專利名稱：：診斷、預后或監(jiān)測eb病毒(ebv)相關癌癥的方法和試劑盒的制作方法診斷、預后或監(jiān)測EB病毒(EBV)相關癌癥的方法和試劑盒發(fā)明領域本發(fā)明通常涉及通過一企測和/或定量腫瘤相關DNA序列it斷、預后或監(jiān)測個體癌癥的方法和試劑盒。具體來說，本發(fā)明涉及通過4企測和/或定量尿中EBVDNA序列診斷、預后或監(jiān)測EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)相關癌癥的方法和試劑盒。
背景技術：
：EB病毒(EBV)是普遍存在的人類皰滲病毒，首先發(fā)現其與非洲型伯基特氏淋巴瘤(Burkitt，slymphoma,BL)相關。隨后，還發(fā)現EBV感染與鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)密切相關。已經證明，可以在采集于中國南方的幾乎所有NPC組織中^r測到EBV基因組(Chenetal.,Intervirology.36(2):91-8(1993);Dickensetal"JClinPathol.45(5):396-7(1992))。與這些結果一致，我們已經證明，可以在96%NPC患者的血漿中檢測到EBVDNA,但僅在7%的健康個體中檢測到非常低濃度的EBVDNA(Loetal.,CancerRes.59(6):1188-91(1999))。而且，血漿EBVDNA的水平，無i侖是治療前測量的(Loetal.,CancerRes.60(24):6878-81(2000)),或治療后測量的(Chanetal"JNatlCancerInst.94(21):1614-9(2002》,都對預測總生存率和無病生存率是有^介值的。同樣，循環(huán)的EBVDNA也可用于^r測和監(jiān)測其他EBV相關惡性肺瘤，如淋巴瘤(Leietal.,BrJHaematol.lll(l):239-46(2000))和胃癌(Loetal.,ClinCancerRes.7(7):1856-9(2001))。盡管這種血漿檢驗(plasmatest)可用于檢測NPC,且是相對無風險的操作，但它仍然導致患者的疼痛和焦慮。然而，本領域并未公開尿樣中短EBV相關核酸序列的檢測和定量以及其用途。因此，需要開發(fā)診斷、預后和/或監(jiān)測EBV相關癌癥的替代檢驗。發(fā)明概述我們令人驚訝地發(fā)現，循環(huán)的無細胞EB病毒(EBV)DNA可穿過腎屏障，并且作為NPC和其他EBV相關惡性胂瘤的肺瘤標志，可在尿中檢測到。本發(fā)明的第一方面提供了診斷個體EBV相關癌癥的方法。所述方法包括(a)獲得個體的尿樣；以及(b)檢測尿樣中EBV相關核酸序列，其中尿樣中存在EBV相關核酸序列，表示個體患有EBV相關癌癥。本發(fā)明的第二方面提供了用于個體EBV相關癌癥預后的方法。所述方法包括(a)獲得個體的尿樣；以及(b)檢測尿樣中EBV相關核酸序列，其中尿樣中存在EBV相關核酸序列，表示EBV相關癌癥的不良預后。本發(fā)明的第三方面提供了監(jiān)測個體EBV相關癌癥的方法。所述方法包括(a)獲得不同時間點的個體尿樣；以及(全測和/或定量尿樣中EBV相關核酸序列，其中尿樣中存在EBV相關核酸序列或EBV相關核酸序列水平升高，表示EBV相關癌癥的進展，而尿樣中缺少EBV相關核酸序列或EBV相關核酸序列水平降低則表示EBV相關癌癥的抑制。在本發(fā)明方法的具體實施方案中，在EBV相關癌癥的治療過程中進行步驟(a),尿樣中缺少EBV相關核酸序列或EBV相關核酸序列水平降低，表示治療有效。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，上述方法還包括分析尿樣中EBV相關核酸序列大小的步驟以排除假陽性情況。在這些情況中，尿樣中檢測和/或定量的EBV相關核酸序列可能不是來自循環(huán)的EBV相關核酸片段，且是相對完整的。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，上述EBV相關核酸序列來自EBV基因組5amHI-W區(qū)的至少一個DNA片段或其至少一個RNA轉錄本。