專(zhuān)利名稱(chēng)：：具有羧基的酸性物質(zhì)的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有羧基的酸性物質(zhì)的生產(chǎn)方法。L-谷氨酸、L-天冬氨酸作為調(diào)味品原料等有著廣泛的應(yīng)用。琥珀酸作為調(diào)味品、生物降解性塑料的原料等有著廣泛的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：L-谷氨酸主要通過(guò)使用屬于短桿菌屬0S^W&"en'wm)、棒桿菌屬(Cory"e^c/en'wm)、微桿菌屬(M/cra^cfen'wm)的稱(chēng)作棒狀桿菌型纟田菌(coryneformbacteria)的L-谷氨酸生產(chǎn)菌或者它們的突變菌4朱的發(fā)酵方法來(lái)生產(chǎn)(參照例如非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。通過(guò)使用其它菌林的發(fā)酵法來(lái)生產(chǎn)L-谷氨酸的方法已知有使用芽孢桿菌屬(5a"7/w力、鏈霉菌屬(5^印towycM)或青霉屬(尸em'"7/^m)屬等微生物的方法(參照例如專(zhuān)利文獻(xiàn)1),使用假單胞菌屬CPww<io/woway)、節(jié)桿菌屬(JW/zraZac&r)、沙雷氏菌屬(Serraf/a)或4叚絲酵母屬(a^z/^o等微生物的方法(參照例如專(zhuān)利文獻(xiàn)2)，使用芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬或產(chǎn)氣氣桿菌(Jerokz"erawoge"^)(現(xiàn)在名為產(chǎn)氣腸桿菌C&2tera6ac^"aerage"es))等微生物的方法(例如參照專(zhuān)利文獻(xiàn)3),使用大腸桿菌的突變菌抹的方法(參照例如專(zhuān)利文獻(xiàn)4)，等等。此外，還公開(kāi)了使用屬于克雷伯氏菌屬(i:/eZw'e〃a)、歐文氏菌屬(5rvWm'a)、泛菌屬(尸a"/ofe")或腸桿菌屬的微生物的L-谷氨酸生產(chǎn)方法(參照例如專(zhuān)利文獻(xiàn)5~7)。此外，已經(jīng)公開(kāi)了通過(guò)利用重組DNA技術(shù)來(lái)增強(qiáng)L-谷氨酸的生物合成酶的活性，來(lái)增加L-谷氨酸生產(chǎn)能力的各種技術(shù)。例如，有報(bào)道稱(chēng)在棒桿菌屬或短桿菌屬細(xì)菌中，導(dǎo)入編碼大腸桿菌或谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)來(lái)源的檸檬酸合酶的基因?qū)τ谠鰪?qiáng)棒狀桿菌型細(xì)菌的L-谷氨酸生產(chǎn)能力是有效的(參照例如專(zhuān)利文獻(xiàn)8)。此外，有報(bào)道稱(chēng)將棒狀桿菌型細(xì)菌來(lái)源的檸檬酸合酶基因?qū)雽儆谀c桿菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、歐文氏菌屬或埃希氏菌屬的腸桿菌科細(xì)菌，對(duì)增強(qiáng)4L-谷氨酸生產(chǎn)能力是有效的(參照例如專(zhuān)利文獻(xiàn)7)。作為提高氨基酸等目的物質(zhì)生產(chǎn)能力的方法，已知有對(duì)物質(zhì)的攝入系統(tǒng)或排出系統(tǒng)進(jìn)行修飾的方法。作為修飾物質(zhì)的攝入系統(tǒng)的方法，例如已知有通過(guò)缺失或減弱將目的物質(zhì)攝入細(xì)胞的攝入系統(tǒng)，來(lái)提高目的物質(zhì)生產(chǎn)能力的方法。具體地，已知有通過(guò)缺失gluABCD操縱子或其一部分來(lái)缺失或減弱L-谷氨酸向細(xì)胞內(nèi)的攝入，從而提高L-谷氨酸生產(chǎn)能力的方法(參照例如專(zhuān)利文獻(xiàn)9);以及通過(guò)弱化。票呤核香酸向細(xì)胞內(nèi)的攝入，來(lái)強(qiáng)化嘌呤核苷酸生產(chǎn)能力的方法(參照例如專(zhuān)利文獻(xiàn)10)等。另一方面，作為修飾排出系統(tǒng)的方法，已知有強(qiáng)化目的物質(zhì)的排出系統(tǒng)的方法，以及缺損或弱化目的物質(zhì)生物合成系統(tǒng)的中間體或底物的排出系統(tǒng)的方法。作為強(qiáng)化目的物質(zhì)排出系統(tǒng)的方法，已知有例如使用強(qiáng)化了L-賴氨酸排出基因(LysE)的棒桿菌屬細(xì)菌菌抹的L-賴氨酸生產(chǎn)方法(參照例如專(zhuān)利文獻(xiàn)ll)、使用強(qiáng)化了L-谷氨酸排出系統(tǒng)基因(yhfK)的腸桿菌科細(xì)菌的L-谷氨酸生產(chǎn)方法(參照例如專(zhuān)利文獻(xiàn)18)。此外，還報(bào)道了利用被認(rèn)為與L-氨基酸的排出相關(guān)的rhtA,B,C基因的L-氨基酸生產(chǎn)方法(參照例如專(zhuān)利文獻(xiàn)12)。作為對(duì)目的物質(zhì)生物合成系統(tǒng)的中間體或底物的排出系統(tǒng)進(jìn)行缺損等的方法，已知有當(dāng)目的物質(zhì)為L(zhǎng)-谷氨酸時(shí)，通過(guò)突變或破壞2-酮戊二酸通透酶基因，來(lái)弱化目的物質(zhì)的中間體2-酮戊二酸的排出的方法(參照例如專(zhuān)利文獻(xiàn)13)。除此之外，還有人提出將編碼與物質(zhì)的細(xì)胞膜透過(guò)相關(guān)的ATP結(jié)合盒(ATPBindingcassette)超家族(ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體)的基因應(yīng)用于氨基酸的細(xì)胞膜輸送被修飾的微生物的選育(參照例如專(zhuān)利文獻(xiàn)14)。有報(bào)道稱(chēng)，在埃希氏菌屬細(xì)菌中，通過(guò)增強(qiáng)預(yù)想與L-氨基酸的排出相關(guān)的yfiK等基因的表達(dá)，提高了L-谷氨酸的生產(chǎn)效率(參照例如專(zhuān)利文獻(xiàn)15)。此外，有報(bào)道稱(chēng)，通過(guò)增強(qiáng)yhfK基因的表達(dá)也可以提高L-谷氨酸生產(chǎn)能力(例如參照專(zhuān)利文獻(xiàn)18)。此外，在L-谷氨酸的生產(chǎn)方法方面，已知有在酸性條件下培養(yǎng)微生物，在發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸同時(shí)析出L-谷氨酸的方法(參照例如專(zhuān)利文獻(xiàn)16)。在使L-谷氨酸析出的低pH條件下，L-谷氨酸的不帶電荷的游離體的形式的存在比例升高，它們?nèi)菀淄高^(guò)細(xì)胞膜。通常認(rèn)為，L-谷氨酸一旦被攝入細(xì)胞內(nèi)，則會(huì)由于谷氨酸脫氫酶的作用一步轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)CA循環(huán)的中間體2-酮戊二酸，因而被攝入細(xì)胞內(nèi)的L-谷氨酸容易被代謝掉。但是，在L-谷氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)中，使用2-酮戊二酸脫氫酶活性缺損或者降低的腸桿菌屬細(xì)菌等或埃希氏菌屬細(xì)菌(例如專(zhuān)利文獻(xiàn)16、17)，這些微生物不能分解2-酮戊二酸，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)L-谷氨酸濃度上升而抑制生長(zhǎng)，無(wú)法進(jìn)行培養(yǎng)。因此，在上述專(zhuān)利文獻(xiàn)16中，通過(guò)突變處理選育出缺損了2-酮戊二酸脫氬酶活性并且能夠在生產(chǎn)L-谷氨酸的同時(shí)析出L-谷氨酸的菌抹，來(lái)用于L-谷氨酸的生產(chǎn)。在發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸等非氨基有機(jī)酸時(shí)，通常使用厭氧螺菌屬(Anaerobiospirillum)、放線桿菌屬(Actinobacillus)等厭氧性細(xì)菌(專(zhuān)利文獻(xiàn)19以及專(zhuān)利文獻(xiàn)20、非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。在使用厭氧性細(xì)菌時(shí)，產(chǎn)物的收率高，但另一方面增殖需要大量的營(yíng)養(yǎng)素，必須在培養(yǎng)基中添加大量的CSL(玉米漿)等有機(jī)氮源。這些有機(jī)氮源的大量添加不僅造成培養(yǎng)基成本的提高，還造成取出產(chǎn)物時(shí)的純化成本提高，因此是不經(jīng)濟(jì)的。此外，還已知先在需氧性條件下一次培養(yǎng)諸如棒狀桿菌型細(xì)菌等需氧性細(xì)菌，使菌體增殖，然后收集菌體、清洗，以靜止菌體的形式在不通氧的條件下生產(chǎn)非氨基有機(jī)酸的方法(專(zhuān)利文獻(xiàn)21以及專(zhuān)利文獻(xiàn)22)。這種情況下，在使菌體增殖時(shí)，即使有機(jī)氮的添加量少也能夠利用簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)充分增殖，因而是經(jīng)濟(jì)的，但在目的有機(jī)酸的生成量、生成濃度以及單位菌體的生產(chǎn)速度提高、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)化等方面還有改善的余地。此外，還報(bào)道了使用磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性增強(qiáng)的細(xì)菌來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)非氨基有機(jī)酸的方法等(例如專(zhuān)利文獻(xiàn)23)。此外，對(duì)于作為兼性厭氧性革蘭氏陰性細(xì)菌的大腸桿菌，已知有和棒狀桿菌型細(xì)菌一樣先在需氧性條件下進(jìn)行一次培養(yǎng)，使菌體增殖后，以靜止菌體的形式在不通氧的條件下厭氧式地生產(chǎn)非氨基有機(jī)酸的方法(非專(zhuān)利文獻(xiàn)3),以及需氧地生產(chǎn)非氨基有片幾酸的方法(專(zhuān)利文獻(xiàn)24);然而，由于大腸桿菌是革蘭氏陰性細(xì)菌，不耐滲透壓，其在單位菌體的生產(chǎn)率等方面還有改善的余地。ybjL基因是存在于大腸桿菌的基因組上的基因(參照例如非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)，從預(yù)想的氨基酸序列的模體、拓樸結(jié)構(gòu)等來(lái)分析，認(rèn)為其編碼某種轉(zhuǎn)運(yùn)體。但是，對(duì)于該基因，尚沒(méi)有將其克隆、表達(dá)后加以分析的報(bào)道，其實(shí)際功能尚不清楚。專(zhuān)利文獻(xiàn)l:美國(guó)專(zhuān)利第3,220,929號(hào)說(shuō)明書(shū)專(zhuān)利文獻(xiàn)2:美國(guó)專(zhuān)利第3,563,857號(hào)i^L明書(shū)專(zhuān)利文獻(xiàn)3:特公昭32-9393號(hào)7>報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)4:特開(kāi)平5-244970號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)5:特開(kāi)2000-106869號(hào)公報(bào)(美國(guó)專(zhuān)利第6,682,912號(hào))專(zhuān)利文獻(xiàn)6:特開(kāi)2000-189169號(hào)公報(bào)(美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)第2001009836號(hào))專(zhuān)利文獻(xiàn)7:特開(kāi)2000-189175號(hào)公報(bào)(美國(guó)專(zhuān)利第7,247,459號(hào))專(zhuān)利文獻(xiàn)8:特公平7-121228號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)9:歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)7>開(kāi)1038970號(hào)說(shuō)明書(shū)專(zhuān)利文獻(xiàn)10專(zhuān)利文獻(xiàn)11專(zhuān)利文獻(xiàn)12專(zhuān)利文獻(xiàn)13專(zhuān)利文獻(xiàn)14專(zhuān)利文獻(xiàn)15專(zhuān)利文獻(xiàn)16專(zhuān)利文獻(xiàn)17專(zhuān)利文獻(xiàn)18專(zhuān)利文獻(xiàn)19專(zhuān)利文獻(xiàn)20專(zhuān)利文獻(xiàn)21專(zhuān)利文獻(xiàn)22專(zhuān)利文獻(xiàn)23專(zhuān)利文獻(xiàn)24歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)1004663號(hào)說(shuō)明書(shū)國(guó)際公開(kāi)第97/23597號(hào)小冊(cè)子特開(kāi)2000-189177號(hào)公報(bào)(美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)第MO5239177號(hào))國(guó)際公開(kāi)第97/23597號(hào)小冊(cè)子國(guó)際公開(kāi)第00/37647號(hào)說(shuō)明書(shū)特開(kāi)2000-189180號(hào)(美國(guó)專(zhuān)利第6,979,560)特開(kāi)2001-333769號(hào)公報(bào)(美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)第2007134773號(hào))特開(kāi)平7-203980號(hào)(美國(guó)專(zhuān)利第5,573，945號(hào))特開(kāi)2005-278643(美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)第2005196846號(hào))美國(guó)專(zhuān)利第5,142,834號(hào)公報(bào)美國(guó)專(zhuān)利第5,504,004號(hào)公報(bào)特開(kāi)平11-113588號(hào)公才艮特開(kāi)平11-196888號(hào)公報(bào)特開(kāi)平11-196887號(hào)公報(bào)美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)第20050170482號(hào)非專(zhuān)利文獻(xiàn)l:明石邦彥等著《氨基酸發(fā)酵》(7$乂酸発酵)，學(xué)會(huì)出版中心(學(xué)會(huì)出版iry夕一)、195215頁(yè)、1986年非專(zhuān)利文獻(xiàn)2:Guettler，M.V.etal.1999.InternationalJournalofSystematicBacteriology49:207-216非專(zhuān)利文獻(xiàn)3:Vemuri,G.N.etal.2002.JournalofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology28(6):325-332非專(zhuān)利文獻(xiàn)4:Blattner,F.R.etal.1997.Science277(5331):1453-7
