專利名稱：蘇云金芽胞桿菌的增效蛋白基因bell及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬農(nóng)業(yè)微生物學(xué)應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種蘇云金芽胞桿菌增效蛋白
基因的分離、克隆以及它的編碼的蛋白在微生物殺蟲劑中的應(yīng)用，本發(fā)明還涉及基因工 程菌的制備。與微生物基因工程和生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域有關(guān)。涉及本發(fā)明的生物材料樣品即蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)BMB0187
保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(英文簡稱CCTCC);保藏單位地址中國湖北省
武漢市武漢大學(xué)內(nèi)；保藏編號CCTCC NO: M208245 ;分類命名蘇云金芽胞桿菌 (Bacillus thuringiensis)BMB0187。
背景技術(shù)：
蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis ， Bt)是 一 種廣泛存在于各種生態(tài)環(huán)境 中的革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌。該物種最大的特點就是在其生長周期中能形成內(nèi)生芽胞的 休眠體，并且在其芽胞形成的同時能產(chǎn)生對許多昆蟲具有特異毒性的由殺蟲晶體蛋白 (Insecticidal Crystal Proteins, ICPs)組成的伴胞晶體。這些殺蟲晶體蛋白對鱗翅目、雙 翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目等昆蟲綱IO個目500多種昆蟲以及原生動物、線形動物 門、扁形動物門中某些有害種類也有特異的生物活性(Schnepf H E， Crickmore N， Rie J V， LereclusD， BaumJ， FeitelsonJ， ZeiglerDR， Dean D H. 1998.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins.Microbiol Mol Biol Rev， 62: 775-806)。 由于蘇云金芽胞 桿菌對多種昆蟲都有很高的殺蟲活性，而且具有對環(huán)境和人蓄無損害等優(yōu)點，因此被廣 泛地應(yīng)用于生物農(nóng)藥的開發(fā)。目前，基于蘇云金芽胞桿菌開發(fā)的生物殺蟲劑已經(jīng)成為最 成功的一種生物農(nóng)藥，占到了整個生物農(nóng)藥行業(yè)90%以上的市場，廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、 林業(yè)和倉儲等害蟲的防治。同時人們也不斷將蘇云金芽胞桿菌的殺蟲晶體蛋白基因轉(zhuǎn)入 植物中，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物，用于農(nóng)業(yè)害蟲的防治。 蘇云金芽胞桿菌殺蟲劑最初都是使用篩選的野生型菌株進行生產(chǎn)。盡管蘇云金 芽胞桿菌有諸多優(yōu)點，但是在田間應(yīng)用時也存在防效不穩(wěn)定、殘效期短、殺蟲速度慢、 對某些目標(biāo)害蟲不敏感等問題。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們逐漸利用基因工程的手段 對野生型菌株進行遺傳改造，來提高原有菌株的殺蟲活性，延長其殘效期等。然而，隨 著蘇云金芽胞桿菌殺蟲劑應(yīng)用的不斷推廣和使用強度的不斷增強，目標(biāo)害蟲的抗性現(xiàn)象 也不斷被科學(xué)家所發(fā)現(xiàn)。這些因素嚴(yán)重制約了蘇云金芽胞桿菌殺蟲劑產(chǎn)品的應(yīng)用和推 廣，威脅著整個行業(yè)的快速發(fā)展。解決這一問題的有效途之一就是尋找新的殺蟲增效因 子，用以顯著提高原有菌株的殺蟲活性，并延緩或克服昆蟲對其產(chǎn)生的抗性。
近年來，尋找新的殺蟲增效因子一直是蘇云金芽胞桿菌應(yīng)用研究領(lǐng)域中最為活 躍的部分之一。Hilder等利用絲氨酸蛋白酶抑制劑使蘇云金芽胞桿菌產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋 白的殺蟲活性提高20倍以上(Hilder VA， Gatehouse AMR， Sheerman SE， Barrer RF， Boulter D.1987.A novel 4 mechanism of insect resistanceengineered into tobacco.Nature 330 : 160-163.) ; Regev等發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶(chitinase)可以通過降解昆蟲圍食膜的幾丁質(zhì)層而大幅提高Bt殺蟲晶體蛋白的殺蟲活性(Regev A， Keller M， Strizhov N. 1996.Synergistic activity of a Bacillus thuringiensis delta-endotoxin and a bacterial endochitinase against Spodoptera littoralis larvae.Appl Environ Microbiol 62 : 3581-3586.)。 此后，越來越多的協(xié)同增效因 子被發(fā)現(xiàn)，如雙效菌素ZwittermicinA，伴侶蛋白P20，溶細(xì)菌毒素Cyt，鈣粘蛋白片段 CR12-MPED等(Pardo-L' opezL， Mu noz-Garay C， Porta H， Rodr' lgguez-Almaz' an C， Sober' on M， Bravo A.2008.Strategies to improve the insecticidal activity of Cry toxins from Bacillus thuringiensis.Peptides.In press)。 這些研究結(jié)果提供許多策略去提高蘇云金芽 胞桿菌菌株的殺蟲活性，或者能夠很好地延緩或克服昆蟲對其產(chǎn)生的抗性，然而對于蘇 云金芽胞桿菌殺蟲劑產(chǎn)業(yè)和基于Bt的轉(zhuǎn)基因植物領(lǐng)域的應(yīng)用還有相當(dāng)?shù)木嚯x。