專利名稱：免疫相關基因的多態(tài)性的檢測用探針及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于檢測免疫相關基因的多態(tài)性的探針及其用途。

背景技術：
作為在基因水平上分析所有疾病的原因、個體間的疾病易患病性(患病的容易程度)、個體間的藥效的差異等的方法，點突變，即所謂的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測被廣泛進行。
作為多態(tài)性的一般的檢測方法，可以例舉(1)對于試樣的目標DNA，通過PCR(Polymerase Chain Reaction)擴增檢測目標區(qū)域，分析其擴增產(chǎn)物的全序列的直接測序法，(2)與前述(1)同樣進行PCR，對擴增產(chǎn)物進行限制性酶處理，通過DNA雜交(southern hybridization)對由于限制性片段長度多態(tài)性導致的變化進行分型的PCR-RFLP(限制性片段長度多態(tài)性，Restriction Fragment Length Polymorphism)法等。
然而，前述(1)的方法例如需要在PCR之后進行測序，再通過測序儀進行電泳等。因此，檢測時極費時間和勞動力。而且，由于在PCR后需要處理所獲得的擴增產(chǎn)物，在該處理時存在產(chǎn)生污染的危險。前述(2)的方法中，也需要在PCR后，對獲得的擴增產(chǎn)物用各種限制性酶進行處理，并進行分析，也耗費時間和精力。而且，對獲得的擴增產(chǎn)物的限制性酶處理，需要臨時取出擴增產(chǎn)物再進行。因此，存在著第1次反應中獲得的擴增產(chǎn)物飛散，并混入到第2次的其它反應中的危險。由于這樣的問題，前述(1)和(2)的方法中，存在著難以實現(xiàn)點突變檢測自動化的問題。
由于這些問題，近年來，作為SNP的檢測方法，Tm(解鏈溫度，Melting Temperature)分析受到關注。其首先使用與含有檢測目標的SNP的區(qū)域互補的探針，使待測核酸和前述探針形成雜交體(雙鏈核酸)。并且，對雜交產(chǎn)物實施加熱處理，通過吸光度等信號測定檢測伴隨溫度上升的雜交體向單鏈核酸的解離(熔解)。該方法為基于該檢測結果來確定Tm值并判斷SNP的方法。Tm值隨雜交產(chǎn)物的同源性越高而越高，同源性越低而越低。因此，在檢測對象位點的多態(tài)性為X或Y時，對于含有目標多態(tài)性(例如Y)的核酸和與其100％互補的探針形成的雜交產(chǎn)物，預先求出其Tm值(評價基準值)。接著，測定待測核酸和前述探針的Tm值(測定值)。并且，如果該測定值與前述評價基準值相同，則待測核酸與探針為完全匹配，即，可以判斷待測核酸的檢測對象位點為目標多態(tài)性(Y)。另一方面，如果前述測定值比前述評價基準值低，則待測核酸與探針錯配，即，可以判斷待測核酸的檢測對象位點為其它的多態(tài)性(X)。如果為這種方法，例如，只對添加了前述探針的PCR反應液實施溫度處理，進行信號測定，就可以檢測SNP，因此也能實現(xiàn)檢測裝置的自動化。
然而，采用這種Tm分析的檢測方法存在以下問題?；虻亩鄳B(tài)性中一般存在純合體(例如，X/X或Y/Y)和雜合體(例如，X/Y)。多態(tài)性的檢測中，為純合體(X/X或Y/Y)，或為雜合體(X/Y)，以及為純合體時為X/X的純合體和Y/Y的純合體中的哪一個，上述判斷很重要。但是，為雜合體時，含有多態(tài)性為X的基因和多態(tài)性為Y的基因，二者的差異只不過是點突變即一個堿基的差異。這樣的話，會發(fā)生這樣的現(xiàn)象，即，與含有一種多態(tài)性(例如，Y)的序列完全雜交(完全匹配)的探針進而也會與含有其它多態(tài)性(X)的序列雜交(1個堿基的錯配)。這種情況下，一旦通過Tm分析制成顯示信號強度與溫度之間的關系的熔解曲線，則存在著由于顯示完全匹配序列的高溫側(cè)的峰的存在，而難以檢測顯示錯配序列的低溫側(cè)的峰的問題。也就是說，即使在試樣中存在錯配序列的情況下，由于存在完全匹配序列，其判斷有可能變得困難，檢測靈敏度有可能降低。而且，即使就純合體來說，在多態(tài)性X的純合體(X/X)和多態(tài)性Y的純合體(Y/Y)中，仍舊只是一個堿基序列的差異。因此，如前所述，如果難以判斷完全匹配的峰和錯配的峰，其結果為，難以判斷是顯示前者(X/X)的峰，還是顯示后者(Y/Y)的峰。也就是說，即使可以判斷是純合體，但也存在難以確定多態(tài)性種類的情況。
近年來，利用人所具有的免疫機能的抗體藥物在醫(yī)藥領域備受關注。作為前述抗體藥物，可以例舉例如，惡性淋巴瘤治療藥Rituxan(商品名；一般名Rituximab)，乳腺癌的治療藥Herceptin(商品名；一般名Trastuzumab)等。然而，人的免疫力存在個人差異，人們認為這對前述抗體藥物的藥效有影響。而且，有報道指出基因的變異(例如，SNP)是影響藥效的因子。具體而言，報道了與免疫相關的基因FCGR3A基因(非專利文獻1)的多態(tài)性。該基因編碼IgG的片段C受體(FcRs)中的1種即FcγRIIIa。因此，在治療中使用前述抗體藥物時，例如，檢測這種基因的多態(tài)性(SNP)，考慮其結果，再確定抗體藥物的給藥量和治療藥的變更等治療方針被認為是有幫助的。
非專利文獻1Buillaume Cartron et al.BLOOD，1FEBRUARY 2002，第99卷，第3期

發(fā)明內(nèi)容
由于這樣的理由，F(xiàn)CGR3A基因的多態(tài)性的檢測例如在使用抗體藥物的治療中非常重要。而且，前述的問題，不僅對于FCGR3A基因，而且對于其它免疫相關基因，例如FCGR2A基因，IL-10基因，TNFα基因和TNFβ基因也可同樣考慮。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種多態(tài)性檢測方法，其能簡便且高可信性地對免疫相關基因的只有一個堿基不同的多態(tài)性進行判斷。
為了實現(xiàn)前述目的，本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針的特征在于，由選自于下述(A)～(H)構成的組中的至少一個寡核苷酸構成 (A)與以序列號1中第193位的鳥嘌呤為第一位堿基，向3’方向直到第13～21位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述鳥嘌呤互補的胞嘧啶為3’末端 (B)與以序列號2中第191位的鳥嘌呤為第一位堿基，向3’方向直到第15～24位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述鳥嘌呤互補的胞嘧啶為3’末端 (C)與以序列號3中第311位的鳥嘌呤為第一位堿基，向5’方向直到第16～21位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述鳥嘌呤互補的胞嘧啶為5’末端 (D)與以序列號4中第391位的鳥嘌呤為第一位堿基，向3’方向直到第16～22位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述鳥嘌呤互補的胞嘧啶為3’末端 (E)與以序列號5中第426位的鳥嘌呤為第一位堿基，向5’方向直到第15～24位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述鳥嘌呤互補的胞嘧啶為5’末端 (F)與以序列號6中第165位的胞嘧啶為第一位堿基，向3’方向直到第16～27位堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以前述胞嘧啶為5’末端 (G)與以序列號7中第394位的鳥嘌呤為第一位堿基，向3’方向直到第12～16位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述鳥嘌呤互補的胞嘧啶為3’末端 (H)與以序列號300中第393位的鳥嘌呤作為第一位堿基，向3’方向直到第15～22位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述鳥嘌呤互補的胞嘧啶為3’末端 本發(fā)明的多態(tài)性檢測用試劑，其特征在于，其為一種用于檢測免疫相關基因的多態(tài)性的試劑，含有本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針。
本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法，其特征在于，其是一種免疫相關基因的多態(tài)性的檢測方法，含有下述(1)～(3)工序 (1)準備反應體系的工序，所述反應體系含有檢測前述多態(tài)性的待測核酸和本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針 (2)改變前述反應體系的溫度，測定顯示前述待測核酸和前述探針的雜交產(chǎn)物的熔解狀態(tài)的信號值的工序 (3)根據(jù)伴隨溫度變化的前述信號值的變動，決定前述待測核酸中的前述多態(tài)性的工序。
通過本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針，利用Tm分析，可以簡便且高可信度地判斷免疫相關基因FCGR3A基因、FCGR2A基因、IL-10基因、TNFα基因和TNFβ基因的后述規(guī)定的多態(tài)性。具體而言，即使免疫相關基因的多態(tài)性是雜合體(X/Y)，也可以判斷并檢測多態(tài)性X和多態(tài)性Y。而且，即使免疫相關基因的多態(tài)性是純合體(X/X或Y/Y)時，也可以判斷是X/X還是Y/Y。如前所述，在通過Tm分析進行的雜合體(X/Y)的檢測中，如前所述，以往的探針中，由于前述探針與含有一個多態(tài)性(X)的序列和含有只有1個堿基不同的其它多態(tài)性(Y)的序列這兩者雜交，因此前述熔解曲線中二者的信號峰重疊，難以判斷多態(tài)性。與之相對，通過本發(fā)明的探針，盡管與這兩個序列雜交，但在前述熔解曲線中能充分分離二者的信號峰。因此，根據(jù)本發(fā)明，能簡便地判斷并檢測只有一個堿基不同的多態(tài)性。而且，根據(jù)本發(fā)明，例如，在同一反應體系中添加兩種以上的探針，也能在前述同一反應體系中判斷各探針所對應的免疫相關基因的多態(tài)性。因此，例如，對于一個待測試樣，使用一個反應體系，能檢測多個多態(tài)性。這樣一來，根據(jù)本發(fā)明能容易地且可信度高地判斷免疫相關基因的多態(tài)性，因此例如，檢測結果也可以反映到通過前述抗體藥物的給藥而進行的治療上。因此，本發(fā)明可以說在醫(yī)療領域等中極為有用。



圖1是表示本發(fā)明的實施例1中的Tm分析結果的圖。
圖2是表示本發(fā)明的實施例2中的Tm分析結果的圖。
圖3是表示本發(fā)明的實施例3中的Tm分析結果的圖。

具體實施例方式 本發(fā)明中，以下，將發(fā)生檢測目標的多態(tài)性的位點稱為“檢測對象位點”，將探針可以雜交的序列，即含有前述檢測對象位點的前述序列稱為“檢測對象序列”。前述檢測對象序列中，將與探針完全匹配的檢測對象序列稱為“完全匹配序列”，將與探針錯配的檢測對象序列稱為“錯配序列”。在本發(fā)明中，所謂完全匹配是指前述檢測對象位點的堿基與前述探針中的對應堿基互補，優(yōu)選是指前述檢測對象序列和前述探針完全互補。本發(fā)明中，所謂錯配是指前述檢測對象位點的堿基與前述探針中的對應堿基非互補，優(yōu)選是指前述檢測對象位點與前述探針在前述檢測對象位點以外完全互補。而且，將具有完全匹配序列的核酸、DNA或基因稱為“完全匹配核酸、完全匹配DNA或完全匹配基因”，將具有錯配序列的核酸、DNA或基因稱為“錯配核酸、錯配DNA或錯配基因”。而且，將進行多態(tài)性檢測的核酸、DNA或基因稱為“待測核酸、待測DNA或待測基因”。
<探針> 如前所述，本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針，其特征在于，其是用于檢測免疫相關基因的多態(tài)性的探針，由選自于下述(A)～(H)構成的組中的至少一個寡核苷酸構成。而且，如后所述，本發(fā)明的多態(tài)性檢測探針例如除以下的各種寡核苷酸以外，還可以具有例如標記物質(zhì)等。
FCGR3A探針 由下述(A)的寡核苷酸構成的探針是用于檢測免疫相關基因FCGR3A基因的多態(tài)性的探針。以下，將該探針稱為“FCGR3A探針” (A)與以序列號1中第193位的鳥嘌呤(g)為第一位堿基，向3’方向直到第13～21位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述鳥嘌呤互補的胞嘧啶(c)為3’末端。
本發(fā)明的FCGR3A探針是用于檢測序列號1所示的FCGR3A基因的部分序列中的第201位堿基(k)的多態(tài)性(g/t；祖先型等位基因(ancestral allele)“g”)的探針。該多態(tài)性，例如，以登錄號No.rs396991登錄于NCBI。在本發(fā)明中，以下將該多態(tài)性稱為“FCGR3A多態(tài)性”。
本發(fā)明的FCGR3A探針與FCGR3A基因的有義鏈(正向鏈)互補，通過與有義鏈的雜交，能檢測有義鏈中的多態(tài)性。前述寡核苷酸(A)中，與序列號1的第201位堿基(k)對應的互補堿基用m表示，前述m是腺嘌呤或胞嘧啶。m為腺嘌呤時，探針與多態(tài)性(t)完全匹配，m為胞嘧啶時，探針與多態(tài)性(g)完全匹配。因此，根據(jù)是否完全匹配，能檢測FCGR3A多態(tài)性。m優(yōu)選為腺嘌呤。
FCGR3A探針的具體例子示于下表。序列號8～16表示的探針由與含有序列號1中的第201位(k)的區(qū)域互補的序列構成，堿基m為與序列號1中的第201位堿基(k)對應的互補堿基。以下所示的各序列中，堿基m可以是腺嘌呤(a)和胞嘧啶(c)中的任意一種，優(yōu)選為腺嘌呤(a)。下表中“Tm(℃)”是下表的序列和與其完全互補的序列雜交時的Tm(℃)，通過MELTCALC軟件(http://www.meltcalc.com/)，將參數(shù)設為寡核苷酸濃度0.2μM、鈉當量(Na eq.)50mM而計算出的值(以下，同樣)。前述Tm值，例如，可以通過前述MELTCALC軟件(http://www.meltcalc.com/)等計算，另外也可以通過毗鄰法(Nearest Neighbor Method)確定。下述探針中，優(yōu)選由序列號14的堿基序列構成的寡核苷酸(A1)。
[表1]
另外，本發(fā)明的FCGR3A探針也可以是由與前述(A)的寡核苷酸互補的寡核苷酸(A’)構成的探針。這樣，通過與反義鏈(相反鏈)的雜交，能夠檢測反義鏈中的多態(tài)性。
FCGR2A探針 由下述(B)的寡核苷酸構成的探針是用于檢測免疫相關基因FCGR2A基因的多態(tài)性的探針。以下，將該探針稱為“FCGR2A探針”。
