價(jià)值的底棲鯰形目鰭科魚類，廣泛分布于江河、湖泊、水庫(kù)等水域。其肉質(zhì) 鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，肌間刺少，因而深受消費(fèi)者青睞。近年來價(jià)格較高，市場(chǎng) 需求量日益增大。黃顙魚雄魚比雌魚生長(zhǎng)快。據(jù)調(diào)査，在相同養(yǎng)殖條件下， 第一年雄性黃顙魚比同胞雌魚的生長(zhǎng)速度快30%左右。在養(yǎng)殖的第二年，其 雄魚生長(zhǎng)至150-200克，而雌魚卻只有50-75克，雌雄生長(zhǎng)差異接近3 倍。因此，如果能夠在育種中人工控制黃顙魚的性別，培育出全雄黃顙魚， 將大大提高產(chǎn)量，降低養(yǎng)魚成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。
生產(chǎn)單性雄魚有幾種方法可供選擇如人工挑選、雄性激素直接誘導(dǎo)性 逆轉(zhuǎn)、雄核發(fā)育、種間雜交、人工誘導(dǎo)三倍體以及遺傳學(xué)方法等。目前，使 用遺傳學(xué)的方法生產(chǎn)XY全雄魚在尼羅羅非魚單性養(yǎng)殖使用過。這種稱為 GMT技術(shù)，適用于雄性配子異型的魚類，方法可靠、穩(wěn)定，而且對(duì)環(huán)境友 好，無(wú)不良的影響。
最近劉漢勤等成功地從XY生理雌魚雌核發(fā)育產(chǎn)生了 YY超雄魚，并且通 過與XX雌魚測(cè)交得到了全雄子代，驗(yàn)證了YY超雄魚的存在，說明了該技術(shù) 路線的可行性，也為全雄黃顙魚的生產(chǎn)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。但當(dāng)應(yīng)用到大規(guī) 模生產(chǎn)中時(shí)，該技術(shù)存在一些技術(shù)瓶頸，阻礙了全雄魚的生產(chǎn)，比如生產(chǎn) 實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，通過黃顙魚XY雌魚雌核發(fā)育產(chǎn)生YY超雄魚的同時(shí)，也產(chǎn)生了 XY正常雄魚，其數(shù)量與YY超雄魚不相上下，阻礙了 YY超雄魚在全雄魚苗 培育中的應(yīng)用。因此如何準(zhǔn)確快捷地鑒定開YY和XY雄魚成為實(shí)現(xiàn)全雄黃顙 魚苗規(guī)?；a(chǎn)中的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。傳統(tǒng)的方法只有通過測(cè)交實(shí)驗(yàn)后，根據(jù)子 代性別比例，才能判斷出其父本為遺傳YY或XY雄魚；而在測(cè)交實(shí)驗(yàn)中，測(cè) 交子代需要養(yǎng)殖3個(gè)月以上才能解剖根據(jù)組織學(xué)判斷其性別，因此實(shí)驗(yàn)周期 長(zhǎng)，養(yǎng)殖成本高，不利于大規(guī)模生產(chǎn)；不僅如此，多年來的繁殖實(shí)驗(yàn)，還未 發(fā)現(xiàn)YY超雄魚具有和正常XY雄魚一樣的自然繁殖能力；而且黃顙魚精巢為 小葉型，在行人工繁殖時(shí)幾乎是無(wú)法擠出精液的，因此測(cè)交實(shí)驗(yàn)時(shí)，通常要 殺掉雄魚從精巢獲得精液進(jìn)行人工授精。因此無(wú)法通過測(cè)交實(shí)驗(yàn)直接獲得活 的YY超雄魚用于持續(xù)生產(chǎn)全雄魚苗。
綜上所述，要實(shí)現(xiàn)全雄黃顙魚苗的規(guī)?；a(chǎn)，急需一種經(jīng)濟(jì)、快捷、 準(zhǔn)確且不須殺害黃顙魚的YY超雄魚鑒定方法。隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展和成熟，利用DNA標(biāo)記鑒定性別成為可 能，為我們提供一種經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)捷并且準(zhǔn)確的遺傳性別鑒定手段，但前提是要先 篩選到性別特異DNA標(biāo)記。目前，在一些經(jīng)濟(jì)魚類中，通過各種DNA分子標(biāo) 記技術(shù)(RAPDs， RFLPs， SSRs， AFLPs等)篩選性別特異標(biāo)記已有許多報(bào) 道，如Kovacs等利用RAPD掃描非洲鯰魚(Clarias gariepinus) 雌、 雄基因池，找到兩個(gè)雄性性別相關(guān)的RAPD標(biāo)記；Sakamoto等發(fā)現(xiàn)兩個(gè)SSR 標(biāo)記(0royFGT19 TUF和0myRGT28 TUF )與雄性虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的性別決定位點(diǎn)相連鎖。同時(shí)，魚類的性別特異DNA標(biāo)記通常具 有物種或者品系特異性， 一種魚類的性別特異標(biāo)記通常不能跨物種使用，因 此要利用分子標(biāo)記實(shí)現(xiàn)黃顙魚的遺傳性別鑒定，首先要篩選到黃顙魚的性別 特異標(biāo)記。
AFLP分子標(biāo)記技術(shù)是一種基于PCR技術(shù)的多位點(diǎn)分子標(biāo)記技術(shù)，具有 顯示出很強(qiáng)多態(tài)性的能力。每對(duì)AFLP選擇性擴(kuò)增引物能夠獲得50-100個(gè)條 帶，通過有限的引物組合可以獲得大量的擴(kuò)增片段。因此AFLP分子標(biāo)記特 別適于對(duì)尚無(wú)分子遺傳信息背景的物種進(jìn)行研究。近五年來AFLP分子標(biāo)記 技術(shù)在篩選性別標(biāo)記研究中得到了較廣泛應(yīng)用，并且有一些成功的報(bào)道，如 Ezaz等用AFLP技術(shù)掃描尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus L.) 基因 組，找到3個(gè)Y染色體連鎖(0niY425. 0niY382. 0niY227) 和一個(gè)X染色 體連鎖(0niX420) 的AFLP標(biāo)記；Brunelli等應(yīng)用AFLP也找到了一個(gè)新 的大鱗大麻哈魚Y染色體特異的標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種黃顙魚性染色體特異分子標(biāo)記及遺傳 性別鑒定方法，方法簡(jiǎn)單，操作方便，結(jié)合傳統(tǒng)的YY超雄魚培育路線，可 以實(shí)現(xiàn)全雄黃顙魚魚苗的規(guī)模化生產(chǎn)，進(jìn)而為黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)提供全雄魚苗， 最終達(dá)到提高黃顙魚的產(chǎn)量，降低養(yǎng)魚的成本，提高了經(jīng)濟(jì)效益的目的。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施
如上所述，要實(shí)現(xiàn)全雄黃顙魚的大規(guī)模生產(chǎn)，其關(guān)鍵點(diǎn)在于急需一種經(jīng)
濟(jì)、快捷、準(zhǔn)確且不須殺害黃顙魚的YY超雄魚鑒定方法。因此，本發(fā)明通 過篩選獲得黃顙魚性染色體特異DNA標(biāo)記，并利用該標(biāo)記實(shí)現(xiàn)快捷準(zhǔn)確地鑒 定黃顙魚的遺傳性別，通過鑒定獲得大YY超雄魚用于全雄黃顙魚苗的生產(chǎn)。
本發(fā)明的基本構(gòu)思是首先，采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，篩選獲得黃顙 魚X和Y染色體特異AFLP標(biāo)記，轉(zhuǎn)化成簡(jiǎn)捷使用的SCAR標(biāo)記后，建立黃顙 魚性染色體基因型(XX/XY/YY) PCR鑒定方法;其次，將本方法應(yīng)用到全雄 黃顙魚培育中的遺傳性別鑒定，為全雄黃顙魚苗的生產(chǎn)提供可靠的YY超雄 魚。
本發(fā)明的方法是采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)篩選黃顙魚X和Y性染色體 特異AFLP標(biāo)記，克隆這些X或Y性染色體特異AFLP標(biāo)記并序列分析，通過 染色體步移克隆這些特異標(biāo)記DNA片段的側(cè)翼DNA序列，通過序列分析比 對(duì)，選擇適合設(shè)計(jì)引物的性染色體特異位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異引物，將這些標(biāo)記轉(zhuǎn) 化為方便使甩的SCAR標(biāo)記，結(jié)合X和Y染色體特異SCAR標(biāo)記，建立黃顙魚 性染色體基因型(XX/XY/YY) PCR鑒定方法，將本方法應(yīng)用到全雄黃顙魚培育中各種繁殖組合的遺傳性別鑒定，最終鑒定出YY超雄魚用于全雄黃顙魚 的生產(chǎn)。
因此，本發(fā)明包括四大步驟一)篩選和克隆黃顙魚XY性染色體特異
AFLP標(biāo)記；二)轉(zhuǎn)化為XY性染色體特異SACR標(biāo)記；三)建立黃顙魚性染 色體基因型PCR鑒定方法；四)在全雄黃顙魚培育中進(jìn)行遺傳性別鑒定。
上述的一)篩選和克隆黃顙魚XY性染色體特異AFLP標(biāo)記包括-
1. XY性染色體特異的AFLP標(biāo)記篩選；2.性染色體特異AFLP標(biāo)記的克 隆與序列分析；
其中上述的1. XY性染色體特異的AFLP標(biāo)記的篩選-
按照常規(guī)方法從黃顙魚M雌魚、XY雄魚和YY超雄魚尾鰭樣品中提取 基因組DNA，通過瓊脂糖電泳及分管光度計(jì)來檢測(cè)DNA的濃度，最終將DNA 濃度稀釋成30ng/ii 1。
AFLP篩選包括以下步驟1)使用商業(yè)上獲得的和限制性 內(nèi)切酶(NEB公司)對(duì)DNA模板進(jìn)行酶切，2)使用商業(yè)上獲得的T4 DNA連 接酶(NEB公司)，將特異接頭連接到酶切片段兩端，3)進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，4) 進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，5)電泳分析。
