專利名稱：一種重組藍藻的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種重組藍藻。
背景技術：
全球面臨的能源問題、環(huán)境問題向人們提出了發(fā)展可再生清潔能源的要求，而糧 食短缺問題又要求可再生清潔能源的發(fā)展要實現不與人爭糧、不與作物爭地、不與人和作 物爭淡水。 丁醇(butanol)是一種重要的化工原料，主要用于制造增塑劑、溶劑、萃取劑等， 是一種高附加值化學品，全球年需求量超過140萬噸。此外，丁醇還是一種極具潛力的新型 生物燃料，具有如下優(yōu)點其熱值、辛烷值與汽油相當，含氧量與汽油中常用的甲基叔丁基 醚相近；其不腐蝕管道，便于管道輸送；其蒸汽壓低，安全性高，能與汽油以任意比混合。
丁醇可由發(fā)酵和石油化工合成法生產，由于石油危機，丁醇發(fā)酵生產成為研究熱 點。發(fā)酵生產主要是通過丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)發(fā)酵糧食生產丁 醇。從70年代起三十幾年的研究，闡明了丙酮丁醇梭菌的丁醇代謝途徑，使丁醇發(fā)酵生產 取得了很大進展。但丁醇發(fā)酵生產存在發(fā)酵底物成本高、產物丁醇中混雜有丙酮、丙酮丁醇 梭菌嚴格厭氧及丁醇對細胞有毒害等缺點。因此，科學家們在改進發(fā)酵生產丁醇的同時也 在探索用非厭氧菌生物合成丁醇。美國和日本的科學家先后將丙酮丁醇梭菌的丁醇合成途 徑導入大腸桿菌中，并得到有丁醇產生的菌株。這種方法雖然解決了梭菌發(fā)酵生產丁醇時 產物中混有丙酮和產丁醇梭菌的嚴格厭氧不利于操作的問題，但大腸桿菌仍為異養(yǎng)菌，其 原料成本依然很高，沒有解決發(fā)展生物能源與糧食問題的沖突。 藍藻(blue-green algae)又稱藍細菌(cyanobacteria)，是可以進行放氧光合作 用的原核生物。藍藻能夠利用二氧化碳和太陽能快速繁殖，而且其廣泛分布在淡水、海水甚 至是污水中，是生物合成能源產品的理想宿主。作為原核生物，藍藻細胞結構簡單、遺傳背 景與大腸桿菌相似，易于基因操作。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種產丁醇的重組藍藻。 本發(fā)明所提供的重組藍藻，是通過包括如下步驟的方法得到的重組藍藻向藍藻 中導入如下1)、2)或3)中所述的丁醇合成相關基因 1)所述丁醇合成相關基因包括如下酶的編碼基因電子轉移黃素蛋白A亞基、烯 酰水合酶(又稱烯酰輔酶A水合酶)、丁酰輔酶A脫氫酶、乙醇脫氫酶； 2)所述丁醇合成相關基因包括如下酶的編碼基因電子轉移黃素蛋白B亞基、烯 酰水合酶、丁酰輔酶A脫氫酶、乙醇脫氫酶； 3)所述丁醇合成相關基因包括如下酶的編碼基因電子轉移黃素蛋白A亞基、電
子轉移黃素蛋白B亞基、烯酰水合酶、丁酰輔酶A脫氫酶、乙醇脫氫酶。 所述丁醇合成相關基因還可包括如下酶的編碼基因3-羥丁酰輔酶A脫氫酶和/或乙酰輔酶A乙酰轉移酶(又稱硫解酶)和/或丁醇脫氫酶。 所述方法還可包括滅活所述藍藻中的至少一個聚-13羥基丁酸酯合成相關基因 的步驟。 所述滅活的方法可為用至少一個的所述丁醇合成相關基因替換至少一個的所述 聚-P羥基丁酸酯合成相關基因。 所述聚-P羥基丁酸酯合成相關基因具體可為聚-13羥基丁酸酯合成酶的編碼基 因；所述滅活的方法具體可為用所述乙醇脫氫酶的編碼基因替換所述聚_3羥基丁酸酯合 成酶的編碼基因。 所述滅活的方法可以是通過同源重組實現的。 本發(fā)明方法中導入的丁醇合成相關基因可以自行通過復制型重組質粒來進行表
達(即不包括滅活所述色球藻科藍藻中的至少一個聚-P羥基丁酸酯合成相關基因的步驟
的情況)，也可以整合到染色體上進行表達(即包括滅活所述色球藻科藍藻中的至少一個
聚-13羥基丁酸酯合成相關基因的步驟情況)，或者二者同時進行。 所述各酶可以是如下氨基酸序列的蛋白質 所述烯酰水合酶為如下1)或2)所述的蛋白質 1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質； 2)將序列表中序列3的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且具有烯酰水合酶功能的由1)衍生的蛋白質；
所述丁酰輔酶A脫氫酶為如下a)或b)所述的蛋白質
a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質； b)將序列表中序列4的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且具有丁酰輔酶A脫氫酶功能的由a)衍生的蛋白質；
所述電子轉移黃素蛋白B亞基為如I或II所述的蛋白質
I由序列表中序列5所示的氨基酸序列組成的蛋白質； II將序列表中序列5的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且具有電子轉移黃素蛋白B亞基功能的由I衍生的蛋白質；
所述電子轉移黃素蛋白A亞基為如下i或ii所述的蛋白質
i由序列表中序列6所示的氨基酸序列組成的蛋白質； ii將序列表中序列6的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且具有電子轉移黃素蛋白A亞基功能的由i衍生的蛋白質；
所述3-羥丁酰輔酶A脫氫酶為如下①或②所述的蛋白質
①由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質； ②將序列表中序列7的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失
和/或添加且具有3_羥丁酰輔酶A脫氫酶功能的由①衍生的蛋白質； 所述丁醇脫氫酶為如下A或B所述的蛋白質 A.由序列表中序列8所示的氨基酸序列組成的蛋白質； B.將序列表中序列8的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且具有丁醇脫氫酶功能的由A衍生的蛋白質；
所述乙醇脫氫酶為如下A)或B)所述的蛋白質