(B)與以序列號2中第191位的鳥嘌呤(g)為第一位堿基，向3’方向直到第15～24位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述鳥嘌呤互補的胞嘧啶(c)為3’末端 本發(fā)明的FCGR2A探針是用于檢測序列號2所示的FCGR2A基因的部分序列中第201位的堿基(y)的多態(tài)性(t/c；祖先型等位基因“t”)的探針。該多態(tài)性，例如，以登錄號No.rs1801274登錄于NCBI。以下，將該多態(tài)性稱為“FCGR2A多態(tài)性”。
本發(fā)明的FCGR2A探針與FCGR2A基因的有義鏈(正向鏈)互補，通過與有義鏈的雜交，能檢測有義鏈中的多態(tài)性。前述寡核苷酸(B)中，與序列號2的第201位堿基(y)對應的互補堿基用r表示，前述r為腺嘌呤或鳥嘌呤。r為鳥嘌呤時，探針與多態(tài)性(c)完全匹配，r為腺嘌呤時，探針與多態(tài)性(t)完全匹配。因此，根據(jù)是否完全匹配，能檢測FCGR2A多態(tài)性。r優(yōu)選為腺嘌呤。
FCGR2A探針的具體例子示于下表。序列號17～26表示的探針由與含有序列號2中的第201位(y)的區(qū)域互補的序列構成，堿基r為與序列號2中的第201位堿基(y)對應的互補堿基。以下所示的各序列中，堿基r可以是腺嘌呤(a)和鳥嘌呤(g)中的任意一種，優(yōu)選為腺嘌呤(a)。下述探針中，優(yōu)選由序列號23的堿基序列構成的寡核苷酸(B1)。
[表2]
另外，本發(fā)明的FCGR2A探針也可以是由與前述(B)的寡核苷酸互補的寡核苷酸(B’)構成的探針。這樣，通過與反義鏈(相反鏈)的雜交，能檢測反義鏈中的多態(tài)性。
IL-10(-592)探針 由下述(C)的寡核苷酸構成的探針是用于檢測免疫相關基因IL-10基因的第592位的位點的多態(tài)性的探針。以下，將該探針稱為“IL-10(-592)探針”。
(C)與以序列號3中第311位的鳥嘌呤(G)為第一位堿基，向5’方向直到第16～21位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述鳥嘌呤互補的胞嘧啶(C)為5’末端。
本發(fā)明的IL-10(-592)探針是用于檢測序列號3所示的IL-10基因的部分序列中第301位的堿基(m)的多態(tài)性(a/c；祖先型等位基因“c”)的探針。該多態(tài)性，例如，以登錄號No.rs1800872登錄于NCBI。以下，將該多態(tài)性稱為“IL-10(-592)多態(tài)性”。
本發(fā)明的IL-10(-592)探針與IL-10基因的有義鏈互補，通過與有義鏈的雜交，能檢測有義鏈中的多態(tài)性。前述寡核苷酸(C)中，與序列號3的第301位堿基(m)對應的互補堿基用k表示，前述k為胸腺嘧啶或鳥嘌呤。k為胸腺嘧啶時，探針與多態(tài)性(a)完全匹配，k為鳥嘌呤時，探針與多態(tài)性(c)完全匹配。因此，根據(jù)是否完全匹配，能檢測IL-10(-592)多態(tài)性。k優(yōu)選為胸腺嘧啶。
本發(fā)明的IL-10(-592)探針的具體例子示于下表。序列號27～32表示的探針由與含有序列號3中的第301位(m)的區(qū)域互補的序列構成，堿基k為與序列號3中的第301位堿基(m)對應的互補堿基。以下所示的各序列中，堿基k可以是胸腺嘧啶(t)和鳥嘌呤(g)中的任意一種，優(yōu)選為胸腺嘧啶(t)。下述探針中，優(yōu)選由序列號30的堿基序列構成的寡核苷酸(C1)。
[表3]
另外，本發(fā)明的IL-10(-592)探針也可以是由與前述(C)的寡核苷酸互補的寡核苷酸(C’)構成的探針。這樣，通過與反義鏈的雜交，能檢測反義鏈中的多態(tài)性。
IL-10(-819)探針 由下述(D)的寡核苷酸構成的探針是用于檢測免疫相關基因IL-10基因的第819位的位點的多態(tài)性的探針。以下，將該探針稱為“IL-10(-819)探針”。
(D)與以序列號4中第391位的鳥嘌呤(G)為第一位堿基，向3’方向直到第16～22位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述鳥嘌呤互補的胞嘧啶(C)為3’末端。
本發(fā)明的IL-10(-819)探針是用于檢測序列號4所示的IL-10基因的部分序列中第401位的堿基(y)的多態(tài)性(c/t；祖先型等位基因“c”)的探針。該多態(tài)性，例如，以登錄號No.rs1800871登錄于NCBI。以下，將該多態(tài)性稱為“IL-10(-819)多態(tài)性”。
本發(fā)明的IL-10(-819)探針與IL-10基因的有義鏈互補，通過與有義鏈的雜交，能檢測有義鏈中的多態(tài)性。前述寡核苷酸(D)中，與序列號4的第401位堿基(y)對應的互補堿基用r表示，前述r為鳥嘌呤或腺嘌呤。r為鳥嘌呤時，探針與多態(tài)性(c)完全匹配，r為腺嘌呤時，探針與多態(tài)性(t)完全匹配。因此，根據(jù)是否完全匹配，能檢測多態(tài)性。r優(yōu)選為鳥嘌呤。
本發(fā)明的IL-10(-819)探針的具體例子示于下表。序列號33～39所示探針由與含有序列號4中的第401位(y)的區(qū)域互補的序列構成，前述r是對應于序列號4中第401位的堿基(y)的互補堿基。以下所示的各序列中，堿基r可以是鳥嘌呤(g)和腺嘌呤(a)中的任意一種，優(yōu)選為鳥嘌呤(g)。下述探針中，優(yōu)選由序列號36的堿基序列構成的寡核苷酸(D1)。
[表4]
而且，本發(fā)明的IL-10(-819)探針也可以是由與前述(D)的寡核苷酸互補的寡核苷酸(D’)構成的探針。這樣，通過與反義鏈的雜交，能檢測反義鏈中的多態(tài)性。
IL-10(-1082)探針 由下述(E)的寡核苷酸構成的探針是用于檢測免疫相關基因IL-10基因的第1082位的位點的多態(tài)性的探針。以下，將該探針稱為“IL-10(-1082)探針”。
(E)與以序列號5中第426位的鳥嘌呤(G)為第一位堿基，向5’方向直到第15～24位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述鳥嘌呤互補的胞嘧啶(C)為5’末端。
本發(fā)明的IL-10(-1082)探針是用于檢測序列號5所示的IL-10基因的部分序列中第414位的堿基(r)的多態(tài)性(a/g；祖先型等位基因“a”)的探針。該多態(tài)性，例如，以登錄號No.rs1800896登錄于NCBI。以下，將該多態(tài)性稱為“IL-10(-1082)多態(tài)性”。
本發(fā)明的IL-10(-1082)探針與IL-10基因的有義鏈互補，通過與有義鏈的雜交，能檢測有義鏈中的多態(tài)性。前述寡核苷酸(E)中，與序列號5的第414位的堿基(r)互補的堿基用y表示，前述y為胸腺嘧啶或胞嘧啶。y為胸腺嘧啶時，探針與多態(tài)性(a)完全匹配，y為胞嘧啶時，探針與多態(tài)性(g)完全匹配。因此，根據(jù)是否完全匹配，能檢測多態(tài)性。y優(yōu)選為胞嘧啶。
本發(fā)明的IL-10(-1082)探針的具體例子示于下表。序列號40～49所示的探針由與含有序列號5中的第414位(r)的區(qū)域互補的序列構成，堿基y是與序列號5中的第414位的堿基(r)互補的堿基。以下所示的各序列中，堿基y可以是胸腺嘧啶(t)和胞嘧啶(c)中的任意一種，優(yōu)選為胞嘧啶(c)。下述探針中，優(yōu)選為由序列號47的堿基序列構成的寡核苷酸(E1)。
[表5]
另外，本發(fā)明的IL-10(-1082)探針也可以是由與前述(E)的寡核苷酸互補的寡核苷酸(E’)構成的探針。這樣，通過與反義鏈的雜交，能檢測反義鏈中的多態(tài)性。
IL-10(-3575)探針 由下述(F)的寡核苷酸構成的探針是用于檢測免疫相關基因IL-10基因的第3575位的位點的多態(tài)性的探針。以下，將該探針稱為“IL-10(-3575)探針”。
(F)與以序列號6中第165位的胞嘧啶(C)為第一位堿基，向3’方向直到第16～27位堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以前述胞嘧啶(C)為5’末端 本發(fā)明的IL-10(-3575)探針是用于檢測序列號6所示的IL-10基因的部分序列中第179位的堿基(w)的多態(tài)性(a/t；祖先型等位基因“t”)的探針。該多態(tài)性，例如，以登錄號No.rs1800890登錄于NCBI。以下，將該多態(tài)性稱為“IL-10(-3575)多態(tài)性”。
本發(fā)明的IL-10(-3575)探針與IL-10基因的反義鏈互補，通過與反義鏈的雜交，能檢測反義鏈中的多態(tài)性。前述寡核苷酸(F)中，與序列號6中第179位的堿基(w)對應的堿基用w表示，前述w是胸腺嘧啶或腺嘌呤。w為胸腺嘧啶時，探針與反義鏈的多態(tài)性(a)完全匹配，w為腺嘌呤時，探針與反義鏈的多態(tài)性(t)完全匹配。因此，根據(jù)是否完全匹配，能檢測多態(tài)性。w優(yōu)選為胸腺嘧啶。
本發(fā)明的IL-10(-3575)探針的具體例子示于下表。序列號50～61所示的探針由與含有序列號6中的第179位(w)的區(qū)域相同的序列構成，堿基w是與序列號6中的第179位的堿基(w)對應的堿基。以下所示的序列中，堿基w是胸腺嘧啶(t)和腺嘌呤(a)中的任意一種，優(yōu)選為胸腺嘧啶(t)。下述探針中優(yōu)選由序列號57的堿基序列構成的寡核苷酸(F1)。
[表6]
另外，本發(fā)明的IL-10(-3575)探針也可以是由與前述(F)的寡核苷酸互補的寡核苷酸(F’)構成的探針。這樣，通過與有義鏈的雜交，能檢測有義鏈中的多態(tài)性。
TNFα(-308)探針 由下述(G)的寡核苷酸構成的探針是用于檢測免疫相關基因TNFα基因的多態(tài)性的探針。以下，將該探針稱為“TNFα(-308)探針或TNFα探針”。
(G)與以序列號7中的第394位的鳥嘌呤(G)為第一位堿基，向3’方向直到第12～16位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述鳥嘌呤互補的胞嘧啶(C)為3’末端。
本發(fā)明的TNFα探針是用于檢測序列號7所示的TNFα基因的部分序列中第401位的堿基(r)的多態(tài)性(a/g；祖先型等位基因“g”)的探針。該多態(tài)性，例如，以登錄號No.rs1800629登錄于NCBI。以下，將該多態(tài)性稱為“TNFα(-308)多態(tài)性或TNFα多態(tài)性”。
本發(fā)明的TNFα探針與TNFα基因的有義鏈互補，通過與有義鏈的雜交，能檢測有義鏈中的多態(tài)性。前述寡核苷酸(G)中，與序列號7的第401位的堿基(r)互補的堿基用y表示，前述y為胸腺嘧啶或胞嘧啶。y為胸腺嘧啶時，探針與多態(tài)性(a)完全匹配，y為胞嘧啶時，探針與多態(tài)性(g)完全匹配。因此，根據(jù)是否完全匹配，能檢測多態(tài)性。y優(yōu)選為胞嘧啶。
本發(fā)明的TNFα探針的具體例子示于下表。序列號62～66所示的探針由與含有序列號7中的第401位(r)的區(qū)域互補的序列構成，堿基y是與序列號7中的第401位的堿基(r)互補的堿基。以下所示的各序列中，堿基y可以是胸腺嘧啶(t)和胞嘧啶(c)中的任意一種，優(yōu)選為胞嘧啶(c)。下述探針中，優(yōu)選為由序列號64的堿基序列構成的寡核苷酸(G1)。
[表7]
另外，本發(fā)明的TNFα探針可以是由與前述(G)的寡核苷酸互補的寡核苷酸(G’)構成的探針。這樣，通過與反義鏈的雜交，能檢測反義鏈中的多態(tài)性。
TNFβ探針 由下述(H)的寡核苷酸構成的探針是用于檢測免疫相關基因TNFβ基因的多態(tài)性的探針。以下，將該探針稱為“TNFβ(+252)探針或TNFβ探針”。
(H)與以序列號300中第393位的鳥嘌呤(G)作為第一位堿基，向3’方向直到第15～22位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述鳥嘌呤互補的胞嘧啶(C)為3’末端。
本發(fā)明的TNFβ探針是用于檢測序列號300所示的TNFβ基因的部分序列中第401位的堿基(y)的多態(tài)性(t/c)的探針。該多態(tài)性，例如，以登錄號No.rs909253登錄于NCBI。以下，將該多態(tài)性稱為“TNFβ(+252)多態(tài)性或TNFβ多態(tài)性”。
本發(fā)明的TNFβ探針與TNFβ基因的有義鏈互補，通過與有義鏈的雜交，能檢測有義鏈的多態(tài)性。前述寡核苷酸(H)中，與序列號300的第401位的堿基(y)對應的互補堿基用r表示，前述r是腺嘌呤或鳥嘌呤。r為鳥嘌呤時，探針與多態(tài)性(c)完全匹配，r為腺嘌呤時，探針與多態(tài)性(t)完全匹配。因此，根據(jù)是否完全匹配，能檢測多態(tài)性。r優(yōu)選為鳥嘌呤。
TNFβ探針的具體例子示于下表。序列號301～308表示的探針由與含有序列號300中的第401位(y)的區(qū)域互補的序列構成，堿基r為與序列號300中的第401位的堿基(y)對應的互補堿基。以下所示的各序列中，堿基r可以是腺嘌呤(a)和鳥嘌呤(g)中的任意一種，優(yōu)選為鳥嘌呤(g)。下述探針中，優(yōu)選由序列號306或序列號307的堿基序列構成的寡核苷酸(H1)。
[表8]
另外，本發(fā)明的TNFβ探針還可以是由與前述(H)的寡核苷酸互補的寡核苷酸(H’)構成的探針。這樣，通過與反義鏈的雜交，能檢測反義鏈中的多態(tài)性。
本發(fā)明的探針包括前述的各寡核苷酸中，除與檢測對象位點對應的堿基位點以外，缺失、置換或添加了1個或多個堿基的堿基序列所構成的、能與檢測對象序列雜交的寡核苷酸構成的探針。
本發(fā)明的探針優(yōu)選在前述的寡核苷酸上結合了標記物質(zhì)的標記探針。作為前述標記探針，例如，可以例舉單獨顯示信號且由于形成雜交體而不顯示信號的標記探針，或單獨不顯示信號但由于形成雜交體而顯示信號的標記探針。如果為前者這樣的探針，則在與檢測對象序列形成雜交體(雙鏈核酸)時不顯示信號，而由于加熱探針游離時顯示信號。另外，如果為后者的探針，則由于與檢測對象序列形成雜交體(雙鏈核酸)時顯示信號，由于加熱探針游離時信號就減少(消失)。
前述標記物質(zhì)沒有限制，例如，可以例舉螢光色素(螢光團)。作為前述標記探針的具體例子，例如，優(yōu)選用螢光色素標記，單獨顯示螢光且由于形成雜交體螢光減少(例如，猝滅)的探針。利用這種螢光猝滅現(xiàn)象(Quenching phenomenon)的探針被稱為螢光猝滅探針。前述標記探針優(yōu)選寡核苷酸的3’末端或5’末端被螢光色素標記，更優(yōu)選3’末端和5’末端中堿基為胞嘧啶的核苷酸末端被標記。此時，優(yōu)選將前述標記探針的堿基序列設計成在前述標記探針雜交的檢測對象序列中，與前述標記探針的末端堿基的胞嘧啶配對的堿基或距離前述配對堿基1～3堿基的堿基為鳥嘌呤。這種探針一般被稱為鳥嘌呤猝滅探針，已知為所謂的QProbe(注冊商標)。這種鳥嘌呤猝滅探針一旦與檢測對象序列雜交，被螢光色素標記的末端胞嘧啶由于靠近前述檢測對象序列中的鳥嘌呤，因此出現(xiàn)前述螢光色素的發(fā)光變?nèi)?螢光強度減少)的現(xiàn)象。