使用商業(yè)上獲得的&。 DNA聚合酶進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，采用上海生物工程 公司合成的AFLP引物(16個(gè)仏el序列引物分別與16個(gè)&oRI序列引物進(jìn) 行組合，共256個(gè)引物組合)，對(duì)黃顙魚8個(gè)XX雌魚，8個(gè)XY雄魚和8個(gè) YY超雄魚個(gè)體的基因組進(jìn)行AFLP擴(kuò)增分析。其中3個(gè)引物組合擴(kuò)增出2個(gè) X染色體特異AFLP片段和2個(gè)Y染色體特異AFLP片段。具體為編號(hào)62 引物組合(序列為SEQ ID NO. 1的上游引物E6和序列為SEQ ID NO. 2的下 游引物M2)在所有XY和YY個(gè)體中均擴(kuò)增出一個(gè)大小為233bp的特異片 段，同時(shí)編號(hào)33引物組合(序列為SEQ ID NO. 3的上游引物E3和序列為 SEQ ID NO. 4的下游引物M3)在所有XY和YY個(gè)體中均擴(kuò)增出一個(gè)大小為 226bp的特異片段，而這兩個(gè)特異片段在所有XX個(gè)體的擴(kuò)增產(chǎn)物中均不出 現(xiàn)，因此將這類只在所有XY和YY個(gè)體中出現(xiàn)，而在XX個(gè)體中不出現(xiàn)的片 段作為Y染色體特異AFLP片段；另外，編號(hào)62引物組合在所有XX和XY 個(gè)體中均擴(kuò)增出一個(gè)大小為239bp的特異片段，同時(shí)63號(hào)引物組合(序列 為SEQ ID NO. 1的上游引物E6和序列為SEQ ID NO. 4的下游引物M2)在 所有XX和XY個(gè)體中均擴(kuò)增出一個(gè)大小為226bp的特異片段，而這兩個(gè)片段 在所有YY個(gè)體中均不出現(xiàn)，因此將這類只在所有XX和XY個(gè)體中出現(xiàn)，而 在YY個(gè)體中不出現(xiàn)的片段作為X染色體特異AFLP片段。
其中上述的2.性染色體特異AFLP標(biāo)記的克隆與序列分析包括以下步 驟1)黃顙魚XY性染色體特異AFLP片段的回收；2)性染色體特異AFLP 片段的克??；3)性染色體特異AFLP片段的序列分析；
上述的1)黃顙魚XY性染色體特異AFLP片段的回收
AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，從聚丙烯酰胺凝膠切下XY性染色體特異 片段，用50iil單蒸水漂洗后，加入50yl單蒸水，并將凝膠搗碎，于 95'C中加熱15min,使目標(biāo)DNA片段從凝膠中釋放出來。短暫離心后，上清 溶液作為選擇性擴(kuò)增的模板，用每個(gè)特異片段所對(duì)應(yīng)的選擇性擴(kuò)增引物以及 同樣的PCR條件分別進(jìn)行再次AFLP選擇性擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)，紫外燈照射下從凝膠中切下 特異片段，通過凝膠回收試劑盒(Omega公司)回收純化特異片段備用。 上述的2)性染色體特異AFLP片段的克隆
將回收的4個(gè)特異片段連接到商業(yè)上獲得的pMD18-T載體(Takara公 司)后，采用標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5ci (購(gòu)自武漢大學(xué)菌種保藏 中心)，采用常規(guī)PCR法篩出含有目標(biāo)片段的陽(yáng)性克隆。
上述的3)性染色體特異AFLP片段的序列分析 選取陽(yáng)性克隆，送至上海聯(lián)合基因公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過 DNAMAN4. 0軟件分析(Lynnon公司)?？寺×松鲜?個(gè)黃顙魚Y染色體特 異AFLP片段和2個(gè)X染色體特異AFLP片段，分別命名為Pf-Y62、 Pf-Y33、 Pf-X62和Pf-X63，其序列分別為SEQ ID NO. 5、 SEQ ID NO. 6、 SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列。序列分析顯示性染色體特異 AFLP片段Pf-X62和Pf-Y62為黃顙魚X和Y染色體上的一對(duì)等位序列，它 們的序列差異在于6個(gè)堿基的插入或缺失以及1個(gè)堿基的替換；性染色體特 異AFLP片段Pf-X33和Pf-Y63也是黃顙魚X和Y染色體上的一對(duì)等位序 列，它們的序列差異在于l個(gè)堿基的替換。
上述的二)轉(zhuǎn)化為XY性染色體特異SACR標(biāo)記包括
l.染色體步移獲得性染色體特異片段的側(cè)翼序列；2.序列分析比對(duì)，選 擇性染色體特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物；3.轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記；
上述的1.染色體步移獲得性染色體特異片段的側(cè)翼序列
使用商業(yè)上獲得的染色體步移試劑盒(Genome Walking KU， Takara 公司)，通過三輪擴(kuò)增，克隆黃顙魚XY性染色體特異的2對(duì)等位序列的側(cè) 翼序列，按照試劑盒說明書的要求，其過程包括
1) SP1引物分別與本試劑盒中的AP1、 AP2、 AP3、 AP4引物組合，以黃 顙魚XX和YY個(gè)體基因組DNA為模板，進(jìn)行第一輪擴(kuò)增；
2) SP2引物分別與本試劑盒中的AP1、 AP2、 AP3、 AP4引物組合，以第 一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增；
3) SP3引物分別與本試劑盒中的AP1、 AP2、 AP3、 AP4引物組合，以第 二輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第三輪擴(kuò)增；
4) 第三輪擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離，切下清晰條帶，通過 瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit, Omiga公司)回收，并連 接到商業(yè)上獲得的pMD18-T載體(Takara公司)后，采用標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化感 受態(tài)大腸桿菌DH5ci (購(gòu)自武漢大學(xué)菌種保藏中心)，采用常規(guī)PCR法篩出
含有目標(biāo)片段的陽(yáng)性克隆。
上述的2.序列分析比對(duì)，選擇性染色體特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物 選取陽(yáng)性克隆，送至上海聯(lián)合基因公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過 DNAMAN4.0軟件(Lynnon公司)與原特異片段拼接和分析，最終獲得2對(duì) 性染色體特異的等位序列各約1.5Kb。從染色體步移獲得的側(cè)翼序列中選擇 X和Y染色體差異位點(diǎn)較為豐富的大小為311bp-624bp的片段用于序列分 析，其序列分別為SEQ ID NO. 9、 SEQ ID NO. 10、 SEQ ID NO. 11、 SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 13所示的核苷酸序列，其中SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10為同一個(gè)基因在X染色體上存在的2種大小的拷貝；通過分析比對(duì)性染色體特異等位序列分別在黃顙魚X和Y染色體上拷貝的序列差異，發(fā)現(xiàn)一 批穩(wěn)定的X和Y染色體序列差異位點(diǎn)，可以用來區(qū)分X或Y染色體；從中選
擇部分X和Y性染色體存在序列差異且適合設(shè)計(jì)引物的位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了 4對(duì)特 異引物，分別為-
1〉 Y染色體特異標(biāo)記Pf-Y62引物-
由序列為SEQ ID NO. 14的上游引物Pf-XY62L和序列為S￡Q ID NO, 15的下游引物Pf-Y62R組合；
2〉 X染色體特異標(biāo)記Pf-X62引物-
由序列為SEQ ID NO. 14的上游引物Pf-XY62L和序列為SEQ ID NO. 16的下游引物Pf-X62R組合；
3) Y染色體特異標(biāo)記Pf-Y33引物
由序列為SEQ ID NO. 17的上游引物Pf-Y33L和序列為SEQ ID NO. 18 的下游引物Pf-Y33R組合； 4) X染色體特異標(biāo)記Pf-X63引物
由序列為SEQ ID NO. 19的上游引物Pf-X63L和序列為SEQ ID NO. 20 的下游引物W-X63R組合；
上述的3.轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記
采用上一歩設(shè)計(jì)的4對(duì)性染色體特異標(biāo)記引物，在黃顙魚XX, XY和YY 個(gè)體基因組MA中擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25iii: 2.5iii iOXPCR buffer, 2. Ota 25mM Mgci" i(i TaqDNA聚合酶，0. 5"1 lOmM dNTP, 0.5uM上下游引物，20ng DNA，加水至25yl;擴(kuò)增條件分別為
Pf-Y62或Pf-X62: 94°C 30s ， 58°C 30s , 72°C 30s ,循環(huán)數(shù) 為36;
Pf-Y33或Pf-X63: 94。C 30s ， 65°C/-0. 5。C 30s , 72。C 30s , 循環(huán)數(shù)為iO; 94°C 30s , 60°C 30s ， 72。C 30s ，循環(huán)數(shù)為25;
擴(kuò)增結(jié)果顯示Pf-Y62引物組合可以從黃顙魚XY雄魚和YY超雄魚基 因組中擴(kuò)增出一個(gè)片段大小為S68bp的特異片段，Pf-Y33引物組合可以從 黃顙魚XY雄魚和超雄魚基因組中擴(kuò)增出一個(gè)片段大小為462bp的特異 諷A片段，而這兩個(gè)引物組合從XX雌魚個(gè)體基因組中則均不能擴(kuò)增出該特 異片段。Pf_X62引物組合可以從黃顙魚XX雌魚和XY雄魚基因組中擴(kuò)增出 —個(gè)片段大小為598bp或285bp的特異DNA片段，X63引物組合可以從 黃顙魚XX雌魚和XY雄魚基因組中擴(kuò)增出一個(gè)片段大小為462bP的特異DM 片段，而這兩個(gè)引物組合從YY超雄魚個(gè)體基因組中則均不能擴(kuò)增出該特異 片段。
上述的三)建立黃顙魚性染色體基因型PCR鑒定方法包括
1. 取樣和DNA提取..
