專(zhuān)利名稱(chēng)：：重組人類(lèi)第九因子及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種重組人類(lèi)第九因子蛋白，以及編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及一種治療血友病的方法。
背景技術(shù)：
：目前在發(fā)達(dá)國(guó)家中，治療血友病病人的方式包含預(yù)防性及按需性(on-demand)替代療法(LofqvistT.etal.,J.Intern.Med.1997;241:395-400)，注射來(lái)自血漿或重組的濃縮凝血因子(LippertB.etal.,BloodCoagul.Fibrinolysis.2005;16:477-485)。血友病的標(biāo)準(zhǔn)療法是注入濃縮蛋白質(zhì)以取代有缺陷的凝血因子。注入的量是依據(jù)出血的嚴(yán)重程度、出血的位置及病人的體型大小來(lái)決定。病況嚴(yán)重的病人則可能以定期預(yù)防性的輸液來(lái)治療。若能有適當(dāng)?shù)闹委煟蠖鄶?shù)患有血友病的人均能擁有相對(duì)正常的生活。然而高成本及數(shù)量有限的重組蛋白，使得凝血因子的劑量成為治療血友病時(shí)的重要問(wèn)題。除此之外，來(lái)自血漿的產(chǎn)品容易有傳染人類(lèi)免疫缺陷病毒(mv)及b、c型肝炎的風(fēng)險(xiǎn)，注入到病人體內(nèi)的蛋白其半衰期也很短，導(dǎo)致需要相當(dāng)頻繁的輸液(WhiteG.C.etal.，Transfus.Sci.1998;19:177-189)。其它像是基因療法及組織植入技術(shù)，亦被研究是否可作為可能的療法(HoughC.etal.，J.Thromb.Haemost.，2005;3:1195-1205)。其中一個(gè)血友病病患的基因療法臨床試驗(yàn)顯示因?yàn)榭惯f送載體(deliveringvehicle)的抗體產(chǎn)生之故，所以凝血因子的表現(xiàn)量只有短暫的增加(MannoC.S.etal.，Nat.Med.2006;12:342-347)。因此，基因療法仍然是一個(gè)研究中的方法，在能廣泛用于治療血友病之前仍有許多障礙需要克服。4B型血友病是因缺乏一種名叫第九因子的凝血蛋白所引起。該基因位于X染色體上因此這是一種性聯(lián)遺傳疾病。此疾病主要發(fā)生于男性。約每3萬(wàn)名男性中就有1人患有B型血友病。人類(lèi)第九因子是一種維生素K依賴(lài)性酶原，在血液凝固上扮演了很重要的角色。第九因子在體內(nèi)循環(huán)時(shí)為一個(gè)具有415氨基酸的單鏈酶原，分子量為55000道爾頓(dalton)，在正常血漿中的含量約為5pg/ml。重組第九因子產(chǎn)品大大地減少了傳染HIV及B、C型肝炎的風(fēng)險(xiǎn)。如果擁有加強(qiáng)凝血活性的重組第九因子能通過(guò)第九因子DNA的基因工程生產(chǎn)，不但可以降低凝血因子的成本，亦可在管理血友病病患時(shí)減少使用的劑量。此外，這種方法也提供了一個(gè)更有效的血友病患基因療法試驗(yàn)工具。圖l顯示純化的重組第九因子的SDS-PAGE分析。將來(lái)自野生型(IX-7)及突變體(IX-1、IX-2、IX-8、IX-3、IX-4、IX-5及IX-6)的純化蛋白質(zhì)(每欄4pg)進(jìn)行十二垸基硫酸鈉聚丙烯酰胺膠體電泳(SDS-PAGE)。樣本在不加入還原劑也不破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的條件下(non-reducingcondition)跑電泳。通過(guò)考馬斯藍(lán)染色以顯現(xiàn)第九因子的蛋白條帶。使用BCATM蛋白試驗(yàn)套組(Pierce,Rockford,IL,USA)測(cè)定親和純化(affinity-purified)后重組野生型第九因子及丙氨酸替換過(guò)的第九因子的濃度，其中牛丙種球蛋白(bovine^-globulin)(catJ23212,Pierce)被使用來(lái)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)以供計(jì)算蛋白濃度之用。圖2顯示通過(guò)pBS-HCRHPl-A-FIX高壓注射處理(如之前方法所述)后24小時(shí)，B型血友病小鼠中的人類(lèi)第九因子濃度。通過(guò)6到8秒內(nèi)的高壓，自尾靜脈注射2ml的50嗎DNA至體重20嗎的B型血友病公鼠中。之后讓小鼠慢慢復(fù)原，至注射后24小時(shí)處死小鼠，收集血漿以測(cè)定凝血活性，及以酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)蛋白濃度(IX:Ag)。每筆數(shù)據(jù)各表示一只小鼠的數(shù)據(jù)。利用在平行實(shí)驗(yàn)中收集自20個(gè)健康個(gè)體的正常血漿進(jìn)行連續(xù)稀釋?zhuān)宰鞒隹捎糜贓LISA及凝血活性測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。這些收集血槳中的第九因子蛋白濃度及凝血活性被假定為5ng/ml。5圖3顯示利用腺相關(guān)病毒(AAV)移轉(zhuǎn)基因至B型血友病小鼠中以表現(xiàn)第九因子的結(jié)果。建構(gòu)各自帶有IX-6及IX-7之rAAV2/8載體的方法如之121110前方法中所述。分別靜脈注射4x10vg/kg(a)4x10及8xl0vg/kg(b)如上所述帶有IX-6及IX-7之rAAV2/8載體至同型接合的(Homozygous)B型血友病小鼠(n=6，年齡8到14周，重16到18g)中。注射后2周收集血液以測(cè)量第九因子蛋白濃度及凝血活性。根據(jù)年齡為每組小鼠編號(hào)。專(zhuān)一活性以百分比表示，定義為每個(gè)樣本所測(cè)得的凝血活性除以其ELISA測(cè)出的質(zhì)量(IX:Ag)。利用在平行實(shí)驗(yàn)中收集自20個(gè)健康個(gè)體的正常血漿進(jìn)行連續(xù)稀釋?zhuān)宰鞒隹捎糜贓LISA及凝血活性測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。這些收集血漿中的第九因子蛋白濃度及凝血活性被假定為5pg/ml。圖4為活化態(tài)第九因子的彩帶圖(ribbondrawing),其由2個(gè)EGF區(qū)及IRFN.PDB催化區(qū)所組成。殘基86、277及338以支鏈顯示。在活性部位上結(jié)合的抑制物也以支鏈顯示。推測(cè)出的活化態(tài)第八因子結(jié)合部位及活化勝肽區(qū)亦被標(biāo)出。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種比野生型第九因子擁有更高活性的重組第九因子，能用較少的劑量便達(dá)到血友病的治療效果。本發(fā)明提供了一種新的第九因子DNA序列，在藉由各種不同工具(如病毒載體)運(yùn)送到動(dòng)物體內(nèi)后，與表達(dá)野生型第九因子的DNA序列相比，能表現(xiàn)出具有較高凝血活性的第九因子蛋白。使用重組技術(shù)，在氨基酸位置86、276、277和338同時(shí)作雙重或三重丙氨酸替換的第九因子顯示出高于野生型第九因子(IX-7)2到14倍的凝血活性。為了了解這些變異型第九因子增加凝血活性的原因，一些功能參數(shù)被測(cè)定。