前述螢光色素沒有限制，例如，可以例舉熒光素、磷光體、羅丹明、聚甲炔染料衍生物等，作為市售的螢光色素，例如，可以例舉BODIPY FL(商標名，Molecular Probes公司制)、FluorePrime(商品名，Amersham Pharmacia公司制)、Fluoredite(商品名，Millipore公司制)、FAM(ABI公司制)、Cy3及Cy5(Amersham Pharmacia公司制)、TAMRA(Molecular Probes公司制)、Pacific Blue(B ecton，Dickinson公司制)等。探針的檢測條件沒有特別限定，可以根據(jù)所使用的螢光色素適當確定。例如，太平洋藍(Pacific Blue)可以在檢測波長450～480nm下檢測，TAMRA可以在檢測波長585～700nm下檢測，BODIPY FL可以在檢測波長515～555nm下檢測。若使用這種探針，則可以根據(jù)信號的變動，容易地確認雜交與其的分離。
另外，本發(fā)明的探針例如可以在3’末端上添加磷酸基。如后所述，待測核酸可以通過PCR等核酸擴增法進行制備，此時，可以使本發(fā)明的探針共存于核酸擴增反應的反應體系中。此時，如果預先在前述探針的3’末端上添加磷酸基，例如則能充分防止探針自身通過核酸擴增反應而伸長。而且，即使通過在3’末端上添加如上前所述的標記物質(zhì)，也可以獲得同樣效果。
本發(fā)明的探針可以分別用于各種免疫相關基因中的多態(tài)性的檢測。而且，在多態(tài)性檢測時，既可以使用本發(fā)明的探針中的一種，只檢測一種多態(tài)性，也可以使用兩種以上的探針，檢測兩種以上的多態(tài)性。使用兩種以上的本發(fā)明的探針時，例如，可以使之共存于同一反應體系中，使用前述同一反應體系而檢測兩種以上的多態(tài)性。此時，優(yōu)選用檢測條件不同的螢光色素標記各探針。
此外，在采用本發(fā)明的探針的多態(tài)性的檢測中，檢測方法沒有任何限制，只要是利用檢測對象序列與探針的雜交的方法即可。作為使用本發(fā)明的探針的方法的一例，對于利用Tm分析的多態(tài)性的檢測方法，說明如下。
<多態(tài)性檢測方法> 本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法如前所述，其特征在于，其是免疫相關基因的多態(tài)性的檢測方法，包括下述(1)～(3)工序。而且，本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法的特征在于，其使用本發(fā)明的探針，其它構成和條件等不受以下所述限制。
(1)準備反應體系的工序，所述反應體系含有檢測前述多態(tài)性的待測核酸和本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針 (2)改變前述反應體系的溫度，測定顯示前述待測核酸和前述探針的雜交產(chǎn)物的熔解狀態(tài)的信號值的工序 (3)根據(jù)伴隨溫度變化的前述信號值的變動，決定前述待測核酸中的前述多態(tài)性的工序 本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法中使用的本發(fā)明的探針，如前所述，可以是一種，也可以是兩種以上。為前者的情況下，在一個反應體系中能檢測所希望的一種多態(tài)性，為后者的情況下，通過在反應體系中添加兩種以上的本發(fā)明的探針，就能在一個反應體系中分別檢測各探針對應的所希望的兩種以上的多態(tài)性。在一個反應體系中檢測兩種以上的多態(tài)性時，本發(fā)明的探針的組合沒有特別限定，但例如可以例舉以下組合 (1)FCGR3A探針和IL-10(-819)探針的組合，優(yōu)選含有序列號14的序列的探針和含有序列號36的序列的探針的組合 (2)FCGR2A探針、IL-10(-592)探針和TNFα(-308)探針的組合，優(yōu)選含有序列號23的序列的探針、含有序列號30的序列的探針和含有序列號64的序列的探針 (3)IL-10(-1082)探針和IL-10(-3575)探針的組合，優(yōu)選含有序列號47的序列的探針和含有序列號57的序列的探針的組合 (4)IL-10(-592)探針和IL-10(-1082)探針的組合，優(yōu)選含有序列號30的序列的探針和含有序列號47的序列的探針的組合 在一個反應體系中添加兩種以上的探針時，優(yōu)選各探針分別被檢測條件不同的標記物質(zhì)標記。由此，只改變檢測條件，即便使用同一個反應體系，也可以簡便地檢測兩種以上的多態(tài)性。
本發(fā)明中，前述待測核酸既可為單鏈核酸，也可為雙鏈核酸。前述待測核酸為雙鏈核酸時，例如，如后所述，優(yōu)選在前述(2)工序中包括加熱前述反應體系而使雙鏈的待測核酸解離的工序。通過將雙鏈核酸解離成單鏈核酸，使得與本發(fā)明的探針的雜交成為可能。
本發(fā)明中，前述待測核酸，例如可以是生物體試樣中原本含有的核酸，也可以是以前述核酸作為模板核酸，通過核酸擴增法擴增出的擴增產(chǎn)物，此時可以提高檢測精度。前述擴增產(chǎn)物，例如可以是以生物體試樣中的DNA作為模板的擴增產(chǎn)物，也可以是以由生物體試樣中的總RNA、mRNA等RNA通過逆轉(zhuǎn)錄-PCR合成的cDNA作為模板的擴增產(chǎn)物。
前述待測核酸為前述擴增產(chǎn)物時，可以在前述(1)工序中，例如，使用預先制備的擴增產(chǎn)物，準備含有本發(fā)明的探針和前述擴增產(chǎn)物的反應體系，也可以在本發(fā)明的探針的存在下，由模板核酸通過核酸擴增法擴增目標擴增產(chǎn)物，準備含有前述探針和擴增產(chǎn)物的反應體系。
在后者的情況下，前述(1)工序優(yōu)選包括下述(1a)工序。
(1a)在含有前述探針的反應體系中，通過核酸擴增法，由模板核酸生成作為前述待測核酸的擴增產(chǎn)物的工序。
前述核酸擴增法不受限制，例如，可以例舉PCR(聚合酶鏈式反應，Polymerase Chain Reaction)法、NASBA(依賴核酸序列的擴增，Nucleic acid sequence based amplification)法、TMA(轉(zhuǎn)錄介導的擴增，Transcription-mediated amplification)法、SDA(鏈置換擴增，Strand Displacement Amplification)法等，其中優(yōu)選PCR法。
在前述(1a)工序中優(yōu)選使用用于擴增含有前述免疫相關基因中的檢測目標的多態(tài)性的序列的引物。引物的序列沒有特別限定，只要能擴增含有檢測對象位點的檢測對象序列即可，例如，可以根據(jù)檢測對象序列和其周邊序列等，通過以往公知的方法適當設定。引物的長度沒有特別限定，可以設定為一般的長度，例如，可以例舉10～30mer。如前所述，在檢測兩種以上的多態(tài)性時，可以分別并用用于擴增各多態(tài)性的檢測對象序列的引物。另外，通過使這些引物共存于同一反應體系中，能同時擴增兩種以上的檢測對象序列。
作為前述引物，例如，可以使用擴增基因的有義鏈的正向引物(以下，也稱為“F引物”)和擴增反義鏈的反向引物(以下，也稱為“R引物”)中的任意一種，但優(yōu)選將這兩者作為一對引物對使用。以下，示出引物對的一個例子，但其僅為示例，本發(fā)明并不限于此。
FCGR3A引物對(a) FCGR3A多態(tài)性的檢測中，作為引物對，例如，可以例舉包括由下述(F1)的寡核苷酸構成的正向引物和由下述(R1)的寡核苷酸構成的反向引物的引物對(a)。
(F1)與以序列號1的堿基序列中的第173位的胞嘧啶(c)為第1位堿基，向5’方向直到第27～46位堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以前述胞嘧啶(c)作為3’末端 (R1)與以序列號1的堿基序列中的第307位的腺嘌呤(a)為第1位堿基，向3’方向直到第23～29位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述第307位的腺嘌呤(a)互補的胸腺嘧啶(t)作為3’末端 以下，示出正向引物和反向引物的具體例子，但本發(fā)明并不限于此。而且，這些正向引物和反向引物的組合沒有任何限制，但其中特別優(yōu)選包括由序列號77的堿基序列構成的正向引物和由序列號97的堿基序列構成的反向引物的引物對。
[表9]
FCGR2A引物對(b) FCGR2A多態(tài)性的檢測中，作為引物對，例如，可以例舉包括由下述(F2)的寡核苷酸構成的正向引物和由下述(R2)的寡核苷酸構成的反向引物的引物對(b)。
包括由下述(F2)的寡核苷酸構成的正向引物和由下述(R2)的寡核苷酸構成的反向引物的引物對 (F2)與以序列號2的堿基序列中的第189位的鳥嘌呤(g)為第1位堿基，向5’方向直到第23～38位堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以前述鳥嘌呤(g)作為3’末端 (R2)與以序列號2的堿基序列中的第206位的鳥嘌呤(g)為第1位堿基，向3’方向直到第31～48位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述第206位的鳥嘌呤(g)互補的胞嘧啶(c)作為3’末端 以下，示出正向引物和反向引物的具體例子，但本發(fā)明并不限于此。而且，這些正向引物和反向引物的組合沒有任何限制，但其中特別優(yōu)選包括由序列號132的序列構成的F2引物和由序列號114的堿基序列構成的R2引物的引物對。
[表10]
IL-10(-592)引物對(c) IL-10(-592)多態(tài)性的檢測中，作為引物對，例如，可以例舉包括由下述(F3)的寡核苷酸構成的正向引物及由下述(R3)的寡核苷酸構成的反向引物的引物對(c)。
(F3)與以序列號3的堿基序列中的第291位的胞嘧啶(c)作為第1位堿基，向5’方向直到第23～41位堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以前述胞嘧啶(c)作為3’末端 (R3)與以序列號3的堿基序列中的第311位的鳥嘌呤(g)作為第1位堿基，向3’方向直到第27～41位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述第311位的鳥嘌呤(g)互補的胞嘧啶(c)作為3’末端 以下，示出正向引物和反向引物的具體例子，但本發(fā)明并不限于此。而且，這些正向引物和反向引物的組合沒有任何限制，但其中特別優(yōu)選包括由序列號148的堿基序列構成的正向引物和由序列號167的堿基序列構成的反向引物的引物對。
[表11]
IL-10(-819)引物對(d) IL-10(-819)多態(tài)性的檢測中，作為引物對，例如，可以例舉包括由下述(F4)的寡核苷酸構成的正向引物及由下述(R4)的寡核苷酸構成的反向引物的引物對(d)。
(F4)與以序列號4的堿基序列中的第351位的鳥嘌呤(g)為第1位堿基，向5’方向直到第24～39位堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以前述鳥嘌呤(g)作為3’末端 (R4)與以序列號4的堿基序列中第420位的鳥嘌呤(g)為第1位堿基，向3’方向直到第29～46位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述第420位的鳥嘌呤(g)互補的胞嘧啶(c)作為3’末端 以下，示出正向引物和反向引物的具體例子，但本發(fā)明并不限于此。而且，這些正向引物和反向引物的組合沒有任何限制，但其中特別優(yōu)選包括由序列號182的堿基序列構成的正向引物和由序列號198的堿基序列構成的反向引物的引物對。
[表12]
IL-10(-1082)用引物對(e) IL-10(-1082)多態(tài)性的檢測中，作為引物對，例如，可以例舉包括由下述(F5)的寡核苷酸構成的正向引物及由下述(R5)的寡核苷酸構成的反向引物的引物對(e)。
(F5)與以序列號5的堿基序列中的第329位的胞嘧啶(c)為第1位堿基，向5’方向直到第22～32位堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以前述胞嘧啶(c)作為3’末端 (R5)與以序列號5的堿基序列中第447位的鳥嘌呤(g)為第1位堿基，向3’方向直到第23～39位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述447位的鳥嘌呤(g)互補的胞嘧啶(c)作為3’末端 以下，示出正向引物和反向引物的具體例子，但本發(fā)明并不限于此。而且，這些正向引物和反向引物的組合沒有任何限制，但其中特別優(yōu)選包括由序列號213的堿基序列構成的正向引物和由序列號227的堿基序列構成的反向引物的引物對。
[表13]
IL-10(-3575)用引物對(f) IL-10(-3575)多態(tài)性的檢測中，作為引物對，例如，可以例舉包括由下述(F6)的寡核苷酸構成的正向引物及由下述(R6)的寡核苷酸構成的反向引物的引物對。
(F6)與以序列號6的堿基序列中的第139位的胞嘧啶(c)作為第1位堿基，向5’方向直到第25～42位堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以前述胞嘧啶(c)作為3’末端 (R6)與以序列號6的堿基序列中第223位的鳥嘌呤(g)作為第1位堿基，向3’方向直到第19～33位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述第223位的鳥嘌呤(g)互補的胞嘧啶(c)作為3’末端 以下，示出正向引物和反向引物的具體例子，但本發(fā)明并不限于此。而且，這些正向引物和反向引物的組合沒有任何限制，但其中特別優(yōu)選包括由序列號244的堿基序列構成的正向引物和由序列號260的堿基序列構成的反向引物的引物對。
[表14]
TNFα引物對(g) TNFα多態(tài)性的檢測中，作為引物對，例如，可以例舉包括由下述(F7)的寡核苷酸構成的正向引物及由下述(R7)的寡核苷酸構成的反向引物的引物對。
(F7)與以序列號7的堿基序列中的第386位的鳥嘌呤(g)為第1位堿基，向5’方向直到第26～41位堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以前述鳥嘌呤(g)作為3’末端 (R7)與以序列號7的堿基序列中第418位的胞嘧啶(c)為第1位堿基，向3’方向直到第24～40位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述第418位的胞嘧啶(c)互補的鳥嘌呤(g)作為3’末端 以下，示出正向引物和反向引物的具體例子，但本發(fā)明并不限于此。而且，這些正向引物和反向引物的組合沒有任何限制，但其中特別優(yōu)選包括由序列號277的堿基序列構成的正向引物和由序列號293的堿基序列構成的反向引物的引物對。
[表15]
TNFβ引物對(h) TNFβ多態(tài)性的檢測中，作為引物對，例如，可以例舉包括由下述(F8)的寡核苷酸構成的正向引物及由下述(R8)的寡核苷酸構成的反向引物的引物對。
