專利名稱：：乙酰氧基酮的微生物還原的制作方法乙酰氧基酮的微生物還原本發(fā)明涉及制備式I的2-氨基-[5-(l-羥基-2-羥基或鹵代-乙基)]-吡嗪衍生物的方法，其中R是低級(jí)垸基羰基或氨基保護(hù)基并且R1是羥基或鹵素，所述方法包括式II的酮的酶促水解和/或酶促不對(duì)稱還原，其中W是低級(jí)烷基羰基氧基或鹵素。該方法在對(duì)映體純的(S)-N-[5-(1,2-二羥基-乙基)-吡嗪基]-2,2-二甲基-丙酰胺的制備中特別有用。該化合物是作為葡糖激酶激活劑的式III的2-(3-氯-4-甲磺?；?苯基)-3-環(huán)戊基-N-[5-(l,2-二羥基-乙基)-吡嗪-2-基]-丙酰胺的中間體，所述式III化合物可用于治療和/或預(yù)防II型糖尿病式III化合物公開(kāi)于PCT國(guó)際專利申請(qǐng)WO2004/052869Al中。在合成式III化合物中使用的關(guān)鍵砌塊之一是式Ia的對(duì)映體純的2-氨基-[5-(l,2-二羥基-乙基)]-吡嗪衍生物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中R是低級(jí)垸基羰基或氨基保護(hù)基。為了制備活性藥物成分(APIs)，絕對(duì)必需使用異構(gòu)體純的砌塊和/或高度立體選擇性的程序，因?yàn)锳PIs中的副組分可能不利地影響疾病的治療。因此，所有APIs都要求高純度。旋光活性的1，2-二醇是通用的合成中間體并且難以以對(duì)映體純的形式獲得。WO2004/052869Al中描述的用于制備(S)-N-[5-(l,2-二羥基-乙基)-吡嗪基]-2,2-二甲基-丙酰胺的方法包括，在包含四氧化鋨的反應(yīng)中Sharpless氧化相應(yīng)的乙烯基吡嗪前體(參見(jiàn)方案1)。該反應(yīng)由于四氧化鋨催化劑的毒性而不能在多-kg規(guī)模上進(jìn)行。因此，需要解決的問(wèn)題是找到一種不含有毒試劑并且能夠在大的工業(yè)規(guī)模上進(jìn)行的合適的工藝備選方案。鮮有報(bào)道在單個(gè)步驟中將垸氧基酮微生物水解/還原成相應(yīng)的二醇的文獻(xiàn)實(shí)例。G.Egri等，r"ra/z^ra"y^ymme^y1998,義277-2S3，描述了一系列l(wèi)-乙酰氧基-3-芳氧基丙-2-酮通過(guò)面包酵母的生物轉(zhuǎn)化。所測(cè)試的13種酮中只有2種在沒(méi)有形成中間體一乙酸酯的情況下被直接轉(zhuǎn)化成二醇。6大多數(shù)情況下看到的是一乙酸酯和二醇的混合物，對(duì)于制備式I化合物的方法而言，這是不合需要的。另外，這些反應(yīng)僅是以0.5g的規(guī)模在0.25%w/w的底物濃度下進(jìn)行的；遠(yuǎn)低于用于制備式I化合物的規(guī)模和底物濃度。T.Kometani等，《/說(shuō)c^c/e"ce.所oe"g.2001,P/'525-527，描述了通過(guò)使用面包酵母還原l-乙酰氧基-2-丙酮而制備(S)-l,2-丙二醇。盡管向二醇的轉(zhuǎn)化是在1。/。w/v底物濃度完成的，ee為88。/。。該值只能通過(guò)抑制乙酰氧基酮的水解而提高。Z-LWei等，MW"力a/C7zem&^y2000,S,"29-/737，描述了由相應(yīng)的2-乙酰氧基-l-芳基乙酮制備S-二醇，但是同樣選擇性較低并且在大多數(shù)情況下存在一乙酸酯。通過(guò)微生物還原/水解反應(yīng)形成的(S)-二醇的ee是關(guān)鍵值，因?yàn)樗绊慉PI的最終收率。在根據(jù)本發(fā)明制備的API的情形中，隨后的酮縮醇化和結(jié)晶步驟導(dǎo)致對(duì)映體過(guò)量增加到>99%。除了所述的烷氧基酮的水解/還原的微生物生物轉(zhuǎn)化外，可以應(yīng)用的僅是必需分離的生物催化劑-酶(例如水解酶、酮還原酶、葡糖脫氫酶)-以一罐法。采用分離的酮還原酶的不對(duì)稱還原與使用葡糖脫氫酶和酯部分的酶促水解的酶促輔因子循環(huán)的組合是本領(lǐng)域的現(xiàn)狀。S.Kambourakis等，7^ra/2^/ra"v4矽mwe/72005,M,j(5卵，描述了使用不同酮還原酶的2-羥基-l-苯基-乙酮的還原。采用兩種以上的酶類型的酶促轉(zhuǎn)化經(jīng)常是成功的，如V.Kren等，C/zem.￡d1995,340」，卵3中所述。因此，乙酰氧基酮轉(zhuǎn)化成羥基酮的上游酶促水解和此原位產(chǎn)生羥基酮的下游還原模擬了可能的微生物-水解/還原-生物轉(zhuǎn)化。使用孤立的酶的多酶促反應(yīng)具有以下一些優(yōu)點(diǎn)，如i)可以使用標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)備；ii)高反應(yīng)速率，iii)與整個(gè)細(xì)胞體系相比無(wú)副活性，iv)簡(jiǎn)單的反應(yīng)控制以及v)由于所產(chǎn)生的(S)-二醇的更高ee，在隨后的酮縮醇化反應(yīng)中有更高的收率。2-氨基-[5-(乙?；?]-吡嗪衍生物的末端位置可以具有不同的取代基，其在酮部分的不對(duì)稱還原后可轉(zhuǎn)換成羥基官能團(tuán)。對(duì)于鹵素取代基，或更具體地，氯取代基，即一種潛在選擇物，在以下文獻(xiàn)中描述了不同芳基酮的幾種生物催化的不對(duì)稱還原L.Hua等，Ogam'cc&說(shuō)bwo/ecw/"rC/zem&^y2006,4,2仰0-2砂5和L.Hua等r"ra/2edrawj^mme^y2005,W75-W7S。據(jù)描述，由芳香族氯化醇開(kāi)始的對(duì)映體純1，2-二醇的合成是，經(jīng)由T.Ikamiya等，T^ra/z^/ra"2004,<5化74〃-7W7中的相應(yīng)的對(duì)映體純環(huán)氧化物，和隨后的環(huán)氧化物水解，所述環(huán)氧化物水解或者經(jīng)由生物催化的水解，如Z.Li等，rdraW應(yīng)勿畫(huà)勿2006,77,仏52中所述，或者具有使用金屬催化的水解，如G-J.Kim等，re/ra/z^ra"2005,W,22^-2266中所述。采用根據(jù)本發(fā)明的生物轉(zhuǎn)化方法，己經(jīng)發(fā)現(xiàn)了制備對(duì)映體純的2-氨基-[5-(1，2-二羥基-乙基)]-吡嗪衍生物的一個(gè)有效程序。除非另外指出，以下的定義用于舉例說(shuō)明和限定本文中用于描述本發(fā)明的各種術(shù)語(yǔ)的含意和范圍。在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)"低級(jí)"用于表示由1-6個(gè)、優(yōu)選l-4個(gè)碳原子組成的基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"鹵素"是指氟和氯，優(yōu)選氯。單獨(dú)的或與其他基團(tuán)組合的術(shù)語(yǔ)"垸基"是指1-20個(gè)碳原子、優(yōu)選1-16個(gè)碳原子、更優(yōu)選l-10個(gè)碳原子的支鏈或直鏈一價(jià)飽和脂肪族烴基。單獨(dú)的或與其他基團(tuán)組合的術(shù)語(yǔ)"低級(jí)垸基"或"CrC6-烷基"是指1-6個(gè)碳原子、優(yōu)選l-4個(gè)碳原子的支鏈或直鏈一價(jià)垸基。該術(shù)語(yǔ)進(jìn)一步示例為以下基團(tuán)如甲基，乙基，正-丙基，異丙基，正-丁基，仲-丁基，異丁基,叔丁基，正-戊基,3-甲基丁基，正-己基，2-乙基丁基等。優(yōu)選的低級(jí)垸基殘基是甲基，乙基和叔丁基，其中特別優(yōu)選叔丁基。術(shù)語(yǔ)"低級(jí)烷基羰基"是指基團(tuán)-C(0)-R，，其中R，是l-6個(gè)碳原子、優(yōu)選l-4個(gè)碳原子的支鏈或直鏈一價(jià)垸基。優(yōu)選的"低級(jí)垸基羰基"或"CrCV烷基羰基"基團(tuán)是乙酰基，丙酰基，丁?；?，新戊?