專利名稱：：雙鏈斷裂誘餌及其單獨(dú)的用途的制作方法雙鏈斷裂誘餌及其單獨(dú)的用途本發(fā)明涉及干擾哺乳動(dòng)物細(xì)胞中DNA雙鏈斷裂修復(fù)途徑的組合物和方法。因此，本發(fā)明涉及用于治療增生性病癥的組合物和方法。
背景技術(shù)：
：放療法和化療法，單獨(dú)使用或與手術(shù)聯(lián)用，是抗擊人類癌癥的重要治療手段?；熍c放療的結(jié)合被廣泛用于癌癥治療。盡管仍未被完全闡明，細(xì)胞毒素作用的生物學(xué)基礎(chǔ)依賴于細(xì)胞機(jī)制，諸如細(xì)胞周期或DNA損傷，這對(duì)于放射誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡同樣重要，導(dǎo)致癌癥治療中聯(lián)合不同療法的加合甚至更好的協(xié)同效益。最近在生物藥物(單克隆抗體，細(xì)胞因子/激酶抑制劑，免疫療法/疫苗)開發(fā)中的進(jìn)展證明了它們對(duì)腫瘤亞型的有效性和特異性。但它們經(jīng)常與化學(xué)細(xì)胞毒素聯(lián)用。盡管在新型細(xì)胞毒藥物的開發(fā)中取得許多進(jìn)展，對(duì)化療的抗藥性仍然是癌癥治療中主要的臨床顧慮。對(duì)與藥物攝取/流出、代謝性降解、靶誘變、增強(qiáng)的修復(fù)、細(xì)胞死亡(凋亡和壞死)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的抗藥性機(jī)制的了解對(duì)于特別是在某些對(duì)治療有抗性的腫瘤中保證化療的效力和改善治療指標(biāo)是非常必要的。最近十年中，本領(lǐng)域進(jìn)行了許多研究，有人開始描述對(duì)輻射應(yīng)答的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的復(fù)雜性。在這方面，作為電離輻射靶標(biāo)的特定目標(biāo)基因是那些參與調(diào)節(jié)輻射誘導(dǎo)的致死機(jī)制，諸如凋亡或DNA修復(fù)的基因。因?yàn)殡p鏈斷裂(DSBs)是最致命的DNA損傷，當(dāng)DSB修復(fù)效率增加時(shí)，電離輻射的效率降低。DSBs的修復(fù)涉及兩種機(jī)制非同源性末端連接(NHEJ，不依賴于序列的途徑)和同源重組(HR，依賴序列的途徑)(Jackson綜述，2002)。根據(jù)所使用的方法和癌細(xì)胞系，參與這兩種主要DSB修復(fù)途徑的靶基因到目前為止導(dǎo)致較小或中等的放射敏感性(Belenkov等，2002;Marangoni等，2000a;Ohnishi等，1998)。Ku(例如，Ku70和Ku80)和DNA-PKcs蛋白在輻射或化學(xué)誘導(dǎo)的DNADSBs的修復(fù)中非常重要。如果損傷不能被及時(shí)修復(fù)，細(xì)胞死亡。因此，它們代表了用于使靶細(xì)胞和組織對(duì)放射療法和化學(xué)療法致敏的潛在有興趣的分子靶。據(jù)此，已經(jīng)設(shè)想了許多方法并進(jìn)行了嘗試，以抑制這些參與在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中占優(yōu)勢(shì)的NHEJ途徑的關(guān)鍵蛋白(Ku70/Ku80，DNA-PKcs等)1)PI3K抑制劑(磷脂酰肌醇-3-激酶)(即，DNA-PKcs，ATM,ATR)(Bouton等，2000;Durant&Ka薩，2003;Willmore等，2004;Vauger等，2004);2)顯性失活肽(KU80的C-末端)(Marangoni等，2000b;Kim等，2002);3)單鏈抗體可變區(qū)片段(scFv)(DNA-PKcs)(Li等，2003a);4)RNA適體(SELEX:RNA結(jié)合Ku)(Yoo&Dynan，1998);5)反義(Ku70，Ku80，DNA-PKcs)(Li等，2003b;Marangoni等，2000c;Sak等，2002);6)siRNA(DNA-PKcs)(Peng等，2000)。盡管付出了這些巨大努力，但以參與DNA修復(fù)途徑的基因作為耙與癌癥療法的結(jié)合仍處在早期實(shí)驗(yàn)階段，到目前為止還沒有臨床研究顯示任何得到證實(shí)的效果。值得注意的是上述方法具有共同的特征它們靶向于參與具有可能的旁路或補(bǔ)償途徑的復(fù)雜的級(jí)聯(lián)途徑(例如NHEJ)的單個(gè)效應(yīng)子(蛋白)。專利申請(qǐng)WO2005/040378公開了干擾哺乳動(dòng)物細(xì)胞中DNA雙鏈斷裂修復(fù)途徑的組合物和方法。尤其是，其涉及以非基因特異性方式干擾DNA損傷感知、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或修復(fù)途徑的核酸分子，以及它們用于引發(fā)接受抗癌治療的腫瘤的細(xì)胞致死的用途。其描述了利用(化學(xué)修飾或非化學(xué)修飾)短dsDNA分子可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)直接或間接DNA損傷療法的敏感性，所述短dsDNA分子充當(dāng)斷裂DNA片段的模擬物，并被認(rèn)為是DNA損傷性治療誘導(dǎo)的DSB位點(diǎn)(即DSB的模擬底物)。這些分子，還稱作"DSB誘餌"分子(簡稱Dbait)，賦予或增加任意腫瘤細(xì)胞對(duì)DNA損傷癌癥治療性療法(即化療和放療)的敏感性。Dbait分子通過引誘并劫持DNADSB修復(fù)酶的全復(fù)合物(holocomplex)，從而干擾DNA損傷感知、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或修復(fù)過程發(fā)揮作用。因此，本申請(qǐng)涉及結(jié)合能夠直接或間接地造成DNA的DSBs的物理和/或化學(xué)劑的Dbait分子。發(fā)明概述本發(fā)明的發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，在沒有任何直接或間接DNA損傷性治療(即，化療，放療)的情況下，腫瘤細(xì)胞對(duì)單獨(dú)的Dbait分子的存在敏感。如實(shí)施例所示，作為單獨(dú)的癌癥療法，Dbait分子在體外以及體內(nèi)都是有效的。因此，本發(fā)明涉及在沒有任何直接或間接DNA損傷性治療的情況下，核酸分子制備用于治療增生性病癥的藥物中的用途，其中所述核酸分子包括至少16bp、大于24bp、優(yōu)選32bp的雙鏈部分，具有至少一個(gè)游離末端，其中所述分子是被至少一個(gè)Ku蛋白結(jié)合的底物，并能夠活化DNA-PKcs。本發(fā)明還涉及一種治療受試者的增生性病癥的方法，包括給所述受試者施用治療有效量的核酸分子，所述核酸分子包括至少16bp、優(yōu)選32bp的雙鏈部分，具有至少一個(gè)游離末端，是被至少一個(gè)Ku蛋白結(jié)合的底物并且能夠活化DNA-PKcs。本發(fā)明還涉及一種用于評(píng)估本發(fā)明核酸的治療效率的方法，包括確定組蛋白H2AX的磷酸化。8本發(fā)明還涉及一種用于在細(xì)胞和/或組織中增加組蛋白H2AX的磷酸化或活化組蛋白H2AX的方法，包括向所述細(xì)胞和/或組織中導(dǎo)入本發(fā)明的核酸。圖1:源自人腫瘤(Hela,Hep2和M059K)和轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞(MRC5)的各種細(xì)胞系中組蛋白H2AX和磷酸化組蛋白H2AX0-H2AX)的Western印跡。M059J是DNA-PK缺陷型(源自野生型M059K)。AT5BI是ATM缺陷型(源自野生型MRC5)。圖2:用各種Dbait分子轉(zhuǎn)染后5小時(shí)或10Gy照射后l小時(shí)，Hep2細(xì)胞中磷酸化組蛋白H2AX(Y-H2AX)和磷酸化關(guān)卡蛋白Chk2(Chk2-T68p)的水平。圖3:取出的Hep2腫瘤中y-H2AX水平的Western印跡分析。圖4:取出的Hep2腫瘤中，H2AX水平的FASC分析。圖5:裸鼠中Hep2(HNSCC)異種移植物的Kaplan-Meier曲線。圖6:裸鼠中LU1205異種移植物的Kaplan-Meier曲線。