專利名稱：一種曲霉表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種曲霉表達(dá)載體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
遺傳操作系統(tǒng)是進(jìn)行基因與蛋白質(zhì)功能研究必不可少的。目前已有一些遺傳操作系統(tǒng)可用于煙曲霉，如以乳清酸核苷_5-磷酸脫羧酶基因pyrG為篩選標(biāo)記的pCDA14。 pCDA14轉(zhuǎn)化煙曲霉尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷株CEA17后可在不含尿苷/尿嘧啶的培養(yǎng)基上篩選自養(yǎng)型轉(zhuǎn)化子。雖然該載體還存在轉(zhuǎn)化率和重組率不高的問題，仍是目前研究煙曲霉基因功能的重要手段。但迄今為止還沒有一個較好的載體系統(tǒng)可用于在煙曲霉中表達(dá)蛋白質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種曲霉表達(dá)載體及其應(yīng)用。 本發(fā)明所提供的曲霉表達(dá)載體，命名為pchiGFP-S載體，包含原核復(fù)制起點(diǎn)、篩選標(biāo)記基因和外源基因表達(dá)盒；所述外源基因表達(dá)盒從上游至下游依次包括幾丁質(zhì)酶基因啟動子、外源基因和終止子。 其中，pchiGFP-S載體的幾丁質(zhì)酶基因啟動子和外源基因之間還可含有信號肽序列。含有信號肽序列的pchiGFP-S載體命名為pchiGFP載體，pchiGFP載體在宿主菌中表達(dá)的外源蛋白可分泌到細(xì)胞外。所述信號肽序列具體可為序列表中序列1自5'末端第1704-1817位。所述幾丁質(zhì)酶基因啟動子的核苷酸序列具體可為序列表中序列1自5'末端第l-1703位。所述終止子具體可為構(gòu)巢曲霉的TrpC基因終止子。所述篩選標(biāo)記基因可為氨芐青霉素抗性基因。所述原核復(fù)制起點(diǎn)可為PBR322的復(fù)制起始點(diǎn)。
含有所述載體的重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種生產(chǎn)蛋白的方法。 本發(fā)明所述的生產(chǎn)蛋白的方法，是將所述的表達(dá)載體導(dǎo)入曲霉中獲得重組菌，培養(yǎng)所述重組菌生產(chǎn)目的蛋白。 本發(fā)明的曲霉表達(dá)載體能夠使外源基因在煙曲霉表達(dá)，且可以無需誘導(dǎo)，利用曲霉生產(chǎn)目的蛋白。本發(fā)明的曲霉表達(dá)載體為煙曲霉基因蛋白功能的研究提供了一個很好的表達(dá)系統(tǒng)。


圖1為PCR鑒定結(jié)果。 圖2為熒光顯微鏡觀察GFP綠色熒光。 圖3為SDS-PAGE檢測發(fā)酵上清液中的GFP蛋白。
具體實施例方式
實施例1、構(gòu)建煙曲霉表達(dá)載體
—、構(gòu)建pchiGFP表達(dá)載體提取煙曲霉YJ407 CGMCC 0386 (ZL99105415. 6)的基因組DNA，基因組DNA的提取
方法參照《分子克隆實驗指南》。 設(shè)計引物ChiG-N和ChiG-C， ChiG-N和chiG-C的核苷酸序列如下 引物ChiG-N :5' -GGAATTCGAGCCATTGCCTACATCCTTCAC-3'(劃線部分為EcoRI酶識
別位點(diǎn))； 引物ChiG-C :5' -GGGGTACCGCGCGCGCCTCCAGATCAGTAC-3，(劃線部分為Kpnl酶識別位點(diǎn))。 以煙曲霉基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增片段A，片段A包含煙曲霉幾丁質(zhì)酶基因(AfchiBl)的1. 5kb啟動子(PehiB1)和N-端信號肽。 PCR反應(yīng)體系10Xpyrobest Buffer 5 ii L，弓| 物ChiG-N和ChiG-C各1 ii L(20 ii mol/L) ， DNA模板0. 5 ii L (1 ii g/ ii L) ， dNTPs (各2. 5mM) 4 ii L，pyrobestenzyme (TAKARA， 5U/ u L) 0. 5 u L，最后補(bǔ)水至50 u L。 反應(yīng)條件94。C熱變性3min ;94。C變性lmin，50。C退火45s，72。C延伸lmin30s，共30個循環(huán)；72。C最后延伸10min。 PCR產(chǎn)物(片段A)用DNA凝膠回收試劑盒回收，方法參考其說明書。
片段A連接到pGEM-T Easy載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-ChiBl，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a ，對重組質(zhì)粒pGEM-ChiBl進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明片段A的核苷酸序列如序列表中序列1所示。 用Kpnl和BamHI雙酶切消化pMCB17載體(Fernandez-Abalos， J. M. ， et al.，Plant—ad即ted green fluorescent protein is a versatile vital reporter forgeneexpression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus,Aspergillus nidulans. Mol Microbiol, 1998. 27 (1) :p. 121-30)(中國科學(xué)院微生物研究所)，用北京博大泰克生物技術(shù)公司的膠回收試劑盒購回收800bp左右的片段，得到經(jīng)Kpnl/BamHI消化的片段B，片段B包含GFP2-5基因。 片段B連接到pGEM-T Easy載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a ，對重組