；?，戊酰基和己?；８鼉?yōu)選乙?；托挛祯；?叔丁基羰基)，最優(yōu)選叔丁基羰基。此處使用的術(shù)語(yǔ)"氨基保護(hù)基"是指通常用于在化合物上的其他官能團(tuán)反應(yīng)時(shí)封閉或保護(hù)氨基官能團(tuán)的取代基。合適的氨基保護(hù)基選自甲酰基，芐基，酯基如芐氧羰基("Cbz"),9-芴基甲氧羰基("FMOC"),叔丁氧羰基("BOC")和烯丙氧羰基，以及芳基磺?；苌锶鐚?duì)-甲苯磺?；S磺?；捅交酋；?。氨基保護(hù)基的選擇和使用(添加和隨后的去除)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。上述術(shù)語(yǔ)所指基團(tuán)的更多實(shí)例描述于T.W.Greene和P.G.M.Wuts,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,3fedition,JohnWileyandSons,NewYork,NY,1999。優(yōu)選的氨基保護(hù)基是BOC。術(shù)語(yǔ)"低級(jí)垸基羰基氧基"是指基團(tuán)-O-C(O)-R"，其中R"是1-6個(gè)碳原子、優(yōu)選1-4個(gè)碳原子的直鏈一價(jià)烷基。優(yōu)選的"低級(jí)烷基羰基氧基"或"CVC6-垸基羰基氧基"基團(tuán)是乙酰氧基，丙酰氧氧基，丁酰氧基，戊酰氧基和己酰氧基。特別優(yōu)選的"低級(jí)垸基羰基氧基"是乙酰氧基。術(shù)語(yǔ)"對(duì)映體純"是指組合物中單個(gè)對(duì)映體占至少90%、優(yōu)選約95%-100%、更優(yōu)選98%-100%、最優(yōu)選99%-100%這樣的組成。此處使用的術(shù)語(yǔ)"對(duì)映體過(guò)量"(簡(jiǎn)稱"ee")，定義為[F(+)-F(-)]，其中F(+)指(+)-對(duì)映體的摩爾或重量分?jǐn)?shù)并且F(-)指(-)-對(duì)映體的摩爾或重量分?jǐn)?shù)。相應(yīng)地，術(shù)語(yǔ)"對(duì)映體過(guò)量百分比"或"。/。ee"定義為100x[F(+)-F(-)]。備選地，可以將對(duì)映體過(guò)量百分比計(jì)算為100x([R]-[S]/[R]+[S])。本發(fā)明涉及一種用于制備式I化合物的方法，其中R是低級(jí)烷基羰基或氨基保護(hù)基并且R1是羥基或鹵素，所述方法包括式II的酮的酶促水解和/或酶促不對(duì)稱還原，其中W是低級(jí)烷基羰基氧基或鹵素。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法的特征在于，R'是羥基并且W是乙酰氧基，即獲得式Ia化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中R是低級(jí)烷基羰基或氨基保護(hù)基。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法的特征在于，酶促水解和酶促不對(duì)稱還原是采用近平滑假絲酵母(Ca"&^para;^7a^)種的酵母一起進(jìn)行的。因此，本發(fā)明涉及用于制備式&的2-氨基-[5-(1，2-二羥基-乙基)]-吡嗪的方法，其中R是低級(jí)垸基羰基或氨基保護(hù)基，所述方法包括式IIa的酮化合物的釆用近平滑假絲酵母種酵母的酶促水解和酶促不對(duì)稱還原通過(guò)使用酵母近平滑假絲酵母菌株，由處于技術(shù)上相關(guān)的底物濃度的相應(yīng)乙酰氧基酮IIa的水解和不對(duì)稱還原，制備所需的產(chǎn)物Ia。該方法可以在不添加水解酶如脂酶的情況下進(jìn)行，因?yàn)樵摼昕梢酝瑫r(shí)催化水解和不對(duì)稱還原。詳細(xì)地，本發(fā)明涉及可放大的生物催化法，其包括式IIa化合物的使用酵母近平滑假絲酵母的水解和不對(duì)稱微生物還原，以獲得式Ia的對(duì)映體純的(S)-二醇，所述方法包括以下步驟a)將近平滑假絲酵母培養(yǎng)物在含有富有營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基的燒瓶或發(fā)酵罐中于27-30。C生長(zhǎng)1-2天，所述培養(yǎng)基中包括酵母提取物(1%w/v)，大豆胨(1%w/v)，含氮酵母堿基(0.67%w/v)和葡萄糖(2。/。w/v);b)在接種后16-20h加入NH40H，以將pH維持在6.5-7.0范圍內(nèi)，并且供給相當(dāng)于3-5%(v/v)/24h的乙醇，以提供用于生長(zhǎng)和用于不對(duì)稱還原的還原等價(jià)物；c)再過(guò)2-4小時(shí)后，向發(fā)酵液中以在875ml水中的懸浮液形式加入175g的式IIa的乙酰氧基酮底物，以得到1-5%(w/v)的最終濃度；d)在2-5天內(nèi)將式IIa的乙酰氧基酮水解和還原成相應(yīng)的(S)-二醇；e)通過(guò)分離生物質(zhì)(離心)離析出(S)-二醇，接著將(S)-二醇用乙酸乙酯萃取(用2體積當(dāng)量萃取3次)并且濃縮。該反應(yīng)還必須進(jìn)行完全，§卩，所有的底物必須在5M(w/v)的底物濃度被轉(zhuǎn)化，這顯著高于在文獻(xiàn)實(shí)例中所引用的濃度。通過(guò)用近平滑假絲酵母將式IIa的乙酰氧基酮生物轉(zhuǎn)化，獲得ee在91.4。/。-95.6。/。范圍內(nèi)的對(duì)映體純的(S)-二醇。如此處所使用的，近平滑假絲酵母是在Roche分離的菌株并且根據(jù)Budapest條約在2007年3月9日存放在DSMZ(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,Inhoffenstrasse7B,38124Braunschweig,Germany),保藏登記號(hào)為DSM19155。幾種其他的近平滑假絲酵母菌珠也催化以92-95%的ee得到(S)-二醇的所述生物轉(zhuǎn)化，表明可潛在地使用任何近平滑假絲酵母菌株。另外，可以使用酵母乳酒假絲(Ca"fife/aA:e7^r),可克斯克塞維酵母(尺/w少verom少ces附anc/(3"ws)禾口真菌可可花癭病菌(Ga7o"ecW"ia'gWz^cM/(2)的菌珠。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及可放大的生物催化法，其包括乙酸2-[5-(2，2-二甲基-丙?；?propioyl)氨基)-吡嗪-2-基]-2-氧代-乙酉旨(式IIa的化合物，其中R是叔丁基羰基)的不對(duì)稱微生物還原，和使用酵母近平滑假絲酵母的水解，以獲得對(duì)映體純的(8)-^[5-(1，2-二羥基-乙基)-吡嗪基]-2,2-二甲基-丙酰胺。在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該方法的特征在于，酶促水解是通過(guò)選自酯酶、蛋白酶或脂酶的水解酶(EC3丄1)進(jìn)行的并且隨后的酶促不對(duì)稱還原是通過(guò)一種或多種氧化還原酶(ECl丄l)進(jìn)行的。因此，本發(fā)明還涉及用于制備式Ia的2-氨基-[5-(l,2-二羥基-乙基)]-吡嗪的方法，其中R是低級(jí)烷基羰基或氨基保護(hù)基，該方法包括式IIa的酮化合物的通過(guò)選自水解酶、酯酶、蛋白酶或脂酶的酶的酶促水解和通過(guò)一種或多種氧化還原酶的酶促不對(duì)稱還原，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>優(yōu)選地，酶促水解是通過(guò)脂酶進(jìn)行的。更優(yōu)選脂酶獲自南極假絲酵母(Cawo^flJwtorc"ca),產(chǎn)堿桿菌屬中的禾中"/co/z'ge"esw.)或洋蔥伯克霍爾德氏菌(5wrA:/zoWer/ace/QC〖")。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用酮還原酶或醇脫氫酶作為酶促不對(duì)稱還原中的氧化還原酶。