專(zhuān)利名稱(chēng)：摩爾根氏變形桿菌的(d)-專(zhuān)一性羰基還原酶的基因序列和氨基酸組成的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
摩爾根氏變形桿菌(Morga"e//a;wo^z""') CMCC(B) 49208的(D)-羰基還原 酶的基因序列和氨基酸組成，該(D)-專(zhuān)一性羰基還原酶基因用于生物法拆分外消 旋化合物，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
光學(xué)純^偽麻黃堿，在醫(yī)藥上是多功能多用途的藥物。在臨床上主要用于 支氣管哮喘，過(guò)敏型反應(yīng)，低血壓及鼻粘膜充血腫脹引起的鼻塞等治療。由于 麻黃堿分子中含有復(fù)合官能團(tuán)，因此還常被用于有機(jī)合成，研制新型藥物。因 此，幵展麻黃堿拆分方法的研究極有意義。
利用生物法轉(zhuǎn)化制備光學(xué)純的手性化合物具有反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物單一， 立體選擇性、區(qū)域選擇性和化學(xué)選擇性較高，并能完成一些化學(xué)合成難以進(jìn)行 的反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。合成光學(xué)活性物質(zhì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)大致可分為兩類(lèi) 一類(lèi)是把外消旋 體拆分為兩個(gè)具有光學(xué)活性的對(duì)映體；另一類(lèi)是從外消旋或手性的前體出發(fā)， 通過(guò)催化反應(yīng)得到不對(duì)稱(chēng)的光學(xué)活性產(chǎn)物。
90年代起國(guó)際上對(duì)微生物及酶拆分手性化合物進(jìn)行大量的研究。酶由氨基酸 構(gòu)成，其活性中心構(gòu)成了一個(gè)不對(duì)稱(chēng)環(huán)境，有利于對(duì)消旋體的識(shí)別，是一種高 度手性的催化劑。其催化效率高，有較強(qiáng)的專(zhuān)一性。酶促拆分消旋體是比較理 想的選擇。利用完整細(xì)胞對(duì)外消旋化合物進(jìn)行轉(zhuǎn)，可以獲得光學(xué)純對(duì)映體，在 非水相及有機(jī) 一 水雙相反應(yīng)體系中，也可酶促轉(zhuǎn)化制備光學(xué)純化合物。
目前，部分立體選擇性氧化還原酶基因已通過(guò)基因工程手段獲得，而對(duì)于 來(lái)源于Morga"e//a morgam7 CMCC(B) 49208的立體選擇性氧化還原酶基因，國(guó) 內(nèi)外研究很少，其基因組序列等信息幾乎為空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供Morga"e//a worgam7 CMCC(B) 49208的(D)-羰基還原酶 的基因序列和氨基酸組成，以便利用該基因的重組菌株進(jìn)行外消旋手性拆分， 并為進(jìn)一步研究用于手性拆分的微生物立體選擇性氧化還原酶的多樣性，轉(zhuǎn)化 途徑及反應(yīng)機(jī)理創(chuàng)造條件。
本發(fā)明的技術(shù)方案摩爾根氏變形桿菌(Morga"e//a Anorgam7) CMCC(B) 49208的(D)-專(zhuān)一性羰基還原酶，其基因核苷酸序列為SEQ ID NO: 1。該摩爾 根氏變形桿菌(Morga"e〃a mc^a"") CMCC(B) 49208的(D)-專(zhuān)一性羰基還原酶，其氨基酸組成為SEQIDNO: 2。
通過(guò)對(duì)立體選擇性氧化還原酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，認(rèn)為來(lái)源于Morg朋e/fo wwg"w7 CMCC 490868的(D)-羰基還原酶將底物l-苯基-2-甲氨基丙酮(MAK) 轉(zhuǎn)化為A偽麻黃堿的反應(yīng)機(jī)理為在NAD+的存在下，添加葡萄糖，葡萄糖脫 氫酶，使NAD+還原為NADH，然后在NADH的存在下，將底物l-苯基-2-甲氨 基丙酮(MAK)不對(duì)稱(chēng)還原為A偽麻黃堿。
