專利名稱：一種從冬蟲夏草菌發(fā)酵液中提取黑色素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從冬蟲夏草菌發(fā)酵液中提取黑色素的方法。
背景技術(shù)：
黑色素(Melanin)是廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中的 一種棕色到黑色的色素，是一種結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的酚類聚合物，能夠提高生物的生存和競(jìng)爭能力(AloisandMichael, Annual Review of Phytopathology 1986,24:411-451)。它是生物體為抵抗紫外線和電離輻射等因素的傷害，逐漸進(jìn)化而成的，可以被看成是生物體用來保護(hù)自己的一道屏障。黑色素的應(yīng)用潛力巨大，不僅具有抗氧化、抗輻射作用，還具有免疫促進(jìn)(Savaet al. ， Food Research International, 2001， 34 (4) :337-343)、抗癌(El-0beid et al.，Phytomedicine， 2006， 13(5) :324-333)、抑制病毒復(fù)制(Montef ioriand Zhou， AntiviralResearch, 1991， 15(1) :11-25)等作用，因此，在醫(yī)藥、化妝品、食品、電子等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。 入藥的冬蟲夏草是冬蟲夏草菌
寄 生在鱗翅目(L印idoptera)蝙蝠蛾科(H印ialidae)幼蟲，尤其是蟲草蝠蛾(H印ialusarmoricanusOberthilr)上形成的蟲菌復(fù)合體，是我國特產(chǎn)的 一 種名貴中藥和高級(jí)滋補(bǔ)品。在生物分類上冬蟲夏草菌歸屬于子囊菌門(Ascomycota)、肉座菌目(Hypocreales)、蛇 包蟲草禾斗(Ophiocordycipitaceae)、蛇孢蟲草屬
，作為青藏高原特有的真菌，其分布地域局限，天然產(chǎn)量非常有限，并被國家相關(guān)部門列為了二級(jí)保護(hù)物種[《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄(第一批)》，1999]。針對(duì)天然冬蟲夏草資源緊缺的現(xiàn)狀，全國先后有多個(gè)科研單位進(jìn)行了冬蟲夏草菌的深層發(fā)酵研究，有的進(jìn)入了工業(yè)化生產(chǎn)，但發(fā)酵后的發(fā)酵液沒有能得到很好的開發(fā)利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從冬蟲夏草菌發(fā)酵液中提取黑色素的方法。
本發(fā)明所提供的從冬蟲夏草菌發(fā)酵液中提取黑色素的方法，包括以下步驟將冬
蟲夏草菌發(fā)酵液除去菌絲體后，進(jìn)行酸化處理，收集沉淀，得到黑色素粗提物。 所述冬蟲夏草菌發(fā)酵液是由冬蟲夏草(Cordyc印s sinensis) 762經(jīng)液體深層發(fā)酵
得到的；所述發(fā)酵的溫度10-21°C ;所述發(fā)酵的時(shí)間為20-60天。 冬蟲夏草(Cordyc印s sinensis) 762已于2008年12月05日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCC 2793。
所述方法還包括以下純化的步驟 (a)脫蛋白采用鹽酸水解法對(duì)黑色素粗提物進(jìn)行脫蛋白，得到脫蛋白的黑色素；
(b)脫脂將步驟(a)所述脫蛋白的黑色素用有機(jī)溶劑進(jìn)行脫脂，得到脫脂的黑色素； (c)去除氯離子以去離子水洗滌步驟(b)所述脫脂的黑色素，直至氯離子定性檢測(cè)為陰性為止；然后經(jīng)真空干燥或在25-5(TC干至恒重，得到純化的黑色素。
其中，所述酸化處理是將所述冬蟲夏草菌發(fā)酵液的pH值調(diào)至1-3。