表2證實(shí)了增加的凝血活性與活化態(tài)第八因子有關(guān)，且被認(rèn)為是第九因子與活化態(tài)第八因子間的親和力增加，以及第十因子&at增加及《M減少的結(jié)果。從0.5到1公升的穩(wěn)定轉(zhuǎn)殖HEK293細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化出重組第九因子。使用雙縮脲法(Biuretmethod)(BCA蛋白質(zhì)定量分析組，購(gòu)自Pierce公司)測(cè)定純化的第九因子(如圖l所示)并將其稀釋到5pg/ml。使用部份凝血活酶時(shí)間分析(aPTTassay)以測(cè)定其凝血活性。人類(lèi)正常血漿經(jīng)連續(xù)稀釋后用于產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。正常血漿中的第九因子濃度被測(cè)定為5pg/ml。樣本的專(zhuān)一活性(specificactivity)定義為凝血活性除以其質(zhì)量濃度，并以百分比表示。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩次重復(fù)。因此，本發(fā)明提供了一種重組人類(lèi)第九因子蛋白，其在編碼如SEQIDNo:7所示的氨基酸序列的氨基酸殘基上作氨基酸的替換，氨基酸替換位置選自由86、276、277和338所組成的群組，但不包含氨基酸位置338的單一替換。在一較佳實(shí)施例中，該替換上之氨基酸為丙氨酸。此處使用的術(shù)語(yǔ)"氨基酸"指一個(gè)包含氨及羧官能基的分子。在生物化學(xué)中，該術(shù)語(yǔ)指通式為H2NCHRCOOH的a-氨基酸，其中R是一個(gè)有機(jī)取代基。(x-氨基酸中的氨基及羧基連接在同一個(gè)碳原子上，即所謂的(x-碳。各種不同的a-氨基酸其連接在a-碳上的支鏈(R基)也不同。一般來(lái)說(shuō)，標(biāo)準(zhǔn)氨基酸如丙氨酸、天門(mén)冬酰胺、天門(mén)冬氨酸、谷酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸、精氨酸或賴(lài)氨酸都可用作為替換的氨基酸。在一更佳實(shí)施例中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有編碼如SEQIDNo:1、2、3、4、5或6所示的氨基酸序列。在一最佳實(shí)施例中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有編碼如SEQIDNo:6所示的氨基酸序列。替換氨基酸殘基所創(chuàng)造出的非自然發(fā)生的人類(lèi)第九因子，展現(xiàn)出了高于野生型第九因子蛋白2到14倍的凝血活性(表l)，且與輔因子活化態(tài)第八因子有較強(qiáng)的親和力。在一較佳實(shí)施例中，重組人類(lèi)第九因子蛋白其尺d值為0.1到0.5nM，《M值為32到128nM。更佳之i^值為32到56nM(表2)。本發(fā)明也提供一種編碼重組人類(lèi)第九因子蛋白的分離核酸，其具有如SEQIDNO:9、10、11、12、13或14所示的核苷酸序列。在一較佳實(shí)施例中，該核酸具有如SEQIDNO:11、12、13或14所示的核苷酸序列。在一更佳實(shí)施例中，該核酸具有如SEQIDNO:14所示的核苷酸序列。7表l純化第九因子的凝血活性凝血活性專(zhuān)一活性(兇/ml)(%)IX國(guó)74.72±0.8194±16IX-15.38±0,50"5±10IX國(guó)25.96±0.77130±15IX-818.08±0.14362±3IX-36.34±0.34122±7IX-48.51±2.06199±41IX-59.38±3.30188±66IX-666.04±2.841293±57表2活化態(tài)第八因子存在或不存在時(shí)，產(chǎn)生活化態(tài)第十因子的動(dòng)力學(xué)參數(shù)^niaxEnz〗酶WnMnMFXa/minnMx1(H(WHsec1)nM不存在活化態(tài)第八因子IX-77訴.8±102.60.16±0.04102.62±0.幼352.95±109.17IX-1531.9±130.20.14±0.03102.25±0.幼426.54±35.84NDIX-2395.3±43.00.07±0.05101.22±0鄰303.54±204.5NDIX.B479.8±44.00.08±0.04101.37±0.61280.05±108.加NDIX-3290.1±54.580.12±0.05101.站±0.打726i1±298.62NDIX-4479.0±87.50.08±0.02101.35±0.41278.切±3&18NDIX-5681.4±151.10.10±0,07101.64±1.11240.59±161.64NDIX-6742.8±18.00.17±0.05102.82±0.肪3的.68±121.26ND不存在活化態(tài)第八因子x1x108IX.754.04±5.2527.81±0鄰0.03314.17±0.342i4±0.212.44±1加IX-155.39±10.5715.11±0.900.0495加士0.幼0.93±0.121.42±0.48IX-244.27±2.15汰74±0.420,0568.89±0.132.01±0.071.20±0.08IX.844.79±8.3328.41±3.340.0529.加±1.072.04±0.141.32±0.24IX.335.17±3.1934.12±1.130.03914.56±0.484.16±0.281.站±0.44IX4肌站±13.1546.78±8.020.1067.36±1.260.91±0.040.40±0.11IX.5116.53±12.45148.81±14.030.11417.93±6.722.12±0.440.34±0.15IX-6訴.01±10.5352_26±10.220.1446.07±1.191.33±0.100.19±0.07a.活化態(tài)第九因子-活化態(tài)第八因子復(fù)合物的濃度可從實(shí)驗(yàn)條件及Kd的觀察值得知。b.尺加=￥腿/[酶],單位為MFXa,M"FIXa(或FIXa-FVIIIa)'S"。c.反應(yīng)物培養(yǎng)在0.4nM第八因子及0.25nM第九因子中，以活化0到200nM的第十因子，同時(shí)存在有0.5mM活化態(tài)第十因子專(zhuān)一小受質(zhì)(spectrozymeFXa)、40nMPCPS及5mMCa2+。氛ND:未測(cè)定。8本發(fā)明進(jìn)一步提供一種醫(yī)藥組合物，其包含本發(fā)明中的人類(lèi)第九因子蛋白，及其醫(yī)藥上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。除了在體外表現(xiàn)及分析丙氨酸變異體的生物特性，本發(fā)明亦使用小鼠模型以評(píng)估其潛在作用。B型血友病小鼠提供了一個(gè)模型，可研究各種不同第九因子在生理上所扮演的作用角色。為了估計(jì)第九因子的降解途徑，有幾種人類(lèi)第九因子蛋白被注射至血友病小鼠的尾靜脈中，以觀察這些突變蛋白質(zhì)的特性。以流體動(dòng)力學(xué)為基礎(chǔ)將裸露的質(zhì)體DNA遞送至肝臟，可使小鼠體內(nèi)的血漿含有轉(zhuǎn)殖基因產(chǎn)物并達(dá)到具有療效的濃度。該技術(shù)被使用于將可制造野生型及變異型第九因子蛋白質(zhì)的基因DNA遞送至B型血友病小鼠體內(nèi)。