該酶催化氧化還原反應(yīng)的最合適的初始pH為7.5，最合適的轉(zhuǎn)化溫度為30 °C。底物MAK濃度、葡萄糖的添加量和葡萄糖脫氫酶的濃度分別為150mg/L、 100|amol/L、 15U/mL。
本發(fā)明所采用的微生物為摩爾根氏變形桿菌(ikforga"e//a mowam7)，保藏 于中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，保藏號(hào)CMCC(B) NO. 49208。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明用轉(zhuǎn)化效果較好的菌株worgam7 CMCC(B) 49208，分離獲得(D)-羰基還原酶進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)化底物l-苯基-2-甲氨 基丙酮(MAK)得到單一產(chǎn)物A偽麻黃堿。
經(jīng)轉(zhuǎn)化液組成和轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化后，所用酶蛋白不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)化底物l-苯基-2-甲 氨基丙酮(MAK)，產(chǎn)物的產(chǎn)量有較大的提高，確定了優(yōu)化的轉(zhuǎn)化液組成和轉(zhuǎn)化 條件。
獲得Mwga"e〃a wo"a"" CMCC(B) 49208的(D)-專(zhuān)一性羰基還原酶的基因， 并利用表達(dá)該基因的重組大腸桿菌進(jìn)行外消旋手性拆分，為進(jìn)一步研究用于手 性拆分的微生物立體選擇性還原酶的多樣性、轉(zhuǎn)化途徑及反應(yīng)機(jī)理創(chuàng)造條件。


圖1 CMCC(B) 49208的(D)-羰基還原酶的肽指紋圖譜。
具體實(shí)施例方式
Aforg朋e〃a mwga剛7 CMCC(B) 49208的(D)-專(zhuān)一性羰基還原酶基因的PCR 產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后，利用BigDye測(cè)序試劑盒和應(yīng)用生物系統(tǒng)自動(dòng)DNA測(cè)序 儀進(jìn)行核苷酸序列的測(cè)序，其核苷酸序列為SEQIDNO: 1，該還原酶氨基酸組 成為SEQIDNO: 2。
實(shí)施例1:通過(guò)常規(guī)蛋白質(zhì)分離純化方法，獲得M mwgam7 CMCC(B) 49208 的(D)-專(zhuān)一性羰基還原酶。取一定量酶液加入0.2 mol/LpH 7.5的磷酸緩沖液，150 mg/LMAK， 100 pmol/L葡萄糖，10mol/LNADH， 15U/mL葡萄糖脫氫酶，雙 蒸水補(bǔ)足至lmL，在30 。C下反應(yīng)10 h， HPLC (Agilent 1100 serices色譜儀， ZORBAXSBC18柱，G1314A紫外檢測(cè)器，柱溫40 °C，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm， 進(jìn)樣量10 mL，流動(dòng)相為甲醇:0.02 mol/L的磷酸二氫鉀緩沖液:乙酸:三乙胺 =4:96:0.2:0.13 (v:v:v:v))。檢測(cè)結(jié)果表明，反應(yīng)液中89%以上的MAK被轉(zhuǎn)化為 cZ-偽麻黃堿。利用MADLI-TOF-MS方法獲得該羰基不對(duì)稱(chēng)還原酶的肽指紋圖譜，如圖1 所示。經(jīng)NCBI利用MASCOT通過(guò)Protein Prospector蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)目的蛋白進(jìn) 行鑒定，通過(guò)MOWSE評(píng)分方法，未能得到100。％的匹配識(shí)別，初步顯示為一 種新蛋白。
通過(guò)MOWSE評(píng)分方法獲得最主要的一個(gè)匹配，檢索所得有意義匹配蛋白 為一芽孢桿菌中的亮氨酸脫氫酶，而M mo^tw//CMCC(B) 49208菌株也屬于芽 孢桿菌屬，且羰基不對(duì)稱(chēng)還原酶與亮氨酸脫氫酶都為氧化還原酶系，此匹配蛋 白與目的酶應(yīng)該有一定的同源性。
與Protein Prospector蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的下列序列比對(duì)，只與黑體字所標(biāo)的核苷酸 相同。