圖7:裸鼠中SK28異種移植物的Kaplan-Meier曲線。圖8:Balb/C小鼠中注射Dbait的免疫應(yīng)答。發(fā)明詳述如專利申請(qǐng)WO2005/040378所公開的，Dbait分子是一種新型治療分子，其可以非基因特異性的方式干擾哺乳動(dòng)物細(xì)胞的DNADSB修復(fù)系統(tǒng)。這些新分子，被稱為Dbait分子，是參與NHEJ途徑(不依賴序列的途徑)的蛋白，尤其是Ku和/或DNA-PK蛋白的全復(fù)合物的底物，能夠中和細(xì)胞的DNA修復(fù)能力，從而增加它們對(duì)DNA損傷性治療的敏感性。本發(fā)明還公開了在無DNA損傷性治療的情況下，Dbait分子引發(fā)染色體完整性的關(guān)鍵保障，組蛋白H2AX的磷酸化的能力。H2AX的這種翻譯后修飾由DNA-PK(DNA依賴性激酶)-介導(dǎo)的途徑調(diào)節(jié)，但不依賴于ATM(共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變物)-介導(dǎo)的途徑。H2AX的這種意外/錯(cuò)誤地活化的生物學(xué)后果是DNA雙鏈斷裂(DSB)修復(fù)系統(tǒng)，尤其是非同源性末端連接(NHEJ)途徑的瓦解，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞致死，所述腫瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞具有更高水平的自發(fā)性(復(fù)制錯(cuò)誤)和內(nèi)源性(氧化應(yīng)激)發(fā)生的DSBs。更具體地，本發(fā)明提供以下證據(jù)在沒有任何DNA損傷性治療的情況下，Dbait分子能夠引發(fā)裸鼠中異種移植的人腫瘤的細(xì)胞/組織致死。因此，本發(fā)明涉及這種分子作為單獨(dú)治療劑的用途，尤其用于治療增生性疾病?？梢酝ㄟ^大量特征定義本發(fā)明的Dbait分子，諸如它們的最小長度，至少一個(gè)游離末端的存在，以及雙鏈部分的存在。就如將在下文論述的，Dbait分子的一個(gè)重要特征是它們精確的核苷酸序列基本上不影響它們的活性。此外，Dbait分子可以包含修飾的和/或非天然的骨架。Dbait分子優(yōu)選的是非人類來源的(即，其核苷酸序列和/或構(gòu)象(例如，發(fā)夾)不與在人類細(xì)胞中存在的一樣)，最優(yōu)選是合成來源的。根據(jù)Dbait分子的作用機(jī)制，Dbait分子的序列幾乎不起作用(即使有的話)。因此，與現(xiàn)有技術(shù)中用于基因/蛋白特異性靶向(例如，反義，反基因(antigene)，siRNA，適體，誘餌(decoy)，核酶，等)的分子不同，Dbait分子可以與已知的基因、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、5'-或3'-上游序列、外顯子、內(nèi)含子等具有任一顯著水平的序列同源性或同一性。換句話說，Dbait分子干擾NHEJ途徑的作用是不依賴序列的，Dbait分子與人類基因組的任一基因可以具有低于80。/?；?0Q/。，甚至低于60%或50°/。的序列同一性。這種不依賴序列的作用機(jī)制是Dbait分子的標(biāo)志，其將Dbait分子與其他基因特異性或蛋白特異性(依賴序列的)治療劑諸如反義寡核苷酸，小干擾RNA(siRNA，shRNA和miRNA)，和免疫刺激性CpG寡核苷酸，以及被設(shè)計(jì)成捕獲特定蛋白的適體/誘餌清楚區(qū)分開來。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，Dbait分子的序列與人類核酸序列總的同一性程度低于約80%，70%,65%，60%,55%或50%。確定序列同一性的方法是本領(lǐng)域公知的，包括例如Blast。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，在嚴(yán)格條件下，Dbait分子不與人類基因組DNA雜交。典型的嚴(yán)格條件是能夠?qū)⑼耆パa(bǔ)的核酸與部分互補(bǔ)的核酸區(qū)分開來的條件。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，Dbait分子的序列不含CpG，目的是避免公知的toll樣受體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，如果這種作用是不需要的話。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，具有至少32bp或32bp的雙鏈部分的Dbait分子包括與Dbait32(SEQIDNo1)、Dbait32Ha(SEQIDNo28)、Dbait32Hb(SEQIDNo29)、Dbait32Hc(SEQIDNo30)或Dbait32Hd(SEQIDNo31)相同的核苷酸序列。任選地，Dbait分子具有與Dbait32、Dbait32Ha、Dbait32Hb、Dbait32Hc或Dbait32Hd相同的核苷酸組成，但它們的核苷酸序列是不同的。然后，Dbait分子包括具有3A、6C、12G和11T的雙鏈部分的一條鏈。優(yōu)選地，Dbait分子的序列不包含任何CpG二核苷酸?？紤]到它們的作用機(jī)制，Dbait分子的長度是可以變化的，只要它們足以允許包含Ku和DNA-PKcs蛋白的Ku蛋白復(fù)合物的適當(dāng)結(jié)合。WO2005/040378的實(shí)驗(yàn)部分顯示，Dbait分子的長度必須大于16bp，優(yōu)選為32bp，以確保結(jié)合這種Ku復(fù)合物并允許DNA-PKcs活化。優(yōu)選地，Dbait分子包括16-200bp，更優(yōu)選24-100bp,仍然更優(yōu)選26-100，和最優(yōu)選32-100bp。例如，Dbait分子包括24-160，26-150，28-140，30-120，32-100bp。"bp"旨在表示分子包括指定長度的雙鏈部分。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，雙鏈部分包括Dbait32(SEQIDNo1)、Dbait32Ha(SEQIDNo28)、Dbait32Hb(SEQIDNo29)、Dbait32Hc(SEQIDNo30)或Dbait32Hd(SEQIDNo31)的至少16、18、20、22、24、26、28、30或32個(gè)連續(xù)核苷酸。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，雙鏈部分由Dbait32(SEQIDNo1)、Dbait32Ha(SEQIDNo28)、Dbait32Hb(SEQIDNo29)、Dbait32Hc(SEQIDNo30)或Dbait32Hd(SEQIDNo31)的16、18、20、22、24、26、28、30或32個(gè)連續(xù)核苷酸組成。本發(fā)明的Dbait分子必須具有至少一個(gè)游離末端，作為DSB的模擬物。所述游離末端可以是游離的平末端或5'-/3'-突出末端。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，它們只包含一個(gè)游離末端。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，它們包含兩個(gè)游離末端。因此，本發(fā)明還涉及如下所述的Dbait分子其是具有兩個(gè)游離末端的雙鏈分子，并具有Dbait32(SEQIDNo1)、Dbait32Hads(SEQIDNo28)、Dbait32Hbds(SEQIDNo29)、Dbait32Hcds(SEQIDNo30)或Dbait32Hdds(SEQIDNo31)的核苷酸序列。Dbait分子可以是線性的或，優(yōu)選的，由發(fā)夾雙鏈核酸組成。在這種情況下，環(huán)可以是核酸，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他化學(xué)基團(tuán)，優(yōu)選是接頭諸如六乙二醇或四脫氧胸苷酸(T4)。