通過(guò)病毒載體進(jìn)行全身性遞送治療的轉(zhuǎn)殖基因，可能導(dǎo)致長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)殖基因表現(xiàn)效果(MiaoC.H.etal.，Mol.Ther.2001;3:947-957)。但基因轉(zhuǎn)移到肝細(xì)胞的效率不高。當(dāng)重組腺相關(guān)病毒(AAV)遞送系統(tǒng)證實(shí)其在B型血友病動(dòng)物模型的初步臨床前研究中具有良好效率后，便獲得熱烈的支持(DavidoffA.M.etal.,Mol.Ther.2005;11:875-888)。兩個(gè)臨床研究使用AAV血清2型載體，將第九因子由直接肌內(nèi)注射遞送至肌肉(MannoC.S.etal.，Blood.2003;101:2963-2972)或通過(guò)肝動(dòng)脈灌注(MannoC.S,etal.,Nat.Med.2006;12:342-347)遞送至肝臟。在肌肉注射試驗(yàn)中，血漿中的第九因子濃度通常不會(huì)上升到超過(guò)1%，但在接受肝動(dòng)脈遞送AAV載體的單一病患血漿中可測(cè)得高達(dá)12%的濃度。然而該濃度上升后隨后便是血清轉(zhuǎn)胺酶濃度的暫時(shí)上升及第九因子表現(xiàn)的減少，可能是因?yàn)轭A(yù)先存在的宿主免疫機(jī)制會(huì)辨識(shí)AAV衣殼蛋白并攻擊轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。由于重組IX-6在本發(fā)明之小鼠模型中比起野生型(IX-7)有較高的活性，所以可能可以減少病毒顆粒的注射數(shù)量，但又能達(dá)到相同的第九因子活性。9因此，本發(fā)明又提供一種在體內(nèi)產(chǎn)生人類(lèi)第九因子蛋白的方法，其包含(a)建構(gòu)載體，其攜帶有編碼人類(lèi)第九因子蛋白之核酸；及(b)將該載體施予至哺乳動(dòng)物體內(nèi)。在一較佳實(shí)施例中，該哺乳動(dòng)物為人類(lèi)。此處使用的術(shù)語(yǔ)"施予"不限于但包含通過(guò)載體、質(zhì)體、脂質(zhì)體、DNA注射、電穿孔、基因槍、靜脈注射或肝動(dòng)脈灌注等方式。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種治療血友病的方法，其包含施予需要該治療之病人一達(dá)有效劑量之本發(fā)明蛋白質(zhì)。具體實(shí)施例方式本發(fā)明可能以不同的形式來(lái)實(shí)施，并不僅限于下列文中所提及的實(shí)例。下列實(shí)施例僅作為本發(fā)明不同面向及特點(diǎn)中的代表。材料由美國(guó)酶石開(kāi)究實(shí)驗(yàn)室公司(EnzymeResearchLaboratory,SouthBend,IN,USA)購(gòu)得純化的人類(lèi)活化態(tài)第七因子、活化態(tài)第十因子、活化態(tài)第十一因子、第十因子、及多株山羊抗人類(lèi)第九因子抗體(cat.#GAFIX-AP)。磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine,PC)、磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)及胰島素-運(yùn)鐵蛋白-鈉亞硒酸鹽(Insulin-Transferrin-Sodiumselenite,ITS)等使用于無(wú)血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)基添加物則取自于西格瑪化學(xué)公司(SigmaChemicalCo.,St.Louis，MO,USA)。制備組織因子及PCPS磷脂的方法則如前案所述(ChangYJ,etal.，Biochemistry,1999:10940-10948)。第九因子缺乏血漿、活化態(tài)第十因子專(zhuān)一小受質(zhì)及活化態(tài)第九因子專(zhuān)一小受質(zhì)(SpectrozymeFIXa)購(gòu)自美國(guó)公司(AmericanDiagnosticaInc.,Greenwich,CT，USA)。所有的限制性?xún)?nèi)切酶和聚合酶均為新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司(NewEnglandBiolabsInc.,Beverly,MA，USA)的產(chǎn)品。G418(Geneticin)則取自德國(guó)默克公司(Ca舊iochem，MerckKGaA,Darmstadt,Germany)。所有的分光光度分析法(spectrophotometricassays)均使用安裝有溫度控制器的微盤(pán)分析儀(Fmaxmicrotiterplatereader)(MolecularDevicesCorp.,MenloPark,CA，USA)。強(qiáng)鹽基性陰離子交換劑(QAE-SephadexA50)及陰離子交換層析管柱(ResourceQ)則取自英國(guó)的安瑪西亞生技醫(yī)藥公司(AmershamPharmaciaBioTech,UK,Bucks,England)。方法第九因子的體外突變、表現(xiàn)及純化以使用引物對(duì)的PCR方法(QuickChange,Stratagene，Boston,USA)在人類(lèi)第九因子的cDNA上進(jìn)行定點(diǎn)突變，將位于殘基第86、277或338的密碼子替換成可轉(zhuǎn)譯出丙氨酸的密碼子。替換殘基86的引物對(duì)序列為1X86(SEQIDNO:17)及IX86T7(SEQIDNO:18);替換殘基277的引物對(duì)序列為1X277(SEQIDNO:19)及1X277-2(SEQIDNO:20);替換殘基338的引物對(duì)序列為1X338(SEQIDNO:21)及IX338D(SEQIDNO:22)。利用這些引物對(duì)，7種不同的第九因子cDNA被制造出并被完全定序，同時(shí)將野生型第九因子(IX-7)亞克隆(subclone)至pCR3TM-Uni(Invitrogen,CA，USA)中并使其在巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus)promoter的控制下于人類(lèi)293細(xì)胞中表現(xiàn)。7個(gè)重組第九因子突變體中，有3個(gè)是單一替換變異體，分別在殘基86、277或338處被替換成丙氨酸(序列分別如SEQIDNO:1,SEQIDNO:2或SEQIDNO:8所示)；另外3個(gè)則是雙重替換變異體，分別在殘基86與277(SEQIDNO:3)、殘基86與338(SEQIDNO:4)或殘基277與338(SEQIDNO:5)處被替換成丙氨酸；最后1個(gè)則是三重替換變異體，其在殘基86、277與338處都被替換成丙氨酸(SEQIDNO:6)。用ELISA(方法如后所述)鑒定能表現(xiàn)重組蛋白的細(xì)胞克隆(clone),并使用市面上可購(gòu)得的專(zhuān)一抗第九因子的抗體。依照已有的方法，在無(wú)血清培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)正確細(xì)胞株及純化重組蛋白。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將1公升的培養(yǎng)上清液以5mM苯甲脒(benzamidine)及4mMEDTA微調(diào)并以4，350rpm在4°C下離心(HA6000，SorvallRC-3CPlus,DuPont)30分鐘。