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明所要解決的問(wèn)題本發(fā)明的課題是提供能夠高效生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)特別是L-谷氨酸、L-天冬氨酸、琥珀酸的菌抹，以及提供應(yīng)用該菌抹高效地生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的方法。解決問(wèn)題的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明人等為解決上述問(wèn)題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果，分離出與L-谷氨酸抗性相關(guān)的基因ybjL，并發(fā)現(xiàn)ybjL基因表達(dá)加強(qiáng)的菌林使L-谷氨酸的發(fā)酵收率提高。而且還發(fā)現(xiàn)ybjL基因表達(dá)加強(qiáng)的菌株使琥珀酸等的生成速度或收率提高，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明提供以下的發(fā)明。(1)一種微生物，其具備生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的能力，并且經(jīng)過(guò)修飾而增強(qiáng)了ybjL基因的表達(dá)。(2)(l)所述的微生物，其經(jīng)過(guò)下述方式纟務(wù)飾而增加了ybjL基因的表達(dá)提高ybjL基因的拷貝數(shù)或者修飾ybjL基因的表達(dá)調(diào)節(jié)序列。(3)(1)或(2)所述的微生物，其中，ybjL基因是編碼下述(A)或(B)所述的蛋白質(zhì)的基因(A)具有SEQIDNO:2、4或87所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(B)具有在SEQIDNO:2、4或87所示的氨基酸序列取代、缺失、插入或添加了1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并且在微生物內(nèi)增強(qiáng)其表達(dá)可提高具有微生物生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的能力。(4)(1)(3)中任一項(xiàng)所述的微生物，其中，ybjL基因?yàn)榫幋aSEQIDNO:5或88所示的蛋白質(zhì)的基因。(5)(1)(4)中任一項(xiàng)所述的微生物，其中所述微生物為屬于腸桿菌科的細(xì)菌。(6)(5)所述的微生物，所述孩i生物選自下組埃希氏菌屬細(xì)菌、腸桿菌屬細(xì)菌、拉烏爾菌屬細(xì)菌、泛菌屬細(xì)菌和克雷伯氏菌屬細(xì)菌。(7)(1)(4)中任一項(xiàng)所述的微生物，其中，所述微生物為瘤胃細(xì)菌。(8)(7)所述的微生物，其中，所述微生物為產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌。(9)(1)(8)中任一項(xiàng)所述的微生物，其中，所述酸性物質(zhì)為選自琥珀酸、富馬酸、蘋(píng)果酸、草酰乙酸、檸檬酸、異檸檬酸以及a-酮戊二酸中的1種或2種以上的有機(jī)酸。(10)(1)()中任一項(xiàng)所述的微生物，其中，所述酸性物質(zhì)為L(zhǎng)-谷氨酸和/或L-天冬氨酸。(11)生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)(1)(10)中任一項(xiàng)所述的微生物，從而在該培養(yǎng)基中生成并蓄積具有羧基的酸性物質(zhì)，并且從該培養(yǎng)基中收集具有羧基的酸性物質(zhì)。(12)(ll)所述的方法，其中，所述酸性物質(zhì)為選自琥珀酸、富馬酸、蘋(píng)果酸、草酰乙酸、檸檬酸、異檸檬酸、以及a-酮戊二酸中的l種或2種以上的有才幾酸。(13)(ll)所述的方法，其中，所述酸性物質(zhì)為L(zhǎng)-谷氨酸和/或L-天冬氨酸。(14)生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的方法，其特征在于，通過(guò)使(1)(10)中任一項(xiàng)所述的微生物或該微生物的處理產(chǎn)物在含有碳酸根離子、碳酸氫根離子或二氧化碳?xì)怏w的反應(yīng)液中作用于有機(jī)原料來(lái)生成具有羧基的酸性物質(zhì)，并且收集該酸性物質(zhì)。(15)(14)所述的方法，其中，所述酸性物質(zhì)為選自琥珀酸、富馬酸、蘋(píng)果酸、草酰乙酸、檸檬酸、異檸檬酸、以及a-酮戊二酸中的1種或2種以上的有才幾酸。(16)生產(chǎn)含琥珀酸的聚合物的方法，該方法包括通過(guò)(12)或(15)所述的方法生產(chǎn)琥珀酸的步驟，以及使所得的琥珀酸聚合的步驟。圖1為顯示輔助質(zhì)粒RSF-Red-TER的結(jié)構(gòu)的圖。圖2為顯示輔助質(zhì)粒RSF-Red-TER的構(gòu)建的圖。圖3為顯示ybjL擴(kuò)增株在高濃度L-谷氨酸存在下的生長(zhǎng)的圖。圖4為顯示埃希氏菌屬細(xì)菌中ybjL擴(kuò)增抹的琥珀酸蓄積的圖。圖5為顯示腸桿菌屬細(xì)菌中ybjL擴(kuò)增抹的琥珀酸蓄積的圖。發(fā)明的具體實(shí)施例方式以下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。<1>本發(fā)明的具備生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的能力的微生物本發(fā)明的微生物是具備生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的能力，且經(jīng)過(guò)了修飾而增強(qiáng)了ybjL基因的表達(dá)的微生物。"生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的能力"是指當(dāng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物時(shí)，以可從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收的程度在細(xì)胞或培養(yǎng)基中生成、蓄積具有羧基的酸性物質(zhì)的能力。作為具備生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的能力的微生物，可以是本身具備生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的能力的微生物，也可以是通過(guò)利用突變法或重組DNA技術(shù)對(duì)如下文所述的微生物進(jìn)行修飾而具備了生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的能力的微生物，或者可以是通過(guò)導(dǎo)入本發(fā)明的基因而賦予或增強(qiáng)了生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的能力的^f效生物。在本發(fā)明中，"具有羧基的酸性物質(zhì)，，是指具有羧基，且在處于未形成鹽的游離體的形式時(shí)顯示酸性的有機(jī)化合物。具體而言，可以列舉有機(jī)酸、以及具有兩個(gè)羧基的L-氨基酸即酸性氨基酸。作為L(zhǎng)-氨基酸，可以列舉L-谷氨酸或L-天冬氨酸，作為有機(jī)酸，可以列舉琥珀酸、富馬酸、蘋(píng)果酸、草酰乙酸、檸檬酸、異檸檬酸、a-酮戊二酸等。可在本發(fā)明中使用的微生物的親本株沒(méi)有特殊限制，優(yōu)選是細(xì)菌。作為細(xì)菌，優(yōu)選屬于腸桿菌科的細(xì)菌、分類(lèi)為瘤胃細(xì)菌的細(xì)菌、以及棒狀桿菌型細(xì)菌。腸桿菌科中包括屬于埃希氏菌(Escherichia)、腸桿菌(Enterobacter)、歐文氏菌(Erwinia)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、泛菌(Pantoea)、光狀桿菌(Photorhabdus)、普羅威登斯菌(Providencia)、拉烏爾菌(Raoultella)、沙門(mén)氏菌(Salmonia)、沙雷氏菌(Serratia)、志賀氏菌(Shigella)、摩根氏菌(Morganella)、耶爾森菌(Yersinia)等屬的細(xì)菌。特別是優(yōu)選根據(jù)NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的數(shù)據(jù)庫(kù)(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgiyyid=91347)中使用的分類(lèi)法被分類(lèi)為腸桿菌科的細(xì)菌。這其中，特別優(yōu)選屬于埃希氏菌屬、腸桿菌屬、拉烏爾菌屬、泛菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬的細(xì)菌。所謂屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌，并非特殊限制，是指該細(xì)菌根據(jù)微生物學(xué)家所知的分類(lèi)被歸類(lèi)為埃希氏菌屬。作為在本發(fā)明中使用的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌，例如4旦不限于大腸桿菌(Escherichiacoli)。對(duì)于可在本發(fā)明中使用的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌沒(méi)有特殊限制，例如包括Neidhardt等的著作(Neidhardt，F(xiàn).C.Ed.19%.Escherichiacoliand10Salmonella:CellularandMolecularBiology/SecondEditionpp.2477-2483.Table1.AmericanSocietyforMicrobiologyPress,Washington,D.C)中記述的種系的微生物。具體而言，可以列舉源自原型野生抹K12株的大腸桿菌W3110(ATCC27325)、大腸桿菌MG1655(ATCC47076)等。這些菌4朱可以從例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(地址1230110801UniversityBoulevard,Manassas,VA20110，UnitedStatesofAmerica)通過(guò)分售獲得。即，對(duì)各菌抹給予了對(duì)應(yīng)的登錄號(hào)，可以利用該登錄號(hào)通過(guò)分售獲得。各菌抹的相應(yīng)登錄號(hào)見(jiàn)美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄。泛菌屬細(xì)菌、歐文氏菌屬細(xì)菌和腸桿菌屬細(xì)菌是被分類(lèi)為Y-變形細(xì)菌(y-Proteobacteria)的細(xì)菌，它們?cè)诜诸?lèi)學(xué)上的親緣關(guān)系彼此非常接近(J.Gen.Appl.Microbiol.1997，43:355-361;Int.J.Syst.Bacteriol.199747:1061-1067)。近年來(lái)，依據(jù)DNA-DNA雜交實(shí)驗(yàn)等，屬于腸桿菌屬的細(xì)菌中有些被重新分類(lèi)為成團(tuán)泛菌CPa"toeaagg/omeraw)或戶aw/oea等(Int.J.Syst.Bacteriol.1989，39:337-345)。此外，屬于歐文氏菌屬的細(xì)菌中有些尋皮重新分類(lèi)為菠蘿泛菌CPflwtoeor、斯氏泛菌(尸fl"toea他雨"/)(參照Int.J.Syst.Bacteriol.1993，43:162-173)。作為腸沖干菌屬細(xì)菌,可以歹l]舉成團(tuán)腸4干菌(Enterobacteragglomerans)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)等。具體而言，可以使用歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)952221號(hào)說(shuō)明書(shū)中示例的菌抹。作為腸桿菌屬的代表性菌4朱，可以列舉成團(tuán)腸桿菌ATCC12287抹、產(chǎn)氣腸桿菌ATCC13048抹、產(chǎn)氣腸桿菌NBRC12010林(BiotechnolBioeng.2007Mar27;98(2):340-348)、產(chǎn)氣腸桿菌AJ110637(FERMABP-10955)抹等。AJ110637抹是2006年3月利用以甘油為碳源的液體蓄積培養(yǎng)從靜岡縣牧之原市須須木海岸邊的土壤中獲得的。后來(lái)測(cè)定了其16SrDNA的全長(zhǎng)序列，結(jié)果與產(chǎn)氣腸桿菌NCTC10006抹顯示99.9%的同源率。此外，在利用API試劑盒進(jìn)行的生理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果中，得到了與產(chǎn)氣腸桿菌的基準(zhǔn)菌種相同的結(jié)果，由此將該分離獲得的抹鑒定為產(chǎn)氣腸桿菌。該菌抹于2007年8月22日保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利生物保藏中心(〒305-8566日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)，保藏號(hào)FERMP-21348;2008年3月13日轉(zhuǎn)為基于布達(dá)佩斯條約的國(guó)際保藏，并被給予FERM保藏號(hào)ABP-10955。作為泛菌屬細(xì)菌的代表性菌一朱，可以列舉Pewtoea、斯氏泛菌、成團(tuán)泛菌、檸檬泛菌(尸a"toeac/^ea)。具體地，可以列舉下述菌抹。尸a"toeaAJ13355抹(FERMBP-6614)(歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)0952221號(hào)i兌明書(shū))戶a"toeaawa"a^AJ13356株(FERMBP-6615)(歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)0952221號(hào)說(shuō)明書(shū))而且，這些菌4朱在歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)0952221號(hào)說(shuō)明書(shū)中^皮描述為成團(tuán)腸桿菌，但是現(xiàn)在，如上文所述，已通過(guò)16SrRNA的堿基序列分析等將其重新分類(lèi)為尸a"toeaa"a"加、。