采集黃顙魚尾鰭樣品，貯存于無(wú)水乙醇中，按照常規(guī)方法提取基因組,。
2. PCR反應(yīng)；
選用所設(shè)計(jì)的4個(gè)SC収標(biāo)記中的任意一個(gè)X染色體特異SCAR標(biāo)記和一 個(gè)Y染色體特異SCAR標(biāo)記作為組合，分別在待鑒定黃顙魚樣品基因組D隱中擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件均如步驟二)轉(zhuǎn)化為XY性染色體特異 SACR標(biāo)記中的3.轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記中所述的PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件。 3.結(jié)果判斷
根據(jù)每個(gè)樣品的擴(kuò)增結(jié)果來判斷其性染色體基因型只能夠擴(kuò)增出X染
色體特異SCAR特異標(biāo)記片段，而擴(kuò)增不出Y染色體特異SCAR標(biāo)記片段的個(gè) 體為遺傳XX個(gè)體；既能擴(kuò)增出X染色體特異SCAR標(biāo)記片段，又能擴(kuò)增出Y 染色體SCAR標(biāo)記片段的個(gè)體為遺傳XY個(gè)體；只能擴(kuò)增出Y染色體特異 SCAR標(biāo)記片段，而擴(kuò)增不出X染色體特異SCAR標(biāo)記片段的個(gè)體為遺傳YY個(gè)體。
上述的四)在全雄黃顙魚培育中進(jìn)行遺傳性別鑒定包括l.XX雌魚 XXY雄魚交配組合子代遺傳性別鑒定；2.XY雌魚雌核發(fā)育組合子代遺傳性 別鑒定；3.YY生理雌魚X XY雄魚交配組合子代遺傳性別鑒定；4.YY生理 雌魚XYY超雄魚交配組合子代遺傳性別鑒定；5. XX雌魚XYY超雄魚交配組 合子代遺傳性別鑒定。
上述步驟四)的l.XX雌魚XXY雄魚交配組合子代遺傳性別鑒定 待子代長(zhǎng)至性成熟，從外觀判斷待鑒定黃顙魚性別后，分別剪取雌、雄 黃顙魚尾鰭樣品，按常規(guī)方法提取基因組DNA。采用上述步驟三)所述的黃 顙魚性染色體基因型PCR鑒定方法，選用Y染色體特異SCAR標(biāo)記Pf-Y62 引物擴(kuò)增各樣品DNA，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判斷樣品的遺傳性別能夠擴(kuò)增出一個(gè) 大小為568bp特異片段的個(gè)體為遺傳XY魚，不能擴(kuò)增出該特異片斷的個(gè)體 為遺傳XX魚。結(jié)果顯示所有從外觀判斷為雄魚的個(gè)體均能擴(kuò)增出一個(gè)大 小為56Sbp特異片段，而從外觀判斷為雌魚的個(gè)體均不能擴(kuò)增出該特異片 段。因此，分子標(biāo)記鑒定出的遺傳性別與其性別表型完全一致(圖2)。 上述步驟四)的2. XY雌魚雌核發(fā)育組合子代遺傳性別鑒定-采集黃顙魚XY雌魚雌核發(fā)育子代XX雌魚、XY雄魚和YY超雄魚各12 尾(已通過測(cè)交實(shí)驗(yàn)鑒定個(gè)體遺傳性別)，剪取尾鰭樣品，按照常規(guī)方法提 取基因組DNA。采用上述步驟三)所述的黃顙魚性染色體基因型PCR鑒定方 法選用所設(shè)計(jì)的4個(gè)SCAR標(biāo)記所對(duì)應(yīng)的引物組合，分別在以上36個(gè)黃顙 魚樣品基因組DNA中擴(kuò)增。如步驟三)所述的方法，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判斷各樣 品的遺傳性別，結(jié)果顯示所有12個(gè)XX雌魚樣品均能夠擴(kuò)增出兩個(gè)X染色 體特異SCAR標(biāo)記片段，不能擴(kuò)增出Y染色體特異SCAR標(biāo)記片段；所有12 個(gè)XY雄魚樣品均既能擴(kuò)增出兩個(gè)X染色體特異SCAR標(biāo)記片段，又能擴(kuò)增出 兩個(gè)Y染色體SCAR標(biāo)記片段；所有12個(gè)YY超雄魚樣品均能擴(kuò)增出兩個(gè)Y 染色體特異SCAR標(biāo)記片段，擴(kuò)增不出X染色體特異SCAR標(biāo)記片段。因此， 由性染色體特異SCAR標(biāo)記鑒定出的各樣品遺傳性別與測(cè)交實(shí)驗(yàn)鑒定出的結(jié) 果完全一致(圖3)。
上述步驟四)的3. YY生理雌魚x XY雄魚交配組合子代遺傳性別鑒定 從YY雌魚x XY雄魚交配組合子代中抽取H4尾魚，剪取小片尾鰭，用 常規(guī)方法提取基因組DNA后，采用上述步驟三)所述的黃顙魚性染色體基因 型PCR鑒定方法選用Pf_Y62和Pf_X63標(biāo)記進(jìn)行遺傳性別鑒定。結(jié)果顯 示Pf-Y62引物組合在所有114個(gè)樣品中均能擴(kuò)增出一個(gè)片段大小為568bp 的特異片段；與此同時(shí)Pf-X63引物則只在57個(gè)樣品中能夠擴(kuò)增出一個(gè)片段大小為462bp的特異片段，其余57個(gè)樣品無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，說明在114尾子代 中有57尾(50%) YY超雄魚和57尾XY雄魚(圖4)。
上述步驟四)的4. YY生理雌魚xYY超雄魚交配組合子代遺傳性別鑒
定
從YY生理雌魚xYY超雄魚交配組合中抽取42尾子代，剪取小片尾鰭， 用常規(guī)方法提取基因組DNA。采用上述步驟三)所述的黃顙魚性染色體基因 型PCR鑒定方法選用Pf-Y62和Pf-X62兩個(gè)標(biāo)記進(jìn)行遺傳性別鑒定。兩 個(gè)標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果顯示，Pf-Y62引物組合在42個(gè)樣品中均能擴(kuò)增出一個(gè)片 段大小為568bp的Y染色體特異片段，而Pf-X62引物組合在42個(gè)樣品中 均無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，表明所有42尾子代均為YY超雄魚(圖5)。
上述步驟四)的5. XX雌魚xYY超雄魚交配組合子代遺傳性別鑒定 從上述步驟3和4所鑒定得到的YY超雄魚中各選取5尾YY超雄魚，性 成熟后分別與XX雌魚進(jìn)行交配。待測(cè)交子代長(zhǎng)至4個(gè)月時(shí)，隨機(jī)抽取400 尾仔魚，解剖后根據(jù)組織學(xué)判斷性腺為精巢或卵巢來判斷魚的性別。解剖結(jié) 果顯示，所有400尾魚均為雄魚；同時(shí)從中隨機(jī)抽取20尾魚剪取尾鰭，按 照常規(guī)方法提取基因組DNA，采用上述步驟三)所述的黃顙魚性染色體基因 型PCR鑒定方法，選用Pf-Y62標(biāo)記于20個(gè)樣品的基因組DNA中擴(kuò)增。結(jié) 果顯示，所有個(gè)體均能擴(kuò)增出一個(gè)片段大小為568bp的特異片段，說明它們 均為遺傳上的雄魚，同時(shí)再次說明了上述步驟3和4鑒定的YY超雄魚為遺 傳上的YY魚(圖6)。
本發(fā)明的特點(diǎn)是
G)首先篩選到黃顙魚X和Y染色體特異AFLP標(biāo)記，并將它們轉(zhuǎn)化成 方便使用的SCAR標(biāo)記，從而建立了黃顙魚性染色體基因型鑒定PCR方法；
(2) 首先通過上述方法鑒定出YY超雄魚，從而避免了通過測(cè)交實(shí)驗(yàn)鑒 定YY超雄魚所帶來的人力和物力的消耗，也避免了進(jìn)行測(cè)交實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)YY超 雄魚的傷害；
(3) 本發(fā)明所描述的分子標(biāo)記輔助的全雄黃顙魚培育方法目前在國(guó)內(nèi) 外均無(wú)報(bào)道，本方法具有高效、準(zhǔn)確、穩(wěn)定和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，推廣后將有助于 實(shí)現(xiàn)全雄黃顙魚苗的規(guī)?；a(chǎn)，顯著提高黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)的生產(chǎn)效率。同時(shí) 本方法也可推廣到其它經(jīng)濟(jì)魚類的性別控制育種中，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和 社會(huì)價(jià)值。


圖1 A.黃顙魚性染色體特異標(biāo)記片段的序列比對(duì)分析(Pf62XS和 Pf62XL分別為Pf-X62標(biāo)記在X染色體上兩種不同大小拷貝的序列；Pf62Y 為Pf-Y62標(biāo)記在Y染色體上的序列)；黑色背景的堿基為三個(gè)序列相同位 點(diǎn)，其余藍(lán)白色背景的堿基為差異位點(diǎn)。方框內(nèi)為設(shè)計(jì)的性染色體特異引物 位點(diǎn)。
B.Pf-Y33和Pf-X33標(biāo)記的DNA序列分析(33X為X染色體特異的拷 貝，33Y為Y染色體特異的拷貝)。黑色背景的堿基為三個(gè)序列相同位點(diǎn)， 其余藍(lán)白色背景的堿基為差異位點(diǎn)。方框內(nèi)為性染色體特異引物位點(diǎn)。圖2應(yīng)用Y染色體特異SCAR標(biāo)記Pf-Y62鑒定XX雌魚XXY雄魚交配 組合子代的遺傳性別。
圖3利用X和Y性染色體特異SCAR標(biāo)記鑒定XY生理雌魚雌核發(fā)育組合 子代的遺傳性別。