質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明片段B的核苷酸序列如序列表中序列3所示。 用BamHI和HindlII雙酶切消化PAN7-l載體(Punt，P. J. ， et al. transformation
of Aspergillus based on the hygromycin B resistance markerfrom Escherichia
coli.Gene， 1987. 56(1) :p. 117-24)(中國科學(xué)院微生物研究所)，回收其中700bp左右的片
段，得到經(jīng)BamHI/Hindlll消化的片段C，片段C包含構(gòu)巢曲霉的TrpC終止區(qū)。 片段C連接到pGEM-T Easy載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a ，對重組
質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明片段B的核苷酸序列如序列表中序列2所示。用EcoRI/Kpnl雙酶切的片段A，用KpnI/BamHI消化的片段B以及BamHI/Hindlll
消化的片段C與EcoRI/Hindlll酶切的pUC19載體連接，構(gòu)建重組載體pchiGFP。 二、構(gòu)建pchiGPF-S表達(dá)載體 提取煙曲霉YJ407 CGMCC 0386的基因組DNA，基因組DNA的提取方法參照《分子克隆實驗指南》。 設(shè)計引物ChiG-CS，引物ChiG-CS的核苷酸序列如下
弓I物ChiG-CS :5， -GGGGTACCGCTGTTGTCGTTTCAGTCGAGCTTG-3，(劃線部分為Kpnl酶識別位點(diǎn))。 以煙曲霉基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增片段D，片段D僅包含煙曲霉幾丁質(zhì)酶基因(AfchiBl)的啟動子(PAiB1)。 PCR反應(yīng)體系IOXPCR Buffer 5 ii L，弓|物ChiG-N和ChiG-CS各1 ii L， DNA模板0. 5ii L(l ii g/ii L) ，d證s(各2. 5mM)4ii L，pyrobest enzyme (TAKARA， 5U/ii L) 0. 5 ii L，最后補(bǔ)水至50ii L。 反應(yīng)條件94。C熱變性3min ;94。C變性lmin，50。C退火45s，72。C延伸lmin30s，共30個循環(huán)；72。C最后延伸10min。 PCR產(chǎn)物(片段D)用DNA凝膠回收試劑盒回收，方法參考其說明書。
片段D連接到pGEM-T Easy載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-ChiGS，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a ，對質(zhì)粒pGEM-ChiGS進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明片段D的核苷酸序列如序列表中序列1中自5'末端第1-1703位。 用EcoRI和Kpnl酶切的片段D與EcoRI和Kpnl酶切的載體pChiGFP連接，獲得
重組載體pchiGPF-S。 三、煙曲霉中GFP的表達(dá) pCDA14(d' Enfert， C. ， Selection of multiple disruption eventsinAspergillus fumigatus using the orotidine-5' -decarboxylase gene， pyrG， asaunique transformation marker. Curr Genet， 1996. 30 (1) :p. 76-82)(中國科學(xué)院微生物研究所)與pchiGPF-S， pCDA14與pchiGFP分別共轉(zhuǎn)化煙曲霉CEA17 (d' Enfert， . CurrentGenetics, 1996， Jun ;30(1) :76-82.)(中國科學(xué)院微生物研究所)，方法如下:
接種108-l()9煙曲霉CEA17孢子于50ml YG培養(yǎng)基(酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L，瓊脂15g/L)中，37°C ，培養(yǎng)5小時，離心6000rpm， 10分鐘，回收孢子，用滅菌水洗二次，加入40ml細(xì)胞壁消化液(硫酸銨52. 8g/L，檸檬酸鉀16. 2g/L，酵母提取物5g/L，蔗糖5g/L，4g/L Lysing enzyme (Sigma) ， pH 6. 0) ， 33°C ， 100rpm緩慢裂解3小時。離心去上清，用洗滌液(硫酸銨52. 8g/L、蔗糖10g/L，pH 6. 0)洗二次。原生質(zhì)體懸于lml儲存液(KC1 44. 4g/L、CaCl2 7.35g/L、M0PS 2g/L，pH 6.0)，4。C保存。取100 ii 1原生質(zhì)體與4 ii g pCDA14禾P4iigpchiGFP(或者pChiGFP-S)再加入50ii1 PEG 6000溶液(PEG6000 250g/L、CaCl2 7. 35g/L、KC144. 4g/L、Tris 1.21g/L，pH 7. 5)，冰上放置15分鐘后，加入lml PEG 6000溶液，室溫20分鐘。37t:保溫Plate溶液(瓊脂糖3. 5g/L、硫酸銨52. 8g/L、蔗糖342g/L，溶于100ml MM)，保持液體狀態(tài)，加入3. 5ml混勻，鋪在高滲固體選擇培養(yǎng)基(瓊脂15g/L，硫酸銨52. 8g/L，蔗糖340g/L，溶于1000ml匪)上，30。C培養(yǎng)2_3天，看到明顯的菌落后，用匪[鹽溶液20m1/L [氯化鉀26g/L，七水合硫酸鎂26g/L，磷酸氫二鉀76g/L，微量元素50ml/L (十水合硼酸鈉40mg/L，五水合硫酸銅400mg/L， 二水合硫酸亞鐵800mg/L， 二水合硫酸錳800mg/L， 二水合鉬酸鈉800mg/L，七水合硫酸鋅8g/L)，葡萄糖10g/L、谷氨酸鈉lg/L， p朋.8]再篩選，快速提取DNA進(jìn)行PCR，擴(kuò)增GFP以及P。hiB1進(jìn)行鑒定(圖1)。以pCDA14與pUC19載體轉(zhuǎn)化煙曲霉CEA17作為對照。 圖1A為PCR鑒定pCDA14和pchiGFP共轉(zhuǎn)化的煙曲霉CEA17， 1為PCR擴(kuò)增PchiB1，2為PCR擴(kuò)增GFP， 3為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖IB為PCR鑒定pCDA14和pchiGPF-S共轉(zhuǎn)化的煙曲霉CEA17， 1為PCR擴(kuò)增PchiB1， 2為PCR擴(kuò)增GFP， 3為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
PCR鑒定為陽性的菌的lOiU孢子(lXl()8個/ml)分別接于200ml液體CM中， 37t:，200rpm培養(yǎng)。對轉(zhuǎn)化菌株在菌絲生長初期(7h)、對數(shù)生長中期(30h)、平臺期(60h) 和衰亡期(140h)進(jìn)行GFP表達(dá)分析。 CM由如下物質(zhì)組成葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母提取物lg/L，酶水解酪素 1. 5g/L，鹽溶液20ml/L[氯化鉀26g/L，七水合硫酸鎂26g/L，磷酸氫二鉀76g/L，微量元素 50ml/L (十水合硼酸鈉40mg/L，五水合硫酸銅400mg/L， 二水合硫酸亞鐵800mg/L， 二水合硫 酸錳800mg/L， 二水合鉬酸鈉800mg/L，七水合硫酸鋅8g/L) ] ， pH 6. 8。
熒光顯微鏡觀察GFP綠色熒光。 熒光顯微鏡觀察結(jié)果如圖2所示，pchiGFP-S轉(zhuǎn)化的菌株中綠色熒光在菌絲生長 初期開始出現(xiàn)，在對數(shù)生長期和平臺期逐漸增強(qiáng)，并在衰亡期達(dá)到最大，說明pchiGFP-S轉(zhuǎn) 化的菌株中GFP的表達(dá)受生長周期調(diào)控。pchiGFP轉(zhuǎn)化的菌株在對數(shù)期、平臺期及衰亡期的 菌絲細(xì)胞內(nèi)只有微弱的熒光信號。PCDA14與pUC19載體轉(zhuǎn)化的菌株則無任何熒光信號出 現(xiàn)。 SDS-PAGE檢測菌絲生長初期(7h)、對數(shù)生長中期(30h)、平臺期(60h)和衰亡期 (140h)發(fā)酵上清液中的GFP蛋白。 SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖3所示，表明pchiGFP-S轉(zhuǎn)化的菌株發(fā)酵上清液中沒有檢 測到GFP蛋白，pchiGFP轉(zhuǎn)化的菌株發(fā)酵上清液中GFP蛋白在菌絲生長初期開始出現(xiàn)，并隨 培養(yǎng)時間的延長而逐漸增強(qiáng)，而且GFP的分泌與幾丁質(zhì)酶AfChiBl的分泌同步。pCDA14與 pUC19載體轉(zhuǎn)化的菌株無任何熒光信號出現(xiàn)。 圖3中，"EC"代表胞外蛋白，"IC"代表胞內(nèi)蛋白，"M"代表蛋白分子量標(biāo)記。
上述實驗結(jié)果說明pchiGPF-S和pchiGPF載體中的目的基因(GFP)可在煙曲霉中 表達(dá)。 序列表 〈110〉中國科學(xué)院微生物研究所 〈120〉一種曲霉表達(dá)載體及其應(yīng)用 〈130>CGGNARW82096 〈160>3 〈210>1 〈211>1817 〈212>DNA 〈213〉曲霉屬煙曲霉(Aspergillus fumigatus)
〈400〉 1 aaagcgacac ctacggatag aagtgttcta atgacaagcg gcttgttcaa gctatttagc 60
tgtcctcaac tggaaagatt agaacagctt cagacattaa ctagatatgc ctccctgcaa 120
cagcctcgct attgggaagt tcattaatta tgaacatcgc agccttttct aatctactcc 180
