專利名稱：：監(jiān)測(cè)hiv感染的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明大體涉及人類免疫缺陷病毒(HIV)，特別涉及一種監(jiān)測(cè)HIV感染強(qiáng)度和預(yù)測(cè)發(fā)展成獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的時(shí)間的方法。背景急性HIV感染中抗體的出現(xiàn)時(shí)間最近被圖示出來(lái)(map)，并且已顯示大多數(shù)抗體在對(duì)HIV包膜表位的峰響應(yīng)(peakresponse)之后約兩至三個(gè)星期才會(huì)出現(xiàn)。實(shí)際上，大多數(shù)保護(hù)性抗體(中和自體病毒的抗體)可延遲長(zhǎng)達(dá)1年(Wei等，Nature422:307-12(2003);Richman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:4144-9(2003))(圖1)。Fiebig等(AIDS17:1871-1879(2003))研究了來(lái)自美國(guó)血庫(kù)的血漿供體的血漿組(plasmapanel)，且發(fā)現(xiàn)該血漿組代表圍繞HIV傳播取樣的最早時(shí)間點(diǎn)(圖2)。這些血漿組的時(shí)間進(jìn)程在任何可檢測(cè)的病毒存在之前開(kāi)始，并且當(dāng)未發(fā)生血清轉(zhuǎn)化時(shí)，繼續(xù)穿過(guò)病毒....匕升期(ramp-upstage)(或隱蔽期)并穿過(guò)HIV的第一期和第二期。圖3顯示了1.1個(gè)這樣的血槳組的病毒量。為了首先理解在HIV傳播時(shí)抗體誘導(dǎo)的"延遲"，首先要解決的問(wèn)題是是否有免疫抑制事件，例如大量凋亡，其伴隨在急性HIV感染期間的病毒上升期時(shí)磷脂酰絲氨酸微粒的釋放(Mattapallil等，Nature434:1093(2005)，Veazey等，Science280:427(1998)，Guadalupe等，J.Virol.77:11708(2003),Benchley等，J.Exp.Med.200:749(2004),Mehandru等，J.Exp.Med.200:761(2004),Esser等，j.Virol.75:6173-6182(2001)，Aupelx等，J.ClinInvest99:1546-1554(1997)，Callahan等，J.Immunol.170:4840-4845(2003))。凋亡微粒是有活性的細(xì)胞或凋亡細(xì)胞的產(chǎn)物，它們?cè)谠S多疾病的血漿中增加，包括例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的自身免疫性疾病(Distler等，Arth.Rheum.52:33337-3348(2005),Tesse等，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.25:2522-2527(2005),Cerri等，丄Immunol.177:1975-1980(2006))、克羅恩氏病(Chamouard等，Dig.Dis.Sci.50:574-580(2005))、冠心病和其他形式的心臟疾病(Boulanger等，Cardiovas.Res.67:1-3(2005))和慢性HIV-l感染(Esser等，J.Virol.75:6173-6182(2001),Aupelx等,J.ClinInvest.99:1546-1554(1997))。凋亡微?？山Y(jié)合至非凋亡細(xì)胞并誘導(dǎo)凋亡(Distler等，Apoptosis10:731-741(2005))，并且凋亡微粒是促凝血的(Distiller等，Apoptosis10:731-741(2005))、促炎的(Tesse等，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.25:2522-2527(2005),Cerri等，J.Immunol.177:1975-1980(2006))，且可免疫抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞對(duì)特異抗原的應(yīng)答(Esser等,J.Virol.75:6173-6182(2001),Fadok等.J.Immunol.174:1393(2005))。微粒水平與健康成人體內(nèi)的il-6水平相關(guān)(Chirinos等，Amer.j.Card.95:1258-1260(2005))、在急性冠狀動(dòng)脈綜合癥中增加并且與血管造影的冠狀動(dòng)脈損害的嚴(yán)重程度有關(guān)(在Mezentsev,Am.J.Physiol.HeartCirc.Physiol.289:H1106-H1114(2005)中有綜述)。CD31/膜聯(lián)蛋白V+凋亡微粒與冠心病病人的冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能有關(guān)(Werner等，Arterioscler.Throm.Vase.Biol.26:112-116(2006),2005年10月電子公布)。Aupelx等(J.ClinInvest.99:1546-1554(1997))表明，測(cè)量血漿中的凋亡微粒的水平可提供關(guān)于HIV中免疫細(xì)胞破壞嚴(yán)重程度的信息，也可提供對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的反應(yīng)性的指示。本發(fā)明通過(guò)測(cè)量微粒的血漿水平并測(cè)試細(xì)胞活性和/或凋亡而提供一種在急性HIV感染(AHI)期間預(yù)測(cè)病人體內(nèi)HIV感染的進(jìn)程的方法、一種測(cè)定在AHI中免疫系統(tǒng)的潛在破壞程度的方法和一種監(jiān)測(cè)感染進(jìn)程的方法。發(fā)明概述本發(fā)明大體涉及HIV。更具體地，本發(fā)明涉及一種監(jiān)測(cè)HIV感染強(qiáng)度和預(yù)測(cè)發(fā)展成AIDS的時(shí)間的方法。本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)將從下述描述中變得清晰。附圖簡(jiǎn)述圖1.緊接在急性HIV-1感染后的抗體應(yīng)答的概括圖。通過(guò)ELISA分析來(lái)自急性HIV-1感染(AHI)之前、期間和之后的不同時(shí)間點(diǎn)的血槳供體的樣品，以確定是否存在抗gp:140的抗體、V3環(huán)、CD4結(jié)合位點(diǎn)(BS)和近膜端外部區(qū)(MPER)。樣品還被分析是否存在中和抗體(Nab)和是否存在2F5、4E10和2G12中和抗體。使用bDNA技術(shù)(ChironDiagnostics)來(lái)定量HIVRNA。圖2.HIV標(biāo)記物發(fā)展的示意性半定量顯示(根據(jù)Fiebig等，AIDS17:1871(2003)修改)。圖3.血漿組的病毒量。使用bDNA技術(shù)(ChironDiagnostics)分析在HIV-1感染之前、期間和之后的不同時(shí)間點(diǎn)從血庫(kù)供體獲得的血槳的病毒RNA。圖4A-4C.AHI期間的可溶Fas配體水平。通過(guò)ELISA(Diaclone)分析在HIV-l傳播之前、期間和之后的不同時(shí)間點(diǎn)從血庫(kù)供體獲得的血漿中是否存在可溶Fas配體。每個(gè)樣品重復(fù)分析兩次，誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。還測(cè)量了這些組的病毒量(bDNA,Chirondiagnostics)并將病毒量顯示在第二個(gè)軸上(拷貝/ml)。圖中顯示了三個(gè)代表性的組。圖5.Fas配體水平在第0天之前和之后的增加百分?jǐn)?shù)。對(duì)于每個(gè)單獨(dú)的組成員，將第0天之前(含)的平均Fas配體水平與第O天之后的平均Fas配體水平比較。圖6A-6C.AHI期間的腫瘤壞死因子受體2(TNFR2)。通過(guò)ELISA(Diaclone)分析在HIV-1感染之前、期間和之后的不同時(shí)間點(diǎn)從血庫(kù)供體獲得的血漿中是否存在可溶TNFR2配體。每個(gè)樣品重復(fù)分析兩次，誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。還測(cè)量了這些組的病毒量(bDNA,Chirondiagnostics)并將病毒量顯示在第二個(gè)軸上(拷貝/ml)。圖中顯示了三個(gè)代表性的組。圖7.TNFR2水平在第0天之前和之后的增加百分?jǐn)?shù)。對(duì)于每個(gè)單獨(dú)的組成員，將第0天之前(含)的平均TNFR2水平與第0天之后的平均TNFR2水平比較。圖8A-8CAHI期間的TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)水平。通過(guò)ELISA(Hycult)分析在HIV-1感染之前、期間和之后的不同時(shí)間點(diǎn)從血庫(kù)供體獲得的血漿中是否存在可溶TRAIL。每個(gè)樣品重復(fù)分析兩次，誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。還測(cè)量了這些組的病毒量(bDNA,Chirondiagnostics)并將病毒量顯示在第二個(gè)軸匕(拷貝/ml)。圖中顯示了三個(gè)代表性的組。圖9.TRAIL水平在第0天之前和第0天之后的增加百分?jǐn)?shù)。對(duì)于每個(gè)單獨(dú)的組成員，將第0天之前(含)的平均TRAIL水平與第0天之后的平均TRAIL水平比較。圖10.血庫(kù)組6246的TRAIL水平。