專利名稱：滲透休克細(xì)胞的設(shè)備與方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及用于從細(xì)胞周質(zhì) 分離分子的設(shè)備和方法。
背景技術(shù)：
在很多商業(yè)生物工藝中，使用機(jī)械的細(xì)胞破碎釋放胞內(nèi)內(nèi)容物。這個(gè)步 驟釋放所有胞內(nèi)內(nèi)容物，導(dǎo)致進(jìn)一步的下游單元操作中的重大挑戰(zhàn)。對于細(xì) 菌周質(zhì)空間中的蛋白質(zhì)分子，已經(jīng)使用實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的分批滲透休克步驟以選 擇性地釋放周質(zhì)內(nèi)容物而不完全破碎細(xì)胞。這樣的方法通常首先用高摩爾濃 度鹽或糖溶液(浸泡緩沖液)平衡發(fā)酵液，從而在細(xì)胞內(nèi)建立高的滲透壓力。然 后以分批模式與低同滲濃度的緩沖液(休克緩沖液)混合有限的時(shí)間，以釋放周 質(zhì)內(nèi)容物。釋放后通過離心去除細(xì)胞。這個(gè)傳統(tǒng)的批式方法耗費(fèi)時(shí)間，而且 有其他局限，比如難于放大、接觸時(shí)間的精確控制和低通量。這些因素限制 了其在目的分子的大規(guī)模釋放中的適用性。因而，可以克服這些限制的方法 和設(shè)備將是本領(lǐng)域中的改進(jìn)。
發(fā)明概述
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，制備重組目的多肽的方法包括發(fā)酵用重組 表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述重組表達(dá)系統(tǒng)能使目的多肽分泌入所述宿主 細(xì)胞的周質(zhì)中。發(fā)酵在發(fā)酵培養(yǎng)基中在使目的多肽分泌入宿主細(xì)胞的周質(zhì)中 的條件下進(jìn)行。通過對發(fā)酵培養(yǎng)基中包含的宿主細(xì)胞施以連續(xù)的滲透休克而 從周質(zhì)提取目的多肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，公開了用于滲透休克細(xì)胞的設(shè)備。設(shè)備可
以包括包含細(xì)月包的第一溶液的第一儲(chǔ)罐(first reservoir containing cells in a first solution)和包含第二溶液的第二儲(chǔ)罐。第一溶液的同滲濃度高于第二溶液。設(shè) 備可以進(jìn)一步包括產(chǎn)生包含第 一溶液的第 一流體流的裝置，產(chǎn)生包含第二溶 液的第二流體流的裝置，和將第一和第二流體流合并(combine)為第三流體流
的裝置。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了用于滲透休克細(xì)胞的方法。方法可以包括 提供包含細(xì)胞的第一溶液和第二溶液。第一溶液的同滲濃度高于第二溶液的 同滲濃度。方法可以進(jìn)一步包括產(chǎn)生包含第一溶液的第一流體流，產(chǎn)生包含 第二溶液的第二流體流，和將第一和第二流體流合并為第三流體流。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了從細(xì)胞分離重組目的多肽的方法。方法可 以包括提供包含產(chǎn)生目的多肽的細(xì)胞的第一溶液。細(xì)胞將目的多肽分泌入細(xì) 胞的周質(zhì)空間中。方法可以進(jìn)一步包括提供第二溶液，其中第一溶液的同滲 濃度高于第二溶液的同滲濃度。方法可以進(jìn)一步產(chǎn)生包含第 一溶液的第 一流 體流，產(chǎn)生包含第二溶液的第二流體流，將第一和第二流體流合并為第三流 體流，和將來自細(xì)胞周質(zhì)的重組目的多肽釋放入第三流體流。然后可以從第 三流體流去除細(xì)月包。
附圖簡述
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)了解的是，各圖中描述的元件沒有按照比例，僅 僅是出于說明的目的。通過參考本發(fā)明如下的詳述、所附的權(quán)利要求和幾幅 圖，將更清楚地理解本發(fā)明的特性(nature)以及本發(fā)明的實(shí)例實(shí)施方案。其中