gtetccttcc ctctacttat gacttgtttt tccateactg agaagcgaca tgaaacggac 240
tttatggatt cactagaaaa gctaatggat acagaatctc gacatccagc catggcaggt 300
accctggttt ataatgagcc attgcctaca tccttcacaa ctcaattgtg tttttattat 360
60067]tcctgctttctcttccggtagcaggccgacgC3tg3gtgC gtgtCgtctC Cg3皿C^3C420
0068]tggctaactatttcctgattacggcctcgt ggtcatcggt gtgattctca480
0069]tcatctggacggtttectggtttatcaaggggcag^gag attctcacgt cagratgtcc540
0070]tctcgacaacgttaactcatCtgC3tCgCt gtg3皿C3gC ggcagacc皿600
0071]tctgcactgatgcactggatgtg鄉(xiāng)tectctctttctgt gccattgacg gacteggtat660
0072]caaatcggttC3gCgg3g^gttctcaacttcatgagtat gacacgtgcg agctectcca720
0073]tatgttcgcctctcagacattectgactccte^tgg^g gac3cgc^3 gte皿ccteg780
0074]atgg^tggcgtccccccatatttcgactgacacgtetgc atcgg^teg ctgacc3gg3840
0075]■teggggttcggcagcatcaccccgtactgcactccatc gcgcggggtc aaccccagtg■
0076]tgtcttcaagaccctgtcagacaacattgg tatgttacat tacattactc960
0077]皿gggttg皿皿gccgteatctcggctgttgccaattcte ctgcccagtt gacaaaatga1020
0078]tegcgggagtgategtgacatcccttgggctcggcggcaa cggtcacgtc gcategcgtc1080
0079]acgctccctttcagctgctgcaaaccccttttgacccatt皿3C3gtgga atgateaccc1140
0080]C皿3gggC3tgtgcttcgatatecacgtcctcatgtcgtt acatcgaact gagattecgg1200
0081]agacccctcacgcgacteagcgccttggcgaccctccacg cggggagtca cattgccttt1260
0082]tctgcaccaagtgaagctctateagcccag ctccctttca tctgccgacg1320
0083]tcgcatgcaggatggtc郷tecgtga皿cctggcctgtg actcgagatt actgcaagat1380
0084]cgacggccgtcggatcaccggaacctggttcttcactgaa tcgctgcctt atctcttcat1440
0085]ctgatttgatccctetcttgtgacacgttgcratragggt tectegtgat agggctctgg1500
0086]atctecaacgcgacgatgggacttgaccag ggagcgacgc tgtgtggtga1560
0087]gtgttgt卿tgtcg皿tgag皿gacragg 3g3ttcag3g ate皿teggg1620
0088]agcgtttcttgtggtettteC皿tgC3C3gaacgactcat ccgacaagct catecatcga1680
0089]caagctcgacacaatgcgctttgcaacttc caccatcgtc aaggtcgccc1740
0090]ttctgcttegcagtctttgtgtcgacgccgcagtgatgtg g皿tcgtgat 3ccagtegte1800
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0095]〈213〉曲霉屬煙曲霉(Aspergillus fumigatus)
0096]〈400〉2
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0098]cgatgtcagctccggagttgtgttcaggat ctcgataaga tacgttcatt120
0099]tgtccaagcagc^agagtgccttctegtgattt皿tegc tccatgtc^ c^g^te皿180
0100]acgcgttttcgggtttecctcttccagatacagctcatct gcaatgcatt aatgcattga240
0101]ctgcaacctagtaacgccttcaggctccggcg^gag^g ^tegctteg cagagctett300
0102]ttcattttcggg卿cg卿tc^gcagatC33CggtCgt C33g3g3CCt 3Cg3g3Ctg3360
0103]ggaatccgctcttggctccacgcgactatatatttgtctc taattgtact ttgacatgct420