移除細(xì)胞殘?jiān)螅瑢⑸锨逡和ㄟ^(guò)以TBS/EDTA(20mMTris-Cl，pH7.5，及150mMNaCl/4mMEDTA)平衡過(guò)的QAE-SephadexA50管柱(30ml，5x2.5cm)。以含5mM苯甲脒的1公升TBS沖洗管柱后，可用含0到30mMCaCl2梯度于含TBS/1mM苯甲脒條件下沖提出第九因ii集、并使用超過(guò)原體積IOO倍的50mMTris-Cl(pH7.5)透析，然后通過(guò)0.22卞m的針筒過(guò)濾器(syringefilter,Millipore,Cork,Ireland)過(guò)濾。約100毫升的QAE沖提液被裝入ResourceQ管柱(1ml,AktaFPLCpurifier,AmershamBiosciences)。以含50mMTris-Cl(pH7.5)的緩沖液清洗過(guò)管柱后，用含NaCl梯度(0~1M)的50mMTris-Cl(pH7.5)沖提管柱。沖提出的第九因子在約250mMNaCl的部分。進(jìn)行SDS-PAGE電泳及考馬斯藍(lán)(Coomassieblue)染色以驗(yàn)證純化的重組第九因子蛋白。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)及凝血活性試驗(yàn)使用人類(lèi)第九因子的多株抗體，以ELISA測(cè)定培養(yǎng)上清液及小鼠血漿中的野生型及被丙氨酸替換過(guò)的人類(lèi)第九因子(hFIX)之蛋白質(zhì)量。該抗體為種特異性多株抗hFIX抗體，并不會(huì)與小鼠的第九因子交叉反應(yīng)。收集平行實(shí)驗(yàn)中至少20個(gè)健康個(gè)體的血槳并進(jìn)行連續(xù)稀釋?zhuān)悦枥L出可用于計(jì)算第九因子濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。來(lái)自收集血漿的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與那些來(lái)自純化血漿第九因子(IMMUNINE(產(chǎn)品名),BaxterVienna,Austria)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相似。重組第九因子蛋白的功能是用部分凝血活酶時(shí)間(one-stageaPTTassay)測(cè)定凝血活性。使用連續(xù)稀釋中的收集血漿作為試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。凝血試驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與那些來(lái)自純化血槳第九因子(IMMUNINE)及重組第九因子(BeneFIX(產(chǎn)品名)，GeneticsInstitute,Inc.CambridgeMA，USA)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)均很相似。一個(gè)樣本的專(zhuān)一活性(specificactivity)定義為凝血活性除以其質(zhì)量。在收集的一般人類(lèi)血漿中，第九因子蛋白的質(zhì)量及凝血活性假設(shè)為5pg/ml。通過(guò)活化態(tài)第十一因子及活化態(tài)第七因子-組織因子(VIIa*TF)復(fù)合物以活化第九因子通過(guò)活化態(tài)第十一因子并加入TBS/5mMCaCl2以活化第九因子，其中酶與基質(zhì)的比率為1比200。在一定時(shí)間的間隔抽出反應(yīng)混合物的等分試樣(aliquot),并放置于含1%SDS及2mMEDTA的溶液中以終止反應(yīng)，以電泳試樣緩沖液(gelloadingbuffer)(最終濃度為50mMTris-Cl(pH6.8)、2mMEDTA、1%SDS、8%甘油及0.025%溴酚藍(lán))調(diào)整，然后用SDS-PAGE分析。通過(guò)活化態(tài)第七因子-組織因子復(fù)合物活化第九因子，并以1比80的酶與基質(zhì)比率在TBS/5mMCaCl2中進(jìn)行。在一定時(shí)間的間隔抽出反應(yīng)混合物的等分試樣，然后以SDS-PAGE分析。活化態(tài)第九因子及第十因子的交互作用如上所述，通過(guò)活化態(tài)第十一因子制備出活化態(tài)第九因子。使用先前所述(ChangYJ,etal.，JournalofBiologicalChemistry.2002;277:25393)的抗凝血酶III(ATIII)滴定并測(cè)得活化態(tài)第九因子分子濃度。當(dāng)存有或不存有活化態(tài)第八因子時(shí)，通過(guò)動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)活化態(tài)第十因子(由活化態(tài)第九因子所產(chǎn)生)所造成的活化態(tài)第十因子專(zhuān)一小受質(zhì)的水解，以分析活化態(tài)第九因子與第十因子的交互作用。簡(jiǎn)單地說(shuō)，當(dāng)活化態(tài)第八因子不存在時(shí)，活化態(tài)第十因子(10nM)與PCPS—同在室溫下培養(yǎng)5分鐘，然后加入不同濃度的第十因子(0到1pM)及0.5mM活化態(tài)第十因子專(zhuān)一小受質(zhì)。將反應(yīng)紀(jì)錄為根據(jù)培養(yǎng)時(shí)間下混合物的吸光度變化。反應(yīng)的最終體積為ioopl，且在37。C含0.01。/。BSA及TBS/5mMCaCb中40PCPS的緩沖液(TBS/CaCl2/BSA/PCPS)中進(jìn)行。當(dāng)活化態(tài)第八因子存在時(shí)，25jil的活化態(tài)第八因子(新鮮制備)與同體積、在TBS/CaCl2/BSA/PCPS中先經(jīng)過(guò)稀釋及預(yù)培養(yǎng)的活化態(tài)第九因子先一起培養(yǎng)，以進(jìn)行活化態(tài)第九因子與第十因子的交互作用，接著加入50pl含PCPS、活化態(tài)第十因子專(zhuān)一小受質(zhì)及第十因子之反應(yīng)混合物。在微盤(pán)分析儀上動(dòng)力學(xué)偵測(cè)混合物中活化態(tài)第九因子-活化態(tài)第八因子復(fù)合體(具有內(nèi)源性十酶(tenase)復(fù)合體活性)所產(chǎn)生的活化態(tài)第十因子。最終濃度分別為野生型或突變型活化態(tài)第九因子0.25nM;活化態(tài)第八因子0.4nM;PCPS40第十因子0到200nM;及活化態(tài)第十因子專(zhuān)一小受質(zhì)0.5mM。如之前所述，以下列方程式計(jì)算活化態(tài)第九因子活性吸光度(A4()5)=a—+bf+c?；罨瘧B(tài)第九因子與活化態(tài)第八因子間的交互作用在有限濃度的活化態(tài)第八因子下，監(jiān)測(cè)內(nèi)源性十酶活性以進(jìn)行結(jié)合實(shí)13驗(yàn)。將25個(gè)微孔新鮮制備的活化態(tài)第八因子(0.4nM)與25pl不同濃度野生型或突變型活化態(tài)第九因子(0到20nM)—起培養(yǎng)，以形成內(nèi)源性十酶復(fù)合體。接著加入50nl由含TBS/Ca/PCPS/BSA的反應(yīng)緩沖液與第十因子及活化態(tài)第十因子專(zhuān)一小受質(zhì)所組成的混合物，以測(cè)量活化態(tài)第八因子與活化態(tài)第九因子結(jié)合而形成的內(nèi)源性十酶復(fù)合體活性。