A)由序列表中序列9所示的氨基酸序列組成的蛋白質； B)將序列表中序列9的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且具有乙醇脫氫酶功能的由A)衍生的蛋白質； 所述乙酰輔酶A乙酰轉移酶(又稱硫解酶)為如下(1)或(2)所述的蛋白質 (1)由序列表中序列10所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (2)將序列表中序列10的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且具有乙酰輔酶A乙酰轉移酶功能的由(1)衍生的蛋白質。 所述導入的各酶的核苷酸序列可以如下 所述烯酰水合酶的編碼基因為如下1) 、2)或3)所述的基因 1)其核苷酸序列為序列表中序列1自5'末端第1-786位核苷酸的DNA分子； 2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； 3)與1)限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子； 所述丁酰輔酶A脫氫酶的編碼基因為如下a) 、 b)或c)所述的基因 a)其核苷酸序列為序列表中序列1自5'末端第800-1939位核苷酸的DNA分子； b)在嚴格條件下與a)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； c)與a)限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子； 所述電子轉移黃素蛋白B亞基的編碼基因為如I、 II或III所述的基因 I其核苷酸序列為序列表中序列1自5'末端第1958-2737位核苷酸的DNA分子； II在嚴格條件下與I限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； III與I限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子； 所述電子轉移黃素蛋白A亞基的編碼基因為如下i、 ii或iii所述的基因 i其核苷酸序列為序列表中序列1自5'末端第2756-3766位核苷酸的DNA分子； ii在嚴格條件下與i限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； iii與i限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子； 所述3-羥丁酰輔酶A脫氫酶的編碼基因為如下①、②或③所述的基因 ①核苷酸序列為序列表中序列1自5'末端第3871-4719位核苷酸的DNA分子； ②在嚴格條件下與①限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； ③與①限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子； 所述乙醇脫氫酶的編碼基因為如下A、 B或C所述的基因 A.其核苷酸序列為序列表中序列2自5'末端第610-3186位核苷酸的DNA分子； B.在嚴格條件下與A限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； C.與A限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子； 所述丁醇脫氫酶的編碼基因為如下(1) 、 (2)或(3)所述的基因 (1)其核苷酸序列為序列表中序列11所示的DNA分子； (2)在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； (3)與(1)限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子； 所述乙酰輔酶A乙酰轉移酶的編碼基因為如下(1) 、 (2)或(3)所述的基因 (1)其核苷酸序列為序列表中序列12所示的DNA分子； (2)在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；
(3)與(1)限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子；
本發(fā)明中所用的出發(fā)菌可以藍藻門中的任一藍藻，具體可以是色球藻科藍藻，具 體可如色球藻科藍藻為淡水藍藻聚球藻6803(Synechocystis sp. PCC 6803)和海水藍藻聚 球藻7002(Synechococcus sp. PCC 7002)。 本發(fā)明中得到的重組藍藻具體為藍藻集胞藻(Synechocystis sp. ) SMB-100CGMCC No.2795和聚球藻(Synechococcus sp.)SMB-101 CGMCC No. 2794。 藍藻集胞藻(Synechocystis sp. )SMB-IOO已于2008年12月10日保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國 科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 2795。 聚球藻(Synechococcus sp. )SMB-lOl已于2008年12月10日保藏于中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學 院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 2794。 本發(fā)明利用了藍藻可以進行光合自養(yǎng)的特性、可以在海水和污水中生長的特性及 易于進行基因操作的優(yōu)點。 本發(fā)明對藍藻代謝途徑進行改造和重建，在藍藻中建立丁醇合成途徑，使其具有 產丁醇的能力。這樣構建的重組藍藻根據其自身的光合自養(yǎng)的特點來大量繁殖，從而產生 更多的能源產品丁醇。本發(fā)明中使用藍藻自身的誘導啟動子，在控制丁醇合成途徑的同時 又避免了丁醇對藍藻的毒害作用。 本發(fā)明實現了利用藍藻將地球上取之不盡的太陽能和溫室氣體二氧化碳轉化為 能源產品丁醇，避免了能源再生過程中對糧食等其它有機物的浪費，同時又有利于環(huán)境保 護。因此，利用本發(fā)明重組藍藻來生產丁醇是實現可再生清潔能源持續(xù)、健康發(fā)展的理想途 徑之一。


圖1為重組藍藻SMB-100的鑒定。 圖2為標準品中丁醇的色譜圖。 圖3為重組藍藻8MB-100培養(yǎng)液中丁醇的色譜圖。 圖4為重組藍藻SMB-101的鑒定。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從生物公司購買。 下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。 本發(fā)明的總體構思如下 —、通過代謝工程改造，在藍藻中建立丁醇合成途徑 1、從丙酮丁醇梭菌中克隆丁醇合成途徑中所需酶的編碼基因烯酰水合酶 (crt) 、 丁酰輔酶A脫氫酶(bed)、電子轉移黃素蛋白B亞基(etfB)、電子轉移黃素蛋白A亞 基(etfA) 、3-羥丁酰輔酶A脫氫酶(hbd)和乙醇脫氫酶(adhe)。其中前五個基因crt、bcd、 etfB、 etfB和hbd為一個操作子，將其命名為命名為crt操縱子。