因此，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，Dbait分子可以是具有雙鏈部分和環(huán)的發(fā)夾分子，所述雙鏈部分包括Dbait32(SEQIDNo1)、Dbait32Ha(SEQIDNo28)、Dbait32Hb(SEQIDNo29)、Dbait32Hc(SEQIDNo30)或Dbait32Hd(SEQIDNo31)的至少16、18、20、22、24、26、28、30或32個(gè)連續(xù)核苷酸，環(huán)是六乙二醇接頭或四脫氧胸苷酸接頭(T4)。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，那些Dbait分子可以具有由Dbait32(SEQIDNo1)、Dbait32Ha(SEQIDNo28)、Dbait32Hb(SEQIDNo29)、Dbait32Hc(SEQIDNo30)或Dbait32Hd(SEQIDNo31)的16、18、20、22、24、26、28、30或32個(gè)連續(xù)核苷酸組成的雙鏈部分。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，Dbait分子如下所述1)當(dāng)與藥學(xué)上可接受的載體/賦形劑一起使用時(shí)，雙鏈Dbait分子能夠被細(xì)胞/組織體攝入到細(xì)胞核中；2)Dbait分子的至少一個(gè)游離末端可被參與DSB損傷感知、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或修復(fù)過程的酶的全復(fù)合物識(shí)別；以及，3)Dbait分子的至少一個(gè)游離末端可被所述復(fù)合物整合到腫瘤細(xì)胞的基因組DNA中。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)諸如環(huán)和/或骨架，Dbait分子具有不能復(fù)制的結(jié)構(gòu)。在這方面，本發(fā)明的Dbait分子可僅僅具有或主要(超過50%)具有天然的磷酸二酯骨架或化學(xué)修飾的磷酸二酯骨架，或具有化學(xué)基團(tuán)或化學(xué)基團(tuán)混合物的另一種骨架，前提是所述修飾的dsDNA仍然是參與NHEJ途徑，尤其是Ku和DNA-PKcs蛋白，以及DSB損傷感知或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的全復(fù)合物的底物。有利地，化學(xué)修飾的目的在于，如果發(fā)生基因組整合，為Dbait分子賦予化學(xué)穩(wěn)定性和/或防止它們的進(jìn)一步復(fù)制(誘變效應(yīng)的可能原因)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，Dbait分子包括2'-脫氧核苷酸骨架，任選的包括一個(gè)或數(shù)個(gè)(2、3、4、5或6個(gè))除了腺嘌呤、胞嘧啶、13鳥嘌呤和胸腺嘧啶以外的修飾核苷酸和/或核酸堿基。因此，Dbait分子基本上是DNA結(jié)構(gòu)。也可以具有糖模擬物諸如2'-0-烷基核糖，2'-0-垸基-C4'支鏈核糖，環(huán)丁基或其他碳環(huán)或己糖醇來代替呋喃戊糖基。優(yōu)選的Dbait在一條鏈或每條鏈的末端包括一個(gè)或數(shù)個(gè)化學(xué)修飾的核苷酸或基團(tuán)。在一個(gè)具體的優(yōu)選實(shí)施方案中，Dbait分子的游離末端受到一條鏈或每條鏈末端的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)修飾的磷酸二酯骨架的保護(hù)。優(yōu)選的化學(xué)基團(tuán)，尤其是修飾的磷酸二酯骨架包括硫代磷酸酯?；蛘?，優(yōu)選的Dbait具有3'-3'核苷酸鍵，或具有甲基膦酸酯骨架的核苷酸。本發(fā)明其他修飾的骨架包括氨基磷酸酯，嗎啉代核酸，2'-0，4'-C亞甲基/亞乙基橋連的鎖核酸，肽核酸(PNA)，和短鏈垸基，或長度可變的環(huán)烷基糖間鍵或短鏈雜原子或雜環(huán)糖內(nèi)鍵，或技術(shù)人員已知的任何修飾的核苷酸。美國專利5,677,437描述了雜芳香寡核苷酸鍵。氮接頭或含氮基團(tuán)也可用于制備寡核苷酸模擬物(美國專利5，792，844和5,783,682)。美國專利5,637,684描述了氨基磷酸酯和硫代氨基磷酸酯(phosphorothioamidate)寡聚化合物。還預(yù)見了具有嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸(美國專利5,034,506)。在其他實(shí)施方案中，諸如寡核苷酸的肽核酸(PNA)骨架、磷酸二酯骨架可以被聚酰胺骨架取代，堿基直接或間接地結(jié)合到聚酰胺骨架的氮雜氮原子上。其他合成的寡核苷酸可以包含取代的糖部分，所述糖部分在2'位置包括下列基團(tuán)中的一個(gè)OH，SH，OCH3，SCH3，F(xiàn)，OCN，OCH2CH2OCH3，0(CH2)nNH2或0(CH2)nCH3，其中n是l到約10;Cl到C10的低級(jí)垸基、取代的低級(jí)烷基、烷芳基或芳垸基；Cl;Br;CN;CF3;OCF3.;O-S-;或N-烷基；O-,S-,或N-鏈烯基；SOCH3;S02CH3;ONO;NO;N3。Dbait分子可以包括至少一個(gè)嵌入元件(embeddedelement)，其阻礙DNA復(fù)制、DNA修復(fù)或阻礙損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。所述嵌入元件可以整合到雙鏈片段的內(nèi)部位置(例如，在中心)或末端。它(它們)可以包括a)不能用作DNA復(fù)制模板的單元，諸如聚乙二醇鏈，優(yōu)選六乙二醇鏈，或任何烴鏈，最終被一個(gè)或多個(gè)雜原子例如氧、硫、氮或包括一個(gè)或多個(gè)雜原子的雜原子或雜環(huán)基團(tuán)所阻斷和/或取代；b)作為阻斷元件的單元，因?yàn)槠洳皇蹹NA聚合酶或核酸外切酶的作用，諸如任何3'-修飾的核苷酸，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他核苷酸；c)天然的寡核苷酸，諸如Tn，當(dāng)用于發(fā)夾片段的環(huán)中時(shí)，諸如四脫氧胸苷酸(T4)。所述鏈通過化學(xué)合成、半生物合成或生物合成，任何擴(kuò)增方法，然后是任意提取和制備方法及任意化學(xué)修飾進(jìn)行制備。如專利申請(qǐng)WO2005/040378所公開，可以按照例如實(shí)施例2和3描述的體外和基于培養(yǎng)細(xì)胞的分析，和/或也可以按照例如實(shí)施例4和5描述的體內(nèi)分析，評(píng)估Dbait分子的生物活性。最容易和最相關(guān)的分析是依賴DNA的蛋白激酶活性分析(參見實(shí)施例2，圖1.4)。到目前為止這種簡單的分析已被用于預(yù)測(cè)Dbait分子的體內(nèi)活性。但是，其他基于培養(yǎng)細(xì)胞的分析，諸如輻射增強(qiáng)的非常規(guī)整合(illegitimateintegration)的抑制分析也是相關(guān)的(參見實(shí)施例3，圖2.3&圖2.4)。實(shí)際上，本發(fā)明的Dbait分子必須能夠活化DNA-PK。在一個(gè)實(shí)施方案中，Dbait分子還能夠抑制輻射增強(qiáng)的非常規(guī)DNA整合。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，例如通過凝膠遷移分析確定的Dbait分子在體外結(jié)合Ku復(fù)合物。這種Ku復(fù)合物包括一個(gè)或數(shù)個(gè)Ku蛋白與至少一個(gè)DNA-PKc蛋白的組合。在一個(gè)進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，優(yōu)選的通過利用藥學(xué)上可接受的載體/賦形劑，本發(fā)明的Dbait分子滲入細(xì)胞核中。最優(yōu)選的本發(fā)明Dbait分子組合了上述特性中的數(shù)個(gè)或全部。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，Dbait分子是化學(xué)修飾的Dbait分子，如上述定義及人類治療中其他實(shí)踐的Dbait分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，Dbait分子不是化學(xué)修飾的，并對(duì)應(yīng)于天然的核酸片段，但顯示化學(xué)修飾片段的特征，尤其是具有根據(jù)所述化學(xué)修飾的Dbait分子限定的堿基對(duì)的數(shù)目和特性。