通過(guò)ELISA(Diacione)分析來(lái)自組6246的血漿樣品的可溶TRAIL水平并分析是否存在HIVRNA(bDNA,ChironDiagnostics)(拷貝/ml)。樣品6246-15(病毒量>100拷貝/ml的第一時(shí)間點(diǎn)后的11天)被選擇用來(lái)作微粒的流式細(xì)胞分析。圖ll.在AHI血漿中的純化的微粒的流式細(xì)胞分析。純化的微粒是通過(guò)使用星形孢菌素刺激Jurkat細(xì)胞(ATCCTTB-152)24小時(shí)而制備的。通過(guò)高速離心收集微粒，并將顆粒重懸在PBS中。將血漿(樣品6246-15)稀釋在PBS中。所有樣品都以在PBS中1:10的最終稀釋度來(lái)分析。通過(guò)PBS樣品確定設(shè)門(gating)，并且全事件(totalevents)被記錄2分鐘。圖12.純化的微粒和AHI血漿的表型分析。純化的微粒制劑或血槳(樣品6246-15)被稀釋并直接用抗CD3和CD45的APC結(jié)合的抗體染色。通過(guò)PBS樣品確定設(shè)門，并且全事件(#e)被記錄2分鐘。所顯示的百分?jǐn)?shù)代表門(gate)內(nèi)的事件和平均熒光強(qiáng)度(MFI)以及信噪比(S/N)。圖13.微粒的抗磷脂酰絲氨酸染色。使用抗磷脂酰絲氨酸2aG4抗體或C44對(duì)照抗體對(duì)血漿(樣品6246-15)進(jìn)行染色。隨后與二抗(羊抗人FITC結(jié)合的抗體)一起溫育。圖14.HIV感染的T細(xì)胞顯示出抗磷脂酰絲氨酸。H-9細(xì)胞(ATCCCRL-8543)或被HIV感染，或未被感染而被用作對(duì)照。隨后使用對(duì)照抗體(抗人表皮生長(zhǎng)因子受體，Erbitux)或抗磷脂酰絲氨酸(Tarvidn)染色細(xì)胞。隨后細(xì)胞被與二抗(結(jié)合的(FITC-或金-標(biāo)記的)羊抗人抗體)一起溫育。圖15.微粒在AHI血漿中表達(dá)磷脂酰絲氨酸。利用流式細(xì)胞儀來(lái)分析各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(病毒量被檢測(cè)前的21天(第-21天)，在病毒量被測(cè)定為〉100拷貝/ml后的第7、11和14天)的組6246是否存在用抗磷脂酰絲氨酸抗體(2aG4)染色的微粒。作為對(duì)照，還以相同方式分析來(lái)自正常的未感染血庫(kù)供體的血漿。圖16A-16C.與HBV組的比較圖17A-17C.圖17A.從0T1T細(xì)胞中分離出的微泡的TEM。為免疫顯微研究，OT1微泡被施加至涂布有聚L-賴氨酸的電子顯微鏡格柵上、被用1%BSA阻斷，并用抗CD8a和抗TCRb(圖17B)抗體雙重標(biāo)記。15nm(CD8，粗箭頭)或5nm(TCR，細(xì)箭頭)Au標(biāo)記的鏈酶抗生物素蛋白結(jié)合的抗體被用作二抗。使用Os04清洗和處理柵格，并使用透射式電子顯微鏡檢査。圖17C.將微泡錨定至L1傳感器芯片(通過(guò)親脂性連接體)的BIAcore結(jié)合分析的示意圖和與肽-M.HC復(fù)合物之間的結(jié)合相互作用。圖18.OT1微泡被如示意性顯示在圖17C中那樣錨定在BIAcoreLl傳感器芯片....匕在基線穩(wěn)定后并在注射BSA以阻斷非特異性結(jié)合后，Ova-Kb(...h方線條)或?qū)φ誚SV-K15(下方線條)四聚體以0.25mg/mL被注射。結(jié)合應(yīng)答顯示OVA-Kb肽特異性結(jié)合至表達(dá)微泡的OT1TCR。圖9A-19C.HIV-1、丙肝病毒(HCV)和乙肝病毒(HBV)血漿供體受試者的血漿病毒量。研究了30個(gè)^乂+血清轉(zhuǎn)化血漿供體血漿組(HBV和HCV陰性)、10個(gè)HBV血漿供體血清轉(zhuǎn)化組(HIV陰性)和IO個(gè)HCV血漿供體血清轉(zhuǎn)化組(HIV陰性)。這些組證實(shí)了HIV(圖19A)、HCV(圖19B)和HBV(圖19C)中病毒上升的動(dòng)力學(xué)。T。被定義為HIV病毒量達(dá)到100拷貝/ml的第一天，HCV病毒達(dá)到600拷貝/ml的第一天或HBV病毒達(dá)到700拷貝/ml的第一天。圖20-20C.細(xì)胞死亡的血漿標(biāo)記物。圖20A.通過(guò)ELISA測(cè)量每個(gè)血漿樣品的TRAIL、TNFR2和Fas配體，并與病毒量水平比較。圖20B顯示了三個(gè)代表性的受試者。為了比較受試者之間凋亡的血漿標(biāo)記物的增加，將T。前的平均值與T。后的平均值比較，并計(jì)算增加百分?jǐn)?shù)。圖20C.相同的凋亡的血漿標(biāo)記物還在IO個(gè)HCV或HBV急性感染受試者中被測(cè)量。圖中顯示了一個(gè)HCV和一個(gè)HBV受試者中的代表性的結(jié)果。圖21A-21C.血槳分析物峰值水平與每個(gè)組中的第.一個(gè)血漿以及未感染的血衆(zhòng)的比較。圖21A.對(duì)于每組數(shù)據(jù)進(jìn)行Boxplot分析，并顯示了急性HIV-1、HBV和HCV組的結(jié)果，其中垂直線意味著最大值和最小值。使用Student氏T測(cè)試來(lái)計(jì)算P值。陰影方框表示p<0.01.圖21B.在30個(gè)被研究的急性HIV-1感染的患者內(nèi)，30/30、27/30、26/30分別表明TRAIL、TNFR2和Fas配體水平的峰值接近(在15天內(nèi))病毒量峰值。而且，21/30病人表明TRAIL水平在病毒量達(dá)到峰值之前達(dá)到峰值，而16/30TNFR2和Fas配體水平與病毒量同時(shí)達(dá)到峰值。對(duì)所研究的10個(gè)HCV和HBV受試者進(jìn)行了同樣的分析。圖21C顯示峰值分析物相對(duì)最大病毒擴(kuò)張(maximumviralexpansion)的時(shí)序(timing)。結(jié)果來(lái)自配對(duì)Wilcoxon秩檢驗(yàn)，低p值顯示兩個(gè)平均數(shù)(峰值天數(shù))是明顯不同的。這暗示，平均的峰值"達(dá)峰時(shí)間"(例如，峰值擴(kuò)張日和峰值TRAIL日)是明顯不同的。達(dá)峰時(shí)間之間的延遲可以平均值、中值和四分位差的方式來(lái)描述。每種分析物最大值的到達(dá)時(shí)間被與峰值病毒擴(kuò)張的時(shí)間(最左邊方框)比較。由Wilcoxon檢驗(yàn)算出的p值顯示在分析物的上方。有意義的p值顯示峰值分析物水平的平均日顯著不同于病毒擴(kuò)張的峰值平均日或最大速度平均日。還記載了平均延遲時(shí)間(括號(hào)內(nèi)的中等時(shí)間)。開(kāi)圓衷示離群值。圖22A和22B.血漿樣品中的相對(duì)微粒計(jì)數(shù)。圖22A.對(duì)于每個(gè)血漿供體受試者，獲得每個(gè)連續(xù)時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)微粒計(jì)數(shù)。研究了30個(gè)受試者，顯示了三個(gè)代表性的受試者。圖22B.對(duì)10個(gè)HBV和HCV感染受試者進(jìn)行同樣的分析。圖中顯示了在一個(gè)代表性的HCV和-一個(gè)HBV受試者中的連續(xù)時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果。微粒(MP)計(jì)數(shù)為4，病毒量為x。圖23A-23C.急性HIV-1感染中血漿MP的形態(tài)學(xué)和CCR5表達(dá)。圖23A顯示從急性HIV-1感染受試者(6244)收集的血漿MP的電子顯微圖片。通過(guò)超速離心法將血漿MP制成小球狀，并通過(guò)蔗糖墊純化。大箭頭顯示尺寸為100nM至1的雙膜微粒。小箭頭顯示30-100nm的顆粒(外來(lái)體)。棒二IOOnm。圖23B顯示在急性HIV-1感染期間存在CCR5+MP。圖23B.MP的流式細(xì)胞分析，與同種型陰性對(duì)照相比(上圖)MP是CCR5+(下圖)。圖23C顯示在5個(gè)不同的血清轉(zhuǎn)化組中、在第一個(gè)血清樣品中和在峰值MP計(jì)數(shù)時(shí)的CCR5+MP(%CCR5+MP，它由表型流式分析乘以相對(duì)MP計(jì)數(shù)來(lái)決定)的數(shù)目比較。圖24A和24B.PWM/oCpG-刺激的扁桃體B細(xì)胞的MP誘導(dǎo)的抑制。圖24A.從健康供體獲得的扁桃體細(xì)胞被單獨(dú)培養(yǎng)或在存在PWM和oCpG的情況F與或不與源自PBMC的MP—起培養(yǎng)。MP的存在誘導(dǎo)了總IgG和IgA的減少的產(chǎn)出。數(shù)據(jù)代表五個(gè)實(shí)驗(yàn)，并以平均數(shù)士SEM的形式表示。圖24B顯示通過(guò)增加PBMCMP的量而形成的I.gG的劑量依賴性抑制。圖25A-25C.測(cè)量血漿MP的流式細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展。首先分析了聚苯乙烯珠粒的混合物(圖25A)。尺寸為0.lMm至1.0pm的珠粒以等比例混合物，并被稀釋，且使用BDLSRI1來(lái)分析。使用側(cè)向散射作為尺寸鑒別器，因?yàn)楣怆姳对龉鼙惹跋蛏⑸錂z測(cè)器的二極管具有增強(qiáng)的鑒別較小顆粒的能力。為了確定最佳的稀釋范圍，分析了--連串的連續(xù)稀釋的聚苯乙烯珠?；旌衔?圖25B)。我們發(fā)現(xiàn)，任何未被充分稀釋的樣品因?yàn)橹睾虾透咧袛嗦识a(chǎn)生了不實(shí)的低的事件計(jì)數(shù)。樣品被稀釋到一次只有一個(gè)微粒流過(guò)激光束的時(shí)候，細(xì)胞儀處理的計(jì)數(shù)事件將更加精確。實(shí)際上，當(dāng)珠粒混合物以1:1000稀釋時(shí)，4種不同尺寸的珠粒不能被很好地辨別，但是以1:100,000稀釋時(shí)，可以檢測(cè)到每個(gè)尺寸的清楚的個(gè)數(shù)。