專利名稱：人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白hel-128及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供一種新的人附睪特異表達(dá)精子結(jié)合
蛋白HEL-128，屬于RNases A家族的新成員。公開(kāi)了編碼HEL-128蛋白的氨基酸序列和編
碼本蛋白的DNA序列。本發(fā)明還公開(kāi)了該蛋白的制備和檢測(cè)方法，以及生物學(xué)功能。該蛋
白對(duì)精子成熟、正常受精及早期胚胎發(fā)育發(fā)揮重要作用。HEL-128蛋白可作為免疫性避孕藥
的研發(fā)，以及男性不育癥的臨床診斷與治療的靶蛋白。該蛋白的研發(fā)，對(duì)男性生殖醫(yī)學(xué)研究
意義重大。 發(fā)明背景 近50年來(lái)，精子數(shù)量和質(zhì)量都有下降趨勢(shì)，45歲以下的男性原發(fā)性不育者占 5% -10% ;另外，預(yù)計(jì)2020年全球?qū)⒂?0億人口進(jìn)入生育高峰期，人口膨脹壓力隨之加大， 但對(duì)于男性而言，可供選擇的避孕方式還不能令人完全滿意，因此研究人類附睪基因功能， 將為解決精子成熟異常所引起的男性不孕癥的診斷和治療提供分子水平的信息，同時(shí)也為 開(kāi)發(fā)一些阻斷精子成熟的男性避孕藥物提供新的思路。在過(guò)去的幾十年里，人們雖然對(duì)動(dòng) 物附睪的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但由于物種的不同人附睪基因表達(dá)與動(dòng)物有較大的 差異，同時(shí)也受人組織標(biāo)本來(lái)源困難和科學(xué)界對(duì)男性生殖研究興趣的限制，人類附睪功能 基因的研究一直滯后于其他學(xué)科。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明對(duì)HEL-128進(jìn)行了系統(tǒng)的生物學(xué)研究，獲得了高純度具有活性的HEL-128 重組蛋白(rHEL-128)和相應(yīng)的單抗，采用RT-PCR和免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該蛋白在人體重 要組織和在不同年齡人的附睪組織表達(dá)譜，確定了該蛋白與精子結(jié)合的部位同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了 該蛋白與不同年齡人的精子結(jié)合的特征。在功能研究方面主要進(jìn)行了 RNase A活性試驗(yàn)、 抗體封閉后的精子運(yùn)動(dòng)和穿卵實(shí)驗(yàn)、抗菌活性試驗(yàn)。通過(guò)我們的研究獲得了 HEL-128較為 系統(tǒng)的生物學(xué)信息和科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，其結(jié)果將有助于人們進(jìn)一步對(duì)附睪HEL-128在正常 男性生理的功能的認(rèn)識(shí)，研究異常所引起疾病的診斷和治療。 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種新的人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-128。
—種人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-128,它具有序列表中序列2的氨基酸序列 或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序 列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)或多肽。 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-128的基因。它 是下列核苷酸序列之一 序列表中序列1的DNA序歹lj， GenBank注冊(cè)號(hào)為EU414264 ;
編碼序列表中SEQ ID No. 2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸； 與序列表中序列1限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì) 的DNA序列。 序列表中的SEQID No. l，全長(zhǎng)c DNA序列為618bp，定位于人14qll. 2號(hào)染色體上，編碼205個(gè)氨基酸，編碼蛋白為HEL-128,含有信號(hào)肽，其開(kāi)放閱讀框?yàn)?15bp，是一個(gè)完整的讀碼框。N末端26個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，裂解位點(diǎn)位于26，27氨基酸之間并產(chǎn)生含179個(gè)氨基酸的成熟肽，為20kD的分泌蛋白。具有RNaseA超家族的特性，但缺乏RNases具有催化活性所必需的位點(diǎn)及標(biāo)簽基序CKXXNTF這兩個(gè)特征。 本發(fā)明的第三方面，提供了采用基因工程技術(shù)制備具有人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-128活性多肽的方法，它包括含有上述多核苷酸序列的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。 本發(fā)明的第四方面，提供了與上述人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-128特異性結(jié)