本發(fā)明涉及說明書中公開的任意Dbait分子的用途。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，Dbait分子選自Dbait32(SEQIDNo1)、Dbait32H-po(SEQIDNo3)、Dbait32H(SEQIDNo4)、Dbait32-T4(SEQIDNo2)、Dbait32Hc-5，5，(SEQIDNo14)、Dbait32-NH2(SEQIDNo15)、Dbait32H-FITC(SEQIDNo21)、Dbait32H-Cy3(SEQIDNo22)、Dbait32H-Biot(SEQIDNo23)、Dbait32Ha(SEQIDNo8)、Dbait32Hb(SEQIDNo9)、Dbait32Hc(SEQIDNo10)、Dbait32Hd(SEQIDNo11)、Dbait32Hc-3，mp(SEQIDNo12)、Dbait32Hc-5，3，mp(SEQIDNo13)、Dbait32Hc-Cy3(SEQIDNo25)、Dbait32Hc-Cy5(SEQIDNo26)、Dbait32Hd-FITC(SEQIDNo27)、Dbait32Hads(SEQIDNo28)、Dbait32Hbds(SEQIDNo29)、Dbait32Hcds(SEQIDNo30)、Dbait32Hdds(SEQIDNo31)、Dbait64(SEQIDNo19)和Dbait64L(SEQIDNo20)。還可以使用其組合。因此，本發(fā)明涉及一種在沒有任何直接或間接DNA損傷性治療(即，化療和放療)的情況下治療增生性病癥的方法，包括向患有增生性病癥的細(xì)胞和/或組織中導(dǎo)入如上定義的Dbait分子；從而誘導(dǎo)所述細(xì)胞和/或組織的細(xì)胞致死。本發(fā)明還涉及一種在細(xì)胞和/或組織中增加組蛋白H2AX的磷酸化或活化組蛋白H2AX的方法，包括向所述細(xì)胞和/或組織中導(dǎo)入如上定義的Dbait分子，從而增加組蛋白H2AX的磷酸化和活化組蛋白H2AX。組蛋白H2AX是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的蛋白。Swiss-Prot中的參考號(hào)是P16104,Unigene是Hs477879。磷酸化在Ser-139上進(jìn)行(Li等，2005，綜述)。本發(fā)明涉及一種在沒有任何直接或間接DNA損傷性治療的情況下誘導(dǎo)患有增生性病癥的細(xì)胞和/或組織的細(xì)胞致死的方法，包括向所述細(xì)胞和/或組織中導(dǎo)入如上定義的Dbait分子；從而誘導(dǎo)所述細(xì)胞和/或組織的細(xì)胞致死。在上述方法的一個(gè)具體實(shí)施方案中，在所述導(dǎo)入步驟中使用轉(zhuǎn)染劑。例如，轉(zhuǎn)染劑可以選自PEI(US6，013，240)，S叩erfect(Qiagene)，陽離子脂質(zhì)諸如Lipofectin(Invitrogen)。在本發(fā)明的方法和用途中，使用有效量的Dbait分子。尤其是，Dbait分子的量使該分子到達(dá)被治療細(xì)胞的細(xì)胞核。此外，所述量足以活化DNA-PK,以及增加組蛋白H2AX的磷酸化并活化組蛋白H2AX。本發(fā)明涉及Dbait分子在制備藥物中的用途，所述藥物用于在沒有任何直接或間接的DNA損傷性治療的情況下治療增生性病癥。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述Dbait分子包括至少16、18、20、22、24、26、28或30bp的雙鏈部分，優(yōu)選32bp，具有至少一個(gè)游離末端，其中所述Dbait分子是被至少一個(gè)Ku蛋白結(jié)合的底物并能夠活化DNA-PKcs。Dbait分子基本上是DNA。本發(fā)明還涉及一種在沒有任何直接或間接的DNA損傷性治療的情況下治療受試者的增生性病癥的方法，包括給所述受試者施用治療有效量的Dbait分子。尤其是，本發(fā)明涉及一種在沒有任何直接或間接的DNA損傷性治17療(即，化療和放療)的情況下增加患有癌癥的受試者的存活時(shí)間的方法，包括給所述受試者施用治療有效量的如上定義的Dbait分子；從而增加所述受試者的存活時(shí)間。受試者可以是哺乳動(dòng)物或人。優(yōu)選的，受試者是人。通常，"哺乳動(dòng)物"是指被劃分為哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物，包括實(shí)驗(yàn)室、家養(yǎng)、農(nóng)場(chǎng)和動(dòng)物園動(dòng)物，具體為寵物動(dòng)物，諸如小鼠，大鼠，兔，豬，綿羊，山羊，牛，馬和更高級(jí)的靈長類動(dòng)物。這種方法涉及一種新型治療劑，所述治療劑可用于治療由不受控制的細(xì)胞增殖尤其是癌癥引起的疾病。盡管Dbait主要旨在作為常規(guī)DNA損傷性治療的替代物用于抗癌治療，它也可用于非惡性疾病的抗增殖治療，諸如與過高細(xì)胞分裂率(增殖)相關(guān)的疾病，例如銀屑病或狹窄(stenosise)/再狹窄(restenosis)。已經(jīng)通過在早期階段向斑馬魚胚胎細(xì)胞注射Dbait分子來評(píng)估抗增殖活性。Dbait分子特異性殺傷快速分裂的內(nèi)部細(xì)胞，而對(duì)分裂緩慢的外周細(xì)胞幾乎沒有影響。本發(fā)明可以被用作哺乳動(dòng)物受試者(尤其是人類受試者)中各種類型癌癥的單獨(dú)的癌癥療法，諸如實(shí)體癌和白血病，尤其是放射或化學(xué)抗性的癌癥。相關(guān)的器官或區(qū)域可以是肺和支氣管，頭和頸，腦，胃腸道，胰腺，肝，結(jié)腸直腸癌，泌尿生殖道，婦科器官，乳腺，內(nèi)分泌腺，皮膚，視網(wǎng)膜，CNS，血液學(xué)器官，已知或不明原發(fā)部位的轉(zhuǎn)移瘤，和殘遺物(例如胸腺)。組織學(xué)本質(zhì)可以是上皮的，鱗狀細(xì)胞癌，腺癌，移行癌，成纖維細(xì)胞/成血管細(xì)胞來源的(肉瘤)，神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)來源的，內(nèi)分泌腺的，類癌，胃腸道間質(zhì)的，內(nèi)皮的，造血的，和胚胎的。優(yōu)選的，癌癥選自惡性膠質(zhì)瘤，頭頸癌，結(jié)腸癌，肝癌，肺癌，皮膚癌，乳腺癌和宮頸癌。Dbait分子可以與合適的可接受的載體/賦形劑一起，通過任意合適的途徑施用，諸如口服或靜脈內(nèi)或腫瘤內(nèi)施用，或皮下注射或局部施用或其他途徑。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，轉(zhuǎn)染劑與Dbait分子聯(lián)用。根據(jù)體內(nèi)研究使用的方案，本發(fā)明提供了建立使用Dbait分子的臨床方案的合理性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使其輕易地適合于人，尤其取決于患者的重量/體表。本發(fā)明的組合物包括將被導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核的有效量的Dbait分子。例如，當(dāng)使用腫瘤內(nèi)施用時(shí)，所述有效量至少為0.1mg每1cm3腫瘤，優(yōu)選0.6mg每1cm3腫瘤，最優(yōu)選的1mg每1cm3腫瘤。所述有效量可按每日治療方案施用(例如，每周5天連續(xù)3周或每周3次連續(xù)5周)?；蛘?，以下有效量可以按例如每周的治療方案連續(xù)5周進(jìn)行施用至少0.3mg每1cm3腫瘤，優(yōu)選1.8mg每1cm3腫瘤，最優(yōu)選3mg每1cr^腫瘤。當(dāng)使用其他給藥途經(jīng)時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以改變所述量以在腫瘤中獲得尤其是按照每日的治療方案以下有效量的Dbait分子至少O.lmg每lcm3腫瘤，優(yōu)選0.6mg每1cni3月中瘤，最優(yōu)選1mg每1cn^腫瘤；或尤其是按照每周的治療方案，至少0.3mg每1cm3月中瘤，優(yōu)選1.8mg每1cm3腫瘤，最優(yōu)選3mg每lcm3腫瘤。