專利名稱：：用于鑒別單核苷酸多態(tài)性(snp)的方法用于鑒別單核苷酸多態(tài)性(SNP)的方法本發(fā)明提供用于鑒別單核苷酸多態(tài)性(SNP)的方法，該方法提供改良的靈敏度和特異性。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是單堿基改變或點突變，還包括所謂的"indel"突變(核苷酸的插入或缺失)，從而在個體間產(chǎn)生遺傳變異。SNP占全部人類遺傳變異的約90%，在30億個堿基的人類基因組中每100-300個堿基發(fā)生一次。然而，SNP可以在其他生物體(如，病毒)中更為頻繁地發(fā)生。SNP可以發(fā)生在基因組的編碼區(qū)或非編碼區(qū)。編碼區(qū)的SNP可以改變或不改變蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列。非編碼區(qū)的SNP可以改變啟動子或加工位點，并可以影響基因轉(zhuǎn)錄和/或加工。了解個體是否在基因組區(qū)域具有感興趣的特定SNP，可以提供足夠的信息以開發(fā)針對多種疾病的診斷、預(yù)防和治療性應(yīng)用。存在多種對SNP進(jìn)行基因分型的方法。對SNP基因分型方法的關(guān)鍵要求是其能明確地區(qū)分存在的等位基因突變體。因為人類是二倍體，對雙等位基因SNP而言存在3種可能的基因型患者具有純合的野生型序列、純合的突變序列、或雜合序列。這些方法中的大多數(shù)可基于分子機制分為4組等位基因特異性雜交、等位基因特異性寡核苷酸連接、引物延伸、測序。近來，實時PCR的出現(xiàn)使得可以開發(fā)用于SNP檢測的均質(zhì)法(homogeneousmethods),例如FRET探針的解鏈曲線分析和5'熒光核酸酶檢測(也稱作TaqMan⑧檢測)。這些方法是有吸引力的，因為信號擴增和等位基因檢測可在同一個封閉的試管中完成。它們使用熒光等位基因特異性寡核苷酸(ASO)探針，并通常在包含整合的熒光計的熱循環(huán)儀上進(jìn)行。這些方法要求適當(dāng)?shù)奶结樤O(shè)計和緩沖液組成以及對PCR循環(huán)條件的調(diào)整。因此，在這些循環(huán)條件中，其中一個最重要的待優(yōu)化變量是退火溫度(Ta)，即允許引物與單條DNA鏈結(jié)合的溫度。低Ta可導(dǎo)致非特異性PCR產(chǎn)物的合成，而使用高Ta可減少所需PCR產(chǎn)物的生成。因此，最佳Ta的應(yīng)用在甚至存在錯配的情形下使靶DNA與引物的交叉雜交降至最少而不是避免這種交叉雜交。引物間PCR擴增效率的差異不足以大得允許容易地將正常的核苷酸和突變的核苷酸區(qū)分開。為了通過實時PCR改善SNP檢測，對熒光監(jiān)測進(jìn)行了優(yōu)化。FRET雜交探針的解鏈曲線分析是Utah大學(xué)的專利技術(shù)(WO-A-97/46707)。在其最簡單的形式中，反應(yīng)混合物包括兩種與靶序列的鄰近區(qū)域雜交的寡核苷酸探針。以熒光染料標(biāo)記所述兩種探針鄰近的3'和5'末端。由"供體"發(fā)射的熒光刺激"受體"熒光團(tuán)產(chǎn)生獨特的熒光復(fù)合物。所述復(fù)合物僅在所述探針與所擴增DNA上的鄰近位點結(jié)合時形成。一旦完成PCR擴增，可通過緩慢加熱擴增子/探針異源雙鏈體并測量探針與擴增子解離所產(chǎn)生熒光的改變生成"解鏈曲線"。解鏈曲線分析的原理是各雙鏈DNA有其自身特定的解鏈溫度(Tm)，Tm被定義成50°/。的DNA變?yōu)閱捂湑r的溫度。因此，溫度曲線對于正常和突變的等位基因有所不同。相對于探針與突變等位基因形成的復(fù)合物而言，突變探針與野生型等位基因間的單核苷酸錯配使得探針在更低的溫度解離或解鏈。雖然這一技術(shù)可用以鑒定核酸中的SNP，但其在實際應(yīng)用上存在一些缺點。由于兩種類型的等位基因之間的序列差異非常小，設(shè)計為優(yōu)先與一種類型的擴增子結(jié)合的探針也很有可能顯示出可與另一種擴增子類型相結(jié)合。例如，在如SNP這種情形的取代中，對PCR產(chǎn)物的解鏈動力學(xué)的影響非常小以至于不能被可靠地檢測。解鏈曲線方法通常的取代方式是使用水解型(TaqMan)探針。