優(yōu)選地，DNA片^:或RNA轉錄本小于180個核苷酸。本發(fā)明的第四方面提供了用于個體EBV相關癌癥診斷或預后的試劑盒。所述試劑盒包含a)用于從個體尿樣中提取核酸的第一單元；以及b)用于4企測提取的核酸中EBV相關核酸序列的第二單元，其中第二單元包含用于擴增EBV基因組5amHI-W區(qū)的至少一個片4爻的至少一對引物。本發(fā)明的第五方面提供了監(jiān)測個體EBV相關癌癥的試劑盒。所述試劑盒包含a)多個用于從個體的尿樣中提取核酸的第一單元；以及b)多個用于4企測和/或定量才是耳又的核酸中EBV相關核酸序列的第二單元，其中第二單元包含用于擴增EBV基因組5amHI-W區(qū)的至少一個片段的至少一對引物。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的試劑盒還包含從個體獲得尿樣的裝置。在本發(fā)明的一些實施方案中，上述EBV相關核酸是DNA。在其他實施方案中，其是RNA。在本發(fā)明一些優(yōu)選的實施方案中，EBV相關癌癥是鼻咽癌(NPC)、天然殺傷細胞淋巴瘤(NK-淋巴瘤)或胃癌。在更優(yōu)選的實施方案中，EBV相關癌癥是鼻咽癌。通過以示例的方式顯示和描述的本發(fā)明優(yōu)選實施方案的下述說明，本發(fā)明的優(yōu)勢對本領域普通技術人員將變得更為顯而易見。附圖簡要說明圖1顯示依據尿EBVDNA的可4企測性，NPC患者的血漿EBVDNA的濃度；以及圖2顯示在具有可檢測的尿EBVDNA的NPC患者中血漿EBVDNA和尿EBVDNA水平之間的相關性，其中(a):尿EBVDNA濃度表示為拷貝/mL尿，以及(b):尿EBVDNA濃度表示為拷貝/mmol尿肌氨酸酐。發(fā)明的詳細描述除非另有說明，本文所用的所有技術和科學術語具有本發(fā)明所屬
技術領域：
的技術人員所通常理解的涵義。如上文所述，本發(fā)明的方法可用于診斷或預測EBV相關癌癥，如鼻咽癌(NPC)。在這些方法中，首先從個體獲得尿樣，隨后進行尿樣中EBVDNA序列的檢測和/或定量。也公開了監(jiān)測個體EBV相關癌癥的方法。所述方法包括下述步驟(a)獲得不同時間點的個體尿樣；以及(b)檢測和/或定量尿樣中EBVDNA序列。尿樣中EBVDNA序列水平的差異作為EBV相關癌癥的發(fā)展的指征。例如，尿樣中存在EBVDNA序列或EBVDNA序列水平升高，表示EBV相關癌癥的進展，而尿樣中缺少EBVDNA序列或EBVDNA序列水平降低，則表示EBV相關癌癥的抑制。這種方法特別適用于評估EBV相關癌癥治療的效率。員應當理解的是，該步驟在某些情況下不是必須的，在所述情況下，已經提前獲得尿樣，例如，在采樣中心(samplingcenter)。在優(yōu)選的實施方案中，尿樣中EBVDNA序列的檢測或定量包括如下步驟(l)從尿樣中提取DNA;(2)擴增提取的DNA中EBVDNA序列；以及(3)檢測和/或定量擴增的EBVDNA序列。如本文所用的，短語"EBVDNA序列"指EB病毒(EBV)基因組(GenBank登錄號AJ507799)的片段，并且通常是基因組DNA降解的產物。特別是，本發(fā)明的EBVDNA序列包含EBV基因組SawHI-W區(qū)的至少一個片l殳。本文所用的SamHI陽W區(qū)指Jonesetal.，NucleicAcidsRes.11:3919-3937(1983)中公開的EBV基因組的重復5amHI醫(yī)W限制片段?？梢岳斫?，較長的DNA序列以較低的速率穿過腎屏障。因此，為了提高檢測的靈敏度，本發(fā)明所選的EBVDNA序列的大小不超過180bp。優(yōu)選，本發(fā)明靶標DNA序列的大小不超過76bp。本文所用術語"擴增(amplifying)"或"擴增(amplification)"意指EBVDNA序列其他拷貝的產生，通常利用聚合酶鏈式反應或本領域7>知的其他技術進行?？梢岳肞CR擴增EBVDNA序列單拷貝，達到可以由幾種不同方法4企測的水平。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，步驟(2)和步驟(3)通過實時定量PCR(Q-PCR)進行。