圖4利用性染色體特異SCAR標(biāo)記Pf-Y62和Pf-X63鑒定YY生理雌魚 與XY正常雄魚交配組合子代的遺傳性別。
圖5利用性染色體特異SCAR標(biāo)記Pf-Y62和Pf-X62鑒定YY生理雌魚 與YY超雄魚交配組合子代的遺傳性別。
圖6利用性染色體特異SCAR標(biāo)記Pf-Y62鑒定YY超雄魚與正常XX雌 魚交配組合子代的遺傳性別。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
一種黃顙魚性染色體特異分子標(biāo)記及遺傳性別鑒定方法，其步驟是
本發(fā)明包括四大步驟 一)篩選和克隆黃顙魚XY性染色體特異AFLP標(biāo) 記；二)轉(zhuǎn)化為XY性染色體特異SACR標(biāo)記；三)建立黃顙魚性染色體基因 型PCR鑒定方法；四)在全雄黃顙魚培育中進(jìn)行遺傳性別鑒定。
上述的一)篩選和克隆黃顙魚XY性染色體特異AFLP標(biāo)記，包括 1. XY性染色體特異的AFLP標(biāo)記篩選；2.性染色體特異AFLP標(biāo)記的克 隆與序列分析；
其中上述的1. XY性染色體特異的AFLP標(biāo)記篩選
按照常規(guī)方法從黃顙魚XX雌魚、XY雄魚和YY超雄魚尾鰭樣品中提取 基因組DNA，通過瓊脂糖電泳及分管光度計(jì)來檢測(cè)DNA的濃度，最終將DNA 濃度稀釋成30ng/u 1。
AFLP篩選包括以下步驟
1) 基因組DNA模板酶切
使用商業(yè)上獲得的ifeel和AcoRI限制性內(nèi)切酶(NEB公司)各5U，同 時(shí)對(duì)300ng基因組DNA進(jìn)行雙酶切，酶切條件為37°C，反應(yīng)3小時(shí)后70°C 對(duì)限制性內(nèi)切酶滅活15min。
2) 將特異接頭連接到酶切片段兩端 商業(yè)上合成特異接頭，
五coRI接頭5隱CTC GTA GAC TGC GTA CC-3
CAT CTG ACG CAT GG Myd接頭5-GACG ATG AGT CCT GAG-3 TAC TCA GGA CTC15 向上一步酶切產(chǎn)物中分別加入Mwl接頭(50^M)和￡coRI接頭 (5|aM)各lpl，商業(yè)上獲得的T4 DNA連接酶(NEB公司)0.2ul， 13. 8ul單蒸水，4.0iil buffer。 4°C反應(yīng)過夜。
3) 進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增 一 使用商業(yè)上獲得的7a《DNA聚合酶(Fermanta公司)進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增；將
上述的連接產(chǎn)物稀釋10倍，作為預(yù)擴(kuò)增的模板；預(yù)擴(kuò)增引物為商業(yè)上合成 的引物 (E+l: 5'GACTGCGTACCAATTCA3' ， M+l : 5'GATGAGTCCTGAGTAAC3')進(jìn)行擴(kuò)增。E—AAT E—ACC E-AGA
E—ATC E-ATG E—ATT
M-CCC M—CGC
M-CCG M-CGG
M-CCT M—CGT
4) 進(jìn)行選擇性擴(kuò)增
使用商業(yè)上獲得的DNA聚合酶進(jìn)行選擇性擴(kuò)增；將上述預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物 稀釋20倍，作為選擇性擴(kuò)增的模板；引物為預(yù)擴(kuò)增引物3'末端加上2個(gè) 隨機(jī)堿基，通過商業(yè)合成的Msd和五coRI選擇性擴(kuò)增引物各16個(gè)，共組合 成256個(gè)引物組合進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。
16個(gè)￡coRI選擇性擴(kuò)增引物為
E+3.- 5'-GACTGCGTACCAATTCANN-3'
E-AAC E-AAG E-ACA E-ACT E-AAA E-AGT
E-ACC E-ACG E-AGC E-AGG E-ATA 16個(gè)^&d選擇性擴(kuò)增引物為 M+3: 5'-GATGAGTCCTGAGTAAC剛-3' M-CAA M-CAC M-CAG M-CAT M-CCA M-CTA M-CTC M-CTG M-CTT M-CGA
5) 電泳分析
往上述選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物加入1/5體積的6X Loading buffer (Takara 公司)上樣液，94'C變性5分鐘后，迅速置于冰上待用。將6%的聚丙烯酰 胺凝膠預(yù)電泳，預(yù)電泳條件為恒功率100W， l小時(shí)；然后將變性好的選擇 性擴(kuò)增產(chǎn)物移到凝膠上電泳，電泳條件為恒定功率90W，溫度50°C, 2.5 小時(shí)。
電泳結(jié)束后釆用銀染法，對(duì)聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行銀染將分離好的6% 聚丙烯酰胺凝膠在2升P/()乙酸中固定30min;單蒸水漂洗后，置于銀染液 (2000ml單蒸水+3ml甲醛+2g硝酸銀)中銀染30min;單蒸水漂洗后，放 入預(yù)冷的顯影液(2000ml單蒸水+3ml甲醛+10g NaOH)中顯色至電泳條帶 清晰后，將凝膠取出用單蒸水漂洗，停止顯色。將凝膠自然風(fēng)干后通過肉眼 進(jìn)行條帶分析篩選。
使用商業(yè)上獲得的7^ DNA聚合酶進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，采用上海生物工程 公司合成的AFLP引物(16個(gè)i&el序列引物分別與16個(gè)化oRI序列引物進(jìn) 行組合，共256個(gè)引物組合)，對(duì)黃顙魚8個(gè)XX雌魚，8個(gè)XY雄魚和8個(gè) YY超雄魚個(gè)體的基因組進(jìn)行AFLP擴(kuò)增分析。其中3個(gè)引物組合擴(kuò)增出2個(gè) X染色體特異AFLP片段和2個(gè)Y染色體特異AFLP片段。具體為編號(hào)62 引物組合(序列為SEQ ID NO. 1的上游引物E6和序列為SEQ ID NO. 2的下 游引物M2)在所有XY和YY個(gè)體中均擴(kuò)增出一個(gè)大小為233bp的特異片 段，同時(shí)編號(hào)33引物組合(序列為SEQ ID NO. 3的上游引物E3和序列為 SEQ ID NO. 4的下游引物M3)在所有XY和YY個(gè)體中均擴(kuò)增出一個(gè)大小為 226bp的特異片段，而這兩個(gè)特異片段在所有XX個(gè)體的擴(kuò)增產(chǎn)物中均不出 現(xiàn)，因此將這類只在所有XY和YY個(gè)體中出現(xiàn)，而在XX個(gè)體中不出現(xiàn)的片 段作為Y染色體特異AFLP片段；另外，編號(hào)62引物組合在所有XX和XY 個(gè)體中均擴(kuò)增出一個(gè)大小為239bp的特異片段，同時(shí)63號(hào)引物組合(序列 為SEQ ID NO. 1的上游引物E6和序列為SEQ ID NO. 4的下游引物M2)在 所有XX和XY個(gè)體中均擴(kuò)增出一個(gè)大小為226bp的特異片段，而這兩個(gè)片段 在所有YY個(gè)體中均不出現(xiàn)，因此將這類只在所有XX和XY個(gè)體中出現(xiàn)，而 在YY個(gè)體中不出現(xiàn)的片段作為X染色體特異AFLP片段。其中上述的2.性染色體特異AFLP標(biāo)記的克隆與序列分析包括以下步 驟1)黃顙魚XY性染色體特異AFLP片段的回收；2)性染色體特異AFLP 片段的克?。?)性染色體特異AFLP片段的序列分析；
上述的l)黃顙魚XY性染色體特異AFLP片段的回收-
AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，從聚丙烯酰胺凝膠切下XY性染色體特異 片段，用50ixl單蒸水漂洗后，加入50yl單蒸水，并將凝膠搗碎，于 95'C中加熱15min，使目標(biāo)DNA片段從凝膠中釋放出來。短暫離心后，上清 溶液作為選擇性擴(kuò)增的模板，用每個(gè)特異片段所對(duì)應(yīng)的選擇性擴(kuò)增引物以及 同樣的PCR條件分別進(jìn)行再次AFLP選擇性擴(kuò)增。
擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)，紫外燈照射下從凝膠中切下 特異片段，通過凝膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit, Omega公司)回 收純化特異片段備用。
上述的2)性染色體特異AFLP片段的克隆
將回收的4個(gè)特異片段連接到商業(yè)上獲得的pMD18-T載體(購(gòu)自 Takara公司)后，采用標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 a (購(gòu)自武漢大學(xué) 菌種保藏中心)，采用常規(guī)PCR法篩出含有目標(biāo)片段的陽(yáng)性克隆。