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2、在藍藻中誘導表達crt操縱子構建藍藻表達載體pAM-crt，使crt操縱子在藍 藻內源銅誘導啟動子的啟動下，在藍藻中誘導表達。 3、在藍藻中表達乙醇脫氫酶基因(adhe):通過同源重組，將adhe基因整合在藍藻 基因組DNA上，并使其表達。 二、工程藍藻的鑒定及丁醇的誘導合成與檢測 1、基因水平鑒定上述丁醇合成途徑所需酶的編碼基因已成功轉入藍藻中； 2、通過誘導激活工程藻中建立的丁醇合成途徑，使工程藻產丁醇；通過液相色譜
檢測工程藍藻中有丁醇產生。 下述實施例中，出發(fā)菌分別為色球藻科集胞藻屬淡水藍藻集胞藻 6803 (Synechocystis sp. PCC 6803)(Zhang S， Spann KW， et al. Identification oftwo genes， sll0804 and slrl306， as putative components of theC02—concentrating mechanism in the cyanobacterium Synechocystis sp. strainPCC 6803.J Bacteriol. 2008 190 :8234-7 ;)(中國科學院微生物研究所)和色球藻科聚球藻屬海水藍 藻聚球藻7002(Synechococcus sp. PCC 7002) : (Tin Z, Hei皿ickel M, et al. Biogenesis of iron—sulfur clusters in photosystem I :holo—NfuA from the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 r即idly andefficiently transfers [4Fe_4S] clusters to 即o-PsaC in vitro. .T Biol Chem. 2008,283 :28426-35)(中國科學院微生物研究所)。
丙酮丁醇梭菌為丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC824(US2007020740(A1));藍藻表達載體pAM2770 (Wu X， Li DW， et al. The Anabaenasp. strain PCC 7120 asrl734 gene encodes a negative regulator of heterocystDevelopment. Molecul Microbiol. 2007,64 :782-794.)(中國科學院微生 物石開究所)；質茅立pRL271 (Wei TF， Ramasubramanian TS， et al. Anabaena sp. strain PCC7120 ntcA Gene required for growth on nitrate and heterocyst development. JBacteriol. 1994， 176 :4473-4482.)。(中國科學院微生物研究所)。 下述實施例中Synechocystis sp. PCC 6803及其工程菌轉化、篩選及培養(yǎng)時所用 培養(yǎng)基為BG-11培養(yǎng)基，基因工程菌株篩選時添加lOii g/ml的卡那霉素和lOii g/ml的氯霉素。 下述實施例中Synechococcus sp. PCC 7002及其工程菌轉化、篩選及培養(yǎng)時所用 培養(yǎng)基為Medium 957培養(yǎng)基，基因工程菌株篩選時添加10 y g/ml的卡那霉素和10 y g/ml 的氯霉素。 BG-11培養(yǎng)基組成每升培養(yǎng)基中含有NaN031.5g， K2HP040 . 04g， MgS04 7H200. 075g， CaCl2 2H20 0. 036g，擰檬酸0. 006g，擰檬酸鐵銨0. 006g， EDTA(disodiumsalt)O. 001g，Na2C030 . 02g， Trace metal mix A5 1. 0ml，瓊脂10. 0g，蒸餾水 1. 0L， pH 7. 1±0. 3。 Medium 957培養(yǎng)基組成每升培養(yǎng)基中含有蒸餾水250. 0ml，海水750. Oml， MgS04 7H20 0. 04g， CaCl2 2H20 0. 02g， NaN03 0. 75g， K2HP04 3H20 0. 02g，擰檬酸3. 0mg， 檸檬酸鐵銨3. 0mg， EDTA(disodium potassium salt)乙二胺四乙酸0. 5mg， Na2C030 . 02g， Trace metal mix A5 1. 0ml，瓊月旨10. 0g， pH 8. 5±0. 3。Trace metal mix A5組成每升中含有1138032 . 86g，MnCl2 *4H20 1. 81g， ZnS04 *7H200. 222g， NaMo04 2H20 0. 39g， CuS04 5H20 0. 079g， Co(N03)2 6H2049. 4mg，蒸餾水1. 0L。
實施例1、色球藻科集胞藻屬(Synechocystis)淡水藍藻集胞藻的重組構建
本實施例中使用的出發(fā)藍藻為淡水藍藻集胞藻6803 (Synechocystis sp.PCC6803)。 —、向出發(fā)菌中導入丁醇合成相關基因 本實驗中的丁醇合成相關基因由crt基因、bcd基因、etfB基因、etfA基因和hbd
基因組成，組成一個crt操縱子，各基因均來自梭菌。 1 、 crt操縱子的擴增 提取丙酮丁醇梭菌基因組DNA; 根據丙酮丁醇梭菌基因組中crt操縱子DNA序列和藍藻表達載體pAM2770上的酶 切位點設計引物如下 crtF :ATTC GAGCTC AATGGAACTAAACAATGTCATCCT (下劃線部分為Sacl酶切位點)；
crtR :CG GGATCC ATGGGGATTCTTGTAAACTTATT (下劃線部分為BamHI酶切位點)。
以丙酮丁醇梭菌基因組DNA為模板、以crtF和crtR為引物，進行PCR擴增；對擴增 產物進行測序，得到的基因的序列如序列表中序列l(wèi)所示，表明擴增產物為有crt基因、bcd 基因、etfB基因、etfA基因和hbd基因的crt操縱子，序列正確，其中自序列1的5'末端第 1-786位核苷酸為crt基因的序列，第800-1939位核苷酸為bed基因的序列，第1958-2737 核苷酸為etfB基因的序列，第2756-3766位核苷酸為etfA基因的序列，第3871-4719位核 苷酸為hbd基因的序列。 2、重組藍藻表達載體pAM-crt的構建 為避免丁醇對藍藻生長的毒害作用，使用藍藻內源啟動子銅誘導啟動子petE在 藍藻中誘導表達crt操縱子。 用限制性內切酶Sacl和BamHI酶切上述crt操縱子；用限制性內切酶Sacl和
BamHI酶切藍藻表達載體pAM2770，回收大片段；將兩酶切產物連接，連接產物轉化至大腸