本文所用術語"實時定量PCR"或"Q-PCR"指基于連續(xù)地光學監(jiān)測熒光PCR反應進程的方法。在這種系統(tǒng)中，除了常夫見PCR所用的一對擴增引物外，還包括雙標記的熒光雜交#:針。一種熒光染料作為報道分子(如FAM),且其發(fā)射譜由第二熒光染料(如TAMRA)淬滅。在PCR的延伸階段，T叫DNA聚合酶的5，到3，的核酸外切酶活性從探針中切割報道分子，因此將其從淬滅劑中釋放，導致焚光增加。熒光隨后用于監(jiān)測擴增過程并測定最初模板DNA的量。我們的研究發(fā)現，健康個體的尿中可以偶爾攜帶EBVDNA。為了排除這些假陽性情況，本發(fā)明的方法還包括分析尿樣中存在的EBVDNA序列大小的步驟。在一些實施方案中，分析EBVDNA序列的大小通過兩次或多次PCR檢測或Q-PCR檢測進行。這些檢測使用不同大小的擴增子。因為較長的DNA序列以較低的速率穿過腎屏障，因此當使用更大的擴增子時，在相同的擴增循環(huán)后，將獲得濃度低得多的最終擴增產物。如果利用不同大小的擴增子(如59bp和76bp),靶向EBVDNA序列的兩種或多種PCR檢測或Q-PCR檢測產生相似量的最終擴增產物，則存在于尿樣中的EBVDNA序列可能不是來自穿過腎屏障的循環(huán)EBVDNA。排除這些情況使本發(fā)明的方法對于NPC和其他EBV相關惡性腫瘤的診斷、預后或監(jiān)測具更高的可靠性?？蛇x地，我們可以以常失見方式分析大于180bp的EBV基因組片段是否存在于尿樣中。因為大于180bp的DNA片段難以穿過腎屏障，因此個體尿樣中存在大于180bp的EBV基因組片段可用于將所述個體從患有EBV相關癌癥的患者中排除。如先前所述，血漿EBVDNA濃度可用于i貪斷、預測或監(jiān)測NPC和其他EBV相關惡性肺瘤。本發(fā)明公開了在血漿和尿EBVDNA濃度之間存在良好的相關性，即血漿EBVDNA濃度可以通過定量尿EBVDNA濃度測定。因此，尿中EBVDNA序列濃度的檢測，是診斷、預測或監(jiān)測NPC和其他EBV相關惡性肺瘤的血漿纟全測的優(yōu)良替代方案。根據本發(fā)明，個體尿樣中存在EBVDNA序列可用于指示EBV相關癌癥，包括EBV相關癌癥的發(fā)展進程。根據本發(fā)明，個體尿樣中存在EBVDNA序列也可以作為EBV相關癌癥的不良預測因素，用于預測個體總生存率或復發(fā)的可能性。當追蹤患有EBV相關癌癥的個體尿樣中EBV序列的水平一段時間后，該水平的趨勢反映了癌癥的發(fā)展。通常，水平升高表示癌癥的進展。尿中EBV序列水平的趨勢也可以用于評估EBV相關癌癥治療的有效性。尿樣中缺少EBVDNA序列或EBVDNA序列的水平降低是治療有效的優(yōu)良指征。上文將EBVDNA作為EBV相關核酸的i兌明性實例。本領域4支術人員公知的是，存在與EBV相關的其他類型核酸，如RNA。因此，在某些實施方案中，用于EBV相關癌癥診斷、預后和監(jiān)測的方法，包括檢測EBV相關RNA,如人類個體尿樣中EB編碼的小RNA(Epstein-BarrencodedsmallRNA,EBER)。此外本發(fā)明公開了用于個體EBV相關癌癥的診斷或預后的試劑盒。該試劑盒包含a)用于從尿樣中提取DNA的第一單元；以及b)用于檢測和/或定量提取的DNA中EBVDNA序列的第二單元，其中第二單元包含用于擴增EBV基因組萬amHI-W區(qū)的至少一個片段的至少一對引物。本發(fā)明還公開了監(jiān)測個體EBV相關癌癥的試劑盒。該試劑盒包含a)多個用于從尿樣中提取DNA的第一單元；以及b)多個用于才企測和/或定量提取的DNA中EBVDNA序列的第二單元，其中第二單元包含擴增EBV基因組5a附HI-W區(qū)的至少一個片段的至少一對引物。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的試劑盒還包含用于從個體獲得尿樣的裝置。如果需要，試劑盒還可以包含使用試劑盒的說明書。通常，試劑盒的第二單元還包含Q-PCR檢測的探針。為了排除上文提到的假陽性情況，試劑盒優(yōu)選包含不同大小擴增子的引物。例如，試劑盒包含擴增180bpEBVDNA序列的一對引物，以及擴增76bpEBVDNA序列的另一對引物。