專利名稱：：參與番茄紅素生物合成的基因、含有該基因的重組載體以及帶有重組載體的轉(zhuǎn)化的微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及參與番茄紅素生物合成的基因、含有該基因的重組載體以及帶有重組載體的轉(zhuǎn)化的微生物，更具體來說，涉及番茄紅素生物合成所需的、并具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:3和SEQIDNO:5的DNA序列的基因，含有選自所述基因的至少一個基因的重組載體，以及帶有重組載體的轉(zhuǎn)化的微生物。
背景技術(shù)：
：番茄紅素是類胡蘿卜素色素的一種。類胡蘿卜素是具有抗氧化活性的C40類異戊二烯化合物，屬于一組根據(jù)它們的分子結(jié)構(gòu)而具有黃色、紅色和橙色的色素。例如，類胡蘿卜素包括(3-胡蘿卜素、番茄紅素、葉黃素、蝦青素、玉米黃質(zhì)等，并已經(jīng)被用作營養(yǎng)補(bǔ)充劑、醫(yī)學(xué)補(bǔ)給品、可食用著色劑和動物飼料添加劑。其中，番茄紅素具有式l所代表的分子結(jié)構(gòu)，是脂溶性的物質(zhì)，在番茄、西瓜、葡萄等中形成了紅色色素的分子體，并且具有非常低的極性。與其它類胡蘿卜素相似，番茄紅素具有抗氧化和抗癌活性。血根據(jù)到目前為止已經(jīng)完成的研究，由底特律(美國)的Karmanos癌癥研究中心(KarmanosCancerCenter)的Omer領(lǐng)導(dǎo)的小組在2000年報道了番茄紅素抑制前列腺癌的轉(zhuǎn)移(OmerKucuk等，CancerEpidemiology,10,861-869,2001)。Hasharon醫(yī)院(Hasha訓(xùn)Hospital,以色列，特拉維夫)的過敏科(DepartmentofAllergy)和番茄紅素的制造商LycoRed證實(shí)，番茄紅素在患有運(yùn)動引發(fā)的哮喘的患者中具有緩解哮喘癥狀的效應(yīng)(LNeuman等，Allergy,55,1184-1189)。此外，Kuopio大學(xué)(UniversityofKuopio)的公共衛(wèi)生系(DepartmentofPublicHealth)報道了臨床試驗(yàn)的結(jié)果，番茄紅素對于心肌疾病和動脈粥樣硬化具有出色的保護(hù)作用(TiinaRissanen等，ExpBiolMed(Maywood)"227，900-907,2002)。類胡蘿卜素的體內(nèi)生物合成途徑顯示在圖l中。在活的生物體中，被同化的甘油和葡萄糖，當(dāng)進(jìn)行2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑(MEP途徑)或甲羥戊酸途徑(MVA途徑)時，被代謝成異戊烯基焦磷酸(在本文后面稱為"IPP")或二甲基烯丙基焦磷酸(在本文后面被稱為"DMAPP")，而IPP或DMAPP被代謝成法呢基焦磷酸(在本文后面稱為"FPP")，它在通用類異戊二烯途徑中是進(jìn)入兒種后續(xù)過程的重要中間體。FPP和IPP通過crtE基因編碼的香葉基香葉基焦磷酸合酶被轉(zhuǎn)化成香葉基香葉基焦磷酸(在本文后面稱為"GGPP")。然后，GGPP被crtB基因編碼的八氫番茄紅素合酶轉(zhuǎn)化成八氫番茄紅素，八氫番茄紅素被crtl基因編碼的八氫番茄紅素去飽和酶代謝成番茄紅素。然后，番茄紅素被crtY基因轉(zhuǎn)化成p-胡蘿卜素，|3-胡蘿卜素被crtZ基因編碼的p-胡蘿卜素羥化酶轉(zhuǎn)化成玉米黃質(zhì)，玉米黃質(zhì)被crtW基因編碼的(3-胡蘿卜素酮酶轉(zhuǎn)化成蝦青素。此外，番茄紅素也可以被crtL和crtR基因代謝成葉黃素。如上所述，對于作為類胡蘿卜素共同前體的異戊烯基二磷酸(IPP)的生物合成途徑來說，已經(jīng)知道有甲羥戊酸途徑和非甲羥戊酸途徑。在這種情況下，已知甲羥戊酸途徑存在于大多數(shù)真核生物(例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae))、植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、一些細(xì)菌(例如月市炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)禾口Paracoccuszeaxanthinifaciens)以及癥疾細(xì)胞中。