合的抗體，以及由此開(kāi)發(fā)的用于附睪功能異常所致的不育癥的輔助診斷。 本發(fā)明的第五方面，提供了檢測(cè)樣本中是否存在人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白
HEL-128的方法，它包括將待測(cè)樣品與分泌蛋白的特異性抗體在一定條件下共同作用，觀
察是否形成抗原抗體復(fù)合物，有抗原抗體復(fù)合物形成就提示樣品中存在分泌蛋白。 本發(fā)明的第六方面，提供了本發(fā)明蛋白和其編碼序列的用途。例如本發(fā)明蛋白可
作為一種抗菌藥物或作為診斷不育癥的分子靶點(diǎn)，或作為有效藥物成分用于治療不育癥，
或作為開(kāi)發(fā)新型避孕藥物的靶分子。根據(jù)人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-128的編碼序列
或其片段，可設(shè)計(jì)引物或探針用于PCR或核酸雜交，或者用于制備基因芯片。 本發(fā)明的第七方面，提供了一種藥物組合物，所述組合物包含本發(fā)明所述的蛋白、
核苷酸序列、構(gòu)建物或細(xì)胞，以及藥學(xué)上可接受的載體。 本發(fā)明的蛋白能夠在附睪內(nèi)特異性表達(dá)，而且所述蛋白表現(xiàn)抗菌活性，定位于精子赤道后區(qū)，因此可能與生殖有關(guān)。因?yàn)樗且环N天然的抗菌肽，可以預(yù)見(jiàn)可能具有較少的副作用，本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)可從以下的詳細(xì)描述獲知。


圖.1 HEL-128蛋白在人精子上的免疫熒光定位 紅色熒光顯示精子核；綠色熒光顯示HEL-128蛋白在精子上的定位；A組HEL-128蛋白定位，C3.顯示HEL-128蛋白結(jié)合在精子赤道后區(qū)。 B組陽(yáng)性對(duì)照，A3顯示HEL-75蛋白結(jié)合于整個(gè)精子(文章已發(fā)表) C組陰性對(duì)照。 比例尺5mm。 圖2 HEL-128基因組織表達(dá)圖譜 l附睪頭2附睪體3附睪尾4睪丸5心6肝7脾8腎9胃10陰性對(duì)照 圖3. HEL-128蛋白在附睪液表達(dá)的western blot結(jié)果 M -Marker ;1 :陽(yáng)性對(duì)照，HEL-75蛋白；2 :陰性對(duì)照，小鼠血清;3 :HEL_128蛋白
本發(fā)明的蛋白包括了所述蛋白多肽的具有相同或相似性生物活性或功能的變異形式，這些變異形式包括(但并不限于)相對(duì)于天然蛋白的氨基酸序列有若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳的1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和取代。另外，所述缺失或插入(增加)也可發(fā)生在C末端和/或N末端(通常有20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi)的氨基酸缺失或增加)，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的
4氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變氨基酸的功能，提供功能相似氨基酸的保守性置換表是 本領(lǐng)域所熟知的。下列5組各自含有能相互保守置換的氨基酸；脂族甘氨酸(G)、丙氨酸 (A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I);芳族苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);
含硫甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C);堿性精氨酸(R)、賴氨酸(K)、組氨酸(H);酸性天冬
氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)。另外，該術(shù)語(yǔ)還包括了蛋白的片段或衍生物，條件是該片段或衍生
物保留了所希望的蛋白生物活性。 本發(fā)明的核苷酸序列通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì) 于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引 物，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA文庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。 這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得 到有關(guān)序列。 本發(fā)明中，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法將包含編碼本發(fā)明的蛋白的核苷