最終濃度分別為活化態(tài)第八因子O.lnM;PCPS40)iM;第十因子IOOnM;活化態(tài)第十因子專(zhuān)一小受質(zhì)0.5mM;及活化態(tài)第九因子0到15nM。三個(gè)獨(dú)立反應(yīng)均進(jìn)行實(shí)驗(yàn)二重復(fù)，并使用所有的數(shù)據(jù)點(diǎn)繪制曲線(xiàn)。根據(jù)如下方程[/刷？++L如刷,++L)2-4[刷,[服:22計(jì)算并推導(dǎo)出&值(ChangYJ,etal.,JournalofBiologicalChemistry.2002;277:25393)。第十因子與活化的抗凝血酶III(ATIII)間的交互作用以酶-抑制劑復(fù)合體的凝膠分析進(jìn)行抗凝血酶m對(duì)活化態(tài)第九因子的抑制。0.53的活化態(tài)第九因子與0.53nM抗凝血酶III一同被培養(yǎng)在37°C下100|il的TBS/5mMCaCl2中(含有或不含有0.01單位/毫升的肝素)。在不同時(shí)間間隔(0、5、10、20及30分鐘)抽出反應(yīng)混合物的等分試樣(20^1)，將之與電泳試樣緩沖液(最終濃度為50mMTris-Cl(pH6.8)、2mMEDTA、1%SDS、8%甘油及0.025%溴酚藍(lán))混合后，進(jìn)行SDS-PAGE及銀染。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所有下面提及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵守標(biāo)準(zhǔn)程序，遵照臺(tái)灣的國(guó)立臺(tái)灣大學(xué)準(zhǔn)則、美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生院動(dòng)物保護(hù)準(zhǔn)則及美國(guó)西雅圖兒童醫(yī)院及地區(qū)醫(yī)學(xué)中心的準(zhǔn)則。來(lái)自C57BL/6品系的B型血友病小鼠取自戴爾史塔福特教授(Dr.DarrelStafford,BiologyDepartment,UniversityofNorthCarolinaatChapelHill,NC,USA)及凱瑟琳海教授(Dr.KatherineHigh,TheChildren'sHospitalofPhiladelphia,PA，USA)。蛋白質(zhì)灌注B型血友病小鼠以2.5%阿佛丁(Avertin)麻醉小鼠并靜脈注射0.25pg/每克體重的重組蛋白IX畫(huà)6(SEQIDNO.6)、IX-7(SEQIDNO.7)及IX陽(yáng)8(SEQIDNO.8)以達(dá)到假定的循環(huán)濃度5ng/ml,其中小鼠的總血漿體積估計(jì)為體重的十分之一。注射后5分鐘、15分鐘及2小時(shí)，將小鼠處死并從下腔靜脈收集血液至3.8°/。檸檬酸鈉(9:lv/v)中。在室溫下以8，000rpm(Eppendorf,5415R)離心10分鐘以制備出血漿，并以ELISA分析蛋白質(zhì)量，及以aPTT分析凝結(jié)活性。高壓注射(Hydrodynamicinjection)及測(cè)量B型血友病小鼠中人類(lèi)第九因子的表現(xiàn)將編碼重組第九因子(SEQIDNos:9-16)的cDNA亞克隆至pBS-HCRHPl-A(MiaoC.H.etal.,Mol.Ther.2001;3:947-957)中，在人類(lèi)脂蛋白元E/C-I基因座控制區(qū)(locuscontrolregion)及人類(lèi)a-1抗胰蛋白酶啟動(dòng)子的控制之下，利用可增進(jìn)蛋白質(zhì)表現(xiàn)的人類(lèi)第九因子內(nèi)含子l(己切除前后端)及牛生長(zhǎng)激素多聚腺苷酸化信號(hào)序列，使該cDNA能在B型血友病小鼠的肝中被最佳表現(xiàn)。以2.5%阿佛丁麻醉小鼠。將這些表現(xiàn)質(zhì)體(pBS-HCRHPl-A-FIX)的等分試樣(50到100pg)溶解在2mlPBS(磷酸鹽緩沖液)中并將其注射至17到24g小鼠的尾靜脈，期間約6到8秒。每個(gè)使用不同質(zhì)體的實(shí)驗(yàn)都重復(fù)數(shù)次，且至少有兩批以上在不同時(shí)間所準(zhǔn)備的質(zhì)體DNA。自下腔靜脈采取血液樣本，并用1/10(v/v)3.8。/。的檸檬酸鈉稀釋以制成血槳。分別以ELISA和aPTT測(cè)量在小鼠血漿中表現(xiàn)的人類(lèi)第九因子濃度及呈現(xiàn)的凝血活性。同時(shí)亦制備肝組織，以進(jìn)行ELISA測(cè)量第九因子的表現(xiàn)。使用含5pl/ml多種蛋白酶抑制劑(Sigma)的2mlT-PER組織蛋白質(zhì)萃取試劑(cat#78510，Pierce)將全部的肝(1到1.7克)均質(zhì)化。離心后，上清液中提取出的所有蛋白質(zhì)約31.8±3.5mg/ml，使用這些蛋白質(zhì)進(jìn)行ELISA以測(cè)量人類(lèi)第九因子的濃度。使用假型ssAAV2/8載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)將編碼IX-6(SEQIDNO:14)及IX-7(SEQIDNO:15)之cDNA序15列(長(zhǎng)1.4kb，沒(méi)有3端非轉(zhuǎn)譯區(qū))分別亞克隆至pBS-HCRHPl-A中，隨后被切除成為4.3kb、含有全部表現(xiàn)卡匣(加強(qiáng)子、啟動(dòng)子、第九因子編碼區(qū)及內(nèi)含子l、以及牛生長(zhǎng)激素多聚腺苷酸化信號(hào))的S;^I片段，再將其亞克隆至pAAV-MCS(Stratagene，LaJolla，CA)的iVort位點(diǎn)，其與連接子(linker)接合后會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)镴^"I。最后產(chǎn)生的質(zhì)體包含兩側(cè)帶有AAV2的反轉(zhuǎn)末端重復(fù)序列(ITRs)的全部表現(xiàn)卡匣(4.3-kbS/^I片段)。根據(jù)三重基因轉(zhuǎn)染法(Tripletransfectionmethod)(XiaoX，etal.JVirol.1998;72:2224-2232)，使用攜帶有個(gè)別IX-6及IX-7表現(xiàn)卡匣的ssAAV2/8載體以產(chǎn)生AAV病毒顆粒。使用第九因子專(zhuān)一性引物(SEQIDNOs:28及29)，由定量PCR(LightCycler480，RocheAppliedScience,Mannheim,Germany)測(cè)定載體劑量，并以每毫升載體基因組(vg/ml)為單位表示。從尾靜脈將病毒顆粒施打至B型血友病小鼠內(nèi)，載體劑量為4xl012、4xlOU或8xl(Tvg/公斤體重。尾靜脈注射入AAV顆粒的兩周之后將小鼠處死。自下腔靜脈收集血液樣本以用作血漿制備。分別以ELISA及aPTT測(cè)量人類(lèi)第九因子蛋白的表現(xiàn)濃度及在小鼠血漿中的凝血活性。結(jié)果工程重組第九因子蛋白比野生型第九因子(IX-7)顯示較高的凝血活性為了尋找有較高凝血功效的第九因子，本發(fā)明選擇213、228、240、247、276及277等6個(gè)氨基酸位置并分別將其取代為丙氨酸(序列分別如SEQIDNOs:23、24、25、26、27及2所示)。