非甲羥戊酸途徑存在于大多數(shù)細(xì)菌(例如大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli))、以及植物細(xì)胞的載色體(質(zhì)體)中。也就是說，革蘭氏陰性(-)細(xì)菌大腸桿菌只使用非甲羥戊酸途徑生物合成IPP。但是，野生型大腸桿菌可能不生產(chǎn)番茄紅素，因?yàn)橐吧痛竽c桿菌不具有參與類胡蘿卜素、包括番茄紅素的生物合成的基因。已經(jīng)進(jìn)行了許多嘗試，通過將不同來源的基因?qū)氩划a(chǎn)生番茄紅素的微生物例如野生型大腸桿菌中，以產(chǎn)生類胡蘿卜素、包括番茄紅素。RocheVitamins,Inc.通過轉(zhuǎn)化來自于黃桿菌(Flavobacteriumsp.)R1534的crtE、crtB和crtl基因，制備了大腸桿菌轉(zhuǎn)化體，其番茄紅素的含量是0.5mg/gDCW(LuisPasamontes等，US20040058410，2004)，AmocoCorporation通過使用來自于草生歐文氏桿菌(Erwiniaherbicola)的crtl基因制備了產(chǎn)番茄紅素的酵母菌株，其含量為O.lmg/g(毫克/克)DCW(RodneyL.Ausich等，US5，530,189，1996)。Misawa等使用源自于歐文氏桿菌物種和橙黃土壤桿菌(Agrobacteriumaurantiacum)的crtE、crtB和crtl基因，制備了產(chǎn)番茄紅素的、含量為1.03mg/g(毫克/克)DCW的大腸桿菌菌株，以及番茄紅素的含量為0.11mg/g(毫克/克)DCW的釀酒酵母菌株(NorihikoMisawa,JournalofBiotechnology,59,169-181,1998)。KirinBeerKabushikiKaisha使用了源自于噬夏孢歐文氏桿菌(Erwiniauredovora)的cr伍、crtB、crtl基因，在微生物中生產(chǎn)了番茄紅素，從而獲得了番茄紅素的含量為2.0mg/g(毫克/克)DCW的大腸桿菌菌株(NorihikoMisawa等，US5,429,939,1995)。但是，正如在上面的研究結(jié)果中描述的，番茄紅素的含量太低，難以開發(fā)出有效的生產(chǎn)工藝。為了解決上述問題，本發(fā)明提供了與已知基因相比能夠產(chǎn)生番茄紅素含量更高的轉(zhuǎn)化體的新基因，含有該新基因的載體，以及帶有載體的轉(zhuǎn)化的微生物。因此，本發(fā)明人嘗試了改進(jìn)番茄紅素的生產(chǎn)率，并發(fā)現(xiàn)，具有較高番茄紅素含量的微生物可以通過從海水的宏基因組文庫中分離參與番茄紅素生物合成的crtE、crtB和crtl基因，克隆crtE、crtB和crtl基因，對基因進(jìn)行測序，將基因?qū)胼d體，而從不產(chǎn)生番茄紅素的微生物來制備，因此，在上述事實(shí)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明得以完成。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)難題本發(fā)明的一個方面，提供了編碼番茄紅素生物合成所需的蛋白的基因。本發(fā)明的另一個方面，提供了含有所述基因的重組載體。本發(fā)明的另一個方面，通過使用所述重組載體提供了番茄紅素含量增加的重組微生物。技術(shù)方案按照本發(fā)明的一個方面，提供了編碼香葉基香葉基焦磷酸合酶、并具有SEQIDNO:1顯示的DNA序列的crtE基因。按照本發(fā)明的另一個方面，提供了編碼八氫番茄紅素合酶、并具有SEQIDNO:3顯示的DNA序列的crtB基因。按照本發(fā)明的另一個方面，提供了編碼八氫番茄紅素去飽和酶、并具有SEQIDNO:5顯示的DNA序列的crtl基因。按照本發(fā)明的另一個方面，提供了含有選自SEQIDNO:l顯示的crtE基因、SEQIDNO:3顯示的crtB基因和SEQIDNO:5顯示的crtl基因中的至少一個基因的重組載體。按照本發(fā)明的另一個方面，提供了帶有重組載體的轉(zhuǎn)化的微生物。