為分析血漿微粒(圖25C)，使用相似的稀釋系列來(lái)實(shí)驗(yàn)性地確定最佳稀釋度(數(shù)據(jù)未示出)。通過(guò)將O.lpm珠粒包括在低側(cè)向散射范圍、將l.OMm珠粒包括在較高側(cè)向散射范圍，而將具有非常小的前向散射和側(cè)向散射的顆粒排除，而畫(huà)出MP門(參見(jiàn)圖25A和圖25C的方框)。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，以1:100,000稀釋度分析聚苯乙烯膠料珠粒，使得所有數(shù)據(jù)都以相同方式被設(shè)門。在血漿樣品中，大部分MP被發(fā)現(xiàn)在O.l至0.5pm之間(微粒門內(nèi)的數(shù)目證實(shí)側(cè)向散射面積小于104)。存在較大的微粒(大于0.5pm但小于l.Opm)，但比例較小。圖26.凍融循環(huán)對(duì)血漿MP表型的影響。因?yàn)橐恍┘?xì)胞外標(biāo)記物在血漿供體樣品中的表達(dá)水平低，因此作了凍融血漿對(duì)MP表型的影響的研究。來(lái)自HIV-1慢性感染供體的血漿被分成2部分。第一部分保留在20t:(新鮮的)。第二部分被凍融2次。所有樣品隨后被如實(shí)施例3中所描述的那樣稀釋、過(guò)濾和離心。MP重懸液被與直接結(jié)合有CD3、CD45、CD61(血小板MP標(biāo)記物)和膜聯(lián)蛋白V(其結(jié)合至磷脂酰絲氨酸)一起溫育。方框中的百分?jǐn)?shù)顯示了在去除同種型對(duì)照的背景后MP對(duì)那種特定標(biāo)記物呈陽(yáng)性的百分?jǐn)?shù)。CD3、CD4、CD61和膜聯(lián)蛋白陽(yáng)性MP的百分?jǐn)?shù)在兩次凍融循環(huán)后顯著減少。發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及確定HIV中免疫系統(tǒng)破壞程度的方法、確定AHI中預(yù)測(cè)和疾病進(jìn)程的方法和確定AHI中治療需要的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種檢測(cè)HIV感染的強(qiáng)度并預(yù)測(cè)發(fā)展成AIDS的時(shí)間的方法。這些方法基于免疫活化和/或凋亡的血漿測(cè)試和血槳微粒的表型分析和定量分析。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，這些方法包括檢測(cè)TRAIL、Fas配體和/或TNFR2的血漿水平。免疫系統(tǒng)的HIV-1破壞的其他血漿標(biāo)記物可被單獨(dú)使用或與這些測(cè)試結(jié)合使用(一種這樣的標(biāo)記物是核蛋白HMGB-1，其從凋亡細(xì)胞中釋放在血漿中(Nowak等，Cytokine34:17-23(2006),2006年5月11日電子公布))。微粒可來(lái)自任何免疫細(xì)胞或非免疫細(xì)胞。微粒的表型特征化具有診斷用途。HIV-1病毒微粒是CD45-，因此CD45可被用來(lái)區(qū)別病毒和免疫細(xì)胞微粒(Esser等,Virol.75:6173-6:182(2001))?？傮w來(lái)說(shuō)，增加的T細(xì)胞微粒表明T細(xì)胞在體內(nèi)被破壞。重要的是要注意，TNFR2和Fas配體增加的程度具有不均勻性。這表明在AHI期間，具有免疫系統(tǒng)大量凋亡的病人，也具有免疫系統(tǒng)少量凋亡的病人。因此，確定哪些病人需要用抗HIV藥物治療(即，具有升高的Fas配體水平、TNFR2水平、微粒水平和TRAIL水平的病人)，哪些病人不需要用HIV藥物治療(沒(méi)有或具有最低的Fas配體水平、TNFR2水平、TRAIL水平和CD45、CD3T細(xì)胞微粒水平)，對(duì)于指導(dǎo)在AHI中的治療很重要。以F實(shí)施例中提供的數(shù)據(jù)證實(shí)，在AHI的病毒量上升期，當(dāng)需要產(chǎn)生保護(hù)性抗體時(shí)，在許多病人體的血漿中存在很高水平的微粒、高TRAIL水平、高Fas配體水平和高TNFR2水平。這些蛋白質(zhì)和微粒的水平的不均勻性表明，單獨(dú)或組合測(cè)量這些參數(shù)提供一種適用亍預(yù)測(cè)HIV感染進(jìn)程和發(fā)展成AIDS的時(shí)間的預(yù)測(cè)測(cè)試。將意識(shí)到的是，一種或多種這些參數(shù)也可與其他凋亡、細(xì)胞死亡和/或活化的標(biāo)記物(例如，可溶HMGB-1、CD25、CD69或T細(xì)胞活化/凋亡的其他可溶分子)^起考慮。雖然以下實(shí)施例中提供的細(xì)節(jié)具體涉及HIV,但本發(fā)明在其范圍內(nèi)也包括，使用這些相同的參數(shù)監(jiān)控其他在急性感染期間帶有凋亡的傳染病(Bahl等，J.Immunol.176:4284-4295(2006))的發(fā)展和/或臨床進(jìn)程的方法。本發(fā)明的某些方面將在以下非限制性的實(shí)施例中詳細(xì)描述。本發(fā)明與2006年11月17日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/859,496號(hào)相關(guān)，通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容合并至本文中。實(shí)施例1已在血庫(kù)組中研究了幾種凋亡的血漿標(biāo)記物，包括Fas配體、TNFR2和TRAIL。TRAIL與HIV感染中的活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡有關(guān)(Katsikis等，J.Exp.Med.186:1365-1372(1997))。Fas配體被發(fā)現(xiàn)在AHI中升高(圖4和圖5)。在11/13病人的血漿中觀察到了Fas配體的升高，但在2/13中未升高，表明在-些病人中沒(méi)有或有較少的凋亡，而在其他病人中并非如此。相似地，在11/13病人中TNFR2升高，同樣，在具有低Fas配體水平的相同的兩個(gè)病人中，血漿TNFR2沒(méi)有增加(圖6和圖7)。最后，TRAIL水平在所有30個(gè)測(cè)試病人中都升高，其中具有較低水平的其他凋亡標(biāo)記物的兩個(gè)病人具有較低的TRAIL(圖8、9)。因此，與急性HIV感染一起出現(xiàn)的大量凋亡，導(dǎo)致TRAIL的釋放、經(jīng)由FAS-FASL相互作用的凋亡的介導(dǎo)和含病毒和其他顆粒的PS的釋放，所有這些共同開(kāi)始免疫抑制宿主，阻止了快速的保護(hù)性B細(xì)胞應(yīng)答。隨后，進(jìn)行了AHI樣品6246-15中的微粒的流式細(xì)胞儀表型分析(圖10)。圖11顯示磷酸緩沖液鹽(pH7)背景的前向和側(cè)向散射、來(lái)自星形孢菌素處理的JurfcatT細(xì)胞的純化微粒的前向和側(cè)向散射和在第11天峰值病毒血癥(peakviremia)時(shí)的病人6246血漿中的微粒的前向和側(cè)向散射。圖11顯示血漿中的微粒，每組計(jì)數(shù)2分鐘。圖12顯示純化的Jurkat微粒(pMP)或病人6246MP的表型，并顯示微?？杀槐硇头治?，且Affl病人微粒為78.6%CD3+、53%CD45+。CD45是T細(xì)胞和單核細(xì)胞的表面分子，其不存在于HIV病毒中(Esser等，J.Virol.75:6173-6182(2001))。因此，在圖12中約一半的微粒像病毒，而」半的顆粒是來(lái)自未感染HIV的細(xì)胞的凋亡顆粒或不含有HIV基因物質(zhì)。重要的是，來(lái)自病人6246的大多數(shù)微粒是磷脂酰絲氨酸(PS)陽(yáng)性的(圖13)。相似的，如圖14所示，HIV感染的細(xì)胞是PS+。實(shí)施例2基亍表面等離子共振(SPR)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析已被開(kāi)發(fā)用來(lái)描述來(lái)自T細(xì)胞的微粒的特征。該分析可以描述釋放自免疫細(xì)胞的微粒的特征。圖17和18圖示了SPR分析在T細(xì)胞微粒的特征描述中的應(yīng)用。本文所描述的分析可被用來(lái)監(jiān)測(cè)抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答的狀態(tài)，該狀態(tài)以TCR特異性、蛋白質(zhì)磷酸化和活化和凋亡的功能標(biāo)記物來(lái)衡量。使族/fC/類M/ZC//教驟沐鄉(xiāng)微嚴(yán)特雜r潘應(yīng)微粒游特,一旦活化或凋亡，微粒即從免疫細(xì)胞(如T細(xì)胞或B細(xì)胞)或抗原呈遞細(xì)胞中釋放(018^1'等，八化1^8&Rheumatism52:3337-3348(2005))。但是，這些微粒在數(shù)量.匕和質(zhì)量上都不相同，且根據(jù)誘導(dǎo)刺激物而改變(imenez等,Thromb.Res.109:175-180(2003);Distler等,Proc.Natl.Acad.Sci.102:2892-2897(2005);Kolowas等，Scand.J.Immunol.,61:226-233(2005))。因?yàn)檫@些顆粒攜帶來(lái)自母細(xì)胞的膜，表面抗原的特征可被用來(lái)確定微粒的來(lái)源。已報(bào)告稱，微粒含有免疫球蛋白家族的表面蛋白(TCR、BCR)、糖基化磷脂酰肌醇-(GPI-)錨定分子和四次跨膜蛋白(tetraspan)家族的成員(Denzer等，J.CellSci.113:3336-3374(2000);Koopman等，Blood84:1415-1420(1994);Heijnen等，94:3791-3799(1999))。