此外，本發(fā)明還涉及作為增生性病癥(例如，癌癥)治療效率的標(biāo)記物的組蛋白H2AX，尤其是本文描述的Dbait分子。然后，本發(fā)明涉及一種用于評(píng)估Dbait分子的治療效率的方法，包括測(cè)定組蛋白H2AX的磷酸化率。例如可以按照實(shí)施例中的描述檢測(cè)組蛋白H2AX的磷酸化。與未經(jīng)任何治療的磷酸化水平相比更高的組蛋白H2AX磷酸化水平指示治療效率。尤其是，所述方法包括，給受試者施用Dbait分子，測(cè)定組蛋白H2AX的磷酸化水平，并比較經(jīng)歷和未經(jīng)歷任何Dbait分子治療的組蛋白H2AX的被測(cè)磷酸化水平。在任意治療前特定腫瘤中磷酸化組蛋白H2AX的組成型高水平還是Dbait單獨(dú)療法對(duì)該腫瘤效果的良好標(biāo)記物。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將參考附圖和表格，在下列實(shí)施例中給出。實(shí)施例盡管專利申請(qǐng)WO2005/040378中完整描述了Dbaits分子，為了清楚起見，Dbait分子的設(shè)計(jì)、合成和制備概述于實(shí)施例1。實(shí)施例2顯示了對(duì)誘導(dǎo)H2AX磷酸化的能力的分子和細(xì)胞研究，以及DNA-PKcs參與和ATM介導(dǎo)途徑的未參與的證明。實(shí)施例3描述了對(duì)裸鼠中異種移植的人腫瘤的體內(nèi)分析，該分析顯示腫瘤消退和延長的生存。實(shí)施例1:Dbait分子的設(shè)計(jì)、合成和制備。設(shè)計(jì)兩種類型的Dbait分子線性或發(fā)夾dsDNA片段。對(duì)于發(fā)夾Dbait分子來說，六乙二醇接頭或四脫氧胸苷酸被用作環(huán)。dsDNA莖的末端可通過整合硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或3'-3'核苷酸鍵保護(hù)其不被3'-核酸外切酶化學(xué)降解。原則上，可以使用其他化學(xué)修飾，只要它們適合Ku70/Ku80結(jié)合和DNA-PKes活化(Martensson&Hammarten，2002)。合成并分析各種莖長8bp(Dbait8H)、16bp(Dbaitl6H)、24bp(Dbait24H)和32bp(Dbait32H)的不同Dbait分子，以及具有類似的GC/AT含量的不同莖序列(Dbait32H，Dbait32Ha,Dbait32Hb，Dbait32Hc和Dbait32Hd)。需要注意Dbait32Hc中CpG序列的缺失。還設(shè)計(jì)啞鈴形dsDNA片段(Dbait32C)作為對(duì)照，所述片段的兩個(gè)末端被兩個(gè)六乙烯環(huán)密封。一些Dbait分子經(jīng)熒光素(Dbait32H-FITC)、花菁3(Dbait32H-Cy3)、花菁5(Dbait32Hc-Cy5)或生物素(Dbait32H-Biot)標(biāo)記的T標(biāo)記。表1、2和3概述了本研究中使用的Dbait分子的序列和化學(xué)結(jié)構(gòu)。序列表中按照下列參考號(hào)公開了Dbait分子Dbait32(SEQIDNo1)、Dbait32-T4(SEQIDNo2)、Dbait32H-po(SEQIDNo3)、Dbait32H(SEQIDNo4)、Dbait24H(SEQIDNo5)、Dbaitl6H(SEQIDNo6)、Dbait8H(SEQIDNo7)、Dbait32Ha(SEQIDNo8)、Dbait32Hb(SEQIDNo9)、Dbait32Hc(SEQIDNo10)、Dbait32Hd(SEQIDNo11)、Dbait32Hc-3，mp(SEQIDNo12)、Dbait32Hc-5，3，mp(SEQIDNo13)、Dbait32Hc-5，5，(SEQIDNo14)、Dbait32-NH2(SEQIDNo15)、Dbait32C(SEQIDNo16)、Dbait32ss(SEQIDNo17)、Dbait32Hcss-po(SEQIDNo18)、Dbait32Hads(SEQIDNo28)、Dbait32Hbds(SEQIDNo29)、Dbait32Hcds(SEQIDNo30)、Dbait32Hdds(SEQIDNo31)、Dbait32H-FITC(SEQIDNo21)、Dbait32H-Cy3(SEQIDNo22)、Dbait32H-Biot(SEQIDNo23)、Dbait32Hc畫Cy3(SEQIDNo25)、Dbait32Hc隱Cy5(SEQIDNo26)、Dbait32Hd-FITC(SEQIDNo27)、Dbait64(SEQIDNo19)禾口Dbait64L(SEQIDNo20)。Dbait分子序列和化學(xué)結(jié)構(gòu)Dbait32Dba舊2-T4Dbait32H-poDbai訓(xùn)Dbai訓(xùn)Dbait1SHDbai份HDbait32HaDbait32HbDbait32HcDbai訓(xùn)dDbait32aDbait32bDbait32cDbait32dDbait32Hc-3'mpDbait32Hc-53'mpDbait32Hc-55'Dbail32-NH2Dba汰32CDbait32ssDbait32Hcss-po'ACGCACGGGTGTTCGGTCGTTTGTTCGGATCT3''TGCGTGCCCACAACCCAGCJUUCJUGCCTAGR5,'ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCTTGCGTGCCCACAACCCAGCAAACMGCCTAGAACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT3'TGCGTGCCCAOLACCCAGCAAACMGCCTAGA55'ACGCACGGGTGTTGGGTCG丁TTCTTCGGATCT33'TGCGTGCCCACAACCCAGCAAACMGCCTAGA55'ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGT3'飛3'TGCGTGCCCJLCJUCCCAGOUACA5'J》5'ACGCACGGGTGTTGGG33'TGCCTGCCCACAACCC5:〕'ACGCACGG3:〕3J3fGCATCCJLGACJIAACCACCGAAACGTCJU:CGTG5'rTGCGTCCC5'rCGTJU5GTCTCTTTGCTGGCTTTGCJLGTGGCAC3'5'GCTAGGCTTCTTTGCTGGGTTCTAGGCJICJIGC3'3'CGATCCGAACAJULCGACCCUCATCCGTGTCG5'5'GCTCTGCCCJLCJUCCCAGCJIAACAAGCCTAGA3'3'CGACACGGGTGTTGGGTCGTTTCTTCGGATCT5'5'GCTAGCTCTGTTTGGTCGCTTTGCAGTGGCAC3'3'CGATCCAGACAJUCCACCGAAACGTCACCGTC5'5'CGTAGGTCTCTTTGGTCGCTTTGCAGTGGCAC3'3'GCATCCAGACJUUlCCACCGJUUCGTCJICCGTG5z51GCTAGGCTTGTTTGCTGGGTTGTJIGGCJICAGC3'3'CGATCCGMCAAACGACCCJUCATCCGTCTCWGCTGTGCCCACJUCCCJLGCJUACAAGCCTAGa3'3'CGACACGGGTGTTCGGTCGTTTGTTCGGATCTSz5'GCTAGGTCTCTTTGGTGGCTTTCCAGTGGCAC3'3'CGaTCCAGACJlMCCACCGAAJlCGTCJlCCGTG5'5'GCTGTCCCCACAJICCCAGCAAACJULGCCTJLGA33zc諷CACGGCTGTTGGGTCGTTTCTTCGGJlTCT5〕〕5'gctGTCCCCACMCCCAGCMACAAGCCTAGA3'、3'c諷CACGGGTCTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT5'j)5'GCTAGGCTTGTTTGCTGGGTTCTAGGCACilGC3'C3'—3'GATCCGJULCJUACGACCCAACATCCGTGTCG55'ACGCACGGGTCTTCGGTCGTTTGTTCGGATCT3'-叫3'TGCGTCCCCACJLACCCAGCAAACAAGCCTAG'-NH,c:5zACGCACGGGTCTTGGGTCGTTTCTTCGGATCT33'TGCGTGCCCACAACCCAGCJUACJUGCCTJIGAS5'ACGCJLCGGGTCTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT—35'GCTGTCCCCACJUCCCJlGCAJULCJUGCCTAGA3'表1.1:Dbait分子的序列和化學(xué)結(jié)構(gòu)。