有益效果如上所述，在本發(fā)明中，從海水的宏基因組文庫中克隆了編碼番茄紅素生物合成所需的蛋白的三個新的crtE、crtB、crtl基因。此外，證實(shí)了通過運(yùn)用crt基因，可以在不產(chǎn)生番茄紅素的大腸桿菌中生產(chǎn)番茄紅素，并且通過只使用新的crt基因或其與已知crt基因的組合，可以制備出與常規(guī)技術(shù)制備的菌株相比具有更高番茄紅素含量的重組菌株。因此，本發(fā)明的crt基因可用于生產(chǎn)類胡蘿卜素例如番茄紅素，并且對于在微生物中大量生產(chǎn)類胡蘿卜素(包括番茄紅素)也是非常有用的。附圖簡述圖l是番茄紅素的生物合成過程的說明圖。圖2是重組載體pT5-LYC-idi的酶切圖的說明圖。圖3是重組載體pT5-ErEBI的酶切圖的說明圖。圖4是重組載體pT5-ErBI的酶切圖的說明圖。圖5是重組載體pT-EF5的酶切圖的說明圖。圖6是重組載體pT-SF5的酶切圖的說明圖。圖7是重組載體pBF5-crt的酶切圖的說明圖。本發(fā)明的最佳實(shí)施方案后文將參考附圖對本發(fā)明的示例性實(shí)施方案迸行更詳細(xì)的描述。在本發(fā)明中，從海水的宏基因組文庫中克隆了編碼番茄紅素生物合成所需的蛋白的crtE、crtB和crtl基因，構(gòu)建了包含這些基因的重組載體，并用重組載體轉(zhuǎn)化了不產(chǎn)番茄紅素的大腸桿菌菌株。此外，通過對轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株進(jìn)行發(fā)酵，在與常規(guī)研究中制備的菌株相比時，證實(shí)番茄紅素的含量增加，從而完成了本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明，提供了編碼番茄紅素生物合成所需的蛋白、并具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:3和SEQIDNO:5顯示的DNA序列的基因，7這些基因是從海水的宏基因組文庫獲得的。SEQIDNO:1、SEQIDNO:3禾口SEQIDNO:5的DNA序列分別編碼SEQIDNO:2、SEQIDNO:4和SEQIDNO:6顯示的氨基酸(香葉基香葉基焦磷酸合酶、八氫番茄紅素合酶和八氫番茄紅素去飽和酶)。本發(fā)明中提供的基因可以導(dǎo)入到各種不同的宿主細(xì)胞中，有效地用于生產(chǎn)番茄紅素和其它類胡蘿卜素?；蚩梢詥为?dú)或以其組合使用。例如，通過將本發(fā)明的crtl基因?qū)胫缓衏rtE和crtB基因的微生物，所述crtl基因可以用于生產(chǎn)番茄紅素。此外，通過將本發(fā)明的crtE、crtB和crtl基因?qū)肷锖铣深惡}卜素例如蝦青素的微生物，所述crtE、crtB和crtI基因也可用于增加番茄紅素的產(chǎn)量。此外，本發(fā)明還提供了含有番茄紅素生物合成基因的重組載體。本發(fā)明的重組載體是通過將crtE、crtB和crtl基因?qū)氲交A(chǔ)載體中構(gòu)建的。所有可用于克隆和表達(dá)crt基因的載體一般來說都可以用作本發(fā)明的基礎(chǔ)載體，并可以根據(jù)宿主細(xì)胞而變化。在本發(fā)明的實(shí)施例中使用了質(zhì)粒pTrc99A作為基礎(chǔ)載體，并通過將crtE、crtB和crtl基因?qū)氲交A(chǔ)載體中、同時也導(dǎo)入編碼大腸桿菌的IPP異構(gòu)酶的idi基因，制備了重組載體，并命名為"pT5-LYC-idi(圖2)"。此外，通過將本發(fā)明的crt基因與已知的crt基因進(jìn)行組合，制備了重組載體，分別命名為"pT5-ErEBI(圖3)，'、"pT5-ErBI(圖4)，，、"pT-EF5(圖5)"禾口"pT國SF5(圖6)"。除了重組載體之外，任何含有選自本發(fā)明的crtE、crtB和crtl基因中的至少一個基因的重組載體，都包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，本發(fā)明還提供了帶有含有番茄紅素生物合成基因的重組載體的轉(zhuǎn)化菌株。大腸桿菌或酵母可以用作宿主，用含有番茄紅素生物合成基因的重組載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明的實(shí)施例中，使用重組載體pT5-LYC-idi、pT5-ErEBI、pT5-ErBI、pT-EF5和pT-SF5制備了轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。