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，從蘇云金芽胞桿菌中分離并克隆一種 新型的增效蛋白基因，證實了該增效蛋白Bell具有提高殺蟲晶體蛋白殺蟲活性的功能， 并揭示該增效蛋白(基因)在農(nóng)業(yè)殺蟲微生物和轉(zhuǎn)基因微生物或轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用前 景。本發(fā)明還涉及蘇云金芽胞桿菌基因工程菌的制備及應(yīng)用。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的 申請人:從擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的蘇云金芽胞桿菌庫斯塔克亞種(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki， serotype H3ab)YBT-1520(本申請人自己的授權(quán)發(fā)明專利，中 國發(fā)明專利號ZL 95106749.40)菌株中分離得到一個新的增效蛋白基因，申請人將這個 基因命名為bell。經(jīng)過測序發(fā)現(xiàn)該增效蛋白基因bell的編碼區(qū)由2202個堿基組成，它具 有如序列表SEQIDNO: l所示的核苷酸序列。序列分析發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的bell基因編碼的 增效蛋白Bell是由734個氨基酸殘基組成，其具有如序列表SEQ ID NO : 1所示的氨基 酸序列，分子量大小約為85kDa。通過原核超量表達(dá)和室內(nèi)生物測定證實本發(fā)明的基因 bell在微生物中表達(dá)的Bell蛋白，能夠顯著提高殺鱗翅目昆蟲的殺蟲晶體蛋白CrylAc的 殺蟲活性。申請人通過構(gòu)建含有增效蛋白Bell的蘇云金芽胞桿菌基因工程菌，揭示了該 蛋白在農(nóng)業(yè)害蟲棉鈴蟲的防治方面的具有很好的應(yīng)用價值。本發(fā)明提供的上述基因序列是一種新的增效蛋白基因，該基因可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化
微生物和植物，使之表達(dá)出增效蛋白Bell，使受體生物表現(xiàn)出該蛋白具有的顯著提高殺
蟲晶體蛋白殺蟲活性的特性，可用于克服或延緩害蟲對微生物殺蟲劑的抗藥性問題，在
農(nóng)業(yè)害蟲的生物防治方面具有廣泛的應(yīng)用價值。更詳細(xì)的技術(shù)方案參見《具體實施方式
》的描述。


序列表SEQIDNO : l是本發(fā)明分離和克隆的蘇云金芽胞桿菌增效蛋白基因的核 苷酸序列及編碼序列； 圖1 :是本發(fā)明實施例構(gòu)建的克隆載體pUC19-be11的構(gòu)建圖； 圖2 :是本發(fā)明實施例中超量表達(dá)載體pEMB0184的構(gòu)建圖； 圖3 :是本發(fā)明克隆的增效蛋白基因bell的原核超量表達(dá)與純化的SDS-PAGE電
泳分析；
4M
1 :
2 :
3 :
4 :
5 :
6 :






圖
結(jié)果分析之
圖
結(jié)果分析之 圖 圖 圖； 圖分析。 M 1 : 2 :
:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；
BL21/pGEX-6p-l菌株未誘導(dǎo)對照的菌體總蛋白； BL21/pGEX-6p-l菌株l.Ommol/L的IPTG誘導(dǎo)3h的菌體總蛋白； BL21/pEMB0184菌株未誘導(dǎo)的菌體總蛋白； BL21/pEMB0184菌株l.Ommol/L的IPTG誘導(dǎo)3h的菌體總蛋白； 從BL21/pEMB0184誘導(dǎo)培養(yǎng)物中親和層析純化的GST-bell蛋白； 從BL21/pGEX-6p-l誘導(dǎo)培養(yǎng)物中親和層析純化的GST蛋白。
4 :是本發(fā)明實施例中增效蛋白Bell與殺蟲晶體蛋白不同濃度配比生物測定
5 :是本發(fā)明實施例中增效蛋白Bell與殺蟲晶體蛋白不同濃度配比生物測定
6 :含有增效蛋白基因bell穿梭表達(dá)載體pBMB0186的構(gòu)建路線7 :增效蛋白Bell和殺蟲晶體蛋白CrylAclO共表達(dá)載體pBMB0187的構(gòu)建
8 :增效蛋白基因bell在蘇云金芽胞桿菌BMB171中表達(dá)的SDS-PAGE電泳
:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)； BMB171菌株36h培養(yǎng)物的菌體總蛋白； BMB0187菌株36h培養(yǎng)物的菌體總蛋白。
具體實施方案 以下敘述是根據(jù)本發(fā)明實施方案的實施例。應(yīng)該說明的是，本發(fā)明的實施例對 于本發(fā)明只有說明作用，而沒有限制作用。有關(guān)DNA的標(biāo)準(zhǔn)操作方法和所使用的藥品均 參考《分子克隆實驗指南》所描述的內(nèi)容(參見J.薩姆布魯克等，分子克隆實驗指南， 第三版，金冬雁等(譯)，北京，科學(xué)出版社，2002年)。本發(fā)明中所涉及的其他各種實 驗操作，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，文中沒有特別說明的部分，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可 以參照本發(fā)明申請日之前的各種常用工具書、科技文獻或相關(guān)的說明書、手冊等加以實 施。 實施例1蘇云金芽胞桿菌YBT-1520中增效蛋白基因bell的克隆
本發(fā)明以蘇云金芽胞桿菌YBT-1520(本申請人自己的授權(quán)發(fā)明專利，中國發(fā)明 專利號ZL95106749.40)作為增效蛋白基因bell的來源菌株，同時可參考文獻孫明， 劉子鐸，喻子牛.2000.蘇云金芽胞桿菌YBT-1520殺蟲晶體蛋白基因的屬性.微生物學(xué)報 40: 365-371。該菌株血清型為H3ab，能形成典型的菱形晶體，主要的晶體蛋白成分的 分子量約為130千道爾頓(kDa)，對鱗翅目昆蟲棉鈴蟲和小菜蛾等具有特異的高毒性。目 前，該菌株的全基因組序列已經(jīng)由申請人所在課題組測序完成，但沒有登錄。