多酶促生物轉(zhuǎn)化是以一罐式反應(yīng)方式轉(zhuǎn)化的。水解-脫乙酰基化-是通過(guò)使水解酶與懸浮在兩相反應(yīng)介質(zhì)中的式IIa的乙酰氧基酮接觸而進(jìn)行的。還原是通過(guò)使氧化還原酶與原位形成的(x-羥基酮接觸而進(jìn)行的。由于原位形成的a-羥基酮的低穩(wěn)定性，還原酶的應(yīng)用活性必須超過(guò)水解酶的應(yīng)用活性。所需的還原當(dāng)量是以催化量應(yīng)用的并且原位循環(huán)。預(yù)期的式Ia產(chǎn)物是在工業(yè)反應(yīng)條件下制備的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及可放大的生物催化方法，該方法包括通過(guò)選自水解酶、酯酶、蛋白酶或脂酶的酶的乙酸2-[5-(2,2-二甲基-丙酰基氨基)-吡嗪-2-基]-2-氧代-乙酯(式IIa的化合物，其中R是叔丁基羰基)的水解，和通過(guò)一種或多種氧化還原酶的酶促不對(duì)稱還原，以獲得對(duì)映體純的(S)-N-[5-(l,2-二羥基-乙基)-吡嗪基]-2，2-二甲基-丙酰胺。RH-N、乂N、N。JOCH。方案2H、UOOH第一步，通過(guò)乙酰氧基酮(5)脫乙酰基化的羥基酮(6)的原位生成是采用水解酶、酯酶、蛋白酶或脂酶進(jìn)行的，優(yōu)選采用脂酶；還更優(yōu)選釆用來(lái)自南極假絲酵母的脂酶[例如CALBL(Novozyme)]，采用來(lái)自產(chǎn)堿桿菌屬的種的脂酶[例如QLM(MeitoSangyo)]，采用來(lái)自洋蔥伯克霍爾德氏菌的脂酶(脂酶PS)及其突變脂酶AH。后續(xù)的不對(duì)稱還原是采用氧化還原酶進(jìn)行的，優(yōu)選采用酮還原酶或醇脫氫酶，更優(yōu)選采用酮還原酶KRED101,107,111,112,113禾P114,A1F,B1D和B1E[BioCatalytics]。所需的還原當(dāng)量可以采用所有現(xiàn)有技術(shù)的方法在原位循環(huán)；優(yōu)選采用酶；更優(yōu)選采用葡糖脫氫酶GDH102[BioCatalytics]。合適的緩沖劑是生化領(lǐng)域中普遍使用的常規(guī)緩沖劑，其在pH5-8、優(yōu)選pH6-7范圍內(nèi)。在反應(yīng)進(jìn)程中，通過(guò)加入堿，優(yōu)選NaOH或KOH溶液，將反應(yīng)混合物的pH在選擇的值保持恒定。中和形成的乙酸需要一個(gè)當(dāng)量，中和形成的葡糖酸需要更多的當(dāng)量。在KRED101，脂酶AH和GDH102的酶組合的情況下，在非極性有機(jī)溶劑如正-庚垸或叔丁基甲基醚(TBME)(例如20%v/v)和D-葡萄糖(例如0.5M)存在下使用2-(4-嗎啉基)-乙磺酸緩沖齊!」(例如pH6.25)正向影響總的反應(yīng)性。反應(yīng)溫度可以在25-45°C、優(yōu)選30-40°C范圍內(nèi)。底物濃度可以在1-20%(w/w)范圍內(nèi)，優(yōu)選5%(w/w)。原位形成的羥基酮(6)的低穩(wěn)定性要求催化還原活性超過(guò)脫乙?；钚?。羥基酮(6)的原位濃度必須足夠高，以使其不對(duì)稱還原的周轉(zhuǎn)率高。酮還原酶顯示出對(duì)乙酰氧基酮(5)直接還原明顯較低的活性，以及對(duì)于生成的乙酰氧基醇-二醇(7)的潛在中間體，明顯較低的對(duì)映體純度。該方法條件必須抑制乙酰氧基酮(5)的直接還原，或通過(guò)觸發(fā)其原位濃度提高原位形成的羥基酮(6)的不對(duì)稱還原的高周轉(zhuǎn)率，以維持對(duì)映體純的0S)-二醇(7)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于制備式Ib的2-酰氨基-[5-(l-羥基-2-鹵代-乙基)]-吡嗪的方法，其中R是低級(jí)烷基羰基或氨基保護(hù)基并且R1是鹵素，該方法包括式lib的酮的酶促不對(duì)稱還原，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>其中W是鹵素。優(yōu)選R和R2是氯。優(yōu)選地，酶促不對(duì)稱還原是通過(guò)一種或多種氧化還原酶進(jìn)行的。更優(yōu)選使用酮還原酶或醇脫氫酶作為氧化還原酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及N-[5-(2-氯-乙酰基)-吡嗪基]-2，2-二甲基-丙酰胺(4)至(5)-N-[5-(2-氯-l-羥基-乙基)-吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酰胺(5)的酶促還原。該不對(duì)稱還原是通過(guò)使氧化還原酶與氯酮(8)接觸而進(jìn)行的。所需的還原當(dāng)量是以催化量應(yīng)用的并且原位還原。優(yōu)選的氧化還原酶是酮還原酶或醇脫氫酶，更優(yōu)選酮還原酶KRED101,KRED111，KRED112,KRED113和KRED114[BioCatalytics]。所需的還原當(dāng)量可以通過(guò)常規(guī)方法原位循環(huán)；優(yōu)選采用酶；更優(yōu)選采用葡糖脫氫酶GDH102[BioCatalytics]。'合適的緩沖劑是生化領(lǐng)域中普遍使用的常規(guī)緩沖劑，其在pH5-8、優(yōu)選pH6-7范圍內(nèi)。在反應(yīng)進(jìn)程中，通過(guò)加入堿，優(yōu)選NaOH或KOH溶液，將反應(yīng)混合物的pH在選擇的值保持恒定。中和形成的葡糖酸需要一在KRED101和GDH102的酶組合的情況下，在D-葡萄糖(例如0.06M)存在下、在更高的底物濃度使用磷酸鉀緩沖劑(例如pH6.5)和更高D-葡萄糖濃度的加入正向影響總的反應(yīng)性。反應(yīng)溫度可以在25-45°C、優(yōu)選30-35°C范圍內(nèi)。底物濃度可以在0.1-10%(w/w)范圍內(nèi)，優(yōu)選5%(w/w)，更優(yōu)選0.5%(w/w)。有利地，氯酮(8)向?qū)τ丑w純的(5>>^-[5-(2-氯-1-羥基-乙基)-吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酰胺(Ic)的不對(duì)稱還原不需要第三種水解酶(例如脂酶)并且不原位產(chǎn)生潛在的不穩(wěn)定中間體。絕對(duì)構(gòu)型是由晶體結(jié)構(gòu)確定的。隨后，必須通過(guò)氯對(duì)羥基的親核取代將對(duì)映體氯化的醇(Ic)轉(zhuǎn)化成所需的對(duì)映體純的(S)-二醇(7)。如上己經(jīng)描述的，R優(yōu)選是叔丁基羰基，即此前定義的方法優(yōu)選是由其中R是叔丁基羰基的式II化合物開(kāi)始而進(jìn)行的。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及新的式IIc的化合物其中112是低級(jí)院基羰基氧基或鹵素。式IIc化合物的制備可以根據(jù)下面的方案4和5進(jìn)行。在步驟1中，將2-氨基-5-溴代吡嗪(l)的氨基在二氯甲垸中用三甲基乙酰氯(新戊酰氯；PivCl)保護(hù)，以卯％收率得到酰胺7。鈀催化的酰胺2的羰甲氧基化(步驟2)是在4:1的二甲基甲酰胺:甲醇混合溶劑中、在500psi的一氧化碳下、在帕爾反應(yīng)器中進(jìn)行的，以84%收率得到甲酯9。在步驟3中，甲酯9與通過(guò)用雙(三甲基甲硅烷基)氨基化鋰(LHMDS)處理由乙酸叔丁酯生成的烯醇的克萊森縮合，產(chǎn)生酮酯10。在萃取后處理和溶劑交換后，將得到的10的乙醇溶液在催化量的溴化鋰存在下用N-溴琥珀酰亞胺(NBS)處理，從9以95%的總收率得到溴化物11。用在二氯甲垸中的三氟乙酸(TFA)處理11，以97%的收率得到oi-溴酮IId(步驟5)，在室溫?cái)嚢?0h后完成脫羧基。