桿菌中，通過50ii g/ml卡那霉素篩選，得到重組質粒。重組質粒序列分析結果表明，crt操
縱子正確插入到pAM2770載體上銅誘導啟動子petE下游Sacl和BamHI位點，并且插入的
序列正確，將正確的陽性重組藍藻表達載體命名為pAM-crt。 3、pAM-crt對藍藻Synechocystis sp. PCC 6803的轉化及篩選 轉化方法具體步驟為收集處于對數生長期的藍藻細胞，用培養(yǎng)基BG-ll洗滌細
胞后，將質粒pAM-crt加入到藍藻培養(yǎng)液中混勻，光照下靜止培養(yǎng)5小時； 篩選在含有卡那霉素的固體BG-ll培養(yǎng)基平板上篩選重組子，卡那霉素篩選濃
度為10 y g/ml ; 將得到的陽性重組藍藻命名為PCC 6803/pAM-crt。4、空載體pAM2770對藍藻Synechocystis sp. PCC 6803的轉化及篩選 轉化方法具體步驟為收集處于對數生長期的藍藻細胞，用培養(yǎng)基BG-ll洗滌細
胞后，將質粒pAM2770加入到藍藻培養(yǎng)液中混勻，光照下靜止培養(yǎng)5小時。 篩選在含有卡那霉素的固體BG-ll培養(yǎng)基平板上篩選重組子，卡那霉素篩選濃
度為lOii g/ml。； 將得到的含空載體的重組藍藻命名為PCC 6803/pAM2770。
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二、用丙酮丁醇梭菌丁醇合成途徑中adhe基因替換藍藻Synechocystis sp. PCC 6803中PHB合成酶基因 由于藍藻中存在聚羥基丁酸(PHB)次級代謝途徑，PHB合成與丁醇合成有共同 的前體，而PHB合成酶的敲除不影響藍藻生長，因此，用丁醇合成途徑中最后一個酶乙醇 脫氫酶基因(adhe)來取代藍藻基因組中的PHB合成酶基因(phb)，構建整合表達載體 pUC-up-adhe-Cm-down，通過同源重組，用adhe和氯霉素抗性基因(Cm)取代藍藻PHB合成 酶基因。 1、藍藻同源重組整合表達載體pUC-up-adhe-Cm-down的構建
adhe基因的獲得以丙酮丁醇梭菌的基因組DNA為模板，用下述引物(adheF/ adheR)進行PCR擴增，PCR產物測序，得到adhe基因，其核苷酸序列如序列表中序列2中第 610-3186位核苷酸所示。 up為藍藻基因組DNA中phb編碼區(qū)上游的600bp DNA片段，通過以下方法獲得 以淡水藍藻集胞藻6803(Synechocystis sp. PCC 6803)的基因組DNA為模板，用下述引物 進行PCR擴增，PCR產物測序，得到up序列，其核苷酸序列如序列表中序列2中第1-609位 核苷酸所示。 down為藍藻基因組DNA中phb編碼區(qū)下游的600bp DNA片段，通過以下方法獲得 以淡水藍藻集胞藻6803(Synechocystis sp. PCC 6803)的基因組DNA為模板，用下述引物 (downF/downR)進行PCR擴增，PCR產物測序，得到down序列，其核苷酸序列如序列表中序 列2中第4402-4996位核苷酸所示。Cm序列的獲得以質粒pRL271為模板，用下述引物(CmF/CmR)進行PCR擴增，PCR 產物測序，得到Cm序列，其核苷酸序列如序列表中序列2中第3352-4401位核苷酸所示。
up-adhe的獲得首先PCR分別擴增得到up和adhe，然后再把兩片段混在一起作 模板，用upF/adheR引物對進行第二輪PCR擴增，得到up-adhe ; Cm-down的獲得首先PCR分別擴增得到Cm和down,然后再把兩片段混在一起作 模板，用CmF/downR引物對進行第二輪PCR擴增，得到Cm-down ;; pUC-up-adhe-Cm-down的獲得用限制性內切酶Xbal酶切Cm-down，用限制性 內切酶Xbal酶切pUC-18載體，連接得到重組載體pUC-18/Cm-down ;用限制性內切酶 BamHI酶切up-adhe，用限制性內切酶BamHI酶切pUC-18/Cm-down，連接得到重組載體 pUC_up_adhe_Cm_down 。 陽性質粒的轉化及篩選用pUC-up-adhe-Cm-down轉化大腸桿菌，經50 y g/ml氨 節(jié)霉素和30 g/ml氯霉素篩選陽性克隆。 陽性質粒的驗證將篩選得到的陽性質粒進行測序，表明插入的up-adhe-Cm-down
序列如序列表中序列2所示，得到載體pUC-up-adhe-Cm-down正確； 擴增各片段及融合PCR所需引物如下卯F :5， -CGCGGATCCCAGATTCGGTCTTCCCCCAGGCG (BamHI) 卯R : 5 ， -CTTTTTGATTTGTAACTTTCATGGTCAAAATCCACCTTACTACTGGC (up-adhe融合所 需嵌合引物)adheF :5' -ATGAAAGTTACAAATCAAAAAGAadheR :5' —CGCGGATCCAAAGAATTGTGGAGTAAAGGATA(BamHI)
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CmF :5' -GCTCTAGAGGTTGATAATGAACTGTGCTGAT(Xbal)CmR:5' -GTTGCCCTAATGTATTCCAGCAAATCGAATTTCTGCCATTCATCCG (Cm-down融合所需嵌合引物) downF:5' -TTGCTGGAATACATTAGGGCAAC downR :5' -GCTCTAGAGATATCGAAGCGGACAACGGCAT (Xbal) 2、將pUC-up-adhe-Cm-down轉化至實驗一中的重組藍藻PCC 6803/pAM_crt中
轉化方法具體步驟為收集處于對數生長期的重組藍藻PCC 6803/pAM-crt細胞， 用培養(yǎng)基BG-11洗滌細胞后，將質粒pUC-up-adhe-Cm-down加入到細胞液中混勻，光照下靜 止培養(yǎng)5小時。 篩選在含有氯霉素的固體BG-ll培養(yǎng)基平板上篩選重組子，氯霉素篩選濃度為 lOii g/ml ;將篩選得到的重組藍藻命名為SMB-IOO。 同時向藍藻PCC 6803/pAM2770中轉入空載體pUC-18，將得到的重組藍藻命名為
PCC 6803/pAM2770/pUC，作為對照；同時向藍藻PCC 6803中轉入空載體pUC18，作為對照，