本文描述的SPR分析對(duì)于使用肽-MHC四聚體檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞是特別靈敏的分析。在本文所述的研究中，T細(xì)胞微泡是從鼠科動(dòng)物OTlT細(xì)胞分離出的，該T細(xì)胞表達(dá)對(duì)SIINFEKL-Kb(Ova-Kb)復(fù)合物特異的Va2VB5TCR。這些微泡的尺寸不均一，并且如動(dòng)態(tài)光散射和透射電鏡所評(píng)估的，它們的流體動(dòng)力學(xué)半徑在400nm至70nm內(nèi)變化(圖17A)。-旦細(xì)胞裂解并在蔗糖濃度離心以收集耐洗滌性微區(qū)(detergentresistantmicrodomain，DRM)后，微泡會(huì)本能地釋放進(jìn)培養(yǎng)物中。已報(bào)道稱，DRM在TCR/CD3復(fù)合體和共同受體(CD8/CD4)分子中是富集的(Montixi等，TheEMBOJ.17:5334-5348(1998))。本文報(bào)道的是基于SPR的分析的進(jìn)展，其中微泡首先被錨定至固定在Li傳感器芯片(BIAcorelnc.)的表面上的脂質(zhì)連接體(圖171C)。約1600個(gè)應(yīng)答單位(responseuinit，RU)的0T1微泡被錨定至Ll傳感器芯片上，其后為-一段時(shí)間的表面穩(wěn)定化，注射BSA(0.5mg/mL)5分鐘以阻斷非特異性結(jié)合。當(dāng)與對(duì)照VSV-Kb復(fù)合體相比時(shí)，注射Ova-Kb復(fù)合體賦予錨定的OT1微泡特異性的結(jié)合(圖18)。這證實(shí)，SPR分析可被用來(lái)監(jiān)測(cè)在活化或凋亡后是否存在從T細(xì)胞中釋放出微粒。另外，微泡被捕獲在Ll傳感器表面上(以RU單位計(jì))可使用己知尺寸的標(biāo)準(zhǔn)合成微泡和總磷脂量來(lái)定量。因此，可能監(jiān)測(cè)從來(lái)自HIV感染個(gè)體的樣品中的T細(xì)胞釋放出的微泡，并確定經(jīng)受凋亡的T細(xì)胞上的TCR的抗原特異性。T細(xì)胞微泡將被選擇性地捕獲在抗CD3固定的表面上，且隨后使用MHCI類或MHCII類四聚體確定捕獲的微泡的抗原特異性。上述分析并不限于T細(xì)胞微粒，也包括對(duì)來(lái)自B細(xì)胞的微粒的特征進(jìn)行描述。B細(xì)胞特異性四聚體己被開(kāi)發(fā)出來(lái)(參見(jiàn)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/840,423號(hào))且己在SPR結(jié)合分析中和通過(guò)流式細(xì)胞儀被測(cè)試特異性。r一智應(yīng)微纖歪顏微餘東游艦薪述微粒由脫落的質(zhì)膜片段組成并且包括胞質(zhì)元素(Distler等，Athritis&Rheumatism52:3337-3348(2005))。對(duì)于T細(xì)胞微粒，Src激酶、Lck和Fyn和銜接蛋白LAT與脂質(zhì)微區(qū)結(jié)合，并且它們是T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵成分(Zhang等，Immunity,9:239-246(1998);Resh等，Nature,387:617-620(1997);Schade&Levine，Biochem.Biophys.Res.Commun"296:637-643(2002))。因此，所描述的方法將用來(lái)研究在微粒中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)磷酸化狀態(tài)與免疫T細(xì)胞活化或HIV感染之間的關(guān)系。本文使用的策略包括首先使用...匕述MHC四聚體來(lái)描述T細(xì)胞微粒的抗原特異性，隨后界定所發(fā)現(xiàn)的抗原特異性微粒的磷酸化狀態(tài)。所捕獲的微粒將利用BIAcore300的恢復(fù)能力而從BIAcore傳感器芯片上洗脫。洗脫的顆粒隨后被裂解，然后通過(guò)以F步驟確定磷酸化狀態(tài)a)與抗信號(hào)分子抗體(Src激酶、Lck、Fyn、LAT)免疫雜交；和b)2D液相色譜，隨后通過(guò)質(zhì)譜法來(lái)鑒別。洗脫的物質(zhì)將使用2D-LC被分離，且單個(gè)的磷酸化蛋白將使用MALDI-TOF/TOF被分析。使用這種方法鑒別的蛋白質(zhì)將使用與抗磷抗體的普通免疫雜交而被確認(rèn)是磷酸化了的。這種應(yīng)用使得可以描述釋放的微粒的特征，以鑒別免疫細(xì)胞中的活化狀態(tài)和信號(hào)途徑以及它們?cè)诒┞队贖IV感染時(shí)的改變。纖游錄靴"務(wù)定飾層鵬録。對(duì)于HIV-1病毒，其在從感染細(xì)胞芽生的過(guò)程中將細(xì)胞特異性膜蛋白加入其病毒包膜(Hioe等,J.Virol.75:1077-1088(2001);Laio等,AIDSRes.Hum.Retro.16:355-366(2000))，芽生微粒攜帶來(lái)自母細(xì)胞的細(xì)胞表面蛋白標(biāo)記物。這些表面標(biāo)記物是釋放出標(biāo)記物的T細(xì)胞的功能狀態(tài)的跡象標(biāo)記(tell-talesign)。除了基于流式細(xì)胞分析的微粒表型分析外，使用....匕述SPR分析捕獲來(lái)自T細(xì)胞的微粒也是用于確定T細(xì)胞的活化狀態(tài)的新方法。T細(xì)胞的功能狀態(tài)是通過(guò)監(jiān)測(cè)活化標(biāo)記物(CD69、CD25)、凋亡標(biāo)記物(PDl、TRAIL受體、FAS、FasL)的表達(dá)來(lái)確定的。實(shí)施例3HIV-1和SIV感染中的關(guān)鍵時(shí)間是病毒誘導(dǎo)的大量CD4+、CCR.5+T細(xì)胞損失，這種細(xì)胞損失在腸相關(guān)淋巴組織(GALT)中非常嚴(yán)重(Guadalupe等，J.Virol.77:11708-11717(2003)，Brenchley等，J.Exp.Med.200:749-759(2004),Mehandru等，J.Exp.Med.200:761-770(2004))。已有文獻(xiàn)證明GALTCD4T細(xì)胞的耗盡發(fā)生在急性SlVmac239感染的峰值病毒量時(shí)(Veazey等，Science280:427-431(1998),Haase,Nat.Rev.Immunol.5:783-792(2005),Li等，Nature434:1148-1152(2005),Mattapallil等，Nature434:1093-1097(2005))，以及人HIV-1傳播的數(shù)周內(nèi)(Guadalupe等，J.Virol.77:11708-11717(2003)，Brenchley等,J.Exp.Med.200:749-759(2004),Mehandru等，J.Exp.Med.200:761-770(2004))。在急性SIV感染中，30-40%的記憶CD4+T細(xì)胞被感染(Veazey等，Science280:427-431(1998),Haase，Nat.Rev.Immunol.5:783-792(2005),Li等，Nature434:1148-1152(2005)，Mattapallil等，Nature434:1093-1097(2005))。急性HIV-l感染期間免疫細(xì)胞死亡的機(jī)制還是未知，但可能包括通過(guò)HIVTat、Vp:r或gpl20蛋白來(lái)誘導(dǎo)凋亡途徑(Badley等，Blood96:2951-1964(2000),Chase等，TrendsPharmacol.Sci.27:4-7(2006),Boya等，Biochim.Biophys.Acta1659:178-189(2004))、CD4+T細(xì)胞的HIV陽(yáng)l感染(Guadalupe等，J.Virol.77:11708-11717(2003),Mehandm等,J.Exp.Med.200:761-770(2004)，Veazey等,Science280:427-431(1998),Li等,Nature434:1148-1152(2005))和由于例如腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)的分子殺傷引起的未感染細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)(Lum等，J.Virol.75:11128-11136(2001)，Herbeuval等，Clin.Immuno1.123:121-128(2007))。從HIV-1傳播到CD4T細(xì)胞的潛伏性感染庫(kù)的建立的時(shí)間被定義為窗口期，在此時(shí)期內(nèi)預(yù)防性HIV-l疫苗必須消滅HIV-l(Johnston等，N.Engl.J.Med.356:2073-2081(2007,Wong等，BiologyofEarlyInfectionandImpactonVaccineDesign(早期感染的生物學(xué)和對(duì)疫苗設(shè)計(jì)的影響)，第17-22頁(yè)(CaisterAcademicPress,Norfolk,UK(2007))。雖然建立CD4T細(xì)胞潛伏庫(kù)的確切的最早時(shí)間尚且未知，但潛伏庫(kù)最遲在血清轉(zhuǎn)化時(shí)(傳播后的約第25天)有急性HIV-l感染癥狀時(shí)建:立的(Wong等,BiologyofEarlyInfectionandImpactonVaccineDesign(早期感染的生物學(xué)和對(duì)疫苗設(shè)計(jì)的影響)，第17-22頁(yè)(CaisterAcademicPress,Norfolk,UK(2007),Chun等，Proc.Natl.Acad.SciUSA95:8869-8873(1998))。