專利名稱：雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體及其制備方 法和用途。
背景技術(shù)：
雙歧桿菌質(zhì)粒的研究相對較少。1982年，Sgortati等對1461株共24個種的雙歧桿菌進行 了質(zhì)粒的檢測，發(fā)現(xiàn)四個種(總菌株數(shù)的20%)的雙歧桿菌即長雙歧桿菌、球雙歧桿菌、星狀 雙歧桿菌以及印度雙歧桿菌含有質(zhì)粒。在GenBank中檢索到雙歧桿菌質(zhì)粒的記錄也只有16個 [NC006843、 NC004978、 NC004770、 NC004769、 NC004768、 NC004253、 NC004252、 NC00443、 NC004943、 NC002635、 NC002133、 NC003527、 Y11549、 E17316、 X84655、 DQ093580]但沒有 一個是可以直接用于外源基因表達的載體。由于自然界雙歧桿菌質(zhì)粒的稀有性，關(guān)于雙歧桿 菌表達質(zhì)粒的研究無論從數(shù)量還是質(zhì)量均很薄弱。穿梭質(zhì)粒是能在兩種或兩種以上宿主中復(fù)制的質(zhì)粒，大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭質(zhì)粒是指 在大腸桿菌和雙歧桿菌中均能夠復(fù)制的人工構(gòu)建的質(zhì)粒。以大腸桿菌為宿主，有利于轉(zhuǎn)化和 重組子的篩選，并能增加所需DNA克隆片段的檢出率，利于保存和操作等優(yōu)勢。1990年 Marteuzzi等從長雙歧桿菌B2577菌株中分離出的隱性質(zhì)粒pMBl，通過限制性內(nèi)切酶將pMBl質(zhì) 粒酶切后連接到質(zhì)粒載體上，對其復(fù)制區(qū)域的進行了研究，1994年Missich等將pMBl質(zhì)粒經(jīng) 限制性酶切和連接酶作用，在體外與pcEM—5zf (+)質(zhì)粒重組，成功地構(gòu)建了大腸桿菌-長雙 歧桿菌的穿梭載體pRMl和pRM2[3]。 1996年Rossi， Marteuzzi等以pMBl復(fù)制子為基礎(chǔ)，構(gòu)建了 大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭載體pDG7，這是最早關(guān)于雙歧桿菌表達質(zhì)粒的報道[4]。 1998年 Rossi等以pDG7為基礎(chǔ)進一步將此質(zhì)粒載體改建為質(zhì)粒pDLI41， pDGA7和pDC07，分別用以表 達熒光假單胞菌脂酶，芽胞桿菌淀粉酶和鏈霉菌膽固醇氧化酶[5]，這是最早報道具有實用 價值的雙歧桿菌表達載體的例子。此后的雙歧桿菌表達載體大多以此為骨架進行改造。1997 年Matsumura H等以長雙歧桿菌質(zhì)粒為骨架構(gòu)建了pBLES100表達載體[6] ， 2002年T0SHIYUKI Nakamura等用它表達胞嘧啶脫氨酶(cytosine deaminase)基因用于實體瘤的基因治療研 究[7]。國內(nèi)對大腸桿菌-長雙歧桿菌穿梭表達載體的研究非常有限。2006年韓慶旺等以質(zhì)粒 pDG7、 pBCSK(+)、 pET-9C為基礎(chǔ)，構(gòu)建大腸桿菌-長雙歧桿菌穿梭表達載體pET-1128，并將人內(nèi)皮抑素基因插入到新構(gòu)建的表達載體中表達"」。2006年，侯鑫等以pMBl復(fù)制基因片段和 hu啟動子為元件，以pMD18-T為骨架，構(gòu)建了大腸桿菌-長雙歧桿菌穿梭表達載體pMB-HU，并 表達了抑癌基因PTEN，但從源流上講，與pET-1128—樣，均屬于pMBl質(zhì)粒系列[8]。至于2001 年劉文華等報道的轉(zhuǎn)內(nèi)皮抑素基因雙歧桿菌制劑對肺癌的療效[9]和任啟偉等2004年報道的重 組胞嘧啶脫氨酶基因的嬰兒雙歧桿菌表達胞嘧啶脫氨酶對鼠黑色素瘤B16—F10細胞的殺傷效 應(yīng)研究[1<)]，質(zhì)粒分別是大腸桿菌質(zhì)粒pBV220和pGEX-lLambdaT，其復(fù)制元件均為pBR322的復(fù) 制序列，穩(wěn)定性差。雖然pMBl的復(fù)制序列來自雙歧桿菌，使質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大改善，但刪除 了pMBl的復(fù)制序列的復(fù)制起始位點W ，使質(zhì)粒復(fù)制的調(diào)控受到影響，在一定程度上影響了質(zhì) 粒的穩(wěn)定性。而且在上述的報道中，除侯鑫等以雙歧桿菌的hu啟動子構(gòu)建的pMBl重組載體外 ，其余的載體均以大腸桿菌的LacZ或其衍生序列Tac[如pGEX系列載體]制成，需要用IPTG ( Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，異丙基-B-D硫代半乳糖苷)調(diào)控才能表達， 而IPTG具有一定的毒性，這在很大程度上限制了它在基因治療和口服疫苗研制中的應(yīng)用?？