將得到的重組藍藻命名為PCC 6803/pUC。三、重組藍藻SMB-100的驗證及目標產物丁醇的檢測 (1)基因水平鑒定 分別提取藍藻SMB-100、PCC 6803/pAM2770、PCC 6803/pUC和PCC 6803/pAM2770/ pUC的總DNA ;再分別以crtF、 crtR和phb700F、 phb700R(藍藻PHB合成酶基因的上下 游700bp處設計的引物)為引物，進行PCR擴增。結果如圖IA所示，在SMB-100中用引 物crtF、 crtR擴增得到4. 7kb的DNA片段，大小與crt操縱子一致；在對照組中用引物 crtF、 crtR沒有擴增到條帶，表明上述丁醇合成途徑所需酶的編碼基因crt操縱子已成 功轉入藍藻SMB-IOO中。結果如圖IB所示，在SMB-100中，用引物phb700F、 phb700R擴 增得到5. 3kb的DNA片段，大小與up-adhe-Cm-down 一致；在對照組中用引物phb700F、 phb700R擴增到3.4kb片段，該片段為PHB合成酶基因(2kb)及其上下游700bp，這表明 adhe基因已成功轉入藍藻SMB-100中，并且adhe基因已通過同源重組成功取代PHB合 成酶基因。(圖1中，A為crt操縱子導入重組藍藻SMB-100的鑒定，泳道1 :DNA Maker 入DNA/HindIII，泳道2 :SMB-IOO，泳道3 :對照組PCC 6803/pAM2770，泳道4 :對照組PCC 6803/pUC、泳道5 :對照組PCC 6803/pAM2770/pUC ;B為adhe基因整合到SMB-100基因 組的鑒定，泳道1 :DNA Maker入DNA/HindIII，泳道2 :SMB-IOO，泳道3 :對照組PCC6803/ pAM2770，泳道4 :對照組PCC 6803/pUC，泳道5 :對照組PCC6803/pAM2770/pUC) 。 phb700F : 5， -TACAACATTTTTCTGTAGGC-3，， phb700R :5， -ATGTCGCCTATCAACTGTTGA-3，。
(2)重組藍藻SMB-100生產丁醇性能的檢測 將重組藍藻SMB-100接種于不含銅的BG-11培養(yǎng)基中，在30。C 、60 iimol m—2s—1光 照、振蕩的條件下培養(yǎng)至對數生長后期，使其細胞密度達到0D73。 = 1. 5 ;向培養(yǎng)液中加入 2 M CuS04使銅誘導啟動子petE啟動adhe基因和crt操縱子的表達，進而誘導丁醇合成； 在銅誘導48小時后，取培養(yǎng)液進行液相色譜檢測。 液相色譜檢測方法為樣品前處理取培養(yǎng)液12000rpm離心lmin，取上清液， 用0. 22 ii m濾膜過濾；色譜條件:Agilent 1200液相色譜儀，示差檢測器;BioRadAminex HPX-87H有機酸柱(300*7. 8mm)，柱溫15 °C ;上樣量10iU ;流動相為O. 05mM H2S04，流速0. 5ml/min。 丁醇標準品購自Sigma公司(目錄號4C006217);在如上色譜條件下標準品中丁
醇的保留時間為40. 9分鐘，丁醇標準品的檢測圖譜如圖2所示(A表示丁醇)。 重組藍藻SMB-100培養(yǎng)液的上清的檢測圖譜如圖3所示(A表示丁醇)。 實驗設3次重復，結果取平均數。結果表明，工程藻SMB-100生產丁醇的能力為
0. 27g/L培養(yǎng)液。 實施例2、色球藻科聚球藻屬海水藍藻聚球藻7002的重組構建 本實施例中使用的出發(fā)藍藻為海水藍藻聚球藻7002 (Synechococcus
sp.PCC7002)。 —、向出發(fā)菌中導入丁醇合成相關基因 導入基因的序列及導入方法均與實施例1中一所述一致。轉入空載體pAM2770的重組藍藻命名為PCC 7002/pAM2770。 二、用梭菌丁醇合成途徑中adhe基因替換藍藻Synechocystis sp. PCC 6803中 PHB合成酶基因 方法均與實施例1中二所述一致。 既導入空載體pAM2770又導入空載體pUC18的藍藻命名為PCC7002/pAM2770/pUC，
作為對照；向藍藻PCC 7002中轉入空載體pUC18的藍藻命名為PCC 7002/pUC。 將得到的含有adhe基因和crt操縱子的重組藍藻命名為SMB-lOl。 三、藍藻SMB-101的驗證及目標產物丁醇的檢測 (l)基因水平鑒定 鑒定方法與實施例1中三所述一致。 結果如圖4A所示，在SMB-101中用引物crtF、crtR擴增得到4. 7kb的DNA片段，大 小與crt操縱子一致；在對照組中用引物crtF、crtR沒有擴增到條帶，表明上述丁醇合成途 徑所需酶的編碼基因crt操縱子已成功轉入藍藻SMB-101中。結果如圖4B所示，在SMB-101 中，用引物phb700F、 phb700R擴增得到5. 3kb的DNA片段，大小與up-adhe-Cm-down —致； 在對照組中用引物phb700F、phb700R擴增到3. 4kb片段，該片段為PHB合成酶基因(2kb)及 其上下游700bp這表明adhe基因已成功轉入藍藻SMB-101中，并且adhe基因已通過同源重 組成功取代PHB合成酶基因。(圖4中，A為crt操縱子導入重組藍藻SMB-101的鑒定，1 : DNA Maker ADNA/Hindlll ;2 :SMB-lOl ;3 :對照組PCC 7002/pAM2770， 4 :對照組PCC 7002/ pUC，5 :對照組PCC 7002/pAM2770/pUC ;B為adhe基因整合到SMB-101基因組的鑒定，1 :DNA Maker ADNA/Hindlll ;2 :SMB-lOl ;3 :對照組PCC 7002/pAM2770， 4 :對照組PCC 7002/pUC， 5 :對照組PCC 7002/pAM2770/pUC)。 phb700F :5' -TACAACATTTTTCTGTAGGC-3， ， phb700R : 5， -ATGTCGCCTATCAACTGTTGA-3，。
(2)重組藍藻SMB-101生產丁醇性能的檢測 將重組藍藻SMB-101接種于不含銅的Medium 957培養(yǎng)基中，在30 °C 、 60 molm—2s—1光照、振蕩的條件下培養(yǎng)至對數生長后期，使其細胞密度達到0D73。 = 1. 5 ;向 培養(yǎng)液中加入2 M CuS04使銅誘導啟動子petE啟動adhe基因和crt操縱子的表達，進而 誘導丁醇合成；在銅誘導48小時后，取培養(yǎng)液進行液相色譜檢測。
色譜檢測方法及條件同實施例1中三一致。
實驗設3次重復，結果取平均數。結果表明，工程藻SMB-101生產丁醇的能力為