通過(guò)在室溫與在DMF中的乙酸鈉的取代反應(yīng)，將a-溴酮IId轉(zhuǎn)化成乙酰氧基酮lie(步驟6)。在從乙酸乙酯/庚垸結(jié)晶后，以卯M的收率獲得乙酰氧基酮IIe。隨后，發(fā)現(xiàn)，通過(guò)加入水，IIe可以直接從反應(yīng)混合物中沉淀出來(lái)。萬(wàn)案4步驟lPivCl吡啶<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>步驟2CO催化劑PdCI2(PPh3)2Et3N4:1DMF:MeOHN-[5-(2-氯-乙?；?-吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酰胺(IIf)可以由甲酯9通過(guò)與溴氯甲垸反應(yīng)和用丁基鋰活化而直接獲得(參見(jiàn)方案5)。、C02Me步驟3LHMDStBuOAcTHF10步驟4NBS催化劑L舊r丁酮11步驟6NaOAcAcOH<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>萬(wàn);在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及新的式Ic的化合物，CH，H3CH。CHN、乂NO、、Zlc、ClOH在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于制備式ni化合物的方法，H。CIII該方法包括根據(jù)權(quán)利要求1-11的方法，接著是a)式Ia的二醇la、OHOH其中R是低級(jí)烷基羰基或氨基保護(hù)基，與2,2-二甲氧基丙烷反應(yīng)以形成縮醛，并且在堿性條件下將胺脫保護(hù)以獲得式IV的化合物，▽、oIVoCH，b)式IV的胺與式V的羧酸或其活化衍生物縮合17獲得所述的胺；和C)在酸性條件下水解所述縮醛。發(fā)現(xiàn)2R-(3-氯-4-甲磺酰基-苯基)-3-環(huán)戊基-N-[5-(lS,2-二羥基-乙基)-吡嗪-2-基]-丙酰胺(式III的化合物)是有效的葡糖激酶激活劑。激活GK從而提高GK傳感系統(tǒng)的靈敏度的化合物，在所有II型糖尿病的高血糖特征的治療中是有用的。葡糖激酶激活劑將增加P-細(xì)胞和肝細(xì)胞中葡萄糖代謝的通量，這將與增加的胰島素分泌聯(lián)系在一起。因此這樣的試劑可用于治療II型糖尿病和其他代謝疾病。在步驟a)中，1，2-二醇基團(tuán)以環(huán)狀縮醛形式被保護(hù)。1,2-二醇與二甲氧基丙烷的反應(yīng)提供l，3-二氧戊環(huán)。優(yōu)選地，反應(yīng)在酸催化劑如對(duì)甲苯磺酸(PTSA)或樟腦磺酸(CSA)的存在下進(jìn)行?？s醛對(duì)除質(zhì)子酸如乙酸水溶液，三氟乙酸水溶液和鹽酸以及路易斯酸外的大多數(shù)反應(yīng)條件是穩(wěn)定的。因此縮醛將不被用于隨后的胺脫保護(hù)的堿如碳酸鉀攻擊。對(duì)于步驟b)中的縮合，可以采用式V羧酸的活化衍生物，例如其可以是通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的方法制備的保護(hù)的酯或酰氯。優(yōu)選地，可以使用式V酸的酰氯，并且在堿如吡啶或氨基吡嗪的存在下進(jìn)行偶合。酰氯可以通過(guò)式V化合物與草酰氯或亞硫酰二氯在合適的溶劑如二氯甲烷中.的反應(yīng)而制備。在步驟c)中，將縮醛保護(hù)基在酸性條件下，例如通過(guò)使用鹽酸而解離，以獲得式III的1,2-二醇。在下面的方案6中，舉例說(shuō)明了由式Ia化合物開(kāi)始制備式III化合物的方法，所述式Ia化合物是通過(guò)此前定義的酶促方法制備的。方案6<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>以下實(shí)施例用于舉例說(shuō)明本發(fā)明而不限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1乙酸2-[5-(2,2-二甲基丙?；被?-吡嗪-2-基]-2-氧代-乙酯的制備步驟l:N-(5-溴-吡嗪-2-基)-2,2-二甲基丙酰胺(2)的制備將配備有磁力攪拌器、溫度計(jì)、冷凝器和氮?dú)馊肟?出口的3-頸lL圓底燒瓶裝入50.00g(287.4mmol)的2-氨基-5-溴吡嗪(1),218mL的二氯甲烷和30.50mL(377.1mmol)的吡啶。然后，在5min內(nèi)滴加39.30mL(319.1mmol)的三甲基乙酰氯(PivCl)。隨之發(fā)生放熱，使混合物溫度從22。C升高到44。C。在約40。C攪拌2h后，HPLC分析顯示反應(yīng)完全。將反應(yīng)混合物用200mL乙醇稀釋，然后通過(guò)在大氣壓下蒸餾而濃縮。在收集240mL餾出物并且混合物溫度達(dá)到68。C后，緩慢加入100mL水，同時(shí)將混合物溫度保持在約68。C。加入完成后，使得到的懸浮液冷卻到室溫并且攪拌過(guò)夜。通過(guò)過(guò)濾收集固體，用100mL的乙醇:水l:l洗滌，并且通過(guò)抽吸干燥，得到67.08g(90.4。/。收率)的標(biāo)題化合物，為淺米色固體；由HPLC分析確定的純度為98.21%(HPLC柱ZorbaxEclipseXDB-C8，4.6x50mm,1.8,,洗脫液5-100%乙腈/水+01.%TFA，以1mL/min洗脫5min，在UV250nm檢測(cè)，停留時(shí)間4.22min)。步驟2:5-(2,2-二甲基-丙?；被?-吡嗪-2羧酸甲酯(9)的制備將300mL帕爾反應(yīng)器裝入15.00g(58.11mmol)在步驟1中制備的化合物，16.80mL(414.8mmol)的甲醇，67.20mL的二甲基甲酰胺(DMF),61.20mg(0.0872mmol)的氯化雙(三苯膦)鈀和8.900mL(63.92mmol)的三乙胺。將反應(yīng)器用氮?dú)獯祾?次(通過(guò)將其加壓，接著通風(fēng)至大氣壓)，然后用一氧化碳吹掃2次。將混合物加熱到92。C，同時(shí)在500rpm攪拌，然后用CO加壓至500psi，歷時(shí)18h。HPLC分析顯示反應(yīng)完全。在冷卻到65。C后，將反應(yīng)器減壓并且將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到500mL圓底燒瓶中。用30mL的DMF沖洗反應(yīng)器，并且將沖洗液也轉(zhuǎn)移到燒瓶中。然后，加入80mL的水。在冷卻到室溫后，將得到的固體通過(guò)過(guò)濾收集，用50mL的DMF:水1:1和50mL的水洗滌，并且通過(guò)抽吸干燥，得到11.56g(83.8%收率)的標(biāo)題化合物，為淺米色固體；由HPLC分析確定的純度為100%(條件與步驟i中相同，停留時(shí)間3.46min)。20步驟3:3-[5-(2,2-二甲基-丙酰基氨基)-吡嗪-2-基]-3-氧代-丙酸-叔丁酯(10)的制備將配備有磁力攪拌器，加料漏斗，熱電偶探頭和氮?dú)馊肟?出口的3-頸l-L圓底燒瓶裝入25.00mL(185.5mmol)的乙酸叔丁酯，20.00g(84.30mmol)在步驟2中制備的化合物和20mL的THF。在冷卻到-20。C后，滴加261.4mL(261.4mmol)的l.OM雙(三甲基甲硅垸基)氨基化鋰(LHMDS)的THF溶液，同時(shí)將反應(yīng)混合物的溫度保持在-20。C和0。C之間。將得到的紅色溶液在-20。C攪拌40min。HPLC分析顯示反應(yīng)完全。將混合物溫?zé)岬?。C，然后通過(guò)加入預(yù)冷的200mL(260.3mmol)的25wt。/。檸檬酸溶液猝滅。將有機(jī)層分離，用2x200mL的飽和氯化鈉溶液洗滌并且在30°C/60mmHg濃縮至約50mL的體積。將濃縮的溶液用200mL丁酮稀釋并再次在30。C/60mmHg濃縮至約50mL。將濃縮物再次用200mL丁酮稀釋并且在30°C/60mmHg濃縮至約100mL的體積。NMR分析顯示不存在THF。將得到的標(biāo)題化合物的丁酮溶液直接用于下一步驟。