上述的3)性染色體特異AFLP片段的序列分析 選取陽(yáng)性克隆，送至上海聯(lián)合基因公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過 DNAMAN4. 0軟件分析(Lynnon公司)?？寺×松鲜?個(gè)黃顙魚Y染色體特 異AFLP片段和2個(gè)X染色體特異AFLP片段，分別命名為Pf-Y62、 Pf-Y33、 Pf-X62和Pf-X63，其序列分別為SEQ ID NO. 5、 SEQ ID NO. 6、 SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列。序列分析顯示性染色體特異 AFLP片段Pf-X62和Pf-Y62為黃顙魚X和Y染色體上的一對(duì)等位序列，它 們的序列差異在于6個(gè)堿基的插入或缺失以及1個(gè)堿基的替換；性染色體特 異AFLP片段Pf-X33和Pf-Y63也是黃顙魚X和Y染色體上的一對(duì)等位序 列，它們的序列差異在于1個(gè)堿基的替換。
上述的二)轉(zhuǎn)化為XY性染色體特異SACR標(biāo)記包括
l.染色體步移獲得性染色體特異片段的側(cè)翼序列；2.序列分析比對(duì)，選 擇性染色體特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物；3.轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記；
上述的1.染色體步移獲得性染色體特異片段的側(cè)翼序列
使用商業(yè)上獲得的染色體步移試劑盒(Genome Walking Kit, Takara 公司)，通過三輪擴(kuò)增，克隆黃顙魚XY性染色體特異的2對(duì)等位序列的側(cè) 翼序列，按照試劑盒說明書的要求，其過程包括
1) SP1引物分別與本試劑盒中的AP1、 AP2、 AP3、 AP4引物組合，以黃 顙魚XX和YY個(gè)體基因組DNA為模板，進(jìn)行第一輪擴(kuò)增；
2) SP2引物分別與本試劑盒中的AP1、 AP2、 AP3、 AP4引物組合，以第 一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增
3) SP3引物分別與本試劑盒中的AP1、 AP2、 AP3、 AP4引物組合，以第 二輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第三輪擴(kuò)增；
4) 第三輪擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離，切下清晰條帶，通過 凝膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit, Omega公司)回收，并連接到商 業(yè)上獲得的pMD18-T載體(購(gòu)自Takara公司)后，采用標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a (購(gòu)自武漢大學(xué)菌種保藏中心)，采用常規(guī)PCR法篩出含 有目標(biāo)片段的陽(yáng)性克隆。
上述的2.序列分析比對(duì)，選擇性染色體特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物-
選取陽(yáng)性克隆，送至上海聯(lián)合基因公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過 DN認(rèn)AN4. 0軟件(Lynnon公司)與原特異片段拼接和分析，最終獲得2對(duì) 性染色體特異的等位序列各約1.5Kb。從染色體步移獲得的側(cè)翼序列中選擇 X和Y染色體差異位點(diǎn)較為豐富的大小為311bp-624bp的片段用于序列分 析，其序列分別為SEQ ID NO. 9、 SEQ ID NO. 10、 SEQ ID NO. 11、 SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 13所示的核苷酸序列，其中SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10為同一個(gè)基因在X染色體上存在的2種大小的拷貝；通過分析比對(duì)性 染色體特異等位序列分別在黃顙魚X和Y染色體上拷貝的序列差異，發(fā)現(xiàn)一 批穩(wěn)定的X和Y染色體序列差異位點(diǎn)，用來區(qū)分X或Y染色體；從中選擇部 分X和Y性染色體存在序列差異且適合設(shè)計(jì)引物的位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了 4對(duì)特異引 物，分別為-
1 ) Y染色體特異標(biāo)記Pf-Y62引物
由序列為SEQ ID NO. 14的上游引物Pf-XY62L和序列為SEQ ID NO. 15的下游引物Pf-Y62R組合；
2) X染色體特異標(biāo)記Pf-X62引物
由序列為SEQ ID NO. 14的上游引物Pf-XY62L和序列為SEQ ID NO. 16的下游引物Pf-X62R組合；
3) Y染色體特異標(biāo)記Pf-Y33引物
由序列為SEQ ID NO. 17的上游引物Pf-Y33L和序列為SEQ ID NO. 18 的下游引物Pf-Y33R組合；
4) X染色體特異標(biāo)記Pf-X63引物
由序列為SEQ ID NO. 19的上游引物Pf-X63L和序列為SEQ ID NO. 20 的下游引物Pf-X63R組合;
上述的3.轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記
采用上一步設(shè)計(jì)的4對(duì)性染色體特異標(biāo)記引物，在黃顙魚XX， XY和YY 個(gè)體基因組DNA中擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25ul: 2. 5 ixl 10XPCR buffer, 2.0ul 25mM Mgcl2， 1U TaqDNA聚合酶，0.5nl 10mM dNTP， 0.5uM上下游引物，20ng DNA，加水至25iil;擴(kuò)增條件分別為
Pf-Y62或Pf-X62: 94°C 30s , 58°C 30s ， 72°C 30s ，循環(huán)數(shù) 為36;
Pf-Y33或Pf-X63: 94°C 30s ， 65。C/-0. 5°C 30s ， 72°C 30s ， 循環(huán)數(shù)為10; 94°C 30s ， 60°C 30s ， 72°C 30s ，循環(huán)數(shù)為25;
擴(kuò)增結(jié)果顯示Pf-Y62引物組合可以從黃顙魚XY雄魚和YY超雄魚基 因組中擴(kuò)增出一個(gè)片段大小為568bp的特異片段，Pf-Y33引物組合可以從 黃顙魚XY雄魚和YY超雄魚基因組中擴(kuò)增出一個(gè)片段大小為化2bp的特異 DNA片段，而這兩個(gè)引物組合從XX雌魚個(gè)體基因組中則均不能擴(kuò)增出該特 異片段。Pf-X62引物組合可以從黃顙魚XX雌魚和XY雄魚基因組中擴(kuò)增出 一個(gè)片段大小為598bp或285bp的特異DNA片段，Pf-X63引物組合可以從 黃顙魚XX雌魚和XY雄魚基因組中擴(kuò)增出一個(gè)片段大小為462bp的特異DNA片段，而這兩個(gè)引物組合從YY超雄魚個(gè)體基因組中則均不能擴(kuò)增出該特異 片段。
上述的三)建立黃顙魚性染色體基因型PCR鑒定方法包括
1. 取樣和DNA提取
采集黃顙魚尾鰭樣品，貯存于無(wú)水乙醇中，按照常規(guī)方法提取基因組
DNA。
2. PCR反應(yīng)
選用所設(shè)計(jì)的4個(gè)SCAR標(biāo)記中的任意一個(gè)X染色體特異SCAR標(biāo)記和一 個(gè)Y染色體特異SCAR標(biāo)記作為組合，分別在待鑒定黃顙魚樣品基因組DNA 中擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件均如步驟二)轉(zhuǎn)化為XY性染色體特異 SACR標(biāo)記中的3.轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記中所述的PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件。
3. 結(jié)果判斷
根據(jù)每個(gè)樣品的擴(kuò)增結(jié)果來判斷其性染色體基因型只能夠擴(kuò)增出X染 色體特異SCAR特異標(biāo)記片段，而擴(kuò)增不出Y染色體特異SCAR標(biāo)記片段的個(gè) 體為遺傳XX個(gè)體；既能擴(kuò)增出X染色體特異SCAR標(biāo)記片段，又能擴(kuò)增出Y 染色體SCAR標(biāo)記片段的個(gè)體為遺傳XY個(gè)體；只能擴(kuò)增出Y染色體特異 SCAR標(biāo)記片段，而擴(kuò)增不出X染色體特異SCAR標(biāo)記片段的個(gè)體為遺傳YY 個(gè)體。
上述的四)在全雄黃顙魚培育中進(jìn)行遺傳性別鑒定包括l.XX雌魚 XXY雄魚交配組合子代遺傳性別鑒定；2.XY雌魚雌核發(fā)育組合子代遺傳性 別鑒定；3.YY生理雌魚X XY雄魚交配組合子代遺傳性別鑒定；4. YY生理 雌魚XYY超雄魚交配組合子代遺傳性別鑒定；5. XX雌魚XYY超雄魚交配組 合子代遺傳性別鑒定。