大寫字母是具有磷酸二酯骨架的核苷酸。粗體大寫字母是具有硫代磷酸酯骨架的核苷酸。半環(huán)實(shí)線代表六乙二醇接頭。Dbait32-T4含有4個(gè)胸腺嘧啶(丁4)作為接頭，代替六乙二醇接頭。Dbait32C是啞鈴形(閉合)分子。Dbait32Hc-5'5'來源于Dbait32Hc，其中3'-3'鍵被引入3'末端前，因此只呈現(xiàn)兩個(gè)5'-末丄山頓0Dbait分子序列和化學(xué)結(jié)構(gòu)Dbait32-FITDbait32-Cy3Dbait32-BiotDba肪H-Cy3Dbait32H-Cy3Dbait32H-Cy5Dbait32H-FI丁5'ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGAlfl'^3'TGCGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA&"^:-fluorescein(FITC),cyanine3(Cy3)orBio^taggedT3'CGAZACGt5」t=cyanine3taggedT5'GCTCTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA3'CGACACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGAM'乂t=cyanine3(Cy3)orCyanine5-taggedT5'GCmGGTCTGTTTGGTGGCTTTGCAGTGGCAC3~^3'CGarCCAGACAAACCACCGAAACGTCACGKE5'〉亡=fluorescein(FITC-taggedT表1.2:如指示的各種標(biāo)記Dbait分子的序列和化學(xué)結(jié)構(gòu)。Dbait分子序列和化學(xué)結(jié)構(gòu)Dbait645'acgcacgggtgttgggtcgtttgttcggatctacgcacggtcgtttgttcggtgttggcgatct3'3，tgcgtgcccacaacccagcaaacaagcctagatgcgtgccagcaaacaagccacaaccgctaga5'Dbait64L5'acgcacgggtgttgggtcgtttgttcggatct-acgcacggtcgtttgttcggtgttggcgatct33'tgcgtgcccacaacccagcaaacaagcctaga——tgcgtgccagcaaacaagccacmccgctaga5'表1.3:64-bpDbait64和Dbait64L分子的序列和化學(xué)結(jié)構(gòu)。大寫字母是具有磷酸二酯骨架的核苷酸。粗體大寫字母是具有硫代磷酸酯骨架的核苷酸。實(shí)線代表六乙二醇接頭。所有Dbait分子通過自動(dòng)化固相寡核苷酸合成(Eurogentec,Belgium)來制備。它們通過變性反相HPLC進(jìn)行純化。變性毛細(xì)管凝膠電泳、MALDI-TOF/LC-MS被用于質(zhì)量控制。超過85%或90%的寡核苷酸是全長的。在運(yùn)輸之前所有樣品都被凍干。一經(jīng)接收，將所有樣品都溶于雙蒸水。變性條件(6(TC-9(TC，取決于Dbait分子的熱穩(wěn)定性)下260nm處的吸光度計(jì)算Dbait分子的濃度(Cantor等，1970)。通過特定染料相應(yīng)波長處的吸光度計(jì)算熒光染料標(biāo)記的Dbait分子的濃度(490nm處FITC:s=80000M".cm";550nm處Cy3:￡=150000M".cm";650nm處Cy5:s=250000M".cm國1)。將具有六乙二醇接頭和3'-突出及互補(bǔ)末端的兩半發(fā)夾退火，并通過DNAT4連接酶(BioLabs)連接，制備啞鈴形dsDNA片段(Dbait32C)?；趯?duì)熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)的考慮，根據(jù)它們的分子性狀，使用下列方案制備Dbait分子的樣品-對(duì)于雙分子的Dbait分子(Dbait32、Dbait32-NH2、Dbait64和Dbait64L):溶于雙蒸水的每條鏈的1:1母液(優(yōu)選在高濃度)的混合物必須在90'C加熱5分鐘以便每條鏈完全變性。通過平穩(wěn)的恢復(fù)到室溫(樣品通常置于水浴中)進(jìn)行退火，并將產(chǎn)生的雙鏈分子等分量保存于-20。C。-對(duì)于單分子Dbait分子(發(fā)夾)溶于雙蒸水的含有200pM發(fā)夾Dbait分子的溶液必須在卯'C加熱5分鐘以便完全變性。必須通過將樣品置于冰水((TC)冷卻進(jìn)行退火。等分量保存于-2(TC。實(shí)施例2:Dbait分子本身的分子和細(xì)胞生物活性。專利申請(qǐng)WO2005/040378提供了以下證據(jù)，在存在細(xì)胞粗提物而沒有任何DNA損傷性治療的情況下1)Dbait分子是參與NHEJ途徑第一步的Ku蛋白的誘餌；2)Dbait分子是DNA末端連接反應(yīng)的競爭物，但不取代結(jié)合的復(fù)合物。Ku蛋白的募集是前提；3)32-bp長的Dbait分子能夠活化DNA-PK。一種簡單的無細(xì)胞DNA-PK活性分析表明，激酶活化只需要所述長度(約32-bp)和具有Dbait分子游離末端的雙鏈DNA，在一定程度上與它們的序列和化學(xué)修飾無關(guān)。這與NHEJ途徑，一種不依賴序列的DNA末端連接機(jī)制，中DNA-PKcs的參與一致。本發(fā)明人己經(jīng)進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來評(píng)估在沒有任何DNA損傷性治療的情況下Dbait分子是否有生物學(xué)效果。出人意料的發(fā)現(xiàn)，Dbait分子的存在誘導(dǎo)組蛋白變體H2AX的磷酸化，H2AX被稱為基因組完整性的保障，因?yàn)镠2AX的磷酸化形式，y-H2AX在DSB位點(diǎn)形成焦點(diǎn)(foci)并引發(fā)下游DNA修復(fù)。通過western印跡和FACS分析培養(yǎng)的細(xì)胞中或從Dbait32Hc治療的腫瘤收集的細(xì)胞中y-H2AX的程度。在裸鼠的3種異種移植的人腫瘤中觀察到體內(nèi)顯著的腫瘤消退。動(dòng)物研究使用建立的人類細(xì)胞系Hep2(頭頸鱗狀細(xì)胞癌，HNSCC)、LU1205和SK28(黑素瘤)。利用Hep2、HeLaS3(上皮宮頸癌)、M059K和M059J(惡性膠質(zhì)瘤)，MRC5和AT5BI(成纖維細(xì)胞)進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞的研究。在100%濕度、95°/?？諝夂?°/。C02條件下，細(xì)胞在含有10。/。熱滅活的胎牛血清(FBS;Invitrogen，CergyPontoise，法國)和抗生素(IOO嗎/ml鏈霉素和100jig/ml青霉素)的完全DMEM的單層培養(yǎng)物中37T:生長。LU1205在含有4n/。熱滅活FBS、1°/。谷氨酰胺和抗生素(IOOpg/tnl鏈霉素和100(ig/ml青霉素)的MCDB中生長。收集6孔板中指數(shù)生長的細(xì)胞，將其與700ml完全DMEM孵育，所述完全DMEM含有Dbait分子和Superfect試齊lJ(Qiagen，Courtaboeuf，法國)的混合物，其比例為每figDNA，10plSuperfect。在標(biāo)準(zhǔn)條件下37°C5小時(shí)后，用PBS清洗細(xì)胞，并添加完全DMEM。為了進(jìn)行Western印跡分析，細(xì)胞在5cm直徑的培養(yǎng)皿中生長，按照制造商的說明書用Superfect(Qiagene)轉(zhuǎn)染2figDbait32Hc分子，然后在培養(yǎng)基中于37'C靜置不同時(shí)間。