酸序列插入到載體中，這些方法包括但不限于體外重組DNA技術(shù)，體內(nèi)重組技術(shù)等。 上述載體可用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)脑撕驼婧思?xì)胞，以使其能夠表達(dá)所編碼的本
發(fā)明的蛋白，宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞，或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是
高等真核細(xì)胞，如昆蟲(chóng)細(xì)胞等?？刹捎玫霓D(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染方法包括但并不限于磷酸鈣共沉淀法、
顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)等。 本發(fā)明的蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其他特性通過(guò) 各種方法分離和純化表達(dá)產(chǎn)物，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包 括但不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用常規(guī)的蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、聲 波破菌、超離心、分子篩層析、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析和其它各種層析技術(shù) 及這些方法的結(jié)合。 本發(fā)明還包括對(duì)蛋白或其片段具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，還包括具 有免疫活性的抗體片段或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來(lái)自人的抗體部分 的抗體。 本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化 的基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生，本發(fā)明 的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備。
發(fā)明人通過(guò)研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，該蛋白定位于成熟精子的赤道后區(qū)(圖l)，在附 睪、心、肝、脾、肺、腎、胃、睪丸等多種組織均有表達(dá)(圖2)，發(fā)明人在大腸桿菌中表達(dá)了人 HEL-128蛋白，用其免疫小鼠，獲得了其多抗血清。發(fā)明人用Western blot在附睪體部檢測(cè) 到一條23KD左右條帶(圖3)。另外，該蛋白還表現(xiàn)出具有很好的抗菌活性，切可能具有獨(dú) 特的抗菌機(jī)制。 本發(fā)明的藥物組合可根據(jù)各種需要制成各種劑型，通?？蓪⑺幬锝M合物制成可注 射劑，例如液體溶液或懸浮液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液中、溶液載體的固體 形式，脂質(zhì)體也包括在藥學(xué)上可接受的載體的定義中，本發(fā)明的藥物組合物可由醫(yī)師根據(jù) 患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對(duì)病人有益的劑量進(jìn)行施用， 為了提高用藥效果，本發(fā)明的蛋白也可以與其他藥物共同使用。 下面結(jié)合具體實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，除非另有描述，本發(fā)明的實(shí)施將采用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。這些技術(shù)在下面文獻(xiàn)中有完整的描述例如Sambrook《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版(1989);《DNA克隆》第I和第II巻(D. N. Glover編輯，1985);《寡核苷酸合成》(M. J. Gait編輯，1984);《核酸雜交》(B. D. H謙s和S。 J。 Higgins編輯。1984);《蛋白質(zhì)純化；原理和實(shí)踐》第2版(Spring-Verlag，N. Y.)，以及《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)》I-IV巻(D. C. Weir和C. C. Blackwell編輯1986)或者，可以按照試