傮w而言，大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭載體的構(gòu)建和優(yōu)化篩選仍然是雙歧桿菌基因工程研 究和發(fā)展的弱點和重點，上述穿梭載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌與雙歧桿菌的效率不同，對雙歧桿菌轉(zhuǎn) 化效率還有待于提高，穩(wěn)定性也有所欠缺；而且目前的穿梭載體的來源單一，需要有使用新 的思路和基本元件構(gòu)建效率更高、更穩(wěn)定的穿梭載體，為本領(lǐng)域提供新的載體工具。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體。 本發(fā)明雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體，以pGEX-5x-l質(zhì)粒為骨架，含有雙歧桿菌的a -淀粉酶基因的啟動子Amy0，還含有長雙歧桿菌KJ36質(zhì)粒的復(fù)制蛋白B序列。其中，所述雙歧桿菌的a -淀粉酶基因的啟動子八1^0替換了口0￡乂-5^1上的啟動子？1￡^。 進一步的，上述的pGEX-5x-l質(zhì)粒缺失了LacIq片段。進一步的，上述的雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體具有SEQ ID NO. l所示的核苷酸序列進一步的，上述的雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體還帶有抗性篩選基因。比如帶有 氨芐青霉素抗性篩選基因，能使轉(zhuǎn)入上述雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體的重組菌在含有 50y g/ml氨芐青霉素的MRS培養(yǎng)基上生長，用于篩選重組菌。進一步的，上述的雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體還含有可表達的外源基因。更進一 步的，上述的外源基因為人產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的不耐熱腸毒素B亞單位基因。本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種制備上述的雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體的方法，該方法包括以下步驟a、 以雙歧桿菌的a -淀粉酶基因的啟動子AmyO替換pGEX-5x-l上的Ptac啟動子；b、 將長雙歧桿菌KJ36質(zhì)粒的復(fù)制蛋白B序列酶切后連接到步驟a所得的質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌，篩選，檢測確認后即得。進一步的，上述方法的步驟a中還要刪除pGEX-5x-l質(zhì)粒的LacIq片段。本發(fā)明所要解決的第三個技術(shù)問題是提供了含有上述所述雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達 載體的宿主細胞。進一步的，所述的宿主細胞為雙歧桿菌或大腸桿菌。本發(fā)明所要解決的第四個技術(shù)問題是提供上述的宿主細胞在制備口服疫苗或口服疫苗的 粘膜免疫佐劑中的用途。本發(fā)明所要解決的第五個技術(shù)問題是提供一種口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐劑，該 口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐劑是上述的宿主細胞添加藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成 分制備而成的。本發(fā)明中涉及使用的現(xiàn)有的核苷酸序列均能在已發(fā)表的本領(lǐng)域?qū)W術(shù)刊物及GenBank中檢 索而得，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員均能在參考本領(lǐng)域教科書或試驗手冊的基礎(chǔ)上完成本發(fā)明涉及 的分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)試驗。