當(dāng)對帶有導(dǎo)入了本發(fā)明基因的重組載體的轉(zhuǎn)化菌株測量其所產(chǎn)生的番茄紅素的量時，在含有源自于海水宏基因組文庫的crtE、crtB和crtl基因組合的大腸桿菌中，番茄紅素的產(chǎn)量是15.3mg/L(毫克/升)，每個細(xì)胞的番茄紅素含量是4.2mg/g(毫克/克)DCW。此外，在含有已知crt基因和本發(fā)明基因的組合的大腸桿菌中，生產(chǎn)番茄紅素的最大產(chǎn)量是22.8mg/L(毫克/升)，每個細(xì)胞的最大含量為5.4mg/g(毫克/克)DCW。如上所述，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目標(biāo)，從海水的宏基因組中獲得了新的crtE、crtB和crtI基因，也獲得了含有基因的重組載體和用重組載體轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌。當(dāng)對獲得的重組大腸桿菌菌株進(jìn)行發(fā)酵時，重組大腸桿菌菌株與現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)菌株相比，每個細(xì)胞具有更高的番茄紅素含量，使得與現(xiàn)有技術(shù)發(fā)明相比，開發(fā)有效的番茄紅素生產(chǎn)工藝成為可能。后文將結(jié)合示例性實(shí)施方案對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述。但是，應(yīng)該理解，本文提出的描述只是優(yōu)選的例子，僅僅是出于說明的目的，不打算對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。實(shí)施方案實(shí)施例實(shí)施例h從海水的宏基因組文庫克隆用于番茄紅素生物合成的新基因(crtE、crtB和crtl)為了獲得番茄紅素生物合成所需的crtE、crtB和crtl基因，從海水中直接獲取基因組DNA(宏基因組)來構(gòu)建宏基因組文庫。在番茄紅素帶有紅色的事實(shí)基礎(chǔ)上，選擇發(fā)紅的克隆，并測序以證實(shí)其身份。首先，通過膜過濾從大量海水收集微生物，從海水獲得宏基因組DNA。因?yàn)榇蠖鄶?shù)微生物的尺寸為0.2到10pm(微米)，因此首先使用蠕動泵將大量海水通過孔徑為10pm(微米)的濾器，主要除去尺寸大于10nm(微米)的各種類型懸浮固體，然后通過孔徑為0.2)im(微米)的濾器，只選擇性回收尺寸為0.2pm(微米)以上的微生物。按照使用CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)的方法(Zhou等，Appl.Environm.Microbiol.62:316-322,1996)，從回收的微生物中進(jìn)行染色體DNA提取。從得到的微生物細(xì)胞制備的宏基因組DNA，使用拷貝控制的Fosmid文庫生產(chǎn)試劑盒(Epicenter)，制備了宏基因組文庫。在這種情況下，制備過程按照制造商的手冊進(jìn)行。宏基因組文庫的構(gòu)建使用Fosmid載體拷貝控制pCClFOS(Epicenter)來進(jìn)行。插入DNA被連接到拷貝控制pCClFOS載體中，然后使用MaxPlaxX包裝提取物(Epicenter),對連接的Fosmid克隆進(jìn)行包裝。在該程序中，獲得了超過10，000個克隆。將獲得的Fosmid克隆在室溫靜置培養(yǎng)48小時以觀察菌落的顏色，從培養(yǎng)的菌落中篩選發(fā)紅的菌落。為了通過PCR方法證實(shí)在這些菌落中是否存在crt基因，從源自于噬夏孢歐文氏桿菌(Erwiniauredovora)、草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)、黃桿菌(Flavobacteriumsp.)菌株ATCC21588、類球紅細(xì)菌(Rhodobactersphaeroides)和橙黃土壤桿菌(Agrobacteriumaurantiacum)的crtl的C-末端區(qū)域(crtlf)和crtB的中間區(qū)域(crtBr)合成了引物對。