1 MALEIFEYLE KYDYEQVVFC QDKESGLKAI IAIHDTTLGP ALGGT麗TY 51 DSEEMIEDA LRLAKGMTYK N嵐GLNLGG AKTVIIGDPR腿SEAMFRA 101 LGRYIQGLNG RYITAEDVGT TV匪DIIHE ETDFVTGISP SFGSSGNPSP 151 VTAYGVYRGM KAAAKEAFGT DNLEGKVIAV QGVGNVAYHL CKHLHAEGAK 201 LIVTDINKEA VQRAVEEFGA TAVEPNEIYG VECDIYAPCA LGATVNDETI 251 PQLKAKVIAG S應(yīng)QLKEDR HGDII腦GI VYAPDYVINA GGVINVADEL 301 YGYNRERALK RVESIYDTIA KVIEISKRDG IATYVMDRL AEERIASL認(rèn) 351 SRSTYL腦H DIISRR 實(shí)施例2:取上下兩部分("IAIHDTTL"和"IATYVAAD")核苷酸序列設(shè) 計(jì)兼并引物
上游引物Z 1為5 ，-ATHGCNATHCAYGAYACNAC-3 ，；
下游引物Z1為5，-GCNGCNACRTANGTNGCDAT-3，
對(duì)M mo^am7CMCC(B)49208細(xì)菌基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件95°C 預(yù)變性5min,95。C變性30s， 53 。C退火45 s， 72。C延伸lmin， 30個(gè)循環(huán)后于72 °C 繼續(xù)延伸10min，得到900bp左右的基因片段?；厥?00 bp左右的特異性片段， 測(cè)定該基因片段序列，該段序列與在NCBI網(wǎng)站上面公布的數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)以后， 得到同源性較高的均為芽孢桿菌的亮氨酸脫氫酶基因(leucine dehydrogenase LeuDH gene )。
選取同源性較高的幾個(gè)基因序列，分析其保守序列，由此設(shè)計(jì)全基因PCR 擴(kuò)增引物Z3、 Z4:
上游引物Z3: 5,-CGCCTGCAGGCG ATGGCATTAGAAATCTTCGA隱3 ，
P^頂每切位點(diǎn)
下游引物Z4: 5，扁CGCCTGCAGGCGTTAGCGACGGCTAATAATGT-3，
Art酶切位點(diǎn)
以M wo^"w7 CMCC(B) 49208細(xì)菌基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件95。C預(yù)變性5 min, 95 。C變性1 min， 65 。C退火1 min， 72 。C延伸lmin, 30個(gè)循環(huán)后于72 。C繼續(xù)延伸10min。擴(kuò)增出1.1 kb左右的基因片段，回收1.1 kb左右的特異性片段，測(cè)定該基因片段序列，得到SEQIDNO: 1，即為M膨rg朋//CMCC(B) 49208的(D)-專(zhuān)一性羰基還原酶目的基因。
實(shí)施例3:提取質(zhì)粒pKK223經(jīng)i^I酶切后，與同樣酶切的目的基因片段連接后轉(zhuǎn)化到Eco/nM109感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含有氨芐青霉素的LB平板，隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒，尸WI酶切驗(yàn)證已插入目的基因的重組質(zhì)粒再采用J^oRI酶切，驗(yàn)證獲得目的基因正向連接的重組質(zhì)粒，含有該重組質(zhì)粒的重組菌
進(jìn)行進(jìn)一步酶活驗(yàn)證工作。
實(shí)施例4:重組菌與宿主菌Eco/ZJM109 (作為對(duì)照)在37X:， LB培養(yǎng)基
