專利名稱：乙醇診斷/測定試劑(盒)及乙醇濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乙醇診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定乙醇濃度的方
法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乙醇具成癮性，酒濫用和酒依賴是當(dāng)今世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的社會經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生
問題之一。在西方國家，酒精相關(guān)性肝病已成為死亡的第六位原因。在我國，近20年來，隨
著社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人均酒消耗量大幅度上升，酒依賴的患病率日趨增高。 生物樣品中乙醇的定量測定方法主要有化學(xué)比色法，酶終點(diǎn)比色法，均相酶免疫測
定法(EIA)，氣相色譜法(GC)和呼出氣乙醇分析。此外血清滲透量法可作乙醇半定量分析。 有多種化學(xué)比色法曾用于乙醇定量測定，微量擴(kuò)散法是其中較簡單實(shí)用的一種，
微量溢出的乙醇可使鉻酸還原成藍(lán)色的氧化鉻。 根據(jù)所用的試劑酶不同，乙醇的酶法測定分為二種乙醇氧化酶法和乙醇脫氫酶 法，與乙醇氧化酶法相比，乙醇脫氫酶法的專一性高，不會與甲醇和丙酮起催化反應(yīng)。
—般認(rèn)為氣相色譜法可作為參考方法，尤其在準(zhǔn)確性和精密度要求高的法醫(yī)學(xué)乙 醇測定中應(yīng)用最廣。GC法的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)在于特異、靈敏，且能同時分析多種揮發(fā)性醇類物質(zhì)， 如乙醇、甲醇、丙酮、乙醛和異丙醇。 其他乙醇的測定方法還有均相酶免疫分析(Homogeneous enzymeimm皿oassay)、 滲透量法、呼出氣乙醇分析法；用呼出氣乙醇分析儀檢測乙醇操作簡單、快速，在交通執(zhí)法 部門應(yīng)用較多。這類儀器中一種是根據(jù)紅外光吸收原理設(shè)計的，該法測定的乙醇濃度與酶 法測得的血乙醇濃度相關(guān)性很好。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出 一 種利用雙倍酶循環(huán)擴(kuò)增法
(EnzymaticRecycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)
聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計量/連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm
波長處吸光度的變化，得以測定乙醇濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的
乙醇診斷/測定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化
分析儀上進(jìn)行乙醇濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明乙醇濃度測定方法如下 乙醇+輔酶酒精脫氡酶乙醛+還原型輔酶 乙醛+水過氧化氡酶乙醇+過氧化氫 過氧化氫+輔酶NAD (P) H氧化酶還原型輔酶+氧 這種方法應(yīng)用酒精脫氫酶(alcohol dehydrogenase ;EC 1. 1. 1. 1)酶(偶)聯(lián)過 氧化氫酶(Catalase ;EC 1. 11. 1. 6) 、NAD(P)H氧化酶(NAD(P)H oxidase ;ECl. 6. 3. 1)酶促
反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法。酒精脫氫酶作為作用酶，功能為將乙醇酶解產(chǎn)生乙醛。過氧化氫酶作為循環(huán)酶過氧化氫酶的酶促作用使乙醛再次變回乙醇，使乙醇不斷地被重復(fù)循環(huán)利用。酒精
脫氫酶與NAD(P)H氧化酶都作為顯色酶，將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原 型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度， 通過測量340nm處吸光度上升的速度，可以測算出乙醇的濃度。 實(shí)驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單
劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明乙醇診斷/測定試劑(盒)較為理想 緩沖液 lOOmmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 輔酶 3mmol/L 酒精脫氫酶 10000U/L 過氧化氫酶 12000U/L NAD(P)H氧化酶 12000U/L 本發(fā)明的乙醇診斷/測定試劑(盒)可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、酒精脫氫酶、過氧化氫酶、NAD(P)H氧化酶。 試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、酒精脫氫酶、過氧化氫酶、NAD(P)H氧化酶。
輔酶、酒精脫氫酶、過氧化氫酶、NAD(P)H氧化酶在試劑1或試劑2中的位置可以 試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑l 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化氫酶、NAD (P) H氧化酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、酒精脫氫酶。 輔酶、酒精脫氫酶、過氧化氫酶、NAD(P)H氧化酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位 置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試 劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定乙醇濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
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實(shí)施例一 本實(shí)施例的乙醇診斷/測定試劑為單試劑，包括 [OO42]三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
輔酶 3mmol/L
酒精脫氫酶 10000U/L
過氧化氫酶 12000U/L
NAD (P) H氧化酶 12000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復(fù)溶后使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C ，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度《0. 1，測
試主波長340nm，測試副波長405nm，被測乙醇樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為