(F8)與以序列號300的堿基序列中的第350位的胞嘧啶(c)為第1位堿基，向5’方向直到第18～37位堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以前述胞嘧啶(c)作為3’末端 (R8)與以序列號300的堿基序列中第443位的鳥嘌呤(g)為第1位堿基，向3’方向直到第17～37位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述第443位的鳥嘌呤(g)互補的胞嘧啶(c)作為3’末端 以下，示出正向引物和反向引物的具體例子，但本發(fā)明并不限于此。而且，這些正向引物和反向引物的組合沒有任何限制，但其中特別優(yōu)選包括由序列號337的堿基序列構成的正向引物和由序列號312的堿基序列構成的反向引物的引物對。
[表16]
在前述(1)工序中，本發(fā)明的探針相對于前述待測核酸的添加比例(摩爾比)沒有特別限制，但為了能充分確保檢測信號，優(yōu)選為1倍以下，更優(yōu)選為0.1倍以下。此時，前述待測核酸，例如，可以是具有完全匹配序列的完全匹配核酸和具有錯配序列的錯配核酸的總計，也可以是包括完全匹配序列的擴增產(chǎn)物和包括錯配序列的擴增產(chǎn)物的總計。而且，待測核酸中完全匹配DNA的比例通常不明，但從結果看，前述探針的添加比例(摩爾比)優(yōu)選為完全匹配核酸(含有完全匹配序列的擴增產(chǎn)物)的10倍以下，更優(yōu)選為5倍以下，進一步優(yōu)選為3倍以下。而且，其下限沒有特別限定，例如，為0.001倍以上，優(yōu)選為0.01倍以上，更優(yōu)選為0.1倍以上。本發(fā)明的探針相對于前述待測核酸的添加比例，例如，可以為相對于雙鏈核酸的摩爾比，也可以為相對于單鏈核酸的摩爾比。
作為使用本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法的試樣，沒有特別限定，但可以列舉生物體試樣。作為前述生物體試樣的具體例子，例如，可以例舉白細胞等血細胞、全血、口腔粘膜等口腔內(nèi)細胞、指甲或毛發(fā)等體細胞、生殖細胞、吐出的痰、羊水、石蠟包埋組織、尿、胃液、胃清洗液等。本發(fā)明中，前述試樣的采集方法和從前述試樣制備待測核酸的方法等沒有限制，可以采用以往公知的方法。
就Tm值進行說明。逐步加熱含有雙鏈核酸(例如，雙鏈DNA)的溶液時，260nm處的吸光度上升。這是因為雙鏈核酸中雙鏈間的氫鍵因加熱而解離，解離(DNA的熔解)成單鏈核酸(例如，單鏈DNA)。而且，所有的雙鏈核酸均解離成單鏈核酸時，其吸光度呈現(xiàn)出加熱開始時的吸光度(僅雙鏈核酸的吸光度)的約1.5倍左右，由此可以判斷熔解結束?；谶@種現(xiàn)象，熔解溫度Tm一般定義為吸光度達到吸光度總上升量的50％時的溫度。
本發(fā)明中，用于測定Tm值的伴隨溫度變化的信號變動，其測定也可以根據(jù)前述原理通過260nm處的吸光度測定而進行，但優(yōu)選測定添加于探針上的標記物質(zhì)的信號。因此，作為本發(fā)明的探針，優(yōu)選使用前述標記探針。作為前述標記探針，例如，可以例舉單獨顯示信號且由于形成雜交體而不顯示信號的標記探針，或者單獨不顯示信號但由于形成雜交體而顯示信號的標記探針。如果為前者的探針，則在與檢測對象序列形成雜交體(雙鏈核酸)時不顯示信號，而由于加熱探針游離則顯示信號。此外，如果為后者探針，則由于與檢測對象序列形成雜交體(雙鏈核酸)而顯示信號，而由于加熱探針游離則信號減少(消失)。因此，通過在信號特有的條件(吸光度等)下檢測由該標記物質(zhì)產(chǎn)生的信號，可以與前述260nm處的吸光度測定同樣，進行熔解的進行和Tm值的確定。標記探針中的標記物質(zhì)，例如，如前所述。
以下，就本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法，以待測核酸為核酸擴增物，使用經(jīng)螢光色素標記的標記探針作為本發(fā)明的探針為例進行說明。另外，本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法的特征在于使用本發(fā)明的探針本身，其它工序和條件沒有任何限制。
首先，從全血中分離基因組DNA。從全血中分離基因組DNA可以通過以往公知的方法進行。作為具體例子，例如，可以使用市售的基因組DNA分離試劑盒(商品名GFX GenomicBlood DNA Purification kit；GE Healthcare Bio-Science公司制)等。
隨后，在含有分離的基因組DNA的試樣中添加標記探針，制備反應液。如前所述，添加的標記探針可以是一種，也可以為兩種以上。作為前述標記探針，例如，優(yōu)選QProbe。前述QProbe一般為用螢光色素標記探針末端的胞嘧啶的探針，其通過與檢測對象序列雜交，前述螢光色素和檢測對象序列的鳥嘌呤相互作用，其結果為螢光減少(或猝滅)。標記探針的堿基序列如前所述，可以根據(jù)檢測目標的多態(tài)性而適當選擇。
前述標記探針的添加時機沒有特別限定，例如，可以在后述的核酸擴增反應后添加到PCR擴增產(chǎn)物中，也可以在核酸擴增反應之前添加。這樣在PCR等核酸擴增反應前添加前述標記探針時，例如，如前所述，優(yōu)選在探針的3’末端上添加螢光色素或添加磷酸基。
前述標記探針可以添加于含有分離的基因組DNA的試樣，也可以在溶劑中與基因組DNA混合。作為前述溶劑，沒有特別限定，例如，可以例舉Tris-HCl等緩沖液，含有KCl、MgCl2、MgSO4、丙三醇等的溶劑，PCR用反應液等核酸擴增用反應液這些以往公知的溶劑。
接著，以分離的基因組DNA作為模板，在前述標記探針的存在下，通過PCR等核酸擴增法，對含有發(fā)生檢測目標多態(tài)性的檢測對象位點的序列進行擴增。以下，作為核酸擴增法，以PCR為例，對本發(fā)明進行說明，但不限于此。而且，PCR的條件沒有特別限定，可以通過以往公知的方法進行。
具體而言，對含有前述基因組DNA和前述標記探針的前述反應液進行PCR。該反應液的組成沒有特別限定，只要是本領域技術人員即可適當設定，例如，除了前述基因組DNA和前述標記探針外，還可以列舉DNA聚合酶等聚合酶、dATP、dTTP、dCTP、dGTP及dUTP等dNTP、緩沖液、各種催化劑、引物等。
然后，進行獲得的擴增產(chǎn)物(雙鏈DNA)的解離以及使通過解離獲得的單鏈DNA與前述標記探針雜交。例如，其可以根據(jù)前述反應液的溫度變化而進行。
前述雙鏈DNA的解離可以通過例如加熱來進行。該解離工序中的加熱溫度只要為前述擴增產(chǎn)物可以解離的溫度即可，沒有特別限定，例如為85～95℃。加熱時間也沒有特別限定，通常是1秒～10分鐘，優(yōu)選為1秒～5分鐘。
另外，解離的單鏈DNA與前述標記探針的雜交，例如，可以在前述解離工序后通過使前述解離工序中的加熱溫度下降而進行。該雜交工序中的溫度條件沒有特別限定，但優(yōu)選比前述標記探針的Tm值更低的溫度，例如為40～50℃。而且，前述溫度下的處理時間沒有特別限定，例如為1～600秒。
雜交工序中，前述反應液的各組成的體積和濃度沒有特別限定。作為具體例子，前述反應液中的DNA的濃度是例如為0.01～1μmol/L，優(yōu)選為0.1～0.5μmol/L，前述標記探針的濃度，例如，優(yōu)選滿足前述的DNA的添加比例的范圍，例如為0.001～10μmol/L，優(yōu)選為0.001～1μmol/L。
然后，改變前述反應液的溫度，測定顯示前述擴增產(chǎn)物(前述單鏈DNA)和前述標記探針的雜交產(chǎn)物的熔解狀態(tài)的信號值。具體而言，例如，通過加熱前述反應液而加熱前述單鏈DNA和前述標記探針的雜交產(chǎn)物，測定伴隨溫度上升的信號值的變動。如前所述，例如，在使用末端的胞嘧啶被標記的探針(鳥嘌呤猝滅探針)時，在與單鏈DNA雜交的狀態(tài)下螢光減少(或猝滅)，在解離的狀態(tài)下發(fā)出螢光。因此，例如，可以緩慢加熱螢光減少(或猝滅)的雜交產(chǎn)物，測定伴隨溫度上升的螢光強度的增加即可。
測定螢光強度的變動時的溫度范圍沒有特別限定，例如，開始溫度為室溫～85℃，優(yōu)選為25～70℃，例如，終止溫度為40～105℃。而且，溫度的上升速度沒有特別限定，例如為0.1～20℃/秒，優(yōu)選為0.3～5℃/秒。
使用兩種以上的標記探針來檢測兩種以上的多態(tài)性時，只要在適應于各標記探針的標記物質(zhì)的條件下，基于各標記探針測定信號變動即可。
然后，分析前述信號的變動，確定Tm值。具體而言，例如，根據(jù)獲得的螢光強度計算各溫度下每單位時間的螢光強度變化量。變化量為(-d螢光強度增加量/dt)時，例如，可以將顯示最低值的溫度確定為Tm值。而且，變化量為(d螢光強度增加量/dt)時，例如，可以將最高點確定為Tm值。此外，作為標記探針，不使用猝滅探針而使用單獨不顯示信號但由于形成雜交體而顯示信號的探針時，相反地測定螢光強度的減少量即可。
并且，根據(jù)這些Tm值，確定目標檢測對象位點的多態(tài)性(基因型)。在Tm分析中，例如可獲得這樣的結果完全互補的雜交體(匹配)與一個堿基不同的雜交體(錯配)相比，表示解離的Tm值要高。因此，通過預先確定前述探針的完全互補的雜交體的Tm值和一個堿基不同的雜交體的Tm值，可以確定目標檢測對象位點的多態(tài)性。例如，目標檢測對象位點的多態(tài)性為X或Y時，使用與檢測對象位點為X的檢測對象序列完全互補的探針時，形成的雜交體的Tm值若與完全互補的雜交體的Tm值相同，則可以判斷檢測對象位點的堿基為X。另外，如果形成的雜交體的Tm值與一個堿基不同的雜交體的Tm值相同，或比完全互補的雜交體的Tm值低，則可以判斷檢測對象位點的堿基為Y。
另外，在本發(fā)明中，代替如前所述的使前述反應液的溫度上升以加熱雜交產(chǎn)物來測定伴隨溫度上升的信號變動的方法，例如，可以進行雜交體形成時的信號變動的測定。也就是說，可以在使含有前述探針的反應液的溫度下降以形成雜交產(chǎn)物時，測定伴隨前述溫度下降的信號變動。
作為具體例子，就使用單獨顯示信號且由于形成雜交體而不顯示信號的標記探針(例如、QProbe)的情況進行說明。在單鏈DNA與探針解離的狀態(tài)下發(fā)出螢光，但隨溫度下降而形成雜交體時，前述螢光則減少(或猝滅)。因此，例如，可以使前述反應液的溫度緩慢下降，測定伴隨溫度下降的螢光強度的減少即可。另一方面，使用單獨不顯示信號但由于形成雜交體而顯示信號的標記探針時，在單鏈DNA與探針解離的狀態(tài)下不發(fā)出螢光，但由于溫度下降而形成雜交體時，則發(fā)出螢光。因此，例如，可以使前述反應液的溫度緩慢下降，測定伴隨溫度下降的螢光強度的增加即可。
<多態(tài)性檢測用試劑> 本發(fā)明的多態(tài)性檢測用試劑，其特征在于，其是用于檢測免疫相關基因的多態(tài)性的多態(tài)性檢測用試劑，含有本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針。本發(fā)明的特征在于含有前述的本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針，其它構成和條件沒有任何限制。而且，本發(fā)明的多態(tài)性檢測用試劑，例如，也可以稱為用于免疫相關基因的多態(tài)性的檢測的探針試劑盒。
在本發(fā)明的多態(tài)性檢測用試劑中，本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針可以為一種也可以為兩種以上。探針為兩種以上時，其組合沒有特別限定，例如可以例舉前述那樣的組合。另外，兩種以上的探針例如可以分別收納于容器中，而且如前所述，由于能夠進行同一反應體系中的多態(tài)性的檢測，因此也可以以混合狀態(tài)收納于同一容器中。而且，含有兩種以上的探針時，各探針優(yōu)選被不同標記物質(zhì)標記。通過這樣改變標記物質(zhì)的種類，即使是同一反應體系，也可以進行各個探針的檢測。作為前述標記物質(zhì)，例如優(yōu)選為檢測波長不同的物質(zhì)。
據(jù)報道，如前所述免疫相關基因FCGR3A基因、FCGR2A基因、IL-10基因、TNFα基因及TNFβ基因中，例如分別存在與商品名Rituxan等惡性淋巴瘤治療藥、商品名Herceptin等乳腺癌治療藥(例如，商品名Herceptin)等抗體藥物的藥效相關的多態(tài)性。而且，根據(jù)本發(fā)明的探針，可以分別檢測這些多態(tài)性。另外，對于這些多態(tài)性，例如存在只檢測到某一個種類的突變型的情況，但也存在檢測到多種突變型的情況。本發(fā)明中作為檢測目標的各多態(tài)性，分別顯示了與前述抗體藥物的藥效之間的關系，可認為分別顯示出特有的特征。因此，例如，檢測多個多態(tài)性，通過綜合判斷這些結果，可以進行更好的診斷和治療。因此，通過使本發(fā)明的多態(tài)性檢測試劑或探針試劑盒中含有兩種以上的本發(fā)明的探針，可以更簡便地進行用于診斷和治療等的多態(tài)性檢測。
本發(fā)明的檢測用試劑還可以進一步含有用于擴增含有免疫相關基因中的檢測目標位點的區(qū)域的引物或引物對。作為引物對，例如，根據(jù)使用的本發(fā)明的探針的種類，可以例舉如前所述的引物對。具體而言，優(yōu)選分別含有FCGR3A探針和FCGR3A引物對、FCGR2A探針和FCGR2A引物對、IL-10(-592)探針和IL-10(-592)引物對、IL-10(-819)探針和IL-10(-819)引物對、IL-10(-1082)探針和IL-10(-1082)引物對、IL-10(-3575)探針和IL-10(-3575)引物對、TNFα探針和TNFα引物對、TNFβ探針和TNFβ引物對的組合。
本發(fā)明的探針的組合沒有特別限定，例如可以例舉如前所述的例子。而且，就引物或引物對的組合而言，也可以根據(jù)本發(fā)明的探針的組合來確定。
本發(fā)明的檢測用試劑，除此之外例如還可以含有核酸擴增反應所必需的成分。作為具體例子，例如可以例舉DNA聚合酶等聚合酶、dATP、dTTP、dCTP、dGTP及dUTP等dNTP、緩沖液、各種催化劑等。而且，本發(fā)明的檢測用試劑可以是檢測試劑試劑盒，還可以進一步含有使用說明書。
接著，就本發(fā)明的實施例進行說明。但是，本發(fā)明并不限于下述實施例。而且，％表示w/v％。
實施例 [實施例1] FCGR3A多態(tài)性及IL-10(-819)多態(tài)性的檢測 使用本發(fā)明的探針，通過Tm分析，檢測FCGR3A多態(tài)性和IL-10(-819)多態(tài)性。
從FCGR3A多態(tài)性和IL-10(-819)多態(tài)性為已知的3名健康者中，通過EDTA采血管采集血液(試樣1～試樣3)。各試樣的FCGR3A多態(tài)性和IL-10(-819)多態(tài)性分別如下。FCGR3A多態(tài)性IL-10(-819)多態(tài)性 試樣1T/T C/C 試樣2G/T T/C 試樣3T/T T/T 將前述各試樣10μL與70μL下述試樣稀釋液1混合，將混合液10μL再與70μL下述試樣稀釋液2混合。將該混合液17μL于95℃加熱10分鐘后，添加到46μL下述PCR反應液中進行PCR。前述PCR，通過熱循環(huán)儀于95℃處理60秒后，以95℃下1秒和62℃下15秒作為1個循環(huán)，重復進行50個循環(huán)，再進行95℃下1秒、40℃下60秒的處理。然后，繼續(xù)將溫度上升速度設為1℃/3秒，使前述PCR反應液由40℃逐漸加熱到75℃，測定經(jīng)時的螢光強度的變化(波長515～555nm、585～700nm)。