重組蛋白的凝血活性與野生型第九因子幾乎相同，或者具有更高之活性(表3)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>*這些蛋白質(zhì)均為(3^-純化的部分本發(fā)明更進(jìn)一步選擇人類(lèi)第九因子上的86、277及338等3個(gè)氨基酸位置，并將他們單一或一并替換成丙氨酸。本發(fā)明在人類(lèi)293腎臟細(xì)胞中總共表現(xiàn)7種丙氨酸替換過(guò)的第九因子變異體。這些突變的第九因子表現(xiàn)濃度與野生型第九因子(IX-7)十分相似，約為0.08到0.5微克/24小時(shí)/106細(xì)胞。純化之后，所有的重組第九因子蛋白在SDS-PAGE中均顯示為單一條帶，其移動(dòng)性與來(lái)自血漿中的第九因子相似(圖l)。進(jìn)行氨基酸序列分析，定出每個(gè)重組蛋白前5個(gè)殘基，以驗(yàn)證并確認(rèn)重組蛋白的特性(數(shù)據(jù)未展示)。通過(guò)活化態(tài)第十一因子及活化態(tài)第七因子-組織因子復(fù)合物，更進(jìn)一步測(cè)試IX-7及丙氨酸突變體是否健全以活化重組第九因子蛋白，及是否在存在或不存在肝素的情況下會(huì)被抗凝血酶III抑制。這些實(shí)驗(yàn)均顯示IX-7及其它7個(gè)丙氨酸重組體之間并無(wú)顯著差異(數(shù)據(jù)未展示)。由此可作出結(jié)論，即在位置86、277及338上的丙氨酸替換并不會(huì)改變第九因子整體的結(jié)構(gòu)。純化的重組第九因子之凝血活性顯示于表l。重組IX-7具有充分活性,專(zhuān)一活性為94%。所有的第九因子突變體均有功效，并比IX-7多出1.1到13倍的凝血活性。其中，IX-6的活性最高，比IX-7的凝血活性高出13倍。IX-6增加的凝血活性和其與活化態(tài)第八因子之間的親和力相關(guān)測(cè)量重組活化態(tài)第九因子的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以研究丙氨酸替換對(duì)活化態(tài)第九因子之凝血活性的影響。假定活化態(tài)第九因子-活化態(tài)第八因子復(fù)合物的十酶活性與該復(fù)合體的濃度成比例關(guān)系，便可由活化態(tài)第九因子-活化態(tài)第八因子復(fù)合物之間的結(jié)合親和力作為指標(biāo)，監(jiān)測(cè)活化態(tài)第十因子的產(chǎn)生并計(jì)算表觀(apparent)解離常數(shù)(《d)。如表2所示，具有單一丙氨酸突變的3個(gè)變異體(IX-1、IX-2及IX-8)及具有雙重丙氨酸突變的其中一個(gè)變異體(IX-3)的&(1.20nM到1.95nM)均與IX-7的7^(2.44nM)相當(dāng)接近。令人驚訝的是，具有雙重丙氨酸突變的2個(gè)變異體(IX-4及IX-5)以及具有三重丙氨酸突變的變異體(IX-6)之7Q(分別為0.4nM、0.34nM及0.19nM)，與lX-7或夷卩3個(gè)單一丙氨酸突變的變異體之尺d相比顯著下降。IX-6與IX-7的《d戲劇性地相差10倍。不僅如此，IX-6與活化態(tài)第八因子還可形成酶復(fù)合物(0.144nM)，比IX-7與活化態(tài)第八因子的復(fù)合物(0.033nM)效率更佳。根據(jù)這些結(jié)果，再加上比起IX-7，IX-6與活化態(tài)第八因子間有較佳的親和力，解釋了為何IX-6可以有較高的凝血活性。當(dāng)活化態(tài)第八因子不存在時(shí)，所有重組突變體與IX-7的動(dòng)力學(xué)參數(shù)(即《M和^at)都非常相似(表2)，^at/《M約在240.59到726.81Mec"間。該結(jié)果顯示出當(dāng)活化態(tài)第八因子不存在時(shí)，活化態(tài)第九因子裂解第十因子的效率相當(dāng)?shù)?，這個(gè)情況在IX-7已被證實(shí)其它的活化態(tài)第九因子的突變體也是有相同特性。重組的IX-6在體內(nèi)比IX-7更有活性為了評(píng)估重組第九因子在體內(nèi)的效能，IX-6、IX-7及IX-8蛋白被灌注到B型血友病小鼠體內(nèi)，并在一定的時(shí)間間隔分析血漿樣本，追蹤這些蛋白質(zhì)的濃度及凝血功能。如表4所示，尾靜脈注射10itig重組蛋白至20克小鼠中的5分鐘后，自B型血友病小鼠的血漿中可檢測(cè)出大約1pg/ml的IX-7蛋白，但第15分鐘后濃度會(huì)下降到初始濃度的76%，而第2小時(shí)后則會(huì)下降到初始濃度的18%。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，循環(huán)中的IX-7因子凝血活性約在121至lj483。/。蛋白質(zhì)量之間。IX-6及IX-8的平行實(shí)驗(yàn)，使每個(gè)檢測(cè)IX-7蛋白濃度的時(shí)間點(diǎn)上都能同時(shí)比較被灌注IX-6及IX-8小鼠的情形。與被灌注IX-7的小鼠相比，被灌注重組IX-8的小鼠分別顯示出2.4(5分鐘后的樣本)至j3.67倍(2小時(shí)后的樣本)更高的凝血活性。IX-6則與體外實(shí)驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)一致，與被灌注IX-7的小鼠相比，灌注IX-6的B型血友病小鼠顯示出高的更多的活性，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上約為IX-7專(zhuān)一活性的2.6到7.5倍，例如在第5分鐘時(shí)的數(shù)據(jù)，IX-7(凝血活性2.91/蛋白U5)比上IX-6為(12.05/0.72)。表4連續(xù)時(shí)間紀(jì)錄被灌注重組第九因子蛋白的小鼠血漿中的第九因子濃度*IX-7(n=4>IX-8(n=2)IX-6凝血活性IX:Ag凝血活性IX:Ag凝血活性IX:Ag(以五分鐘所測(cè)量數(shù)字為百分之百計(jì)算)5分鐘2,91±1.21.15±0.2(100)6.98±1.40,92±0.1(100)12.05±4.40.72±0.1(100)(n-5)15分鐘2.63±1.00.88±0.3(76)5.24±2.70.86±0.1(94)6.74±1.40.55±0.2(77)(n=4)120分鐘0.64±0.40.21±0,2(18)2.35±0.20.36±0.0(39)4.80±3.10.45±0.1(62)(n=3)*約10嗎的第九因子被注射至每只小鼠中，以達(dá)到假定的蛋白濃度(每毫升血漿中5ng)。在注射后不同時(shí)間點(diǎn)取出血液樣本并進(jìn)行ELISA及凝血試驗(yàn)分析。連續(xù)稀釋平行實(shí)驗(yàn)的正常血漿以得出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。ELISA系統(tǒng)使用來(lái)自ERL(Gafix-AP160)的pAb作為涂布抗體，ERLpAb-HRP(Gafix-HRP)作為檢測(cè)抗體。正常血漿中的第九因子濃度假定為5ng/ml。通過(guò)高壓注射法將基因遞送至B型血友病小鼠中高壓注射帶有各自cDNA的表達(dá)質(zhì)體至B型血友病小鼠中，由肝臟主要表達(dá)第九因子突變體，以評(píng)估第九因子突變體治療B型血友病的效果。DNA注射后的第24小時(shí)測(cè)量表達(dá)濃度，如圖2及表5所示。重組IX-7及所有經(jīng)過(guò)丙氨酸替換的突變體(除了IX-6)均被表達(dá)并被分泌至血漿中，蛋白質(zhì)濃度為0.7到U7pg/ml，凝血活性則為0.46到2.26嗎/ml。