正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出乙醇的濃度大小。 實(shí)施例二 本實(shí)施例的乙醇診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
輔酶 3mmol/L
試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 酒精脫氫酶 10000U/L 過氧化氫酶 12000U/L NAD (P) H氧化酶 12000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C ，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度《0. 1，測
試主波長340nm，測試副波長405nm，被測乙醇樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，
反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出乙醇的濃度大小。 實(shí)施例三 本實(shí)施例的乙醇診斷/測定試劑為三試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
輔酶 3mmol/L
試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
過氧化氫酶 12000U/L
NAD (P) H氧化酶 12000U/L 試劑3三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 酒精脫氫酶 10000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定乙醇濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C ，反應(yīng)時間10分鐘，起始
吸光度《0. 1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測乙醇樣品與試劑1、試劑2、試劑3
的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約1分鐘左右，檢測
時間2分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出乙醇的濃度大小。 申請人:經(jīng)過實(shí)驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達(dá)到本發(fā)明 的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。 總之，實(shí)驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0005 ;吸光度時間反應(yīng)曲線應(yīng)呈上 升曲線直至終點(diǎn)；試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達(dá)20mmol/L ;試劑測試的不準(zhǔn)確 度，其相對偏差不超過±3% ;試劑測試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《1% ;試劑 的靈敏度可達(dá)O. 0300±0. 0200 AA/mmol/L ;試劑在2-8"下保存，活性可以穩(wěn)定一年；—— 本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
一種雙倍酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法的乙醇的濃度測定方法，其方法如下乙醇+輔酶 酒精脫氫酶 乙醛+還原型輔酶乙醛+水 過氧化氫酶 乙醇+過氧化氫過氧化氫+輔酶 NAD(P)H氧化酶 還原型輔酶+氧將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出乙醇的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種乙醇診斷/ 緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶酒精脫氫酶 過氧化氫酶 NAD (P)H氧化酶515253試劑成分的濃度不-反應(yīng)作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。Sl底物可以是化合物商品，也可以由其它酶反應(yīng)方法生成。生成方法 為
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙醇診斷/測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、酒精脫氫酶、過氧化氫酶、NAD(P)H氧化酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙醇診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、酒精脫氫酶、過氧化氫酶、NAD(P)H氧化酶組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、酒精脫氫酶、過氧化氫酶、 NAD(P)H氧化酶組成。輔酶、酒精脫氫酶、過氧化氫酶、NAD(P)H氧化酶在試劑1或試劑2中 的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙醇診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、酒精脫氫酶、過氧化氫酶、NAD(P)H氧化酶組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化氫酶、NAD(P)H氧化酶 組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、酒精脫氫酶組成。輔酶、酒精脫氫酶、過氧化氫酶、NAD(P)H 氧化酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙醇診斷/測定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 l-4000mmol/L或0. 1% _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(A,niaSulfate)、甘油 (Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一 種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用雙倍酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的乙醇診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定乙醇濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、酒精脫氫酶、過氧化氫酶、NAD(P)H氧化酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出乙醇的濃度大小。
文檔編號C12Q1/26GK101750374SQ20081024426
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司