步驟4:2-溴-3-[5-(2，2-二甲基-丙?；被?-吡嗪-2-基]-3-氧代-丙酸叔丁酯(11)的制備將配備有磁力攪拌器的l-L圓底燒瓶裝入73.00mg(0.841mmol)的溴化鋰和在步驟3中獲得的丁酮溶液(約100mL)，其在理論上含有27.09g(84.30mmol)的3-[5-(2，2-二甲基-丙?；被?-吡嗪-2-基]-3-氧代-丙酸-叔丁酯和約73mL的丁酮。在通過(guò)HPLC仔細(xì)監(jiān)測(cè)反應(yīng)的情況下，向得到的混合物分批加入總量為15.16g(85.17mmol)的N-溴琥珀酰亞胺。在室溫?cái)嚢?h后，HPLC分析顯示反應(yīng)完全。將反應(yīng)混合物在25°C/25mmHg濃縮至約70mL的體積，然后用130mL乙酸乙酯稀釋并且用3x100mL的水洗滌。在35。C/60mmHg濃縮至約90mL的體積后，將得到的懸浮液用200mL庚烷稀釋，并且再濃縮至約90mL的體積。然后，加入200mL的庚烷，并且將懸浮液再次濃縮至約150mL的體積。然后將固體通過(guò)過(guò)濾收集，用2x50mL的庚垸洗滌并且通過(guò)抽吸干燥，得到32.16g的標(biāo)題化合物，為淺黃色固體；由HPLC分析確定的純度為98.7%(HPLC柱ZorbaxXDB-C8,3x100mm,3.5洗脫液20-100%乙腈/水+01.°/。TFA，流速0.5mL/min，歷時(shí)10min，在UV254nm檢測(cè)，停留時(shí)間9.52min)。21步驟5:N-[5-(2-溴-乙酰基)-吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酰胺(IId)的制備將配備有磁力攪拌器和氮?dú)馊肟?出口的500mL圓底燒瓶裝入32.10g(80.19mmol)在步驟4中制備的化合物，90mL的二氯甲烷和56.20mL(756.6mmol)的三氟乙酸，并且將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?0h。HPLC分析顯示反應(yīng)完全。將反應(yīng)混合物在30°C/30mmHg濃縮至約40mL的體積，用200mL甲苯稀釋，并且濃縮至約50mL的體積。將得到的漿液用100mL甲苯稀釋并且再次濃縮至約50mL的體積。在用100mL庚垸稀釋后，通過(guò)過(guò)濾收集固體，并且通過(guò)抽吸干燥，得到23.30g(96.8%收率)的標(biāo)題化合物，為黃色固體；由HPLC分析確定的純度為99.15。/。(條件與步驟4中相同，停留時(shí)間7.76min)。步驟6:乙酸2-[5-(2，2-二甲基丙?；被?-吡嗪-2-基]-2-氧代-乙酯(IIe)的制備將配備有磁力攪拌器，加料漏斗，熱電偶探頭和氮?dú)馊肟?出口的500mL圓底燒瓶裝入4.40mL(76.86mmol)的乙酸，140mL的DMF和7.000g(85.33mmol)的乙酸鈉。然后，在45min內(nèi)滴加23.30g(77.62mmol)在步驟5中獲得的化合物。在室溫再攪拌lh后，HPLC分析顯示反應(yīng)完全。將反應(yīng)混合物用350mL乙酸乙酯稀釋，并且在攪拌下加入100mL飽和碳酸氫鈉。將有機(jī)層分離，用3x100mL水洗滌并且在30°C/60mmHg濃縮至約60mL的體積。將得到的漿液用200mL庚垸稀釋，在30°C/60mmHg濃縮至約150mL的體積，并且在50°C攪拌30min。在冷卻到室溫后，將固體通過(guò)過(guò)濾收集，用40mL在庚烷中的10%乙酸乙酯洗滌，并且通過(guò)抽吸干燥，然后減壓蒸餾(中央清掃系統(tǒng)(housevacuum))24h，得到19.52g(90.0%收率)的標(biāo)題化合物，為灰白色固體；由HPLC分析確定的純度為98.81%(條件與步驟4中相同，停留時(shí)間6.78min)。'H-NMR(DMSO-d6):10.71(s，1H),9.37(d,1H),8.89(d,1H),5.48(s,2H),2.14(s，3H),1.25ppm(s，9H)。實(shí)施例2N-[5-(2-氯-乙?；?-吡嗪-2-基]-2，2-二甲基-丙酰胺(IIf)的制備將配備有機(jī)械攪伴器，加料漏斗，熱電偶探頭和氮?dú)馊肟?出口的3-頸l-L圓底燒瓶裝入在實(shí)施例1，步驟2中制備的24.10g(102mmol)5-(2，2-二甲基-丙酰基氨基)-吡嗪-2-羧酸甲酯(9)，300mL的THF并且加入24.0mL(369mmol)的溴氯甲垸。在使用-90。C庚烷-液氮冷卻浴冷卻到-78。C后，滴加100.0mL(260mmol)的2.6M在己垸中的丁基鋰溶液，同時(shí)將反應(yīng)混合物溫度保持在-77士2。C。然后加入另外15.0mL(231mmol)的溴氯甲烷，接著滴加另外的55.0mL(143mmol)的2.6M在己烷中的丁基鋰，同時(shí)將反應(yīng)混合物溫度保持在-77士2。C。HPLC分析顯示反應(yīng)完全。將冷混合物緩慢倒入300mL(300mmol)的1TV鹽酸中并且攪拌以溫?zé)岬江h(huán)境溫度。將混合物在真空下部分濃縮，并且將沉淀的固體通過(guò)過(guò)濾分離，用水洗滌并且通過(guò)抽吸干燥，得到19.42g的粗制產(chǎn)物，為淺橙色固體，由HPLC分析確定的純度為91.5%。將該粗制產(chǎn)物19.0g在100mL乙酸乙酯中形成漿液，并且用50mL庚烷稀釋得到的懸浮液。然后將固體通過(guò)過(guò)濾收集，用2x50mL的庚垸-乙酸乙酯1:1洗滌并且通過(guò)抽吸干燥，得到13.5g(53%收率)的氯酮，為灰白色固體，由HPLC分析確定的純度〉99M。'H-固R(DMSO-d6):10.71(s,1H),9.35(d,1H)，8.94(d,1H)，5.20(s,2H),1.25ppm(s,9H)。實(shí)施例3發(fā)酵和生物轉(zhuǎn)化將2x500ml含100mL的508S培養(yǎng)基的帶障板的燒瓶用1mL的近平滑假絲酵母R2599冷凍儲(chǔ)液接種，所述508S培養(yǎng)基在每升去離子水中包含葡萄糖20g,酵母提取物10g和大豆胨10g。然后將燒瓶在設(shè)置在220rpm的環(huán)形振蕩器上于27。C溫育72小時(shí)。然后將燒瓶?jī)?nèi)容物儲(chǔ)集到合適的接種燒瓶中，并且接種到含5L的YSD培養(yǎng)基的7.5L發(fā)酵罐中，所述YSD培養(yǎng)基在每升去離子水中包含葡萄糖20g,酵母提取物10g,大豆胨10g和不含氨基酸的含氮酵母堿基6.7g和ShellAseol防沫劑0.3ml。發(fā)酵參數(shù)設(shè)置如下溫度27。C，通過(guò)自動(dòng)調(diào)節(jié)通氣和攪拌速度將溶解氧維持超過(guò)50%,通過(guò)自動(dòng)加入25%w/v氫氧化銨將pH維持在6.5，使用劑量計(jì)以4-5。/。v/v每天的速率進(jìn)料乙醇(100。/c))。在培養(yǎng)20h后，取出1.5L的液體培養(yǎng)基并且開(kāi)始乙醇進(jìn)料。再過(guò)2小時(shí)后，以在875mL水中的懸浮液的形式加入175.5g的乙酸2-[5-(2,2-二甲基丙?；被?-吡嗪-2-基]-2-氧代-乙酯(實(shí)施例1)，得到5%(w/v)的最終濃度。定時(shí)取樣并且用HPLC分析以確定CS)-N-[5-(l,2-二羥基-乙基)-吡嗪-基]-2，2-二甲基-丙酰胺(7)的滴定度(titre)以及該產(chǎn)物的對(duì)映體純度。當(dāng)在68小時(shí)后判斷反應(yīng)完全時(shí)，通過(guò)將液體培養(yǎng)基在原位加熱到70°C30分鐘而將近平滑假絲酵母滅活。表l反應(yīng)時(shí)間二醇R-二醇S-二醇(h)(g/L)(%)(%)11.033.42017.02417.02617.644.527.25132.36830.73.696.4分離將如上獲得的熱滅活的液體培養(yǎng)基用于產(chǎn)物分離。