上述步驟四)的l.XX雌魚XXY雄魚交配組合子代遺傳性別鑒定 待子代長(zhǎng)至性成熟，從外觀判斷待鑒定黃顙魚性別后，分別剪取雌、雄 黃顙魚尾鰭樣品，按常規(guī)方法提取基因組DNA。采用上述步驟三)所述的黃 顙魚性染色體基因型PCR鑒定方法，選用Y染色體特異SCAR標(biāo)記Pf-Y62 引物擴(kuò)增各樣品DNA，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判斷樣品的遺傳性別能夠擴(kuò)增出一個(gè) 大小為568bp特異片段的個(gè)體為遺傳XY魚，不能擴(kuò)增出該特異片斷的個(gè)體 為遺傳XX魚。結(jié)果顯示所有從外觀判斷為雄魚的個(gè)體均能擴(kuò)增出一個(gè)大 小為568bp特異片段，而從外觀判斷為，雌魚的個(gè)體均不能擴(kuò)增出該特異片 段。因此，分子標(biāo)記鑒定出的遺傳性別與其性別表型完全一致(圖2)。 上述步驟四)的2. XY雌魚雌核發(fā)育組合子代遺傳性別鑒定 采集黃顙魚XY雌魚雌核發(fā)育子代XX雌魚、XY雄魚和YY超雄魚各12 尾(己通過測(cè)交實(shí)驗(yàn)鑒定個(gè)體遺傳性別)，剪取尾鰭樣品，按照常規(guī)方法提 取基因組DNA。采用上述步驟三)所述的黃顙魚性染色體基因型PCR鑒定方 法選用所設(shè)計(jì)的4個(gè)SCAR標(biāo)記所對(duì)應(yīng)的引物組合，分別在以上36個(gè)黃顙 魚樣品基因組DNA中擴(kuò)增。如步驟三)所述的方法，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判斷各樣 品的遺傳性別，結(jié)果顯示所有12個(gè)XX雌魚樣品均能夠擴(kuò)增出兩個(gè)X染色 體特異SCAR標(biāo)記片段，不能擴(kuò)增出Y染色體特異SCAR標(biāo)記片段；所有12 個(gè)XY雄魚樣品均既能擴(kuò)增出兩個(gè)X染色體特異SCAR標(biāo)記片段，又能擴(kuò)增出兩個(gè)Y染色體SCAR標(biāo)記片段；所有12個(gè)YY超雄魚樣品均能擴(kuò)增出兩個(gè)Y 染色體特異SCAR標(biāo)記片段，擴(kuò)增不出X染色體特異SCAR標(biāo)記片段。因此， 由性染色體特異SCAR標(biāo)記鑒定出的各樣品遺傳性別與測(cè)交實(shí)驗(yàn)鑒定出的結(jié) 果完全一致(圖3)。
上述步驟四)的3. YY生理雌魚x XY雄魚交配組合子代遺傳性別鑒定-從YY雌魚x XY雄魚交配組合子代中抽取114尾魚，剪取小片尾鰭，用 常規(guī)方法提取基因組DNA后，采用上述步驟三)所述的黃顙魚性染色體基因 型PCR鑒定方法選用Pf-Y62和Pf-X63標(biāo)記進(jìn)行遺傳性別鑒定。結(jié)果顯 示Pf-Y62引物組合在所有114個(gè)樣品中均能擴(kuò)增出一個(gè)片段大小為568bp 的特異片段；與此同時(shí)Pf-X63引物則只在57個(gè)樣品中能夠擴(kuò)增出一個(gè)片段 大小為462bp的特異片段，其余57個(gè)樣品無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，說明在114尾子代 中有57尾(50%) YY超雄魚和57尾XY雄魚(圖4)。
上述步驟四)的4. YY生理雌魚xYY超雄魚交配組合子代遺傳性別鑒
定
從YY生理雌魚xYY超雄魚交配組合中抽取42尾子代，剪取小片尾鰭， 用常規(guī)方法提取基因組DNA。采用上述步驟三)所述的黃顙魚性染色體基因 型PCR鑒定方法選用Pf-Y62和Pf-X62兩個(gè)標(biāo)記進(jìn)行遺傳性別鑒定。兩 個(gè)標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果顯示，Pf-Y62引物組合在42個(gè)樣品中均能擴(kuò)增出一個(gè)片 段大小為568bp的Y染色體特異片段，而Pf-X62引物組合在42個(gè)樣品中 均無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，表明所有42尾子代均為YY超雄魚(圖5)。
上述步驟四)的5. XX雌魚xYY超雄魚交配組合子代遺傳性別鑒定 從上述步驟3和4所鑒定得到的YY超雄魚中各選取5尾YY超雄魚，性 成熟后分別與XX雌魚進(jìn)行交配。待測(cè)交子代長(zhǎng)至4個(gè)月時(shí)，隨機(jī)抽取400 尾仔魚，解剖后根據(jù)組織學(xué)判斷性腺為精巢或卵巢來判斷魚的性別。解剖結(jié) 果顯示，所有400尾魚均為雄魚；同時(shí)從中隨機(jī)抽取20尾魚剪取尾鰭，按 照常規(guī)方法提取基因組DNA，釆用上述步驟三)所述的黃顙魚性染色體基因 型PCR鑒定方法，選用Pf-Y62標(biāo)記于20個(gè)樣品的基因組DNA中擴(kuò)增。結(jié) 果顯示，所有個(gè)體均能擴(kuò)增出一個(gè)片段大小為568bp的特異片段，說明它們 均為遺傳上的雄魚，同時(shí)再次說明了上述步驟3和4鑒定的YY超雄魚為遺 傳上的YY魚(圖6)。SEQUENCE LISTING
<110>中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所
〈120〉 黃顙魚性染色體特異分子標(biāo)記及遺傳性別鑒定方法 〈130〉 黃顙魚性染色體特異分子標(biāo)記及遺傳性別鑒定方法 <160> 20
〈170〉 Patentln version 3.5
<210> 1 〈211〉 19 <212> 腿 <213> 人工序列 <400> 1
gactgcgtac caattcacg 19
<210> 2 <211〉 19 <212> DNA 〈213〉 人工序列 <400> 2
gatgagtcct gagtaacac 19
<210> 3 〈211〉 19 〈212〉 DNA 〈213> 人工序列 <400〉 3
gactgcgtac caattcaca 19
<210> 4
〈211〉 19
〈212〉 隨
〈213〉 人工序列'i'
〈400〉 4
gatgagtcct gagtaacag 19
<210〉 5 〈211〉 211 <212> DNA
〈213> Pelteobagrus fulvidraco 〈400〉 5
gaattcacgg tccttctgtt cgggctcgcg ctgagtccga ggacgttctg tctgtgtttg 60 gaggcagggc ttgcgccgct gagaatagca ggtctcagga tcctgactta catagacgac 120tggcttatta tagccgattcgagagagaatgttttcaaaacactgcccgtgtgctctcac180
acatcactcg gtttcagagtcaatgtgttaa211
〈210〉 6
<211〉 204
<212> 腿
<213〉 Pelteobagrus fulvidraco
<400〉 6
ttaacagacc agagtgccagcaactgctgcctcgtccttgttcctaagcctgtcccctcg60
gccactgagg gatgacacacaactcctaca^aagtcacttttagtatagcattactttgta120
tttagccttg catcagtgtcattgggagstgttagatgttgtttttacagaatgagctgt180
actagagtca ttagtgtgaattcc204
<210> 7
<211> 217
<212〉 腿
<213〉 Pelteobagrus fulvidraco
<400〉 7
gaattcacgg tccttctgttcgggctcgcgctgagtccgaggacgttctgtctgtgtttg60
gaggcagggc ttgcgccgctgagaatagcaggtctcaggatcctgacttacatagacgac120
tggcttatta tagcctattcg3gagagaatgtgtttcaaaacactgcccgtgtgctctca180
cacatcactg cgctcggtttcagagtcaatgtgttaa217
<210〉 8
<211〉 204
<212> DNA
<213〉 Pelteobagrus fulvidraco
<400> 8
ttaacagacc agagtgccagcaactgctgcctcgtccttgttcctaagcctgtcccctcg60
gccactgagg gatgacacacaactcctacaaagtcacttttagtatagcattactttgta120
tttagccttg catcagtgtcattgggagatgttagatgttgtttttacagaatgagctgt180
actagagtca ttagcgtgaattcc204
〈210〉 9
<211> 311
〈212〉 DNA'
〈213〉 Pelteobagrus fulvidraco
<400> 9
tagagagatg aagaagggggacaaggctttcaaactgtgtcttcctaggaacccggcaca60
gcgccagacg ccatctaacaggacctaacgctcctgttgcaggacgccagtcccactaca120
ctggcaggtc caacaaaccccgtgggsaaccacaggctcagcagagaccccccccccccc180
cacatgttca ataaaggttacggccccagttttccacaaaaaaaattatgaaaacttctc240