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體創(chuàng)造性地采用雙歧桿菌 質(zhì)粒pKJ36的復(fù)制子作為重組載體在雙歧桿菌中穩(wěn)定復(fù)制的基本復(fù)制元件，與現(xiàn)有技術(shù)中使 用的pMBl系列相比，保留了復(fù)制起始位點的重復(fù)序列，重組質(zhì)粒的復(fù)制受到嚴格的調(diào)控，因 此，增加了重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性，并同時具有雙歧桿菌質(zhì)粒的復(fù)制起始元件和大腸桿菌的復(fù)制 起始元件。另外還創(chuàng)造性地使用雙歧桿菌a -淀粉酶基因的啟動子作為重組質(zhì)粒驅(qū)動外源基 因表達的啟動子， 一方面該啟動子在雙歧桿菌中廣泛存在，是淀粉代謝的主要酶類，因此， 在雙歧桿菌中很容易使外源基因高效地表達；另一方面，該啟動子不需要特殊的調(diào)控因子， 很適合在體內(nèi)表達外源基因，免去了調(diào)控因子的毒性(如ITPG)和增加的生產(chǎn)成本，具有良 好的生物安全性。本發(fā)明雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體中可以用來攜帶如人產(chǎn)腸毒素大 腸桿菌的不耐熱腸毒素B亞單位基因等各種外源基因在雙歧桿菌或大腸桿菌中表達，使生產(chǎn) 得到的重組工程菌具有更高的表達效率，表達量也更為穩(wěn)定，能廣泛應(yīng)用于制備口服疫苗或 口服疫苗的粘膜免疫佐劑中，為本領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用提供了一種新的載體工具，具有很好的應(yīng) 用前景。


圖l為pGEX-5x-l，其中的ptac表示tac啟動子，引物F表示正向引物，引物R表示正反引 物，MCS表示多克隆位點，laclq表示阻遏蛋白編碼區(qū)。圖2為pBEX，其中的pAymO表示a-淀粉酶基因啟動子，MCS表示多克隆位點，R印B表示 長雙歧桿菌復(fù)制子序列區(qū)，bla表示氨芐青霉素抗性基因編碼區(qū)。圖3為MCS序列及酶切位點，圖4為pGEX-pAymO電泳圖譜，其中的P表示質(zhì)粒pGEX-pAymO (2. 5kb) ， M表示DNA marker(1DNA/Hind11)。圖5為pBEX電泳圖譜，其中的P表示質(zhì)粒pBEX (3. 5kb)， M表示DNA marker(自制PCR產(chǎn) 物Marker)。圖6為pBEX-LTB電泳圖，其中的M表示DNA marker (自制PCR產(chǎn)物Marker) ， l為ltB的PCR 產(chǎn)物(390bp) ， 2為pBEX-LTB質(zhì)粒與ltB的PCR產(chǎn)物的混合物，3為pBEX-LTB質(zhì)粒。 圖7為pBEX-LTB，其中的1 tB表示ETEC-1 tB編碼區(qū)。圖8為pBEX-LTB在雙歧桿菌中表達的SDS-PAGE電泳圖，其中的2表示蛋白質(zhì)marker(上海 生工)，1， 3-5表示ltB基因在不同時間表達的LTB的產(chǎn)物(8h， 4h) ， 6表示pBEX空白對照。圖9為pBEX-LTB口服活疫苗的保護性試驗，其中的A為無重組載體雙歧桿菌組大鼠經(jīng) E44815攻毒后的結(jié)果，B為疫苗免疫組大鼠經(jīng)E44815攻毒后的結(jié)果，可見A組較B組出現(xiàn)了嚴 重的小腸漲氣。圖io為本發(fā)明雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體的構(gòu)建過程示意圖。圖11為用本發(fā)明雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體構(gòu)建表達LTB基因的工程菌的流程圖。
具體實施方式
以下通過對本發(fā)明具體實施方式
的描述說明但不限制本發(fā)明。 實施例一 本發(fā)明雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體的構(gòu)建一.以雙歧桿菌的a-淀粉酶(amylase)基因(GenBank No: AY240946)的啟動子AmyO (位置599-690 nt)替換pGEX-5x-l上的Ptac啟動子(183-932)，同時用PCR方法刪除 pGEX-5x-l上的LacIq片段G立置3301-4420 nt)。 具體步驟如下1.用BamHI和Sacn酶切切取由上海生物工程技術(shù)公司合成的a -淀粉酶基因AmyO (啟動 子)序列110個堿基對，其5'端添加了M13反向測序引物序列(taaaacgacggccagt) (SEQ ID NO. 6)以便于測序。