劑生產(chǎn)商所提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 實(shí)施例1基因克隆及序列分析 對(duì)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的人附睪cDNA文庫(kù)進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序篩選，獲取表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)，利用Unigene數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行電子克隆，獲得人HEL-128全長(zhǎng)cDNA。使用 Expasy Translate tool (http ://us. expasy.orghttp://us. expasy.org)，InterProScan (http://www. ebi. ac. uk/Tools/http://www. ebi. ac. uk/Tools/) 禾口Protein代roteinblast(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/http://www. ncbi. nlm.nih. gov/BLAST/)等預(yù)測(cè)HEL-128肽序列及假定功能。SignalP(http:〃www. cbs. dtu.dkhttp:〃www. cbs. dtu. dk) ，PSORTII和WoLFPSORT (http: 〃psort. nibb. ac. jp)等軟件分析預(yù)測(cè)該蛋白的信號(hào)肽及胞內(nèi)定位。ProfileScan(http:〃myhits. isb-sib. ch/cgi-bin/PFSCANhttp:〃myhits. isb-sib. ch/cgi-bin/PFSCAN)預(yù)測(cè)N端糖基化和磷酸化位點(diǎn)。
對(duì)獲得的人HEL-128全長(zhǎng)cDNA，根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)HEL-128編碼區(qū)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物F :5' -TTGGTACCGACGACGACGACAAGATGAGAACTCTCATCACCACA-3'，下游R :5' -GCGGCGAATTCGGGCGGTATGACAAAG- 3'上下游引物兩端分別引進(jìn)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Kpnl和EcoRI。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的人附睪cDNA文庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增HEL-128基因片段。PCR反應(yīng)條件94。C預(yù)變性10min， (94°C，40s ;55。C，45s ;70。C ， 30s) 30個(gè)循環(huán)，70。C延伸10min，4。C保存。反應(yīng)結(jié)束后，1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并分離回收目的片段，插入克隆載體pMD-18T中進(jìn)行測(cè)序鑒定。
實(shí)施例2 RT-PCR實(shí)驗(yàn) 組織分離后立即液氮冷凍。所有組織總RNA的提取采用Trizol —步法，并按照廠家的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，采用RT-PCR法進(jìn)行擴(kuò)增人HEL-128 cDNA片段，采用的上游引物F:5，-ctg gtg cag ttt caa gag gtg-3，，下游弓l物R :5，-tec ccc ggg cta ggg cga tatgacaaa gac-3'，退火及延伸溫度95°C 30s，56。C 40s and 72°C lmin，以內(nèi)源性P actin作為內(nèi)參同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，P-actin引物序列上游5'-CCATGCCAATCTCATCTT-3'，下游引物5' -CGTGACATTAAGGAGAAG-3'。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HEL-128在心、肺、肝、脾、腎、胃、睪丸等多種組織均有表達(dá)。但在附睪表達(dá)量較高。 實(shí)施例3. HEL-128多抗血清制備及Western blot實(shí)驗(yàn) 用重組HEL-128蛋白免疫BALB/C小鼠制備多抗。簡(jiǎn)單地說(shuō)，每只老鼠于第1天注射50iig重組蛋白與等量的完全福氏佐劑(CFA)。然后在第15，30和45天注射25iig重組蛋白和等量的不完全福氏佐劑(IFA)加強(qiáng)免疫。第60天從眼球取血，分離血清后用ELASA和western blot分析抗體的效價(jià)和特異性。ELISA分析表明抗體效價(jià)達(dá)到1 : 10000。