圖1是用于滲透休克細(xì)胞的實(shí)例設(shè)備的示意圖；和 圖2是用于滲透休克細(xì)胞的另 一個(gè)實(shí)例設(shè)備的示意圖。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及對細(xì)胞進(jìn)行滲透休克的設(shè)備和方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過 使用滲透休克而制備重組肽的方法和設(shè)備。對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員顯而易 見的是，本文所述實(shí)施方案為說明性的，并不意欲限定本發(fā)明或所附權(quán)利要 求的范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解的是，可以在不背離本發(fā)明范圍的 情況下對本文提出的實(shí)施方案進(jìn)行各種組合或修改。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，制備重組目的多肽的方法包括發(fā)酵用重組 表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述重組表達(dá)系統(tǒng)能將目的多肽分泌入宿主細(xì)胞 的周質(zhì)中。在發(fā)酵培養(yǎng)基中在使目的多肽分泌入宿主細(xì)胞的周質(zhì)中的條件下
進(jìn)行發(fā)酵。目的多肽可以選自下組干擾素、白介素、生長激素、生長因子、 細(xì)胞因子、酶、酶抑制劑、抗體和抗體片段。通過對發(fā)酵培養(yǎng)基中包含的宿 主細(xì)胞施以連續(xù)的滲透休克而從周質(zhì)提取目的多肽。根據(jù)具體的實(shí)施方案， 對宿主細(xì)胞施以連續(xù)的滲透休克包括提供包含細(xì)胞的第 一溶液，和提供第二 溶液，其中第一溶液的同滲濃度高于第二溶液的同滲濃度。產(chǎn)生包括第一溶 液的第一流體流，并產(chǎn)生包括所述第二溶液的第二流體流。然后將第一和第 二流體流合并為第三流體流?？赏ㄟ^將高摩爾濃度的漿料與低摩爾濃度的休 克緩沖液連續(xù)混合來完成連續(xù)的滲透休克。高摩爾濃度漿料可以選自例如下 組高的糖或鹽溶液。低摩爾濃度休克緩沖液可以選自例如下組Tris、 Bis-Tris 和磷酸鹽。方法還可以任選地包括在從細(xì)胞釋放滲透壓力之后或之前使用熱 交換器，在從細(xì)胞釋放滲透壓力之前或之后施用溶劑，和在從細(xì)胞釋放滲透 壓力之前或之后進(jìn)行化學(xué)處理。
參考圖1，其說明了根據(jù)本發(fā)明的用于滲透休克細(xì)胞的設(shè)備100的實(shí)例 實(shí)施方案的示意圖。如圖所示，設(shè)備100包括包含第一溶液106的第一儲(chǔ)罐 102。第一溶液106中所示為細(xì)胞108。設(shè)備100進(jìn)一步包括包含第二溶液110 的第二儲(chǔ)罐104。在第一儲(chǔ)罐102和第二儲(chǔ)罐104底部所示為產(chǎn)生流體流的 裝置111A和111B。產(chǎn)生第一流體流的裝置111A產(chǎn)生包含第一溶液106和細(xì) 胞108的第一流體流112。產(chǎn)生流體流的裝置111B產(chǎn)生包含第二溶液110的 第二流體流114。還表示了合并流體流的裝置116,其將第一流體流112和第 二流體流114合并形成第三流體流118。
雖然將產(chǎn)生流體流的裝置111A和111B描繪為第 一和第二儲(chǔ)罐102和104 中的孔，但是可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何產(chǎn)生流體流的裝置。 產(chǎn)生流體流的裝置111A和111B的實(shí)例包括，^_不限于，孑L、插口(spigot)、 噴管(spout)、閥門(valve)、噴淋件(pouring)、管件(tubing)、泵及它們的組合。