在標(biāo)準(zhǔn)條件下37'C5小時(shí)后，用PBS清洗細(xì)胞3次，并添加完全DMEM。細(xì)胞再孵育l小時(shí)，清洗3次并用Laemmli緩沖液裂解。蛋白被轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上，該硝化纖維素膜用5%脫脂乳封閉(1小時(shí))，然后與在lxPBS，1%BSA中1/100稀釋的抗-H2AX(Ce11SignalingTechnology,Denver,USA)禾卩小鼠抗磷酸組蛋白H2AX(Serl39)(Upstate，Tempcula,CA,USA)、兔單克隆抗磷酸Thr68-Chk2抗體(CellSignalingTechnology,Denver,USA)溫育過夜。印跡然后與在TBST中1/5000稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG二抗(P0448,Dako)溫育。蛋白抗體復(fù)合物在hyperfilm(Amersham)上顯示，并用ImageJ(Publicdomain)定量。為了通過y-H2AX的FACS進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，細(xì)胞在5cm直徑的培養(yǎng)皿中生長，按照制造商的說明書用Superfect(Qiagene)轉(zhuǎn)染2^gDbait32Hc分子，然后在培養(yǎng)基中于37'C靜置不同時(shí)間。在3次清洗循環(huán)后，細(xì)胞用2%PFA固定10分鐘。再清洗一次后，利用在lxPBS,1%BSA中1/100稀釋的兔抗？H2AX抗體(4411-PC，Trevigen)檢測(cè)Y墨H2AX的存在。細(xì)胞用lxPBS，0.5%TritonX-100清洗3次，然后在室溫下與在lxPBS，1%BSA中1/100稀釋的若丹明偶聯(lián)的山羊抗兔抗體溫育1小時(shí)。通過FACScan流式細(xì)胞儀(FACSalibur，Beckton-Dickinson,USA)分析細(xì)胞。因?yàn)镈bait32H/Dbait32Hc活化粗提物中DNA-PKcs的激酶活性，本發(fā)明人想知道它是否將誘導(dǎo)活細(xì)胞中DNA-PKcs的下游靶的磷酸化。因此本發(fā)明人分析了Dbait32Hc轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中H2AX的磷酸化(Chowdhury等，2000;Paull等，2000)。圖1顯示Dbait32Hc轉(zhuǎn)染極大刺激了所有DNA-PKcs感受態(tài)腫瘤細(xì)胞系(Hek,Hep2，M059K和轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞系MRC5)中H2AX的磷酸化。但是，在DNA-PKcs缺陷腫瘤細(xì)胞系(源自M059K的M059J)中未觀察到H2AX的磷酸化，而在DNA-PKcs感受態(tài)但ATM-缺陷的轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞系(源自MRC5的AT5BI)中存在H2AX的磷酸化。這表明，在體外，依賴Dbait的激酶活化是與細(xì)胞系起源無關(guān)的普遍過程。H2AX的磷酸化取決于DNA-PKcs的狀態(tài)，但與ATM的狀態(tài)無關(guān)。Y-H2AX的高水平持續(xù)直至24-48小時(shí)。圖2顯示用各種Dbait分子轉(zhuǎn)染后5小時(shí)和無Dbait32Hc轉(zhuǎn)染的10Gy照射后1小時(shí)，Hep2細(xì)胞中H2AX的磷酸化形式的水平及在Thr68被ATM磷酸化的關(guān)卡蛋白Chk2(Chk2-T68p)的水平。只在Dbait32Hc轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中觀察到y(tǒng)-H2AX的高水平。在Dbait32Hc轉(zhuǎn)染細(xì)胞中這種水平高于在輻射過的細(xì)胞中。相反，Chk2-T68p的水平在Dbait32Hc轉(zhuǎn)染細(xì)胞中增加很少，而在輻射過的細(xì)胞中要高得多。這些結(jié)果證明Dbait32Hc不活化激酶ATM。圖3顯示從接受60pgDbait32Hc治療(腫瘤內(nèi)注射，用PEI作為轉(zhuǎn)染劑)的Hep2腫瘤收集的細(xì)胞中y-H2AX的水平，并與未治療的Hep2腫瘤中的背景水平比較。治療后24小時(shí)取出腫瘤，將其在液氮中冷凍，并保存于-80'C。在分析前，細(xì)胞用機(jī)械法解離，然后進(jìn)行免疫標(biāo)記用于western印跡或FACS分析(見下文)。應(yīng)當(dāng)注意到甚至在未治療的腫瘤中y-H2AX水平也是相當(dāng)高的，但是在Dbait32Hc治療的腫瘤中觀察到的水平顯著更高。圖4顯示約10.000細(xì)胞的FACS分析。與未治療或用60ngDbait8H作為轉(zhuǎn)染對(duì)照的治療相比，在用60pgDbait32Hc治療的腫瘤的Hep2細(xì)胞中觀察到高水平的y-H2AX。實(shí)施例3:裸鼠中異種移植的人腫瘤的治療通過使用由皮下注射放射抗性的細(xì)胞系(源自人頭頸鱗狀細(xì)胞癌HNSCC的Hep2;及源自人黑素瘤的LU1205和SK28)異種移植的人腫瘤的裸鼠，評(píng)估Dbait分子的體內(nèi)活性，Dbait分子是作為一種新型分子療法和常規(guī)DNA損傷療法的替代。為了建立體內(nèi)概念的證據(jù)，對(duì)異種移植了各種人腫瘤的小鼠進(jìn)行研究。通過注射約1百萬個(gè)人腫瘤細(xì)胞進(jìn)行異種移植。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約200mmS(在接種腫瘤細(xì)胞后約7-10天)時(shí)開始治療。每周測(cè)量腫瘤大小2-3次。計(jì)算腫瘤體積(V-2XaXb2，其中a-長度，b二寬度)。跟蹤小鼠至少150天。當(dāng)腫瘤體積超過2cn^時(shí)，根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)則處死動(dòng)物，處死時(shí)間被認(rèn)定為死亡時(shí)間(用于Kaplan-Meier曲線的存活終止點(diǎn))。典型的分析條件由腫瘤內(nèi)注射1-6納摩爾(nmole)Dbait分子和轉(zhuǎn)染劑聚乙烯亞胺(PEI，PolyplusTransfection)的相應(yīng)制劑組成。對(duì)于HNSCC異種移植來說，每2天、一周3天共5周注射配制的Dbait分子(Dbait32H或Dbait32Hc)。對(duì)于LU1205和SK28異種移植來說，連續(xù)3天注射配制的Dbait32Hc分子，并在之后一周重復(fù)一次。圖5顯示裸鼠中HNSCC異種移植物的Kaplan-Meier曲線。在60pg(3納摩爾)和120pg(6納摩爾)Dbait32H/Dbait32Hc分子治療組中觀察的明顯延長的生存，而60昭(6納摩爾)單鏈對(duì)照(Dbait32ss)的治療是陰性的。如圖6和圖7所示，在裸鼠的兩種其他異種移植的人腫瘤(LU1205和SK28)中也觀察到Dbait32Hc的有益效果。無論施用頻率如何只要達(dá)到指定總量就能觀察到Dbait32Hc的有益效果。施用可以被劃分為每周3次、2次或理論上1次注射的頻率。28對(duì)每種治療和每種腫瘤類型進(jìn)行腫瘤應(yīng)答的描述性分析。第1天是第一次治療的日子。跟蹤所有動(dòng)物至少150天或直至它們按倫理規(guī)則被處死。根據(jù)Kaplan-Meier方法估算中值生存期。通過從每個(gè)治療組單個(gè)小鼠的腫瘤體積四倍增時(shí)間(quadruplingtimes)減去對(duì)照組的平均腫瘤體積四倍增時(shí)間，計(jì)算TGD。利用個(gè)體測(cè)量計(jì)算每個(gè)治療組的平均TGD。通過Kaplan-Meier估算評(píng)價(jià)總體生存曲線，并利用非參數(shù)LogRank檢驗(yàn)進(jìn)行比較，因?yàn)閿?shù)據(jù)不符合正態(tài)分布。