1.蘇云金芽胞桿菌YBT-1520總DNA的抽提 將蘇云金芽胞桿菌YBT-1520菌株用接種環(huán)通過無菌操作方法接種于5mL的常用 LB液體培養(yǎng)基中(配方蛋白胨1%，酵母粉0.5%， NaCll%， pH 7.0-7.2)，置于3(TC、 200rpm的搖床中培養(yǎng)過夜；然后通過無菌操作將50 y L的YBT-1520培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至5mL的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期；然后于5000rpm， 3min離心收 集菌體，用STE緩沖液(配方10mM Tris-HCl， pH = 8.0， 50mM NaCl， lmM乙二胺 四乙酸(EDTA))lmL洗滌一次，力B 100 y L溶液I(配方50mM Tris-HCl， pH 8.0， 10mM EDTA)和10 ii L溶菌酶(50mg/mL)， 37。C作用30min以上；加入200 y L2X十二烷基磺 酸鈉(SDS)于50°C -60"水浴30min ;加入200 y L 5mol/L NaCl混和，加入500 y L苯酚 /氯仿/異戊醇(按體積比25 : 24 : 1)，離心l加00rpm， 5min，吸取上清液，重復(fù)抽 提1-2次；將上層DNA溶液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管，加入等體積95%乙醇，室溫靜置5min 后離心12000rpm， 5min，取沉淀用200 y L 70%乙醇洗滌一次，冷凍抽干后溶于50 y LTE 溶液中。2.PCR擴增獲得bell基因的DNA片段 根據(jù)YBT-1520的全基因組中的序列信息，設(shè)計了一對特異性引物用來擴增目標(biāo) 基因bell(引物序列為上游belPl: 5' -GCCGGATCCATGTATACAATGTTTTTCCTC-3'，下游belP2: 5' -GGCGAATTCTTATTCATTATATAAGCTATC-3')。 以事先準(zhǔn)備好 的蘇云金芽胞桿菌的總DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)的體系和程序如下
25iiL反應(yīng)體系包含2.5iiL IOXPCR反應(yīng)緩沖液，1 y L dNTP(各2.5mM)， 0.5 ii L特異性上游引物Pl(20mM)， 0.5 y L特異性下游引物P2(20mM)， 0.2 y L模板(上 述YBT-1520的總DNA)， 0.25 y L ExTaq酶，加滅菌去離子水至25 y L。
PCR反應(yīng)參數(shù) 和程序為94°C， 5min， 1個循環(huán)；94°C， lmin， 52°C， lmin， 72°C， 2.5min， 30個循 環(huán)；72°C， 10min， 1個循環(huán)。
3.bell基因的序列測定和序列分析 PCR產(chǎn)物通過PCR產(chǎn)物回收試劑盒(購自O(shè)mega生物技術(shù)公司)純化回收后通 過T/A克隆連接到T載體pMD19-T上(購自TaKaRa生物技術(shù)公司)，得到含有bell全長 基因的重組質(zhì)粒pUC19-bell(見圖1)，之后將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5 a ，并 涂布氨芐青霉素抗性平板(Ampr，終濃度為100ug/ml)。將抗性平板置于37。C培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)12h-16h，待轉(zhuǎn)化子長到一定大小以后，以belPl和belP2為引物，以轉(zhuǎn)化子的菌落菌體 為模板，通過PCR擴增對轉(zhuǎn)化子進行篩選。將篩選到的陽性轉(zhuǎn)化子用5ml的液體LB培 養(yǎng)基活化培養(yǎng)，然后取lml的過夜培養(yǎng)物送樣測序(由Invitrogen公司完成)。測序結(jié)果 具有如序列表SEQIDNO: l中所示的核苷酸序列，申請人將該基因命名為bell基因(基 因命名以斜體小寫表示)。通過軟件分析預(yù)測此段編碼序列可編碼一個由734個氨基酸組 成的蛋白質(zhì)，預(yù)測其分子量為85kDa，申請人將其命名為增效蛋白Bell(蛋白命名以正體 大寫表示)。 實施例2蘇云金芽胞桿菌增效蛋白Bell的超量表達(dá)，純化和增效活性
1.蘇云金芽胞桿菌增效蛋白Bell原核超量表達(dá)載體的構(gòu)建
將實施例1中獲得的含有bell全長基因的重組質(zhì)粒pUC19-be11經(jīng)BamHI和 EcoRI雙酶切，同時將表達(dá)載體pGEX-6p-l進行相同的雙酶切。上述載體和外源的酶切 產(chǎn)物通過0.8 %的瓊脂糖凝膠分離后，切下目標(biāo)片段并通過DNA凝膠回收試劑盒(購自 Omega生物技術(shù)公司)純化回收。之后將兩者通過T4連接酶(購自寶生物工程(大連)有 限公司，即TaKaRa)連接，從而獲得了含有bell全長ORF的重組表達(dá)質(zhì)粒pEMB0184(見 圖2)。將該重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5 a (購自Tiangen公司)，并抽提質(zhì)粒
6分別進行BamHI和EcoRI雙酶切驗證，酶切片段大小與預(yù)期大小一致，進一步的測序結(jié) 果表明bell全長ORF片段被正確地插入了到了表達(dá)載體pGEX-6p-l中。
2.蘇云金芽胞桿菌增效蛋白Bell原核超量表達(dá)，純化與定量分析
為了得到大量的增效蛋白Bell，申請人將上述攜帶有增效蛋白bell全長編碼基 因的重組表達(dá)質(zhì)粒pEMB0184轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)(購自Tiangen公司)，得到了重 組菌BL21/pEMB0184。將該重組菌株接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中(另外附加終濃度為 100 ii g/mL氨芐青霉素)，過夜活化。以1 : 100(體積比)轉(zhuǎn)接至50mLLB液體培養(yǎng)基 中，置于37t:搖床培養(yǎng)至OD600為0.5-0.8左右以后，加入l.Ommol/L的異丙基-B-D-硫 代半乳糖苷(即IPTG，購自sigma公司)于37 tH秀導(dǎo)培養(yǎng)3h。 之后12000rpm離心 30sec收集菌體，分別用0.5XNaCl和滅菌去離子水洗滌菌體三遍后，按照菌體滅菌去 離子水=1 : 5的體積比重新混勻菌體，加入等體積的2X上樣緩沖液(2X上樣緩沖液 配方100mm/l Tris-Cl(pH6.8)， 200mm/L 二硫蘇糖醇，4%SDS， 0.2%溴酚藍(lán)，20%甘 油)，混勻后，沸水浴中處理3-5min， 12000rpm離心5min，以上清液進行SDS-PAGE電 泳。SDS-PAGE電泳操作步驟參見Laemmli描述的方法(Laemmli， UK. 1970.Cleavage of structural proteins duringthe assembly of the head ofbacteriophage T4.Nature 227 : 680-685)。 結(jié)果如圖3所示，與空載體對照菌株BL21/pGEX-6P-l相比，本實施例的BL21/pEMB0184 表達(dá)了一條特異蛋白帶，如圖3泳道4所示。與蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)比對，估算該特異性蛋 白其分子量為113kDa，與預(yù)計的融合增效蛋白GST-Bell分子量大小吻合。證明本發(fā)明 的增效蛋白Bell在大腸桿菌中得到了成功的表達(dá)。 將上述重組菌BL21/pEMB0184的3h誘導(dǎo)培養(yǎng)物經(jīng)過12000rpm離心30sec收集菌 體，利用超聲波(技術(shù)參數(shù)功率400W，破碎30秒，間歇30秒)將細(xì)胞破碎后12000rpm 離心15min取上清。然后將上清液過親和層析柱(購自Novagen公司)提純該特異蛋白 GST-Bell。具體的純化步驟按照試劑盒GST Bind (購自Novagen公司)操作說明書進 行。對最終的純化產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖3泳道5所示，提純的蛋白 與BL21/pEMB0184中表達(dá)的特異性蛋白條帶大小一致(如圖3泳道4所示)，說明本發(fā) 明提純的特異蛋白就是融合增效蛋白GST-Bell。之后，用Bradford染色法(具體方法參 考文獻Bradford M M.1976.A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein-dye binding.Anal Biochem 72 : 248-254.) 測定了純化的蛋白溶液的含量，結(jié)果表明純化的增效蛋白溶液濃度為98.86 g/mL。
3.殺蟲晶體蛋白CrylAclO的提純和定量分析 將攜帶殺蟲晶體蛋白基因crylAclO的蘇云金芽胞桿菌重組菌BMB871(菌株來源 見文獻吳嵐，孫明，喻子牛，利用蘇云金芽胞桿菌轉(zhuǎn)座子Tn4430構(gòu)建含crylAclO基 因的解離載體，微生物學(xué)報，2000， 40: 264-269.)菌株在ICPM培養(yǎng)基(配方蛋白胨 0.6%，葡萄糖0.5%， CaCO30.1%， MgSO40.05%， KH2PO40.05%， pH7.0-7.2)中培養(yǎng) 48h-52h后，取發(fā)酵液按照常規(guī)的復(fù)紅染色制作鏡片，經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察，待90%以上的 芽孢脫落后，將發(fā)酵液于12000rpm， 4t:離心10min收集胞晶混合物，之后分別用lmo1/ mL NaCl和蒸餾水洗三遍，然后加入適量50mmol/mLNa2CO3(3 % P -巰基乙醇，pH = 9.5)，充分混勻，37。C水浴60min， 12000rpm， 4。C離心15min去沉淀，上清中加入二十 分之一體積的4mol/mL NaAC-HAc(pH4.0)，冰上靜置30min ; 12000rpm， 4。C冷凍離心
710min，收集沉淀物，用去離子水清洗3遍，最后將沉淀溶于50mmol/mL Na2C03(pH9.5)
中，即為提純后殺蟲晶體蛋白溶液。 同樣地用Bradford染色法測定了純化的殺蟲晶體蛋白CrylAclO蛋白溶液的含
量，結(jié)果表明本發(fā)明純化的CrylAclO蛋白溶液濃度為748.1 y g/mL。4.增效蛋白Bell對殺蟲晶體蛋白CrylAclO殺蟲的增效活性的測定 以棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)初孵幼蟲為對象測定了本發(fā)明制備的增效蛋白
Bell對殺蟲晶體蛋白CrylACIO殺蟲的增效活性。具體的生物測定程序按照標(biāo)準(zhǔn)測定程
序(參見文獻沈鞠群等.蘇云金桿菌制劑的標(biāo)準(zhǔn)化程序和方法，生物防治通報，1990(增
刊)12-16)進行。每個樣品的生物測定重復(fù)3次，并計算出LCs。。 為了檢測增效蛋白Bell對殺蟲晶體蛋白CrylAclO殺蟲的增效活性，申請人設(shè)計
了下列兩個實驗。 在第一個實驗中申請人首先固定了殺蟲晶體蛋白的CrylAclO在飼料中的最終使 用濃度為3 g/mL，將不同濃度的的增效蛋白Bell溶液與之混合后加入到飼料中進行生 測。共設(shè)置了5個濃度梯度，增效蛋白Bell與殺蟲晶體蛋白CrylAclO的比例分別為(質(zhì) 量比)O :15， 1 ; 15 ; 2 : 15， 4 : 15， 8 : 15，設(shè)單獨的CrylAclO也即0 : 15組為對 照。結(jié)果如圖4所示，對照組中單加3 iig/mL的CrylAclO可以引起的死亡率為34.2%， 而當(dāng)加入了 0.2的y g/ml增效蛋白Bell后，其致死率急劇上升到了 65.3%。當(dāng)增效蛋 白Bell的濃度繼續(xù)增加以后，死亡率也跟著上升到了76.2%。以上結(jié)果說明該增效蛋白 有明顯的增強殺蟲晶體蛋白CrylAclO殺蟲毒性的作用，而且在該增效效果隨著增效蛋白 Bell濃度的增加而提高。在第二個試驗中申請人固定了增效蛋白Bell在飼料中的最終使用濃度為0.2y g/ mL，將不同濃度的的殺蟲晶體蛋白CrylAclO溶液與之混合后加入到飼料中進行生測。 共設(shè)置了 4個濃度梯度，增效蛋白Bell與殺蟲晶體蛋白CrylAclO的比例(按質(zhì)量比計) 分別為l :0， 1; 15; 1 : 30， 1 : 60，設(shè)單加CrylAclO組為對照。結(jié)果如圖5所示， 我們可以明顯看出，在所用的4個濃度比例下，增效蛋白Bell與CrylACIO混合使用組的 供試?yán)ハx的死亡率明顯高于沒有添加增效蛋白的CrylAclO各濃度組的死亡率。以上結(jié)果 進一步說明該增效蛋白具有明顯的增強殺蟲晶體蛋白CrylAclO殺蟲毒性的作用。
實施例3利用增效蛋白Bell構(gòu)建蘇云金芽胞桿菌高效殺蟲基因工程菌
在實施例2中申請人證明了體外純化的增效蛋白Bell具有明顯的增強殺蟲晶體 蛋白CrylAclO殺蟲毒性的作用，本實施例利用了該蛋白的這一特性，構(gòu)建出了一株高效 殺蟲的蘇云金芽胞桿菌基因重組菌。具體制備步驟如下
1.含增效蛋白Bell的大腸桿菌-蘇云金芽胞桿菌穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建