作為歐文氏菌屬細(xì)菌，可以列舉解淀粉歐文氏菌(五rvWw'aam_y/ovora)、胡蘿卜專(zhuān)欠腐歐文氏菌(五r^m'acaratovora);作為克雷伯氏菌屬細(xì)菌，可以列舉植生克雷伯氏菌(i:/e^wW/ap/a""co/a);作為拉烏爾菌屬細(xì)菌，可以列舉植生拉烏爾菌(iaow/^〃a;/a""co/a)。具體地，可以列舉下述菌斗朱。解淀粉歐文氏菌ATCC15580抹胡蘿卜軟腐歐文氏菌ATCC15713氺朱植生克雷伯氏菌AJ13399林(FERMBP-6600)(歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)955368號(hào)說(shuō)明書(shū))植生克雷伯氏菌AJ13410抹(FERMBP-6617)(歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)955368號(hào)說(shuō)明書(shū))植生拉烏爾菌ATCC33531林而且，AJ13399抹以及AJ13410抹在保藏時(shí)被歸類(lèi)為植生克雷伯氏菌，但現(xiàn)在植生克雷伯氏菌已被歸類(lèi)為植生拉烏爾菌(Drancourt，M.2001.IntJSystEvolMicrobiol.51:925-32)。作為瘤胃細(xì)菌，可以列舉曼氏桿菌屬(Mannheimia)細(xì)菌、》文線桿菌屬細(xì)菌、厭氧螺菌屬細(xì)菌、Pyrobacterium屬細(xì)菌、月形單胞菌屬(Selenomonas)纟田菌，可以4吏用產(chǎn)琥詢酸曼氏4干菌(7W"a"w/2e/m/asMcc/m'cz^rodwcera1)、產(chǎn)琥珀酸方丈線4干菌(」c""o6ac/〃MJswcc/"oge"ay)、反芻月形單月包菌(iSe/e"cww"oyn^/"a""wm)、小韋榮氏球菌(F^7/owe〃a/arvw/a)、產(chǎn)琥詢酸沃林氏菌(ffo/we〃aswc"'woge"&s)、產(chǎn)琥玉白酸厭氧蟲(chóng)累菌(Jwaero6z'05/^W〃wmwcc/m'c^ra^ce"力等細(xì)菌，特別優(yōu)選使用產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌。作為具體菌抹，可以列舉曼氏桿菌屬菌種55E抹(KCTC0769BP株)(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)2003/0113885號(hào)公報(bào)、國(guó)際公開(kāi)2005/052135號(hào)小冊(cè)子)。<1-1>生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的能力的賦予以下，說(shuō)明賦予細(xì)菌以生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的能力的方法，或增強(qiáng)如上所述的微生物的生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的能力的方法。為了賦予生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的能力，可以采用在用于通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)物質(zhì)的細(xì)菌的選育中從來(lái)采用的方法，例如獲取營(yíng)養(yǎng)缺陷突變體、類(lèi)似物抗性菌抹或代謝調(diào)節(jié)突變菌抹，創(chuàng)建具有羧基的酸性物質(zhì)生物合成系統(tǒng)酶表達(dá)增強(qiáng)的重組菌抹等等(參見(jiàn)《氨基酸發(fā)酵》(《7$乂酸発酵》)，(抹)學(xué)會(huì)出版中心(學(xué)會(huì)出版七y夕一)，1986年5月30日首次出版發(fā)行，第77-100頁(yè))。這里，在具有羧基的酸性物質(zhì)生產(chǎn)菌的選育中，所賦予的營(yíng)養(yǎng)缺陷性、類(lèi)似物抗性或代謝調(diào)節(jié)突變等性質(zhì)可以是單獨(dú)一種，也可以是兩種或者三種以上。此外，表達(dá)被增強(qiáng)的具有羧基的酸性物質(zhì)生物合成系統(tǒng)酶可以是單獨(dú)一種，也可以是兩種或三種以上。另外，可以將營(yíng)養(yǎng)缺陷性、類(lèi)似物抗性或代謝調(diào)節(jié)突變等性質(zhì)的賦予與生物合成系統(tǒng)酶的增強(qiáng)組合起來(lái)。具備生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的能力的營(yíng)養(yǎng)缺陷突變體菌林、具有羧基的酸性物質(zhì)的類(lèi)似物抗性菌抹或代謝調(diào)節(jié)突變菌抹可如下獲得對(duì)親本菌抹或野生型菌抹施以常規(guī)突變處理，即X-射線或紫外線照射、或用誘變劑例如N-曱基-N，-硝基-N-亞硝基胍等處理；然后從所得的突變菌抹中選擇性物質(zhì)的能力的菌株。以下，具體地例示賦予微生物以生產(chǎn)氨基酸或有機(jī)酸的能力的方法、以及氨基酸或有機(jī)酸生產(chǎn)菌?！碙-谷氨酸生產(chǎn)菌〉作為通過(guò)修飾來(lái)賦予諸如上述的微生物以L-谷氨酸生產(chǎn)能力的方法，可以列舉例如通過(guò)進(jìn)行修飾而增強(qiáng)編碼L-谷氨酸生物合成相關(guān)酶的基因的表達(dá)的方法。作為L(zhǎng)-谷氨酸生物合成相關(guān)酶，可以列舉例如谷氨酸脫氫酶(以下也稱(chēng)"GDH")(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合酶(gltAB)、異檸檬酸脫氬酶(icdA)、順烏頭酸水合酶(acnA，acnB)、檸檬酸合酶(以下也稱(chēng)"CS，，)(gltA)、曱基檸檬酸合酶(以下也稱(chēng)"PRPC")(prpC)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(以下也稱(chēng)"PEPC")(ppc)、丙酮酸羧化酶(pyc)、丙酮酸脫氫酶(aceEF,lpdA)、丙酮酸激酶(pykA，pykF)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油變位酶(pgmA，pgml)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapA)、丙糖磷酸異構(gòu)酶(tpiA)、果糖二磷酸醛縮酶(fbp)、磷酸果糖激酶(pfkA，pfkB)、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶(pgi)等。此外，酶名稱(chēng)后的括號(hào)內(nèi)為基因名稱(chēng)。這些酶中，優(yōu)選CS或PRPC、PEPC和GDH中的1種以上，更優(yōu)選全部這3種。以下，就對(duì)微生物進(jìn)行修飾以增強(qiáng)目的基因的表達(dá)的方法進(jìn)行說(shuō)明。第一種方法是通過(guò)將目的基因克隆在適當(dāng)?shù)妮d體上，并用所得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主微生物，來(lái)提高該基因的拷貝數(shù)的方法。例如，當(dāng)使用編碼CS的基因(gltA基因)、編碼PEPC的基因(ppc基因)和編碼GDH的基因(gdhA基因)作為目的基因時(shí)，由于這些基因的堿基序列在埃希氏菌屬細(xì)菌和棒桿菌屬細(xì)菌中已經(jīng)闡明(Ner,S.etal.1983.Biochemistry22:5243-5249;Fujita，N.etal.1984.J.Biochem.95:909-916;Valle，F(xiàn).etal.1984.Gene27:193-199;Microbiology140:1817-1828，1994;Eikmanns，B丄etal.1989.Mol,Gen.Genet.218:330-339;Borma皿，E.R.etal.1992.MolecularMicrobiology6:317-326)，因此可以基于各堿基序列來(lái)合成引物，以染色體DNA為模板，通過(guò)PCR法獲耳又。作為用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒，可以列舉能夠在屬于腸桿菌群的細(xì)菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒，例如pUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29(pHSG、pSTV可從TAKARABio公司獲得)、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218(pMW可從NIIPONGENE公司獲得)等。而且，還可以以噬菌體DNA代替質(zhì)粒作為載體使用。作為用于同時(shí)增強(qiáng)上述CS或PRPC、PEPC和GDH的活性的質(zhì)粒，可以列舉整合了gltA基因、ppc基因和gdhA基因的RSFCPG(參照歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)第0952221號(hào)說(shuō)明書(shū))、和RSFCPG的gltA基因被替換成prpC的RSFPPG。作為轉(zhuǎn)化方法，可以使用例如，用氯化鈣處理受體菌細(xì)胞來(lái)增加DNA的透過(guò)性的方法，此方法被才艮道用于大腸桿菌K-12(Mandel,MandHiga，A.,J.1970.Mol.Biol.53:159-162)，或者由處于增殖階段的細(xì)胞制備感受態(tài)細(xì)胞并導(dǎo)入DNA的方法，此方法被才艮道用于枯草芽孢桿菌CSa"7/Mw^7/力(Duncan,C.H.etal.1977.Gene,1:153)?；蛘?，還可以應(yīng)用將DNA受體菌的細(xì)胞制備成容易導(dǎo)入重組DNA的原生質(zhì)體或原生質(zhì)球的狀態(tài)，再將重組DNA導(dǎo)入DNA受體菌的方法，此方法被報(bào)道用于枯草芽孢桿菌、方文線菌和酵母(Chang,S.andChoen，S.N.1979,Molec.Gen.Genet.168:111-115;Bibb,M丄etal.1978.Nature274:398;Hinnen,A.etal.1978.Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1929)。此外，采用電脈沖法(特開(kāi)平2-207791號(hào)公報(bào))也能夠進(jìn)行微生物的轉(zhuǎn)化。目的基因來(lái)實(shí)現(xiàn)。為了將多個(gè)拷貝的目的基因?qū)氲轿⑸锏娜旧wDNA上，可以利用染色體DNA上以多拷貝存在的序列作為靶標(biāo)，通過(guò)同源重組>去(ExperimentsinMolecularGenetics,ColdSpringHarborLab.(1972))來(lái)進(jìn)行。作為染色體DNA上以多拷貝存在的序列，可以利用重復(fù)DNA(repetitiveDNA)和存在于轉(zhuǎn)座元件端部的反向重復(fù)序列?；蛘?，可以如特開(kāi)平2-109985號(hào)公報(bào)所述那樣，將目的基因搭載在轉(zhuǎn)座子上，使其發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而將多個(gè)基因拷貝導(dǎo)入染色體DNA上。另外，還可以通過(guò)使用Mu噬菌體的方法(特開(kāi)平2-109985號(hào))將目的基因整合到宿主染色體上。第2種方法是在染色體DNA上或質(zhì)粒上、將目的基因的啟動(dòng)子等表達(dá)調(diào)節(jié)序列替換為強(qiáng)的表達(dá)調(diào)節(jié)序列來(lái)增強(qiáng)目的基因的表達(dá)的方法。例如，lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子等是已知的強(qiáng)啟動(dòng)子。此外，還可以如國(guó)際公開(kāi)WO00/18935所公開(kāi)的那樣，在基因的啟動(dòng)子區(qū)域?qū)霐?shù)個(gè)堿基的堿基取代，將其修飾成更強(qiáng)的啟動(dòng)子，以及對(duì)SD序列進(jìn)行修飾。啟動(dòng)子強(qiáng)度的評(píng)價(jià)方法和強(qiáng)啟動(dòng)子的例子記載于Goldstein等的論文(Goldstein,M.A.,andDoi,R.H.1995.Biotechnol.Annu.Rev.1:105隱128)等中。表達(dá)調(diào)節(jié)序列的取代例如可以像使用溫度敏感型質(zhì)粒的基因取代那樣進(jìn)行。作為可以在大腸桿菌或中使用的、具有溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)的載體，可以列舉例如WO99/03988號(hào)國(guó)際^Hf小冊(cè)子所述的質(zhì)粒pMAN997等。此外，表達(dá)調(diào)節(jié)序列的取代還可以通過(guò)下述方法來(lái)進(jìn)行利用Xp盆菌體的Red重組酶(Redrecombinase)的方法(Datsenko,K.A.andWanner,B丄.2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97(12):6640-6645)，以及將Red驅(qū)動(dòng)整合法與X噬菌體來(lái)源的切出系統(tǒng)(Cho，E.H.etal.2002.J.Bacteriol.184:5200-5203)聯(lián)合使用的方法(參照WO2005/010175號(hào))等。而且，也可以將表達(dá)調(diào)節(jié)序列的修飾與如上所述的提高基因的拷貝數(shù)的方法聯(lián)合使用。此外，Red驅(qū)動(dòng)整合中，如參考例l所示，可以適合地使用對(duì)XRed基因產(chǎn)物有抗性的菌抹例如SC17(0)株。該菌抹于2005年9月21保藏于俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(RussianNationalCollectionofIndustrialMicroorganisms(VKPM),GNIIGenetika)(地址Russia,117545Moscow,1Dorozhnyproezd.1)，寸呆藏號(hào)VKPMB-9246。作為經(jīng)采用以上方法進(jìn)行修飾而增強(qiáng)了檸檬酸合酶基因、曱基檸檬酸合酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和/或谷氨酸脫氫酶基因的表達(dá)的微生物，可以例示出特開(kāi)平2001-333769號(hào)公報(bào)、特開(kāi)2000-106869號(hào)7>才艮、特開(kāi)2000-189169號(hào)公報(bào)、特開(kāi)2000-333769、特開(kāi)2006-129840、國(guó)際公布2006/051660號(hào)小冊(cè)子等中記載的微生物。