中，200 r/min條件下過(guò)夜培養(yǎng)后，按l %接種量轉(zhuǎn)接，相同條件培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期(約4h)，用終濃度為0.4mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6h， 6000 r/min離心6min收集菌體，40mmol/L磷酸緩沖液重新懸浮菌體，在冰浴條件下超聲破碎(工作時(shí)間ls，間隔時(shí)間2s，破壁10min)。 4°C， 6000 r/min離心10 min，上清即為無(wú)細(xì)胞抽提液，取一定量抽提液加入0.2mol/LpH7.5的磷酸緩沖液，150mg/LMAK， 100 pmol/L葡萄糖，10mol/LNADH， 15U/mL葡萄糖脫氫酶，雙蒸水補(bǔ)足至lmL，在30 'C下反應(yīng)10h， HPLC檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)下表，表明表達(dá)目的基因的重組大腸桿菌含有能夠?qū)Ｒ恍赞D(zhuǎn)化MAK為A偽麻黃堿的來(lái)源于Mmorg""http:// CMCC(B) 49208的(D)-專(zhuān)一性羰基還原酶。_
無(wú)細(xì)胞抽提液來(lái)源菌^-偽麻黃堿
宿主菌(￡.co//JM109)0
表達(dá)目的基因的重組菌0.114 mg序 列 表
<210〉 SEQIDNO:l<211> 1046<212> DNA
<213> 摩爾根氏變形桿菌(A/wga"e〃awo^3"http://) CMCC(B) NO. 49208
<■〉 1
attttgtcaag3taaag3atgcaattcatgat acaacac t60
tggscctgctcttggtggaagacatatgattctgaagaagcggcgattga120
sgatgcattgcgtcttgcaa鄉(xiāng)ggatgacgcagcagctggcttaaactt180
aggtggtgcgaaaacagtaattatcggtgag3t3卿gCg33gCg3tgtt240
ccgtgcattaggtcgctatattcaaggactaaacggacgttacattacagctgaagatgt300
tggtac犯cagtagatgatatggatsttatcc3tgaagaaactgactttgtaacaggtat360
ctcaccatcattcggttcttctggtaacccatctccggtEiactgcatacggtgtttaccg420
tggtatg8sagcagctgcaaaagaagctttcggtactgacaatttagaaggaaaagtaat480
tgctgttcaaggcgttggtaacgtagcat已tcacctatgcaaacat 11acacgctg紛gg540
3ttgttacagagaagctgtacaacgtgctgtagaagaatt600
cggtgcatcsgcagttgaacttacggtgttgaatgcgatatttacgcacc660
atgtgcactaggcgcaacagttaatgatg已犯ctattccacaacttaaagcaaaagtaat720
cgcagttctgcaaataaccaattaaaagaagatcgtcacggcg已c3tcaitcatgaaatgg780
cgcaccagactatgtaattaatgcaggtggcgt犯tta已cgtagc卿cg840
agtt已tatggatacaat3g3gaacgtgcattaaa已cgcgttatgacacaa■
ttgcaaaagta^tcgaaa^tttcaaaacgcgatggcattgcaacttatgtagcagctgatc960
gtctagctgaagagcgCELttgcaagcttgaa^33ctctcgtagcacatacttacgcaacg1020
gtcacgacattattagccgtcgctaa1046
<210〉 SEQIDNO:2
<211> 365
<212〉 PRT
<213> 摩爾根氏變開(kāi)沐菌(M5g匿〃關(guān)wg畫(huà)7) CMCC(B) NO. 49208
<400〉 2
Met Ala Leu Glu lie
5
Gin Val Val Phe Cys20
Phe Glu Tyr Leu Glu10
Gin Asp Lys Glu Ser25
Lys Tyr Asp Tyr Glu15
Gly Leu Lys Ala lie30lie AlaArg MetLeu ArgLeu AsnLys AspGin GlyThr ValThr GlyVal ThrGlu AlaGin GlyAla GluVal GinAsn GluLeu GlyLys ValHis GlyTyr VeilTyr GlyTyr Asplie AlaAla SerAsp lie