如本領(lǐng)域一名普通技術(shù)人員所顯而易見的，合并流體流的裝置116可為 能將第一流體流112和第二流體流114合并以形成第三流體流118的任何設(shè) 備或儀器?？梢杂糜诒景l(fā)明的實(shí)例實(shí)施方案的合并流體流的合適裝置116的 實(shí)例包括，但不限于，T型接頭、Y型接頭和漏斗。在具體的實(shí)施方案中，118前不使第一流體流112和 第二流體流114的合并的保留(retention)延長的設(shè)備或儀器。在具體的實(shí)施方 案中，第一溶液106和第二溶液110可以以l:4的比例合并。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一溶液106可以具有比第二溶液110更高的同 滲濃度。第一溶液106的溶質(zhì)濃度可為約0.5M至約IOM。第一溶液106的 溶質(zhì)濃度可為，例如，約2M至約6M和，更具體地，其溶質(zhì)濃度可為約1M 至約3 M。
第二溶液110的溶質(zhì)濃度可為約0 M至約1 M和，更具體地，其溶質(zhì)濃 度可為約OM至約0.5 M，或者其溶質(zhì)濃度可為約OM至約0.1 M。
可以用作第一溶液106和第二溶液110的組分的溶質(zhì)實(shí)例包括，但不限 于，糖、鹽、葡萄糖、蔗糖、甘油、氯化鈉、硫酸鈉、磷酸鈉、硝酸鈉、氯 化鉀、硫酸鉀、磷酸鉀、硝酸鉀、氯化4美、硫酸鎂、磷酸鎂、硝酸鎂、氯化 4丐、硫酸4丐、磷酸4丐、硝酸4丐、硫酸銨及它們的組合。在具體的實(shí)施方案中， 第 一溶液106和第二溶液110包括甘油和/或氯化鈉。
如本領(lǐng)域一名普通技術(shù)人員所了解的，細(xì)胞108可為希望進(jìn)行滲透休克 的任何種類生物細(xì)胞。可以進(jìn)行滲透休克的細(xì)胞類型的實(shí)例包括，但不限于， 微生物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、 植物細(xì)胞、假單胞菌屬菌種(i^e^/omo"os sp.)、大腸桿菌(五.co/z')、克雷伯氏 菌屬菌種(尺/efc/"〃a sp.)、酵母屬菌種0Sacc/zarowyce5 sp.)、畢赤酵母屬菌種 (尸/c/z/a sp.)和漢遜酵母屬菌種(/fomewwe/a sp.)。細(xì)胞108可以包括周質(zhì)空間， 并且還可以產(chǎn)生目的分子。在具體的實(shí)施方案中，目的分子可以是多肽，而 細(xì)胞108能夠產(chǎn)生定位于周質(zhì)空間的目的多肽。代表性的目的多肽可以選自， 例如，下組干擾素、白介素、生長激素、生長因子、細(xì)胞因子、酶、酶抑 制劑、抗體和抗體片段。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方案的正常操作中，儲(chǔ)罐102包含含有細(xì)胞108的 第一溶液106。儲(chǔ)罐104包含第二溶液110,第二溶液110的同滲濃度低于第 一溶液106。用于產(chǎn)生流體流的裝置111A產(chǎn)生第一流體流112，其包括第一 溶液106和細(xì)胞108。用于產(chǎn)生流體流的裝置111B產(chǎn)生第二流體流114，其 包括第二溶液110。使第一流體流112和第二流體流114相互流體連通(fluid communication)以產(chǎn)生第三流體流118。例如，可以使用用于合并流體流的裝 置116將第一流體流112和第二流體流114合并，形成第三流體流118。參考圖2，其表示了根據(jù)本發(fā)明用于滲透休克細(xì)胞的設(shè)備200的實(shí)例實(shí) 施方案的示意圖。如圖所示，設(shè)備200具有一些與設(shè)備100相同的特征。用 于產(chǎn)生流體流的裝置111A包括泵122A和插入第一溶液106的管件120A。 泵122A和管件120A—起產(chǎn)生第一流體流112 (未示于圖2中)，其通過管件 120A流動(dòng)。用于產(chǎn)生流體流的裝置111B包含泵122B和插入第二溶液110 的管件120B。泵122B和管件120B—起產(chǎn)生第二流體流114(未示出)，其通 過管件120B流動(dòng)。泵122A和B可以分開地可變地控制第一流體流112和/ 或第二流體流114分別流過管件120A和120B的流速。管件120A和120B 與T型接頭124流體連接。T型接頭124經(jīng)由管件128與混合器126連接。 混合器126經(jīng)由管件132與澄清器130連接。