這一技術(shù)在國際申請WO-A-92/02638中被公開。5'外切核酸酶檢測使用FRET淬滅對聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增的靶DNA進(jìn)行分析。探針是含有優(yōu)選位于5'和3'末端的熒光團(tuán)和淬滅部分的寡核苷酸。該方法使用兩種標(biāo)記的與突變和正常等位基因互補的ASO探針。這兩種探針具有不同的熒光報告染料，但享用共同的淬滅染料。當(dāng)探針完整時，由于報告染料與淬滅染料近似，所述探針不發(fā)熒光。在PCR的退火階段，這兩種探針與它們位于引物位點下游的靶序列競爭性地雜交。隨后，隨著引物的延伸，雜交的探針通過嗜熱水生菌(7T^mopMwa^/"f/cm)(Taq)聚合酶的5'核酸酶活性被剪切。這導(dǎo)致報告染料與引起熒光發(fā)射顯著增加的淬滅物的分離。通過在PCR擴增之后對兩種報告染料的熒光強度進(jìn)行測量而進(jìn)行基因分型。因為TaqMan探針在實時PCR過程中被消化，因此探針不能用于擴增后的解鏈曲線分析采用這一典型的5'核酸酶檢測技術(shù)，在PCR過程中通過對雜交的TaqMan探針的外切核酸酶降解產(chǎn)生了不依賴于溫度的熒光信號。這一方法需要對探針進(jìn)行仔細(xì)設(shè)計以允許對多態(tài)性靶加以區(qū)分，因為優(yōu)先地精確配對的探針被降解并導(dǎo)致熒光信號的增加。如以上對解鏈曲線分析的描述，這一技術(shù)會發(fā)生類似的出現(xiàn)假象的問題。因此，仍然需要可用于測定核酸序列中的SNP的高靈敏方法。如上述，實時擴增已經(jīng)允許開發(fā)用于SNP基因分型的定性檢測，以及對基因表達(dá)或病毒載量測量的定量檢測。在這些領(lǐng)域，擴增過程中所獲得的數(shù)據(jù)被用于確定原始樣品中靶核酸的量。大量研究是進(jìn)行定量檢測所必需的，并存在數(shù)種方法。在與分子信標(biāo)檢測相關(guān)的NASBA擴增過程中，一種用于對病毒載量進(jìn)行定量的方法已被描述于NucleicAcidsResearch,2002,vol.30，N°6e26。該方法允許對原始樣品中HIV-1RNA的量進(jìn)行測定。該量的評估是基于NASBA的轉(zhuǎn)錄率以及信標(biāo)與其特異性擴增子/靶的結(jié)合率產(chǎn)生的熒光的動力學(xué)。當(dāng)野生型RNA(WT)在存在固定量的校準(zhǔn)RNA(calibratorRNA)(Q)的條件下被共擴增時，通過ki，wTVwT/k^VQ的商確定定量變量，其中kt,rna(代表k,，wt和k,，Q)是分子信標(biāo)結(jié)合的反應(yīng)速率常數(shù)，VRNA(代表Vwt和Vq)是轉(zhuǎn)錄率。以HIV-1檢測進(jìn)行的許多研究已表明這一定量變量實際上是固定的校準(zhǔn)RNA濃度下野生型RNA濃度的穩(wěn)定估量值。與所有的預(yù)期相反，本申請發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)上述的定量變量I^wtVwt/Vq用于基于NASBA的定量檢測時，可用作SNP基因分型檢測的判別變量(discriminatoryvariable),這相對于基于單獨的熒光信號的分類具有更好的結(jié)果。因此，本發(fā)明涉及在對生物學(xué)樣品的分型檢測中進(jìn)行基因分型的方法，所述樣品含有一種感興趣的靶核酸，所述靶核酸疑似含有單核苷酸多態(tài)性(SNP)，該方法包括以下步驟-在存在至少兩種不同的標(biāo)記探針的條件下，對所述靶進(jìn)行實時擴增，產(chǎn)生擴增子的多個拷貝，其中每種探針允許在野生型和至少一種可能的突變的SNP位置進(jìn)行實時檢測；-基于兩種檢測探針的每一組合的信號評估判別變量值；和-區(qū)分基因型。在雙等位基因檢測中，基因型之間的差別可用于從純合野生型或純合突變體區(qū)分出雜合突變體。判別變量值的區(qū)分能力是基于相對結(jié)合反應(yīng)速率常數(shù)(Ki)，因為如下面所解釋的那樣，轉(zhuǎn)錄率比值抵消。