此外，生產(chǎn)L-谷氨酸的能力也可以通過(guò)增強(qiáng)6-磷酸葡糖酸脫水酶活性、或2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸醛縮酶活性、或者這兩者的活性來(lái)賦予。作為提高了6-磷酸葡糖酸脫水酶活性、2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸醛縮酶活性的微生物，可以列舉特開(kāi)2003-274988z^開(kāi)的孩i生物。用來(lái)賦予L-谷氨酸生產(chǎn)能力的修飾可以通過(guò)降低或缺損催化從L-谷氨酸生物合成途徑中分支并合成L-谷氨酸以外的化合物的反應(yīng)的酶的活性來(lái)進(jìn)行。催化從L-谷氨酸生物合成途徑中分支并合成L-谷氨酸以外的化合物的反應(yīng)的酶的實(shí)例包括2-酮戊二酸脫氫酶(sucA)，異檸檬酸裂合酶(aceA)，磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(pta),乙酸激酶(ack)，乙酰羥酸合酶(ilvG)，乙酰乳酸合酶(ilvl)，曱酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(pfl)，乳酸脫氫酶(ldh),谷氨酸脫羧酶(gadAB)、1-吡咯啉5-羧酸脫氬酶(putA)等。酶名稱(chēng)之后的括弧中是基因名。這其中，特別優(yōu)選降低或缺損2-酮戊二酸脫氫酶活性。為了降低或缺損如上所述的酶的活性，可以采用與后述的降低或缺損乳酸脫氪酶(LDH)的活性相同的方法。細(xì)胞中目的酶活性的降低或缺損，以及活性降低的程度，可以通過(guò)測(cè)定候選菌抹的菌體提取液或純化級(jí)分的酶活性并與野生株相比較來(lái)加以確認(rèn)。例如，2-酮戊二酸脫氫酶活性可以按照Reed等的方法(Reed，L丄andMukherjee,B.B.1969.MethodsinEnzymology13:55-61)來(lái)觀'J定。在埃希氏菌屬細(xì)菌中缺損或者降低2-酮戊二酸脫氫酶活性的方法記載于特開(kāi)平5-244970號(hào)公報(bào)以及特開(kāi)平7-203980號(hào)公報(bào)等中。此外，在棒狀桿菌型細(xì)菌中缺損或者降低2-酮戊二酸脫氫酶活性的方法記載于國(guó)際公開(kāi)95/34672號(hào)小冊(cè)子中。此外，對(duì)于腸桿菌屬細(xì)菌，/>開(kāi)于特開(kāi)2001-333769號(hào)公報(bào)中。作為缺損了2-酮戊二酸脫氫酶活性或降#^了2-酮戊二酸脫氫酶活性的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌，可以列舉以下的菌株(美國(guó)專(zhuān)利第5，378，616號(hào)和第5,573,945號(hào))。大腸4干菌W3110sucA::Kmr大腸桿菌AJ12624(FERMBP-3853)大腸桿菌AJ12628(FERMBP-3854)大腸桿菌AJ12949(FERMBP-4881)大腸桿菌W3110sucA::Kmr是通過(guò)破壞大腸桿菌W3110的2-酮戊二酸脫氫酶基因(sucA基因)而得到的菌抹。該菌株的2-酮戊二酸脫氫酶完全缺損。作為其它缺損或降低了2-酮戊二酸脫氫酶活性的細(xì)菌，具體地可以列舉如下菌抹。AJ13601(FERMBP-7207歐洲專(zhuān)利^^開(kāi)說(shuō)明書(shū)1078989)尸awtoeaa"awa^AJ13356(FERMBP-6615美國(guó)專(zhuān)利6.331,419號(hào))尸a"toeaa"a"G^SC17sucA(FERMBP-8646國(guó)際7>開(kāi)小冊(cè)子WO2005/085419號(hào))植生克雷伯氏菌AJ13410(FERMBP-6617美國(guó)專(zhuān)利6,197,559號(hào))乳發(fā)酵短桿菌(S"v/Z^cter/Mw/(3"C/^7We"^W)AS株(參照國(guó)際公開(kāi)95/34672號(hào)小冊(cè)子)此外，SC17sucA抹是這樣得到的從AJ13355抹(它是作為能夠在低pH下在含L-谷氨酸和碳源的培養(yǎng)基中增殖的菌林從自然界分離出來(lái)的)獲得粘液低生產(chǎn)性突變株(SC17)，然后破壞該SC17菌株的2-酮戊二酸脫氫酶基因(sucA)。AJ13601林是在該SC17sucA林中導(dǎo)入包含大腸桿菌來(lái)源的gltA、ppc和gdhA基因的質(zhì)粒RSFCPG,以及包含乳發(fā)酵短桿菌來(lái)源的gltA基因的質(zhì)粒pSTVCB,而得到SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB林；再?gòu)脑揝C17sucA/RSFCPG+pSTVCB抹中選擇對(duì)低pH下高濃度L-谷氨酸有抗性的菌林，并選擇增殖度和L-谷氨酸生產(chǎn)能力高的菌抹而得到的(歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)0952221號(hào)說(shuō)明書(shū))。AJ13356抹是AJ13355株的a-KGDH-El亞單位基17因(SUCA)缺失后得到的菌林。SC17sucA抹的內(nèi)部編號(hào)為AJ417，其于平成16年(2004年)2月26日保藏于產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利生物保藏中心(郵政編碼305-8566茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)，保藏號(hào)為FERMBP-08646。AJ13410抹于平成10年(1998年)2月19日保藏于通產(chǎn)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利生物保藏中心，郵政編碼305-8566茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)，保藏號(hào)為FERMP-16647,并于平成11年(1999年)l月11日轉(zhuǎn)為基于布達(dá)佩斯條約的國(guó)際保藏，保藏號(hào)為FERMBP-6617。上述尸"wtoeoAJ13355林、AJ13356抹、AJ13601林和前述的植生克雷伯氏菌AJ13399抹具有于酸性條件下培養(yǎng)時(shí)在液體培養(yǎng)基中蓄積超過(guò)L-谷氨酸飽和濃度的量的L-谷氨酸的能力。此夕卜，為了提高腸桿菌科的生產(chǎn)L-谷氨酸的能力，還可以采用缺損arcA基因的方法(美國(guó)專(zhuān)利7,090,998號(hào)公報(bào))、擴(kuò)增谷氨酸排出基因yhfK基因的方法(W02005/085419小冊(cè)子)。此外，作為具有L-谷氨酸生產(chǎn)能力的棒狀桿菌型細(xì)菌，可以示例出以下菌才朱。黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)AJ11573(FERMP-5492)參照特開(kāi)昭56-151495公報(bào)黃色短桿菌AJ12210(FERMP-8123)參照特開(kāi)昭61-202694公報(bào)黃色短桿菌AJ12212(FERMP-8123)參照特開(kāi)昭61-202694公報(bào)黃色短桿菌AJ12418(FERM-BP2205)參照特開(kāi)平2-186994公報(bào)黃色短桿菌DH18(FERMP-l1116)參照特開(kāi)平3_232497公報(bào)棲糖蜜棒桿菌(Corynebacteriummelassecola)DH344(FERMP-l1117)參照特開(kāi)平3-232497公4艮谷氨酸棒桿菌AJ11574(FERMP-5493)參照特開(kāi)昭56-151495公報(bào)具有L-谷氨酸生產(chǎn)能力的微生物還包括通過(guò)賦予對(duì)表面活性劑等生物素作用抑制物質(zhì)的溫度敏感型突變，從而能夠在含過(guò)量生物素的培養(yǎng)基中在不存在生物素作用抑制物質(zhì)的條件下生產(chǎn)L-谷氨酸的乳發(fā)酵短桿菌AJ13029株(FERMBP-5189;參照WO96/06180號(hào))。此外還包括對(duì)L-谷氨酸代謝拮抗物質(zhì)抗性的脂環(huán)酸桿菌(Alicyclobacillus)屬微生物(特開(kāi)平11-262398號(hào)公報(bào))。具有L-谷氨酸生產(chǎn)能力的微生物還可以是進(jìn)一步具備L-谷氨酸分解活性降低的性質(zhì)、或馬來(lái)酸合酶(aceB)-異檸檬酸裂合酶(aceA)-異檸檬酸脫氫酶激酶/磷酸酶(aceK)操縱子(以下簡(jiǎn)稱(chēng)ace操縱子)的表達(dá)變?yōu)榻M成型的性質(zhì)的微生物。作為具有這樣的性質(zhì)的微生物，可以列舉例如大腸桿菌AJ12628(FERMBP-3854)大腸桿菌AJ12624(FERMBP-3853)。前者是兼具2-酮戊二酸脫氫酶活性降低、L-谷氨酸分解活性降低、ace操縱子的表達(dá)變?yōu)榻M成型等性質(zhì)的突變株；后者是2-酮戊二酸脫氫酶活性降低、且L-谷氨酸分解活性降低的突變林(參照法國(guó)專(zhuān)利2680178號(hào)說(shuō)明書(shū))。此外，當(dāng)使用泛菌屬細(xì)菌時(shí)，優(yōu)選具有下述突變，所述突變使得當(dāng)在含糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生到菌體外的粘液質(zhì)比野生菌抹少。產(chǎn)生到菌體外的粘液質(zhì)比野生菌抹少的突變，可以利用特開(kāi)2001-333769所述的在固體培養(yǎng)基上篩選不生產(chǎn)粘性物質(zhì)的菌抹的方法，或者破壞與多糖合成相關(guān)的ams操縱子的方法。SEQIDNO:66所示為多糖合成相關(guān)的ams操縱子的堿基序列，該操縱子編碼的AmsH、I、A、C、B的氨基酸序列分別如SEQIDNO:67、68、69、70、71所示。<琥珀酸生產(chǎn)菌>作為琥珀酸生產(chǎn)菌，可以使用乙酸、乳酸、乙醇以及甲酸形成能力缺損的菌抹，具體而言，可以列舉大腸桿菌SS373抹(國(guó)際公開(kāi)99/06532號(hào)小冊(cè)子)。乙酸、乳酸、乙醇、以及曱酸形成能力缺損的菌抹通過(guò)如下方式獲得獲取在基本培養(yǎng)基中不能同化乙酸以及乳酸的菌林；或者，降低以下的乳酸生物合成系統(tǒng)基因以及乙酸生物合成系統(tǒng)酶的活性。(國(guó)際/>開(kāi)2005/052135號(hào)小冊(cè)子)。此外，如上所述的菌林可以通過(guò)賦予單氟乙酸抗性(US5,521,075)來(lái)獲3曰傳。作為其他的獲取琥珀酸生成能力提高的菌林的方法，可以列舉下述方法在厭氧條件下用富含葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)缺損曱酸裂合酶和乳酸脫氫酶而無(wú)法同化丙酮酸的菌抹，分離出具有丙酮酸同化能力的突變抹(國(guó)際公開(kāi)1997/16528號(hào)小冊(cè)子)。琥珀酸生產(chǎn)能力還可以通過(guò)下述方式獲得擴(kuò)增以下的琥珀酸生物合成系統(tǒng)相關(guān)的酶的基因，或者缺損催化從該生物合成系統(tǒng)中分支而生成其它化合物的反應(yīng)的酶的基因。還可以通過(guò)修飾而使得乳酸生物合成系統(tǒng)酶之一的乳酸脫氬酶(LDH,以下括號(hào)內(nèi)為酶名稱(chēng))的酶活性降低，來(lái)賦予琥珀酸生產(chǎn)能力(國(guó)際公開(kāi)2005/052135號(hào)小冊(cè)子、國(guó)際公開(kāi)2005/116227號(hào)小冊(cè)子、美國(guó)專(zhuān)利5,770,435號(hào)公報(bào)、美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)2007/0054387號(hào)公報(bào)、國(guó)際公開(kāi)99/53035號(hào)公報(bào)、Alam,K.Y.andClark,D.P.1989.J.Bacteriol.171:6213-6217)。有些微生物具有L型乳酸脫氫酶和D型乳酸脫氫酶，可以通過(guò)修飾使得其中的任一種降低，優(yōu)選使兩者都降低。此外，還可以通過(guò)修飾而使得甲酸生物合成系統(tǒng)酶之一的丙酮酸-曱酸裂合酶(PFL)的酶活性降低，來(lái)賦予琥珀酸生產(chǎn)能力(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)2007/0054387號(hào)公報(bào)、國(guó)際公開(kāi)2005/116227號(hào)小冊(cè)子、國(guó)際公開(kāi)2005/52135號(hào)小冊(cè)子、Do畫(huà)lly，M.I.etal.1998.Appl.Biochem.Biotechnol.70-72:187-198)。還可以通過(guò)進(jìn)行修飾使得屬于乙酸生物合成系統(tǒng)酶的磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(PTA)、乙酸激酶(ACK)、丙酮酸氧化酶(POXB)、乙酰CoA合成酶(ACS)、乙酰CoA水解酶(ACH)的酶活性降低，來(lái)賦予琥珀酸生產(chǎn)能力(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)2007/0054387號(hào)公報(bào)、國(guó)際公開(kāi)2005/052135號(hào)公報(bào)、國(guó)際公開(kāi)第99/53035號(hào)公報(bào)、國(guó)際公開(kāi)2006/031424號(hào)公報(bào)、國(guó)際公開(kāi)2005/113745號(hào)小冊(cè)子、國(guó)際公開(kāi)2005/113744號(hào)小冊(cè)子)。此外，還可以通過(guò)修飾使得屬于乙醇生物合成系統(tǒng)酶的醇脫氫酶(ADH)的酶活性降低，來(lái)提高琥珀酸生產(chǎn)能力(參照國(guó)際公開(kāi)2006/031424號(hào)小冊(cè)子)。此外，通過(guò)降低丙酮酸激酶、葡萄糖PTS(ptsG)、ArcA蛋白質(zhì)、IclR蛋白質(zhì)(iclR)、谷氨酸脫氬酶(gdh)和/或谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合酶(gltBD)的活性，也能夠提高琥珀酸生產(chǎn)能力(國(guó)際公開(kāi)第2006/107127號(hào)、第2007007933號(hào)、特開(kāi)2005-168401)。酶名稱(chēng)后的括號(hào)內(nèi)為基因名稱(chēng)。琥珀酸生產(chǎn)能力還可以通過(guò)增強(qiáng)與琥珀酸生產(chǎn)相關(guān)的生物合成系統(tǒng)酶來(lái)賦予。琥珀酸生產(chǎn)能力還可以通過(guò)增強(qiáng)丙酮酸羧化酶、蘋(píng)果酸酶(malicenzyme)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、富馬酸酶、富馬酸還原酶、蘋(píng)果酸脫氬酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的活性來(lái)提高(特開(kāi)平11-196888號(hào)公報(bào)、國(guó)際公開(kāi)第99/53035號(hào)小冊(cè)子、Hong，S.H.