監(jiān)測EBV相關癌癥的本發(fā)明的試劑盒，特別用于評估EBV相關癌癥治療的有效性，因為尿樣中缺少EBVDNA序列或EBVDNA序列水平降低，可以作為治療有效的指征。對本領域技術人員顯而易見的是，通過利用反轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測或實時定量反轉錄酶聚合酶鏈式反應(Q-RT-PCR)檢測，本發(fā)明的試劑盒也可以用于4企測和/或定量尿樣中EBVRNA序列，進行個體EBV相關癌癥的診斷、預后或監(jiān)測。僅以說明而非限制的方式，提供下述實施例。實施例募集44名NPC患者以及70名健康對照個體。首先從個體尿樣和血漿樣品中提取DNA,隨后，如下文所述，利用靶向EBV基因組5amHI-W區(qū)(Lo1999etal.)的定量實時PCR，擴增提取的DNA的EBVDNA。尿和血漿中DNA片段的提取將來自每個研究個體的10ml尿收集于含有EDTA的試管中。將尿樣在4°C下1,600g離心10分鐘。用0.45的過濾器過濾上清液，除去任何殘余的細胞。利用WizardPlusMiniprepDNA純化試劑盒(WizardPlusMiniprepDNAPurificationKit,Promega,Madison,WI),從尿樣中提耳又DNA。將經過濾的上清液與15mL6M的異石克氰酸胍(guanidineisothiocyanate,GITC)完全混合。向每個樣品中加入1mlDNA純化試劑盒中的樹脂懸浮液，隨后于室溫下在滾軸混合器(Rollermixer)上將混合物完全混合2小時。隨后利用30mL注射器，使尿-樹脂混合物流經試劑盒中提供的小型柱(minicolumn)。隨后使2ml洗滌液流經小型柱。通過簡單離心清除剩余的洗滌液。向小型柱中加入100微升H20，用于洗脫DNA片段。從血漿中提取DNA片段的方法，在本領域內是已知的，如Loetal.CancerRes.60(24):6878-81(2000)所述的利用QIAamp血液試劑盒(QIAampBloodKit,Qiagen，Hilden,Germany)的方法。簡而言之，根據本領域已經建立的實驗方案，從患者獲得血漿樣品。將樣品存儲于-20°C，直到進一步處理。利用QIAamp血液試劑盒(Qiagen,Hilden,Germany),采用制造商推薦的"血液和體液實驗方案"，從血漿樣品中提取DNA。每個柱利用總計400-800血漿樣品，進行DNA提取。記載準確的樣品量，用于計算把標DNA濃度。50/d的終洗脫體積用于從提取柱中洗脫DNA。EBVDNA片段的檢測和定量尿EBVDNA的濃度通過都耙向EBV基因組5amHI-W區(qū)的兩次實時PCR檢測測定。兩種PCR檢測的擴增子大小為76bp和59bp。76bp擴增子才企測所用的引物為5，-CCCAACACTCCACCACACC-3，(SEQIDNO.l)和5，-TCTTAGGAGCTGTCCGAGGG-3，(SEQIDNo.2)。59bp擴增子檢測所用的引物為5，-CCCAGGCACACACTACACACA-3，(SEQIDNo.3)和5，-TCTTAGGAGCTGTCCGAGGG-3，(SEQIDNo.4)。76bp和59bp擴增子檢測所用的熒光探針分別為5，-(FAM)-CACACACTACACACACCCACCCGTCTC-(TAMRA)-3'(SEQIDNo.5)和5，-(FAM)-CACCCGTCTCAGGG-(MGB)-3，(SEQIDNo.6)。PCR反應設置為50的反應體積。每個反應含有5|iL10x的緩沖液A;300nM的每種擴增引物；25nM相應熒光4笨針；4mMMgCl2;均為200的dATP、dCTP和dGTP;400)iMdUTP;1,25單位的AmpliTaqGold;以及0.5單位的AmpErase尿嘧咬N-糖基化酶。用10)al提取的尿DNA作為模板。兩個PCR系統(tǒng)使用相同的熱模式(thermalprofile),即50。C,2min;950C,10min，隨后40個循環(huán)的95°C15s以及56。C1min。利用從EBV陽性細胞系Namawa提取的DNA作為標準，對每個分析并行運行才交準曲線。Namalwa是二倍體細胞系，每個細胞含有兩個完整的EBV基因組。