在分型檢測中，K,值背后的理論比以精心設(shè)計的校準(zhǔn)品(calibrator)進(jìn)行的定量檢測更為復(fù)雜，這是由探針與不同類型擴增子之間的交叉反應(yīng)性所致。因此，對于雙等位基因分型檢測，必須區(qū)分4種結(jié)合反應(yīng)速率常數(shù)kWT—WT:反應(yīng)與野生型擴增子結(jié)合的野生型探針的反應(yīng)速率常數(shù)，kWT—m:反應(yīng)與突變的擴增子結(jié)合的野生型探針的反應(yīng)速率常數(shù)，km—WT:反應(yīng)與野生型擴增子結(jié)合的突變探針的反應(yīng)速率常數(shù)，km—m:反應(yīng)與突變的擴增子結(jié)合的突變探針的反應(yīng)速率常數(shù)。由于探針的特異性，km—wT的值遠(yuǎn)小于kwr-WT的值，這也同樣適用于kwT,相對于km,的關(guān)系。盡管分型檢測從定義上講不是自然定量的，可衍生自兩種熒光曲線的定量變量可用作用于分類的判別變量。為了對此進(jìn)行解釋，考慮進(jìn)行雙基因分型檢測。在純合樣品的情形中，只存在一種類型的RNA擴增子，兩種信標(biāo)都與其結(jié)合。因此，轉(zhuǎn)錄率僅指一種類型的擴增子(野生型或突變的擴增子)。如果考慮對野生型純合靶進(jìn)行擴增，則將野生型探針產(chǎn)生的信號用于評估kwT—wtVwt的但，VwT是野生型擴增子的轉(zhuǎn)錄率。當(dāng)這一擴增子是唯一產(chǎn)生的擴增子時，將由突變探針產(chǎn)生的信號用于評估km—wtVwt的但。因此，在定量檢測中所使用的商k1>WTVWT/k,，gVg簡化為kWT—WTVwT/km-WTVWT，然后再進(jìn)一步簡化為kwr一WT/km—WT，因為轉(zhuǎn)錄率被約去。因此，根據(jù)該方法的一個實施方式，通過計算比值kwT一WT/km—wt或其倒數(shù)實現(xiàn)對用于純合野生型的判別變量值的評估。類似地，對于純合的突變基因型，所述商簡化為kwr一mVm/km—mVm，然后再進(jìn)一步簡化為kwT—m/km—m。顯然，第一個比值(kw—WT/km—WT)在數(shù)值上將遠(yuǎn)大于第二個比值(kWT—m/km—m)。因此，根據(jù)該方法的一個實施方式，通過計算比值kwT一m/km—m或其倒數(shù)實現(xiàn)對用于純合突變類型的判別變量值的評估。對于雜合基因型，存在兩種不同的靶。當(dāng)擴增的起始材料是DNA時，很顯然擴增后樣品中的擴增子的濃度是相同的，因為兩種等位基因以相同的量存在。同樣，由于在靶序列上存在非常小的差異，擴增子的轉(zhuǎn)錄率將被認(rèn)為是相同的。現(xiàn)在，所述商的分子簡化為kwT—wT和k^—m的合并，反應(yīng)野生型探針的結(jié)合；所述商的分母簡化為km,和km—wt的合并，反應(yīng)突變探針的結(jié)合。由于兩種基因的濃度相同，這種合并是加法，所述商因此變成(kWT—wt+kWT,)/(km,+km—WT)。因此，根據(jù)該方法的一個實施方式，通過計算比值(kWT—WT+kWT,)/(km,+km—WT)或其倒數(shù)實現(xiàn)對用于雜合型的判別變量值的評估。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解有可能從本發(fā)明的教導(dǎo)出發(fā)，將比值用于評估SNP的存在，其可以輕微偏離上述本發(fā)明的比值但仍然發(fā)揮作用。例如，除加法外，減法、乘法或除法運算都同樣是可能的。應(yīng)用這些比值的任何其它方案都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。因為轉(zhuǎn)錄率比值約去，僅剩下探針結(jié)合率，所觀察到的判別變量值與靶、引物和酶的確切量無關(guān)，且與酶的活性無關(guān)。因此，判別變量值可用于涉及除NASBA外其他擴增方法(例如PCR)的基因分型檢測。根據(jù)該方法的一個實施方式，通過評估反應(yīng)的相對結(jié)合反應(yīng)速率常數(shù)(kl)實現(xiàn)對兩種檢測探針的每種組合的判別變量值的評估，這兩種檢測探針在所述反應(yīng)中與擴增子結(jié)合。