0. 22g/L培養(yǎng)液。 序列表 〈210>1 〈211>4736 〈212>DNA 〈213〉梭菌屬丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) 〈400〉 1atgg皿cteaacaatgtcatg皿ggte皿gttgctgtegtteccatteac603gaccte皿gcatteaatgcgatecacte3ttetgttete120ggtg腿ttgcgaagtecttgcagteatttteactggagc180tcatttgtegC3gg3gC3g3tetttctgagtgaateccattg皿ggt卿240tecttgga皿teaagtgttt3g皿gattegaacttcttgaa皿gcctgte300ategcagctgtteatggttttgcttteggaggcggatgcga皿tegctetgtcttgtgat360ateag皿tegcttcaagcaacgcaagatttggtc皿ccag皿gteggtctcgg皿teac3420cctggttttggtggtecac3aagactttcaagattegttgg皿tgggratggC皿3gC3g■cttetetttectgcac皿皿tete皿ggcateag皿tcggacttgteaat540皿ggtegteg皿cctegtga600agcaatgctccagtegctgtteagtteagc皿3caggctetteategagg皿tgcagtgt660gatettgatectgctttegcatttgaatcag皿gcatttggag皿tgctt720gatc皿皿ggagctttcategag皿皿g皿780卿tegg郷tggatttteattteac皿gategteagac3840gatggtt卿gaatttgctggC3gC3g皿3ttgatga皿c■皿tgggtragtetggtetgatgggaattcc960gagtetggtggcgc郷tggagatgtettetcgccgttga1020gg皿ttetca皿ggtttgcggtectecaggagttettctttcagcacatecatcactttg1080tgcttcatte3tggtec3gategteccttt1140agcte皿ggtgtgcttetggCC3皿tgC3gg皿cagattc1200tgg3gC3C皿ctgtecttga12603cteatggaggagttgc卿tecttttgttatetttgcaa1320tetcagcattteteateg皿aaggtttctc1380agcttgg皿ttcaacaactgaacttgtett1440tg皿gatetgategteccaggattggte皿g皿gg皿皿ggcttccctet1500actcttgatggagg皿g皿ttggtetegcagctcaagcttteggtetegc1560tg皿ggtgctc皿gagctteC3tg皿gg3gttgg皿g皿g1620ccttgacaaattccaaggtcttgcatggatgatggc卿t3tgg3tgtegctetegaatc1680agctegatet皿gc3gcategcaggacttccatecacagt1740tgatgctgca3gagcteagcttcatgctgca皿tgtegc3atggatgteac皿cteaggc1800agtec皿ttetttggtggatacggatetecg皿tgatgag1860
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15
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17
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100105110CysGlulieAlaMetSerCysAsplie Arglie Ala SerSerAsn Ala115120125ArgPheGlyGinProGluValGlyLeu Glylie Thr ProGlyPhe Gly130135140GlyThrGinArgLeuSerArgLeuVal GlyMet Gly MetAlaLys Gin145150155160LeuliePheThrAlaGinAsnlieLys AlaAsp Glu AlaLeuArg lie165170175
GlyLeuValAsnLysValValGluPro SerGlu Leu MetAsnThr Ala180185190LysGlulieAlaAsnLyslieValSer AsnAla Pro ValAlaVal Lys195200205LeuSerLysGinAlalieAsnArgGly MetGin Cys AsplieAsp Thr210215220AlaLeuAlaPheGluSerGluAlaPhe GlyGlu Cys PheSerThr Glu225230235240AspGinLysAspAlaMetThrAlaPhe lie Glu Lys ArgLyslie Glu245250255
GlyPheLysAsnArg260〈210>4〈211>378〈212>PRT〈213〉梭菌屬丙酮丁酉享梭菌(Clostridium acetobutylicum)〈400>4MetAspPheAsnLeuThrArgGluGin GluLeu Val ArgGinMet Val151015
ArgGluPheAlaGluAsnGluValLys Prolie Ala AlaGlulie Asp202530GluThrGluArgPheProMetGluAsn ValLys Lys MetGlyGin Tyr354045GlyMetMetGlylieProPheSerLys GluTyr Gly GlyAlaGly Gly505560AspValLeuSerTyrlielieAlaVal GluGlu Leu SerLysVal Cys65707580GlyThrThrGlyVallieLeuSerAla HisThr Ser LeuCysAla Ser859095
LeulieAsnGluHisGlyThrGluGlu Gin Lys Gin LysTyr Leu Val
100105110ProLeuAlaLysGly Glu LyslieGlyAlaTyr Gly LeuThrGluPro115120125AsnAlaGlyThrAsp Ser GlyAlaGinGinThr ValAlaValLeuGlu130135140GlyAspHisTyrVal lie AsnGlySerLyslie PhelieThrAsnGly145150155160
GlyValAlaAspThr Phe ValliePheAlaMet ThrAspArgThrLys165170175GlyThrLysGlylie Ser AlaPhelielieGlu LysGlyPheLysGly180185190PheSerlieGlyLys Val GluGinLysLeuGly lieArgAlaSerSer195200205ThrThrGluLeuVal Phe GluAspMetlieVal ProValGluAsnMet210215220lieGlyLysGluGly Lys GlyPheProlieAla MetLysThrLeuAsp225230235240