在HIV-l感染的潛伏期或病毒量....i:::升期，未出現(xiàn)CD4、CD8和B細(xì)胞獲得性抗體對(duì)HIV-l的應(yīng)答，但在病毒量(VL)的下降時(shí)以及窗口期后期出現(xiàn)急性感染癥狀時(shí)出現(xiàn)(Reynolds等，J.Virol.79:9228-9235(2005),Abel等，J.Virol.79:12164-12172(2005),Fiebig等，AIDS17:1871-1879(2003))。因此，研究從傳播至血清病毒血癥之間(潛伏期)以及急性HIV-l感染的病毒量...h升期的事件，對(duì)于理解為什么免疫應(yīng)答不在HIV-1傳播后的較早時(shí)發(fā)生是至關(guān)重要的，以及對(duì)于確定成功的疫苗必須克服什么才能消滅HIV-1也是至關(guān)重要的。在下述研究中，提出了這樣的假設(shè)，即，除了腸CD4T細(xì)胞損失夕卜，HIV-1傳播后的早期HIV-1保護(hù)性免疫應(yīng)答的延遲可涉及高水平的免疫抑制物質(zhì)(例如TRAIL、TNFR2和Fas配體)和血漿微粒的產(chǎn)生。如果免疫抑制分子的升高以及早期CD4+T細(xì)胞死亡發(fā)生在HIV-1傳播后的早期，那么這就為HIV-1復(fù)制界定了保護(hù)時(shí)間，而抗H:1V-1T或B細(xì)胞應(yīng)答被抑制。為了研究急性HIV-1感染的潛伏期和早期病毒上升期，使用了血漿供體的儲(chǔ)存(archived)血漿，可獲得的樣品有HIV-1病毒量.匕升期之前、期間和之后的樣品(Fiebig等(AIDS17:1871-1879(2003))。在血漿中出現(xiàn)HIV-1后(對(duì)應(yīng)于傳播后的約第17天)，在血漿中發(fā)現(xiàn)了可溶TRAIL的最初爆發(fā)(burst)。還發(fā)現(xiàn)了圍繞血漿VL的峰值隨后出現(xiàn)的升高的血漿TNFR2水平、Fas配體水平和血漿微粒(MP)水平。這些數(shù)據(jù)暗示TRAIL作為急性HIV-1感染中細(xì)胞死亡的早期中介體，并證實(shí)了HIV-:1疫苗必須消滅傳播病毒的窗口期很窄。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)ii^存,品.從ZeptoMetrixCorporation(Buffalo,NY)獲得血清轉(zhuǎn)化組(HIV-1+/HCV-/HBV-,n=30，HIV-1-/HCV-/HBV+,n=10,禾nHIV-l-,HCV+/HCV-,n=10)。每組由血漿的連續(xù)等分試樣(sequentialaliquots)(4-30)組成，血漿是在急性HIV-1感染期間大概每隔3天收集一次而獲得的(Huang等,J.Immunol.177:2304-1313(2006))。從InnovativeResearch(Southfield,MI)獲得111￥-1-/11(:￥-/118￥-人血漿(n=25)。所有的研究都經(jīng)DukeUniversityHumanSubjectsInstitutionalReviewBoard(杜克大學(xué)人類受試者制度審核委員會(huì))批準(zhǔn)。瘋it^M試通過(guò)QuestDiagnostics(Lyndhurst,NJ)(HIV-1RNAPCRUltra)進(jìn)行HIV-1血漿供體組的病毒量測(cè)試。由Zeptometrix進(jìn)行HCV和HBV病毒量的領(lǐng)!ji式；選:f華(select)HCV病毒量由PhilipNorris,BloodSystemsResearchInstitute,SanFrancisco,CA提供。,源亡游虛f標(biāo)記激遂存根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)對(duì)Fas、Fas配體、TRAIL(Diaclone,BesanconCedex,France)禾卩TNFR2(HycultBiotechnology,Uden，TheNetherlands)進(jìn)行ELISA。在未稀釋的情況下(TRAIL)、在以1:10稀釋的情況下(TNFR2)和在以1:2稀釋的情況下(Fas配體)，分析了血漿。血漿分析物隨時(shí)間的推移的增加被確定為，T0之后與T0之前相比，值增加了>20%。銜亡^^tO/iV定:量.使用流式細(xì)胞儀測(cè)定每個(gè)血漿樣品中MP的數(shù)目。所有流式細(xì)胞分析都在LSRIIFlowCytometer(BDBiosciences,SanJose，CA)上進(jìn)行，且使用FlowJo軟件(Ashland,OR)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在用于任何MP實(shí)驗(yàn)之前，所有的緩沖液(不含鈣、鎂的PBS和含甲醛的PBS(Sigma,St.Louis,MO))都用0.22pm過(guò)濾器(Millipore，Billerica,MA)過(guò)濾。用來(lái)稀釋血漿樣品的緩沖液(ly。甲醛的PBS，不含鈣'和鎂)被用來(lái)確定背景MP計(jì)數(shù)(在流式細(xì)胞儀上計(jì)時(shí)60秒計(jì)數(shù)約150個(gè)事件)。為定義MP門，在流式細(xì)胞儀..t.分析了尺寸在0.1,至lj1)im之間的FluoSpheresFluorescentMicrospheres(MolecularProbes,Eugene,OR)。MP門被圍繞珠粒(包括0.1pm、0.2pm、0.5和1.0珠粒)畫(huà)出。每個(gè)血漿樣品以1:]00和1:誦被稀釋在"/o甲醛/PBS中，用時(shí)60秒獲得數(shù)據(jù)。最佳的樣品稀釋度被實(shí)驗(yàn)性地確定，可接受的標(biāo)準(zhǔn)是血漿的稀釋度伴隨<5%的中斷計(jì)數(shù)，且噪信比<0.1(噪信比-PBS中背景MP計(jì)數(shù)/實(shí)驗(yàn)血漿MP討-數(shù))。微粒麥麥分叛通過(guò)流式細(xì)胞儀分析MP的上述細(xì)胞表面標(biāo)記物(Hosaka等，J.Infect.Dis.178:1030-1039(1998),Stacey等和theNIAIDCentreforHTV7AIDSVaccineImmunology.ElevationsinplasmalevelsofinnatecytokinespriortothepeakinplasmaviremiainacuteHIV-Iinfection(2007),Clark等,N.EnglJ.Med.324:954-960(1991))。血漿樣品(1-2ml)被5ml的過(guò)濾鹽水稀釋，隨后通過(guò)5pm過(guò)濾器(PallCorporation,EastHills,NY)被過(guò)濾。被稀釋的樣品隨后被離心(1小時(shí)200,000xg，4i:)(SorvallRCMl50GX,ThermoFisherScientific,Waltham，MA)。除去2.5ml的上清液，加入2.5ml的新鮮鹽水，再次離心樣品(1小時(shí)200,000xg，4°C)。在lml的過(guò)濾鹽水中洗滌小球2次；最后一次洗滌后，除去900pl的..t清液，將小球重懸在剩F的200iLil的鹽水中。將10)il的MP懸浮液與抗體和/或膜聯(lián)蛋白V—起溫育(總體積為100^d，溫育20分鐘，20°C，黑暗條件)。具有1%83八的鹽水(Sigma)被用作用于與抗體溫育的染色緩沖液，且2.5mMCaCl2被加入緩沖液中，以染色膜聯(lián)蛋白V。作為膜聯(lián)蛋白V對(duì)照，向緩沖液中加入50mMEDTA。溫育后，使用鹽水/甲醛將體積調(diào)整至500nl，并在24小時(shí)內(nèi)使用流式細(xì)胞儀分析。結(jié)合的抗體包括鼠抗人CD45-PE、CD3匿PE、CD61-PerCp、CCR5-PE和同種型對(duì)照(BDBiosciences,SanJose，CA)，且膜聯(lián)蛋白V結(jié)合至AlexaFluor647(MolecularProbes,Eugene,OR)。逾f徵發(fā)游培籍分叛將8ml的血漿以1:5稀釋在過(guò)濾鹽水中，離心使MP成為小球(200,000xg，1小時(shí)，4°C)。在1ml的鹽水中將小球洗滌2次(100，000xg,30分鐘)。將MP小球重懸在500pi的鹽水中，并覆蓋在1ml的40%蔗糖溶液(在鹽水中)上，并離心MP(lOO,OOOxg，90分鐘)。使小球固化(fix)(1%甲醛，4。C過(guò)夜)、成為小球U00,00xg，60分鐘)，隨后固化在1%四氧化鋨中。切出超薄的截面并乙酸鈾酰后染色，并在PhilipsCM12電鏡(FEICo"Hillsboro,OR)匕檢査。#7^霸凝^##漠遼在杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)中心從實(shí)施過(guò)扁桃體切除術(shù)的兒童患者和成人患者獲得了扁桃體。一旦切除，將扁桃體放在運(yùn)輸培養(yǎng)基中(具有L-谷酰胺(Gibco,Carlsbad,CA)的RPMI1640)，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有200U/ml青霉素G、200昭/ml鏈霉素、50jug/ml慶大霉素和1pg/ml兩性霉素B(Sigma)，并將扁桃體運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室以在4小時(shí)內(nèi)處理。將扁桃體在具有L-谷酰胺并補(bǔ)充有100U/ml青霉素G、100昭/ml鏈霉素、50昭/ml慶大霉素和2嗎/ml兩性霉素B的RPM11640中充分洗滌，以防止細(xì)菌和真菌污染。為分離扁桃體淋巴細(xì)胞，將樣品機(jī)械地切碎并使用消毒過(guò)的鑷子切開(kāi)，所產(chǎn)生的單細(xì)胞懸浮液被處理通過(guò)70pm尼龍細(xì)胞過(guò)濾器(BDBiosciences)。