根據(jù)該方法的另一個實施方式，通過評估反應(yīng)的相對解離反應(yīng)速率常數(shù)(k2)實現(xiàn)對兩種檢測探針的每種組合的判別變量值的評估，這兩種檢測探針在所述反應(yīng)中與擴增子解離。因此，對每種檢測探針的判別變量值的評估允許對基因型進(jìn)行確定。表示判別變量的數(shù)值范圍可以利用臨界值分為不同的范圍，其值取決于探針特性。因此，根據(jù)該方法的一個實施方式，可以利用多個臨界值將衍生自兩種探針信號的組合的判別變量所能達(dá)到的值的范圍分為多個范圍，使得用于每種基因型的判別變量所能達(dá)到的值集中于這些范圍中的一個范圍中。在雙等位基因SNP的情形下，利用臨界值將判別變量所能達(dá)到的值分為3個范圍較低的范圍將含有。純合野生型的簇(條件是第一種探針允許檢測突變型，而第二種探針允許檢測野生型)。第一種探針和第二種探針涉及判別變量比值中的反應(yīng)速率的位置。第一種探針的反應(yīng)速率位于分子，第二種探針的反應(yīng)速率位于分母。。純合突變型的簇(條件是第一種探針允許檢測野生型，而第二種探針允許檢測突變型)。較高的范圍將含有。純合野生型的簇(條件是第一種探針允許檢測野生型，而第二種探針允許檢測突變型)。。純合突變型的簇(條件是第二種探針允許檢測野生型，而第一種探針允許檢測突變型)。中間的范圍(介于較低的范圍與較高的范圍之間，且不重疊)將含有雜合型的簇。根據(jù)另一個實施方式，本發(fā)明涉及用于在多等位基因分型檢測中進(jìn)行基因分析的方法，在所述分型檢測中必須檢測超過兩種的遺傳類型。在必須使用兩種探針的情形下，適用上述相同的原則，但是判別變量所能達(dá)到的值的范圍將被分為超過3個的范圍。例如，對于三等位基因分型檢測，一個范圍將含有3種野生型等位基因的結(jié)果的簇，一個范圍將含有兩種野生型和一種突變等位基因的結(jié)果，一個范圍將含有一種野生型和兩種突變等位基因的結(jié)果，第四個范圍將含有3種突變等位基因的結(jié)果。對于三等位基因分型檢測，基因型例如可以是AAA、AAG、AGG和GGG。類似地，對于雙等位基因分型檢測，所述判別變量分別評估ki,a—a/k!,g—a、(2ki,a—A+lq，a—g)/(2kt，g—a+k!，g—g)、(k,，A—A+2k1;A—a)/(k^—A+2k^—G)以及k,，A—c/k,，c^G。這隨后產(chǎn)生4個不同的范圍，兩個中間組相互之間最為接近。在必須使用三種或更多種探針的情形下，判別變量值可得自每兩條熒光曲線的組合。將使用應(yīng)用相同原則的多維分類策略。優(yōu)選地，所述探針含有一或多個核苷酸和/或核苷酸類似物，所述核苷酸類似物具有增加親和力的修飾。對多態(tài)性的靈敏度由于探針對多態(tài)位點的親和力增加而降低。因此，所述探針能識別幾種擴增子，每種擴增子含有一種不同的己知或未知的SNP。同樣，引物的一個或一些核苷酸可以由其它的核苷酸取代，只要所述引物的特異性和所述引物的解鏈溫度沒有太大的改變。顯然，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，除常用的核苷酸A、G、C和T之外，經(jīng)修飾的核苷酸例如肌苷(inosin)、2'-0-甲基等也可以用在引物和探針中。其它實例有含有經(jīng)修飾的堿基(例如5-甲基脫氧胞苷、5-二甲氨基脫氧尿苷、脫氧尿苷、2，6-二氨基嘌呤、5-溴脫氧尿苷)或任何其它允許雜交的經(jīng)修飾的堿基的至少一種核苷酸。其它經(jīng)修飾的核苷酸可見于US5，405，950和US5，633，364(發(fā)明人均為Mock和Lovem)。本發(fā)明的教導(dǎo)使得從權(quán)利要求的主題出發(fā)進(jìn)行這樣的修飾成為可能。根據(jù)該方法的一個實施方式，通過將樣品與一對引物相接觸進(jìn)行擴增，其中正向和反向引物位于SNP位置的兩側(cè)。當(dāng)進(jìn)行NASBA方法時，正向引物位于SNP位置的下游，反向引物位于SNP位置的上游。當(dāng)進(jìn)行PCR擴增時，正向引物位于SNP位置的上游，反向引物位于SNP位置的下游。根據(jù)該方法的另一實施方式，通過將樣品同時與一對引物和至少兩種經(jīng)標(biāo)記的探針接觸進(jìn)行實時擴增。