引物的DNA序列設(shè)計(jì)如下crtlf:5'-GTNGGNGCRGGCACNCAYCC-3'crtBr:5'陽TCGCGRGCRATRTTSGTSARRTG-3'使用從每個發(fā)紅的菌落提取的FosmidDNA作為模板，然后使用合成的引物與模板一起擴(kuò)增crt基因。也就是說，100ng(納克)FosmidDNA作為模板，在94。C變性5分鐘，然后在下述PCR條件下將PCR擴(kuò)增重復(fù)20個循環(huán):94。C，30秒;50-60。C，30秒，和72。C，l分鐘。然后在下述PCR條件下將PCR擴(kuò)增重復(fù)15個循環(huán)94°C，30秒；50°C，30秒，和72°C，l分鐘。結(jié)果，從一個克隆獲得了具有620bp預(yù)期大小的條帶，將其插入到pST-Bluel載體(Novagen)中，并對其DNA序列進(jìn)行分析。根據(jù)DNA序列分析，證實(shí)了克隆到的DNA序列與報道的crtB基因具有同源性。將獲得的crtB基因片段用作探針進(jìn)行southem雜交，由此獲得了包含crtB基因的番茄紅素生物合成的完整基因簇。通過PCR將用作探針的crtB基因片段與DIG染料連接，將模板DNA用每種限制性酶BamHI、Sail和EcoRI進(jìn)行消化，并進(jìn)行southern雜交。首先，將分別用不同的限制性酶消化的DNAs在0.9。/。的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，按照大小分離DNAs的條帶。然后，將DNAs條帶通過毛細(xì)轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(Schleicher&Schudl，德國)。在42°(3下將探針加入到含有50%甲酰胺的儲存溶液中(5XSSC，0.1。/。N-十二烷基肌氨酸，0.02%SDS，5%阻斷試劑，50%甲酰胺)，然后進(jìn)行6小時以上的雜交。按照制造商的手冊(Boehringer-Mannheim，德國)，將尼龍膜與結(jié)合了堿性磷酸酶的抗DIG抗體進(jìn)行反應(yīng)，加入NBT和X-磷酸鹽作為底物以執(zhí)行顏色反應(yīng)。作為southern印跡的結(jié)果，將在EcoRI限制的DNAs中顯示出信號的大約4kb條帶導(dǎo)入到pBluescriptIIKS(+)載體(Stratagene)中，對DNA片段進(jìn)行測序。根據(jù)測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)條帶具有總共3.2kb的包含crtE、crtB和crtl基因的簇。如上所述，crtE、crtB和crtl基因是從海水的宏基因組文庫中克隆的。在這種情況下，crtE、crtB和crtl基因具有與已知基因不同的DNA序列。在crt基因簇的DNA序列的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了下面的引物，并用于PCR反應(yīng)。然后，將包含三個crt基因的大約3.2-kbDNA片段克隆到pBluescriptIIKS(+)載體的Xhol和Xbal限制性位點(diǎn)之間，并命名為"pBF5-crt"。F5crt-F:5'-GTCTCGAGAGGAGGTAATAAATATGATAAGCCCTATATCCACTGCTGAT隱3'F5crt-Rl:5'扁GATTCTAGATCTAAACCCTCACTGCC隱3'實(shí)施例2:制備包含源自海水宏基因組文庫的番茄紅素生物合成基因的重組載體將在實(shí)施例l中克隆的crtE、crtB和crtl基因插入到表達(dá)載體pTrc99A(AmannmE.等，(1998)Gene,69:301-305)中。首先，為了將crtE基因插入到pTrc99A載體中，合成了下面的引物對。f5E-f:ATATCCAC-3'f5E-r:5'-TAGGATCCCTCGAGATGCATTATCATGGGAGCTTCGCTCGGAGC-3'使用在實(shí)施例l中制備的載體pBF5-crt作為模板，使用引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得包含crtE基因的大約0.85kb的DNA片段。