，andS.Y.Lee.2001.Biotechnol.Bioeng.74:89-95、Millard,C.S.etal.1996.Appl.Environ.Microbiol.62:1808-1810、國(guó)際公開(kāi)2005/021770號(hào)小冊(cè)子特開(kāi)2006-320208、Kim，P.etal.2004.Appl.Environ.Microbiol.70:1238-1241)。這些目的酶的酶活性的增強(qiáng)可以參照前面關(guān)于L-谷氨酸生產(chǎn)菌描述的增強(qiáng)目的基因表達(dá)的方法、以及下述的增強(qiáng)ybjL基因表達(dá)的方法來(lái)進(jìn)行。具體而言，作為屬于腸桿菌科的琥珀酸生產(chǎn)菌，可以列舉以下菌抹。大腸桿菌SS373株(國(guó)際公開(kāi)"/06532號(hào)小冊(cè)子)大腸桿菌AFP111林(國(guó)際公開(kāi)S>716528號(hào)小冊(cè)子)大腸桿菌NZN111抹(美國(guó)專(zhuān)利6,159,738號(hào)公報(bào))大腸桿菌AFP18斗抹(國(guó)際公開(kāi)MO5/116227號(hào)小冊(cè)子)大腸桿菌SBS100MG抹、SBS110MG抹、SBS440MG林、SBS550MG抹、SBS660MG抹(國(guó)際公開(kāi)2006/031424號(hào)公報(bào))作為屬于棒狀桿菌型細(xì)菌的琥珀酸生產(chǎn)菌，可以列舉以下菌抹。黃色短桿菌抹(特開(kāi)平11-113588號(hào)公報(bào))黃色短桿菌AB-41抹/PC擴(kuò)增林(特開(kāi)平11-196888號(hào)公報(bào))谷氨酸棒桿菌AJ110655抹(FERMBP-10951)黃色短桿菌MJ233Aldh(國(guó)際公開(kāi)第200S/021770號(hào)小冊(cè)子)乳發(fā)酵短桿菌(谷氨酸棒桿菌)2256A(ldh，ach，pta,ack)(國(guó)際公開(kāi)第2005/113744號(hào)小冊(cè)子)乳發(fā)酵短桿菌2256A(ldh,pta,ack,poxB)(國(guó)際公開(kāi)第2005/113745號(hào)小冊(cè)子)谷氨酸棒桿菌RldhVpCRB-1PC抹(國(guó)際公開(kāi)2005/0101S2號(hào)小冊(cè)子)作為屬于瘤胃細(xì)菌的琥珀酸生產(chǎn)菌，可以列舉以下菌株。產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌LPK,LPK7，LPK4(國(guó)際公開(kāi)2005/052135號(hào)小冊(cè)子)琥珀酸》文線桿菌(/4c""okc/〃i^wcc&o取"m)130Z(美國(guó)專(zhuān)利5,504,004號(hào)公報(bào))產(chǎn)琥珀酉吏厭氧蟲(chóng)累菌(y4waeraZn'osp/n7/w附swcc/m,")n9dwce"力FZ10(美國(guó)專(zhuān)21產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌FZ53(美國(guó)專(zhuān)利5,573,931號(hào)公報(bào))<l-2〉ybjL基因的表達(dá)的增強(qiáng)本發(fā)明的微生物，可以通過(guò)對(duì)如上所述的具備生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的能力的微生物進(jìn)行修飾，使得ybjL基因的表達(dá)增強(qiáng)來(lái)獲得。不過(guò)，也可以先進(jìn)行修飾使得ybjL基因的表達(dá)增強(qiáng)，然后再賦予生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的能力。此外，還可以是通過(guò)ybjL基因的擴(kuò)增而被賦予或增強(qiáng)了生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的能力的微生物。本發(fā)明的"ybjL基因"是指大腸桿菌的ybjL基因及其同源物，朋朋fl^的ybjL基因及其同源物，產(chǎn)氣腸桿菌的ybjL基因及其同源物。作為大腸桿菌的ybjL基因，可以示例出編碼具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因，優(yōu)選包含SEQIDNO:3的101位~1783位的堿基序列的基因。此外，作為來(lái)源的ybjL基因，可以示例出編碼具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因，優(yōu)選包含SEQIDNO:1的298位1986位的DNA。此外，作為產(chǎn)氣腸桿菌AJ110637抹來(lái)源的ybjL基因，可以示例出編碼具有SEQIDNO:87所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因，優(yōu)選包含SEQIDNO:86的19位~1704位的DNA。而且，作為鼠傷寒沙門(mén)氏菌(5"a/mo"e〃a0^/z/mwn'ww)來(lái)源的ybjL基因，可以示例出編碼具有SEQIDNO:25所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因(SEQIDNO:24);作為鼠疫耶爾森氏菌(l^w'm'apasto)來(lái)源的ybjL基因，可以示例出編碼具有SEQIDNO:27所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因(SEQIDNQ26);作為胡蘿卜軟腐歐文氏菌(五nv/m'acaratovora)來(lái)源的ybjL基因，可以示例出編碼具有SEQIDNO:29所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因(SEQIDNO:28);作為霍亂弧菌(J^hoc/zo/erae)來(lái)源的ybjL基因，可以示例出編碼具有SEQIDNO:31所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因(SEQIDNO:30);作為嗜水氣單胞菌04eramo"oy/^&o//n7a)來(lái)源的ybjL基因，可以示例出編碼具有SEQIDNO:33所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因(SEQIDNO:32);作為深海發(fā)光桿菌CP/20toZw"en'wmpra/w"dwm)來(lái)源的ybjL基因，可以示例出編碼具有SEQIDNO:35所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因(SEQIDNO:34)等。還可以是基于與上述示例的基因的同源性，從谷氨酸棒桿菌、乳發(fā)酵短桿菌等棒狀桿菌型細(xì)菌，銅綠假單胞菌CP化Mdowowosaen^/"osa)等假單月包菌屬細(xì)菌，結(jié)核分枝桿菌(柳co^cten'ww化6ercw/ow'力等分枝桿菌屬(Mycobacterium)細(xì)菌等中克隆得到的。而且，上述鼠傷寒沙門(mén)氏菌、鼠疫耶爾森氏菌、胡蘿卜軟腐歐文氏菌、霍亂弧菌、嗜水氣單胞菌、深海發(fā)光桿菌的ybjL基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別與SEQIDNO:4的氨基酸序列96%、90%、88%、64%、60%、68%同源，而分別與SEQIDNO:2的氨基酸序列86%、卯％、84°/。、63%、60%、67同源。而且，SEQIDNO:2與4的氨基g吏序列之間的同源性為86%。SEQIDNO:2、4之間的共有序列如SEQIDNO:5所示。SEQIDNO:4與87的氨基酸序列之間的同源性為92%，SEQIDNO:2與87的氨基酸序列之間的同源性為83%。而且，產(chǎn)氣腸桿菌AJ110637抹來(lái)源的ybjL基因的序列(SEQIDNO:86)以及其氨基酸序列(SEQIDNO:87)是本發(fā)明人等首次發(fā)現(xiàn)的。SEQIDNO:2、4、87之間的氨基酸序列間的共有序列如SEQIDNO:88所示。所謂ybjL基因同源物，是指如下所述的基因，其來(lái)源于大腸桿菌、和產(chǎn)氣腸桿菌以夕卜的微生物，與大腸桿菌、或產(chǎn)氣腸桿菌的ybjL基因結(jié)構(gòu)顯示高類(lèi)似性，且編碼通過(guò)在微生物內(nèi)增強(qiáng)其表達(dá)能夠提高微生物的生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的能力的蛋白質(zhì)。作為ybjL基因同源物，可以列舉編碼與SEQIDNO:2、4或87的氨基酸序列全長(zhǎng)，或相對(duì)于SEQIDNO:2、4或87的氨基S吏序列具有70%以上、優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選95%以上、特別優(yōu)選97%以上的同源性、并且編碼通過(guò)在微生物內(nèi)增強(qiáng)其表達(dá)能夠提高微生物的物質(zhì)生產(chǎn)能力的蛋白質(zhì)的基因。而且，相對(duì)于上文記載的任一種氨基酸序列具有70%以上、優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選95%以上、特別優(yōu)選97%以上的同源性的ybjL基因同源物可以具有SEQIDNO:5或88，優(yōu)選SEQIDNO:5記載的共有序列。氨基酸序列和堿基序列的同源性可以利用例如Karlin和Altschul的BLAST(Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90，5873(1993))或FASTA(MethodsEnzymol.,183，63(1990))算法來(lái)確定?；谠揃LAST算法，開(kāi)發(fā)出了稱(chēng)為BLASTN、BLASTX的程序(參照http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)。而且，在本說(shuō)明書(shū)中，"同源性"(homology)"有時(shí)指"同一性"(identity)。就ybjL基因而言，只要通過(guò)增強(qiáng)其表達(dá)能夠提高微生物生產(chǎn)目的物質(zhì)的能力，還可以是人工修飾體等具有保守突變的基因。即，可以是編碼具有在現(xiàn)有蛋白質(zhì)的氨基酸序列例如SEQIDNO:2、4、25、27、29、31、33、35或SEQIDNO:87的氨基酸序列中發(fā)生保守突變，具體地為在1個(gè)或數(shù)個(gè)位置上發(fā)生1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因。這里，所謂"數(shù)個(gè)"，雖然因氨基酸殘基的種類(lèi)或其在蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)中的位置而異，但優(yōu)選為1~20個(gè)、更優(yōu)選1~10個(gè)、特別優(yōu)選1~5個(gè)。而且，ybjL基因還可以是編碼如下所述的蛋白質(zhì)的基因所述蛋白質(zhì)相對(duì)于SEQIDNO:2、4、25、27、29、31、33、35或SEQIDNO:87的氨基酸序列全長(zhǎng)具有70%以上、優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選卯％以上、更優(yōu)選95%以上、特別優(yōu)選97%以上的同源性，并且通過(guò)在凝:生物內(nèi)增強(qiáng)其表達(dá)能夠提高微生物的物質(zhì)生產(chǎn)能力。上述取代優(yōu)選為保守取代。保守取代是一種功能上無(wú)變化的中性突變。關(guān)于保守突變，當(dāng)取代位點(diǎn)是芳香族氨基酸時(shí)為Phe、Trp和Tyr之間；當(dāng)取代位點(diǎn)是疏水氨基酸時(shí)為L(zhǎng)eu、lie和Val之間；當(dāng)取代位點(diǎn)是極性氨基酸時(shí)為Gln和Asn之間；當(dāng)取代位點(diǎn)是堿性氨基酸時(shí)為L(zhǎng)ys、Arg和His之間、當(dāng)取代位點(diǎn)是酸性氨基酸時(shí)為Asp和Glu之間；當(dāng)取代位點(diǎn)是具有羥基的氨基酸時(shí)為Ser和Thr之間的相互取代的突變。典型的保守突變是保守取代，被視為保守取代的取代具體來(lái)說(shuō)包括例如用Ser或Thr取代Ala;用Gln、His或Lys取代Arg;用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn;用Asn、Glu或Gln取代Asp;用Ser或Ala取代Cys;用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln;用Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu;用Pro耳又代Gly;用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His;用Leu、Met、Val或Phe取代He;用Ile、Met、Val或Phe取代Leu;用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys;用Ile、Leu、Val或Phe取代Met;用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe;用Thr或Ala取代Ser;用Ser或Ala取代Thr;用Phe或Tyr取代Trp;用His、Phe或Trp取代Tyr;和用Met、Ile或Leu取代Val。諸如這樣的基因例如可以通過(guò)采用定點(diǎn)突變法對(duì)由SEQIDNO:1的298位~1986位組成的堿基序列、由SEQIDNO:3的101位~1783位組成的堿基序列、由SEQIDNO:86的19位~1704位組成的堿基序列、或SEQIDNO:24、26、28、30、32、或者34所示的堿基序列進(jìn)行修飾，而使得所編碼的蛋白質(zhì)的特定位點(diǎn)的氨基酸殘基包含取代、缺失、插入或添加來(lái)獲得。此外，還可以通過(guò)傳統(tǒng)的突變處理來(lái)獲得。作為突變處理，可以列舉將具有上述的任一堿基序列的基因用羥胺等進(jìn)行體外處理的方法，和對(duì)攜帶該基因的微生物例如埃希氏菌屬細(xì)菌采用紫外線或使用N-曱基-N，-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或曱磺酸乙酯(EMS)等在常規(guī)突變處理中使用的突變劑來(lái)進(jìn)行處理的方法。此外，如上所述的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等還包括因基于攜帶ybjL基因的微生物的個(gè)體差異、種間差異等情形而天然發(fā)生的突變(mutant或variant)而產(chǎn)生的那些取代、缺失、插入、添力口或傳M立。