如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所了解的，管件120A和120B、 128和132可為 用于引導(dǎo)流體流的任何種類的設(shè)備或材料。適合用作管件120A和B、 128和 132的各項(xiàng)的實(shí)例包括，但不限于，通道(channel)、管路(piping)、管件(tubing)、 橡膠管件、聚乙烯(tygon)管件，及它們的組合。
泵122A和B可為用于移動(dòng)流體流的任何種類泵?？梢杂糜诟鶕?jù)本發(fā)明 的實(shí)施方案中的泵122A和B的實(shí)例包括，但不限于，蠕動(dòng)泵、軟管泵、計(jì) 量泵、齒4侖泵、螺^走泵、；茲驅(qū)動(dòng)泵、轉(zhuǎn)子動(dòng)力泵(rotodynamicpump)、容積泵 (positive displacement pump)、噴射泵(jet pump)、氣升泵、電》茲泵、噴射器噴 射泵(eductor jet pump)、 ^走摔爭泵(rotary pump)、 S走葉泵(rotary vane pump)、 4主 復(fù)泵(reciprocating pump)和隔膜泵(diaphragm pump)。在具體的實(shí)施方案中， 泵122A和120B以1:4的比例將第一溶液106和第二溶液110提供至T型接 頭124,并且以圖2中所示方向?qū)⒌谝蝗芤?06和第二溶液110提供至T型 4妄頭124。
混合器126可為用于混合流體的內(nèi)容物的任何類型的混合器。可用于根 據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案中的混合器126的實(shí)例包括，但不限于，分散器 (disperser)、 高剪切混合器(high shear mixer)、 多軸混合器(multi-shaft mixer)、 "f亍星式混合器(planetary mixer)、 帶-漿式'混合器(ribbon-paddle mixer)、 立式混 合機(jī)(vertical blender)和靜態(tài)混合器(static mixer)。靜態(tài)混合器的使用能提供有 效的設(shè)備以將物理和流動(dòng)性質(zhì)不同的流混合。靜態(tài)混合器沒有可移動(dòng)部分， 因此產(chǎn)生相對較低的剪切，并提供對設(shè)備內(nèi)接觸/停留時(shí)間的有效控制。
澄清器130可為基于大小或密度分離流體的內(nèi)容物的任何類型的設(shè)備。
10可以用于根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案中的澄清器130的實(shí)例包括，但不限于，濾 器(filter)、離心機(jī)、微濾器(microfilter)、切向流(tangential flow)微濾器，連續(xù) 離心機(jī)和碟片式(disc stack)連續(xù)離心機(jī)。目前優(yōu)選的是碟片式連續(xù)離心機(jī)。
此外，根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的實(shí)施方案可以包含熱交換器或其他溫度改變 設(shè)備以改變第一溶液106和第二溶液110中一個(gè)或兩個(gè)和/或第一流體流112、 第二流體流114和第三流體流118中的一個(gè)或多個(gè)的溫度。對于本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員顯而易見的是，可將熱交換器或其他溫度改變設(shè)備置于設(shè)備中任何 位置，以改變該位置處第一溶液106和/或第二溶液110中一個(gè)或兩個(gè)和/或第 一流體流112、第二流體流114和第三流體流118中的一個(gè)或多個(gè)的溫度。放
器126之間，在混合器126和澄清器130之間，和在儲(chǔ)罐102和104中的一 個(gè)和兩個(gè)中?？捎糜诒景l(fā)明的實(shí)施方案中的合適的熱交換器或其他溫度改變 設(shè)備的實(shí)例包括，但不限于，電加熱器、冷卻或加熱毯(blanket)、冷卻或加熱 夾套(jacket)、殼式熱交換器、管式熱交換器、板式熱交換器、板框式熱交換 器、再生熱交換器、動(dòng)力熱交換器、刮面(scmped surface)熱交換器、絕熱輪 式熱交換器和熱泵。