0104]cctcttctttactctgateg cttgactetg aaaattccgt caccagccct gggttcgcaa■
0105]agateattgcatgtttcttccttgaactctc皿gccteca gg3C3C3cat tcatcgtegg540
teteaacctcgaaatcattcctecteagatggtetec皿tagteaccatggttgcctegt600gaatgctccgtecgccggccgaaacttttttecaactctcctetgagtcg660tttecccagaacacttgttt3gaggteatccttctttctegaagtcctcg720tgtectgtgtaagcgcccactccacatctccactcgacct769
〈210〉3 〈211〉721〈212〉DNA〈213〉〈400〉3atgagte皿ggag皿g皿cttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattegatggt60gatgtteatgttctgtcagtgg卿gggtg皿ggtgatgc皿catecgg3120aaacttecccttgcactectgg皿皿ctecctgttccatggccaacactt180gtcactectttcacctetggtgttcaatgcttttcaagatacccagatcatetg皿gcgg240cacgacttcttc皿gagcgccatgcctgagggatecgtgc郷卿ggaccatcttcttc300皿ggacgacggg皿ctec皿gacacgtgctg皿gtc皿gtttg郷g卿caccctcgtc360agctte郷gaatcgatttc皿gg郷acggaaacatcctcggccac皿g420ttgg皿tecaactecaactcccacaacgtetecatcatggCCg3C皿gC3a皿g皿cggc■acttcaagacccgccac皿catcg^gacggcggcgtgcaactcgctgat540cattetcaac皿ttggcgatggccctgtcctttteccagacaaccattec600ctgtccacacaatctgccctttcg^agatccc皿cga皿catggtcctt660cttgagtttgteacagctgcatg皿cteteca^teaccg720g721
8
權(quán)利要求
一種表達(dá)載體，包含原核復(fù)制起點(diǎn)、篩選標(biāo)記基因和外源基因表達(dá)盒；所述外源基因表達(dá)盒從上游至下游依次包括幾丁質(zhì)酶基因啟動子、外源基因和終止子。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于所述幾丁質(zhì)酶基因啟動子和所述外源基因之間還含有信號肽序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其特征在于所述信號肽序列為序列表中序列1自5'末端第1704-1817位。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一所述的表達(dá)載體，其特征在于所述幾丁質(zhì)酶基因啟動子的核苷酸序列為序列表中序列1自5'末端第1-1703位。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于所述終止子為構(gòu)巢曲霉的TrpC基因終止子。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其特征在于所述篩選標(biāo)記基因為氨芐青霉素抗性基因。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其特征在于所述原核復(fù)制起點(diǎn)為pBR322的復(fù)制起始點(diǎn)。
8. 含有權(quán)利要求1至7中任一所述的表達(dá)載體的重組菌。
9. 權(quán)利要求1至7中任一所述的表達(dá)載體、權(quán)利要求8所述的重組菌在生產(chǎn)蛋白中的應(yīng)用。
10. —種生產(chǎn)蛋白的方法，是將權(quán)利要求1至7中任一所述的表達(dá)載體導(dǎo)入曲霉中獲得重組菌，培養(yǎng)所述重組菌生產(chǎn)目的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種曲霉表達(dá)載體及其應(yīng)用。該表達(dá)載體，包含原核復(fù)制起點(diǎn)、篩選標(biāo)記基因和外源基因表達(dá)盒；所述外源基因表達(dá)盒從上游至下游依次包括幾丁質(zhì)酶基因啟動子、外源基因和終止子。本發(fā)明還公開了一種生產(chǎn)蛋白的方法，該方法是將所述的表達(dá)載體導(dǎo)入曲霉獲得重組菌，培養(yǎng)所述重組菌生產(chǎn)目的蛋白。本發(fā)明的曲霉表達(dá)載體能夠使外源基因在煙曲霉表達(dá)，利用曲霉生產(chǎn)目的蛋白。本發(fā)明的曲霉表達(dá)載體為煙曲霉基因蛋白功能的研究提供了一個很好的表達(dá)系統(tǒng)。
文檔編號C12N1/15GK101760471SQ200810240800
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月23日
發(fā)明者歐陽浩淼, 金城, 陳曉敏 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所