(試樣稀釋液1) 10mmol/L Tris-HCl 0.1mmol/LEDTA 0.05％ NaN3 0.3％SDS (試樣稀釋液2) 10mmol/L Tris-HCl 0.1mmol/LEDTA 0.05％NaN3 [表17] (PCR反應液單位μL) 蒸餾水 28.02 10％NaN3 0.23 20％BSA 0.5 50％丙三醇 2.5 10×Gene Taq緩沖液* 5 2.5mmol/L dNTPs 4 5μmol/L FCGR3A探針 2 100μmol/L FCGR3A F引物 0.5 100μmol/L FCGR3A R引物 0.25 5μmol/L IL-10(-819)探針 2 100μmol/L IL-10(-819)F引物 0.5 100μmol/L IL-10(-819)R引物 0.25 5U/μL Gene Taq FP* 0.25總計46μL *商品名Gene Taq FPNIPPON GENE公司制 FCGR3A探針(序列號14) 5’-tcccaaAaagccccc-(BODIPY FL)-3’ FCGR3A F引物(序列號77) 5’-tctgacttctacattccaaaagccacactcaaagac-3’ FCGR3A R引物(序列號97) 5’-ctcctcccaactcaacttcccagtgtgat-3’ IL-10(-819)探針(序列號36) 5’-acagagatGttacatcacc-(TAMRA)-3’ IL-10(-819)F引物(序列號182) 5’-tgctggagatggtgtacagtagggtgagg-3’ IL-10(-819)R引物(序列號198) 5’-caccatgacccctaccgtctctattttatagtgagc-3’ 這些結果示于圖1。圖1為表示伴隨溫度上升的螢光強度變化的Tm分析圖。在圖1中，(A)為試樣1的結果，(B)為試樣2的結果，(C)為試樣3的結果，上面部分表示FCGR3A多態(tài)性的結果，下面部分表示IL-10(-819)多態(tài)性的結果。
本實施例中，使用與有義鏈的FCGR3A多態(tài)性(t)完全匹配的探針作為FCGR3A探針，使用與有義鏈的IL-10(-819)多態(tài)性(c)完全匹配的探針作為IL-10(-819)探針。其結果是，在FCGR3A多態(tài)性的檢測中，如圖1的上部分所示，純合體(T/T)的試樣1和3僅在表示完全匹配的57.0℃處出現(xiàn)峰。另一方面，雜合體(G/T)的試樣2在表示完全匹配的57.0℃和表示1個堿基錯配的48.0℃處出現(xiàn)峰。而且，在IL-10(-819)多態(tài)性的檢測中，如圖1的下面部分所示，純合體(C/C)的試樣1僅在表示完全匹配的59.0℃處出現(xiàn)峰，純合體(T/T)的試樣3僅在表示錯配的52.5℃出現(xiàn)峰。另一方面，雜合體(T/C)的試樣2在表示完全匹配的59.0℃和表示1個堿基錯配的52.5℃出現(xiàn)峰。根據(jù)此結果可知，通過本發(fā)明的探針可以充分判斷與檢測對象序列雜交的是完全匹配還是錯配，而且可以在一個反應體系中判斷兩種多態(tài)性。
[實施例2] FCGR2A多態(tài)性、IL-10(-592)多態(tài)性和TNFα多態(tài)性的檢測 使用本發(fā)明的探針，通過Tm分析，檢測FCGR2A多態(tài)性、IL-10(-592)多態(tài)性和TNFα(-308)多態(tài)性。
從FCGR2A多態(tài)性、IL-10(-592)多態(tài)性及TNFα(-308)多態(tài)性為已知的1名健康者中，通過EDTA采血管采集血液(試樣1)。并且，準備具有TNFα(-308)多態(tài)性為純合體(A/A)的TNFα基因的質(zhì)粒(試樣2)。各試樣的FCGR2A多態(tài)性、IL-10(-592)多態(tài)性及TNFα(-308)多態(tài)性如下。FCGR2A多態(tài)性 IL-10(-592)多態(tài)性 TNFα多態(tài)性 試樣1C/T C/AG/G 試樣2- - A/A 將10μL的試樣1與70μL的前述試樣稀釋液1混合，將混合液10μL再與70μL前述試樣稀釋液2混合。將該混合液17μL于95℃加熱10分鐘后，添加到46μL下述PCR反應液中進行PCR。另一方面，將1μL的試樣2(3.5pg)添加到46μL下述PCR反應液中進行PCR。前述PCR，通過熱循環(huán)儀于95℃處理60秒后，以95℃下1秒和62℃下15秒作為1個循環(huán)，重復進行50個循環(huán)，再進行95℃下1秒、40℃下60秒的處理。而且，繼續(xù)將溫度上升速度設為1℃/3秒，將前述PCR反應液由40℃逐漸加熱到75℃，測定經(jīng)時的螢光強度的變化(波長450～480nm、515～555nm、585～700nm)。
[表18] (PCR反應液單位μL) 蒸餾水 17.77 10％NaN3 0.23 20％BSA 0.5 50％丙三醇 10 10×Gene Taq緩沖液* 5 2.5mmol/L dNTPs 4 5μmol/L IL-10(-592)探針 2 100μmol/L IL-10(-592)F引物 0.5 100μmol/L IL-10(-592)R引物 0.25 5μmol/L FCGR2A探針 2 100μmol/L FCGR2A F引物 0.25 100μmol/L FCGR2A R引物 0.5 5μmol/L TNFα(-308)探針 2 100μmol/L TNFα(-308)F引物 0.5 100μmol/L TNFα(-308)R引物 0.25 5U/μL Gene Taq FP* 0.25總計46μL *商品名Gene Taq FPNIPPON GENE公司制 IL-10(-592)探針(序列號30) 5’-(Pacific Blue)-cttcctacagTacaggcg-P-3’ IL-10(-592)F引物(序列號148) 5’-ggtaaaggagcctggaacacatcctgtgac-3’ IL-10(-592)R引物(序列號167) 5’-agcccttccattttactttccagagactggc-3’ FCGR2A探針(序列號23) 5’-ttctcccAtttggatccc-(BODIPY FL)-3’ FCGR2A F引物(序列號132) 5’-ctgtggtttgcttgtgggatggagaagg-3’ FCGR2A R引物(序列號38) 5’-aggtcacattcttccagaatggaaaatcccagaaattc-3’ TNFα(-308)探針(序列號64) 5’-ccgtccCcatgccc-(TAMRA)-3’ TNFα(-308)F引物(序列號277) 5’-cctggtccccaaaagaaatggaggcaatagg-3’ TNFα(-308)R引物(序列號293) 5’-ccactgactgatttgtgtgtaggaccctgg-3’ 這些結果示于圖2。圖2為表示伴隨溫度上升的螢光強度變化的Tm分析圖。在圖2中，(A)為試樣1的結果，(B)為試樣2的結果，上面部分表示IL-10(-592)多態(tài)性的結果，中間部分表示FCGR2A多態(tài)性的結果，下面部分表示TNFα(-308)多態(tài)性的結果。
本實施例中，使用與有義鏈IL-10(-592)多態(tài)性(a)完全匹配的探針作為IL-10(-592)探針，使用與有義鏈FCGR2A多態(tài)性(t)完全匹配的探針作為FCGR2A探針，使用與有義鏈TNFα(-308)多態(tài)性(g)完全匹配的探針作為TNFα(-308)探針。其結果是，在IL-10(-592)多態(tài)性的檢測中，如圖2的上面部分所示，雜合體(C/A)的試樣1在表示完全匹配的58.0℃和表示1個堿基錯配的50.0℃處出現(xiàn)峰。而且，在FCGR2A多態(tài)性的檢測中，如圖2的中間部分所示，雜合體(C/T)的試樣1在表示完全匹配的57.0℃和表示1個堿基錯配的48.0℃處出現(xiàn)峰。而且，在TNFα(-308)多態(tài)性的檢測中，如圖2的下面部分所示，純合體(G/G)的試樣1僅在表示完全匹配的61.0℃處出現(xiàn)峰，純合體(A/A)的試樣2僅在表示1個堿基錯配的49.0℃處出現(xiàn)峰。根據(jù)此結果可知，通過本發(fā)明的探針可以充分判斷與檢測對象序列雜交的是完全匹配還是錯配，而且可以在一個反應體系中判斷三種多態(tài)性。
[實施例3] IL-10(-1082)多態(tài)性及IL-10(-3575)多態(tài)性的檢測 使用本發(fā)明的探針，通過Tm分析，檢測IL-10(-1082)多態(tài)性及IL-10(-3575)多態(tài)性。
從IL-10(-1082)多態(tài)性及IL-10(-3575)多態(tài)性為已知的1名健康者中，通過EDTA采血管采集血液(試樣1)。并且，使用商品名GFX Genomic Blood DNA Purification kit(GEHealthcare Bio-Science社制)，純化IL-10(-1082)多態(tài)性和IL-10(-3575)多態(tài)性為已知的基因組，將其稀釋10倍作為試樣2。而且，準備IL-10(-3575)多態(tài)性為純合體(A/A)的合成DNA(試樣3)。各試樣的IL-10(-1082)多態(tài)性及IL-10(-3575)多態(tài)性分別如下。
IL-10(-1082)多態(tài)性 (-3575)多態(tài)性 試樣1A/AT/T 試樣2A/GT/T 試樣3- A/A 將10μL的試樣1與70μL的前述試樣稀釋液1混合，將混合液10μL再與70μL前述試樣稀釋液2混合。將該混合液17μL于95℃加熱10分鐘后，添加到46μL下述PCR反應液中進行PCR。另一方面，將1μL的試樣2或1μL的試樣3(3.5pg)分別添加到46μL下述PCR反應液中，進行PCR。前述PCR反應，通過熱循環(huán)儀于95℃處理60秒后，以95℃下1秒及64℃下15秒作為1個循環(huán)，重復進行50個循環(huán)，再進行95℃下1秒、40℃下60秒的處理。而且，繼續(xù)將溫度上升速度設為1℃/3秒，將前述PCR反應液由40℃逐漸加熱到75℃，測定經(jīng)時的螢光強度的變化(波長515～555nm、585～700nm)。
[表19] (PCR反應液單位μL) 蒸餾水 20.27 10％NaN30.23 20％BSA 0.5 50％丙三醇 10 10×Gene Taq緩沖液* 5 2.5mmol/L dNTPs 4 100mmol/L MgCl2 0.25 5μmol/L IL-10(-1082)探針 2 100μmol/L IL-10(-1082)F引物 0.5 100μmol/L IL-10(-1082)R引物 0.25 5μmol/L IL-10(-3757)探針 2 100μmol/L IL-10(-3757)F引物 0.25 100μmol/L IL-10(-3757)R引物 0.5 5U/μLGene Taq FP*0.25 總計46μL *商品名Gene Taq FPNIPPON GENE公司制 IL-10(-1082)探針(序列號47) 5’-(BODIPY FL)-ccctacttccccCtccc-P-3’ IL-10(-1082)F引物(序列號213) 5’-ccgcaacccaactggctctccttac-3’ IL-10(-1082)R引物(序列號227) 5’-ggattccatggaggctggataggaggtcc-3’ IL-10(-3575)探針(序列號57) 5’-(TAMRA)-cccactggaaaaatTcattt-P-3’ IL-10(-3575)F引物(序列號244) 5’-ggatggaagaagagaggtattccccttcccac-3’ IL-10(-3575)R引物(序列號260) 5’-ccagtttgccctcaagcccagatgc-3’ 這些結果示于圖3。圖3為表示伴隨溫度上升的螢光強度變化的Tm分析圖。在圖3中，(A)為試樣1的結果，(B)為試樣2的結果，(C)為試樣3的結果，上面部分表示IL-10(-1082)多態(tài)性的結果，下面部分表示IL-10(-3575)多態(tài)性的結果。
本實施例中，使用與有義鏈的IL-10(-1082)多態(tài)性(g)完全匹配的探針作為IL-10(-1082)探針。使用與反義鏈的IL-10(-3575)多態(tài)性(a)完全匹配的探針作為IL-10(-3575)探針。這和與有義鏈的IL-10(-3575)多態(tài)性(t)完全匹配的含義相同。其結果是，在IL-10(-1082)多態(tài)性的檢測中，如圖3的上面部分所示，純合體(A/A)的試樣1僅在表示錯配的49.0℃處出現(xiàn)峰，另一方面，雜合體(A/G)的試樣2在表示完全匹配的60.0℃和表示1個堿基錯配的49.0℃處出現(xiàn)峰。而且，在IL-10(-3575)多態(tài)性的檢測中，如圖3的下面部分所示，純合體(T/T)的試樣1及2僅在表示完全匹配的56.0℃處出現(xiàn)峰，純合體(A/A)的試樣3僅在表示錯配的49.0℃處出現(xiàn)峰。根據(jù)此結果可知，通過本發(fā)明的探針可以充分判斷與檢測對象序列雜交的是完全匹配還是錯配，而且可以在一個反應體系中判斷兩種多態(tài)性。
根據(jù)以上結果可知，通過本發(fā)明的探針可以充分判斷與檢測對象序列雜交的是完全匹配還是錯配。因此，根據(jù)本發(fā)明，例如，可以高精確度地判斷檢測目標位點是多態(tài)性(X)還是多態(tài)性(Y)。而且，由于這樣可以判斷完全匹配和錯配，因此例如可以判斷出檢測目標的多態(tài)性是純合體(X/X或Y/Y)還是雜合體(X/Y)，進而還可以判斷是X/X的純合體還是Y/Y的純合體。另外，還可以在一個反應體系中判斷兩種以上的多態(tài)性。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性 如上所述，根據(jù)本發(fā)明，就免疫相關基因FCGR3A基因、FCGR2A基因、IL-10基因、TNFα基因及TNFβ基因而言，即使為僅一個堿基不同的多態(tài)性也可以判斷。因此，例如通過在Tm分析等中使用本發(fā)明的探針，可以簡便地檢測多態(tài)性。而且，根據(jù)本發(fā)明，即使使兩種以上的探針共存于一個反應體系中，也可以判斷其分別對應的基因的多態(tài)性。因此，可以使用一個反應體系進行多個多態(tài)性的檢測。這樣一來，根據(jù)本發(fā)明可以容易地判斷免疫相關基因的多態(tài)性，例如，還可以將檢測結果反映到前述那樣的抗體藥物的治療給藥中。因此，可以說本發(fā)明在醫(yī)療領域等方面極為有用。
序列表
<110>愛科來株式會社(ARKRAY Inc.)