與IX-7及其它丙氨酸突變體相比，IX-6具有可再現(xiàn)的較高蛋白濃度(3.22±0.58pg/ml，n=4)及凝血活性(12.34±2.87|ag/ml，n=4)。有趣的是，與IX-8相比，IX-6也有高出6倍(凝血活性)及2倍(專(zhuān)一活性，即凝血活性/蛋白抗原)的較高活性。比起被注射IX-7及其它突變體的小鼠，在被注射IX-6DNA的小鼠中所發(fā)現(xiàn)的較高第九因子蛋白濃度，并未出現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)系統(tǒng)中，該系統(tǒng)中顯示X-7及IX-6會(huì)被合成至相似濃度。為了進(jìn)一步探究被注射IX-6DNA的小鼠中，血漿第九因子蛋白比起被注射IX-7DNA的小鼠會(huì)有較高濃度的解釋?zhuān)渭?xì)胞內(nèi)及血漿循環(huán)中的第九因子分別被取出并量化。如表5所示，近乎相同數(shù)量的第九因子自被注射IX-6及IX-7DNA的小鼠的肝中被取出(分別為每克肝中1.18及1.36嗎，p=0.43)。這些數(shù)據(jù)顯示被注射IX-6DNA及IX-7DNA的小鼠在肝細(xì)胞中第九因子的表達(dá)相當(dāng)接近。有趣的是，比起被注射IX-7DNA的小鼠，被注射IX-6DNA的小鼠具有統(tǒng)計(jì)上較多的血漿中循環(huán)第九因子(1.5倍的差異，p<0.01，n=7~10)。更重要地是，IX-6DNA小鼠的血漿凝血活性比IX-7DNA處理小鼠高出了15倍(4.88土2.12pg/ml比上0.31士0.15^ig/m1,表5)。表5被高壓注射質(zhì)體的小鼠中的第九因子濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>*高壓傳遞第九因子表達(dá)質(zhì)體至8型血友病小鼠中。通過(guò)6到8秒內(nèi)以高壓方式，自尾靜脈注射2ml的100ngDNA至20(ig的B型血友病公鼠中。之后讓小鼠慢慢復(fù)原，至注射后24小時(shí)處死小鼠，收集血漿以進(jìn)行aPTT凝血分析，及進(jìn)行ELISA測(cè)定蛋白濃度(IX:Ag)。ELISA系統(tǒng)使用來(lái)自ERL(Gafix-AP160)的pAb作為涂布抗體，ERLpAb-HRP(Gafix-HRP)作為檢測(cè)抗體。連續(xù)稀釋正常血漿以得出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。正常血漿中的第九因子濃度假定為5ng/ml。使用假型ssAAV2/8載體的基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)使用病毒載體進(jìn)一步研究IX-6用于基因療法的功效。靜脈注射帶有個(gè)別IX-6及IX-7的重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV2/8)至B型血友病小鼠中，劑量為4xl012vg/kg。注射后2周，由帶有IX-7的rAAV2/8所表達(dá)的血漿第九因子蛋白濃度約為2.3到7.8pg/ml(n=5)(圖3a)。與之相比，由帶有IX-6的rAAV2/8所表達(dá)的第九因子濃度約為1.58到4.23ng/ml(n=6)。該結(jié)果顯示，帶有IX-6的rAAV2/8比起帶有IX-7的rAAV2/8，在小鼠血漿中有較低的第九因子蛋白濃度。相反地，IX-6的專(zhuān)一活性(495±109%)比IX-7的專(zhuān)一活性(94±34%)高上5倍。本發(fā)明也評(píng)估當(dāng)遞送較低劑量的病毒載1110體(分別為4xl0vg/kg及8x10vg/kg)時(shí)，IX-6的效能。如圖3b所示，注射帶有IX-6之rAAV2/8的小鼠，其在兩個(gè)劑量之下的專(zhuān)一活性分別達(dá)到11101236±418%(4x10vg/kg)及l(fā)129±479°/。(8x10vg/kg);至于注射帶有IX-7之rAAV2/8的小鼠，其專(zhuān)一活性分別約為192±24%(4xl0"vg/kg)及10246±116%(8x10vg/kg)。在最低的劑量，其中一只注射IX-6的小鼠具有38%的正常凝血活性，其它4只則都在10%治療濃度以上(或接近)。相反地，注射IX-7的小鼠只有5.6。/。及7.4。/。的正常凝血活性。當(dāng)傾向以注射低劑量的病毒載體治療以減少抗病毒抗體之形成時(shí)，該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了IX-6能作為有效的試劑。從圖4可得知，殘基277位于活化態(tài)第九因子催化區(qū)表面的對(duì)面。根據(jù)浜口等人的研究(HamaguchiN，etal.，blood1994;84:1837-1842)，E277位于第九因子的表面，具有89.2入2的水無(wú)障礙區(qū)(water-accessiblearea)(使用DSSP計(jì)算)，并緊鄰另一個(gè)表面分子D276(具有110.8人2的水無(wú)障礙區(qū))。使用單株抗體基因線(xiàn)狀排列作圖實(shí)驗(yàn)(mappingexperiment)研究位置D276，結(jié)果顯示D276會(huì)被一種抑制活化態(tài)第九因子與活化態(tài)第八因子結(jié)合的抗第九因子抗體"FXC008"識(shí)別，因此成為強(qiáng)烈的抗原表位(FrazierD,etal.,Blood.1989;74:971-977)。再者，E277主鏈的氧被發(fā)現(xiàn)與支鏈的Arg248間會(huì)形成氫鍵，Arg248也是一個(gè)與FXC008結(jié)合有關(guān)的重要?dú)埢?。已知第九因子在結(jié)合至活化態(tài)第八因子之前，需要先進(jìn)行構(gòu)象轉(zhuǎn)變(conformationalchange)并活化成為活化態(tài)第九因子(HamaguchiN,etal.，Biochemistry.1993;32:6324-6329)。因此，因?yàn)榛罨瘎匐牡尼尫哦優(yōu)槿軇┛山佑|的催化區(qū)部分，可能在與活化態(tài)第八因子的結(jié)合上扮演了重要的角色。D276及E277位于在第九因子活化時(shí)會(huì)產(chǎn)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變的區(qū)域是有可能的，他們也可能位于在第九因子活化后，對(duì)重鏈的其它部分的正常構(gòu)象轉(zhuǎn)變具關(guān)鍵性的區(qū)域。因此，F(xiàn)XC008與D276(或E277)的結(jié)合可能會(huì)擾亂在附近或在其它重鏈表面部分所發(fā)生的正常構(gòu)象轉(zhuǎn)變(HamaguchiN,etal.,Biochemistry.1993;32:6324-6329)。擴(kuò)展設(shè)想情境，假定在位置E277進(jìn)行丙氨酸替換可能直接或間接地支持R338位置附近的構(gòu)象。位于D276及/或E277的突變其中任一者可能支持活化態(tài)第九因子在與活化態(tài)第八因子結(jié)合后的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。此外，已推測(cè)出在與活化態(tài)第八因子結(jié)合后活化態(tài)第九因子會(huì)進(jìn)行構(gòu)象轉(zhuǎn)變，因此，活性部位到脂質(zhì)表面的距離會(huì)變得比到第九因子酶原的距離短。已有研究指出，膜結(jié)合酶活性部位中施體染料(donordyes)與位于膜表面的受體染料(acceptordyes)之間的距離，在活化之前與之后會(huì)相差10A以上(MutucumaranaVP,etal.