將4.23L液體培養(yǎng)基在實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)上用轉(zhuǎn)位式轉(zhuǎn)子(3500rpm,15min)離心。除去乳色的上清液(3.60L)。將團(tuán)粒再次懸浮在0.8L水中并且離心，得到0.76L混濁的上清液。將統(tǒng)一的水溶液用乙酸乙酯萃取3次(每次9L)。在第一次萃取時(shí)發(fā)生自發(fā)的相分離。在第二次萃取時(shí)獲得乳狀液。通過(guò)混合在250gdicalitespeedplus(AcrosOrganics123380010)中并且真空過(guò)濾混合物(Filtrox濾板AF50/8427)，破壞乳狀液。在第三次萃取時(shí)獲得快速相分離。將獲得的有機(jī)萃取物集中并且在實(shí)驗(yàn)室旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(rotavap)上真空濃縮。將濃縮物與兩勺dicalitespeedplus混合，過(guò)濾并且用乙酸乙酯補(bǔ)成1.00L濃縮物。該濃縮物含114.4g(s)-二醇(7)。24將濃縮物樣品干燥并且顯示以下分析數(shù)據(jù)(HPLC):99.4%的面積純度，由HPLC(柱子SupelcoSilABZ+,4.6x250mm,5(im,洗脫液20-90%乙腈/水+0.1%TFA，流速1mL/min，歷時(shí)10min，在UV300nm檢測(cè)，停留時(shí)間4.26min)測(cè)定；92.0%ee，由手性HPLC(柱子ChiralpakAD-H，洗脫液20%乙醇/80%乙腈，流速1mL/min，40。C,在UV237nm檢測(cè)，停留時(shí)間18.14min(R-二醇)和20.86min(S-二醇))測(cè)定。^-麗R(DMSO-d6):10.15(s,IH)，9.18(s,IH)，8.44(s，1H),5.54(d,IH)，4.72(t,1H),4.63(dd,IH)，3.69(m，IH)，3.53(m,1H),1.25ppm(s，9H)。MS(離子噴霧)m/z240.1(M+H,M為239.1)。實(shí)施例4大規(guī)模多-酶促反應(yīng)將50g的乙酸2-[5-(2,2-二甲基丙?；碧?吡嗪-2-萄-2-氧代-乙酯(178mmol)在150ml叔丁基甲基醚(TBME)中攪拌。隨后，加入反應(yīng)緩沖液，674mL20mM的2-(4-嗎啉基)-乙磺酸，和100.1g的D-葡萄糖(658mmol)。將溫度調(diào)節(jié)到29。C并且將pH調(diào)節(jié)到6.25。反應(yīng)-脫乙酰基化-由2.01g脂酶AH的加入開(kāi)始。緊接著，加入40mg的葡糖脫氫酶GDH102，201mg的酮還原酶KRED101和202mg的輔因子NADP以開(kāi)始不對(duì)稱還原。反應(yīng)溫度升高到37。C。通過(guò)l.ON氫氧化鈉溶液的受控添加(pH-stat)將攪拌著的懸浮液維持在pH6.25(和37。C)。在11.2h后，在總共消耗354.1mL的l.ON氫氧化鈉后，并且在完全轉(zhuǎn)換后，將反應(yīng)混合物再攪拌10.5h。為了萃取產(chǎn)物，將300g氯化鈉加入到反應(yīng)混合物中并且將pH調(diào)節(jié)到7.5。隨后，將反應(yīng)混合物用1L的乙酸乙酯萃取5次。相分離自發(fā)發(fā)生。將合并的有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)并且在HV上干燥過(guò)夜。分離出44.76g(5)-N-[5-(l,2-二羥基-乙基)-吡嗪-基]-2，2-二甲基-丙酰胺(4)(96.4%HPLC純度，[SupelcoSilABZ+，250x4.6mm,洗脫液20-90%乙腈/水+0.1%TFA，歷時(shí)10min，流速1mL/min，在UV300nm檢測(cè)，停留時(shí)間5.3min]，ee〉99.9%[ChiralpakIA，250x4.6mm，5jim，洗脫液50%庚烷50%乙醇/甲醇1:1，歷時(shí)20min，流速1mL/min，在UV240nm檢測(cè)，對(duì)映體停留時(shí)間9.3禾卩10.9min])，為淺橙色、高粘性的油狀物。25乙酸2-「5-(2，2-二甲基丙?；被?-吡嗪-2-基l-2-氧代-乙酯的小規(guī)模還原將2mg的乙酸2-[5-(2,2-二甲基丙?；被?-吡嗪-2-基]-2-氧代-乙酯溶解在20plDMSO中，并且加入到含有20|iL的2-丙醇，1.5mL的100mM2-(4-嗎啉基)-乙磺酸,pH6.0，3mg的NADPH和3mg的酮還原酶(參見(jiàn)表l)的反應(yīng)瓶中。在2h后，將反應(yīng)物用0.5ml乙酸乙酯萃取，并且經(jīng)由手性HPLC分析([ChiralcelOD-H,250x4.6mm，Nr.146，洗脫液65%庚烷20%庚烷+0.1°/。TFA15%異丙醇，40。C，歷時(shí)15min，流速1mL/min，在UV210nm檢測(cè)，對(duì)映體停留時(shí)間6.2和7.2min]，結(jié)果見(jiàn)表2)。表2:形成相應(yīng)的乙酰氧基醇(乙酸2-[5-(2,2-二甲基丙?；被?-吡嗪-2-基]-2-羥基-乙酯)的選擇的分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>實(shí)施例6小規(guī)模多酶促反應(yīng)將1mg乙酸2-[5-(2,2-二甲基丙?；被?-吡嗪-2-基]-2-氧代-乙酯(IIe)溶解在20piDMSO中，并且加入到含有20nL的2-丙醇，1.5mL的100mM磷酸鉀，pH7.2,3mg的NADPH，30(iL的LipozymeCALBL[Novozyme]和2mg的酮還原酶(參見(jiàn)表2)的反應(yīng)瓶中。在16h后，將反應(yīng)物用0.5ml乙酸乙酯萃取，并且經(jīng)由手性HPLC分析(ChiralcdAD-H，Nr.417，洗脫液90%乙醇10%甲醇，40°C，歷時(shí)30min，流速1mL/min，在UV210nm檢測(cè)，對(duì)映體停留時(shí)間9.2和10.2min]，結(jié)果見(jiàn)表3)。表3:形成相應(yīng)(S)-二醇(4)的選擇的分析結(jié)果KRED轉(zhuǎn)化率ee二醇酮還原酶面積％%10197.69910797.3>9911197.999.511297.8>9911397.9>9911497.398A1F97.5>99BID97.4>99B1E97.4>99實(shí)施例7N-「5-(2-氯-乙酰基)-吡嗪-2-基l-2,2-二甲基-丙酰胺(IIf)的酶促還原將l.5g的N-[S-P-氯-乙?；?-吡嗪-l基]-H二甲基-丙酰胺(實(shí)施例2,5.8mmol)放置在配備有pH電極、pH控制的計(jì)量泵和攪拌器的反應(yīng)器中。隨后加入反應(yīng)緩沖液，300mL的lOOmM磷酸鉀緩沖液和3.5g的D-葡萄糖(17.7mmo1)。將溫度調(diào)節(jié)到30。C并且將pH調(diào)節(jié)到6.5。通過(guò)加入25mg的葡糖脫氫酶GDH102,100mg的酮還原酶KRED101和250mg的輔因子NADP，開(kāi)始不對(duì)稱還原。通過(guò)1.0N氫氧化鈉溶液的受控添加(pH陽(yáng)stat)，將pH維持在pH6.5(和30。C)。在46h后，在總共消耗5.79mL的1.0N氫氧化鈉后，將反應(yīng)物通過(guò)過(guò)濾而澄清。隨后，將產(chǎn)物用0.4L的乙酸乙酯萃取。相分離自發(fā)發(fā)生。將有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)并且在HV上干燥過(guò)夜。分離出1.42gOS)-氯醇(97.7%HPLC純度，[SuplecosilAbz+,250*4.6mm,洗脫液35-90%乙腈/水+0.1%TFA,25。