<120>免疫相關基因的多態(tài)性的檢測用探針及其用途
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<160>349
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>401
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
tgttgctcca ggcccctcgg tgggtgttca aggaggaaga ccctattcac ctgaggtgtc 60
acagctggaa gaacactgct ctgcataagg tcacatattt acagaatggc aaaggcagga 120
agtattttca tcataattct gacttctaca ttccaaaagc cacactcaaa gacagcggct 180
cctacttctg cagggggctt kttgggagta aaaatgtgtc ttcagagact gtgaacatca 240
ccatcactca aggtgagaca tgtgccaccc tggaatgccc agggacgcct gtgtgtggaa 300
cctgcaatca cactgggaag ttgagttggg aggagattcc tgattcttac acgcacttct 360
tcatatgtgg ttccctcctg gtgatcacca ggaggtcccc a 401
<210>2
<211>501
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
acctccatgt aggcccatgt gacctcagcc cttgtccatc ccctcttctc ccctccctac 60
atcttggcag actccccata ccttggacag tgatggtcac aggcttggat gagaacagcg 120
tgtagcctat gtttcctgtg cagtggtaat caccactgtg actgtggttt gcttgtggga 180
tggagaaggt gggatccaaa ygggagaatt tctgggattt tccattctgg aagaatgtga 240
ccttgaccag aggcttgtcc ttccagctgt ggcacctcag catgatggtt tctccctcct 300
ggaactccag gtgaggggtc tggagcacca gccattctga aagacacaaa tatgataaga 360
aaaagttgta aggatagatt ccaagggttt ttcagtctca gaggtacgtt actcacagaa 420
cttgacatga tgtctggcag acagaaatga agatgcttca tgacagatgt gagcattctc 480
ttataggcaa tatatggtat t501
<210>3
<211>601
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
gagatggtgt acagtagggt gaggaaacca aattctcagt tggcactggt gtacccttgt 60
acaggtgatg taacatctct gtgcctcagt ttgctcacta taaaatagag acggtagggg 120
tcatggtgag cactacctga ctagcatata agaagctttc agcaagtgca gactactctt 180
acccacttcc cccaagcaca gttggggtgg gggacagctg aagaggtgga aacatgtgcc 240
tgagaatcct aatgaaatcg gggtaaagga gcctggaaca catcctgtga ccccgcctgt 300
mctgtaggaa gccagtctct ggaaagtaaa atggaagggc tgcttgggaa ctttgaggat 360
atttagccca ccccctcatt tttacttggg gaaactaagg cccagagacc taaggtgact 420
gcctaagtta gcaaggagaa gtcttgggta ttcatcccag gttgggggga cccaattatt 480
tctcaatccc attgtattct ggaatgggca atttgtccac gtcactgtga cctaggaaca 540
cgcgaatgag aacccacagc tgagggcctc tgcgcacaga acagctgttc tccccaggaa 600
a 601
<210>4
<211>801
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
ccttccccag gtagagcaac actcctcgcc gcaacccaac tggctcccct taccttctac 60
acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acaaatccaa gacaacacta 120
ctaaggcttc tttgggaagg ggaagtaggg ataggtaaga ggaaagtaag ggacctccta 180
tccagcctcc atggaatcct gacttctttt ccttgttatt tcaacttctt ccaccccatc 240
ttttaaactt tagactccag ccacagaagc ttacaactaa aagaaactct aaggccaatt 300
taatccaagg tttcattcta tgtgctggag atggtgtaca gtagggtgag gaaaccaaat 360
tctcagttgg cactggtgta cccttgtaca ggtgatgtaa yatctctgtg cctcagtttg 420
ctcactataa aatagagacg gtaggggtca tggtgagcac tacctgacta gcatataaga 480
agctttcagc aagtgcagac tactcttacc cacttccccc aagcacagtt ggggtggggg 540
acagctgaag aggtggaaac atgtgcctga gaatcctaat gaaatcgggg taaaggagcc 600
tggaacacat cctgtgaccc cgcctgtact gtaggaagcc agtctctgga aagtaaaatg 660
gaagggctgc ttgggaactt tgaggatatt tagcccaccc cctcattttt acttggggaa 720
actaaggccc agagacctaa ggtgactgcc taagttagca aggagaagtc ttgggtattc 780
atcccaggtt ggggggaccc a801
<210>5
<211>913
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>misc_feature
<222>(800)..(899)
<223>n表示任意堿基
<220>
<221>misc_feature
<222>(226)..(227)
<223>n表示任意堿基
<400>5
tcaatgctcc ctggcaggca ggaggacagg tgctattgcc ctgttgggac agatgaaaaa 60
cagacacagg gaggatgagt gatttgccct gactatagag tggcagggcc aaggcagagc 120
ccaggcctcc tgcacctagg tcagtgttcc tcccagttac agtctaaact ggaatggcag 180
gcaaagcccc tgtggaaggg gaaggtgaag ctcaaatcaa agctcnncca gagactttcc 240
agatatctga agaagtcctg atgtcactgc cccggtcctt ccccaggtag agcaacactc 300
ctcgccgcaa cccaactggc tctccttact ttctacacac acacacacac acacacacac 360
acacacacac acacacacaa atccaagaca acactactaa ggcttctttg ggarggggaa 420
gtagggatag gtaagaggaa agtaagggac ctcctatcca gcctccatgg aatcctgact 480
tcttttcctt gttatttcaa cttcttccac cccatctttt aaactttaga ctccagccac 540
agaagcttac aactaaaaga aactctaagg ccaatttaat ccaaggtttc attctatgtg 600
ctggagatgg tgtacagtag ggtgaggaaa ccaaattctc agttggcact ggtgtaccct 660
tgtacaggtg atgtaatatc tctgtgcctc agtttgctca ctataaaata gagacggtag 720
gggtcatggt gagcactacc tgactagcat ataagaagtt tcagcaagtg ggggatcctc 780
tagagtcgcg acctcagcan nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 840
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnng 900
gattttggat tca 913
<210>6
<211>465
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>6
gagtgagaca gaaaataaaa tacaaccccc tcttttaawa gccatgctta ctcaggtttt 60
ccttcatttg cagctaaata cagaaatgag agaatatttt ggagcaggga tggaagaaga 120
gaggtattcc ccttcccaca awcttctgat ttcccagtac atcccccact ggaaaaatwc 180
atttaaaatc agtataataa gcattgattr gatgcctact atgcatctgg gcttgagggc 240
aaactggact caggcctttt ggcctcaaga agctcacagt gtgagagtgg catttgtgtc 300
ctcttgaaat tcacaggact aaattgtgcc caggctgaca ttctatccat ccataggtgc 360
ctgccttctc acttccctct cttcatgggc tcttgccttg taccaaaatc caaacccaaa 420
tctcctcaca tgtgagtgtt ggcattcatg tctcagacat gacct 465
<210>7
<211>801
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>7
ttccttggaa gccaagactg aaaccagcat tatgagtctc cgggtcagaa tgaaagaaga 60
aggcctgccc cagtggggtc tgtgaattcc cgggggtgat ttcactcccc ggggctgtcc 120
caggcttgtc cctgctaccc ccacccagcc tttcctgagg cctcaagcct gccaccaagc 180
ccccagctcc ttctccccgc agggacccaa acacaggcct caggactcaa cacagctttt 240
ccctccaacc ccgttttctc tccctcaagg actcagcttt ctgaagcccc tcccagttct 300
agttctatct ttttcctgca tcctgtctgg aagttagaag gaaacagacc acagacctgg 360
tccccaaaag aaatggaggc aataggtttt gaggggcatg rggacggggt tcagcctcca 420
gggtcctaca cacaaatcag tcagtggccc agaagacccc cctcggaatc ggagcaggga 480
ggatggggag tgtgaggggt atccttgatg cttgtgtgtc cccaactttc caaatccccg 540
cccccgcgat ggagaagaaa ccgagacaga aggtgcaggg cccactaccg cttcctccag 600
atgagctcat gggtttctcc accaaggaag ttttccgctg gttgaatgat tctttccccg 660
ccctcctctc gccccaggga catataaagg cagttgttgg cacacccagc cagcagacgc 720
tccctcagca aggacagcag aggaccagct aagagggaga gaagcaacta cagacccccc 780
ctgaaaacaa ccctcagacg c801
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>8
ttttactccc aaaaagcccc c 21
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>9
tttactccca aaaagccccc 20
<210>10
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>10
ttactcccaa aaagccccc19
<210>11
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>11
tactcccaaa aagccccc 18
<210>12
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>12
actcccaaaa agccccc 17
<210>13
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>13
ctcccaaaaa gccccc 16
<210>14
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>14
tcccaaaaag ccccc15
<210>15
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>15
cccaaaaagc cccc 14
<210>16
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>16
ccaaaaagcc ccc 13
<210>17
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>17
cagaaattct cccatttgga tccc 24
<210>18
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>探針
<400>18
agaaattctc ccatttggat ccc23
<210>19
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>19
gaaattctcc catttggatc cc 22
<210>20
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>20
aaattctccc atttggatcc c 21
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>21
aattctccca tttggatccc 20
<210>22
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>22
attctcccat ttggatccc 19
<210>23
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>探針
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ttctcccatt tggatccc 18
<210>24
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>24
tctcccattt ggatccc17
<210>25
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>25
ctcccatttg gatccc 16
<210>26
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>26
tcccatttgg atccc15
<210>27
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>27
cttcctacag tacaggcggg g 21
<210>28
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>28
cttcctacag tacaggcggg 20
<210>29
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>29
cttcctacag tacaggcgg 19
<210>30
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>30
cttcctacag tacaggcg 18
<210>31
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
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cttcctacag tacaggc17
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<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>32
cttcctacag tacagg 16
<210>33
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>33
ggcacagaga tgttacatca cc 22
<210>34
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>34
gcacagagat gttacatcac c21
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>35
cacagagatg ttacatcacc 20
<210>36
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>36
acagagatgt tacatcacc19
<210>37
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>37
cagagatgtt acatcacc 18
<210>38
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>38
agagatgtta catcacc 17
<210>39
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>39
gagatgttac atcacc 16
<210>40
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>40
ccctacttcc ccctcccaaa gaag 24
<210>41
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>41
ccctacttcc ccctcccaaa gaa 23
<210>42
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>42
ccctacttcc ccctcccaaa ga 22
<210>43
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<210>44
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>44
ccctacttcc ccctcccaaa 20
<210>45
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>45
ccctacttcc ccctcccaa 19
<210>46
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>46
ccctacttcc ccctccca18
<210>47
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>47
ccctacttcc ccctccc17
<210>48
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>48
ccctacttcc ccctcc 16
<210>49
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>49
ccctacttcc ccctc 15
<210>50
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>50
cccactggaa aaattcattt aaaatca 27
<210>51
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>51
cccactggaa aaattcattt aaaatc 26
<210>52
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>52
cccactggaa aaattcattt aaaat 25
<210>53
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>53
cccactggaa aaattcattt aaaa24
<210>54
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>54
cccactggaa aaattcattt aaa 23
<210>55
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>55
cccactggaa aaattcattt aa22
<210>56
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>56
cccactggaa aaattcattt a 21
<210>57
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>57
cccactggaa aaattcattt 20
<210>58
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>58
cccactggaa aaattcatt19
<210>59
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>59
cccactggaa aaattcat 18
<210>60
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>60
cccactggaa aaattca 17
<210>61
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>61
cccactggaa aaattc 16
<210>62
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>62
ccccgtcccc atgccc 16
<210>63
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>63
cccgtcccca tgccc 15
<210>64
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>64
ccgtccccat gccc14
<210>65
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>65
cgtccccatg ccc13
<210>66
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>66
gtccccatgc cc 12
<210>67
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>67
tcatcataat tctgacttct acattccaaa agccacactc aaagac46
<210>68
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>68
catcataatt ctgacttcta cattccaaaa gccacactca aagac 45
<210>69
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>69
atcataattc tgacttctac attccaaaag ccacactcaa agac 44
<210>70
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>70
tcataattct gacttctaca ttccaaaagc cacactcaaa gac43
<210>71
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>71
cataattctg acttctacat tccaaaagcc acactcaaag ac 42
<210>72
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>72
ataattctga cttctacatt ccaaaagcca cactcaaaga c 41
<210>73
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>73
taattctgac ttctacattc caaaagccac actcaaagac40
<210>74
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>74
aattctgact tctacattcc aaaagccaca ctcaaagac 39
<210>75
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>75
attctgactt ctacattcca aaagccacac tcaaagac 38
<210>76
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>76
ttctgacttc tacattccaa aagccacact caaagac 37
<210>77
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>77
tctgacttct acattccaaa agccacactc aaagac36
<210>78
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>78
ctgacttcta cattccaaaa gccacactca aagac 35
<210>79
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>79
tgacttctac attccaaaag ccacactcaa agac 34
<210>80
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>80
gacttctaca ttccaaaagc cacactcaaa gac 33
<210>81
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>81
acttctacat tccaaaagcc acactcaaag ac32
<210>82
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>82
cttctacatt ccaaaagcca cactcaaaga c 31
<210>83
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>83
ttctacattc caaaagccac actcaaagac 30
<210>84
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>84
tctacattcc aaaagccaca ctcaaagac29
<210>85
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>85
ctacattcca aaagccacac tcaaagac 28
<210>86
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>86
tacattccaa aagccacact caaagac 27
<210>87
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>87
aatcaggaat ctcctcccaa ctcaacttcc cagtgtgat 39
<210>88
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>88
atcaggaatc tcctcccaac tcaacttccc agtgtgat 38
<210>89
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>89
tcaggaatct cctcccaact caacttccca gtgtgat 37
<210>90
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>90
caggaatctc ctcccaactc aacttcccag tgtgat36
<210>91
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>91
aggaatctcc tcccaactca acttcccagt gtgat35
<210>92
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>92
ggaatctcct cccaactcaa cttcccagtg tgat 34
<210>93
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>93
gaatctcctc ccaactcaac ttcccagtgt gat 33
<210>94
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>94
aatctcctcc caactcaact tcccagtgtg at 32
<210>95
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>95
atctcctccc aactcaactt cccagtgtga t 31
<210>96
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>96
tctcctccca actcaacttc ccagtgtgat 30
<210>97
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>97
ctcctcccaa ctcaacttcc cagtgtgat29
<210>98
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>98
tcctcccaac tcaacttccc agtgtgat 28
<210>99
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>99
cctcccaact caacttccca gtgtgat 27
<210>100
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>100
ctcccaactc aacttcccag tgtgat 26
<210>101
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>101
tcccaactca acttcccagt gtgat25
<210>102
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>102
cccaactcaa cttcccagtg tgat24
<210>103
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>103
ccaactcaac ttcccagtgt gat 23
<210>104
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>104
cctctggtca aggtcacatt cttccagaat ggaaaatccc agaaattc 48
<210>105
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>105
ctctggtcaa ggtcacattc ttccagaatg gaaaatccca gaaattc 47
<210>106
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>106
tctggtcaag gtcacattct tccagaatgg aaaatcccag aaattc 46
<210>107
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>107
ctggtcaagg tcacattctt ccagaatgga aaatcccaga aattc 45