lie His
Trp Thr
Leu Ala
Leu Gly
Lys Ser
Leu Asn
Asp Asp
lie Ser
Ala
Phe
Val
TyrGlyGly
Gly Ala
Arg Ala
lie Tyr
AIei Thr
lie Ala
Asp lie
lie Asn
Tyr Asn
Thr lie
Thr Tyr
Leu Lys
lie Ser
Asp
35Tyr
50Lys
65Gly
80Glu
95Gly110Met125Pro140Gly155Thr170Asn185Lys200Val215Gly230Val245Gly260lie275Ala290Arg305Ala320Val335Asn350Arg365
Thr
Asp
Gly
Ala
Ala
Arg
Asp
Ser
Val
Asp
Val
Leu
Glu
Val
Asn
Ser
His
Gly
Glu
Lys
Ala
Ser
ThrSerMetLysMetTyrliePheTyrAsnAlalieGluGluAspAlaGluGlyArgValAlaArg
LeuGluThrThrPhelielieGlyArgLeuTyrValPheCysGluAsnMETValAlalieAspSer
GlyGluTyrValArgThrHisSerGlyGluHisThrGlyAspThrAsnGlylieLeuGluArgThr
Pro
40Ala
55tys
70lie
85Ala100Ala115Glu130Ser145MET160Gly175Leu190Asp205Ala220lie235lie250Gin265lie280Asn295Lys310lie325Leu340Tyr355
AlaAlaAsnlieLeuGluGluGlyLysLysCyslieThrTyrProLeuValVal
LeulieAlaGlyGlyAspThrAsnAlaValLysAsnAlaAlaGinLysTyrAla
Arg ValSer LysAla GluLeu Arg
GlyGluAlaAspArgValAspProAlalieHisLysValProLeuGluAlaAspGluArgGluAsn
Gly Thr45
Asp Ala60
Ala Gly75
Pro Arg90
Tyr lie
105Gly Thr
120Phe Val
135Ser Pro
150Ala Lys
165Ala Val
180Leu His
195Glu Ala
210Glu Pro
225Cys Ala
240Lys Ala
255Asp Arg
270Pro Asp
285Glu Leu
300Ser lie
315Asp Gly
330Arg lie
345Gly His
360
權(quán)利要求
1、摩爾根氏變形桿菌(Morganella morganii)CMCC(B)49208的(D)-專(zhuān)一性羰基還原酶，其基因核苷酸序列為SEQ ID NO1。
2、 如權(quán)利要求1所述的摩爾根氏變形桿菌(^fo^a"e〃amw^a"")CMCC(B) 49208的(D)-專(zhuān)一性羰基還原酶，其氨基酸組成為SEQIDNO: 2。
全文摘要
摩爾根氏變形桿菌CMCC(B)49208的(D)-專(zhuān)一性羰基還原酶的基因序列和氨基酸組成，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明確定摩爾根氏變形桿菌(Morganella morganii)CMCC(B)49208的(D)-專(zhuān)一羰基還原酶，其基因核苷酸序列為SEQ ID NO1，其氨基酸組成為SEQ ID NO2，該(D)-專(zhuān)一性羰基還原酶基因用于生物法拆分外消旋化合物，利用該基因可使其重組菌用于外消旋手性拆分，并為進(jìn)一步研究用于手性拆分的微生物立體選擇性氧化還原酶的多樣性，轉(zhuǎn)化途徑及反應(yīng)機(jī)理創(chuàng)造條件。
文檔編號(hào)C12N9/02GK101486998SQ20081024328
公開(kāi)日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2008年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月29日
發(fā)明者丁重陽(yáng), 燕 盧, 梁 張, 張鵬華, 王正祥, 石貴陽(yáng) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)