實(shí)施例4.組織免疫熒光實(shí)驗(yàn) 取-7(TC保存附睪組織、睪丸及其他組織OCT組織塊包埋，恒冷箱切片8mm，貼片于1%明膠包被的載玻片上，切片自然干燥后，浸入4%多聚甲醛中20min，再于含0.5X Triton X-100PBS中通透30min。 PBS洗3次，每次5min ;滴加3% BSA，室溫封閉lh后，PBS 洗3次，每次5min ;滴加(1 : 400稀釋)鼠抗HEL-128多抗血清，4。C冰箱過(guò)夜，PBS洗3 次，每次5min ;滴加FITC羊抗鼠IgG(l : 200稀釋)，室溫避光孵育lh， PBS洗3次，每次 5min，蒸餾水洗3次，每次5min ;PI復(fù)染，37°C ， 10min，蒸餾水洗2次，每次10min。緩沖甘 油封片，置激光共聚焦顯微鏡下觀察并照相。陰性對(duì)照用3% BSA取代一抗進(jìn)行孵育即可。
實(shí)施例5.人精子免疫熒光實(shí)驗(yàn) 取正常男性精液，液化后，每lml精液中加入lml PBS，37°C、45°角傾斜放置至少 lh，使活力好的精子上浮。吸取上層液體于另一離心管中，1500r/min離心15min。去上清， 再向沉淀中加入3-5mlPBS，1000r/min離心10min，重復(fù)兩次。洗滌后，加入PBS，調(diào)整精子 密度約為1.0Xl(f個(gè)/ml。將處理好的精液涂片室溫自然干燥，甲醇固定10min，干燥后即 用。免疫熒光步驟同上。結(jié)果表明，人HEL-128定位于精子赤道后區(qū)，可能與精卵融合有關(guān)。
實(shí)施例6.抗菌實(shí)驗(yàn) 按照文獻(xiàn)的方法，我們分析了在大腸桿菌中誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)是否抑制宿主菌 的生長(zhǎng)。簡(jiǎn)單的說(shuō)，含重組載體或者空載體的細(xì)菌過(guò)夜培養(yǎng)后，用LB培養(yǎng)基按照1 : 40接 種，此時(shí)取樣測(cè)0D600，以后每隔lh取樣一次。當(dāng)達(dá)到生長(zhǎng)指數(shù)期時(shí)，將細(xì)菌平均分成2份。 其中一份加入IPTG至終濃度為0. lmM，另一份不加作為對(duì)照，以后每隔lh測(cè)0D600，每次 平行重復(fù)測(cè)量三次。作為陰性對(duì)照組，空白宿主菌BL21用于檢測(cè)IPTG的毒性。結(jié)果表明 HEL-128具有抗菌活性。
實(shí)施例7.核糖核酸酶活性實(shí)驗(yàn) 重組人HEL-128蛋白經(jīng)過(guò)親和層析純化后得到濃度為800ug/ml，用標(biāo)準(zhǔn)酵母tRNA 底物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其核糖核酸酶活性，檢測(cè)方法如下取40mM，pH7. 4磷酸鹽緩沖液在25。C溶解 酵母tRNA，終濃度1. 42nmo1。用0. 5ml 20mm硝酸鑭終止反應(yīng)，12000rpm離心去掉不溶性 tRNA，可溶性tRNA通過(guò)紫外分光測(cè)定其吸光度值(0D260)。核糖核酸酶催化活性定義為每 pmol核糖核酸酶每秒鐘消化的RNA的pmol數(shù)。陰性對(duì)照催化活性小于RNase 7的3% 。圖 示三次試驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HEL-128雖然屬于Rnase家族成員，但不具有核 糖核酸酶的活性。 實(shí)施例8抗體封閉精子運(yùn)動(dòng)、穿卵實(shí)驗(yàn) 1、人精子準(zhǔn)備準(zhǔn)備2個(gè)15ml離心管，每管加入2ml已于37。C、5 % C02飽和濕 度條件下平衡12h的SpermRinse-30，將液化好的精液加入試管底部，然后于37t:、5X (A飽和濕度條件下孵育lh使精子上游并獲能。收集精子懸液，離心，棄上清。然后用 SpermRinse-30洗滌2次，棄上清，再加入5. OmlG-Fert，懸浮15min，以除去SpermRinse-30 中的慶大霉素，重復(fù)洗滌2次。棄上清，用G-Fert調(diào)整精子濃度為1.0 ()7個(gè)/ml。
2抗體封閉精子運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn) 取兩個(gè)1.5ml離心管，分別加入上述處理過(guò)的精液，然后向試驗(yàn)管中按l : 5稀 釋比例加入鼠抗HEL-128多抗血清，向?qū)φ展苤屑尤肱c多抗血清等量的G-Fert，混勻，置于 37°〇、6%0)2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h。然后將孵育后的試驗(yàn)組與對(duì)照組的精液利用計(jì)算 機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)檢測(cè)精子各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)指標(biāo)(平均曲線運(yùn)動(dòng)速度VCL、平均直線運(yùn)動(dòng)速度 VSL、平均路徑速度VAP)。取3份人精液標(biāo)本，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分析RNases 9蛋白對(duì)精子運(yùn)動(dòng)的影響。 