其構(gòu)建路線如下(1) 雙歧桿菌a-淀粉酶基因的啟動子序歹(J: 599 ta aaataaacag catacgttcg caatagtgca aacgctatca aagaagatga acccccgtta aagggattga agaaaaggaa taaaggagcc 690 (SEQ ID NO.7);(2)^^^Egtaaaacgacggcx蹈t (SEQ ID N0.8)是加在599前的肌3測序引物序列及Sacn酶切位點(下劃線)和保護堿基(方框)；(3)在690號堿基后加Bamm酶切位點和保護堿基序列^^^因此，最后合成的a -淀粉酶基因的啟動子序列為tCg3CCgCggt肌肌Cg3CggCC3gtt肌肌t肌3C3gC3t3CgttCgC肌t3gtgC肌3CgCt3tC肌3g肌g3tg肌Cccccgtt肌agggattgaagaaaaggaata肌ggagccggatccatc (127bp)(SEQ ID NO. 9)(如無特別標注，本發(fā)明中說明書中核苷酸序列的默認書寫方式均為由從5'端到3'端的 方向)。2.以pGEX-5x-l質(zhì)粒(序列如SEQ ID NO. 2所示，結(jié)構(gòu)簡圖見附圖l)為模板，用高保真 T叫DNA聚合酶通過PC財廣增獲得載體基本骨架。PCR引物F為pGEX-5x-l上的多克隆位點(MCS)序列，引物R為LacIq上游序列。是刪除 pGEX-5x-1上Lac I q的的引物序列。引物序列如下PF1: ^!^g辟tccccgaattcccg (SEQ ID N0. 10)(位置 pGEX-5x-1 934-949，含BamH頂每切位點)； pRl:teg咖egeggatte謡accxtgaattgac (seq m nq.u)(位置pGEX—5x—工3320-3301，添加SacI頂每切位點)；PC財廣增條件95°C 4 min， (95°C 40 Sec、 52°C 30Sec、 72°C 1 min)X30次循環(huán)。結(jié)果獲得2387bp的pGEX-5x-l上包括氨芐青霉素抗性基因和大腸桿菌復(fù)制起始位點在 內(nèi)的骨架片段。(骨架片段序列如SEQ ID NO. 3所示，過程示意圖見附圖IO)PCR產(chǎn)物用BamHI和SacII雙酶切后與AmyO酶切產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化，在氨芐青霉素抗性平板上 挑取單克隆，質(zhì)粒用電泳鑒定，命名pGEX-pAymO (見附圖4)，本次改造所得的質(zhì)粒明顯要 比第一步所得到的質(zhì)粒pGEX-5x-1小1000多個堿基對，測序確認后以Aat I頂每切備用。第二步合成長雙歧桿菌KJ36質(zhì)粒(GenBank No: AF139129)的復(fù)制蛋白B序列(位置SEQ ID N0.4所示，在兩端添加Aat n酶切位點及保護堿基)，序列片段由上海生工合成，測序確認 無誤。用PCR大量擴增該序列，正向弓l物為pRl: gcgacgtcgtacttagtacaaaagggga (SEQ ID NO. 12) (1-20 nt，添力口 Aat n酶切位點)。反向引物為pR2: gcgacgtcatgatgttcgcggttgcg (SEQ ID NO. 13) (1020-1002 nt， 添加Aat n酶切位點)。PC財廣增條件為95°C 3 min，再經(jīng)95。C 50 Sec、 54°C 40Sec、 72°C lmin的30次循環(huán)pKJ36復(fù)制元件(r印B)序列如SEQ ID NO. 4所示，其中第5 1018位堿基序列為載入本發(fā) 明雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體的序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)Aat n酶切后連接到第一步所得的質(zhì)粒對應(yīng)的Aat I頂每切位點。連接，轉(zhuǎn)化 ，在氨芐青霉素抗性平板上挑取單克隆，質(zhì)粒用電泳檢測后測序確認，命名為pBEX (電泳檢 測結(jié)果見附圖5)。至此，本發(fā)明雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體構(gòu)建成功，命名為pBEX。全長3509bp ( 附圖10中3個片段的核苷酸之和本應(yīng)為120 + 1014 + 2387 = 3521 bp，因有2個酶切位點重復(fù)， 所以應(yīng)減去重復(fù)計算的酶切位點，即減去12個堿基，特此注明)，核苷酸序列如SEQ ID NO. l所示。以sacll酶切位點起始序列記作l，該穿梭表達載體的主要特征如下(1) l-108bp為M13測序引物和a -淀粉酶基因的啟動子序列區(qū)。(2) 114-150bp為多克隆位點，依次有BamHI， EcoRI， Smal， Sall， XhoI和NotI五個單酶切位點。(3) 1569-2429bp為beta-lactamase (bla，氨芐青霉素酶)編碼序列，作抗性篩選基因。