專利名稱：一種含有淡水魚類微囊藻毒素去毒酶基因的檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種檢測試劑盒。
背景技術：
l.淡水養(yǎng)殖中毒物的來源
淡水水體富營養(yǎng)化導致有害藍藻水華頻頻發(fā)生，并可能產(chǎn)生嚴重
危害國民身體健康的藍藻毒素。其中銅綠微囊藻M/crac^^ "emg!'"o犯水華是世界各國淡水湖泊、池塘中分布廣、持續(xù)時間長的 一種可能產(chǎn)毒的藻類水華，其產(chǎn)生的毒素稱為微囊藻毒素
(microcystin，MC)。微囊藻毒素的主體結(jié)構為環(huán)七肽，共有60多種 異構體，毒性較大的是LR、 YR、 RR型，L、 Y、 R分別代表亮氨酸、 酪氨酸、精氨酸。這些毒素具有相似的生物學功能，會造成肝細胞的 損傷，嚴重者還會引起肝內(nèi)出血，致使動物死亡，其中微囊藻毒素-LR 是一種環(huán)狀七肽肝毒素，最常見且毒性高。由于微囊藻毒素通過簡單 擴散的跨膜滲透能力很低，必須通過中間載體即肝細胞膜上的膽汁酸 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)轉(zhuǎn)運至肝實質(zhì)細胞，所以肝臟成為藻毒素的致毒靶器官。該 毒素在肝臟特異聚積，并抑制蛋白磷酸酶l (PP1)和蛋白磷酸酶2A
(PP2A)的活性，導致細胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)的過磷酸化，打破細胞內(nèi) 蛋白磷酸化/脫磷酸化的平衡，并通過細胞信號系統(tǒng)進一步放大這種 生化效應，造成細胞內(nèi)一系列生理生化反應的紊亂，最終導致肝細胞
損傷，甚至發(fā)生急性死亡事件。微囊藻毒素的促腫瘤作用也是通過這 種方式實現(xiàn)的。長期飲用或食用含微囊藻毒素的水或水產(chǎn)品可能引發(fā) 肝癌，特別是在存在肝炎病毒與黃曲霉毒素的情況下，這種引發(fā)肝癌 的可能性更高。因此，解決水體微囊藻毒素的污染對我國國民身體健 康尤為重要。
微囊藻毒素主要通過以下幾個途徑在水生生物休內(nèi)積聚(1 )
生物體通過體表接觸藻毒素，如水生植物及魚卵；(2)生物體直接
飲用藻毒素污染的水或以藍藻水華為食料，這種途徑也被稱為生物濃
縮(bioconcentration)，如浮游動物、貝類及某些藻食性魚類；(3) 生物體位于食物鏈的上游，以浮游動物、貝類及某些藻食性魚類等一 級消費者為食，這些水生生物通過食物鏈積累藻毒素，這種途徑也被 稱為生物放大(biomagnification)，如某些肉食性魚類等。當水生生 物從環(huán)境中通過各種途徑吸收毒素時，毒素在生物體體內(nèi)的積累就隨 之而發(fā)生。研究表明，不同水生生物對微囊藻毒素的聚集能力及凈化 所需時間不同。水生植物是水生生態(tài)系統(tǒng)中的初級生產(chǎn)者，直接與環(huán) 境中的微囊藻毒素接觸，不同水生植物對藻毒素的聚集能力有所差 異，與其表面積以及對毒素的吸收能力有關。另外，毒素吸收后在水 生植物體內(nèi)清除所需的時間也不盡相同。有些藻類，例如細長聚球藻 具有較強凈化毒素的能力，毒素處理一天后，培養(yǎng)基中的藻毒素含量 只有初始濃度的21.7%;處理6天后，培養(yǎng)基中的毒素僅剩8.18%。但 總體上，與水生動物相比，水生植物對毒素的聚集較少，凈化也較慢。
貝類及螯蝦等有殼類無脊椎動物對藻毒素的清除較魚類等脊椎
動物緩慢，有富集毒素的作用。與貝類相比，魚類對微囊藻毒素的積 聚量較低且清除速度較快。實驗條件下用微囊藻填喂虹鱒 (Owcor/^Mc/H^w^bh)， 一小時后毒素在其肝臟內(nèi)迅速聚集，并且 在隨后的24小時內(nèi)大部分被排出體外。由于淡水魚類具備快速吸收