GlyGlyArglieGly lie AlaAlaGinAlaLeu GlylieAlaGluGly245250255AlaPheAsnGluAla Arg AlaTyrMetLysGlu ArgLysGinPheGly260265270ArgSerLeu AspLys Phe GinGlyLeuAlaTrp MetMetAlaAspMet275280285AspValAlalieGlu Ser AlaArgTyrLeuVal TyrLysAlaAlaTyr290295300LeuLysGinAlaGly Leu ProTyrThrValAsp AlaAlaArgAlaLys305310315320
LeuHisAla AlaAsn Val AlaMetAspValThr ThrLysAlaValGin325330335LeuPheGly GlyTyr Gly TyrThrLysAspTyr ProValGluArgMet340345350MetArgAsp AlaLys lie ThrGlulieTyrGlu GlyThrSerGluVal355360365GinLysLeuVallie Ser Gly LysliePhe370375〈210>5〈211>259〈212>PRT〈213〉梭菌屬丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum:)
20
〈400>5MetAsnlieValValCysLeuLys Gin ValPro Asp Thr Ala GluVal151015ArglieAspProValLysGlyThr Leu lieArg Glu Gly ValProSer202530lielieAsnProAspAspLysAsn Ala LeuGlu Glu Ala LeuValLeu354045LysAspAsnTyrGlyAlaHisVal Thr Vallie Ser Met GlyProPro505560GinAlaLysAsnAlaLeuValGlu Ala LeuAla Met Gly AlaAspGlu65707580
AlaValLeuLeuThrAspArgAla Phe GlyGly Ala Asp ThrLeuAla859095ThrSerHisThrlieAlaAlaGly lie LysLys Leu Lys TyrAsplie100105110ValPheAlaGlyArgGinAlalie Asp GlyAsp Thr Ala GinValGly115120125ProGlulieAlaGluHisLeuGly lie ProGin Val Thr TyrValGlu130135140LysValGluValAspGlyAspThr Leu Lyslie Arg Lys AlaTrpGlu145150155160
AspGlyTyrGluValValGluVal Lys ThrPro Val Leu LeuThrAla165170175lieLysGluLeuAsnValProArg Tyr MetSer Val Glu LysliePhe180185190GlyAlaPheAspLysGluValLys Met TrpThr Ala Asp AsplieAsp195200205ValAspLysAlaAsnLeuGlyLeu Lys GlySer Pro Thr LysValLys210215220LysSerSerThrLysGluValLys Gly GinGly Glu Val lieAspLys225230235240
ProValLysGluAlaAla AlaTyr Val ValSer Lys Leu LysGluGlu245250255HisTyrlie〈210>6〈211>336〈212>PRT〈213〉梭菌屬丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)〈400>6
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22
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28
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權利要求
一種重組藍藻，是通過包括如下步驟的方法得到的重組藍藻向藍藻中導入如下1)、2)或3)中所述的丁醇合成相關基因1)所述丁醇合成相關基因包括如下酶的編碼基因電子轉移黃素蛋白A亞基、烯酰水合酶、丁酰輔酶A脫氫酶、乙醇脫氫酶；2)所述丁醇合成相關基因包括如下酶的編碼基因電子轉移黃素蛋白B亞基、烯酰水合酶、丁酰輔酶A脫氫酶、乙醇脫氫酶；3)所述丁醇合成相關基因包括如下酶的編碼基因電子轉移黃素蛋白A亞基、電子轉移黃素蛋白B亞基、烯酰水合酶、丁酰輔酶A脫氫酶、乙醇脫氫酶。
2. 根據權利要求1所述的重組藍藻，其特征在于所述丁醇合成相關基因包括如下酶的編碼基因3-羥丁酰輔酶A脫氫酶和/或乙酰輔酶A乙酰轉移酶和/或丁醇脫氫酶。
3. 根據權利要求1或2所述的重組藍藻，其特征在于所述方法包括滅活所述藍藻中的至少一個聚-e羥基丁酸酯合成相關基因的步驟。
4. 根據權利要求2或3所述的重組藍藻，其特征在于所述滅活的方法為用至少一個的所述丁醇合成相關基因替換至少一個的所述聚-e羥基丁酸酯合成相關基因。
5. 根據權利要求4所述的重組藍藻，其特征在于所述聚-|3羥基丁酸酯合成相關基 因為聚-P羥基丁酸酯合成酶的編碼基因；所述滅活的方法為用所述乙醇脫氫酶的編碼基因替換所述聚-e羥基丁酸酯合成酶的編碼基因。
6. 根據權利要求3-5中任一所述的重組藍藻，其特征在于所述滅活的方法是通過同源重組實現的。
7. 根據權利要求1-6中任一所述的重組藍藻，其特征在于 所述烯酰水合酶為如下1)或2)所述的蛋白質1) 由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2) 將序列表中序列3的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有烯酰水合酶功能的由1)衍生的蛋白質；所述丁酰輔酶A脫氫酶為如下a)或b)所述的蛋白質a) 由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b) 將序列表中序列4的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有丁酰輔酶A脫氫酶功能的由a)衍生的蛋白質；所述電子轉移黃素蛋白B亞基為如I或II所述的蛋白質 I由序列表中序列5所示的氨基酸序列組成的蛋白質；II將序列表中序列5的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有電子轉移黃素蛋白B亞基功能的由I衍生的蛋白質； 所述電子轉移黃素蛋白A亞基為如下i或ii所述的蛋白質 i由序列表中序列6所示的氨基酸序列組成的蛋白質；ii將序列表中序列6的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有電子轉移黃素蛋白A亞基功能的由i衍生的蛋白質； 所述3-羥丁酰輔酶A脫氫酶為如下①或②所述的蛋白質① 由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質；② 將序列表中序列7的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有3_羥丁酰輔酶A脫氫酶功能的由①衍生的蛋白質； 所述丁醇脫氫酶為如下A或B所述的蛋白質A. 