(4) 559-1410bp為長雙歧桿菌的R印B(復(fù)制蛋白B)的編碼序列。實施例二使用本發(fā)明雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體構(gòu)建表達LTB基因的工程菌 本實施例是將人產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(縮寫ETEC，衛(wèi)生部藥品鑒定所菌種保藏號 EC44815)的不耐熱腸毒素B亞單位(縮寫為LTB)的基因(GenBank No: M17874;位置 79-391 nt)連接到實施例一制備得到的雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體pBEX中構(gòu)建表達 LTB基因的穿梭載體pBEX-LTB (見附圖ll)。顯然，實施例一中制備得到的雙歧桿菌-大腸桿 菌穿梭表達載體pBEX還可用于以雙歧桿菌為受體菌的所有外源基因的表達及其基因工程產(chǎn)品 的生產(chǎn)。1、使用本發(fā)明雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體構(gòu)建表達LTB基因的工程菌的步驟如下(1) 用PC財廣增ETEC LTB基因并經(jīng)測序證明無誤后用BamHI和EcoRI雙酶切后連接到雙 歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體pBEX的多克隆位點上，構(gòu)建成轉(zhuǎn)化載體。PCR正向弓1物為LTF : aaggtcgacggatccatgaataaagtaaaatg (SEQ ID NO. 14)(力口入 了BamH頂每切位點)。反向弓1物為LTR: acggagctcgaattcttag織tgctttt,g (SEQ ID NO. 15)(力口入EcoRI 酶切位點)。PC財廣增條件為95°C 5 min， (95°C 50 Sec、 53°C 30Sec、 72°C 1 min)X30次循環(huán)。 PCR產(chǎn)物經(jīng)Aat n酶切后連接到第一步所得的質(zhì)粒對應(yīng)的Aat I頂每切位點。連接轉(zhuǎn)化，在氨芐青霉素抗性平板上挑取單克隆，質(zhì)粒用電泳檢測后測序確認(見附圖6)。至此，本發(fā)明含ETEC LTB基因的雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體pBEX-LTB構(gòu)建成功，全長3881bp (結(jié)構(gòu)簡圖如附圖7所示)，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。(2) 以雙歧桿菌為受體菌，經(jīng)去離子水配制的滅菌10%甘油處理后，用電轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒 載體轉(zhuǎn)化到受體菌中。轉(zhuǎn)化條件為15KV、 200 Q、 25yF。(3) 將轉(zhuǎn)化處理后的雙歧桿菌先在無抗菌素的MRS液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇60-120 min，然后 在含50yg/ ml氨芐青霉素的MRS固體培養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng)，選擇抗性菌落，從而獲得轉(zhuǎn)ETEC LTB基因的雙歧桿菌。PCR和SDS-PAGE鑒定后的陽性克隆即為雙歧桿菌-ETEC LTB重組載體的種子菌。如此反復(fù) 接種培養(yǎng)至繼代培養(yǎng)不低于15代時PCR檢測證實LTB仍然陽性的克隆作為種子菌用于大規(guī)模液 體接種擴增培養(yǎng)，培養(yǎng)物經(jīng)離心濃縮，進一步制備成轉(zhuǎn)ETEC LTB基因的雙歧桿菌-ETEC LTB 重組菌。2、用SDS-PAGE電泳試驗檢測LTB是否在上述大規(guī)模液體接種擴增培養(yǎng)的雙歧桿菌-ETEC LTB重組菌中的穩(wěn)定表達，結(jié)果見附圖8。從附圖8中可以看出LTB在受體雙歧桿菌中能夠穩(wěn)定 和高效率的表達。實施例三使用本發(fā)明雙歧桿菌-ETEC LTB重組菌制備口服活疫苗及該疫苗的藥效驗證1、 將實施例2制備的雙歧桿菌-ETEC LTB重組菌制成乳酸發(fā)酵制劑、片劑和膠囊制劑的 雙歧桿菌-ETEC LTB重組載體口服活疫苗，用于預(yù)防和治療ETEC引發(fā)腹瀉性疾病。也可以作 為所有口服疫苗的粘膜免疫佐劑。2、 口服活疫苗的藥效驗證1)試驗分組(20日齡雄性昆明大鼠30只，隨機分成下述3組) 疫苗免疫組、無重組載體的雙歧桿菌對照組和PBS對照組。