使用淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)(FisherScientific,Pittsburg,PA)分離淋巴細(xì)胞并洗滌兩次。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，使用GuavaEasyCyteMini(Hayward,CA)測(cè)定細(xì)胞數(shù)目和成活力。將細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)充有100U/ml青霉素G、100嗎/ml鏈霉素、25(ig/ml慶大霉素、1pg/ml兩性霉素B和10%FBS(GeminiBioproducts,WestSacramento,CA)的RPMI1640中，培養(yǎng)密度為1ml的總體積為lxl(f個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)在5ml聚苯乙烯圓底管(BDBiosciences)中進(jìn)行。為了刺激抗體產(chǎn)生，將細(xì)胞與oCpG的優(yōu)化的雞尾酒(cocktail)(ColeyPharmaceuticalGroup,Wellesley,MA)禾口美洲商陸有絲分裂原提取物(PWM)1/2000(Crottyetal,J.Immunol.Methods286:111-122(2004)—起培養(yǎng)。培養(yǎng)5日后，收集上清液并通過(guò)ELISA測(cè)定存在于培養(yǎng)上清液中的總IgG和IgA的量。簡(jiǎn)言之，使用純化的鼠抗人IgGFc(HRL，Baltimore,MD)或純化的鼠抗人IgA(BDPharmingen)在0.1MNa.HC03將96孔ELISA板(Coming，Coming,NY)涂敷過(guò)夜。使用洗滌緩沖液(具有0.1%Tween的PBS(Sigma))洗滌孔3次。使用稀釋緩沖液(1%FBS,0.5%BSA(Sigma)和0.05%Tween)在20'C歷時(shí)2小時(shí)將孔封閉。將孔洗滌3次，并加入用稀釋液以1:2稀釋的...b清液。在4'C將板溫育過(guò)夜，并洗滌3次。加入生物素化的鼠抗人IgGFc(HRL)或生物素化的鼠抗人IgA(BDPharminge)，并將板在20"C溫育2個(gè)小時(shí)。洗滌3次后，加入辣根過(guò)氧化物酶鏈霉親和素(VectorLaboratories,Burlingame,CA)并將板在20"C溫育45分鐘。將板洗滌3次，使用3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、底物和終止溶液體系(K:PL,Gaithersburg,MD)繼續(xù)該分析。使用純化的IgG和IgA(Sigma)的連續(xù)稀釋來(lái)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)使用星形孢菌素來(lái)處理正常供體PBMC或扁桃體細(xì)胞而獲得微粒(Bell等，Am.J.Physiol.CellPhysiol.291:C1318-CI325(2006))。在GuavaEasyCyteMini上進(jìn)行細(xì)胞成活力和細(xì)胞計(jì)數(shù)的測(cè)試，5"07個(gè)細(xì)胞被培養(yǎng)在具有.L-谷酰胺、補(bǔ)充有25)ig/ml慶大露素、1(^FBS和:^M星形孢菌素(Sigma)的5mlRPMI1640中。培養(yǎng)過(guò)夜后，收集細(xì)胞和上清液，并離心2次(5min，400xg，4°C)。隨后在超速離心機(jī)中將不含細(xì)胞的....匕清液離心以收集MP(30分鐘，200,000xg，4°C)，使用RPMI1640洗滌MP1次，并將MP重懸在1000pi的新鮮RPMI中，添加100)Lll的MP懸浮液以選擇扁桃體細(xì)胞培養(yǎng)物(或不同的提及以測(cè)定劑量依賴性)。統(tǒng)^學(xué)分叛如在圖和圖的說(shuō)明中所指出的，使用boxplot分析、Student氏t檢驗(yàn)和WilcoxonRankSum分析來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。為了建立起在所有血漿血清轉(zhuǎn)化組中的參考點(diǎn)，時(shí)間0(TO)被定義為對(duì)于HIV-1來(lái)說(shuō)病毒量達(dá)到100拷貝/ml的那天，對(duì)于HCV來(lái)說(shuō)病毒量達(dá)到600拷貝/ml的那天，對(duì)于HBV來(lái)說(shuō)病毒量達(dá)到700拷貝/ml的那天。為了測(cè)定HIV-1感染、HBV感染和HCV感染期間凋亡的血漿標(biāo)記物的增加百分?jǐn)?shù)，第0天之前的平均TRAIL、TNFRW或Fas配體水平被與第O天后的平均水平比較，并計(jì)算出增加百分?jǐn)?shù)([(第O天后的平均數(shù)-第0天前的平均數(shù))/第O天后的平均數(shù)]xlOO)。結(jié)果;急絲/Z/r-7感_#激/坊77^/丄、77W^2浙Fm紀(jì)體ifc^/人乎凝,裔測(cè)定了30個(gè)HIV-1病人、10個(gè)HCV病人和IO個(gè)HBV病人的時(shí)間點(diǎn)(TO)，該時(shí)間點(diǎn)被定義為每個(gè)病毒量測(cè)定的檢測(cè)較低限度(圖19)。隨后分析了每個(gè)血漿供體的連續(xù)血槳樣品中的可溶TRAIL、TNFR2和Fas配體(圖20A)。血漿中TRAIL水平、TNFR2水平和Fas配體水平的變化百分?jǐn)?shù)通過(guò)將TO前的平均分析物水平與TO后的平均水平比較而測(cè)定；根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)，27/30證實(shí)了TRAIL的增加；26/30具有增加的TNFR2;22/30具有增加的Fas配體水平。己報(bào)道稱，丙肝和乙肝感染都誘導(dǎo)肝細(xì)胞的細(xì)胞死亡(Chase等，TrendsPharmacol.Sci.27:4-7(2006),Chou等，J.Immunol.174:2160-2166(2005))。作為對(duì)照，HCV和HBV急性感染的受試者證實(shí)，TRAIL、TNFR2或Fas配體的>20%的增長(zhǎng)在HBV急性感染的受試者中分別只有0/10、3/10和2/10個(gè)受試者，而在HCV急性感染的受試者中分別只有1/10、6/10和7/10個(gè)受試者(圖20C、21B)。第二，將峰值病毒量時(shí)的細(xì)胞死亡血漿分析物水平與從病毒量...t:升之前的受試者抽取的樣品比較，并與未受感染血漿比較。峰值病毒量時(shí)的平均TRAIL水平、TNFR2水平和Fas配體水平顯著不同于在TO前從每個(gè)急性HIV-1感染病人抽取的最早的血漿樣品(對(duì)于TRAIL,p=0.0075;對(duì)于TNRF2，p=U8xl(T5;對(duì)于Fas配體，p=3.88xl(T6)(圖21A)。峰值TRAIL水平、TNFR2水平和Fas配體水平也顯著不同于在未受感染的血漿樣品對(duì)照中的TRAIL水平、TNFR2水平和Fas配體水平(p值分別為p=2.16xl(T8、p=6.16xl0—9和p=1.64xl(T6)(圖21A)。第三，為研究與峰值血漿VL相比，TRAIL、TNFR2和Fas配體的峰值水平的時(shí)序，測(cè)定了凋亡分析物峰值與峰值血漿VL之間的臨時(shí)關(guān)系式。還研究了血漿細(xì)胞死亡分析物的峰值發(fā)生在HIV-1病毒量峰值之前、同時(shí)或之后的受試者的數(shù)目(圖21B)。大部分急性HIV-1感染受試者(對(duì)于TRAIL為30/30、對(duì)于TNFR2是27/30，對(duì)亍Fas配體是26/30)證實(shí)，峰值分析物水平發(fā)生在30天的期限內(nèi)(即，病毒量峰值時(shí)間之前15天，或病毒量峰值時(shí)間之后15天內(nèi))。特別感興趣的是，大部分受試者的TRAIL水平(21/30)在峰值病毒量之前達(dá)到峰值，而TNFR2和Fas配體水平更加通常與病毒量同時(shí)達(dá)到峰值(圖21B)。第四，為了分析在病毒量上升期間，峰值分析物水平相對(duì)病毒擴(kuò)張速度的時(shí)序，進(jìn)行了配對(duì)Wilcoxon秩檢驗(yàn)(圖21C)。峰值病毒擴(kuò)張速度的那天說(shuō)明TO后病毒以最大速度擴(kuò)張的那天。在24個(gè)血漿供體中(其中VL擴(kuò)張速度可被計(jì)算)，峰值病毒擴(kuò)張速度平均發(fā)生在TO后的第5.5天(圖21C)。血漿TRAIL水平在最大病毒擴(kuò)張速度后的1.7天到達(dá)峰值(T0后第7.2天)，而TNFR2水平在最大病毒擴(kuò)張速度后的7.5天(TO后第13天)，且Fas配體水平在最大病毒擴(kuò)張速度后的9.8天(T0后第15.3天)達(dá)到峰值。血漿供體HIV-1VL平均在TO后的13.9天達(dá)到其峰值(中值為13天，四分位差范圍為3天)，這表明TRAIL水平在VL達(dá)到峰值之前很早就達(dá)到峰值，而TNFR2和Fas配體在接近于嚴(yán)高VL水平的時(shí)候達(dá)到峰值水平。峰值血漿TRAIL水平平均為2011pg/ml(在886-4138pg/ml的范圍)。該TRAIL水平處于誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡的活性的生物學(xué)相關(guān)濃度范圍內(nèi)21。血資微敉游定量流《教游議分叛血漿MP是多種類型活化細(xì)胞或凋亡細(xì)胞的正常副產(chǎn)物，或是從多泡體(外來(lái)體)中得來(lái)(Distler等，Autoimmunity39:683-690(2006),Piccin等，BloodRev.21:157-171(2007))(圖25)。