2、抗體封閉精子穿卵實(shí)驗(yàn) 參照Yanagimachi等人的方法，采用上浮法獲取精子并用BWW液孵育3 5h。將 精子濃度調(diào)整到3. 53X107ml，8 12周齡金黃地鼠肌注孕激素，人絨毛膜促性腺激素。處 死金黃地鼠，去掉輸卵管，用O. 1Xhyaluronidase和0. 1% trypsin沖洗卵丘。加0. lml人 精子，石蠟油覆蓋，5% (A，37t:孵育18h。延長(zhǎng)孵育時(shí)間可以使精子獲能和頂體反應(yīng)達(dá)到最 佳水平，將卵放在玻片上，用4%甲醛在4°C固定24 48h并用蓋玻片固定。接著用0. 25% 間苯二酚藍(lán)染色。在相差顯微鏡下放大3400倍進(jìn)行觀察。胞漿內(nèi)腫脹精子頭部的百分?jǐn)?shù) 計(jì)算精子的穿卵率，穿卵指數(shù)=受精的卵細(xì)胞數(shù)/卵細(xì)胞總數(shù)。序列表〈110〉李建遠(yuǎn)〈120〉人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-128及其編碼基因與應(yīng)用〈170>PatentIn version 3. 5〈210>1〈211>618〈212>DNA〈213〉人屬人種(Homosapiens)〈220〉〈221>CDS〈222〉 (1) . (618)〈400>1atg atg 3gaactetcate3CCC3CCC3ctgcccctgctt eta ttg48Met Met ArgThrLeulieThrThrHisProLeuProLeuLeu Leu Leu151015ccg cag cagctgctgCElgctggtgCElgtttgaggtgg3t gat96Pro Gin GinLeuLeuGinLeuValGinPheGinGluValAsp Thr Asp202530ttt gat ttcCC3g朋g朋gataaag朋tttgag tgt ttg144Phe Asp PheProGluGluAspLysLysGluGluPheGluGlu Cys Leu354045g朋3朋ttttttElgtgggcccgec3gaCC3cct3CCaaa gaa aaa192Glu Lys PhePheSerThrGlyProAlaArgProProThrLys Glu Lys505560gtC 333 3g3cgtgtccttattg朋cctatgCC3etaaat cat ata240Val Lys ArgArgValLeulieGluProGlyMetProLeuAsn His lie65707580gag tac tgt朋ccatg朋ateEltgaaagtttectac aaa cac288Glu Tyr CysAsnHisGlulieMetGlyLysAsnValTyrTyr Lys His859095cgttgggtggCElg朋cattacttc
0090]ArgTrpValAlaGluHisTyrPhe
0091]100
0092]c朋atetgttac朋c3gattt
0093]GinLyslieCysTyrAsnArgPhe
0094]115120
0095]tgt朋c￡iggageggtctt
0096]LysCysAsnArgSerLysGlyLeu
0097]130135
0098]g朋gCEltctg朋ateCC3gcg
0099]ThrGluAlaSerGlulieProAla
0100]145150
0101]朋gggctacgtccttateacttgt
0102]LysGlyTyrValLeulieThrCys
0103]165
0104]cgtattcctcatactate朋tgat
0105]ArglieProHisThrlieAsnAsp
0106]180
0107]ElgtttcetcElgtgaggatggtgtc
0108]SerPheLeuSerGluAspGlyVal
0109]195200
0110]〈210>2
0111 ]〈211>205
0112]〈212>PRT
0113]〈213〉人屬人種(Homosapiens)0114]〈400>2
0115]MetMetArgThrLeulieThrThr
0116]15
0117]ProGinGinLeuLeuGinLeuVal
0118]20
0119]PheAspPheProGluGluAspLys
0120]3540
0121]GluLysPhePheSerThrGlyPro
0122]5055
0123]ValLysArgArgValLeulieGlu
0124]6570
0125]GluTyrCysAsnHisGlulieMet
0126]85
0127]ArgTrpValAlaGluHisTyrPhe
7/8頁(yè)
ctt ctt atg caa tat gac gag etc 336 Leu Leu Met Gin Tyr Asp Glu Leu 105 110 gtg era tgt皿t gga att agg 384 Val Pro Cys Lys Asn Gly lie Arg 125
gte g皿gga gtg tet tgttte 432 Val Glu Gly Val Tyr Cys Asn Leu 140
tgt aaa tac gaa tea ctt tat agg 480 Cys Lys Tyr Glu Ser Leu Tyr Arg 155 160 tea tgg atg 528