而且，ybjL基因還可以是這樣的DNA,其與具有由SEQIDNO:l的298位1986位組成的堿基序列的DNA、具有由SEQIDNO:3的101位~1783位組成的堿基序列的DNA、具有由SEQIDNO:86的19位1704位組成的堿基序列的DNA、具有SEQIDNO:1、3、24、26、28、30、32、34或者86的堿基序列的DNA的互補(bǔ)鏈、或者可由具有這些堿基序列的DNA制備的探針在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼通過(guò)在微生物內(nèi)增強(qiáng)其表達(dá)能夠提高微生物的物質(zhì)生產(chǎn)能力的蛋白質(zhì)。這里，"嚴(yán)格條件"是指形成所謂特異性雜交體而不形成非特異性雜交體的條件。將該條件明確地?cái)?shù)值化是困難的，舉一實(shí)例，有這樣的條件在該條件下，具有高同源性的DNA，例如具有80%以上，優(yōu)選卯％以上，更優(yōu)選95%以上，特別優(yōu)選具有97%以上同源性的DNA相互雜交，而同源性較之為低的DNA則不互相雜交；或者是這樣的條件在與常規(guī)Southern雜交的洗滌條件即60°C、lxSSC、0.1%SDS,優(yōu)選O.lxSSC、0.1%SDS，更優(yōu)選65。C、O.lxSSC、0.1%SDS，更優(yōu)選68。C、O.lxSSC、0.1°/。SDS相當(dāng)?shù)臏囟?、鹽濃度下洗滌1次，更優(yōu)選23次。探針可以具有ybjL基因的部分序列。這樣的探針可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的方法，以基于各基因的堿基序列制備的寡核苷酸為引物，以包含各基因的DNA片段為模板，通過(guò)PCR反應(yīng)來(lái)制備。而且，當(dāng)使用300bp左右長(zhǎng)度的DNA片段作為探針時(shí)，作為在上述條件下進(jìn)行雜交后的洗滌條件，可以列舉50。C、2xSSC，0.1%SDS。上文關(guān)于基因同源物以及保守突變的描述同樣適用于本說(shuō)明書(shū)中描述的其它酶基因。ybjL基因的表達(dá)的增強(qiáng)可以按照與上文所述關(guān)于增強(qiáng)L-谷氨酸生產(chǎn)菌目的基因表達(dá)的方法相同的方法，借助下述手段來(lái)實(shí)現(xiàn)通過(guò)轉(zhuǎn)化、同源重組來(lái)提高ybjL基因的拷貝數(shù)，或者對(duì)ybjL基因的表達(dá)調(diào)節(jié)序列進(jìn)行修飾，或者擴(kuò)增能夠提高ybjL的表達(dá)的調(diào)節(jié)子(regulator),或缺失或弱化能夠降低ybjL的表達(dá)的調(diào)節(jié)子。本發(fā)明的微生物優(yōu)選通過(guò)增強(qiáng)ybjL基因的表達(dá)，來(lái)使得具有羧基的酸性物質(zhì)的排出活性提高。"具有羧基的酸性物質(zhì)的排出活性^是高"可以通過(guò)將培養(yǎng)本發(fā)明的微生物時(shí)排出至培養(yǎng)基中的目的物質(zhì)的量，與培養(yǎng)ybjL基因的表達(dá)未增強(qiáng)的對(duì)照微生物時(shí)排出至培養(yǎng)基中的目的物質(zhì)的量相比較來(lái)加以確認(rèn)。即，"具有羧基的酸性物質(zhì)的排出活性的提高，，可以通過(guò)與對(duì)照微生物相比、培養(yǎng)本發(fā)明的微生物時(shí)蓄積在培養(yǎng)基中的具有羧基的酸性物質(zhì)的升高而觀察到。此外，"具有羧基的酸性物質(zhì)的排出活性的提高"還可以通過(guò)"具有羧基的酸性物質(zhì)的排出活性"優(yōu)選與ybjL基因的表達(dá)未增強(qiáng)的菌抹相比，細(xì)胞內(nèi)的具有羧基的酸性物質(zhì)的濃度減少10%以上、優(yōu)選20%以上、特別優(yōu)選30%以上。微生物的絕對(duì)"具有羧基的酸性物質(zhì)的排出活性"可以通過(guò)測(cè)定微生物細(xì)胞內(nèi)的具有羧基的酸性物質(zhì)的濃度與細(xì)胞外的具有羧基的酸性物質(zhì)的濃度的差來(lái)檢測(cè)。而且，"具有羧基的酸性物質(zhì)的排出活性"還可以通過(guò)利用反轉(zhuǎn)膜，用放射性同位素測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的氨基酸攝入活性來(lái)檢測(cè)(J.Biol.Chem2002Vol277.No.51p49841-49849)。例如，可以由表達(dá)ybjL基因的菌體制備反轉(zhuǎn)膜小嚢泡(revertedmembranevesicles),添加ATP或者其它可作為驅(qū)動(dòng)力的底物，通過(guò)測(cè)定用RI標(biāo)記的谷氨酸的攝入活性來(lái)進(jìn)行測(cè)定。此外，還可以通過(guò)使用活菌檢測(cè)經(jīng)標(biāo)記的具有羧基的酸性物質(zhì)與非標(biāo)記的具有羧基的酸性物質(zhì)的交換反應(yīng)的速度來(lái)測(cè)定。本發(fā)明的微生物可以是具備在酸性條件下培養(yǎng)時(shí)在液體培養(yǎng)基中蓄積超過(guò)L-谷氨酸的飽和濃度的量的L-谷氨酸的能力(以下有時(shí)稱(chēng)為酸性條件下的L-谷氨酸蓄積能力)的微生物。這樣的微生物可以是通過(guò)增強(qiáng)ybjL基因的表達(dá)而變得具有酸性條件下的L-谷氨酸蓄積能力的微生物，也可以是天然地具有酸性條件下的L-谷氨酸蓄積能力的微生物。作為具有酸性條件下的L-谷氨酸蓄積能力的微生物，具體而言，可以列舉前述的AJ13355林(FERMBP國(guó)6614)、AJ13356抹(FERMBP-6615)以及AJ13601抹(FERMBP-7207)(以上參照特開(kāi)2001-333769號(hào)公報(bào))等。尸朋toeaAJ13355以及AJ13356抹于平成10年(1998年)2月19日保藏于通產(chǎn)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)名稱(chēng)為產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，地址郵政編碼305-8566茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6),保藏號(hào)FERMP-16644和FERMP-16645,并于平成11年(1999年)1月11日轉(zhuǎn)為基于布達(dá)佩斯條約的國(guó)際保藏，保藏號(hào)FERMBP-6614和FERMBP-6615。AJ13601于1999年8月18日保藏于工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)名稱(chēng)為產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利生物保藏中心)，保藏號(hào)FERMP-17156，并于2000年7月6曰轉(zhuǎn)為基于布達(dá)佩斯條約的國(guó)際保藏，保藏號(hào)FERMBP-7207。而且，這些菌抹在^皮分離出來(lái)時(shí)鑒定為成團(tuán)腸桿菌C&7fera6a"wagg/omera"力，并作為成團(tuán)腸桿菌AJ13355、AJ13356和AJ136014朱加以保藏，近年來(lái)根據(jù)16Sr認(rèn)A的堿基序列解析等，將它們重新分類(lèi)為a"a""fe。在本方法中，生產(chǎn)有機(jī)酸特別是琥珀酸時(shí)，使用除了ybjL基因的表達(dá)上升之外、還進(jìn)一步經(jīng)過(guò)修飾使得乳酸脫氫酶(LDH)、醇脫氫酶(ADH)以及丙酮酸-曱酸裂合酶(PFL)中的l種或2種以上酶的活性降低的微生物株，是更為有效的。這里，"經(jīng)修飾使得乳酸脫氫酶活性降低"是指與乳酸脫氫酶非修飾抹相比較，乳酸脫氬酶活性降低。乳酸脫氬酶活性優(yōu)選與乳酸脫氪酶非修飾抹相比較，每個(gè)菌體平均降低至10%以下。此外，乳酸脫氪酶活性也可以完全缺損。乳酸脫氫酶活性降低可以通過(guò)采用公知的方法(Kanarek，L.andHill,R.L.1964.J.Biol.Chem.239:4202)測(cè)定乳酸脫氫酶活性來(lái)確il。作為大腸桿菌的乳酸脫氫酶活性降低的突變抹的具體生產(chǎn)方法，可以列舉Alam,K.Y.，andClark,D.P.1989.J.Bacteriol.171:6213-6217中記載的方法等。本發(fā)明的乳酸脫氫酶活性降低、且ybjL基因表達(dá)增強(qiáng)的微生物，例如可以這樣獲得如后述的實(shí)施例l那樣，制備LDH基因被破壞的微生物，并用含ybjL基因的重組載體轉(zhuǎn)化該微生物。不過(guò)，用于降低LDH活性的修飾操作與用于增強(qiáng)ybjL表達(dá)的修飾操作先進(jìn)行任一個(gè)均可。此處，大腸桿菌中，LDH由ldhA基因、lldD基因編碼，ldhA基因的DNA序列示于SEQIDNO:36、氨基酸序列示于SEQIDNO:37，lldD基因的DNA序列示于SEQIDNO:38、氨基酸序列示于SEQIDNO:39。為了降低或缺損LDH的活性，可以采用常規(guī)突變處理方法在染色體上27的LDH基因中導(dǎo)入使得細(xì)胞中的LDH活性降低或缺損的突變。例如，可以通過(guò)采用基因重組，缺損染色體上的編碼LDH的基因，或?qū)?dòng)子、Shine-Dalgamo(SD)序列等表達(dá)調(diào)節(jié)序列進(jìn)行修飾等來(lái)實(shí)現(xiàn)。此外，還可以通過(guò)向染色體上的編碼LDH的區(qū)域?qū)氚被崛〈?錯(cuò)義突變)、或?qū)虢K止密碼子(無(wú)義突變)、或?qū)胍欢€(gè)i咸基的添加/缺失的移碼突變、或缺失基因的一部分或整個(gè)區(qū)域來(lái)實(shí)現(xiàn)(QiuZ.andGoodmanM.F.1997.J.Biol.Chem.272:8611=8617)。此外，還可以通過(guò)基因破壞，例如構(gòu)建編碼區(qū)域缺失的編碼突變型LDH的基因并通過(guò)同源重組等用其取代染色體上的正常型LDH基因，或者將轉(zhuǎn)座子、IS因子導(dǎo)入該基因來(lái)實(shí)現(xiàn)LDH活性的降低或缺損。例如，為了通過(guò)基因重組導(dǎo)入使得LDH活性降低或缺損的突變，可以釆用諸如以下的方法。對(duì)LDH基因的部分序列進(jìn)行修飾，制備不產(chǎn)生正常發(fā)揮功能的酶的突變型LDH基因，用含該基因的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過(guò)突變型基因與染色體上的基因之間發(fā)生重組，可以將染色體上的LDH基因替換成突變型?；谌缟纤龅睦猛粗亟M的基因取代的位點(diǎn)特異性突變導(dǎo)入已經(jīng)建立起來(lái)，包括下述方法Datsenko和Wanner開(kāi)發(fā)的稱(chēng)為"Red馬區(qū)動(dòng)整合(Red-drivenintegration)"的方法(Datsenko，K.A.andWanner,B丄.2000.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97(12):p6640-6645)、組合孑吏用Red驅(qū)動(dòng)整合法與入噬菌體來(lái)源的切出系統(tǒng)(Cho，E.H.etal.2002.J.Bacteriol.184:5200-5203)的方法(參照WO2005/010175號(hào))等使用線性DNA的方法，或者使用含溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒的方法等(美國(guó)專(zhuān)利第6303383號(hào)、或特開(kāi)平05-007491號(hào)公l艮、WO2005/010175號(hào)7>報(bào))。此外，基于如上所述的利用了同源重組的基因取代的位點(diǎn)特異性突變導(dǎo)入還可以利用在宿主中不具有復(fù)制能力的質(zhì)粒來(lái)進(jìn)行。此外，"經(jīng)修飾而降低了醇脫氫酶活性"是指與醇脫氫酶非修飾抹相比醇脫氫酶活性降低。醇脫氫酶活性優(yōu)選與醇脫氫酶非修飾林相比較，每個(gè)菌體平均降低至10%以下。此外，醇脫氫酶活性可以完全缺損。醇脫氫酶活性降低可以通過(guò)公知的方法(Lutstorf，U.M.etal.1970.Eur.J.Biochem.17:497-508)測(cè)定醇脫氫酶活性來(lái)確認(rèn)。作為大腸桿菌的醇脫氫酶活性降低的突變抹的具體生產(chǎn)方法，可以列舉Sanchez,A.M.etal.2005.Biotechnol.Prog.21:358-365)中記載的方法等。本發(fā)明的醇脫氫酶活性降低、且ybjL基因的表達(dá)增強(qiáng)的微生物例如可以這樣獲得制備編碼醇脫氫酶(ADH)的基因被破壞的微生物，并將該微生物用含ybjL基因的重組載體轉(zhuǎn)化。不過(guò)，用于降低ADH活性的修飾操作與用于增強(qiáng)ybjL基因表達(dá)的修飾操作任一個(gè)先進(jìn)行都是可以的。降低醇脫氫酶活性可以采用與上迷的降低乳酸脫氫酶活性的方法相同的方法來(lái)進(jìn)行。此外，作為產(chǎn)氣腸桿菌的ADH基因(adhE)，產(chǎn)氣腸桿菌AJ110637(FERMABP-10955)抹的ADH基因的堿基序歹'J(部分序列)如SEQIDNO:74所示。該基因的全堿基序列可以采用例如下述方法確定基于這些部分序列，從產(chǎn)氣腸桿菌的染色體DNA中分離出ADH基因(adhE)。此外，"經(jīng)修飾而降低了丙酮酸-曱酸裂合酶活性"是指與丙酮酸-曱酸裂合酶非修飾抹相比丙酮酸-曱酸裂合酶活性降低。丙酮酸-曱酸裂合酶活性優(yōu)選與丙酮酸-曱酸裂合酶非修飾抹相比較，每菌體平均降低至10%以下。此外，丙酮酸-曱酸裂合酶活性也可以完全缺損。丙酮酸-甲酸裂合酶活性降低可以通過(guò)/^知方法(Knappe，J.andBlaschkowski,H.P.1975.Meth.Enzymol.41:508-518)測(cè)定丙酮酸-曱酸裂合酶活性來(lái)確認(rèn)。本發(fā)明的丙酮酸-曱酸裂合酶活性降低且ybjL基因表達(dá)增強(qiáng)的微生物可以例如這樣獲得制備PFL基因被破壞的微生物，將該微生物用含ybjL基因的重組載體轉(zhuǎn)化。不過(guò)，用于降低PFL活性的修飾操作與用于增強(qiáng)ybjL基因表達(dá)的修飾操作任一個(gè)先進(jìn)行都是可以的。降低PFL活性可以采用與上述的降低乳酸脫氫酶活性相同的方法來(lái)進(jìn)行。在本方法中，在生產(chǎn)有機(jī)酸特別是琥珀酸時(shí)，可以使用除增強(qiáng)了ybjL基因的表達(dá)之外，還進(jìn)一步經(jīng)過(guò)修飾而增強(qiáng)了丙酮酸羧化酶(PC)的活性的微生物。丙酮酸羧化酶活性的增強(qiáng)可以與乳酸脫氫酶活性、醇脫氫酶活性、和/或丙酮酸-曱酸裂合酶活性的降低相組合。"經(jīng)過(guò)修飾而增強(qiáng)了丙酮酸羧化酶活性"是指丙酮酸羧化酶的活性相對(duì)于野生株或親本抹等非修飾抹有所增加。丙酮酸羧化酶的活性例如可以采用后述的測(cè)定NADH的減少的方法來(lái)測(cè)定。