此外，根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的實(shí)施方案可以在需要的位置包含接口或接入 設(shè)備(access ports or devices)。這樣的接口或接入設(shè)備可以在任何點(diǎn)將其他組 分或化學(xué)物質(zhì)加入第一和第二溶液106和110中的一個(gè)或兩個(gè)和/或第一、第 二和第三流體流112、 114和118中的一個(gè)或多個(gè)?？捎糜诒景l(fā)明的合適的接 口或接入設(shè)備的實(shí)例包括，但不限于，門、口、隔膜、閥門、接合處(junction) 及它們的組合。
在正常操作中，圖2所示設(shè)備使用泵1"A通過管件U0A取出(draw)包 含細(xì)胞108的第一溶液106,并將第一溶液106輸送至T型接頭124。還使用 泵122B通過管件120B取出第二溶液110并輸送至T型接頭124。在T型接 頭中合并第一溶液106、細(xì)胞108和第二溶液110。依靠第一溶液106和第二 溶液110的合并對細(xì)胞108進(jìn)行滲透^木克，并且滲透l木克導(dǎo)致細(xì)胞周質(zhì)空間 中的分子釋放入周圍的溶液。由第一溶液106、細(xì)胞108和第二溶液110合 并產(chǎn)生的溶液通過混合器126并到達(dá)澄清器130之上。
本發(fā)明的實(shí)例實(shí)施方案提供分離重組目的多肽的方法。方法包括培養(yǎng)或 發(fā)酵產(chǎn)生重組目的多肽的細(xì)胞，所述細(xì)胞將重組目的多肽分泌入細(xì)胞的周質(zhì)中。在高同滲濃度的溶液中培育細(xì)胞。將高同滲濃度溶液中的細(xì)胞的流體流 與低同滲濃度溶液的流體流合并以形成新流體流，其中將高同滲濃度溶液中 的細(xì)胞與低同滲濃度溶液的流體流混合以使細(xì)胞將重組目的多肽釋放入新流 體流。然后可以(例如，用靜態(tài)混合器)混合新流體流，然后使用澄清設(shè)備如濾 器或離心機(jī)，從包含重組目的多肽的新流體流分離細(xì)胞。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，細(xì)胞可以天然地表達(dá)目的多肽并將
其分泌入周質(zhì)空間，或者細(xì)胞能經(jīng)過工程改造(engineered)以包含構(gòu)建體，所 述構(gòu)建體可以整合入基因組，以產(chǎn)生目的多肽并將其分泌入周質(zhì)空間。
在下述實(shí)施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明，所述實(shí)施例作為說明給出，而且并 不意欲以任何方式限定本發(fā)明。
實(shí)施例 實(shí)施例1
通過合并流體流進(jìn)行滲透〗木克
使用在周質(zhì)空間中表達(dá)人生長激素(hGH)的熒光假單胞菌CP化M^mo"oy //脂rMMcera)菌抹(DC456)。在以20L生物反應(yīng)器規(guī)模發(fā)酵后，在實(shí)驗(yàn)室批式 離心機(jī)中離心發(fā)酵液(broth)。將細(xì)胞漿(cell paste) (3811 g)與3.5 L浸泡緩沖液 (25%蔗糖pH 7.2)混合30分鐘。4木克緩沖液由20 mM Tris， pH 7.2組成。通過 合并流體流進(jìn)行滲透^木克的裝置由下述組成兩個(gè)蠕動(dòng)泵(MasterflexL/S，型 號#77200-62),用于使兩個(gè)流(平衡的細(xì)胞漿料和休克緩沖液)連續(xù)流動(dòng)，使用 T型接頭將兩個(gè)流合并，然后使用靜態(tài)混合器(Co叩rotec, FM 08-10-36)用于兩 個(gè)流的快速混合，該靜態(tài)混合器附接于連續(xù)碟片離心機(jī)(Westfalia SC-6)用于 從液體提取物分離細(xì)胞。平衡的細(xì)胞漿料和休克緩沖液的流速分別是200 mL/ 分鐘和800 mL/分鐘。通過毛細(xì)管電泳(caliper LabChip 90)測量來自原料和提 取物流(extract stream)的樣品中hGH的量。這個(gè)過程的步驟收率(step yield)(提 取物中hGH的量除以發(fā)酵液中hGH的量)為大約70%。