由序列表中序列8所示的氨基酸序列組成的蛋白質；B. 將序列表中序列8的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有丁醇脫氫酶功能的由A衍生的蛋白質；所述乙醇脫氫酶為如下A)或B)所述的蛋白質A) 由序列表中序列9所示的氨基酸序列組成的蛋白質；B) 將序列表中序列9的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有乙醇脫氫酶功能的由A)衍生的蛋白質；所述乙酰輔酶A乙酰轉移酶為如下(1)或(2)所述的蛋白質(1) 由序列表中序列10所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(2) 將序列表中序列10的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加且具有乙酰輔酶A乙酰轉移酶功能的由(1)衍生的蛋白質。
8.根據權利要求1-7中任一所述的重組藍藻，其特征在于所述烯酰水合酶的編碼基因為如下1)、2)或3)所述的基因1) 其核苷酸序列為序列表中序列1自5'末端第1-786位核苷酸的DNA分子；2) 在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3) 與1)限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子； 所述丁酰輔酶A脫氫酶的編碼基因為如下a)、b)或c)所述的基因a) 其核苷酸序列為序列表中序列1自5'末端第800-1939位核苷酸的DNA分子；b) 在嚴格條件下與a)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；c) 與a)限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子； 所述電子轉移黃素蛋白B亞基的編碼基因為如I、 II或III所述的基因I其核苷酸序列為序列表中序列1自5'末端第1958-2737位核苷酸的DNA分子； II在嚴格條件下與I限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； III與I限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子； 所述電子轉移黃素蛋白A亞基的編碼基因為如下i、 ii或iii所述的基因 i其核苷酸序列為序列表中序列1自5'末端第2756-3766位核苷酸的DNA分子； ii在嚴格條件下與i限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； iii與i限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子； 所述3-羥丁酰輔酶A脫氫酶的編碼基因為如下①、②或③所述的基因① 核苷酸序列為序列表中序列1自5'末端第3871-4719位核苷酸的DNA分子；② 在嚴格條件下與①限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；③ 與①限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子； 所述乙醇脫氫酶的編碼基因為如下A、 B或C所述的基因A. 其核苷酸序列為序列表中序列2自5'末端第610-3186位核苷酸的DNA分子；B. 在嚴格條件下與A限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；C. 與A限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子； 所述丁醇脫氫酶的編碼基因為如下(A)、 (B)或(C)所述的基因(A) 其核苷酸序列為序列表中序列11所示的DNA分子；(B) 在嚴格條件下與(A)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；(C) 與(A)限定的DNA序列有90X以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子； 所述乙酰輔酶A乙酰轉移酶的編碼基因為如下(1)、 (2)或(3)所述的基因(1) 其核苷酸序列為序列表中序列12所示的DNA分子；(2) 在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；(3) 與(1)限定的DNA序列有90X以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。
9. 根據權利要求1-8中任一所述的重組藍藻，其特征在于所述藍藻為色球藻科藍藻。
10. 根據權利要求1-9中任一所述的重組藍藻，其特征在于所述重組藍藻為藍藻集胞 藻SMB-100CGMCC No. 2795.和聚球藻SMB-101CGMCC No. 2794。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組藍藻。該重組藍藻，是通過包括如下步驟的方法得到的重組藍藻向色球藻科藍藻中導入如下1)或2)中所述的丁醇合成相關基因1)所述丁醇合成相關基因包括如下酶的編碼基因電子轉移黃素蛋白A亞基、烯酰水合酶、丁酰輔酶A脫氫酶、乙醇脫氫酶；2)所述丁醇合成相關基因包括如下酶的編碼基因電子轉移黃素蛋白B亞基、烯酰水合酶、丁酰輔酶A脫氫酶、乙醇脫氫酶。本發(fā)明實現了利用藍藻將地球上取之不盡的太陽能和溫室氣體二氧化碳轉化為能源產品丁醇，避免了能源再生過程中對糧食等其它有機物的浪費，同時又有利于環(huán)境保護。因此，利用本發(fā)明重組藍藻來生產丁醇是實現可再生清潔能源持續(xù)、健康發(fā)展的理想途徑之一。
文檔編號C12N9/00GK101748069SQ200810239558
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月12日 優(yōu)先權日2008年12月12日
發(fā)明者周杰, 張延平, 李寅, 解鵑, 高成華 申請人:中國科學院微生物研究所