本發(fā)明的方法中使用的PC基因，可以使用其堿基序列已經(jīng)測(cè)定的基因，或者可以從微生物、動(dòng)植物等的染色體分離出編碼具有PC活性的蛋白質(zhì)的DNA片段，測(cè)定其堿基序列后使用。此外，在確定了堿基序列后，還可以使用根據(jù)該序列合成的基因。作為PC基因，可以使用例如棒狀桿菌型細(xì)菌谷氨酸棒桿菌來(lái)源的PC基因(Peters-Wendisch，P,G.etal.1998.Microbiology,144:915-927)。此外，PC基因可以有一部分堿基被其它堿基取代或被刪除，或者有新的堿基插入，或者堿基序列的一部分發(fā)生易位，只要其編碼的PC的功能即二氧化碳固定相關(guān)的性質(zhì)實(shí)質(zhì)上不受損害即可。此外，還可以使用谷氨酸棒桿菌以外的細(xì)菌、或者其它微生物或動(dòng)植物來(lái)源的PC基因。特別地，以下所示的微生物或動(dòng)植物來(lái)源的PC基因的序列是已知(示于以下文獻(xiàn))的，可以通過(guò)像上文所述那樣進(jìn)行雜交或者通過(guò)PCR法擴(kuò)增其ORP部分來(lái)獲得。人[Biochem.Biophys.Res.Comm.，202,1009-1014，(1994)]小鼠[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,90,1766-1779,(1993)]大鼠[GENE，165，331-332,(1995)]酵母；酉良酒酵母(5"acc/7arom少c&scerev/w'ae)粟酒裂殖酵母(iSc/2/myacc/zara，ces/ww6e)嗜熱月旨肪芽孑包桿菌CSa"7/ws他ara^zem70/Mtw)埃特里才艮瘤菌(//2/zC^MWW/Z')而且，增強(qiáng)PC基因的表達(dá)可以按照與上述的L-谷氨酸生產(chǎn)菌的描述中的增強(qiáng)目的基因表達(dá)、以及增強(qiáng)ybjL基因表達(dá)的方法相同的方法進(jìn)行。<2>本發(fā)明的具有羧基的酸性物質(zhì)的生產(chǎn)方法通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物，在培養(yǎng)基中生成并蓄積具有羧基的酸性物質(zhì)，并且從該培養(yǎng)基收集具有羧基的酸性物質(zhì)，可以生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)。此外，通過(guò)使本發(fā)明的微生物或該微生物的處理產(chǎn)物在含有碳酸根離子、碳酸氫根離子或二氧化碳?xì)怏w的反應(yīng)液中作用于有機(jī)原料，生成具有羧基的酸性物質(zhì)，并收集該酸性物質(zhì)，也可以生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)。前一種方法適合用于具有羧基的酸性物質(zhì)為酸性氨基酸的情形。后一種方法適合用于具有羧基的酸性物質(zhì)為有機(jī)酸的情形。以下，對(duì)于作為具有羧基的酸性物質(zhì)的酸性氨基酸以及有機(jī)酸的生產(chǎn)，示例說(shuō)明合適的實(shí)施方式。<2-1>酸性氨基酸的生產(chǎn)通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物，在培養(yǎng)基中生成并蓄積酸性氨基酸，并且從該培養(yǎng)基收集酸性氨基酸，可以生產(chǎn)酸性氨基酸。培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可以使用含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)、其它視需要的氨基酸、維生素等有機(jī)微量營(yíng)養(yǎng)素的常規(guī)培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基或天然培養(yǎng)基均可使用。培養(yǎng)基中使用的碳源和氮源，只要所培養(yǎng)的菌抹能夠利用即可，可以使用任何種類(lèi)的碳源和氮源。作為碳源，可以使用葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物、糖蜜等糖類(lèi)、此外，可以單獨(dú)使用或者與其它碳源組合使用乙醇等醇類(lèi)。此外，乙酸、檸檬酸等有機(jī)酸，當(dāng)其不是目的物質(zhì)時(shí)，也可以使用。作為氮源，可以使用氨氣、硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨、乙酸銨等銨鹽或硝酸鹽等。作為有機(jī)微量營(yíng)養(yǎng)素，可以使用氨基酸、維生素、脂肪酸、核酸，以及含有它們的蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白分解產(chǎn)物等，在使用生長(zhǎng)中需要氨基酸等的營(yíng)養(yǎng)缺陷性突變株時(shí)，優(yōu)選補(bǔ)加需求的營(yíng)養(yǎng)素。作為無(wú)機(jī)鹽類(lèi)，可以使用磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽、錳鹽等。培養(yǎng)優(yōu)選在發(fā)酵溫度2045°C、pH控制在39的條件下進(jìn)行通氣培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)中pH下降時(shí)，例如，添加碳酸鈣，或者用氨氣等i成進(jìn)行中和。通過(guò)在這樣的條件下培養(yǎng)優(yōu)選10小時(shí)~120小時(shí)左右，可以在培養(yǎng)液中蓄積酸性氨基酸。此外，當(dāng)酸性氨基酸為L(zhǎng)-谷氨酸時(shí)，可以使用已調(diào)整至可使L-谷氨酸析出的條件的液體培養(yǎng)基，在進(jìn)行培養(yǎng)的同時(shí)使L-谷氨酸析出至培養(yǎng)基中。作為L(zhǎng)-谷氨酸析出的條件，可以列舉例如pH5.0~4.0、優(yōu)選pH4.54.0、更優(yōu)選pH4.34.0、特別優(yōu)選pH4.0。從培養(yǎng)結(jié)束后的培養(yǎng)液收集L-谷氨酸的方法，可以按照公知的回收方法來(lái)進(jìn)行?？梢圆捎美纾瑥呐囵B(yǎng)液中除去菌體后進(jìn)行濃縮晶析的方法或者離子交換色譜等來(lái)收集。當(dāng)在可使L-谷氨酸析出的條件下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，析出至培養(yǎng)液中的L-谷氨酸可以采用離心分離或過(guò)濾等來(lái)收集。此時(shí)，可以在將培養(yǎng)基中溶解的L-谷氨酸晶析后，一并進(jìn)行分離。<2-2>有機(jī)酸的生產(chǎn)31可以通過(guò)使本發(fā)明的微生物或該微生物的處理產(chǎn)物在含有碳酸根離子、碳酸氫根離子或二氧化碳?xì)怏w的反應(yīng)液中與有機(jī)原料作用，生成有機(jī)酸，并收集該有機(jī)酸，來(lái)生產(chǎn)有機(jī)酸。在第一種實(shí)施方式中，通過(guò)在含碳酸根離子、碳酸氫根離子或二氧化碳?xì)怏w和有機(jī)原料的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，可以同時(shí)進(jìn)行微生物的增殖和有機(jī)酸的生成。該實(shí)施方式中，培養(yǎng)基相當(dāng)于所述反應(yīng)液。而且，微生物的增殖與有機(jī)酸的生成可以同時(shí)進(jìn)行，還可以具有主要增殖微生物的培養(yǎng)期和主要生成有機(jī)酸的培養(yǎng)期。此外，在第二種實(shí)施方式中，使在培養(yǎng)基中培養(yǎng)并增殖后的菌體與含碳酸根離子、碳酸氫根離子或二氧化碳?xì)怏w和有機(jī)原料的反應(yīng)液共存，在該反應(yīng)液中使微生物作用于有機(jī)原料，來(lái)生成有機(jī)酸。該實(shí)施方式中，也可以使用微生物的菌體的處理產(chǎn)物。作為菌體的處理產(chǎn)物，可以列舉例如將菌體用丙烯酰胺、角叉藻聚糖等固定化而得到的固定化菌體，破碎菌體而得到的破碎物，離心分離該破碎物得到的上清，或者用硫酸銨處理等方法部分純化該上清而得到的級(jí)分等。培養(yǎng)中使用的細(xì)菌可以是通過(guò)用瓊脂培養(yǎng)基等固體培養(yǎng)基進(jìn)行斜面培養(yǎng)而得到的，但優(yōu)選是預(yù)先用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)(種子培養(yǎng))而得到的。用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以使用常規(guī)微生物培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基。例如可以使用在由硫酸銨、磷酸鉀、硫酸鎂等無(wú)機(jī)鹽構(gòu)成的配方中添加肉提取物、酵母提取物、蛋白胨等天然營(yíng)養(yǎng)源而得到的一般培養(yǎng)基。在所述第一種實(shí)施方式中，添加在培養(yǎng)基中的碳源也可以是用于生成有機(jī)酸的有機(jī)原料。在所述第二種實(shí)施方式中，培養(yǎng)后的菌體可以通過(guò)離心分離、膜分離等來(lái)回收，并用于有機(jī)酸生成反應(yīng)。作為本發(fā)明的方法中使用的有機(jī)原料，沒(méi)有特殊限制，只要是該微生物能夠同化來(lái)生成琥珀酸的碳源即可，通?？梢允褂冒肴樘恰⑷樘?、葡萄糖、果糖、甘油、蔗糖(sucrose)、蔗二糖(saccharose)、淀粉、纖維素等碳水化合物，甘油、甘露醇、木糖醇、核糖醇等多元醇類(lèi)等發(fā)酵性糖質(zhì)，這其中，優(yōu)選葡萄糖、果糖、甘油，特別優(yōu)選葡萄糖。此外，在有機(jī)酸為琥珀酸時(shí)，為了有效率地生產(chǎn)琥珀酸，可以如特開(kāi)平5-68576那樣添加富馬酸等，或者也可以添加蘋(píng)果酸來(lái)替代富馬酸。此外，還可以使用含有上述發(fā)酵性糖質(zhì)的淀粉糖化液、糖蜜等。這些發(fā)酵性糖質(zhì)可以單獨(dú)或組合使用。對(duì)于上述有機(jī)原料的使用濃度沒(méi)有特殊限制，在不阻礙微生物的培養(yǎng)或有機(jī)酸的生成的范圍內(nèi)，盡可能高的濃度是有利的，通常，在所述第一種實(shí)施方式中，有機(jī)原料在培養(yǎng)基中的濃度為5~30%(W/V)、優(yōu)選1020。/。(W/V)的范圍內(nèi)。此外，在所述第二種實(shí)施方式中，反應(yīng)液中的有機(jī)原料的濃度為530%(W/V)、優(yōu)選1020。/。(W/V)的范圍內(nèi)。此外，可以根據(jù)隨著培養(yǎng)或反應(yīng)的進(jìn)行上述有機(jī)原料的減少，相應(yīng)J也^卜力口有才幾原泮+。作為上述含碳酸根離子、碳酸氫根離子或二氧化碳?xì)怏w和有機(jī)原料的反應(yīng)液，沒(méi)有特殊限制，例如可以是用于培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基，也可以是磷酸緩沖液等緩沖液。反應(yīng)液優(yōu)選為含氮源、無(wú)機(jī)鹽等的水溶液。此處，作為氮源沒(méi)有特殊限制，只要是該微生物能夠同化來(lái)生成有機(jī)酸的氮源即可，具體而言，可以列舉銨鹽、硝酸鹽、尿素、大豆水解物、酪蛋白分解產(chǎn)物、蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、玉米漿等各種有機(jī)、無(wú)機(jī)含氮化合物。作為無(wú)機(jī)鹽，各種磷酸鹽、硫酸鹽、鎂、鉀、錳、鐵、鋅等的金屬鹽。此外，視需要添加生物素、泛酸、肌醇、煙酸等維生素類(lèi)，核苷酸，氨基酸等促進(jìn)生長(zhǎng)的因子。此外，為了抑制反應(yīng)時(shí)的發(fā)泡，在培養(yǎng)液中預(yù)先添加適量的市售消泡劑是理想的。反應(yīng)液的pH可以通過(guò)添加碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸鎂、氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鎂等來(lái)調(diào)整。本反應(yīng)中的pH優(yōu)選通常為pH510、優(yōu)選pH69.5，因此，反應(yīng)中也可以視需要利用堿性物質(zhì)、碳酸鹽、尿素等將反應(yīng)液的pH調(diào)節(jié)至上述范圍內(nèi)。作為本發(fā)明中使用的反應(yīng)液，可以使用水、緩沖液、培養(yǎng)基等，最優(yōu)選培養(yǎng)基?？梢允古囵B(yǎng)基中含有例如上述的有機(jī)原料和碳酸根離子、碳酸氫根離子或二氧化碳?xì)怏w，在厭氧條件下進(jìn)行反應(yīng)。碳酸根離子或碳酸氫根離子可以由亦可充當(dāng)中和劑的碳酸鎂、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀來(lái)提供，但可以視需要也可以由碳酸或者重碳酸(bicarbonicacid)或它們的鹽或二氧化碳?xì)怏w來(lái)提供。作為碳酸或重碳酸的鹽的具體例子，可以列舉例如碳酸鎂、碳酸銨、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫銨、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀等。而且，碳酸根離子、碳酸氫根離子可以添加0.0015M、優(yōu)選0.1~3M、更優(yōu)選1~2M的濃度。在含有二氧化碳?xì)怏w時(shí)，每1L溶液含有50mg25g、優(yōu)選100mg15g、更優(yōu)選150mg10g的二氧化碳?xì)怏w。本反應(yīng)中使用的微生物的生長(zhǎng)最適溫度，通常為25。C4(TC。反應(yīng)時(shí)的溫度通常為25。C40。C、優(yōu)選30。C37。C。反應(yīng)液中的菌體的量沒(méi)有特殊規(guī)定，可以使用1700g/L、優(yōu)選10500g/L、更優(yōu)選20~400g/L。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為1小時(shí)~168小時(shí)，更優(yōu)選為3小時(shí)~72小時(shí)。此外，反應(yīng)可以是分批式的，也可以是柱式(力，厶式)的。培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，優(yōu)選在需氧條件下進(jìn)行。另一方面，有機(jī)酸的生成反應(yīng)可以在需氧條件下進(jìn)行，也可以在微需氧條件或厭氧條件下進(jìn)行。微需氧條件或厭氧條件下的反應(yīng)中，可以采用例如下述方法密閉反應(yīng)容器在不通氣的條件下進(jìn)行反應(yīng)，向反應(yīng)液中供給氮?dú)獾榷栊詺怏w的同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)，向反應(yīng)液中通入含二氧化碳?xì)怏w的惰性氣體，等等。反應(yīng)液(培養(yǎng)液)中蓄積的有機(jī)酸，可以采用常規(guī)方法從反應(yīng)液中分離并純化。