根據(jù)該方法的任一個實施方式，每種探針允許通過與擴增子雜交進(jìn)行實時檢測，探針-擴增子雜交體包括所述SNP位置。根據(jù)該方法的另一實施方式，每種探針通過其提供可區(qū)別信號的標(biāo)記及其存在至少一個核苷酸差異的序列而不同于其它探針。探針序列對應(yīng)于野生型靶或一種可能的突變。在該方法的一個特別的實施方式中，所述探針由分子信標(biāo)組成。在該方法的另一個特別的實施方式中，所述靶核酸序列是DNA。在該方法的另一個特別的實施方式中，所述擴增反應(yīng)是基于轉(zhuǎn)錄的擴增方法，優(yōu)選NASBA方法。NASBA方法在歐洲專利EP-B-0329822中有記載。盡管該方法允許對RNA進(jìn)行擴增，該方法如歐洲專利申請EP-A-1366179中記載的那樣可用于擴增雙鏈核酸。這些方法相對于PCR的主要優(yōu)勢在于其是等溫地進(jìn)行。本發(fā)明的另一目的是一種用于在對生物學(xué)樣品的SNP分型檢測中進(jìn)行基因型檢測的檢測試劑盒，其包含-一套寡核苷酸引物，-至少兩種寡核苷酸探針，所述探針包含與至少部分所擴增核酸序列基本互補的核酸序列，其中一種探針用于野生型鑒定，另一種探針用于突變型鑒定，每種探針具有互不相同的可檢測標(biāo)記；和-適當(dāng)?shù)臄U增試劑。在所述試劑盒的一個特別的實施方式中，所述寡核苷酸引物中的至少一種(稱作正向引物)與RNA聚合酶(優(yōu)選T7RNA聚合酶)啟動子結(jié)合。在所述試劑盒的一個特別的實施方式中，其還包含含有能與利用所述正向引物和反向引物擴增的核酸的區(qū)域雜交的核酸序列的寡核苷酸探針。最后，本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒，其中適當(dāng)?shù)臄U增試劑使得可以進(jìn)行基于轉(zhuǎn)錄的擴增方法，優(yōu)選NASBA方法。定義根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"等位基因"指給定基因或DNA片段的一或多種替代形式中的任何一種；給定基因或DNA片段的兩種或所有等位基因與相同的性狀或特征相關(guān)，但是由特定等位基因編碼的產(chǎn)物或功能與由該基因或DNA片段的其它等位基因編碼的產(chǎn)物或功能在質(zhì)量和/或數(shù)量上有所不同。因此，術(shù)語"多等位基因"指特征在于存在超過一種等位基因的多態(tài)位點。術(shù)語"雙等位基因"指特征在于存在兩種不同的等位基因的多態(tài)位點。因此，雙等位基因SNP是一種多等位基因SNP。本申請所用術(shù)語"基因型"指存在于個體或樣品中的等位基因的同一性。典型地，其指與感興趣的特定基因相關(guān)的個體的基因型；在多倍體個體中，其指個體攜帶有等位基因的何種組合。術(shù)語"基因分型"包括確定特定的等位基因或位于多態(tài)位點的特定的核苷酸。"核酸(NA)"意指DNA和RNA兩者，兩者均以任何可能的構(gòu)型存在，即以雙鏈(ds)核酸的形式，或以單鏈(ss)核酸的形式，或者以其組合形式(部分ds或ss)。這樣的核酸對應(yīng)于任選地包含至少一種修飾的核苷酸的至少兩個連續(xù)的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。該多核苷酸也可以在核苷酸間的鍵的水平上被修飾(例如硫代磷酸、H-磷酸酯、垸基磷酸酯)，在主鏈的水平上被修飾(例如a-寡核苷酸(FR-A-2607507)或PNA(M.Egholmefa/"J.Am.Chem.Soc.，114，1895-1897，1992)或2'-0-烷基核糖。這些修飾中的每一種可以聯(lián)合發(fā)生，只要在核酸中存在至少一種磷酸酯。所述核酸可以是天然的或合成的、寡核苷酸、多核苷酸、核酸片段、核糖體RNA、信使RNA、轉(zhuǎn)移RNA、通過酶促擴增技術(shù)獲得的核酸，所述酶促擴增技術(shù)例如是-PCR(聚合酶鏈反應(yīng))，記載于US4，683，195、US4，683，202和US4，800,159，及其RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄PCR)衍生形式(尤其是如專利EP-B-0,569，272中所述的一步形式)，-RCR(修復(fù)鏈反應(yīng)(RepairChainReaction)),記載于專利申請WO-A-90/01069中，-3SR(自動維持序列擴增)，記載于專利申請WO-A-90/06995中，-NASBA(依賴核酸序列的擴增)，記載于專利申請WO-A-91/02818中，以及-TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增)，記載于US這樣的"核酸"可以用作引物和探針。本申請所用術(shù)語"引物"指天然存在的寡核苷酸(例如限制性片段)或合成產(chǎn)生的寡核苷酸，其能夠用作引物延伸產(chǎn)物合成的起始點，當(dāng)處于適當(dāng)?shù)臈l件(例如緩沖液、鹽、溫度和pH)以及存在核苷酸和用于核酸聚合的試劑(例如依賴DNA或依賴RNA的聚合酶)的條件下，所述引物延伸產(chǎn)物與核酸鏈(模版或靶序列)互補。通常，一套引物將由至少兩條引物組成，一條"上游引物"和一條"下游引物"，它們共同限定擴增子(將利用所述引物擴增的序列)。"靶序列"被定義為待檢測的核酸分子的一部分。其通過引物和與擴增相關(guān)的酶進(jìn)行擴增。擴增生成"擴增子"，擴增子是通過與探針的雜交而被物理檢測的核酸分子。本申請所用術(shù)語"探針"包含與擴增子雜交的一段核苷酸。優(yōu)選地，雜交部分為10-50，更優(yōu)選15-35，最優(yōu)選15-30個核苷酸的一段。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的探針是所謂的分子信標(biāo)(MB)。促進(jìn)特異性核酸靶序列的同質(zhì)檢測的一類寡核苷酸探針(稱作分子信標(biāo))已有描述(Piatek"a/.(1998)NatureBiotechnology16:359-363;TyagiandKramer(1996)NatureBiotechnology14:303-308)。分子信標(biāo)是具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈寡核苷酸。環(huán)部分含有與擴增子(DNA或RNA)互補的序列。莖由于3'末端與5'末端的互補序列的雜交而形成。所述莖可以與擴增子無關(guān)，且是雙鏈的。所述莖的一個臂以熒光染料(熒光團(tuán))標(biāo)記，另一個臂與淬滅部分結(jié)合。在莖-環(huán)狀態(tài)下，探針不產(chǎn)生熒光，因為熒光團(tuán)的能量被轉(zhuǎn)移至淬滅分子。當(dāng)分子信標(biāo)與擴增子雜交時，莖環(huán)結(jié)構(gòu)喪失，且淬滅物和熒光團(tuán)變成相互分離。在這一階段，由熒光團(tuán)發(fā)射的熒光可以被檢測并定量。術(shù)語"判別變量"意指可衍生自觀察到的兩種探針的應(yīng)答并可用于最終分類的應(yīng)答變量。"判別變量"也可以稱作可衍生自熒光曲線的"定量變本發(fā)明將通過實施例并參考附圖進(jìn)行進(jìn)一步描述，在附圖中-圖1表示根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)獲得的結(jié)果。所觀測到的兩種分子信標(biāo)信號的熒光信號增長不產(chǎn)生足夠的差異。圖例A，AA基因型；G，GG基因型；H，雜合基因型GA。-圖2表示用根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)獲得的結(jié)果。相對于來自圖1的熒光比值，定量變量值以對數(shù)刻度標(biāo)在縱坐標(biāo)上。獲得各組間所需區(qū)別的唯一方式是基于標(biāo)于縱坐標(biāo)上的定量變量值。圖例A，AA基因型；G，GG基因型；H，雜合基因型GA。實施例血栓形成是一種主要的人類病患，每年通過心肌梗塞、肺栓塞或中風(fēng)使幾十萬人死亡并使得數(shù)百萬人變得虛弱。風(fēng)險因素包括遺傳性和獲得性疾病。