并清除微囊藻毒素的能力，說明其體內(nèi)存在發(fā)達的微囊藻毒素去毒系
統(tǒng)，目前觀點認為淡水魚類肝臟sGST，即淡水魚類微囊藻毒素去毒 酶在此去毒過程中起關鍵作用，但有關淡水魚類微囊藻毒素去毒酶基 因的研究至今鮮見報道。
另外，由于相關農(nóng)藥的使用，使農(nóng)藥等毒物在淡水養(yǎng)殖魚體內(nèi)積 聚。長期食用含有這些藥物的水產(chǎn)品可致畸、致癌，對人類健康造成 嚴重威脅。各類毒素對人類健康所造成的威脅已引起IM:界各國公共衛(wèi) 生系統(tǒng)的廣泛關注，長期食用含毒素的水產(chǎn)品可引發(fā)肝癌等多種疾 病。研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚、鰱、鳙等池塘主養(yǎng)淡水魚對微囊藻等藍藻均 有很強攝食作用，加上不同的污染源，所以應盡快對羅非魚等淡水水 產(chǎn)品中毒物含量進行安全檢測。
2.去毒酶基因——谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因
谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST， EC2.5.1.18)
普遍存在于各種生物體內(nèi)，是一組由多個基因編碼的、代謝多種內(nèi)源
或外源毒性物質(zhì)之解毒酶系統(tǒng)的重要組成部分，屬于n相代謝酶系。
該酶有胞液和膜結(jié)合兩種形式，以胞液GST (sGST)為主。脊椎動 物各組織中均含有不同種類的sGST，其含量和活性亦各不相同，其
中以肝臟中含量最高。sGST以同或異二聚體形式存在，主要催化多 種化學物質(zhì)包括藥物、化療劑、致癌物以及氧化應激產(chǎn)生的各種毒性 代謝物等，與還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)的巰基(-SH)結(jié) 合，使這些親電子的疏水化合物變成親水性的物質(zhì)，易于從膽汁或尿 液中排泄。某些sGST還具有過氧化物酶和異構酶的活性，能清除脂 類自由基及抗脂質(zhì)過氧化的作用，從而減輕DNA的損傷程度。因此， sGST在機體有毒化合物的代謝、保護細胞免受急性毒性化學物質(zhì)攻 擊以及抑制細胞癌變屮起重要作用。
淡水魚類sGST基因在天然狀態(tài)下主要用于微囊藻毒素等天然毒 物的去毒，而在養(yǎng)殖污染狀態(tài)下，則主要用于農(nóng)藥等人造毒物的去毒。 sGST基因控制所有毒物在前期(第l時相)之氧化、水解去毒過程后 (第2時相)所共有的加合排毒過程，也因此被稱為第2時相去毒酶。 由于在微囊藻毒素去毒代謝過程中，第2時相的加合排毒過程具有獨 一無二的關鍵作用，因此淡水魚類sGST基因又被稱為微囊藻毒素去 毒酶基因。
根據(jù)基因結(jié)構、氨基酸序列、底物特異性、化學親和力及動力學 行為等不同標準，哺乳動物sGST可分為8類a(alpha)、 |i(mu)、兀(pi)、 cj(sigma)、 0(theta)、 oo(omega)、 K(kappa)禾卩;(zeta)。在同一類中，不 同sGST的氨基酸序列同源性至少達到40%，而不同類的sGST之間， 氨基酸序列同源性不到30%。各類sGST按序列相似性和免疫交叉反 應分為不同的亞類，不同亞類的表達水平具有組織特異性。sGST對 GSH的結(jié)合有很高的特異性，但對第二個親電子底物的特異性在不
同類之間及同一類中差別顯著。a、卜兀和e類sGST基因在其大小、
內(nèi)含子/外顯子結(jié)構上明顯不同，研究表明e類同工酶谷胱甘'肽結(jié)合 中心的氨基酸不同于a、 p、兀禾ncj類。此外，e類酶的進化先于其他