為了讓增效蛋白基因bell能夠在蘇云金芽胞桿菌中表達(dá)，申請人采用重疊延伸 的方法(即SOE法，具體方法和原理可以參考J.薩姆布魯克等，2002，分子克隆實驗 指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學(xué)出版社，北京)在其編碼區(qū)的起始密碼子前加上了 該基因自身的啟動子。構(gòu)建路線如圖6所示，由于片段太長，采取了分段擴增的辦法對 啟動子和基因的編碼區(qū)進行連接。首先根據(jù)YBT-1520基因組上基因bell上游啟動子序 歹'J設(shè)計一對弓I物，pi : 5' -TGCGGATCCCGTTAAGTTTCTC-3' ， p2 : 5' -AACAAGT AACCTTTTCATAAGTTACCTCCATCTCTT-3'。再根據(jù)重組質(zhì)粒pUC19-bell上基因bell的序列，設(shè)計另一對引物，p3:5' -CTGTGGTAAGTTATTATCGCCGTACGCGC-3'; p4: 5' -GGATCAACTAGAGCTCTTGC-3'。 以以本發(fā)明的來源菌株蘇云金芽胞桿菌 YBT-1520的總DNA為模板，用本實施例設(shè)計的引物pl和p2擴增出了基因bell的啟動 子900bp左右的片段，該片段3'端帶有基因bell基因編碼區(qū)的第1-20個堿基；以質(zhì)粒 pUC19-bdl的DNA為模板，用引物p3和p4擴增出了基因bell的編碼區(qū)片段的1-1400個 堿基的區(qū)域bell-l，該片段5'端帶有bell的啟動子片段末端的20個堿基。純化兩個擴 增產(chǎn)物后，將兩個DNA片段混在一起作為模板，用引物pl和p4進行第2輪PCR擴增， 擴增得到了大約為2.2kb左右的片段，即為基因pro-bell-l。最后經(jīng)過測序證明啟動子pro 與基因bell基因的bell-l部分編碼區(qū)連接正確。 將得到的pro-bell-l基因片段經(jīng)BamHI和Sacl酶切后，插入到大腸桿菌-蘇云 金芽胞桿菌穿梭載體pHT304(載體來源見Arantes 0 and Lereclus D. 1991.Construction ofcloning vectors for Bacillus thuringiensis.Gene 108 : 115-119)相應(yīng)的多克隆位點中，獲
得了重組質(zhì)粒，申請人將該重組質(zhì)粒命名為pBMB0185，經(jīng)酶切驗證與預(yù)計片段大小相 符。
為了獲得完整的bell基因，用設(shè)計的另 一 對特異性引物p5 : 5， -GCAAGAGCTCTAGTTGATCC-3，禾口 p6 : 5' -CTGCCGAATTCTGAGAAGGT-3 ，， 以pUC 19-bel 1的DNA為模板，擴增出了 bel 1基因剩余的800bp左右的片段bel 1 -2 。 然 后經(jīng)SacI和EcoRI酶切后，插入到pBMB0185相應(yīng)的多克隆位點中，從而獲得了包含bell 基因完整的啟動子和編碼區(qū)的穿梭表達(dá)質(zhì)粒pBMB0186，經(jīng)酶切驗證與預(yù)計片段大小相 符。 2.增效蛋白Bell和殺蟲晶體蛋白CrylAclO共表達(dá)載體的構(gòu)建
為了利用增效蛋白Bell具有增強殺蟲晶體蛋白CrylAclO殺蟲毒性的特性，申請 人將增效蛋白Bell和殺蟲晶體蛋白CrylAclO在蘇云金芽胞桿菌BMB171(菌株來源見文 獻李林，楊超，劉子鐸，李阜隸，喻子牛.2000.蘇云金芽孢桿菌無晶體突變株的逐級 升溫篩選及其轉(zhuǎn)化性能.微生物學(xué)報5 : 395-399.)中進行共表達(dá)。共表達(dá)載體的構(gòu)建如圖 7所示。即，用Sphl單酶切從質(zhì)粒pBMBBK-304(質(zhì)粒來源見文獻孫明，吳嵐，劉子 鐸，喻子牛.2000.利用蘇云金芽胞桿菌非芽胞特異性的啟動子表達(dá)crylAclO和crylC基 因.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報8 : 229-232.)中將完整的殺蟲晶體蛋白基因crylAclO的啟動子和編 碼區(qū)切下來，并插入到包含bell基因完整的啟動子和編碼區(qū)的穿梭表達(dá)質(zhì)粒pBMB00186 的Sphl位點，得到了同時含有bell基因和crylAclO基因的表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗證證明酶 切產(chǎn)物與預(yù)計片段大小相符，說明構(gòu)建正確，申請人將該重組質(zhì)粒命名為pBMB0187。
3.增效蛋白基因bell在蘇云金芽胞桿菌BMB171中的表達(dá) 為了檢測增效蛋白基因bell是否能夠在BMB171中正常表達(dá)，通過電轉(zhuǎn)化的方 法(吳嵐，孫明，喻子牛.利用蘇云金芽胞桿菌轉(zhuǎn)座子Tn4430構(gòu)建含crylAclO基因的解 離載體.微生物學(xué)報，2000， 40: 264-269.)將上述構(gòu)建的共表達(dá)重組質(zhì)粒pBMB0187轉(zhuǎn)化 到蘇云金芽胞桿菌無晶體突變株BMB171中。通過抗性篩選和酶切驗證得到了正確的轉(zhuǎn) 化子BMB0187。 將上述重組菌BMB0187在LB培養(yǎng)基(使用時加入終濃度為20 ii g/mL的紅霉 素)中過夜活化后，轉(zhuǎn)移至ICPM培養(yǎng)基(使用時附加終濃度為20 ii g/mL的紅霉素)中，培養(yǎng)至芽胞完全成熟脫落，收集菌體，分別用0.5XNaCl和滅菌去離子水洗滌三遍后， 按照菌體滅菌去離子水=1 : 5的體積比重新混勻菌體，加入等體積的2倍上樣緩沖液 (配方同本說明書前面的描述)，混勻后，沸水浴中處理3-5min， 12000rpm離心5min，以 上清液進行SDS-PAGE電泳。其結(jié)果如圖8所示，蘇云金芽胞桿菌BMB0187能表達(dá)出 和預(yù)計大小相同的特異性的蛋白質(zhì)，與分子量標(biāo)準(zhǔn)對比，預(yù)測其分子量大小為85kDa， 而陰性對照的蘇云金芽胞桿菌BMB171中(只含有穿梭載體pHT304)則無此對應(yīng)條帶， 說明增效蛋白基因bell在蘇云金芽胞桿菌BMB171中得到了表達(dá)。另外通過電子顯微鏡 觀察證明該重組菌能夠很好地形成典型的菱形晶體，說明增效蛋白基因bell在蘇云金芽 胞桿菌BMB171中的表達(dá)并不影響殺蟲晶體蛋白CrylAclO的正常表達(dá)。以上結(jié)果證明 成功獲得了同時表達(dá)增效蛋白Bell和殺蟲晶體蛋白CrylAclO的基因工程菌，申請人將 其命名為BMB0187。申請人:制備的基因工程菌為蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis) BMB0187，于2008年12月4日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)保藏，其保藏編號為CCTCCNO: M208245。
基因工程菌BMB0187的生物學(xué)及遺傳學(xué)特性 ①生物學(xué)特性菌體直桿狀，營養(yǎng)體呈鏈狀或單生，長3-5微米，寬1-1.2微