C，歷時(shí)10.9min，流速1mL/min，在UV300nm檢測(cè)，停留時(shí)間5.6min]，ee〉99.9%[ChiralcelOD-H，250*4.6mm,洗脫液85%庚烷15%乙醇+0.01M乙酸銨，25。C，歷時(shí)25min，流速0.8mL/min，在UV302nm檢測(cè)，對(duì)映體停留時(shí)間6.6和7.5min])，為淺黃色晶體。'H-NMR(DMSO-d6):10.21(s,1H),9.2(d,1H)，8.50(d,1H),6.10(d,2H),4.94ppm(d/tr,1H),3.92(d/d，2H),1.25ppm(s，9H)。MS(離子噴霧)m/z257.8(M+H，M為257.1)。實(shí)施例82aO-(3-氯-4-甲磺?；?苯基)-3-環(huán)戊基-N-f5-n(S),2-二羥基-乙基V吡嗪-2-基l-丙酰胺(III)的制備步驟1:N-[5-((S)-2,2-二甲基-[1,3]二氧戊環(huán)-4-基)-吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酰胺(12)的制備將N-[5-(l(S),2-二羥基-乙基)-吡嗪-2-基]-2，2-二甲基-丙酰胺(46g，用溶劑稍微濕潤(rùn)，~170mmol)在四氫呋喃(275mL)中的溶液用2,2-二甲氧基丙烷(225mL,1.88mol)和一水合對(duì)甲苯磺酸(3.4g，17.9mmol)處理。將反應(yīng)混合物在25。C攪拌16.5h。薄層色譜顯示反應(yīng)完全，形成極性較小的產(chǎn)物。將反應(yīng)混合物真空濃縮，并且將殘余物溶解在二氯甲垸(600mL)中。將有機(jī)層用飽和氯化鈉水溶液(250mL)和飽和碳酸氫鈉水溶液(250mL)洗滌。每個(gè)水層用二氯甲垸(250mL)反萃取。將合并的有機(jī)層與硫酸鈉(35mg)和NoritACharcoal(8g)—起攪拌，然后通過(guò)C鹽墊過(guò)濾。將濾液真空濃縮至約250g的重量。將該物質(zhì)用乙醚(300mL)處理，并且將混合物再次真空濃縮至約350g的重量，此時(shí)，結(jié)晶開(kāi)始。將混合物在冰箱(4。C)中儲(chǔ)存4h并且過(guò)濾。將固體在真空爐中于30。C干燥16h，得到白色晶體(32.3g，68%),mp144-144.5。C。收集來(lái)自母液的另外的收獲物，得到純度與第一批收獲物相當(dāng)?shù)陌咨w(9.5g，20%)。采用手性柱的高效液相色譜分析顯示，與真實(shí)外消旋物樣品相比，兩批收獲物都是100%ee。將兩批收獲物合并，得到所需的N-[5-((S)-2,2-二甲基-[l,3]二氧戊環(huán)-4-基)-吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酰胺。步驟2:5-((S)-2,2-二甲基-[1,3]二氧戊環(huán)-4-基)-吡嗪-2-基胺(13)的制備將N-[5-((S)-2，2-二甲基-[1,3]二氧戊環(huán)-4-基)-吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酰胺(8.4g，30.7mmol)和碳酸鉀(4.32g，31.2mmol)在甲醇(150mL)中的混合物在25。C攪拌16.5h，此時(shí)，薄層色譜顯示向極性更大的產(chǎn)物的部分轉(zhuǎn)化。為了避免在立體中心處的差向異構(gòu)化，反應(yīng)在完成前是不連續(xù)的。因此，在減壓下于25。C除去溶劑。將得到的殘余物從乙酸乙酯(50mL)再次真空濃縮。使用Biotage色譜(FLASH40L，二氧化硅，乙酸乙酯)純化該物質(zhì)。收集的較早洗脫的部分可用于回收未反應(yīng)的原料新戊?；０罚瑸榘咨腆w(2.0g，24。/。)。將在后洗脫的部分真空濃縮，得到5-((S)-2,2-二甲基-[l,3]二氧戊環(huán)-4-基)-吡嗪-2-基胺(3.7g，63%)，為淡黃色油狀物。采用手性柱的高效液相色譜分析顯示100%ee。步驟3:2(R)-(3-氯-4-甲磺?；?苯基)-3-環(huán)戊基-N-[5-((S)-2,2-二甲基-[l,3]二氧戊環(huán)-4-基)-吡嗪-2-基]-丙酰胺(14)的制備將2(R)-(3-氯-4-甲磺酰基-苯基)-3-環(huán)戊基-丙酸(如實(shí)施例1中制備,6.29g,19.01mmol)和AgV-二甲基甲酰胺(2滴)在二氯甲烷(70mL)中的溶液在2°C攪拌，然后用草酰氯(4.15mL,45.7mmol)處理。將混合物在2。C攪拌5min并且在25。C攪拌15min。然后將反應(yīng)混合物真空濃縮。將殘余物溶解在苯(25mL)中，并且重復(fù)蒸發(fā)。將得到的酰氯溶解在二氯甲烷(40mL)中，冷卻到0。C，然后用由5-((S)-2,2-二甲基-[l,3]二氧戊環(huán)-4-基)-吡嗪-2-基胺(3.65g，18.95mmol),吡啶(4.6mL，56.9mmol)和二氯甲垸(40mL)組成的溶液處理。將混合物在不補(bǔ)充冷卻浴的情況下攪拌16h。然后將反應(yīng)混合物用1N鹽酸水溶液(100mL)處理。分離各層，用二氯甲垸(75mL)萃取水層。將有機(jī)層用飽和碳酸氫鈉水溶液(100mL)和飽和氯化鈉水溶液洗滌。將合并的有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過(guò)濾并且真空濃縮。經(jīng)Biotage色譜(FLASH40L,二氧化硅，1/1乙酸乙酯/己烷)，得到2(RH3-氯-4-甲磺?；?苯基)-3-環(huán)戊基-N-[5-((S)-2,2-二甲基-[1,3]二氧戊環(huán)-4-基)-吡嗪-2-基]-丙酰胺(8.9g,92%)，為白色泡沫(ES)+-HRMSm/e對(duì)于C24H3()C1N305S(M+H)+的計(jì)算值508.1668，實(shí)測(cè)508.1671。步驟4:2(R)-(3-氯-4-甲磺?；?苯基)-3-環(huán)戊基-N-[5-(l(S)，2-二羥基-乙基)-29吡嗪-2-基]-丙酰胺(III)的制備將2(R)-(3-氯-4-甲磺?；?苯基)-3-環(huán)戊基-N-[5-((S)-2,2-二甲基-[1，3]二氧戊環(huán)-4-基)-吡嗪-2-基]-丙酰胺(8.85g，17.4mmol)在四氫呋喃(50mL)中的溶液用1N鹽酸水溶液(50mL)處理。將得到的乳狀反應(yīng)混合物在25。C攪拌，在15min內(nèi)，乳狀反應(yīng)混合物變澄清。在25。C繼續(xù)攪拌16h。將反應(yīng)物真空濃縮，并且用二氯甲烷(1x100mL然后2x50mL)萃取殘余物。每一個(gè)有機(jī)萃取物用飽和碳酸氫鈉水溶液(50mL)和飽和氯化鈉水溶液(50mL)洗滌。將合并的有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過(guò)濾并且真空濃縮。經(jīng)Biotage色譜(FLASH40L，二氧化硅，1/1乙酸乙酯/己烷然后100%乙酸乙酯)，得到2(R)-(3-氯-4-甲磺?；?苯基)-3-環(huán)戊基-N-[5-(1(S),2-二羥基-乙基)-吡嗪-2-基]-丙酰胺(7.15g,88%)，為無(wú)色泡沫(ES)+-HRMSm/e對(duì)于C21H26C1N305S(M+H)+的計(jì)算值468.1355，實(shí)測(cè)468.1360。國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約國(guó)際形式霍夫曼-拉羅奇有限公司瑞士巴塞爾407062/136國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)依照條約第7.1款發(fā)出的在原始保藏情況下的收到在該頁(yè)的底部確認(rèn)I.微生物的鑒定保藏者給出的鑒定號(hào)國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)給出的編號(hào)R2599DSM19155II.具體說(shuō)明和/或建議的分類名稱上述I中鑒定的微生物伴隨有()具體說(shuō)明(x)建議的分類名稱(可用時(shí)用x表示)III.