，JBiolChem.1992;267:17012-17021)。要發(fā)生此情形，可以想見(jiàn)構(gòu)象轉(zhuǎn)變可能涵蓋了活化態(tài)第九因子的樞紐區(qū)域(hingeregion)。既然推測(cè)出的活化態(tài)第八因子結(jié)合區(qū)(包含R388)位于E277的對(duì)面，則可以合理地想象整體的轉(zhuǎn)變可能包含潛在的樞紐運(yùn)動(dòng)，將E277推向另一個(gè)方向。去除該位置的電荷可能可以增進(jìn)該運(yùn)動(dòng)，使其更易與活化態(tài)第八因子結(jié)合。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員能很快體會(huì)到本發(fā)明可很容易達(dá)成目標(biāo)，并獲得所提到的結(jié)果及優(yōu)點(diǎn)，以及那些存在于其中的東西。本發(fā)明中的胚胎、動(dòng)物及其制造程序與方法乃較佳實(shí)施例的代表，其為示范性且不僅局限于本發(fā)明領(lǐng)域。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員將會(huì)想到其中可修改之處及其它用途。這些修改都蘊(yùn)含在本發(fā)明的精神中，并在權(quán)利要求范圍中界定。本發(fā)明的內(nèi)容敘述與實(shí)施例均揭示詳細(xì)，得使任何所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員能夠制造及使用本發(fā)明，即使其中有各種不同的改變、修飾、及進(jìn)步之處，仍應(yīng)視為不脫離本發(fā)明的精神及范圍。說(shuō)明書(shū)中提及的所有專(zhuān)利及出版品，都以和發(fā)明有關(guān)領(lǐng)域的公知技術(shù)為準(zhǔn)。所有專(zhuān)利和出版品都在此被納入相同的參考程度，就如同每一個(gè)個(gè)別出版品都被具體且個(gè)別地指出納入?yún)⒖肌Ｔ诖怂m當(dāng)?shù)嘏e例說(shuō)明的發(fā)明，可能得以在缺乏任何要件，或許多要件、限制條件或并非特定為本文中所揭示的限制情況下實(shí)施。所使用的名詞及表達(dá)是作為說(shuō)明書(shū)的描述而非限制，同時(shí)并無(wú)意圖使用這類(lèi)排除任何等同于所示及說(shuō)明之特點(diǎn)或其部分之名詞及表達(dá)，但需認(rèn)清的是，在本發(fā)明的權(quán)利要求內(nèi)有可能出現(xiàn)各種不同的改變。因此，應(yīng)了解到雖然已根據(jù)較佳實(shí)施例及任意的特點(diǎn)來(lái)具體揭示本發(fā)明，但是所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員仍會(huì)修改和改變其中所揭示的內(nèi)容，諸如此類(lèi)的修改和變化仍在本發(fā)明的申請(qǐng)專(zhuān)利范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種重組人類(lèi)第九因子蛋白，其在編碼如SEQIDNo7所示之氨基酸序列的氨基酸殘基上作氨基酸的替換，氨基酸替換位置選自由86、276、277和338所組成的群組，但不包含氨基酸位置338的單一替換。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，其特征在于其中替換的氨基酸選自丙氨酸、天門(mén)冬酰胺、天門(mén)冬氨酸、谷酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸、精氨酸或賴(lài)氨酸。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，其特征在于其中替換的氨基酸是丙氨酸。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQIDNo:1、2、3、4、5或6所示。5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQIDNo:6所示。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，其特征在于其具有高出野生型第九因子蛋白2到14倍的凝血活性。7.根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白，其特征在于其與輔因子活化態(tài)第八因子間有較強(qiáng)的親和力。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，其特征在于其《d值為0.1到0.5nM。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，其特征在于其《M值為32到128nM。10.—種編碼重組人類(lèi)第九因子蛋白的分離核酸，其具有如SEQIDNO:9、10、11、12、13或14所示的核苷酸序列。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的核酸，其特征在于核苷酸序列如SEQIDNo:14所示。12.—種醫(yī)藥組合物，其包含a.—種如權(quán)利要求l所述的人類(lèi)第九因子蛋白；及b.其醫(yī)藥上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。13.—種在體內(nèi)產(chǎn)生如權(quán)利要求1所述的人類(lèi)第九因子蛋白的方法，其包含a.建構(gòu)載體，其攜帶有編碼人類(lèi)第九因子蛋白的核酸；及b.將該載體施予至哺乳動(dòng)物體內(nèi)。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于該哺乳動(dòng)物是人類(lèi)。15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于該核酸具有如SEQIDNO:9、10、11、12、13或14所示的核苷酸序列。16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于通過(guò)載體、質(zhì)體、脂質(zhì)體、DNA注射、電穿孔或基因槍施予。17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于施予的方法是靜脈注射或肝動(dòng)脈灌注。18.—種治療血友病的方法，其包含施予需要該治療的病人一達(dá)有效劑量如權(quán)利要求1所述的蛋白。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于施予的方法是注射。全文摘要本發(fā)明致力于將第九因子轉(zhuǎn)變成更具有活性的分子，以供B型血友病的基因療法或蛋白質(zhì)療法之用。比起重組的野生型第九因子，利用重組技術(shù)在氨基酸位置86、276、277和338作氨基酸替換的第九因子顯示出更佳的凝血活性。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101680024SQ200880001908公開(kāi)日2010年3月24日申請(qǐng)日期2008年1月5日優(yōu)先權(quán)日2007年1月9日發(fā)明者吳華林,施桂月,林佳霓,林淑華申請(qǐng)人:林淑華;吳凱文