30個(gè)血漿供體的18個(gè)(60%)證實(shí)峰值MP水平接近(TO前15天內(nèi)或TO后15天內(nèi))病毒量峰位，且這18個(gè)峰值中的11個(gè)緊接在病毒量峰值之前出現(xiàn)，而4/18在VL峰值時(shí)達(dá)到峰值(表1和圖22A)。10個(gè)HCV供體中的5個(gè)(50%)具有相似的MP提高，但所研究的10個(gè)HBV組中只有2個(gè)(20%)類似峰值VL的MP水平的提高(圖22B)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>從急性HIV-1感染病人6244、在來(lái)自峰值VL和峰值MP時(shí)(圖22A屮的第10天)的蔗糖梯度純化的MP上研究峰值病毒量時(shí)的MP形態(tài)，發(fā)現(xiàn)尺i不均-、尺寸范亂為10nm節(jié)lOOOnm(圖23A)。虛;^微#貨游變形舒/^化.雖然人多數(shù)MP的農(nóng)艱分析使用在數(shù)小吋內(nèi)處理過(guò)的新鮮血漿(Jy等，J.Thromb.Haemost.2:1842-1851(2004))，似是此研究屮的血漿供體樣品己被凍融.f少2次。研究發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)凍融循環(huán)品著降低rCD3、CD45+、CD61+和膜聯(lián)蛋A+MP的Cf分?jǐn)?shù)(閣26)。岡此，不能精確地量化血漿MP的農(nóng)型，以定量方式分析MP的膜聯(lián)蛋白和CCR5農(nóng)達(dá)，以確定在五個(gè)血漿供體峰值MP樣品和未受感染的第一個(gè)樣品屮在峰值MP時(shí)是否存在MP表込膜聯(lián)蛋白或CCR5的情況。股聯(lián)蛋白+和CCR5+MP都存在丁-血漿供休血漿屮；對(duì)于膜聯(lián)蛋白，MP峰值時(shí)的平均。/o+為12%，范圍為2.3%-38.0%;對(duì)于CCR5十MP，MP峰值時(shí)的％+為5.7%，范圍為1.1%-12.6%(圖23B、23C)。對(duì)于CCR5+(非膜聯(lián)蛋白+MP),與第一組樣品相比，峰值MP時(shí)趨向于具有較高的MP數(shù)H(圖23C)。雖然平均峰值HIV-1VL水平為1,421,628拷貝/ml，總MP的15個(gè)平均峰值為606,88l,733/ml。因此，MP平均比急性fflV-l感染期間血漿中病毒峰值時(shí)的病毒數(shù)目大427倍。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>*校.1卜:的mp水平——新鮮血漿中與兩次凍融血漿中的mp水平定顯顯不2次凍融血漿中的MP水平增加20。/。。l大l此，平均MP水平校i卜:了20。/。。沐^/a/p誘.9游s潘應(yīng)辨敘雖然"知血.漿mp對(duì)y:噬細(xì)胞和dc貝.有抑制作用(Hoffmann等，丄Immunol.174:1393-1404(2005),Huynh等，J.Clin.Invest.109:41-50(2002))，但只有--個(gè)研究表明MP可能抑制B細(xì)胞活化(Koppler等，Eur.J.Immunol.36:648-660(2006))。對(duì)MP對(duì)人記憶B細(xì)胞活化的作用特別感興趣，因?yàn)橄胍氖莻鞑ズ罂焖俚牟《菊T導(dǎo)的記憶B細(xì)胞應(yīng)答。為了確定PBMC來(lái)源的或扁桃體白細(xì)胞來(lái)源的MP是否可以抑制記憶B細(xì)胞活化，使用美洲商陸有絲分裂原(PWMHB類(dass)oCpG來(lái)進(jìn)行記憶B細(xì)胞Ig誘導(dǎo)分析(Crotty等，J.Immunol.Methods286:111-122(2004))。向PWM刺激的扁桃體細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)中加入MP使得總IgG產(chǎn)量和總IgA產(chǎn)量分別降低了70.8%+/-SEM(p=0.0064)和94.2%+/-SEM(p=0.00004)(圖24A);MP的B細(xì)胞抑制是劑量依賴性的(圖24B)。當(dāng)MP產(chǎn)生于自體扁桃體白細(xì)胞或JurkatT細(xì)胞系時(shí)，觀察到了相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)。概括地說(shuō)，此研究中的主要發(fā)現(xiàn)是，在血漿供體中TRAIL的峰值早先出現(xiàn)在傳播的第17天，這暗示TRAIL/DR5處于緊接傳播后的HIV-l誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的關(guān)鍵途徑中?；隗w內(nèi)研究和HIV-l+進(jìn)行性(progressor)扁桃體組織的研究，CD4+T細(xì)胞凋亡的IFN-a、TRAIL、DR5途徑已被提議用于慢性HIV-l感染(L畫(huà)等，J.Virol.75:11:128-11136(2001),Herbeuval等，Clin.Immunol.123:121-128(2007)，Herbeuvel等，Blood106:3524-3531(2005))。受感染的受試者體內(nèi)的CD4+T細(xì)胞因?yàn)樯险{(diào)的TRAIL受體DR5的原因，與來(lái)自未受感染的受試者的C.D4+T細(xì)胞相比，對(duì)TRAIL介導(dǎo)的凋亡更加敏感(Lum等，J.Virol.75:11128-11136(2001)，Herbeuval等，Clin.Immunol.123:121-128(2007),Herbeuvel等，Blood106:3524-3531(2005),Jeremias等，Eur.J.Immunol.28:143-152(1998))。在體內(nèi)，HIV-lgpl20(Herveuval等，Blood105:2458-2464(2005))誘導(dǎo)單核細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹(shù)突細(xì)胞I.FN-a，后者又誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞TRAIL(Lum等，J.Virol.75:11128-11136(2001),Herbeuval等，Clin.Immunol.123:121-128(2007)，Herbeuvel等，Blood106:3524-3531(2005))。還報(bào)道過(guò)HIV-lTat誘導(dǎo)TRAIL,這是CD4+T細(xì)胞的旁觀者殺傷的機(jī)制(Yang等，J.Virol.77:6700-6708(2003))。26一個(gè)重要的問(wèn)題是，為什么血漿TRAIL水平比血漿Fas配體、TNFR2和MP在HIV-l傳播后較早達(dá)到峰值？TRAIL、Fas配體和TNFR2的血漿升高發(fā)生在慢性HIV-1中，且可通過(guò)免疫細(xì)胞活化、細(xì)胞死亡或兩者同時(shí)來(lái)誘導(dǎo)(Herveuval等，Blood105:2458-2464(2005),Aukrust等，J.Infect.Dis.169:420-424(1994),Hober等，Infection24:213-217(1996),Hosaka等，J.Infect.Dis.178:1030-1039(1998))。Stacy等(Stacey等和theNIAIDCentreforHIV/AIDSVaccineImmunology.ElevationsinplasmalevelsofinnatecytokinespriortothepeakinplasmaviremiainacuteHIV-Iinfection(2007))在相同血漿供體中發(fā)現(xiàn)了IFN-a的爆發(fā)，該爆發(fā)與在此研究中看到的TRAIL峰值的時(shí)序同時(shí)。因此，血漿TRAIL峰值在VL血漿峰值之前可能是由于早期凋亡引起，但也可能是由于應(yīng)答上升的VL的免疫活化和IFN-a的pDC生成引起的。假設(shè)提高的血漿Fas配體、TNFR2和微粒的較后出現(xiàn)可能是由于或應(yīng)答大量細(xì)胞死亡引起的，因?yàn)榇朔逯蹬c細(xì)胞死亡峰值在相似的時(shí)間達(dá)到(在恒河猴的實(shí)驗(yàn)性SIV感染中被證明)(Veazey等，Science280:427-431(1998),Haase，Nat.Rev.Immunol.5:783-792(2005)，Li等，Nature434:1148-1152(2005),Mattapallil等，Nature434:1093-1097(2005))。Veazey(Mattapallil等，Nature434:1093-1097(2005))記載了CD4+腸T細(xì)胞損失發(fā)生在早至SIV感染后的第7天。在人體中，Guadalupe等(J.Virol.77:11708-11717(2003)，Mehandm等，J.Exp.Med.200:761-770(2004))和Mehandru和其同事(Brenchley等，J.Exp.Med.200:749-759(2004))分別在HIV-1感染的第一個(gè)月內(nèi)研究了2個(gè)、l個(gè)和9個(gè)病人，發(fā)現(xiàn)腸CD4+T細(xì)胞耗盡了。HIV-1感染的潛伏期是指從傳播到出現(xiàn)血漿病毒血癥的吋間，估計(jì)為10天(7-21天的范圍內(nèi))(Clark等,N.Engl.J.Med.324:954-960(1991),Gaines等，BMJ297:1363-1368(1988),Littl等，J.Exp.Med.190:841-850(1999),Schacker等，Ann.Intern.Med.125:257-264(1996))。