所述酸化處理中所加入的試劑為濃度l-3mol/L的鹽酸。 所述方法還包括將酸化處理后的冬蟲夏草菌發(fā)酵液靜置過夜并離心的步驟；所述離心的相對(duì)離心力可為5000-8000g，離心時(shí)間可為20-40分鐘。 所述步驟(a)脫蛋白的具體方法是將黑色素粗提物用6-7mol/L鹽酸進(jìn)行水解，經(jīng)離心分離，收集沉淀，將沉淀依次用l-0.01mol/L鹽酸、去離子水洗滌得到脫蛋白的黑色素；其中，所述水解的時(shí)間為2-5小時(shí)，所述水解的溫度95-100°C。 所述步驟(b)脫脂的具體方法是將步驟(a)得到的脫蛋白的黑色素溶解在0. 1-1. Omol/L堿溶液中，依次加入氯仿、正丁醇，攪拌，離心，收集水層液體，并調(diào)節(jié)所述水層液體的PH值為l-3，離心收集沉淀，得到脫脂的黑色素。 也可將得到的沉淀重復(fù)上述溶解、有機(jī)溶劑洗滌、離心沉淀的操作至少一次，得到脫脂的黑色素。 所述堿溶液具體可為氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀溶液；所述堿溶液的用量以使所述脫蛋白的黑色素充分溶解即可；所述氯仿與正丁醇的體積比為IO : 1至20 : 1。
冬蟲夏草(Cordyc印s sinensis) 762CGMCC 2793也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草菌發(fā)酵液中含有黑色素，而且冬蟲夏草菌的一些生物學(xué)活性與黑色素有關(guān)。以冬蟲夏草菌發(fā)酵液為原料提取黑色素，可以提高冬蟲夏草菌深層發(fā)酵的經(jīng)濟(jì)效益，實(shí)現(xiàn)其綜合應(yīng)用。另一方面，冬蟲夏草黑色素可能與冬蟲夏草菌抗紫外線能力、對(duì)蝠蛾幼蟲的侵染等有關(guān)，從冬蟲夏草發(fā)菌酵液中提取純化黑色素將促進(jìn)冬蟲夏草菌生理學(xué)和半人工培植的研究，具有一定的理論意義。 試驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的方法提取的黑色素和Sigma公司銷售的黑色素(CAS :8049-97-6)性質(zhì)相近。兩者均溶于堿性溶液，不溶于水、乙醇、丙酮、氯仿、己烷、甲醇、乙酸乙酯、乙醚、石油醚等有機(jī)溶劑，也不溶于植物油，pH小于3時(shí)完全沉淀，易被KMnOpNaClO、H202、 K2Cr207等強(qiáng)氧化劑漂白，多酚反應(yīng)為陽性。


圖1為本發(fā)明提取純化冬蟲夏草黑色素的流程圖。 圖2為實(shí)施例1的冬蟲夏草黑色素(1)與Sigma公司合成的黑色素(2)的紫外吸收光譜。 圖3為實(shí)施例1的冬蟲夏草黑色素(1)與Sigma公司合成黑色素(2)的紅外吸收光譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、從冬蟲夏草菌發(fā)酵液中提取純化黑色素
1)菌株的分離與鑒定 菌株的分離菌株從四川省康定縣采集的冬蟲夏草標(biāo)本蟲體上分離。
分離方法如下將采集的新鮮冬蟲夏草標(biāo)本刷去表面的泥土和植物碎片，用75%的乙醇進(jìn)行表面消毒處理后，取一小塊組織塊放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方見[姚一建，董彩虹，王波，謝雪欽(2005) —種冬蟲夏草的培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基。專利號(hào)ZL200510137457. 8]。
菌株鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定在培養(yǎng)基(ZL200510137457. 8)上，菌落凸起表面不平，培養(yǎng)基背面呈明顯的棕褐色。菌絲體無色，有隔膜，分枝，寬2. 2-4. 3 (-5. 4) ym。分生孢子梗無色，單生或2-8個(gè)簇生，但不形成孢梗束。產(chǎn)孢細(xì)胞系瓶形小梗，無色。分生孢子無色，無隔膜，腎形或長橢圓形，5. 4-14. 0 X 3. 2-4. 3 (-5. 4) y m，單生或2-4 (-6)個(gè)一群，為一檸檬形粘膜所包圍。 分子生物學(xué)鑒定按照文獻(xiàn)[Jiang， Y. &Yao， Y. -J. (2006) ITS sequenceanalysisand ascomatal development of Pseudogymnoascus roseus. Mycotaxon.94 :55-73.]的方法，菌株培養(yǎng)物經(jīng)DNA提取、PCR擴(kuò)增核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)并測(cè)序，所得序列經(jīng)與本實(shí)驗(yàn)室遞交到GenBank的序列AY608925 —致，并與從青藏高原不同地區(qū)采集的冬蟲夏草標(biāo)本的ITS序列比對(duì)，確認(rèn)為冬蟲夏草。該菌株的編號(hào)是762。
冬蟲夏草(Cordyc印s sinensis) 762已于2008年12月05日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCC 2793。