使用QiagenPCR純化試劑盒(Qiagen)純化獲得的DNA片段，用限制性酶EcoRI和BamHI消化，并導(dǎo)入到用同樣的限制性酶消化的pTrc99A載體中，命名為pT-f5crtE。接下來，為了將crtB和crtl基因?qū)氲捷d體pT-f5crtE中，合成了下列兩對引物。f5I-f:5'-ATCTCGAGAGGAGGTAATAAATATGCAAACAGTTGTTATTGGTG陽3'f5I國r:5'-CTCCTCTGCAGTTATCATGGCTGCTCCGCAGTCACCAC-3'f5B-f:5'-CCATGATAACTGCAGAGGAGGTAATAAATATGAAGATAGCGCTGGACCGG-3'f5B-r:5'-AGGTCGACGCGGCCGCGAGCTCTTATCGTAAACCCTCACTGCCAAC-3'首先，使用載體pBF5-crt作為模板，使用引物f5I-f和f5I-r進(jìn)行擴(kuò)增，獲得包含crtl基因的大約1.5kb的DNA片段，使用QiagenPCR純化試劑盒純化獲得的DNA片段。然后，使用載體pBF5-crt作為模板，使用引物f5B-f和f5B-r進(jìn)行擴(kuò)增，獲得包含crtB基因的大約0.9kb的DNA片段，使用QiagenPCR純化試劑盒純化獲得的DNA片段。將這樣獲得的兩個DNA片段彼此混合，在PCR反應(yīng)中使用引物f5I-f和f5B-r進(jìn)行擴(kuò)增，獲得含有crtB和crtl基因的大約2.4kb的最終DNA片段。使用QiagenPCR純化試劑盒純化獲得的DNA片段，用限制性酶XhoI和SalI消化，并導(dǎo)入到用同樣的限制性酶消化的載體pT-f5crtE中，命名為pT-f5EBI。然后，為了將編碼大腸桿菌IPP異構(gòu)酶的idi基因?qū)胼d體pT-f5EBI中，合成了下面的引物對idi-f和idi-r。idi-f:5'誦TAAHAHCTCTAATAAATATHCAAAC朋AACACHTCAT-3'idi-r:5'-CGACGCGGCCGCGCTTATTTAAGCTGGGTAAATGC-3'使用引物對，對大腸桿菌MG1655的染色體DNA進(jìn)行PCR，獲得了含有idi基因的大約0.6kb的DNA片段，使用QiagenPCR純化試劑盒純化獲得的DNA片段。將純化的DNA片段用限制性酶SacI和NotI進(jìn)行消化，并導(dǎo)入到用同樣的限制性酶消化的載體pT-f5EBI中，命名為pT5丄YC隱idi(圖2)。實(shí)施例3:在重組大腸桿菌中生產(chǎn)番茄紅素證實(shí)了在用實(shí)施例2中制備的載體pT5-LYC-idi轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株中，番茄紅素的生物合成是否進(jìn)行。首先，用載體pT5-LYC-idi轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655。將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的每個單菌落接種到5mL(毫升)添加有100(ig/ml(微克/毫升)氨節(jié)青霉素和50嗎/ml(微克/毫升)氯霉素的2YT培養(yǎng)基中(16g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物和5g/LNaCl),在37。C振蕩培養(yǎng)8小時。將600W(微升)得到的培養(yǎng)液接種到30ml(毫升)添加有1%甘油和100嗎/ml(微克/毫升)氨節(jié)青霉素的2YT培養(yǎng)基中，在30。C培養(yǎng)48小時。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)完成后，取適當(dāng)量的培養(yǎng)液，通過計(jì)算細(xì)胞干重(gDCW/L)、番茄紅素的產(chǎn)量(mg番茄紅素/L，在后文中稱為mg/L)和含量(mg番茄紅素/gDCW，在后文中稱為mg/gDCW)，來證實(shí)番茄紅素的生產(chǎn)率。首先，為了獲得番茄紅素的細(xì)胞干重，取5mL(毫升)菌株培養(yǎng)液，放入50mL(毫升)離心管中，離心(8,000卬m，IO分鐘)以除去上清液并回收細(xì)胞沉淀。