實(shí)施例2
通過分批處理進(jìn)行滲透休克
使用在周質(zhì)空間中表達(dá)人生長激素(hGH)的熒光假單胞菌菌抹(DC456)。 在以20L生物反應(yīng)器規(guī)模發(fā)酵后，在實(shí)驗(yàn)室批式離心機(jī)中離心發(fā)酵液。將細(xì)胞漿(150-225 g)與150-225 g浸泡緩沖液(25%蔗糖和20 mM Bis-Tris， pH 7.2) 混合30分鐘。平衡的漿料與4X體積的休克緩沖液(20 mM Bis-Tris， pH 7.2) 混合，保持30分鐘，并在實(shí)驗(yàn)室批式離心機(jī)(Eppendorf)中離心。通過毛細(xì)管 電泳(caliper LabChip 90)測量來自原料和提取物流的樣品中hGH的量。這個(gè) 過程的步驟收率(提取物中hGH的量除以發(fā)酵液中hGH的量)為大約40%。
雖然已經(jīng)在一些實(shí)施方案中描述了本發(fā)明，但是本發(fā)明可以在本公開的 精神和范疇內(nèi)進(jìn)一步修正。因此本申請意欲使用其通用原理(geneml principle) 涵蓋本發(fā)明的任何改變、用途或修改形式(adaptation)。此外，本申請意欲涵 蓋偏離本^^開卻在本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)已知的或慣用的實(shí)踐方式的范圍內(nèi)并且 落入所附權(quán)利要求的限定之內(nèi)的內(nèi)容。
權(quán)利要求
1.制備重組目的多肽的方法，其包括發(fā)酵用重組表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述重組表達(dá)系統(tǒng)能使目的多肽分泌入所述宿主細(xì)胞的周質(zhì)，其中在發(fā)酵培養(yǎng)基中在使目的多肽分泌入所述宿主細(xì)胞周質(zhì)的條件下進(jìn)行所述發(fā)酵；和通過對所述發(fā)酵培養(yǎng)基中包含的宿主細(xì)胞施以連續(xù)的滲透休克而從周質(zhì)提取所述目的多肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中對所述宿主細(xì)胞施以連續(xù)的滲透休克包括提供包含細(xì)胞的第 一溶液； 提供第二溶液；其中所述第 一溶液的同滲濃度高于所述第二溶液的同滲濃度； 產(chǎn)生包含所述第 一溶液的第 一流體流； 產(chǎn)生包含所述第二溶液的第二流體流；和 將所述第 一和第二流體流合并為第三流體流。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述連續(xù)的滲透休克包括將高摩爾濃度 的漿料與低摩爾濃度的休克緩沖液連續(xù)混合。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述高摩爾濃度漿料選自下組高糖濃度或高鹽濃度。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述低摩爾濃度休克緩沖液的pH為約 5至約9。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括在從細(xì)胞釋放滲透壓力之前或 之后使用熱交換器。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括在從細(xì)胞釋放滲透壓力之前或 之后施用溶劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其進(jìn)一步包括在從細(xì)胞釋放滲透壓力之前或 之后進(jìn)行化學(xué)處理。
9. 用于使細(xì)胞滲透休克的設(shè)備，所述設(shè)備包含 第一和第二儲(chǔ)罐；所述第 一儲(chǔ)罐包含含有細(xì)胞的第 一溶液；所述第二儲(chǔ)罐包含第二溶液；其中所述第 一溶液的同滲濃度高于所述第二溶液；用于產(chǎn)生包含所述第一溶液和所述細(xì)胞的第一流體流的裝置；用于產(chǎn)生包含所述第二溶液的第二流體流的裝置；用于將所述第 一和第二流體流合并為第三流體流的裝置。