米，革蘭氏染色陽性，芽胞呈圓柱狀或近橢圓，偏端生，芽胞囊不膨大，在牛肉膏 蛋白胨培養(yǎng)基上菌落圓形，邊緣平滑，菌苔豐滿呈蠟質(zhì)狀，生長溫度10-45t:，最適 pH6.8-7.4，兼性嫌氧，在含7XNaCl的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中生長，在核糖、葡萄糖、 果糖、麥芽糖和可溶性淀粉培養(yǎng)基中產(chǎn)酸，甲基紅反應(yīng)陽性，芽胞生長后期產(chǎn)生伴胞晶 體，伴胞晶體呈菱形，大小不一。 ②本發(fā)明是以蘇云金芽胞桿菌無質(zhì)粒突變菌株BMB171為出發(fā)菌株得到的基 因工程菌，其鞭毛抗原血清型為H2，含有殺蟲晶體蛋白基因crylAclO和增效蛋白基因 bell，伴胞晶體由130KDa晶體蛋白組成。經(jīng)繼代培養(yǎng)，輔助基因bell能夠在工程菌中 穩(wěn)定存在，表達(dá)正常，對受體菌的生長無重大影響。 4.含bell基因的蘇云金芽胞桿菌BMB0187對棉鈴蟲殺蟲活性的室內(nèi)生物測定
為了檢測本發(fā)明構(gòu)建的含bell基因的蘇云金芽胞桿菌BMB0187的殺蟲活性，以 棉鈴蟲H.armigera初孵幼蟲為對象測定了該工程及其出發(fā)菌株的的殺蟲效果。將本發(fā)明 制備的菌株BMB0187和只含有CrylAclO的重組菌BMB871在常用的LB液體培養(yǎng)基(使 用時加入終濃度為20ii g/mL的紅霉素)中過夜活化后，然后按照體積比為1 : 100的接 種量轉(zhuǎn)移至30ml的ICPM培養(yǎng)基(使用時加入終濃度為20 y g/mL的紅霉素)中，培養(yǎng)至 芽胞即將成熟脫落的階段，收集菌體，用滅菌去離子水洗滌一遍后，獲得伴胞晶體混合 物，按照標(biāo)準(zhǔn)測定程序(見沈鞠群等，蘇云金桿菌制劑的標(biāo)準(zhǔn)化程序和方法，生物防治 通報，1990，(增刊)12-16)進行生物測定。每個樣品的生物測定重復(fù)3次，并通過專 業(yè)統(tǒng)計軟件DPS(參考文獻唐啟義，馮明光.DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。北京中國農(nóng)業(yè)出版 社.1997)計算出LCs。。結(jié)果如表l所示，從表l中對應(yīng)濃度的死亡率和計算出的LQ?？?以看出，導(dǎo)入了bell基因的重組菌BMB0187對棉鈴蟲的殺蟲毒力明顯比未導(dǎo)入bell基因 的出發(fā)菌株BMB871強，而且相對增效倍速達(dá)到了 5.7倍。 表1含bell基因的重組菌BMB0187與對照菌株BMB871對棉鈴蟲的殺蟲活性
10菡洙名稱基B型增效倍數(shù)
BMB8710.51
BMB0i87 上述結(jié)果說明本發(fā)明制備的蘇云金芽胞桿菌BMB0187的殺蟲活性比只含有 CrylAclO的出發(fā)菌株BMB871的殺蟲活性提高了近5倍。本發(fā)明的應(yīng)用前景顯示，利用 本發(fā)明的菌劑防治棉鈴蟲，在達(dá)到相同殺蟲效果的同時可以大大減少Bt農(nóng)藥的使用量， 從而可以節(jié)約大量的生產(chǎn)成本。另外，由于Bell蛋白本身來自于蘇云金芽胞桿菌，不存 在轉(zhuǎn)基因生物安全問題，展示本發(fā)明的bell基因在蘇云金芽胞桿菌基因工程菌構(gòu)建方面 具有良好的應(yīng)用價值。
序列表
<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué) <120>蘇云金芽胞桿菌增效蛋白基因bell的克隆與工程菌制備及應(yīng)用 <130> <141>2008-12-01 <160>2<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2202
<212>DNA<213>蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis) <220> <221>gene <222>(1)..(2202) <223> <220> <221>CDS <222>(1)..(2202) <223> <400>1atg tat aca atg ttt ttc etc ata gga aat ata cac tta cat get gat 48
Met Tyr Thr Met Phe Phe Leu lie Gly Asn lie His Leu His Ala Asp
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lie Phe Gin Ala Gly lie Ser Lys Gly Lys Tyr His Asp Arg Gin Asp
35 40 45tta gga ttt att ttg aag aga aat aca cca tta aag gta aga caa aca 192
11
Leu Gly Phe lie Leu Lys Arg Asn Thr Pro Leu Lys Val Arg Gin Thr 50 55 60 aat cct aat ttt aaa gac aaa tta aca tta cgt tta ttg tct aat gac 240 Asn Pro Asn Phe Lys Asp Lys Leu Thr Leu Arg Leu Leu Ser Asn Asp 65 70 75 80 tea aaa aat gaa aaa tec ata caa gta gga aat gaa tgg gtt act ate 288 Ser Lys Asn Glu Lys Ser lie Gin Val Gly Asn Glu Trp Val Thr lie 85 90 95 caa ggt gat acg tct tta gtt cct ttc ata gat act ccg tat ggt gaa 336 Gin Gly Asp Thr Ser Leu Val Pro Phe lie Asp Thr Pro Tyr Gly Glu 100 105 110 gag cac get gta ctt gag tac caa gta ggg aat gaa agt get act aac 384 Glu His Ala Val Leu Glu Tyr Gin Val Gly Asn Glu Ser Ala Thr Asn 115 120 125 ccc ctt ccc att tat aaa caa caa gga agt gta tct caa ttt ttt agt 432 Pro Leu Pro lie Tyr Lys Gin Gin Gly Ser Val Ser Gin Phe Phe Ser 130 135 140 aca tgg gat caa ttt gat gga gag tat gcg tta ctt caa ggg gag agt 480 Thr Trp Asp Gin Phe Asp Gly Glu Tyr Ala Leu Leu Gin Gly Glu Ser 145 150155 160 ttt caa tta ttt gta cct aaa aaa gat aaa gag tta gta aga tct tta 528 Phe Gin Leu Phe