每個樣品分析兩次，隨后取平均值，進行分析。尿EBVDNA的數量可以表示為濃度/單位體積尿。例如拷貝/mL尿，或表示為數量/尿樣中另一種物質的量，以校準尿的濃度，例如拷貝/mmol肌氨酸酐。尿樣中存在EBV或EBV的水平為NPC的有用臨床標志分別利用76bp和59bp檢測，在NPC患者的10(23%)和22(50%)個尿樣中檢測到EBVDNA(表1)。59bp檢測的更高檢測率表明，更短的DNA分子更易于過濾通過腎屏障，并且可在尿中檢測到。與我們之前的結果一致，可在幾乎所有來自NPC患者的血漿樣品中檢測到EBVDNA。如表1所示，來自NPC患者的41(93%)個血漿樣品可以利用59bp檢測或76bp檢測進行檢測。耙標片段大小的進一步減少可進一步增加EBV相關核酸4企測的靈敏度。表1:利用59bp和76bp檢測，NPC患者的尿EBVDNA的檢出率<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>作為對照，也分析了70名健康個體。利用76bp檢測，在3名(40/。)個體的血漿中，EBVDNA是可以4企測的(表2)。它們的血漿EBVDNA濃度為13拷貝/mL,17拷貝/mL和22拷貝/mL。當與44名NPC患者的血漿EBVDNA水平(中間值950拷貝/mL)相比時，這些水平相對較低。在這三名對照個體的尿中，檢測不到EBVDNA。表2:利用59bpEBVDNA檢測，NPC患者和健康對照個體的尿EBVDNA的<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>假陽性情況評估的排除令人吃驚的是，在血漿檢測不到EBVDNA的兩名健康個體的尿中，檢測到了EBVDNA,濃度為227拷貝/mL和1,280,000拷貝/mL。用76bp和180bp大小的擴增子大小，采用靶向EBV基因組5awHI-W區(qū)的兩種實時PCR檢測，分析了這兩個尿樣。利用所述兩種檢測，這兩名個體的尿EBVDNA濃度相對恒定。對于前者前一個體而言，利用76bp和180bp檢測，尿EBVDNA濃度分別為333拷貝/mL和243拷貝/mL。對于后者后一個體而言，利用76bp和180bp檢測，尿EBVDNA分別為1,220,000拷貝/mL和1,073,000拷貝/mL。相反，對于在59bp和76bp兩種檢測中均檢測到尿EBVDNA的NPC患者而言，濃度的平均下降(mediandrop)為93.5%。利用180bp檢測，在44名NPC患者的尿中，未檢測到尿EBVDNA。利用兩種不同大小的PCR檢測，兩名健康個體相對恒定的尿EBVDNA濃度表明，他們尿中檢測到的EBVDNA分子與NPC患者尿中檢測到的EBVDNA相比是相對完整的。一種可能的解釋是，兩名對照個體的尿中存在完整的病毒顆粒，其可能來自活性病毒復制。診斷上，尿EBVDNA的大小可包括于分析中，以增加尿EBVDNA分析的特異性。血漿濃度和尿EBVDNA濃度之間的相關性利用76bp實時PCR檢測，分析NPC患者的血漿EBVDNA濃度。具可^r測和不可^r測的尿EBVDNA的患者的平均血漿EBVDNA濃度分別為2054拷貝/mL和511拷貝/mL(pO.0001,曼-惠特尼檢驗(Mann-Whitneytest))。在具有可^r測的尿EBVDNA的患者中，血漿EBVDNA濃度在統(tǒng)計學上顯著更高。結果顯示于圖1中。對于具有可才企測的尿EBVDNA患者，我們研究了在血槳濃度和尿EBVDNA濃度之間是否存在任何相關性。在血漿濃度和尿EBVDNA濃度之間，存在顯著的正相關性(r=0.684,p<0.0001,斯皮爾曼相關性(Spearmancorrelation);圖2a)。因為EBVDNA尿濃度受患者水合狀態(tài)的影響，我們用肌氨酸酐的尿濃度校正了EBVDNA的尿濃度，并以拷貝/mmol肌氨酸酐表示EBVDNA的濃度。當用尿肌氨酸酐濃度才交正尿EBVDNA濃度時，血漿濃度和尿EBVDNA的濃度之間的正相關性變得更加顯著(r:0.748,p<0.0001，斯皮爾曼相關性；圖2b)。尿才羊中存在EBVDNA或EBVDNA水平是預后的有用標志在平均追蹤8個月后，44名NPC患者中有三名出現了臨床復發(fā)。所有三名患者在治療前尿中具有可^r測的EBVDNA。