10. 權(quán)利要求9的設(shè)備，其中所述第一儲(chǔ)罐是生物反應(yīng)器。
11. 權(quán)利要求9的設(shè)備，其中所述細(xì)胞選自下組微生物細(xì)胞、植物細(xì) 胞、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、真菌細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和酵母細(xì)胞。
12. 權(quán)利要求9的設(shè)備，其中所述細(xì)胞選自下組假單胞菌屬菌種、大腸 桿菌、克雷伯氏菌屬菌種、酵母屬菌種、畢赤酵母屬菌種和漢遜酵母屬菌種。
13. 權(quán)利要求9的設(shè)備，其中所述細(xì)胞具有周質(zhì)空間。
14. 權(quán)利要求9的設(shè)備，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)。
15. 權(quán)利要求9的設(shè)備，其中所述第一溶液包含以約0.5M至約IOM的 摩爾濃度存在于所述第 一溶液中的第 一溶質(zhì)組；其中所述第 一溶質(zhì)組包含至 少一種溶質(zhì)。
16. 權(quán)利要求9的設(shè)備，其中所述第二溶液包含以約0 M至約1 M的摩 爾濃度存在于所述第二溶液中的第二溶質(zhì)組；其中所述第二溶質(zhì)組包含至少一種溶質(zhì)。
17. 權(quán)利要求15和16的設(shè)備，其中所述第二溶質(zhì)組包含甘油、糖或鹽。
18. 權(quán)利要求17的設(shè)備，其中所述糖或所述鹽選自下組葡萄糖、蔗糖、 氯化鈉、硫酸鈉、磷酸鈉、硝酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、磷酸鉀、硝酸鉀、氯 化鎂、硫酸鎂、磷酸鎂、硝酸鎂、氯化鈣、硫酸鈣、磷酸鈣、硝酸鈣、硫酸 銨和它們的組合。
19. 權(quán)利要求15和16的設(shè)備，其中所述第二溶質(zhì)組包含蔗糖或氯化鈉。
20. 權(quán)利要求9的設(shè)備，其中所述產(chǎn)生第一流體流的裝置和所述產(chǎn)生第 二流體流的裝置包含固定于第 一儲(chǔ)罐和/或第二儲(chǔ)罐中的孔的管件和/或管道。
21. 權(quán)利要求9的設(shè)備，其中所述將第一和第二流體流合并的裝置包含T型接頭。
22. 權(quán)利要求21的設(shè)備，其中所述T型接頭包含 第一入口、第二入口和出口；其中所述第 一入口和所述出口形成基本直的流路；其中所述第二入口向所述基本直的流路提供與所述基本直的流路約成直角的流入；其中所述第一流體流通過所述第二入口進(jìn)入所述T型接頭；和 其中所述第二流體流通過所述第 一入口進(jìn)入。
23. 權(quán)利要求1的設(shè)備，其進(jìn)一步包含混合設(shè)備。
24. 權(quán)利要求23的設(shè)備，其中所述混合設(shè)備包含靜態(tài)混合器。
25. 權(quán)利要求9的設(shè)備，其進(jìn)一步包含離心機(jī)、濾器或熱交換器。
26. 權(quán)利要求l的設(shè)備，其進(jìn)一步包含用于添加化學(xué)處理溶劑的位置。
27. 權(quán)利要求1的設(shè)備，其進(jìn)一步包含向發(fā)酵培養(yǎng)基中包含的宿主細(xì)胞 施加連續(xù)的滲透休克的裝置。
28. 滲透休克細(xì)胞的方法，所述方法包括 提供包含細(xì)胞的第 一溶液； 提供第二溶液；其中所述第 一溶液的同滲濃度高于所述第二溶液的同滲濃度； 產(chǎn)生包含所述第 一溶液的第 一流體流； 產(chǎn)生包含所述第二溶液的第二流體流；和 將所述第一和第二流體流連續(xù)合并為第三流體流。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述細(xì)胞選自下組微生物細(xì)胞、植 物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和酵母細(xì)胞。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述細(xì)胞選自下組假單胞菌屬菌種、 大腸桿菌、克雷伯氏菌屬菌種、酵母屬菌種、畢赤酵母屬菌種和漢遜酵母屬菌種。