tggUtggcc actggatggcaccgtcgcgccatcaatgaacagattgggtgattcacacc300gtcacgaggg g 311
<210> 10
<211> 624
<212> 隨
<213> Pelteobagrus fulvidraco
<400〉 10
tagagagatgcaaactgtgtcttcctaggaacccggcaca60
gcgccagaxgccatctgggcagccgcctaacgctgttgcaggacgccagtcccactacac120
tggcaggtccgtgggaaaccacaggctcagcagagaccac180
taagccctggggtaagatgtctctcggaagcctcccgtccccactccctctgttccgaaa240
cgemagcggccgacctgatgttctgcctctggggtttttttcattccgcgttcatgggtg300
gccagccctctggacacctgttctaccctccaggttcacccgtccaaaagacggaggttt360
tccttcgaggatcatcctttgttccgcacaggtttcaccgttccccttgtcgcccagagt420
gccttccccgttgggg犯gtatgtgggattga^tgcagaagcgtcacc犯aacacccccc480
ttcacactcctctcacatgtttacggccccaaaaaaaatt540
atgaaaacttctctggtttggccactggatggcaccgtcggaacagattg600
ggtgattcacaccgtcacgagggg624
〈210> 11
<211> 594
<212> 腿
<213〉 Pelteobagrus fulvidraco
<400> 11
aa^aagggggacaaggctttcaaactgtgtcttcctaggaagccggcaca60
gcgccagacgccatctgggcagccgcctaacgctcctgctgcgggagcagtgggaaccac120
eiggctcagcagagacacccccccccccceitaagccctggggtaagatgtctctcggaagc180
ctcccgtccccactccctctgttccgaaacgaaagcggccgacctgatgttctgcctctg240
gggtttttttcattccgcgttcatgggcggccagccctccggacacctgttctaccctcc300
aggttcacccatcc肪aagacggaggttctccttcgaggattccgcacag360
gtttcaccgttccccgtgtcgcacagagtgccttccccgctggggaagtatgtgggattg420
agtgcagaagcagcgtcaccaaeic3ccccccttcacactcctctcacatgttcaataaag480
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ggC3CCgtCCagccatcaatgaacagattgggtgattcacaccgtcacgagggg594
<210〉 12
〈211〉 477
〈212〉 DNA
<213〉 Pelteobagrus fulvidraco
〈400〉 12
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aattgcttgatgtcatgtgagatttgcatcaagccctaca120
tttcccacctatttatttcctttaa_teLtatgcctcttcctttcttggcctgttttcctct180
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cagtcattttactgaccacgactctttcaggtcagtctcaatgggttgga477
<210> 13
<211> 477
<212〉 DNA
<213〉 Pelteobagrus fulvidraco
〈400〉 13
3c3ga^tgagctgtactagagtcattagtgtgaattcctatactcatacaaaaacttata60
aattgcttgatgtcatgtg3gatttgcatcataatcatggaagccctaca120
tttcccacctatttatttcctttaatatatgcctcttcctUcttggcctgttttcctct180
gtcaggtgacattgttctgatcactaagcccatggcaatatcggagggggagagtgttgt240
ggcattctgatggctacagag組cagttgagcttgtcta300
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tctgctctct"cacccagatggatgtggcttcaxaccgagtgtgctacactcacgacaa420
cagtcattttactgaccacgactcttta8ggtcagtctcaatgggttggaa^cawtc477
<210〉 14
<211〉 24
<212〉 DNA
<213> 人工序列
<柳〉14
,agggggscaag24
<210> 15
〈211〉 20
<212〉 DNA
<213〉 人工序列
<400〉 15
20
〈210〉 16、
<211〉 20
<212> DNA
<213〉 人工序列
<400〉 16
aatctgttcattgatggcgc20
<210> 17 〈211〉 22〈212〉 DNA <213〉 人工序列 <400〉 17
gagctgtact 3gagtc3tta gt 22
<210> 18 <211> 22 <212〉 DNA <213> 人工序列 <400〉 18
ccaacccatt gagactgacc tt 22
〈210〉 19 <211> 22 <212〉 醒 <213〉 人工序列 <400〉 19
gagctgtact agagtc3tt3 gc 22
〈210〉 20 <211> 22 <212〉 DNA <213> 人工序列 <400〉 20
ccaacccatt gagactgacc tg 2權(quán)利要求
1、一種黃顙魚性染色體特異分子標(biāo)記及遺傳性別鑒定方法，它包括以下步驟A. 篩選和克隆黃顙魚XY性染色體特異AFLP標(biāo)記，首先是XY性染色體特異的AFLP標(biāo)記篩選，從黃顙魚XX雌魚、XY雄魚和YY超雄魚尾鰭樣品中提取基因組DNA，通過瓊脂糖電泳及分管光度計(jì)來檢測(cè)DNA的濃度，最終將DNA濃度稀釋成30ng/μl，AFLP篩選包括以下步驟1)使用MseI和EcoRI限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA模板進(jìn)行酶切；2)使用T4DNA連接酶，將特異接頭連接到酶切片段兩端；3)進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增；4)進(jìn)行選擇性擴(kuò)增；5)電泳分析；使用256個(gè)引物組合進(jìn)行AFLP選擇性擴(kuò)增，其中3個(gè)引物組合擴(kuò)增出2個(gè)X染色體特異AFLP片段和2個(gè)Y染色體特異AFLP片段，為編號(hào)62引物組合，序列為SEQ IDNO.1的上游引物E6和序列為SEQ ID NO.2的下游引物M2，在所有XY和YY個(gè)體中均擴(kuò)增出一個(gè)大小為233bp的特異片段，同時(shí)編號(hào)33引物組合，序列為SEQID NO.3的上游引物E3和序列為SEQ ID NO.4的下游引物M3，在所有XY和YY個(gè)體中均擴(kuò)增出一個(gè)大小為226bp的特異片段，這兩個(gè)特異片段在所有XX個(gè)體的擴(kuò)增產(chǎn)物中不出現(xiàn)，將這類只在所有XY和YY個(gè)體中出現(xiàn)，在XX個(gè)體中不出現(xiàn)的片段作為Y染色體特異AFLP片段；另外，編號(hào)62引物組合，在所有XX和XY個(gè)體中均擴(kuò)增出一個(gè)大小為239bp的特異片段，同時(shí)63號(hào)引物組合，序列為SEQ ID NO.1的上游引物E6和序列為SEQ ID NO.4的下游引物M2，在所有XX和XY個(gè)體中均擴(kuò)增出一個(gè)大小為226bp的特異片段，這兩個(gè)片段在所有YY個(gè)體中不出現(xiàn)，將這類只在所有XX和XY個(gè)體中出現(xiàn)，在YY個(gè)體中不出現(xiàn)的片段作為X染色體特異AFLP片段；其次是性染色體特異AFLP標(biāo)記的克隆與序列分析，其步驟是1)黃顙魚XY性染色體特異AFLP片段的回收；2)性染色體特異AFLP片段的克??；3)性染色體特異AFLP片段的序列分析；克隆了黃顙魚X染色體特異AFLP片段和Y染色體特異AFLP片段，分別命名為Pf-Y62、Pf-Y33、Pf-X62和Pf-X63，其序列分別為SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；序列分析顯示性染色體特異AFLP片段Pf-X62和Pf-Y62為黃顙魚X和Y染色體上的一對(duì)等位序列，它們的序列差異在于6個(gè)堿基的插入或缺失以及1個(gè)堿基的替換；性染色體特異AFLP片段Pf-X33和Pf-Y63是黃顙魚X和Y染色體上的一對(duì)等位序列，它們的序列差異在于1個(gè)堿基的替換；B. 