<210>108
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>108
tggtcaaggt cacattcttc cagaatggaa aatcccagaa attc 44
<210>109
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>109
ggtcaaggtc acattcttcc agaatggaaa atcccagaaa ttc43
<210>110
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>110
gtcaaggtca cattcttcca gaatggaaaa tcccagaaat tc 42
<210>111
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>111
tcaaggtcac attcttccag aatggaaaat cccagaaatt c 41
<210>112
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>112
caaggtcaca ttcttccaga atggaaaatc ccagaaattc40
<210>113
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>113
aaggtcacat tcttccagaa tggaaaatcc cagaaattc 39
<210>114
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>114
aggtcacatt cttccagaat ggaaaatccc agaaattc 38
<210>115
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>115
ggtcacattc ttccagaatg gaaaatccca gaaattc 37
<210>116
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>116
gtcacattct tccagaatgg aaaatcccag aaattc36
<210>117
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>117
tcacattctt ccagaatgga aaatcccaga aattc 35
<210>118
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>118
cacattcttc cagaatggaa aatcccagaa attc 34
<210>119
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>119
acattcttcc agaatggaaa atcccagaaa ttc 33
<210>120
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>120
cattcttcca gaatggaaaa tcccagaaat tc 32
<210>121
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>121
attcttccag aatggaaaat cccagaaatt c31
<210>122
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>122
accactgtga ctgtggtttg cttgtgggat ggagaagg 38
<210>123
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>123
ccactgtgac tgtggtttgc ttgtgggatg gagaagg 37
<210>124
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>124
cactgtgact gtggtttgct tgtgggatgg agaagg36
<210>125
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>125
actgtgactg tggtttgctt gtgggatgga gaagg 35
<210>126
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>126
ctgtgactgt ggtttgcttg tgggatggag aagg 34
<210>127
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>127
tgtgactgtg gtttgcttgt gggatggaga agg 33
<210>128
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>128
gtgactgtgg tttgcttgtg ggatggagaa gg32
<210>129
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>129
tgactgtggt ttgcttgtgg gatggagaag g 31
<210>130
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>130
gactgtggtt tgcttgtggg atggagaagg 30
<210>131
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>131
actgtggttt gcttgtggga tggagaagg29
<210>132
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>132
ctgtggtttg cttgtgggat ggagaagg 28
<210>133
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>133
tgtggtttgc ttgtgggatg gagaagg 27
<210>134
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>134
gtggtttgct tgtgggatgg agaagg 26
<210>135
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>135
tggtttgctt gtgggatgga gaagg25
<210>136
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>136
ggtttgcttg tgggatggag aagg 24
<210>137
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>137
gtttgcttgt gggatggaga agg 23
<210>138
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>138
atgaaatcgg ggtaaaggag cctggaacac atcctgtgac40
<210>139
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>139
tgaaatcggg gtaaaggagc ctggaacaca tcctgtgac 39
<210>140
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>140
gaaatcgggg taaaggagcc tggaacacat cctgtgac 38
<210>141
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>141
aaatcggggt aaaggagcct ggaacacatc ctgtgac 37
<210>142
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>142
aatcggggta aaggagcctg gaacacatcc tgtgac36
<210>143
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>143
atcggggtaa aggagcctgg aacacatcct gtgac 35
<210>144
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>144
tcggggtaaa ggagcctgga acacatcctg tgac 34
<210>145
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>145
cggggtaaag gagcctggaa cacatcctgt gac 33
<210>146
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>146
ggggtaaagg agcctggaac acatcctgtg ac32
<210>147
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>147
gggtaaagga gcctggaaca catcctgtga c 31
<210>148
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>148
ggtaaaggag cctggaacac atcctgtgac 30
<210>149
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>149
gtaaaggagc ctggaacaca tcctgtgac29
<210>150
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>150
taaaggagcc tggaacacat cctgtgac 28
<210>151
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>151
aaaggagcct ggaacacatc ctgtgac 27
<210>152
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>152
aaggagcctg gaacacatcc tgtgac26
<210>153
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>153
aggagcctgg aacacatcct gtgac25
<210>154
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>154
aggagcctgg aacacatcct gtgac25
<210>155
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>155
ggagcctgga acacatcctg tgac 24
<210>156
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>156
gagcctggaa cacatcctgt gac 23
<210>157
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>157
gttcccaagc agcccttcca ttttactttc cagagactgg c 41
<210>158
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>158
ttcccaagca gcccttccat tttactttcc agagactggc40
<210>159
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>159
tcccaagcag cccttccatt ttactttcca gagactggc 39
<210>160
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>160
cccaagcagc ccttccattt tactttccag agactggc 38
<210>161
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>161
ccaagcagcc cttccatttt actttccaga gactggc 37
<210>162
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>162
caagcagccc ttccatttta ctttccagag actggc36
<210>163
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>163
aagcagccct tccattttac tttccagaga ctggc 35
<210>164
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>164
agcagccctt ccattttact ttccagagac tggc 34
<210>165
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>165
gcagcccttc cattttactt tccagagact ggc 33
<210>166
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>166
cagcccttcc attttacttt ccagagactg gc 32
<210>167
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>167
agcccttcca ttttactttc cagagactgg c31
<210>168
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>168
gcccttccat tttactttcc agagactggc 30
<210>169
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>169
cccttccatt ttactttcca gagactggc29
<210>170
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>170
ccttccattt tactttccag agactggc 28
<210>171
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>171
cttccatttt actttccaga gactggc 27
<210>172
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>172
tcattctatg tgctggagat ggtgtacagt agggtgagg 39
<210>173
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>173
cattctatgt gctggagatg gtgtacagta gggtgagg 38
<210>174
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>174
attctatgtg ctggagatgg tgtacagtag ggtgagg 37
<210>175
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>175
ttctatgtgc tggagatggt gtacagtagg gtgagg36
<210>176
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>176
tctatgtgct ggagatggtg tacagtaggg tgagg 35
<210>177
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>177
ctatgtgctg gagatggtgt acagtagggt gagg 34
<210>178
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>178
tatgtgctgg agatggtgta cagtagggtg agg 33
<210>179
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>179
atgtgctgga gatggtgtac agtagggtga gg32
<210>180
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>180
tgtgctggag atggtgtaca gtagggtgag g 31
<210>181
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>181
gtgctggaga tggtgtacag tagggtgagg 30
<210>182
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>182
tgctggagat ggtgtacagt agggtgagg29
<210>183
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>183
gctggagatg gtgtacagta gggtgagg 28
<210>184
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>184
ctggagatgg tgtacagtag ggtgagg 27
<210>185
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>185
tggagatggt gtacagtagg gtgagg 26
<210>186
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>186
ggagatggtg tacagtaggg tgagg25
<210>187
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>187
gagatggtgt acagtagggt gagg 24
<210>188
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>188
aggtagtgct caccatgacc cctaccgtct ctattttata gtgagc 46
<210>189
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>189
ggtagtgctc accatgaccc ctaccgtctc tattttatag tgagc 45
<210>190
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>190
gtagtgctca ccatgacccc taccgtctct attttatagt gagc 44
<210>191
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>191
tagtgctcac catgacccct accgtctcta ttttatagtg agc 43
<210>192
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>192
agtgctcacc atgaccccta ccgtctctat tttatagtga gc42
<210>193
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>193
gtgctcacca tgacccctac cgtctctatt ttatagtgag c 41
<210>194
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>194
tgctcaccat gacccctacc gtctctattt tatagtgagc40
<210>195
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>195
gctcaccatg acccctaccg tctctatttt atagtgagc 39
<210>196
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>196
ctcaccatga cccctaccgt ctctatttta tagtgagc 38
<210>197
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>197
tcaccatgac ccctaccgtc tctattttat agtgagc 37
<210>198
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>198
caccatgacc cctaccgtct ctattttata gtgagc36
<210>199
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>199
accatgaccc ctaccgtctc tattttatag tgagc 35
<210>200
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>200
ccatgacccc taccgtctct attttatagt gagc 34
<210>201
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>201
catgacccct accgtctcta ttttatagtg agc 33
<210>202
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>202
atgaccccta ccgtctctat tttatagtga gc32
<210>203
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>203
tgacccctac cgtctctatt ttatagtgag c 31
<210>204
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>204
gacccctacc gtctctattt tatagtgagc 30
<210>205
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>205
acccctaccg tctctatttt atagtgagc29
<210>206
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>206
ctcctcgccg caacccaact ggctctcctt ac32
<210>207
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>207
tcctcgccgc aacccaactg gctctcctta c 31
<210>208
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>208
cctcgccgca acccaactgg ctctccttac 30
<210>209
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>209
ctcgccgcaa cccaactggc tctccttac29
<210>210
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>210
tcgccgcaac ccaactggct ctccttac 28
<210>211
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>211
cgccgcaacc caactggctc tccttac 27
<210>212
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>212
gccgcaaccc aactggctct ccttac 26
<210>213
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>213
ccgcaaccca actggctctc cttac 25
<210>214
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>214
cgcaacccaa ctggctctcc ttac24
<210>215
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>215
gcaacccaac tggctctcct tac 23
<210>216
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>216
caacccaact ggctctcctt ac 22
<210>217
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>217
aaagaagtca ggattccatg gaggctggat aggaggtcc 39
<210>218
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>218
aagaagtcag gattccatgg aggctggata ggaggtcc 38
<210>219
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>219
agaagtcagg attccatgga ggctggatag gaggtcc 37
<210>220
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>220
gaagtcagga ttccatggag gctggatagg aggtcc 36
<210>221
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>221
aagtcaggat tccatggagg ctggatagga ggtcc35
<210>222
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>222
agtcaggatt ccatggaggc tggataggag gtcc 34
<210>223
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>223
gtcaggattc catggaggct ggataggagg tcc 33
<210>224
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>224
tcaggattcc atggaggctg gataggaggt cc32
<210>225
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>225
caggattcca tggaggctgg ataggaggtc c 31
<210>226
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>226
aggattccat ggaggctgga taggaggtcc 30
<210>227
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>227
ggattccatg gaggctggat aggaggtcc29
<210>228
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>228
gattccatgg aggctggata ggaggtcc 28
<210>229
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>229
attccatgga ggctggatag gaggtcc 27
<210>230
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>230
ttccatggag gctggatagg aggtcc 26
<210>231
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>231
tccatggagg ctggatagga ggtcc25
<210>232
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>232
ccatggaggc tggataggag gtcc 24
<210>233
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>233
catggaggct ggataggagg tcc 23
<210>234
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>234
agaggagcag ggatggaaga agagaggtat tccccttccc ac 42
<210>235
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>235
gaggagcagg gatggaagaa gagaggtatt ccccttccca c 41
<210>236
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>236
aggagcaggg atggaagaag agaggtattc cccttcccac40
<210>237
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>237
ggagcaggga tggaagaaga gaggtattcc ccttcccac 39
<210>238
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>238
gagcagggat ggaagaagag aggtattccc cttcccac 38
<210>239
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>239
agcagggatg gaagaagaga ggtattcccc ttcccac 37
<210>240
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>240
gcagggatgg aagaagagag gtattcccct tcccac36
<210>241
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>241
cagggatgga agaagagagg tattcccctt cccac 35
<210>242
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>242
agggatggaa gaagagaggt attccccttc ccac 34
<210>243
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>243
gggatggaag aagagaggta ttccccttcc cac 33
<210>244
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>244
ggatggaaga agagaggtat tccccttccc ac32
<210>245
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>245
gatggaagaa gagaggtatt ccccttccca c 31
<210>246
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>246
atggaagaag agaggtattc cccttcccac 30
<210>247
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>247
tggaagaaga gaggtattcc ccttcccac29
<210>248
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>248
ggaagaagag aggtattccc cttcccac 28
<210>249
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>249
gaagaagaga ggtattcccc ttcccac 27
<210>250
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>250
aagaagagag gtattcccct tcccac 26
<210>251
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>251
agaagagagg tattcccctt cccac 25
<210>252
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>252
gcctgagtcc agtttgccct caagcccaga tgc 33
<210>253
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>253
cctgagtcca gtttgccctc aagcccagat gc32
<210>254
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>254
ctgagtccag tttgccctca agcccagatg c 31
<210>255
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>255