31. 根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述細(xì)胞具有周質(zhì)空間，并且其中所 述細(xì)胞產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)。
32. 根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述第一溶液包含以約0.5M至約10 M的摩爾濃度存在于所述第一溶液中的第一溶質(zhì)組；其中所述第一溶質(zhì)組包含至少一種溶質(zhì)。
33. 根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述第二溶液包含以約OM至約1 M 的摩爾濃度存在于所述第二溶液中的第二溶質(zhì)組；其中所述第二溶質(zhì)組包含至少一種溶質(zhì)。
34. 根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述第一溶質(zhì)組或所述第二溶質(zhì)組包含沖唐或鹽。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述糖或所述鹽選自下組葡萄糖、 蔗糖、甘油、氯化鈉、硫酸鈉、磷酸鈉、硝酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、磷酸鉀、 硝酸鉀、氯化鎂、硫酸鎂、磷酸鎂、硝酸鎂、氯化鈣、硫酸鈣、磷酸鈣、硝 酸4丐、硫酸銨，和它們的組合。
36. 根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中將所述第一和第二流體流合并為所述 第三流體流包括沿著所述第一流體流的路徑確定第一流體路徑；確定與所述第一路徑約成直角的第二流體路徑，其與所述第一流體路徑 相交，且不繼續(xù)穿過所述第一流體路徑，以形成所述第一和第二流體路徑的 交叉點(diǎn)；確定與所述第 一和第二流路的交叉點(diǎn)相連的第三流體路徑； 其中所述第三流體路徑和所述第 一流體路徑形成基本直的流路； 將所述第 一溶液提供至所述第二流體路徑； 將所述第二溶液提供至所述第一流體路徑；和將所述第一和第二溶液在所述第一和第二流體路徑的交叉點(diǎn)合并，使得 所述第三流體流從所述第三流體if各徑流出。
37. 根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中將所述第二溶液提供至所述第一和第 二流體路徑的交叉點(diǎn)，其速率高于將所述第一溶液提供至所述第一和第二流 體路徑的交叉點(diǎn)的速率。
38. 根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其進(jìn)一步包括用靜態(tài)混合器混合所述第三 流體流。
39. 根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生目的多肽，并將所述目 的多肽分泌至所述細(xì)胞的周質(zhì)空間中。
全文摘要
制備重組目的多肽的方法，其包括發(fā)酵用重組表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述重組表達(dá)系統(tǒng)能使目的多肽分泌入所述宿主細(xì)胞的周質(zhì)。通過對包含于發(fā)酵培養(yǎng)基中的宿主細(xì)胞施以連續(xù)的滲透休克而從周質(zhì)提取目的多肽。用于使細(xì)胞滲透休克的設(shè)備包括第一儲(chǔ)罐，其包含細(xì)胞的第一溶液，和第二儲(chǔ)罐，其包含第二溶液，第一溶液的同滲濃度高于第二溶液。還公開了使用第一和第二溶液使細(xì)胞滲透休克的方法。還公開了從細(xì)胞分離重組目的多肽的方法。
文檔編號C12P21/00GK101646780SQ200880002148
公開日2010年2月10日 申請日期2008年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月12日
發(fā)明者薩布拉塔·森, 邁克爾·L·查普爾, 阿南特·Y·帕特卡 申請人:陶氏環(huán)球技術(shù)公司