相反，具有不可檢測的尿EBVDNA的22名患者中沒有人出現臨床復發(fā)。因為具有可才全測的尿EBVDNA的患者具有顯著更高的血漿EBVDNA水平，預期也可以將尿EBVDNA作為治療后生存率的預后標志，因為已知高血漿EBVDNA水平是治療后疾病復發(fā)的不良預后因素。可以預期，存活概率中的差異隨著追蹤期限的增加會變得更為突出。應當理解，盡管結合詳細的說明對本發(fā)明進行了描述，但上述說明意在示例而非限制本發(fā)明的范圍。本說明書引用的和/或列于申請數據頁中的所有上述的美國專利、美國專利申請出版物、美國專利申請、國外專利、國外專利申請以及非專利出版物，通過引用的方式以其整體并入本文。參考文獻Chan,ATC,Lo,YMD,Zee,B,Chan,LYS,etal.(2002)PlasmaEpstein-BarrvimsDNAandresidualdiseaseafterradiotherapyforundifferentiatednasopharyngealcarcinoma(未分"f匕鼻口因癌力文射治療后血漿EB病毒DNA和殘留病).JNatlCancerInst94(21):1614-9.Chen,CL，Wen,WN，Chen,JY,Hsu,MM,etal.(1993)DetectionofEpstein-BarrvirusgenomeinnasopharyngealcarcinomabyinsituDNAhybridization(通過原位DNA雜交檢測鼻咽癌中EB病毒基因組).Intervirology;36(2):91-8.Dickens,P,Srivastava,G,Loke,SL，Chan,CW,etal,(1992)Epstein-BarrvirusDNAinnasopharyngealcarcinomasfromChinesepatientsinHongKong(香港中國患者鼻咽癌中的EB病毒DNA).JClinPathol;45(5):396-7.Jones,MDandGriffin,BE.(1983)ClusteredrepeatsequencesinthegenomeofEpstein-Barrvirus(EB病毒基因組中成簇的重復序列)NucleicAcidsRes;11:3919-3937.Lei,KI,Chan,LYS,Chan,WY,Johnson,PJ,etal.(2000)Quantitativeanalysisofcirculatingcell-freeEpstein-Barrvirus(EBV)DNAlevelsinpatientswithEBV-associatedlymphoidmalignancies(患有EBV相關淋巴惡性胂瘤的患者中循環(huán)的無細胞EB病毒(EBV)DNA水平的定量分析).BrJHaematol11l(l):239-46.Lo,YMD，Chan,ATC,Chan,LYS,Leung,SF,etal.(2000)MolecularprognosticationofnasopharyngealcarcinomabyquantitativeanalysisofcirculatingEpstein-BarrvirusDNA(通過循環(huán)EB病毒DNA的定量分析對鼻咽癌的分子預測).CancerRes;60(24):6878-81.Lo,YMD,Chan,LYS,Lo，KW，Leung,SF,etal.(1999)Quantitativeanalysisofcell-freeEpstein-BarrvirusDNAinplasmaofpatientswithnasopharyngealcarcinoma(患有鼻咽癌的患者的血漿中無細月包EB病毒DNA的定量分析).CancerRes;59(6):l188-91.Lo，YMD,Chan,WY,Ng,EK,Chan,LY,etal.(2001)CirculatingEpstein-BarrvimsDNAintheserumofpatientswithgastriccarcinoma(患有胃癌的患者血清中循環(huán)的EB病毒DNA).ClinCancerRes;7(7):1856-9.權利要求1.診斷個體EB病毒(EBV)相關癌癥的方法，包括(a)獲得個體的尿樣；以及(b)檢測所述尿樣中EBV相關核酸序列，其中所述尿樣中存在EBV序列，表示所述個體患有EBV相關癌癥。