tgagtccagt ttgccctcaa gcccagatgc 30
<210>256
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>256
gagtccagtt tgccctcaag cccagatgc29
<210>257
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>257
agtccagttt gccctcaagc ccagatgc 28
<210>258
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>258
gtccagtttg ccctcaagcc cagatgc 27
<210>259
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>259
tccagtttgc cctcaagccc agatgc 26
<210>260
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>260
ccagtttgcc ctcaagccca gatgc25
<210>261
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>261
cagtttgccc tcaagcccag atgc 24
<210>262
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>262
agtttgccct caagcccaga tgc 23
<210>263
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>263
gtttgccctc aagcccagat gc22
<210>264
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>264
tttgccctca agcccagatg c 21
<210>265
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>265
ttgccctcaa gcccagatgc 20
<210>266
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>266
tgccctcaag cccagatgc19
<210>267
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>267
agaccacaga cctggtcccc aaaagaaatg gaggcaatag g 41
<210>268
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>268
gaccacagac ctggtcccca aaagaaatgg aggcaatagg40
<210>269
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>269
accacagacc tggtccccaa aagaaatgga ggcaatagg 39
<210>270
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>270
ccacagacct ggtccccaaa agaaatggag gcaatagg 38
<210>271
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>271
cacagacctg gtccccaaaa gaaatggagg caatagg 37
<210>272
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>272
acagacctgg tccccaaaag aaatggaggc aatagg36
<210>273
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>273
cagacctggt ccccaaaaga aatggaggca atagg 35
<210>274
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>274
agacctggtc cccaaaagaa atggaggcaa tagg 34
<210>275
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>275
gacctggtcc ccaaaagaaa tggaggcaat agg 33
<210>276
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>276
acctggtccc caaaagaaat ggaggcaata gg 32
<210>277
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>277
cctggtcccc aaaagaaatg gaggcaatag g31
<210>278
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>278
ctggtcccca aaagaaatgg aggcaatagg 30
<210>279
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>279
tggtccccaa aagaaatgga ggcaatagg29
<210>280
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>280
ggtccccaaa agaaatggag gcaatagg 28
<210>281
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>281
gtccccaaaa gaaatggagg caatagg 27
<210>282
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>282
tccccaaaag aaatggaggc aatagg 26
<210>283
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>283
gtcttctggg ccactgactg atttgtgtgt aggaccctgg40
<210>284
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>284
tcttctgggc cactgactga tttgtgtgta ggaccctgg 39
<210>285
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>285
cttctgggcc actgactgat ttgtgtgtag gaccctgg 38
<210>286
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>286
ttctgggcca ctgactgatt tgtgtgtagg accctgg 37
<210>287
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>287
tctgggccac tgactgattt gtgtgtagga ccctgg36
<210>288
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>288
ctgggccact gactgatttg tgtgtaggac cctgg 35
<210>289
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>289
tgggccactg actgatttgt gtgtaggacc ctgg 34
<210>290
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>290
gggccactga ctgatttgtg tgtaggaccc tgg 33
<210>291
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>291
ggccactgac tgatttgtgt gtaggaccct gg32
<210>292
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>292
gccactgact gatttgtgtg taggaccctg g 31
<210>293
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>293
ccactgactg atttgtgtgt aggaccctgg 30
<210>294
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>294
cactgactga tttgtgtgta ggaccctgg29
<210>295
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>295
actgactgat ttgtgtgtag gaccctgg 28
<210>296
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>296
ctgactgatt tgtgtgtagg accctgg 27
<210>297
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>297
tgactgattt gtgtgtagga ccctgg 26
<210>298
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>298
gactgatttg tgtgtaggac cctgg25
<210>299
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>299
actgatttgt gtgtaggacc ctgg 24
<210>300
<211>801
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>300
agggagcccc taggggagaa cagagttgag gggggctcta gggctcaagg tttggctgag 60
ccaccccagc agcccccatt ctcctgctgc ctcacctggg ccccaggcag cagaaccagc 120
agcagcccca gaaggaggag gtgtagggtg gtgccacaca cccttgggag gaagagacgt 180
tcaggtggtg tcatggggag aacctgcaga gaaagagaga gagagagaga gacagtgagc 240
ggggcggggc acgcggcgga agacagacct cccgccctgg gagacagcac cccccgaccc 300
ccgagagaga gatcgacaga gaaggggaca agatgcagtc agagaaaccc caaggtgagc 360
agagggagac agagagagac aggaagggaa cagagaggaa ycatggcaga aacagagaat 420
gtgtgacaga gacaatgaga ctgacagatg gagagtcaga gacagagaag gaaaccaaaa 480
ccaaacccac caaggcccag gcccaggcag gccggggatc caggcagcag gtgcaggagg 540
gaccgaggcc caggcagagg gcaggacact gcggggcggt agtccaaagc acgaagcacg 600
ggcagcccaa ggagatgggg caggagagcc tcacctgctg tgtggagccc ctgggcccgg 660
acgctcaggt ccctttatag aggaagcggc agtggcagcg tggcaggcag cgggcgggtt 720
ctaggtcggg gctggggccc ggggaagccc ccagggctta gaagatactg ctgtttcagt 780
caaaggcagg aaaggctgag g801
<210>301
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>301
tgtttctgcc atggttcctc tc22
<210>302
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>302
gtttctgcca tggttcctct c 21
<210>303
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>303
tttctgccat ggttcctctc 20
<210>304
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>304
ttctgccatg gttcctctc19
<210>305
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>305
tctgccatgg ttcctctc18
<210>306
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>306
ctgccatggt tcctctc 17
<210>307
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>307
tgccatggtt cctctc 16
<210>308
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>308
gccatggttc ctctc 15
<210>309
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>309
tttggtttcc ttctctgtct ctgactctcc atctgtc 37
<210>310
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>310
ttggtttcct tctctgtctc tgactctcca tctgtc36
<210>311
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>311
tggtttcctt ctctgtctct gactctccat ctgtc 35
<210>312
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>312
ggtttccttc tctgtctctg actctccatc tgtc 34
<210>313
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>313
gtttccttct ctgtctctga ctctccatct gtc 33
<210>314
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>314
tttccttctc tgtctctgac tctccatctg tc32
<210>315
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>315
ttccttctct gtctctgact ctccatctgt c 31
<210>316
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>316
tccttctctg tctctgactc tccatctgtc 30
<210>317
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>317
ccttctctgt ctctgactct ccatctgtc29
<210>318
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>318
cttctctgtc tctgactctc catctgtc 28
<210>319
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>319
ttctctgtct ctgactctcc atctgtc 27
<210>320
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>320
tctctgtctc tgactctcca tctgtc 26
<210>321
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>321
ctctgtctct gactctccat ctgtc25
<210>322
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>322
tctgtctctg actctccatc tgtc 24
<210>323
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>323
ctgtctctga ctctccatct gtc 23
<210>324
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>324
tgtctctgac tctccatctg tc22
<210>325
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>325
gtctctgact ctccatctgt c 21
<210>326
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>326
tctctgactc tccatctgtc 20
<210>327
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>327
ctctgactct ccatctgtc 19
<210>328
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>328
tctgactctc catctgtc 18
<210>329
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>329
ctgactctcc atctgtc17
<210>330
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>330
cgacagagaa ggggacaaga tgcagtcaga gaaaccc 37
<210>331
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>331
gacagagaag gggacaagat gcagtcagag aaaccc36
<210>332
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>332
acagagaagg ggacaagatg cagtcagaga aaccc 35
<210>333
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>333
cagagaaggg gacaagatgc agtcagagaa accc 34
<210>334
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>334
agagaagggg acaagatgca gtcagagaaa ccc 33
<210>335
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>335
gagaagggga caagatgcag tcagagaaac cc32
<210>336
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>336
agaaggggac aagatgcagt cagagaaacc c 31
<210>337
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>337
gaaggggaca agatgcagtc agagaaaccc 30
<210>338
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>338
aaggggacaa gatgcagtca gagaaaccc29
<210>339
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>339
aggggacaag atgcagtcag agaaaccc 28
<210>340
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>340
ggggacaaga tgcagtcaga gaaaccc 27
<210>341
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>341
gggacaagat gcagtcagag aaaccc 26
<210>342
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>342
ggacaagatg cagtcagaga aaccc25
<210>343
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>343
gacaagatgc agtcagagaa accc 24
<210>344
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>344
acaagatgca gtcagagaaa ccc 23
<210>345
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>345
caagatgcag tcagagaaac cc 22
<210>346
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>346
aagatgcagt cagagaaacc c 21
<210>347
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>347
agatgcagtc agagaaaccc 20
<210>348
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>348
gatgcagtca gagaaaccc19
<210>349
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>349
atgcagtcag agaaaccc18
權利要求
1.一種多態(tài)性檢測用探針，其特征在于，其為用于檢測免疫相關基因的多態(tài)性的探針，由選自于下述(A)～(H)構成的組中的至少一個寡核苷酸構成
(A)與以序列號1中第193位的鳥嘌呤為第一位堿基，向3’方向直到第13～21位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述鳥嘌呤互補的胞嘧啶為3’末端，
(B)與以序列號2中第191位的鳥嘌呤為第一位堿基，向3’方向直到第15～24位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述鳥嘌呤互補的胞嘧啶為3’末端，
(C)與以序列號3中第311位的鳥嘌呤為第一位堿基，向5’方向直到第16～21位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述鳥嘌呤互補的胞嘧啶為5’末端，
(D)與以序列號4中第391位的鳥嘌呤為第一位堿基，向3’方向直到第16～22位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述鳥嘌呤互補的胞嘧啶為3’末端，
(E)與以序列號5中第426位的鳥嘌呤為第一位堿基，向5’方向直到第15～24位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述鳥嘌呤互補的胞嘧啶為5’末端，
(F)與以序列號6中第165位的胞嘧啶為第一位堿基，向3’方向直到第16～27位堿基的區(qū)域序列相同的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以前述胞嘧啶為5’末端，
(G)與以序列號7中的第394位的鳥嘌呤為第一位堿基，向3，方向直到第12～16位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述鳥嘌呤互補的胞嘧啶為3’末端，
(H)與以序列號300中第393位的鳥嘌呤作為第一位堿基，向3，方向直到第15～22位堿基的區(qū)域互補的至少一個寡核苷酸，該寡核苷酸以與前述鳥嘌呤互補的胞嘧啶為3’末端。
2.根據(jù)權利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，其中前述(A)～(H)的寡核苷酸分別為下述(A1)～(H1)的寡核苷酸
(A1)序列號14的堿基序列構成的寡核苷酸，
(B1)序列號23的堿基序列構成的寡核苷酸，
(C1)序列號30的堿基序列構成的寡核苷酸，
(D1)序列號36的堿基序列構成的寡核苷酸，
(E1)序列號47的堿基序列構成的寡核苷酸，
(F1)序列號57的堿基序列構成的寡核苷酸，
(G1)序列號64的堿基序列構成的寡核苷酸，
(H1)序列號306或序列號307的堿基序列構成的寡核苷酸。
3.根據(jù)權利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，前述探針是用于檢測免疫相關基因FCGR3A基因的多態(tài)性的、由前述(A)的寡核苷酸構成的探針。
4.根據(jù)權利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，前述探針是用于檢測免疫相關基因FCGR2A基因的多態(tài)性的、由前述(B)的寡核苷酸構成的探針。
5.根據(jù)權利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，前述探針是用于檢測免疫相關基因IL-10基因的多態(tài)性的、由選自于前述(C)、(D)、(E)和(F)構成的組中的至少一個寡核苷酸構成的探針。
6.根據(jù)權利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，前述探針是用于檢測免疫相關基因TNFα基因的多態(tài)性的、由前述(G)的寡核苷酸構成的探針。
7.根據(jù)權利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，前述探針是用于檢測免疫相關基因TNFβ基因的多態(tài)性的、由前述(H)的寡核苷酸構成的探針。
8.根據(jù)權利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，前述探針是在前述寡核苷酸上結合了標記物質(zhì)的標記探針。
9.根據(jù)權利要求8所述的多態(tài)性檢測用探針，前述探針是單獨顯示信號且由于形成雜交體而不顯示信號的標記探針，或單獨不顯示信號但由于形成雜交體而顯示信號的標記探針。
10.根據(jù)權利要求8所述的多態(tài)性檢測用探針，前述探針為在前述寡核苷酸上結合了作為前述標記物質(zhì)的螢光色素的標記探針，其單獨顯示螢光且由于形成雜交體而螢光減少。
11.根據(jù)權利要求8所述的多態(tài)性檢測用探針，前述探針是在前述寡核苷酸中具有胞嘧啶的末端核苷酸殘基上結合了前述標記物質(zhì)的標記探針。
12.根據(jù)權利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，前述探針是Tm分析用的探針。
13.一種多態(tài)性檢測用試劑，其特征在于，其為用于檢測免疫相關基因的多態(tài)性的多態(tài)性檢測用試劑，含有權利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針。
14.根據(jù)權利要求13所述的多態(tài)性檢測用試劑，其含有兩種以上的權利要求1所述的前述探針。
15.根據(jù)權利要求14所述的多態(tài)性檢測用試劑，其含有用于檢測FCGR3A基因的多態(tài)性的、由前述(A)的寡核苷酸構成的探針，和用于檢測IL-10基因的多態(tài)性的、由前述(D)的寡核苷酸構成的探針。
16.根據(jù)權利要求14所述的多態(tài)性檢測用試劑，其含有用于檢測FCGR2A基因的多態(tài)性的、由前述(B)的寡核苷酸構成的探針，用于檢測IL-10基因的多態(tài)性的、由前述(C)的寡核苷酸構成的探針，和用于檢測TNFα基因的多態(tài)性的、由前述(G)的寡核苷酸構成的探針。
17.根據(jù)權利要求14所述的多態(tài)性檢測用試劑，其含有用于檢測IL-10基因的多態(tài)性的、由前述(E)的寡核苷酸構成的探針和由前述(F)的寡核苷酸構成的探針。
18.根據(jù)權利要求13所述的多態(tài)性檢測用試劑，其還含有用于擴增前述免疫相關基因中含有檢測目標的多態(tài)性的序列的引物。
19.根據(jù)權利要求18所述的多態(tài)性檢測用試劑，前述探針和引物的組合為選自于以下組合構成的組中的至少一個組合由前述寡核苷酸(A)構成的探針及下述引物對(a)的組合，由前述寡核苷酸(B)構成的探針和下述引物對(b)的組合，由前述寡核苷酸(C)構成的探針和下述引物對(c)的組合，由前述寡核苷酸(D)構成的探針和下述引物對(d)的組合，由前述寡核苷酸(E)構成的探針和下述引物對(e)的組合，由前述寡核苷酸(F)構成的探針和下述引物對(f)的組合，由前述寡核苷酸(G)構成的探針和引物對(g)的組合，以及由前述寡核苷酸(H)構成的探針和下述引物對(h)的組合，
引物對(a)
含有由選自于序列號67～序列號86構成的組中的至少一個堿基序列構成的正向引物、和由選自于序列號87～序列號103構成的組中的至少一個堿基序列構成的反向引物的引物對，
引物對(b)
含有由選自于序列號122～序列號137構成的組中的至少一個堿基序列構成的正向引物、和由選自于序列號104～序列號121構成的組中的至少一個堿基序列構成的反向引物的引物對，
引物對(c)
含有由選自于序列號138～序列號156構成的組中的至少一個堿基序列構成的正向引物、和由選自于序列號157～序列號171構成的組中的至少一個堿基序列構成的反向引物的引物對，
引物對(d)
含有由選自于序列號172～序列號187構成的組中的至少一個堿基序列構成的正向引物、和由選自于序列號188～序列號205構成的組中的至少一個堿基序列構成的反向引物的引物對，
引物對(e)
含有由選自于序列號206～序列號216構成的組中的至少一個堿基序列構成的正向引物、和由選自于序列號217～序列號233構成的組中的至少一個堿基序列構成的反向引物的引物對，
引物對(f)
含有由選自于序列號234～序列號251構成的組中的至少一個堿基序列構成的正向引物、和由選自于序列號252～序列號266構成的組中的至少一個堿基序列構成的反向引物的引物對，
引物對(g)
含有由選自于序列號267～序列號282構成的組中的至少一個堿基序列構成的正向引物、和由選自于序列號283～序列號299構成的組中的至少一個堿基序列構成的反向引物的引物對，
引物對(h)
含有由選自于序列號330～序列號349構成的組中的至少一個堿基序列構成的正向引物、和由選自于序列號309～序列號329構成的組中的至少一個堿基序列構成的反向引物的引物對。
20.根據(jù)權利要求19所述的多態(tài)性檢測用試劑，前述引物對(a)～(h)分別為下述引物對(a1)～(h1)
引物對(a1)
含有由序列號77的堿基序列構成的正向引物和由序列號97的堿基序列構成的反向引物的引物對，
引物對(b1)
含有由序列號132的堿基序列構成的正向引物和由序列號114的堿基序列構成的反向引物的引物對，
引物對(c1)
含有由序列號148的堿基序列構成的正向引物和由序列號167的堿基序列構成的反向引物的引物對，
引物對(d1)
含有由序列號182的堿基序列構成的正向引物和由序列號198的堿基序列構成的反向引物的引物對，
引物對(e1)
含有由序列號213的堿基序列構成的正向引物和由序列號227的堿基序列構成的反向引物的引物對，
引物對(f1)
含有由序列號244的堿基序列構成的正向引物和由序列號260的堿基序列構成的反向引物的引物對，
引物對(g1)
含有由序列號277的堿基序列構成的正向引物和由序列號293的堿基序列構成的反向引物的引物對，
引物對(h1)
含有由序列號337的堿基序列構成的正向引物和由序列號312的堿基序列構成的反向引物的引物對。
21.一種多態(tài)性檢測方法，其特征在于，其為免疫相關基因的多態(tài)性的檢測方法，包括下述(1)～(3)工序
(1)準備反應體系的工序，所述反應體系含有檢測前述多態(tài)性的待測核酸和權利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，
(2)改變前述反應體系的溫度，測定顯示前述待測核酸和前述探針的雜交產(chǎn)物的熔解狀態(tài)的信號值的工序，
(3)根據(jù)伴隨溫度變化的前述信號值的變動，決定前述待測核酸中的前述多態(tài)性的工序。
22.根據(jù)權利要求21所述的多態(tài)性檢測方法，其中，前述(1)工序包括下述(1a)工序
(1a)在含有前述探針的反應體系中，通過核酸擴增法，由模板核酸生成作為前述待測核酸的擴增產(chǎn)物的工序。
23.根據(jù)權利要求22所述的多態(tài)性檢測方法，其中，前述(1a)工序中使用用于擴增前述免疫相關基因中的含有檢測目標的多態(tài)性的序列的引物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種多態(tài)性檢測用探針，其能夠判斷只有一個堿基不同的多態(tài)性。將選自于由序列號4、23、30、47、57和64組成的組中的至少一個寡核苷酸作為Tm分析中的探針使用。通過使用這些探針的Tm分析，能簡便地檢測影響抗體藥物等的藥效的FCGR3A基因、FCGR2A基因、IL-10基因、TNFα基因和TNFβ基因的特定的多態(tài)性。而且，根據(jù)這些探針，通過使兩種以上的前述探針共存于反應體系中，能在同一反應體系中檢測兩種以上的多態(tài)性。
文檔編號C12N15/09GK101652478SQ20088001163
公開日2010年2月17日 申請日期2008年10月3日 優(yōu)先權日2007年10月9日
發(fā)明者平井光春, 間島智史 申請人:愛科來株式會社