2) 昆明大鼠灌胃免疫試驗(4.0乂109細菌/只)無重組載體的雙歧桿菌對照組用不含LTB的pBEX轉(zhuǎn)化的雙歧桿菌灌胃，在第Od， 7d， 14d和第21d灌胃共4次；PBS對照組用PBS分別灌胃，在第Od， 7d， 14d和第21d灌胃共4次；疫苗免疫組用上述雙歧桿菌-ETEC LTB重組載體口服活疫苗(膠囊)灌胃，在第Od， 7d， 14d和第21d灌胃共4次；第21d后用E44815大腸桿菌(4.0X10H細菌/只)對疫苗免疫組、PBS對照組和無重組 載體的雙歧桿菌對照組的大鼠進行灌胃攻毒試驗，24h后解剖觀察。3) 試驗結(jié)果無重組載體的雙歧桿菌對照組和PBS對照組的大鼠100%出現(xiàn)了很嚴重的小腸漲氣，且腸 液分泌較多(由于種屬差異，不產(chǎn)生腹瀉癥狀)，而疫苗免疫組有明顯的保護作用，小腸漲 氣均很輕微，100%沒有明顯的腸液分泌(對比結(jié)果見附圖9)，證明本發(fā)明雙歧桿菌-ETEC LTB重組菌口服活疫苗對大腸桿菌產(chǎn)生的LT腸毒素產(chǎn)生了較好的免疫保護作用。由上述實施例可見，本發(fā)明穿梭表達載體穩(wěn)定性高，在雙歧桿菌中很容易使外源基因高 效地表達，免去了調(diào)控因子的毒性(如IPTG)和增加的生產(chǎn)成本，具有良好的生物安全性， 在基因治療和口服疫苗研制中有很好的應(yīng)用前景，為相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的選擇。參考文獻[l]Sgorbati B， Scardovi V， Leblanc DJ. 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1ccgcggtaaaacgacggccattcgcaatagtgcaaacgct60atgaacccccgtta肌gggaagccggatcc120ccgaattcccgggtcgactcgagcggccgcatcgtgactgactgacgatctgcctcgcgc180gtttcggtgatgacggtg肌aacctctgacacatgcagctcccgg卿cggtcacagctt240gtctgtaagcggatgccggg3gC3g3C肌gcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcg300ggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtat肌ttcttg肌360gacga肌gggcctcgtgatacgcctatttttgtcatgataataatggttt420cttagacgtcgtacttagtac肌肌ggggagcgaacttagtac肌肌ggggagcgaacttg卿gcg肌cagg卿gcga540ttgtactagtatggagtcatgtccaatgagatcgtgaagttcagc肌ccagttc肌c肌c600gtcgcgctgaagaagttcgacgccgtgcacctggacgtgctcatggcgatcgcttcaagg660gtgaggg卿agggcacggccacggtggagttctcgttcgaggagctgcgcggcctcatg720cgattgaggaag肌cctgacc肌c肌gcagctggccgacaagatcgtgcagacg肌cgcg780cgcctgctggcgctgaactacatgttcgaggattcgggcagttcgcgctg840ttcacgaagttcgtcaccgacccgcaggaggcgactctcgcggttggggtc肌cgaggagttcgcgttcctgctcaacgacctgaccagccagttcacgcgcttcgagctggccgagttc960gccgacctcacgcc肌ggagttctacaggcgcgccaagcagtaccgcagc1020tcgggaatctgga卿tcagccgcgatgagttctgccgactgcttggcgtatccgattcc1080CC3CCgCC肌cctgaacagggtcgtgctgaagacgatcgccga卿gtgt1140gggcctctccttggcctgaagatcgagcgccagtacgtgaaacgcaggctgtcgggcttc1200gtgttcacgttcgcccgcgagacccctccggtgatcgacgccaggcccgt卿ggcgagg1260a卿cggacggcgacggc肌gggccattggacgagcgtggcggggtacggcgaggtgttc1320acgaccacggagctgttcgacgtgacggccgcgcgtgaccacttcgacggc獄gtggag1380gccgggg肌tgccgtttcctgcgcgtttgacgcgcgcaaccgcgaacatcatgacgtcag1440gtggcacttttcgggga肌tgtgcgcgg肌cccctatttgtttatttttc1500tccgctcatggcttc肌t肌1560gga卿gtatgagtattc肌catttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcatttt1620gccttcctgtttttgctcacCC3g肌3CgCtggtga肌gtgaagatcagt1680tgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctc肌cagcggtaagatccttgagagtt1740ttcgccccgaagaacgttttgcacttttaaagttctgctatgtggcgcgg1800tattatcccgtgttgacgccgggca卿gcaactcggtcgccgcatacactattctcaga1860atgacttggttgagtactcaccagtcacagtacggatggc1920gagaattatgcagtgctgcctgcggccaacttacttctga1980caacgatcggagg獄,ggagctaaccgcttttttgcac肌catgggggatcatgt肌2040ctcgccttgatcgttggg肌ccggagctga3CC肌3Cg3Cgagcgtgaca2100ccacgatgcctgcagcaatggc肌c肌cgttgcgcaaactattaactggcg肌ctactta2160ctctagcttcccggc肌c肌ggatggaggcggataaagttgcaggaccac2220ttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgagccggtgagc2280gtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggcc卿tggtaagccctcccgtatcgtag2340ttatctacacgacggggagtcaggc肌ctatggatg肌cgatcgctgaga2400taggtgcctccattggtaactgtcagaccaagtttactca2460aaaactt 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1. 一種雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體，其特征在于以pGEX-5x-1質(zhì)粒為骨架，含有雙歧桿菌的α-淀粉酶基因的啟動子AmyO，還含有長雙歧桿菌KJ36質(zhì)粒的復(fù)制蛋白B的序列。
1.根據(jù)權(quán)利要求9所述的含有雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體的宿 主細胞，其特征在于所述的宿主細胞為雙歧桿菌或大腸桿菌。
2.權(quán)利要求9或10所述的宿主細胞在制備口服疫苗或口服疫苗的粘 膜免疫佐劑中的用途。
3.一種口服疫苗或口服疫苗的粘膜免疫佐劑，其特征在于是由權(quán) 利要求9或10所述的宿主細胞添加藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的。
全文摘要
本發(fā)明涉及雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體及其制備方法和用途，屬于基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題為提供新的高效，安全，能穩(wěn)定表達的雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體。本發(fā)明雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體，以pGEX-5x-1質(zhì)粒為骨架，將pGEX-5x-1上的啟動子Ptac替換為雙歧桿菌的α-淀粉酶基因的啟動子AmyO，還含有長雙歧桿菌KJ36質(zhì)粒的復(fù)制蛋白B序列。本發(fā)明雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體能廣泛適用于以雙歧桿菌為受體菌的所有外源基因的表達及其基因工程產(chǎn)品的生產(chǎn)，為本領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用提供了一種新的載體工具，具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/70GK101220370SQ200810300178
公開日2008年7月16日 申請日期2008年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月22日
發(fā)明者馬永平 申請人:重慶醫(yī)科大學(xué)