2.如權利要求1所述的方法，其中步驟(b)包括(bl)從所述尿樣中提取核酸；(b2)從所提取的核酸樣品中擴增所述EBV相關核酸序列；以及(b3);險測擴增的EBV相關核酸序列。3.如權利要求l所述的方法，其中所述EBV相關核酸是DNA。4.如權利要求1所述的方法，其中所述EBV相關核酸序列來自EBV基因組5amHI-W區(qū)的至少一個片段。5.如權利要求4所述的方法，其中所述至少一個片段小于180個核苦酸。6.如權利要求1所述的方法，還包括分析大于180個核苷酸的EBV基因組片段是否存在于所述尿樣中的步驟，其中所述尿樣中存在大于180個核普酸的EBV基因組片段，表示所述個體未患有EBV相關癌癥。7.如權利要求l所述的方法，其中在步驟(b)中定量SamHI-W區(qū)的兩個片段，其中所述兩個片段大小不同且都小于180個核苷酸，且其中，在所述尿樣中，所述兩個片段的水平基本上相等，表示所述個體未患有EBV相關癌癥。8.如權利要求l所述的方法，其中在步驟(b)中，進行聚合酶鏈式反應(PCR)檢測、反轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測、實時定量聚合酶鏈式反應(Q-PCR)檢測或實時定量反轉錄酶聚合酶鏈式反應(Q-RT-PCR)檢測。9.如權利要求8所述的方法，其中所述PCR或Q-PCR檢測中所用的一對引物選自SEQIDNO.1和SEQIDNO.2;以及SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。10.如權利要求8所述的方法，其中所述Q-PCR檢測中所用的探針具有SEQIDNO.5或SEQIDNO.6的DNA序列。11.如權利要求l所述的方法，其中所述EBV相關癌癥是鼻咽癌(NPC)、天然殺傷細胞淋巴瘤(NK淋巴瘤)或胃癌。12.個體EBV相關癌癥預后的方法，包括(a)獲得個體的尿樣；以及(b)檢測所述尿樣中EBV相關核酸序列，其中所述尿樣中存在所述EBV相關核酸序列，表示所述EBV相關癌癥的不良預后。13.如權利要求12所述的方法，其中所述不良預后包括所述個體低總生存概率或高復發(fā)。14.如權利要求12所述的方法，其中所述EBV相關核酸是DNA.15.如權利要求12所述的方法，其中步驟(b)包括(bl)從所述尿樣中^是取核酸；(b2)從所提取的核酸中擴增所述EBV相關核酸序列；以及(b3)檢測擴增的EBV相關核酸序列。16.如權利要求12所述的方法，其中所述EBV相關核酸序列來自EBV基因組5amHI-W區(qū)的至少一個片段。17.如權利要求16所述的方法，其中所述至少一個片段小于180個核香酸。18.如權利要求12所述的方法，其中在步驟(b)中進行聚合酶鏈式反應(PCR)檢測、反轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測、實時定量聚合酶鏈式反應(Q-PCR)檢測或實時定量反轉錄酶聚合酶鏈式反應(Q-RT-PCR)檢測。19.如權利要求18所述的方法，其中所述PCR、RT-PCR、Q-PCR或Q-RT-PCR檢測中所用的一對引物選自SEQIDNO.1和SEQIDNO.2;以及SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。20.如權利要求18所述的方法，其中所述Q-PCR或Q-RT-PCR檢測中所用的探針具有SEQIDNO.5或SEQIDNO.6的DNA序列。21.如權利要求12所述的方法，其中所述EBV相關癌癥是鼻咽癌(NPC)、天然殺傷細胞淋巴瘤(NK淋巴瘤)或胃癌。22.監(jiān)測個體EBV相關癌癥的方法，包4舌(a)獲得不同時間點的個體尿樣；以及(b)4全測和/或定量所述尿樣中EBV相關核酸序列，其中所述尿樣中存在所述EBV相關核酸序列或所述EBV相關核酸序列水平升高，表示所述EBV相關癌癥的進展，而所述尿樣中缺少所述EBV相關核酸序列或所述EBV相關核酸序列水平降低，表示所述EBV相關癌癥的抑制。23.如權利要求22所述的方法，其中步驟(b)包括(bl)從所述尿樣中提耳又核酸；(b2)從所提取的核酸中擴增所述EBV相關核酸序列；以及(b3)一企測和/或量化擴增的EBV相關核酸序列。