通常，血栓形成的趨勢可以起因于機能亢進(jìn)性凝血途徑(hyperactivecoagulationpathways)、低活躍抗凝齊!j機制(hypoactiveanticoagulantmechanisms)或低活躍纖維蛋白溶解作用(hypoactivefibrinolysis)。編碼這些途徑中的蛋白質(zhì)的基因的突變在從誘因到血栓形成的過程中發(fā)揮重要作用。一種可能的SNP涉及編碼一種凝血因子(即，因子II)的基因。在特定的位置，可以存在G(野生型)或A(突變型)核苷酸。對來自3組患者(純合野生型、純合突變體和雜合子)的臨床樣品進(jìn)行NucliSensEasyQ因子II檢測(NucliSensEasyQFactorIIassay)。在該檢測中，在存在兩種分子信標(biāo)的條件下對基因組DNA進(jìn)行擴增。由于擴增產(chǎn)物的累積產(chǎn)生熒光信號。用及時觀察到的最大熒光信號相對于最初背景水平的比值建立對該信號的量的簡單測量。明顯的分類是基于熒光增加的程度-在純合基因型中，一種信號類型可能占據(jù)優(yōu)勢(A或G)，-在雜合基因型中，兩種信號均出現(xiàn)。由于基因型間的高同源性，然而又不能開發(fā)完全特異性的信標(biāo)，因此，如從圖1可見的那樣，在全部3組中兩種信號均出現(xiàn)。顯然，基因型GG組與其他兩組(GA和AA)相區(qū)分，但這兩組顯示出大量的重疊?；蛘?，使用定量變量。結(jié)果見于圖2中。橫坐標(biāo)給出了熒光信號增加的比值。顯然，定量變量值的分離是完全的。對定量變量值的一些概述性統(tǒng)計見于下表1:表l<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>權(quán)利要求1.在對生物學(xué)樣品的分型檢測中進(jìn)行基因分型的方法，所述樣品含有一種感興趣的靶核酸，所述靶核酸疑似含有單核苷酸多態(tài)性(SNP)，該方法包括以下步驟-在存在至少兩種不同的標(biāo)記探針的條件下，對所述靶進(jìn)行實時擴增，產(chǎn)生擴增子的多個拷貝，其中每種探針允許在野生型和至少一種可能的突變的SNP位置進(jìn)行實時檢測；-基于兩種檢測探針的每一組合的信號評估判別變量值；和-區(qū)分基因型。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過將樣品與一對引物相接觸進(jìn)行擴增，其中正向和反向引物位于SNP位置的兩側(cè)。3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過將樣品同時與一對引物和至少兩種經(jīng)標(biāo)記的探針接觸進(jìn)行實時擴增。4.根據(jù)前述權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中每種探針允許通過與擴增子雜交進(jìn)行實時檢測，探針-擴增子雜交體包括所述SNP位置。5.根據(jù)前述權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中每種探針通過其提供可區(qū)別信號的標(biāo)記及其存在至少一個核苷酸差異的序列而不同于其它探針。6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中探針序列對應(yīng)于野生型靶或一種可能的突變。7.根據(jù)前述權(quán)利要求l-6中任一項的方法，其中通過評估反應(yīng)的相對結(jié)合反應(yīng)速率常數(shù)(KD實現(xiàn)對兩種檢測探針的每一組合的判別變量值的評估，在所述反應(yīng)中所述兩種檢測探針與擴增子結(jié)合。8.根據(jù)前述權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中通過評估反應(yīng)的相對解離反應(yīng)速率常數(shù)(k2)實現(xiàn)對兩種檢測探針的每種組合的判別變量值的評估，在所述反應(yīng)中所述兩種檢測探針與擴增子解離。9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的方法，其中可以利用多個臨界值將衍生自兩種探針信號的組合的判別變量所能達(dá)到的值的范圍分為多個范圍，使得用于每種基因型的判別變量所能達(dá)到的值集中于這些范圍中的一個范圍中。