所述分析使用S-Plus6.2版軟件(MathSoftInc,Seattle,WA)禾口statEL(adScience,Paris,法國)。首先對(duì)相同腫瘤類型的每個(gè)組進(jìn)行全面LogRank。然后比較Dbait治療與未治療的對(duì)照。動(dòng)物數(shù)量(n)、相對(duì)危險(xiǎn)度(RR)和P值在表4中給出。所有檢驗(yàn)都被認(rèn)為在0.05顯著性水平是顯著的。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>C:未治療的腫瘤組用作統(tǒng)計(jì)評(píng)分的參照組叮GD計(jì)算和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析描述于材料和方法。"治愈小鼠是治療開始后存活超過200天的動(dòng)物，表4:Dbait32H/Hc治療對(duì)裸鼠異種移植腫瘤效果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在所有異種移植的人腫瘤中都觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的Dbait32H/Dbait32Hc有益結(jié)果。因?yàn)镈bait分子的根本作用機(jī)制和所有細(xì)胞中普遍存在的NHEJ途徑，可以預(yù)料這將適用于具有不同組織學(xué)的其他腫瘤。實(shí)施例4:對(duì)Dbait注射的免疫應(yīng)答無論是靜脈內(nèi)注射或皮下注射，沒有檢測(cè)到Dbait32Hc顯著的誘導(dǎo)任何細(xì)胞因子。本發(fā)明人評(píng)價(jià)了給Balb/C小鼠靜脈內(nèi)(IV)或皮下(SC)注射Dbait32Hc后的免疫應(yīng)答。在重復(fù)注射Dbait后的不同時(shí)間測(cè)量血液樣品中IL2,IL4,IL5，IL6，IL10,IL12P70,IFNy和TNFa的水平。動(dòng)物在24天內(nèi)接受120mg(9納摩爾)Dbait的七次注射，沒有顯示任何中毒現(xiàn)象或皮膚炎癥。本發(fā)明人比較了針對(duì)不包含任何免疫原性CpG序列的Dbait32Hc和包含4個(gè)CpG的Dbait32H的免疫應(yīng)答。只有Dbait32H誘導(dǎo)IL6的快速應(yīng)答和IL12p70的更延遲的應(yīng)答(圖8)。參考文獻(xiàn)BelenkovA.I.;PaiementJ.P.;PanasciL.C.;MoniaB.P.;ChowT.Y.AnantisenseoligonucleotidetargetedtohumanKu80messengerRNAsensitizesM059Kmalignantgliomacellstoionizingradiation,bleomycin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雜原子例如氧、硫、氮或包括一個(gè)或數(shù)個(gè)雜原子的雜原子或雜環(huán)基團(tuán)所阻斷和/或取代；和/或b)單元，其是阻斷元件，不受DNA聚合酶或核酸外切酶的作用，諸如任一3'-修飾的核苷酸，和/或c)天然的寡核苷酸，諸如Tn，當(dāng)用于發(fā)夾片段的環(huán)中時(shí)，優(yōu)選四脫氧胸苷酸(T4)。16.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述分子具有至少32pb或32bp的雙鏈部分，其含有與Dbait32(SEQIDNo1)、Dbait32Ha(SEQIDNo28)、Dbait32Hb(SEQIDNo29)、Dbait32Hc(SEQIDNo30)或Dbait32Hd(SEQIDNo31)相同的核苷酸組成。17.如權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其中所述分子選自Dbait32(SEQIDNo1)、Dbait32H墨po(SEQIDNo3)、Dbait32H(SEQIDNo4)、Dbait32-T4(SEQIDNo2)、Dbait32Hc-5，5，(SEQIDNo14)、Dbait32-NH2(SEQIDNo15)、Dbait32H-FITC(SEQIDNo2)、Dbait32H-Cy3(SEQIDNo22)、Dbait32H扁Biot(SEQIDNo23)、Dbait32Ha(SEQIDNo8)、Dbait32Hb(SEQIDNo9)、Dbait32Hc(SEQIDNo10)、Dbait32Hd(SEQIDNo11)、Dbait32Hc-3，mp(SEQIDNo12)、Dbait32Hc-5,3,mp(SEQIDNo13)、Dbait32Hc-Cy3(SEQIDNo25)、Dbait32Hc-Cy5(SEQIDNo26)、Dbait32Hd-FITC(SEQIDNo27)、Dbait32Hads(SEQIDNo28)、Dbait32Hbds(SEQIDNo29)、Dbait32Hcds(SEQIDNo30)、Dbait32Hdds(SEQIDNo31)、Dbait64(SEQIDNo19)和Dbait64L(SEQIDNo20)。18.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述分子的雙鏈部分包括Dbait32(SEQIDNo1)、Dbait32Ha(SEQIDNo28)、Dbait32Hb(SEQIDNo29)、Dbait32Hc(SEQIDNo30)或Dbait32Hd(SEQIDNo31)的至少16、18、20、22、24、26、28、30或32個(gè)連續(xù)核苷酸。19.如權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述增生性病癥是癌癥，優(yōu)選自惡性膠質(zhì)瘤，頭頸癌，結(jié)腸癌，肝癌，肺癌，皮膚癌，乳腺癌和宮頸癌。20.如權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述分子通過口服途徑或靜脈內(nèi)、腫瘤內(nèi)或皮下注射，顱內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)注射或灌注，或口服途徑施用。21.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中通過在每日治療方案中腫瘤內(nèi)施用有效量的每1cmS腫瘤至少0.1mg，優(yōu)選的每1cm3腫瘤0.6mg，最優(yōu)選的每1cm"腫瘤1mg，或在每周治療方案中腫瘤內(nèi)施用有效量的每1cm4中瘤至少0.3mg，優(yōu)選的每1cm3腫瘤1.8mg，最優(yōu)選的每lcn^腫瘤3mg使用所述分子。22.評(píng)估如權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述核酸的治療效率的方法，包括測(cè)定組蛋白H2AX的磷酸化。23.在細(xì)胞和/或組織中增加組蛋白H2AX的磷酸化或活化組蛋白H2AX的方法，包括向所述細(xì)胞和/或組織中導(dǎo)入如權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的核酸。全文摘要本發(fā)明涉及用于干擾雙鏈斷裂(DSBs)的DNA修復(fù)的組合物和方法。本發(fā)明公開了新型雙鏈核酸分子，其充當(dāng)誘餌并劫持(hijack)負(fù)責(zé)DNADSB感應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或修復(fù)途徑，尤其是DSB修復(fù)的非同源性末端連接(NHEJ)途徑的酶的全復(fù)合物。本發(fā)明公開了這些分子作為單獨(dú)的抗癌藥物，以有效量導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核，以引發(fā)它們的死亡的用途。文檔編號(hào)C12N15/115GK101622351SQ200880002041公開日2010年1月6日申請(qǐng)日期2008年1月11日優(yōu)先權(quán)日2007年1月12日發(fā)明者馬里·迪特雷申請(qǐng)人:法國國家科學(xué)研究中心;法國居里學(xué)院