轉(zhuǎn)化為XY性染色體特異SACR標(biāo)記首先是染色體步移獲得性染色體特異片段的側(cè)翼序列通過三輪擴(kuò)增，擴(kuò)增到黃顙魚XY性染色體特異等位序列的側(cè)翼片段，將片段回收、克隆和測(cè)序；其次是序列分析比對(duì)從染色體步移獲得的側(cè)翼序列中選擇大小為311bp-624bp的片段用于序列分析，其序列分別為SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12和SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列；通過分析比對(duì)性染色體特異等位序列分別在黃顙魚X和Y染色體上拷貝的序列差異，發(fā)現(xiàn)一批穩(wěn)定的X和Y染色體序列差異位點(diǎn)，用來區(qū)分X或Y染色體；從中選擇X和Y性染色體存在序列差異的位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了引物，分別為1)Y染色體特異標(biāo)記Pf-Y62引物由序列為SEQ ID NO.14的上游引物Pf-XY62L和序列為SEQ IDNO.15的下游引物Pf-Y62R組合；2)X染色體特異標(biāo)記Pf-X62引物由序列為SEQ ID NO.14的上游引物Pf-XY62L和序列為SEQ IDNO.16的下游引物Pf-X62R組合；3)Y染色體特異標(biāo)記Pf-Y33引物由序列為SEQ ID NO.17的上游引物Pf-Y33L和序列為SEQ ID NO.18的下游引物Pf-Y33R組合；4)X染色體特異標(biāo)記Pf-X63引物由序列為SEQ ID NO.19的上游引物Pf-X63L和序列為SEQ ID NO.20的下游引物Pf-X63R組合；第三是轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記采用上一步設(shè)計(jì)的特異引物，在黃顙魚XX，XY和YY個(gè)體基因組DNA中擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25μl2.5μl10×PCR buffer，2.0μl25mM Mgcl2，1U TaqDNA聚合酶，0.5μl10mM dNTP，0.5uM上下游引物，20ng DNA，加水至25μl，擴(kuò)增條件分別為Pf-Y62或Pf-X6294℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，循環(huán)數(shù)為36；Pf-Y33或Pf-X6394℃ 30s，65℃/-0.5℃ 30s，72℃ 30s，循環(huán)數(shù)為10；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，循環(huán)數(shù)為25；C. 建立黃顙魚性染色體基因型PCR鑒定方法包括1)取樣和DNA提取采集黃顙魚尾鰭樣品，貯存于無(wú)水乙醇中，提取基因組DNA；2)PCR反應(yīng)選用所設(shè)計(jì)的4個(gè)SCAR標(biāo)記中的任意一個(gè)X染色體特異SCAR標(biāo)記和一個(gè)Y染色體特異SCAR標(biāo)記作為組合，分別在黃顙魚樣品基因組DNA中擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件為步驟B轉(zhuǎn)化為XY性染色體特異SACR標(biāo)記中的第三轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記所述；3)結(jié)果判斷根據(jù)樣品的擴(kuò)增結(jié)果來判斷其性染色體基因型擴(kuò)增出X染色體特異SCAR特異標(biāo)記片段，擴(kuò)增不出Y染色體特異SCAR標(biāo)記片段的個(gè)體為遺傳XX個(gè)體；擴(kuò)增出X染色體特異SCAR標(biāo)記片段，擴(kuò)增出Y染色體SCAR標(biāo)記片段的個(gè)體為遺傳XY個(gè)體；擴(kuò)增出Y染色體特異SCAR標(biāo)記片段，擴(kuò)增不出X染色體特異SCAR標(biāo)記片段的個(gè)體為遺傳YY個(gè)體；D. 在全雄黃顙魚培育中進(jìn)行遺傳性別鑒定包括a.XX雌魚×XY雄魚交配組合子代遺傳性別鑒定剪取黃顙魚尾鰭樣品，提取基因組DNA，采用步驟C所述的黃顙魚性染色體基因型PCR鑒定方法，選用Y染色體特異SCAR標(biāo)記Pf-Y62引物擴(kuò)增各樣品DNA，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判斷樣品的遺傳性別，能夠擴(kuò)增出一個(gè)大小為568bp特異片段的個(gè)體為遺傳XY魚，不能擴(kuò)增出該特異片斷的個(gè)體為遺傳XX魚；b.XY雌魚雌核發(fā)育組合子代遺傳性別鑒定采集XY雌魚雌核發(fā)育組合子代XX雌魚、XY雄魚和YY超雄魚尾鰭樣品，提取基因組DNA，采用步驟C所述的黃顙魚性染色體基因型PCR鑒定方法，選用4個(gè)SCAR標(biāo)記所對(duì)應(yīng)的引物組合，分別在各樣品基因組DNA中擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判斷各樣品的遺傳性別，XX雌魚樣品能夠擴(kuò)增出X染色體特異SCAR標(biāo)記片段，不能擴(kuò)增出Y染色體特異SCAR標(biāo)記片段；XY雄魚樣品均能擴(kuò)增出X染色體特異SCAR標(biāo)記片段，能擴(kuò)增出Y染色體SCAR標(biāo)記片段；YY超雄魚樣品能擴(kuò)增出Y染色體特異SCAR標(biāo)記片段，擴(kuò)增不出X染色體特異SCAR標(biāo)記片段；c.YY生理雌魚×XY雄魚交配組合子代遺傳性別鑒定從YY生理雌魚×XY雄魚交配組合子代中抽取114尾魚，剪取尾鰭，提取基因組DNA，采用步驟C所述的黃顙魚性染色體基因型PCR鑒定方法，選用Pf-Y62和Pf-X63標(biāo)記進(jìn)行遺傳性別鑒定，結(jié)果顯示Pf-Y62引物組合在所有樣品中能擴(kuò)增出一個(gè)片段大小為568bp的特異片段，Pf-X63引物在57個(gè)樣品中能夠擴(kuò)增出一個(gè)片段大小為462bp的特異片段，在另57個(gè)樣品無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，在114尾子代中有57尾YY超雄魚和57尾XY雄魚；d.YY生理雌魚×YY超雄魚交配組合子代遺傳性別鑒定從YY生理雌魚×YY超雄魚交配組合子代剪取尾鰭，提取基因組DNA，按照步驟C所述的黃顙魚性染色體基因型PCR鑒定方法，選用Pf-Y62和Pf-X62兩個(gè)標(biāo)記進(jìn)行遺傳性別鑒定，擴(kuò)增結(jié)果顯示，Pf-Y62引物組合在所有樣品中能擴(kuò)增出一個(gè)片段大小為568bp的Y染色體特異片段，Pf-X62引物組合在所有樣品中無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，表明所有子代為YY超雄魚；e.XX雌魚×YY超雄魚交配組合子代遺傳性別鑒定從步驟c和d所鑒定得到的YY超雄魚中選取YY超雄魚，性成熟后與XX雌魚進(jìn)行交配，測(cè)交子代長(zhǎng)至4個(gè)月時(shí)，抽取400尾仔魚，解剖后根據(jù)組織學(xué)判斷性腺形態(tài)為精巢或卵巢來判斷魚的性別，解剖結(jié)果顯示，所有400尾魚為雄魚；同時(shí)從中隨機(jī)抽取20尾魚剪取尾鰭，提取基因組DNA，按照步驟C所述的黃顙魚性染色體基因型PCR鑒定方法，選用Pf-Y62標(biāo)記于樣品中擴(kuò)增，所有個(gè)體能擴(kuò)增出一個(gè)片段大小為568bp的特異片段，為遺傳上的雄魚。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃顙魚性染色體特異分子標(biāo)記及遺傳性別鑒定方法，包括黃顙魚XY性染色體特異AFLP標(biāo)記的篩選和克隆，黃顙魚XY性染色體特異SCAR標(biāo)記的設(shè)計(jì)，黃顙魚性染色體基因型(XX/XY/YY)PCR鑒定方法的建立。本發(fā)明建立了黃顙魚性染色體特異AFLP標(biāo)記篩選方法，從256個(gè)AFLP引物組合中篩選到3個(gè)引物組合能夠產(chǎn)生4個(gè)X或Y染色體特異AFLP片段，創(chuàng)建了黃顙魚性染色體基因型PCR鑒定方法。本發(fā)明首次篩選到黃顙魚X和Y染色體特異分子標(biāo)記，建立了黃顙魚遺傳性別鑒定方法，并將本方法應(yīng)用到全雄黃顙魚培育過程中的遺傳性別鑒定。本發(fā)明具有高效，準(zhǔn)確和穩(wěn)定的特點(diǎn)，在黃顙魚性別控制和全雄黃顙魚苗種的持續(xù)規(guī)?；a(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101418347SQ200810236650
公開日2009年4月29日 申請(qǐng)日期2008年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月4日
發(fā)明者劉漢勤, 桂建芳, 毛慧玲, 達(dá) 王, 陳宏溪 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所