24.如^K利要求22所述的方法，其中在治療所述EBV相關癌癥的過程中進行步驟(a)，所述尿樣中缺少所述EBV相關核酸序列或所述EBV相關核酸序列水平降低，表示治療有效。25.如權利要求22所述的方法，其中所述EBV相關核酸是DNA。26.如權利要求22所述的方法，其中所述EBV相關核酸序列包含EBV基因組SawHI-W區(qū)的至少一個片段。27.如^5l利要求26所述的方法，其中所述至少一個片l史小于180個核苦酸。28.如權利要求22所述的方法，其中在步驟(b)中進行聚合酶鏈式反應(PCR)檢測、反轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測、實時定量聚合酶鏈式反應(Q-PCR)檢測或實時定量反轉錄酶聚合酶鏈式反應(Q-RT-PCR)檢測。29.如權利要求28所述的方法，其中所述PCR、RT-PCR、Q-PCR或Q-RT-PCR檢測中所用的一對引物選自SEQIDNO.1和SEQIDNO.2;以及SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。30.如4又利要求28所述的方法，其中所述Q-PCR或Q-RT-PCR檢測中所用的探針具有SEQIDNO.5或SEQIDNO.6的DNA序列。31.如權利要求22所述的方法，其中所述EBV相關癌癥是鼻咽癌(NPC)、天然殺傷細胞淋巴瘤(NK淋巴瘤)或胃癌。32.用于個體EBV相關癌癥診斷或預后的試劑盒，包含a)用于從所述個體的尿樣中提取核酸的第一單元；以及b)用于4全測所換:取的核酸中EBV相關核酸序列的第二單元，其中所述第二單元包含用于擴增EBV基因組J5amHI-W區(qū)的至少一個片段的至少一對引物。33.如權利要求32所述的試劑盒，其中所述EBV相關核酸是DNA。34.如權利要求32所述的試劑盒，其中所述EBV基因組5awHI-W區(qū)的至少一個片段小于180個核苦酸。35.如權利要求32所述的試劑盒，其中所述一對引物選自SEQIDNO.1和SEQIDNO.2;以及SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。36.如權利要求32所述的試劑盒，其中所述第二單元還包含具有SEQIDNO.5或SEQIDNO.6的DNA序列的4笨針。37.如權利要求32所述的試劑盒，還包含用于從個體獲得尿樣的裝置。38.如;K利要求32所述的試劑盒，其中所述EBV相關癌癥是鼻咽癌(NPC)、天然殺傷細胞淋巴瘤(NK淋巴瘤)或胃癌。39.監(jiān)測個體EBV相關癌癥的試劑盒，包含a)多個用于從所述個體的尿樣中提取核酸的第一單元；以及b)多個用于4企測和/或定量所提取的核酸中EBV相關核酸序列的第二單元，其中所述第二單元包含用于擴增EBV基因組5amHI-W區(qū)的至少一個片段的至少一對引物。40.如權利要求39所述的試劑盒，其中所述EBV相關核酸是DNA。41.如權利要求39所述的試劑盒，其中所述EBV基因組SamHI-W區(qū)的至少一個片段小于180個核苦酸。42.如權利要求39所述的試劑盒，其中所述至少一對引物選自SEQIDNO.1和SEQIDNO.2;以及SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。43.如權利要求39所述的試劑盒，其中所述第二單元還包含具有SEQIDNO.5或SEQIDN0.6的DNA序列的4笨4十。44.如權利要求39所述的試劑盒，還包含用于從個體獲得尿樣的裝置。45.如權利要求39所述的試劑盒，其中所述EBV相關癌癥是鼻咽癌(NPC)、天然殺傷細胞淋巴瘤(NK淋巴瘤)或胃癌。全文摘要本發(fā)明公開了通過檢測和/或定量個體尿樣中EBV相關核酸片段對EB病毒(EBV)相關癌癥進行診斷、預后或監(jiān)測的無創(chuàng)方法。也公開了對癌癥進行診斷、預后或監(jiān)測的試劑盒。文檔編號C12Q1/68GK101622362SQ200880006051公開日2010年1月6日申請日期2008年1月30日優(yōu)先權日2007年2月26日發(fā)明者盧煜明,陳君賜申請人:香港中文大學