Val Pro Lys Lys Asp Lys Glu Leu Val Arg Ser Leu 165 170 175 aaa gat ttt caa tea ttg gat gag tta att gcg tat tat gaa gat att 576 Lys Asp Phe Gin Ser Leu Asp Glu Leu lie Ala Tyr Tyr Glu Asp lie 180185 190 ttt gtg atg tat gat tea att att ggt tta gat ggc tea acg ttt gaa 624 Phe Val Met Tyr Asp Ser lie lie Gly Leu Asp Gly Ser Thr Phe Glu 195 200 205 aat aaa aaa agt caa aat cgt tat ttc tta aaa gca gat ata tct ggt 672 Asn Lys Lys Ser Gin Asn Arg Tyr Phe Leu Lys Ala Asp lie Ser Gly 210 215 220 get ggc ggt gcc tat tat ggc aca aat tgg aca gcg aat agt aca gat 720 Ala Gly Gly Ala Tyr Tyr Gly Thr Asn Trp Thr Ala Asn Ser Thr Asp 225 230 235 240 agt aca aag atg tgg tta gat aaa eta agt tgg gga act tta cat gaa 768 Ser Thr Lys Met Trp Leu Asp Lys Leu Ser Trp Gly Thr Leu His Glu 245 250 255 ate get cat gga tac caa get ggt ttt gat aat caa gga ata ttt aca 816
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260 265 270 gga gaa gtt tct aat aat eta ttt ggt gtt caa tat caa tat agt aaa 864 Gly Glu Val Ser Asn Asn Leu Phe Gly Val Gin Tyr Gin Tyr Ser Lys
275 280 285 tac ggc aaa aaa gca gat caa gtt ggt tgg ttg ttt aat ttc ggg aaa 912 Tyr Gly Lys Lys Ala Asp Gin Val Gly Trp Leu Phe Asn Phe Gly Lys
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355 360 365 tct tta cca gat tta atg aat cag tat tat agt gag aat gga caa gtt 1152 Ser Leu Pro Asp Leu Met Asn Gin Tyr Tyr Ser Glu Asn Gly Gin Val
370 375 380 gat ttt aca cct gtt ttt gaa aga tgg ggc ttt aag ctt aat cat aaa 1200 Asp Phe Thr Pro Val Phe Glu Arg Trp Gly Phe Lys Leu Asn His Lys 385 390 395 400 caa ata gag atg aat agg gcg aaa ggt ttt ccg get gtt act tct tta 1248 Gin lie Glu Met Asn Arg Ala Lys Gly Phe Pro Ala Val Thr Ser Leu 405 410 415 get tat ata gtg cct gaa tea caa tta gcg aaa gca aga get ata gtt 1296 Ala Tyr lie Val Pro Glu Ser Gin Leu Ala Lys Ala Arg Ala lie Val
420 425 430 gat cct gat att ccg ata aac tec aac ttc gaa ata gtt acg aat cag 1344 Asp Pro Asp lie Pro lie Asn Ser Asn Phe Glu lie Val Thr Asn Gin
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450 455 460 aca aat gaa ata gat aca tta aaa gga gga aaa att aaa tta aaa gaa 1440:0181 ] Thr Asn Glu lie Asp Thr Leu Lys Gly Gly Lys lie Lys Leu Lys Glu
:0182] 465 470 475 ■
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:0203] 580 585 590
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14
Glu Glu Asn Leu lie Gin Arg lie Asp Glu Glu Met Glu Ala lie lie 675680 685 ggt aat cag ttt tta aaa gag ata cca atg caa aaa tta gaa atg aaa 2112 Gly Asn Gin Phe Leu Lys Glu lie Pro Met Gin Lys Leu Glu Met Lys 690 695 700 aag aat gtg tgg atg gca ata aat atg tta tea gaa cca caa aaa ata 2160 Lys Asn Val Trp Met Ala lie Asn Met Leu Ser Glu Pro Gin Lys lie 705 710 715 acg tat atg aat aaa tat aaa gat age tta tat aat gaa taa 2202 Thr Tyr Met Asn Lys Tyr Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu 720 725 730 <210>2 <211>733 <212>PRT <213>蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis) <400>2 Met Tyr Thr Met Phe Phe Leu lie Gly Asn lie His Leu His Ala Asp 15 10 15 Glu Arg lie Asn Ala Lys Lys lie Thr Ser Leu Glu Glu