將回收的細(xì)胞沉淀加入到20mL(毫升)無菌蒸餾水中，懸浮，離心以完全除去培養(yǎng)液成分并回收細(xì)胞沉淀。將回收的細(xì)胞沉淀加入到5mL(毫升)無菌蒸餾水中，完全懸浮，然后置于事先已經(jīng)以mg(毫克)為單位稱重過的鋁稱量盤中。在這種情況下，離心管用無菌蒸餾水清洗，清洗液也加入到稱量盤中。將稱量盤在干燥箱中在105。C干燥12小時以上，冷卻，以mg(毫克)為單位測量稱量盤的重量。細(xì)胞干重(gDCW/L)使用下面的方程l計(jì)算。方程l細(xì)胞干重(gDCW/L)={干燥后盤的重量(mg)-盤的重量(mg)}/5為了確定番茄紅素的產(chǎn)量，10(Hd(微升)量的培養(yǎng)液進(jìn)行離心以獲得細(xì)胞沉淀，將每個細(xì)胞沉淀懸浮在400iil(微升)丙酮中，保持在55。C15分鐘。在得到的懸浮液中再加入60(^1(微升)丙酮，通過將懸浮液在55。C保持15分鐘來提取番茄紅素。將得到的提取液以14，000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘以分離上清液。然后，使用分光光度計(jì)在474.5nm(納米)波長處測量得到的分離上清液的吸光度。然后，將測量值代入通過校正曲線獲得的方程，通過計(jì)算稀釋率確定番茄紅素的量。在這種情況下，為了對校正曲線進(jìn)行作圖，購買了標(biāo)準(zhǔn)的番茄紅素(Sigma)，溶解在丙酮中，稀釋成不同的濃度。然后，使用分光光度計(jì)在474.5nm(納米)波長處測量稀釋的標(biāo)準(zhǔn)番茄紅素的吸光度，將獲得的吸光度值用于標(biāo)準(zhǔn)校正曲線的作圖。使用細(xì)胞干重(gDCW/L)和番茄紅素的產(chǎn)量(mg/L)，從下面的方程2計(jì)算番茄紅素的含量(mg/gDCW)。方程2含量(mg/gDCW)=產(chǎn)量(mg/L)/細(xì)胞干重(gDCW/L)從方程確定的產(chǎn)生的番茄紅素的水平列于下面的表l中。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例4:在帶有包含源自于草生歐文氏菌的crtE、crtB和crtl基因的重組載體的轉(zhuǎn)化大腸桿菌中，評估番茄紅素的生產(chǎn)率使用獲得的源自于草生歐文氏菌的crtE、crtB和crtl基因，制備了載體pT5-ErEBI(圖3)，并導(dǎo)入到大腸桿菌中，獲得轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株。然后，按照與實(shí)施例3相同的方式評估轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株的番茄紅素生產(chǎn)率。在培養(yǎng)48小時后，獲得的番茄紅素的生產(chǎn)率列于下面的表2中。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例5:在帶有包含新crtE基因和源自于草生歐文氏菌crtB和crtl基因組合的重組載體的轉(zhuǎn)化大腸桿菌中，評估番茄紅素的生產(chǎn)率通過將在實(shí)施例2中獲得的載體pT5-LYC-id沖的crtB和crtl基因，用相應(yīng)的已知源自于草生歐文氏菌的基因取代，制備了重組載體pT5-ErBI(圖4)。獲得了帶有重組載體pT5-ErBI的轉(zhuǎn)化大腸桿菌，按照與實(shí)施例3中相同的方式評估新crtE基因的生產(chǎn)率。在培養(yǎng)48小時后，獲得的番茄紅素的生產(chǎn)率列于下面的表3中。表3刺細(xì)胞干重(gDCW/L)產(chǎn)率(mg/L)含量(mg/gDCW)4.910.62.2實(shí)施例6:在帶有包含源自于草生歐文氏菌的crtE基因和新crtB和crtl基因組合的重組載體的轉(zhuǎn)化大腸桿菌中，評估番茄紅素的生產(chǎn)率通過將在實(shí)施例2中獲得的載體pT5-LYC-idi中的crtE基因，用相應(yīng)16的源自于草生歐文氏菌的基因取代，制備了重組載體pT-EF5(圖5)。獲得了帶有重組載體pT-EF5的轉(zhuǎn)化大腸桿菌，按照與實(shí)施例3中相同的方式評估了新crtB基因和新crtl基因的生產(chǎn)率。