2)冬蟲夏草菌發(fā)酵液的制備 冬蟲夏草菌經(jīng)液體深層發(fā)酵40天后，5000g離心15分鐘，去除菌絲體，收集濾液，
并抽濾除去濾液中的細(xì)小雜質(zhì)，得到冬蟲夏草菌發(fā)酵液。 具體制備方法如下 (1)菌株活化將冬蟲夏草(Cordyc印s sinensis) 762CGMCC 2793接種于冬蟲夏草半合成固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度10-2rC，培養(yǎng)時(shí)間40-60天； 該冬蟲夏草半合成固體培養(yǎng)基[姚一建，董彩虹(2004) —種冬蟲夏草半合成培養(yǎng)基.專利號(hào)ZL 200410090875.1]按照如下方法配制取蔗糖50. 0克，蛋白胨10. 0克，酵母提取物3. 0克，磷酸二氫鉀1. 0克，硫酸鎂0. 5克，瓊脂20克，用蒸餾水定容至1000毫升；
(2)發(fā)酵菌種培養(yǎng)用步驟(1)的培養(yǎng)物，在無菌條件下接種到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度10-2rC，培養(yǎng)方式為利用漩渦式搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時(shí)間6-20天；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)以5_10%的體積比的接種量，將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度10-21°C ，培養(yǎng)時(shí)間40天，然后將得到的發(fā)酵液在5000g離心15分鐘，去除菌絲體，收集濾液，并抽濾除去濾液中的細(xì)小雜質(zhì)，制得去除菌絲體的冬蟲夏草菌發(fā)酵液。
冬蟲夏草黑色素的提取純化按照?qǐng)D1所示的流程圖進(jìn)行。
3)冬蟲夏草黑色素粗提物的提取 以步驟1)得到的冬蟲夏草菌發(fā)酵液為原料，提取方法包括如下步驟 取冬蟲夏草菌發(fā)酵液3000ml ，加入2mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值為2. 5，靜置過
夜，使黑色素完全沉淀，8000g離心30分鐘，收集沉淀，用去離子水反復(fù)洗滌沉淀，然后將所
得沉淀經(jīng)冷凍干燥得到3g冬蟲夏草黑色素粗提物。 4)冬蟲夏草黑色素粗提物的純化
將3g冬蟲夏草黑色素粗提物用30ml 6-7mol/L濃鹽酸溶液在IO(TC水解2小時(shí)，冷卻后8000g離心30分鐘，收集沉淀，將沉淀依次用0. Olmol/L鹽酸、去離子水洗滌以除去蛋白質(zhì)雜質(zhì)，得到脫蛋白的冬蟲夏草黑色素； 將得到的脫蛋白的冬蟲夏草黑色素溶解在1. 0mol/L的氫氧化鉀稀堿溶液中，氫氧化鉀溶液的用量為黑色素體積的50倍，加入氯仿溶液和正丁醇溶液以除去脂類。具體做法是將脫蛋白的冬蟲夏草黑色素充分溶解在150mll.0mol/L氫氧化鉀溶液中，依次加入25ml氯仿、2. 5ml正丁醇(氯仿與正丁醇的體積比為10 : 1)，室溫磁力攪拌30分鐘，8000g離心時(shí)間IO分鐘離心去下層(有機(jī)層)，將水層轉(zhuǎn)移，在水層中加入2mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2. 5， 8000g離心時(shí)間30分鐘得到黑色素沉淀，并重復(fù)兩次溶解、有機(jī)溶劑洗滌、沉淀的操作；以去離子水反復(fù)洗滌黑色素沉淀，除去其中的氯離子，直至上清液與Ag+反應(yīng)為陰性，氯離子定性檢測(cè)為陰性為止；室溫風(fēng)干至恒重，即得1. 2g冬蟲夏草黑色素成品。
將本實(shí)施例制備的黑色素和Sigma公司銷售的黑色素(CAS :8049_97_6)進(jìn)行比較。試驗(yàn)證明，兩者的性質(zhì)相近，均溶于堿性溶液，不溶于水、乙醇、丙酮、氯仿、己烷、甲醇、乙酸乙酯、乙醚、石油醚等有機(jī)溶劑，也不溶于植物油，pH小于3時(shí)完全沉淀，被KMn(^、NaC10、 H202、 K2Cr207等強(qiáng)氧化劑漂白，多酚反應(yīng)為陽性，如加入FeCl3后發(fā)生沉淀，遇FeS04/!^Fe(CN)e產(chǎn)生藍(lán)色。紫外光譜(見圖2)為一條隨波長增大而吸光度減小的曲線。紅外光譜(見圖3)在3400cm—工附近存在強(qiáng)而寬的共振吸收帶，是由OH和NHj勺伸縮振動(dòng)而產(chǎn)生，在1620cm—1有一強(qiáng)的吸收帶，由芳香C = C、酰胺中的C = 0和(或)C00—的振動(dòng)引起。