酶類。同類基因有成簇的趨向，如人類sGST基因存在型特異性簇。 到目前為止，4種sGST基因，即GSTM1、 GSTM3、 GSTP1禾卩GSTT1
已證實具有多態(tài)性?；虻亩鄳B(tài)性可引起sGST酶活性的改變，并導 致個體間對潛在致癌物代謝能力的差異。
3.水產(chǎn)品中毒物殘留檢測分析方法
殘留檢測分析方法首先是將有害物質(zhì)從水產(chǎn)品中提取、分離出 來，然后利用儀器設備進行定性和定量分析。目前水產(chǎn)品中毒物殘留 檢測分析方法主要有液相色譜法和免疫法等。
高效液相色譜法(HPLC)是一種靈敏度較高、可靠性較強的一種 方法，此法重復性好、速度快，可使許多極難分離的待測物得以分析， 目前大多數(shù)水產(chǎn)品藥物殘留分析都采用HPLC法。但HPLC法檢出限 較高，為5 10嗎/kg，不能達到國際上對水產(chǎn)品殘留要求的最低限量， 如水產(chǎn)品中氯霉素的含量，歐盟要求小于0.1pg/kg。此外，因動物體 內(nèi)成分復雜， 一些雜質(zhì)干擾測定，應用HPLC法檢測時，對于樣品預 處理必須仔細謹慎，以提高測定準確性和靈敏度。
免疫分析技術免疫分析法是近幾年發(fā)展起來以抗原與抗體的特 異性、可逆性結(jié)合反應為基礎的新型分析技術。免疫反應具有很高的 選擇性和靈敏性，因此，免疫分析技術無論作為獸藥殘留分析的檢
手段還是樣本凈化方法都能使分析過程特別是前處理步驟大大簡化。 作為相對獨立的檢測方法，即基于競爭結(jié)合分析原理的免疫測定法，
包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)、固相免疫傳 感器等。目前使用最普遍的是酶聯(lián)免疫法(ELISA)，具有操作簡便、 靈敏度高、樣品容量大、儀器化程度和分析成本低的優(yōu)點，是目前最 理想的殘留篩選性分析方法之一。目前幾乎所有重要的水產(chǎn)品藥物殘 留都已建立或試圖建立EUSA檢測法，如氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素、 己烯雌酚等。酶聯(lián)免疫法的缺點在于影響因素較多，易出現(xiàn)假陽性結(jié) 果。
綜上所述，由于違禁漁藥種類繁多，每一種漁藥均要用專門方法 進行檢測，檢測所有漁藥費用十分昂貴，而淡水魚一般價格不高，故 一般只能進行部分漁藥的常規(guī)檢測。雖然國家每年也花費巨資使用化 學手段對部分漁藥進行常規(guī)檢測，但往往由于漏檢某種漁藥而產(chǎn)生嚴 重后果。2005年7月我國出口日本的鰻魚由于孔雀石綠不屬于常規(guī) 檢測項目而漏檢，導致鰻魚出口與內(nèi)銷停產(chǎn)，不僅對鰻魚產(chǎn)業(yè)造成毀 滅性打擊，而且波及整個淡水魚養(yǎng)殖業(yè)，以至于出現(xiàn)一時香港居民不 敢食用中國大陸淡水養(yǎng)殖魚的恐慌現(xiàn)象。因此，提供一種能夠簡便、 準確的對養(yǎng)殖魚類體內(nèi)毒物含量進行定性定量的檢測方法對我國淡 水魚類養(yǎng)殖事業(yè)的發(fā)展和監(jiān)督是十分必要的。

實用新型內(nèi)容
本實用新型的目的在于提供一種快速、簡單、實用的檢測魚類體內(nèi)毒物含量的檢測試劑盒。
為了實現(xiàn)上述目的，本實用新型釆用如下技術方案-一種含有淡水魚類微囊藻毒素去毒酶基因的檢測試劑盒，由盒體
和盒蓋組成，盒休內(nèi)含有淡水養(yǎng)殖魚類sGST去毒酶基因表達檢測引 物瓶，用于PCR擴增的DNA多聚酶瓶，PCR反應緩沖液瓶，dNTP
溶液瓶，各瓶外壁之間用加強筋固定連接。
在上述檢測試劑盒中，盒體中還含有作為外參照的淡水養(yǎng)殖魚類 的卩-肌動蛋白mRNA表達檢測引物瓶。
在上述檢測試劑盒中，盒體中還含有用于cDNA合成的0ligo(dT)18