在培養(yǎng)48小時后，獲得的番茄紅素的生產(chǎn)率列于下面的表4中。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實(shí)施例7:在帶有包含源自于集胞藻(Synechocystissp.)PCC6803的crtE基因和新crtB和crtl基因組合的重組載體的轉(zhuǎn)化大腸桿菌中，評估番茄紅素的生產(chǎn)率通過將在實(shí)施例2中獲得的載體pT5-LYC-idi中的crtE基因，用相應(yīng)的源自于集胞藻(Synechocystissp.)PCC6803的基因取代，制備了重組載體pT-SF5(圖6)。獲得了，按照與實(shí)施例3中相同的方式評估帶有重組載體pT-SF5的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的番茄紅素生產(chǎn)率。然后，將獲得的番茄紅素的生產(chǎn)率列于下面的表5中。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>序列名單SEQIDNO:l是源自于海水中宏基因組的crtE基因的DNA序列(867bp)。SEQIDNO:2是由crtE基因編碼的香葉基香葉基焦磷酸合酶的氨基酸序列(288個氨基酸)。SEQIDNO:3是源自于海水中宏基因組的crtB基因的DNA序列(909bp)。SEQIDNO:4是由crtB基因編碼的八氫番茄紅素合酶的氨基酸序列(302個氨基酸)。SEQIDNO:5是源自于海水中宏基因組的crtI基因的DNA序列(1,485bp)。SEQIDNO:6由crtl基因編碼的八氫番茄紅素去飽和酶的氨基酸序列(494個氨基酸)。SEQIDNO:7是集胞藻(Synechocystissp.)PCC6803中的crtE基因的DNA序列。權(quán)利要求1.crtE基因，其編碼香葉基香葉基焦磷酸合酶，并具有SEQIDNO1顯示的DNA序列。2.crtB基因，其編碼八氫番茄紅素合酶，并具有SEQIDNO:3顯示的DNA序列。3.crtl基因，其編碼八氫番茄紅素去飽和酶，并具有SEQIDNO:5顯示的DNA序列。4.重組載體，其含有選自SEQIDNO:l顯示的crtE基因、SEQIDNO:3顯示的crtB基因和SEQIDNO:5顯示的crtl基因中的至少一個基因。5.權(quán)利要求4的重組載體，含有SEQIDNO:l顯示的crtE基因、SEQIDNO:3顯示的crtB基因和SEQIDNO:5顯示的crtl基因。6.權(quán)利要求4的重組載體，含有SEQIDNO:3顯示的ertB基因和SEQIDNO:5顯示的crtl基因，還含有SEQIDNO:7顯示的cr伍基因。7.權(quán)利要求4的重組載體，含有SEQIDNO:3顯示的crtB基因和SEQIDNO:5顯示的crtl基因，還含有源自于草生歐文氏桿菌(Erwiniaherbicola)的crtE基因。8.轉(zhuǎn)化的微生物，其帶有權(quán)利要求4到7任一項(xiàng)中的重組載體。9.權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)化的微生物，包括大腸桿菌。全文摘要本發(fā)明提供了參與番茄紅素的生物合成、并具有SEQIDNO1、SEQIDNO3和SEQIDNO5顯示的編碼番茄紅素生物合成所需的蛋白的DNA序列的基因，含有至少一個所述基因的重組載體，以及用所述重組載體轉(zhuǎn)化的并具有高番茄紅素含量的微生物。當(dāng)培養(yǎng)具有crt基因的重組大腸桿菌時，獲得的番茄紅素的產(chǎn)量為15.3mg/L，含量為4.2mg/gDCW，當(dāng)用本發(fā)明的基因與已知基因的組合轉(zhuǎn)化微生物時，也獲得了番茄紅素的最大含量5.4mg/gDCW。因此，提供了與已知帶有所述基因的番茄紅素產(chǎn)生菌株相比，單位細(xì)胞干重的番茄紅素含量更高的番茄紅素產(chǎn)生菌株。因此，所述基因可用于在微生物中大量生產(chǎn)番茄紅素，也可用于大量生產(chǎn)類胡蘿卜素。文檔編號C12N15/52GK101675166SQ200880011400公開日2010年3月17日申請日期2008年4月7日優(yōu)先權(quán)日2007年4月5日發(fā)明者樸民守,李東炫,趙南侖,鄭皓丞,金鐘根申請人:Sk能源株式會社;阿美克生物科技株式公司