收到和接受本國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)接受于2007-03-09(原始保藏日)！收到的上述I中鑒定的微生物。IV.轉(zhuǎn)化請(qǐng)求的收到本國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)在(原始保藏日)收到上述I中鑒定的微生物，并且在(轉(zhuǎn)化要求的收到日)收到將原始保藏物轉(zhuǎn)化成布達(dá)佩斯條約下的保藏物的請(qǐng)求V.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)名稱德意志微生物保藏中心(DSMZ)具有代表國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)權(quán)力的人或授權(quán)官地址D-38124不倫瑞克員的簽名Inhoffenstr.7B日期2007-03-141適用條約6.4(d)款，該日期是獲得國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)的狀態(tài)的日期。表DSMZ-BP/4(單獨(dú)頁(yè))08/200631國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約國(guó)際形式霍夫曼-拉羅奇有限公司瑞士巴塞爾407062/136國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)依照條約第10.2款發(fā)出的存活證明在該頁(yè)的底部確認(rèn)I.保藏者II.微生物的鑒定名稱霍夫曼-拉羅奇有限公司國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)給出的編號(hào)62/136DSM19155地址瑞士巴塞爾4070保藏或移交日期、2007-03-09III.存活聲明上述II中鑒定的微生物的活性是在2007-03-092測(cè)試的在該日，所述微生物是(x)3存活()3不再存活I(lǐng)V.進(jìn)行存活測(cè)試的條件4V.國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)名稱德意志微生物保藏中心(DSMZ)具有代表國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)權(quán)力的人或授權(quán)官地址D-38124不倫瑞克員的簽名Inhoffenstr.7B日期2007-03-14表示原始保藏的日期，或者進(jìn)行新的保藏或移交的日期，即最近的相關(guān)日期(新保藏的曰期或移交的日期)。在第10.2(a)(ii)和(iii)款所指的情況下，指最近的存活測(cè)試。在可用欄中畫(huà)x在要求填入信息或測(cè)試結(jié)果為陰性時(shí)填入。表DSMZ-BP/9(單獨(dú)頁(yè))08/200權(quán)利要求1.用于制備式I化合物的方法，其中R是低級(jí)烷基羰基或氨基保護(hù)基并且R1是羥基或鹵素，所述方法包括式II的酮的酶促水解和/或酶促不對(duì)稱還原，其中R2是低級(jí)烷基羰基氧基或鹵素。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其特征在于，R'是羥基并且Fe是乙酰氧基。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于，所述酶促水解和所述酶促不對(duì)稱還原是采用近平滑假絲酵母(Ca"^/a，rap^7a^)種的酵母進(jìn)行的。4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于，所述酶促水解是通過(guò)水解酶進(jìn)行的，所述水解酶選自酯酶、蛋白酶和脂酶，并且隨后的酶促不對(duì)稱還原是通過(guò)一種或多種氧化還原酶進(jìn)行的。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于，所述酶促水解是通過(guò)脂酶進(jìn)行的。6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于，所述脂酶從南極假絲酵母(Ca"A<ia,產(chǎn)堿桿菌屬的禾中(爿/ca/z'ge"&s)或洋蔥伯克霍爾德氏菌(5wr狄o/(ien.acep鎖'o)獲得。7.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于，將酮還原酶或醇脫氫酶用作氧化還原酶。8.根據(jù)權(quán)利要求4或權(quán)利要求7的方法，其特征在于，將選自KRED101,KRED107,KRED111,KRED112,KRED113,KRED114,A1F，B1D和B1E中的一種酮還原酶與葡糖脫氫酶GDH102組合用作氧化還原酶。9.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其特征在于，Ri和I^是氯。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于，所述酶促不對(duì)稱還原是通過(guò)一種或多種氧化還原酶進(jìn)行的。11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，將酮還原酶或醇脫氫酶用作氧化還原酶。12.根據(jù)權(quán)利要求l至ll中任何一項(xiàng)的方法，其特征在于，R是低級(jí)烷基羰基。13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任何一項(xiàng)的方法，其特征在于，R是叔丁基羰基。14.式IIc的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中^是低級(jí)烷基羰基氧基或鹵素。15.根據(jù)權(quán)利要求14的式IIc的化合物，其中f是乙酰氧基或鹵素。16.式Ic的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>17.用于制備式m化合物的方法，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>所述方法包括根據(jù)權(quán)利要求1至12所述的方法，接著a)將式Ia的二醇<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中R是低級(jí)垸基羰基或氨基保護(hù)基，與2,2-二甲氧基丙垸反應(yīng)以形成縮醛，并且在堿性條件下將所述胺脫保護(hù)，獲得式IV的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>b)將式IV的胺與式V的羧酸或其活化衍生物縮合，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>獲得所述的酰胺；并且c)在酸性條件下水解所述的縮醛。18.如上所述的新的方法和化合物,全文摘要本發(fā)明涉及用于制備式I的2-氨基-[5-(1-羥基-2-羥基或鹵代-乙基)]-吡嗪衍生物的生物催化的不對(duì)稱還原，式I中，R是低級(jí)烷基羰基或氨基保護(hù)基并且R¹是羥基或鹵素。所述化合物是制備葡糖激酶激活劑的關(guān)鍵中間體。文檔編號(hào)C12P17/10GK101641447SQ200880009751公開(kāi)日2010年2月3日申請(qǐng)日期2008年3月26日優(yōu)先權(quán)日2007年4月4日發(fā)明者史蒂文·保羅·漢隆,恩斯特·庫(kù)普弗,漢斯·艾丁,萍王,舒聯(lián)合,魯姆·尼古拉耶夫·拉迪諾夫申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司