10.根據(jù)前述權(quán)利要求1-9中任一項的方法，其中多等位基因SNP是雙等位基因SNP。11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中利用臨界值將判別變量所能達(dá)到的值分為3個范圍。12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中用于雜合靶的判別變量所能達(dá)到的值集中在中間的范圍。13.根據(jù)權(quán)利要求7和10的方法，其中當(dāng)判別變量所能達(dá)到的值集中在較低的范圍時，靶序列是純合野生型，條件是第一種探針允許檢測突變型，而第二種探針允許檢測野生型，純合突變型，條件是第一種探針允許檢測野生型，而第二種探針允許檢測突變型。14.根據(jù)權(quán)利要求7和10的方法，其中當(dāng)判別變量所能達(dá)到的值集中在較高的范圍時，靶序列是純合野生型，條件是第一種探針允許檢測野生型，而第二種探針允許檢測突變型，純合突變型，條件是第二種探針允許檢測野生型，而第一種探針允許檢測突變型。15.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中通過評估比值(kwr—WT+kWT—m)/(km,+km—WT)或其倒數(shù)實現(xiàn)對用于雜合型的判別變量值的評估。16.根據(jù)權(quán)利要求13或14的方法，其中通過評估比值kwT—m/km,或其倒數(shù)實現(xiàn)對用于純合突變型的判別變量值的評估。17.根據(jù)權(quán)利要求13或14的方法，其中通過評估比值kwT—WT/km—WT或其倒數(shù)實現(xiàn)對用于純合野生型的判別變量值的評估。18.根據(jù)前述權(quán)利要求l-17中任一項的方法，其中所述探針由分子信標(biāo)組成。19.根據(jù)前述權(quán)利要求1-18中任一項的方法，其中所述靶核酸序列是DNA。20.根據(jù)前述權(quán)利要求1-19中任一項的方法，其中所述擴增反應(yīng)是基于轉(zhuǎn)錄的擴增方法，優(yōu)選NASBA方法。21.用于在對生物學(xué)樣品的分型檢測中進(jìn)行基因型檢測的檢測試劑盒，其包含-一套寡核苷酸引物，-至少兩種寡核苷酸探針，所述探針包含與至少部分所擴增核酸序列基本互補的核酸序列，其中一種探針用于野生型鑒定，另一種探針用于突變型鑒定，每種探針具有互不相同的可檢測標(biāo)記；和-適當(dāng)?shù)臄U增試劑。22.根據(jù)權(quán)利要求21的檢測試劑盒，其特征在于所述寡核苷酸引物中稱作正向引物的至少一種引物與RNA聚合酶啟動子優(yōu)選T7RNA聚合酶啟動子結(jié)合。23.根據(jù)權(quán)利要求21或22的檢測試劑盒，其中每種寡核苷酸探針含有能與利用所述正向引物和反向引物擴增的核酸的區(qū)域雜交的核酸序列。24.根據(jù)權(quán)利要求18-23中任一項的檢測試劑盒，其中適當(dāng)?shù)臄U增試劑使得可以進(jìn)行基于轉(zhuǎn)錄的擴增方法，優(yōu)選NASBA方法。全文摘要本發(fā)明提供用于鑒別單核苷酸多態(tài)性(SNP)的方法，該方法提供了改良的靈敏度和特異性。本發(fā)明還涉及檢測試劑盒。因此，本發(fā)明涉及在對生物學(xué)樣品的分型檢測中進(jìn)行基因分型的方法，所述樣品含有一種感興趣的靶核酸，所述靶核酸疑似含有單核苷酸多態(tài)性(SNP)，該方法包括以下步驟在存在至少兩種不同的標(biāo)記探針的條件下，對所述靶進(jìn)行實時擴增，產(chǎn)生擴增子的多個拷貝，其中每種探針允許在野生型和至少一種可能的突變的SNP位置進(jìn)行實時檢測；基于兩種檢測探針的每一組合的信號評估判別變量值；和區(qū)分基因型。本發(fā)明在用于診斷、預(yù)防和治療應(yīng)用的方法中尤其有用。文檔編號C12Q1/68GK101657549SQ200880004126公開日2010年2月24日申請日期2008年2月5日優(yōu)先權(quán)日2007年2月6日發(fā)明者J·沃伊斯滕,M·J·D·德科克申請人:生物梅里埃有限公司