權(quán)利要求
一種從冬蟲夏草菌發(fā)酵液中提取黑色素的方法，包括以下步驟將冬蟲夏草菌發(fā)酵液除去菌絲體后，進(jìn)行酸化處理，收集沉淀，得到黑色素。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述酸化處理是將所述冬蟲夏草菌發(fā)酵液的PH值調(diào)至1-3。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法所述酸化處理中所加入的試劑是濃度為l-3mol/L的鹽酸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述冬蟲夏草菌發(fā)酵液是由冬蟲夏草(Cordyc印s sinensis) 762CGMCC 2793經(jīng)液體深層發(fā)酵后得到的；所述發(fā)酵的溫度10-21°C ;所述發(fā)酵的時(shí)間為20-60天。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括將酸化處理后的冬蟲夏草菌發(fā)酵液靜置過夜并離心的步驟；所述離心的相對(duì)離心力為5000-8000g，所述離心的時(shí)間為20-40分鐘。
6. 根據(jù)權(quán)利1-5中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括以下純化的步驟(a) 脫蛋白采用鹽酸法對(duì)權(quán)利要求l-5中任一所述方法提取的黑色素進(jìn)行脫蛋白，得到脫蛋白的黑色素；(b) 脫脂將步驟(a)所述脫蛋白的黑色素用有機(jī)溶劑進(jìn)行脫脂，得到脫脂的黑色素；(C)去除氯離子以去離子水洗滌步驟(b)所述脫脂的黑色素，直至氯離子定性檢測(cè)為陰性為止；然后經(jīng)真空干燥或在25-5(TC干至恒重，得到純化的黑色素。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述步驟(a)脫蛋白的方法是將權(quán)利要求1-5中任一所述方法提取得到的黑色素用6-7mol/L鹽酸進(jìn)行水解，經(jīng)離心分離，收集沉淀，將沉淀依次用0.01-lmol/L鹽酸、去離子水洗滌得到脫蛋白的黑色素；其中，所述水解的時(shí)間為2-5小時(shí)，所述水解的溫度95-100°C。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述步驟(b)脫脂的方法是將步驟(a)所述脫蛋白的黑色素進(jìn)行至少一個(gè)如下操作過程，得到脫脂的黑色素溶解在0. 1-1. 0mol/L堿溶液中，依次加入氯仿和正丁醇，攪拌，離心，收集水層液體，并調(diào)節(jié)所述水層液體的pH值為l-3，離心收集沉淀。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述堿溶液為氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀溶液；所述氯仿與正丁醇的體積比為10 : 1至20 : 1。
10. 冬蟲夏草(Cordyc印s sinensis) 762，其保藏編號(hào)為CGMCC 2793。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從冬蟲夏草菌發(fā)酵液中提取黑色素的方法。該方法包括以下步驟將冬蟲夏草菌發(fā)酵液除去菌絲體后，進(jìn)行酸化處理，收集沉淀，得到黑色素粗提物。將黑色素粗提物用鹽酸水解去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)，有機(jī)溶劑反復(fù)洗滌和反復(fù)堿溶解后酸化使之沉淀進(jìn)行純化，去離子水反復(fù)洗滌除去氯離子，最后干燥得到冬蟲夏草黑色素成品。本發(fā)明制備的黑色素，和Sigma公司銷售的黑色素CAS8049-97-6性質(zhì)相近。兩者均溶于堿性溶液，不溶于水、乙醇、丙酮、氯仿、己烷等有機(jī)溶劑，pH小于3時(shí)完全沉淀，遇強(qiáng)氧化劑褪色，紫外可見光區(qū)掃描圖譜為一條隨波長增大而吸光度減小的曲線，紅外光譜中有3400cm-1附近和1620cm-1各有一強(qiáng)的吸收帶。
文檔編號(hào)C12R1/645GK101760038SQ200810241008
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月24日
發(fā)明者姚一建, 董彩虹 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院微生物研究所