Pro Thr Trp 20 25 30 lie Phe Gin Ala Gly lie Ser Lys Gly Lys Tyr His Asp Arg Gin Asp 35 40 45 Leu Gly Phe lie Leu Lys Arg Asn Thr Pro Leu Lys Val Arg Gin Thr 50 55 60 Asn Pro Asn Phe Lys Asp Lys Leu Thr Leu Arg Leu Leu Ser Asn Asp 65 70 75 80 Ser Lys Asn Glu Lys Ser lie Gin Val Gly Asn Glu Trp Val Thr lie 85 90 95 Gin Gly Asp Thr Ser Leu Val Pro Phe lie Asp Thr Pro Tyr Gly Glu 100 105 110 Glu His Ala Val Leu Glu Tyr Gin Val Gly Asn Glu Ser Ala Thr Asn 115 120 125 Pro Leu Pro lie Tyr Lys Gin Gin Gly Ser Val Ser Gin Phe Phe Ser 130 135 140 Thr Trp Asp Gin Phe Asp Gly Glu Tyr Ala Leu Leu Gin Gly Glu Ser 145 150 155 160 Phe Gin Leu Phe Val Pro Lys Lys Asp Lys Glu Leu Val Arg Ser Leu 165 170 175 Lys Asp Phe Gin Ser Leu Asp Glu Leu lie Ala Tyr Tyr Glu Asp lie
15
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16
Leu Gin Asp Val Pro Asn Gly Val Tyr Thr Val Glu lie Ser Gly Gly 500 505 510 Lys Thr Asn Ser Met Tyr His Phe Ser Ser Tyr Tyr Ala Tyr Val Lys 515 520 525 Glu Lys Asp Asn Ser Leu Lys lie Asp lie Asn Glu Met Lys Val Ser 530 535 540 Lys Leu Val Asn Glu Thr lie Gin Phe Leu Gly Leu Gly Asp Asp Gin 545 550 555 560 Phe Ala Val Leu Asn Thr Asp Leu Glu Gin Asn Arg Ala lie Phe Thr 565 570 575 lie Thr Thr Lys Thr Pro His Ser Tyr Tyr Ala Gly Glu Lys Tyr Ala 580 585 590 Ser lie Glu Val Phe Asn Glu Lys Gly Glu Lys lie Tyr Thr Lys Glu 595 600 605 Met Glu Gly Thr Asn Val Thr lie Val Lys Asp lie lie Pro Leu Lys 610 615 620 Glu Gly Tyr Arg lie Lys lie Tyr His Asp Glu lie Lys Lys Arg Leu 625 630 635 640 Thr Ser Lys Ala Thr lie lie Asn Pro Met Asn Lys Met Asn Glu Phe 645 650 655 lie lie Thr Lys Trp Gly Leu Lys Asn Thr Ser Leu Gin Asn Asn Pro 660 665 670 Glu Glu Asn Leu lie Gin Arg lie Asp Glu Glu Met Glu Ala lie lie 675 680 685 Gly Asn Gin Phe Leu Lys Glu lie Pro Met Gin Lys Leu Glu Met Lys 690 695 700 Lys Asn Val Trp Met Ala lie Asn Met Leu Ser Glu Pro Gin Lys lie 705 710 715 720 Thr Tyr Met Asn Lys Tyr Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu 725 730
權(quán)利要求
一種分離克隆的蘇云金芽胞桿菌增效蛋白bel1基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO1所示。
2. —種分離克隆的蘇云金芽胞桿菌增效蛋白Belli的編碼基因，它的氨基酸序列如序 列表SEQIDNO : 1所示。
3. —株重組蘇云金芽胞桿菌增效蛋白bell基因的工程菌，該工程菌是蘇云金芽胞桿菌 (Bacillus thuringiensis)BMB0187，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏編號 為CCTCCNO : M208245。
4. 權(quán)利要求2所述的編碼基因作為蛋白在制備微生物殺蟲劑中的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求2所述的編碼基因作為蛋白在轉(zhuǎn)基因微生物或轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求3所述的工程菌BMB0187在制備微生物殺蟲劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。公開了一種來自于蘇云金芽胞桿菌的增效蛋白基因bel1的分離、克隆及增效蛋白Bel1在生物殺蟲劑中的應(yīng)用。從蘇云金芽胞桿菌庫斯塔克亞種YBT-1520菌株中分離得到一個新的增效蛋白基因bel1，該基因編碼產(chǎn)物為一種新的增效蛋白Bel1；該蛋白對鱗翅目昆蟲的殺蟲晶體蛋白Cry1Ac具有很強的殺蟲增效活性；本發(fā)明制備的重組蛋白的殺蟲活性是出發(fā)菌株殺蟲蛋白活性的5.7倍。本發(fā)明還包括重組蘇云金芽胞桿菌增效蛋白bel1基因工程菌的制備，該工程菌已保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏編號為CCTCC NOM208245。
文檔編號C12N15/31GK101691572SQ200810236718
公開日2010年4月7日 申請日期2008年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月9日
發(fā)明者喻子牛, 孫明, 彭東海, 方尚玲, 羅春平, 阮麗芳, 陳守文 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)