Ser Trp Gin Asn Glu Met Gin Lys
170 175 etc gtg gag cca cct gaa cac aga 576 Leu Val Glu Pro Pro Glu His Arg 185 190 ttt gtc ata ccg ccc tag 618 Phe Val lie Pro Pro 205
His Pro Leu Pro Leu Leu Leu Leu
10 15 Gin Phe Gin Glu Val Asp Thr Asp 25 30 Lys Glu Glu Phe Glu Glu Cys Leu 45
Ala Arg Pro Pro Thr Lys Glu Lys 60
Pro Gly Met Pro Leu Asn His lie
75 80 Gly Lys Asn Val Tyr Tyr Lys His
90 95 Leu Leu Met Gin Tyr Asp Glu Leu
9:0128]100105110
:0129]GinLyslieCysTyrAsnArgPheValProCysLysAsnGlylieArg
:0130]115120125
:0131]LysCysAsnArgSerLysGlyLeuValGluGlyValTyrCysAsnLeu
:0132]130135140
0133]ThrGluAlaSerGlulieProAlaCysLysTyrGluSerLeuTyrArg
0134]145150155160
0135]LysGlyTyrValLeulieThrCysSerTrpGinAsnGluMetGinLys
0136]165170175
0137]ArglieProHisThrlieAsnAspLeuValGluProProGluHisArg
0138]180185190
0139]SerPheLeuSerGluAspGlyValPheVallieProPro
0140]19520020權(quán)利要求
一種人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-128，其特征在于，它具有序列表中序列2的氨基酸序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的序列2衍生的蛋白質(zhì)和通過(guò)化學(xué)方法合成的蛋白質(zhì)。
2. —種人類附睪表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-128的編碼基因，它是下列核苷酸序列之一 序列表中序列1的核苷酸序列；與序列表中序列1限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼相同功能蛋白的DNA 序列。
3. 含有權(quán)利要求2所述基因的真核和原核表達(dá)載體。
4. 含有權(quán)利要求2所述基因的細(xì)胞系。
5. 針對(duì)權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)所制備的各種抗體以及以該抗體為活性成分的試劑。
6. 針對(duì)權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)提供的藥物組合物，所述組合物包含本發(fā)明所述的蛋 白、核苷酸序列、構(gòu)建物或細(xì)胞，以及藥學(xué)上可接受的載體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白在不育癥診斷中的應(yīng)用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白在不育癥治療中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因在開(kāi)發(fā)新的避孕藥物中的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白在制備新的抗生素中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明公開(kāi)了一種新的人附睪特異表達(dá)精子結(jié)合蛋白HEL-128及其制備和應(yīng)用。公開(kāi)了本發(fā)明編碼HEL-128蛋白的氨基酸序列，提供攜帶編碼本發(fā)明蛋白的DNA序列的重組表達(dá)載體。該蛋白定位于成熟精子的赤道后區(qū)，在附睪、心、肝、脾、肺、腎、胃、睪丸等多種組織均有表達(dá)，在附睪檢測(cè)到一條23KD左右條帶。另外，該蛋白還表現(xiàn)出具有很好的抗菌活性，切可能具有獨(dú)特的抗菌機(jī)制。HEL-128蛋白可作為免疫性避孕藥的研發(fā)，以及男性不育癥的臨床診斷與治療的靶蛋白?；贖EL-128蛋白開(kāi)發(fā)的相應(yīng)基因或蛋白檢測(cè)方法，將廣泛用于生殖醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N9/22GK101724612SQ20081030516
公開(kāi)日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2008年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日
發(fā)明者李建遠(yuǎn) 申請(qǐng)人:李建遠(yuǎn)