通用引物瓶。
在上述檢測試劑盒中，盒休中還含有反轉(zhuǎn)錄酶瓶。 在上述檢測試劑盒中，盒體中還含有RT-PCR反應緩沖液瓶。 與現(xiàn)有技術相比，本實用新型具有如下有益效果本實用新型的 試劑盒通過測定魚體去毒酶基因表達水平來確定魚體內(nèi)是否含有微 囊藻毒素等毒物及其食用安全問題。該試劑盒基于不同毒物最終均將 導致魚體肝臟去毒酶——可溶性谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(sGST)基因表 達，通過固定方法檢測sGST基因表達水平，從而對淡水養(yǎng)殖魚類體 內(nèi)的毒素含量進行定性定量，為淡水養(yǎng)殖魚食用安全提供安全、簡便、 可靠的指標。

圖l為檢測試劑盒的示意圖。
具體實施方式
如圖1所示， 一種含有淡水魚類微囊藻毒素去毒酶基因的檢測試 劑盒，由盒體1和盒蓋2組成，盒體1內(nèi)含有淡水養(yǎng)殖魚類SGST去
毒酶基因表達檢測引物瓶3，用于PCR擴增的DNA多聚酶瓶4， PCR 反應緩沖液瓶5， dNTP溶液瓶6，作為外參照的淡水養(yǎng)殖魚類的卩-肌動蛋白mRNA表達檢測引物瓶8，用于cDNA合成的oligo(dT)18 通用引物瓶9，反轉(zhuǎn)錄酶瓶IO， RT-PCR反應緩沖液瓶ll，各瓶外壁 之間用加強筋7固定連接。
權利要求1.一種含有淡水魚類微囊藻毒素去毒酶基因的檢測試劑盒，由盒體(1)和盒蓋(2)組成，其特征在于盒體(1)內(nèi)含有淡水養(yǎng)殖魚類sGST去毒酶基因表達檢測引物瓶(3)，用于PCR擴增的DNA多聚酶瓶(4)，PCR反應緩沖液瓶(5)，dNTP溶液瓶(6)，各瓶外壁之間用加強筋(7)固定連接。
2. 如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于盒體(1)中還 含有作為外參照的淡水養(yǎng)殖魚類的(3-肌動蛋白mRNA表達檢測引物 瓶(8)。
3. 如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于盒體(1)中還 含有用于cDNA合成的0ligo(dT)18通用引物瓶(9)。
4. ;如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于盒體(1)中還 含有反轉(zhuǎn)錄酶瓶(10)。
5. 如權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于盒體(1)中還 含有RT-PCR反應緩沖液瓶(11)。
專利摘要本實用新型公開了一種含有淡水魚類微囊藻毒素去毒酶基因的檢測試劑盒。由盒體和盒蓋組成，盒體內(nèi)含有淡水養(yǎng)殖魚類sGST去毒酶基因表達檢測引物瓶，用于PCR擴增的DNA多聚酶瓶，PCR反應緩沖液瓶，dNTP溶液瓶，各瓶外壁之間用加強筋固定連接。本實用新型的試劑盒通過測定魚體去毒酶基因表達水平來確定魚體內(nèi)是否含有微囊藻毒素等毒物及其食用安全問題。該試劑盒基于不同毒物最終均將導致魚體肝臟去毒酶——可溶性谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(sGST)基因表達，通過固定方法檢測sGST基因表達水平，從而對淡水養(yǎng)殖魚類體內(nèi)的毒素含量進行定性定量，為淡水養(yǎng)殖魚食用安全提供安全、簡便、可靠的指標。
文檔編號C12Q1/68GK201183798SQ2008200428
公開日2009年1月21日 申請日期2008年1月15日 優(yōu)先權日2008年1月15日
發(fā)明者韜 劉, 衛(wèi) 葉, 廖婉琴, 梁旭方, 琳 王, 端金霞, 云 符, 陳小佳, 旭 馬 申請人:暨南大學