從出現(xiàn)HIV-1病毒血癥到第一個(gè)抗體應(yīng)答和有癥狀的HIV-1感染(因此建立了潛伏池)的時(shí)間約為14天(Cooper等，J.Infect.Dis.155:1113-1118(1987),Daar等，N.Engl.J.med.324:961-964(1991),Gaines等，Lancet1:1249-1253(1987))。因此，預(yù)防性HIV-1疫苗生效而沒(méi)有細(xì)胞死亡誘導(dǎo)的免疫抑制的最大窗口期為約24天。由于凋亡和免疫抑制的中介體早在傳播后的第17天即存在(10天平均潛伏期+T0后7天的TRAIL發(fā)作)，窗口期被縮短至約14-17天。在急性HIV-1感染的早期存在TRAIL、TNFR2和提高的MP表明，至少有四種潛在的免疫抑制機(jī)制。第一，直接的HIV-1感染導(dǎo)致大部分004+T細(xì)胞損失，即使受感染的細(xì)胞的數(shù)目不是所有〔04+T細(xì)胞耗盡的原因(Guadalupe等，J.Virol.77:11708-11717(2003),Brenchley等，J.Exp.Med.200:749-759(2004)，Mehandru等，J.Exp.Med.200:761-770(2004)，F(xiàn)iebig等，AIDS17:1871-1879(2003))。第二，在未受感染的CD4+T細(xì)胞屮，TRAIL誘導(dǎo)旁觀者殺傷(Lum等，J.Virol.75:11128-11136(2001),Herbeuval等，Clin.Immunol.123:121-128(2007),Herveuval等，Blood105:2458-2464(2005))。在這點(diǎn)匕Miura等(J.Exp.Med.193:651-660(2001))顯示在HIV-1感染的人-PBL-NOD-SC1D鼠屮施用抗TRAILmAb顯著降低/CD4+T細(xì)胞凋亡。第三，免疫應(yīng)答的抑制可通過(guò)T細(xì)胞MP來(lái)介導(dǎo)(Huang等，J.Immunol.177:2304-1313(2006)，Distler等，Arth.Rheum.52:33337-3348(2005),Krysko等,Apoptosis11:1709-1726(2006))。CXCR4+和CCR5+MPn丁將共問(wèn)受體轉(zhuǎn)移全:共同受體陰性的細(xì)胞，使得它們易受HIV-1感染(Mack等，Nat.Med.6:769-775(2000),Rozmyslowicz等，AIDS17:33-42(2003))。MP經(jīng)山R噬細(xì)胞的噬菌作川釋放TGF-前列腺素E2和IL-IO，它們可抑制抗原特異性T和B細(xì)胞應(yīng)答(Huang等，J.Immunol.177:2304-1313(2006)，Hoffmann等，J.Immunol.174:1393-1404(2005),Huynh等，J.Clin.Invest.109:41-50(2002))。在這點(diǎn)上，Estes等(J.Infect.Dis.193:703-712(2006))已證實(shí)，在SIV感染后的第12天，淋巴結(jié)TGF-B和IL-10具有劇烈的增加。幣.:要的站，已.".接顯示PBMC和扁桃體細(xì)胞MP可/i:接抑制iL!憶B細(xì)胞活化(圖24)。最后，F(xiàn)as配體和TRAIL被加入MP中(Huynh等，J.Clin.Invest.109:41-50(2002),Koppler等，Eur.J.Immunol.36:648-660(2006),Cotty等，J.Immunol.Methods286:111-122(2004))。Fas配體表達(dá)MP可直接誘導(dǎo)鄰近細(xì)胞的凋亡(Huang等，J.Immunol.177:2304-1313(2006)，Jodo等，J.Biol.Chem.276:39938-39944(2001)，Monleon等，J.Immunol.167:6736-6744(2001))。活化的T細(xì)胞可以是Fas配體介導(dǎo)的促凋亡微泡的靶標(biāo)(Monleon等，J.Immunol.167:6736-6744(2001))。Salvato等(ClinicalandDevelopmentalImmunology(2008)))最近表明使用抗Fas配體的mAb處理SIV感染的獼猴削弱了疾病并且可能導(dǎo)致對(duì)SIV升高的抗體應(yīng)答。因此，在HlV-1傳播的最初的2-3周，高水平的生物活性血漿介質(zhì)和細(xì)胞死亡的副產(chǎn)物的產(chǎn)生引起以下的觀念，即，預(yù)防性疫苗工作的窗口期可能比之前想像的要短，即，在傳播的最初14-17天內(nèi)，這給在傳播后形成穩(wěn)健的抗HIV-l免疫性的可利用時(shí)間帶來(lái)相當(dāng)大的限制。預(yù)防性疫苗的候選者可能需要靶定誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的HIV-1分子，并被設(shè)計(jì)以誘導(dǎo)對(duì)HIV-1的保護(hù)性免疫應(yīng)答，該誘導(dǎo)將以在傳播時(shí)的最大抑制水平進(jìn)行，或作為二次免疫應(yīng)答在數(shù)小時(shí)至數(shù)天內(nèi)增強(qiáng)的方式進(jìn)行，以在HIV-1誘導(dǎo)的免疫抑制出現(xiàn)之前消滅HIV-1。通過(guò)HIV或其他傳染病的疫苗來(lái)抑制細(xì)胞凋亡和免疫抑制性MP介導(dǎo)的效應(yīng)也可能是重要的。這可通過(guò)，例如，誘導(dǎo)抗脂質(zhì)抗體或抗微粒其他成分的抗體的HIV疫苗成分來(lái)實(shí)現(xiàn)，以便清除微粒和/或阻斷微粒毒性作用。本文的數(shù)據(jù)的另-一種用途是作為HIV-1處理的基本原理。例如，抗TNFR或TNF-a的抗體、抗磷脂酰絲氨酸抗體或其他細(xì)胞死亡抑制劑(Fas-Fc作為FAS-FAS配體相互作用的抑制劑，DR5-Fc作為TRAILD.R5相互作用的抑制劑)可被用來(lái)作為治療手段抑制HIV中的細(xì)胞死亡。通過(guò)引用將以上引用的所有文獻(xiàn)和其他信息源以它們的整體形式合并至本文中。權(quán)利要求1.一種使用抗HIV藥物識(shí)別需要治療的人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的病人的方法，該方法包括i)從所述病人獲得血漿樣品，和ii)測(cè)定在所述樣品中的Fas配體、腫瘤壞死因子受體2(TNFR2)、微粒或TRAILA的水平，其中相對(duì)于對(duì)照具有升高的Fas配體、TNFR2、微?；騎RAIL的血漿水平的病人是需要所述治療的病人。2.如權(quán)利要求1的方法，其中所述對(duì)照是所述病人感染HIV前的Fas配體、TNFR2、微粒或TRAIL的血漿水平，或未受感染的病人的Fas配體、TNFR2、微粒或TRAIL的血漿水平。3.如權(quán)利要求1的方法，其中需要所述治療的所述病人具有是所述對(duì)照至少兩倍的Fas配體、TNFR2、微?；騎RAIL的血漿水平。4.如權(quán)利要求l的方法，其中微粒的水平被測(cè)定。5.如權(quán)利要求1的方法，其中微粒的水平是通過(guò)流式細(xì)胞儀來(lái)測(cè)定的，或通過(guò)被捕獲在抗體覆蓋的板上的微粒來(lái)測(cè)定。6.如權(quán)利要求l的方法，其中所述微粒是CD45+、磷脂酰絲氨酸+或CCR5+。7.如權(quán)利要求l的方法，其中Fas配體的水平被測(cè)定。8.如權(quán)利要求l的方法，其中Fas配體的水平是通過(guò)ELIZA分析來(lái)測(cè)定的。9.如權(quán)利要求l的方法，其中所述TNFR2的水平被測(cè)定。10.如權(quán)利要求1的方法，其中TNFR2的水平是通過(guò)ELIZA分析來(lái)測(cè)定的。11.如權(quán)利要求l的方法，其中TRAIL的水平被測(cè)定。12.如權(quán)利要求1的方法，其中TRAIL的水平是通過(guò)ELIZA分析來(lái)測(cè)定的。13.如權(quán)利要求l的方法，其中所述識(shí)別是在急性HIV感染期間實(shí)現(xiàn)的。14.-,檢測(cè)感染HIV的病人的免疫系統(tǒng)破壞的方法，其包括i)從所述病人獲得血清樣品，和ii)測(cè)定所述樣品中的微粒的水平，其中所述微粒是磷脂酰絲氨酸+、CCR5+、CD3+或CD19+,其中相對(duì)于對(duì)照具有所述微粒的升高的血漿水平的病人是遭受免疫系統(tǒng)破壞的病人。15.如權(quán)利要求14的方法，其中所述對(duì)照是在所述病人感染HIV之前的微粒的血漿水平，或未受感染病人的微粒的血漿水平。16.如權(quán)利要求14的方法，其中遭受免疫系統(tǒng)破壞的0f述病人具有是所述對(duì)照的至少兩倍的微粒的血漿水平。17.如權(quán)利要求14的方法，其中所述微粒是CD45+。18.如權(quán)利要求14的方法，所述方法進(jìn)一步包括測(cè)定所述樣品中的Fas配體、TNFR2或TRAIL的水平，其中相對(duì)于對(duì)照升高水平的Fas配體、TNFR2或TRAIL是所述病人的免疫系統(tǒng)破壞的進(jìn).一步指示。全文摘要本發(fā)明大體涉及人類免疫缺陷病毒(HIV)，特別涉及一種監(jiān)測(cè)HIV感染的強(qiáng)度并預(yù)測(cè)發(fā)展成獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的時(shí)間的方法。文檔編號(hào)C12Q1/70GK101622364SQ200880002138公開(kāi)日2010年1月6日申請(qǐng)日期2008年1月11日優(yōu)先權(quán)日2007年1月11日發(fā)明者南?！·斯密斯,巴頓·F·海恩斯申請(qǐng)人:杜克大學(xué)