具體而言，可以在通過(guò)離心分離、過(guò)濾等除去菌體等固體物質(zhì)后，用離子交換樹(shù)脂等進(jìn)行脫鹽，然后采用結(jié)晶或者柱色譜從該溶液中分離并純化有機(jī)酸。而且，在本發(fā)明中，當(dāng)目的有機(jī)酸為琥珀酸時(shí)，在根據(jù)上述本發(fā)明的方法生產(chǎn)琥珀酸后，通過(guò)以所得琥珀酸為原料進(jìn)行聚合反應(yīng)，能夠生產(chǎn)含琥珀酸的聚合物。近年來(lái)，造成環(huán)境負(fù)擔(dān)的工業(yè)產(chǎn)品數(shù)量增加，而使用植物來(lái)源原料的聚合物一直受到關(guān)注，在本發(fā)明中生產(chǎn)的琥珀酸可以被加工成聚酯、聚酰胺等聚合物來(lái)使用(特開(kāi)平4-189822)。作為含琥珀酸的聚合物，具體而言，可以列舉由丁二醇、乙二醇等二醇與琥珀酸聚合而得到的琥珀酸聚酯，由六亞甲基二胺等二胺與琥珀酸聚合而得到的琥珀酸聚酰胺，等或者含有它們的組合物可以用于食品添加劑、醫(yī)藥品、化妝品等。實(shí)施例以下，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說(shuō)明?！矃⒖祭?〕對(duì)入Red基因產(chǎn)物有抗性的菌抹的構(gòu)建為了在尸a"toea中破壞sdhA基因，構(gòu)建了用于高效率地進(jìn)行稱(chēng)作"Red驅(qū)動(dòng)整合(Red-drivenintegration)"或者"Red介導(dǎo)整合(Red-mediatedintegration)"的方法(Datsenko,K.A.andWanner,B丄.2000.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97:6640-6645)的受體菌。首先，構(gòu)建了表達(dá)人的gam、bet和exo各基因(以下稱(chēng)"入Red基因")的新輔助質(zhì)粒RSF-Red-TER(圖1)。詳細(xì)描述見(jiàn)參考例2。該質(zhì)粒可以用于具有不同基因背景的廣域宿主。理由是l)其具有在許多革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌甚至植物中都能夠穩(wěn)定保持的RSFIOIO廣宿主域質(zhì)粒的復(fù)制子(Scholz，etal.，1989.Gene75:271-288;Bucha腿-Wollastonetal.1987.Nature328:172-175)，2)XRed基因、gam、bet和exo基因受到能夠被許多細(xì)菌的RNA聚合酶識(shí)別的PlacUV5啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)(例長(zhǎng)口、Brunschwig，E.andDarzins，A.111.Gene1:35-41;Dehio，M.etal1998.Gene215:223-229);3)自調(diào)節(jié)因子PlacUV5-lacI、以及大腸桿菌rrnB操縱子的p非依賴性轉(zhuǎn)錄終止子(TrrnB)降低XRed基因的本底表達(dá)水平(Skorokhodova，A.Y.etal.2004.Biotekhnologiya(Rus)5:3-21)。而且，RSF-Red-TER質(zhì)粒包含果聚糖蔗糖酶(levansucmse)基因(sacB)，利用該基因，可以在含蔗糖的培養(yǎng)基中從細(xì)胞回收質(zhì)粒。在大腸桿菌中，PCR反應(yīng)生成的DNA片段與由RSF-Red-TER質(zhì)粒提供的短側(cè)翼區(qū)域一起發(fā)生整合的頻率與使用pKD46輔助質(zhì)粒(Datsenko，K.A.和Wanner,B丄.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA2000.97:6640-6645)時(shí)一樣高。然而，XRed基因的表達(dá)對(duì)a"awa"s顯示毒性。用RSF-Red-TER輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在含IPTG(異丙基-P-D-硫代半乳糖苦，lmM)和適當(dāng)抗生素(氯霉素25嗎/ml或卡那霉素40嗎/ml)的LB培養(yǎng)基上顯示非常低的生長(zhǎng)速度，入Red介導(dǎo)的重組(XRed-mediatedrecombination)的效率即使能夠觀察到，也是非常低的(1(T8)。選擇了對(duì)XRed基因的全部3個(gè)基因的表達(dá)均具有抗性的Pawtoeaa"a"ato突變菌4朱。為此目的，通過(guò)電穿孔將RSF-Red-TER質(zhì)粒導(dǎo)入a"畫(huà)feSC17抹(美國(guó)專(zhuān)利第6,596,517號(hào))。培養(yǎng)18小時(shí)后，得到了約106個(gè)轉(zhuǎn)化抹，有IO個(gè)克隆的菌落具有大的尺寸，其余的菌落都非常小。培養(yǎng)18小時(shí)后，大菌落為約2mm，小菌落為約0.2mm。將培養(yǎng)延長(zhǎng)至24小時(shí)，小菌落不再繼續(xù)生長(zhǎng)，而大菌落繼續(xù)生長(zhǎng)。將對(duì)XRed基因的全部3個(gè)基因(gam、bet和exo)的表達(dá)均具有抗性的大菌落突變菌4朱中的一個(gè)用于進(jìn)一步分析。從1個(gè)大菌落克隆和數(shù)個(gè)小菌落克隆中分離出RSF-Red-TER質(zhì)粒DNA，用它們?cè)俅无D(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655，考察了質(zhì)粒合成Red基因的活性產(chǎn)物的能力。由所得的轉(zhuǎn)化體中Red依賴性整合的對(duì)照實(shí)驗(yàn)可知，只有從大菌落克隆分離的質(zhì)?？梢餜ed依賴性整合所必需的XRed基因的表達(dá)。為了考察所選的大菌落的克隆中是否發(fā)生Red介導(dǎo)的整合，使用PCR反應(yīng)生成的下述線性DNA片段進(jìn)行了電穿孔，所述DNA片段設(shè)計(jì)為包含KmR標(biāo)記和與hisD基因同源的40bp側(cè)翼區(qū)域，用于整合到的hisD基因的Smal識(shí)別位點(diǎn)。將2個(gè)小菌落的克隆用作對(duì)照。尸""to^的hisD基因的核苷酸序列示于SEQIDNO:40。PCR中使用SEQIDNO:41和42的寡核苦酸作為引物，使用pMWl18-(入att-Kmr-Xatt)質(zhì)粒作為模板。使用對(duì)XRed基因不具有抗性的2個(gè)小菌落的克隆作為對(duì)照。pMW118-(XattL-Kmr-人attR)質(zhì)粒的構(gòu)建在參考例3中詳細(xì)描述。RSF-Red-TER質(zhì)粒能夠通過(guò)該質(zhì)粒上的lacl基因誘導(dǎo)Red基因的表達(dá)。對(duì)兩種誘導(dǎo)條件進(jìn)行了考察。在第1組中，電穿孔1小時(shí)前添加IPTG(lmM);在第2組中，在用于制備可電穿孔細(xì)胞的培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)添加IPTG。攜帶分離自大菌落克隆的RSF-Red-TER的SC17的后代的生長(zhǎng)速度并不顯著地低于不帶有RSF-RedTER質(zhì)粒的菌株。添加IPTG僅使這些培養(yǎng)物的生長(zhǎng)速度有些許降低。另一方面，導(dǎo)入了分離自小菌落克隆的后代的RSF-Red-TER的SC17抹在未添加IPTG的條件下生長(zhǎng)非常緩慢，而加以誘導(dǎo)后，生長(zhǎng)基本上停止。用分離自大菌落克隆的后代細(xì)胞的RSF-Red-TER進(jìn)行電穿孔后，有許多KmR克隆(短誘導(dǎo)時(shí)間為18個(gè)克隆，延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間后為約100個(gè)克隆)生長(zhǎng)?？疾斓娜?00個(gè)克隆均具有His-表現(xiàn)型，通過(guò)PCR對(duì)20個(gè)克隆進(jìn)行了確認(rèn)，結(jié)果確認(rèn)了這些細(xì)胞的染色體結(jié)構(gòu)與預(yù)想的相同。而另一方面，用分離自小菌落克隆的后代細(xì)胞的RSF-Red-TER進(jìn)行電穿孔也未能得到發(fā)生了整合的菌抹。使所得大菌落克隆在含7%蔗糖的平板上生長(zhǎng)，并使質(zhì)粒脫落，用RSF-Red-TER再次進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將不攜帶質(zhì)粒的菌抹命名為SC17(0)。該菌抹已于2005年9月21保藏在俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(RussianNationalCollectionofIndustrialMicroorganisms(VKPM),GNIIGenetika)(地址Russia,117545Moscow,1Dorozhnyproezd.1),保藏號(hào)VKPMB畫(huà)9246。上述再次轉(zhuǎn)化后生長(zhǎng)出的全部克隆均與親本菌株克隆SC17(0)—樣具有較大的菌落尺寸。在用RSF-Red-TER質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化的SC17(0)林中進(jìn)行了Red介導(dǎo)的整合實(shí)驗(yàn)。對(duì)于所得的3個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化抹，使用與前述實(shí)驗(yàn)所用的相同的DNA片段進(jìn)行了考察。采用了短誘導(dǎo)時(shí)間(電穿孔1小時(shí)前)。在各個(gè)實(shí)驗(yàn)中，生長(zhǎng)出超過(guò)10個(gè)的Kn^克隆。測(cè)試的全部克隆均具有His'表現(xiàn)型。這樣，就選擇出了對(duì)XRed基因的表達(dá)具有抗性的突變菌抹，將其命名為SC17(0)。該菌株可以作為用于對(duì)a"a"a^s染色體的Red依賴性整合的合適受體菌?！矃⒖祭?〕輔助質(zhì)粒RSF-Red-TER的構(gòu)建輔助質(zhì)粒RSF-Red-TER的構(gòu)建方案如圖2所示。作為構(gòu)建的最初步驟，設(shè)計(jì)了RSFsacBPlacMCS載體。為此目的，分別使用SEQIDNO:43、44、45、46的寡核苷酸，通過(guò)PCR擴(kuò)增了包含pACYC184質(zhì)粒的cat基因和枯草芽孢桿菌C6ac/〃M的sacB基因的結(jié)構(gòu)部分的DNA片段。這些寡核苷酸的5'末端分別包含對(duì)進(jìn)一步克隆而言必需且便利的BglII、Sacl、Xbal、和BamHI限制酶位點(diǎn)。將所得的1.5kb的sacB片革殳克隆到此前獲得的pMW119-P^lacI載體的XbaI-BamHI位點(diǎn)。該載體是依照與pMW118-PlaelacI載體的相關(guān)描述(Skorokhodova,A.Y.etal.2004.Biotekhnologiya(俄語(yǔ))5:3-21)相同的方法構(gòu)建的。只是該載體包含來(lái)自pMW219而不是pMW218質(zhì)粒的多接頭位點(diǎn)。接下來(lái)，將上述的1.0kb的cat片段用BglII和Sacl處理，并克隆到在先步驟中所得的pMW-PlaclacIsacB質(zhì)粒的BamHI-SacI位點(diǎn)。所得的質(zhì)粒pMW-PlaclacIsacBcat包含PlacUV5-lacI-sacB-cat片段。為了將該片段亞克隆到RSF1010載體，將pMW-PlaclacIsacBcat用BglII消化，并用DNA聚合酶I克列諾片段處理使末端平滑化，然后用Sacl切割。從1%瓊脂糖凝膠中洗提出pMWP^lacIsacBcat質(zhì)粒的3.8kb的BglII-SacI片段，將其與用Pstl和Sacl處理的RSF1010載體連4妄。用連4妻反應(yīng)混合液轉(zhuǎn)化大腸4干菌TG1，將其在含氯霉素(50mg/L)的LB培養(yǎng)基上鋪板。對(duì)從生長(zhǎng)出的克隆中分離的質(zhì)粒進(jìn)行限制酶分析，得到了RSFsacB質(zhì)粒。為了構(gòu)建RSFsacBPlacMCS載體，以SEQIDNO:47和48的寡核苷酸為引物，以pMWl19-Placlacl質(zhì)粒為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增了包含PlacUV5啟動(dòng)子的DNA片段。將所得的146bp片段用Sacl和Notl消化，將其與RSFsacB質(zhì)粒的Sacl-Notl大片段連接。然后，以SEQIDNO:49和50的寡核苷酸為引物，以pKD46質(zhì)粒(Datsenko，K.A.，Wanner,B丄.2000.Proc,Natl.Acad.Sci.USA97:6640-6645)為沖莫板，通過(guò)PCR擴(kuò)增了包含人Reda卩y基因和轉(zhuǎn)錄終止子tL3的2.3kb的DNA片段。將所得片段克隆到RSFsacBPlacMCS載體的Pvul-Notl位點(diǎn)。這樣就設(shè)計(jì)了RSFRed質(zhì)粒。為了排除Red基因的通讀轉(zhuǎn)錄，將大腸桿菌rrnB操縱子的p-依賴性轉(zhuǎn)錄終止子插入到cat基因與PlacUV5啟動(dòng)子之間。為此，以SEQIDNO:51和48的寡核苦酸為引物，以大腸桿菌BW3350的染色體為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增了包含PlacUV5啟動(dòng)子與TrrnB終止子的DNA片段。將所得的這些片段用Kpnl處理，并進(jìn)行連接。然后，以SEQIDNO:48和52的寡核苷酸為引物，通過(guò)使用寡核苷酸的PCR擴(kuò)增了包含PlacUV5和TrrnB這兩者的0.5kb片段。將所得DNA片段用EcoRI消化，并用DNA聚合酶I克列諾片段處理使末端平滑化，然后用BamHI切割，將其與RSF-Red載體的Ecll36II-BamHI大片,殳連接。將所得質(zhì)粒命名為RSF-Red-TER?！矃⒖祭?〕pMWl18-(人attL-Kmr-XattR)質(zhì)粒的構(gòu)建pMW118-(人attL-KmL人attR)質(zhì)粒是這樣構(gòu)建的在pMW118-attL-Tc-attR(WO2005/010175)質(zhì)粒中，用pUC4K質(zhì)粒的卡那霉素抗性基因取代四環(huán)素抗性標(biāo)記基因。為此目的，將pMW118-attL-Tc-attR質(zhì)粒的EcoRI-HindIII大片段與pUC4K質(zhì)粒的HindlII-Pstl(676bp)和EcoRI-HindlII(585bp)這2個(gè)片段連接。作為基礎(chǔ)的pMWl18-attL-Tc-attR是通過(guò)連接以下4個(gè)片段而得到的。1)使用引物PI(SEQIDNO:53)和P2(SEQIDNO:54)從大腸桿菌W3350(包含入原噬菌體)染色體的相當(dāng)于attL的區(qū)域通過(guò)PCR擴(kuò)增得到的具有attL(SEQIDNO:55)的BglII-EcoRI片段(l14bp)。這些引物包含BglII和EcoRI的附加識(shí)別^f立點(diǎn)。2)使用引物P3(SEQIDNO:56)和P4(SEQIDNO:57)從大腸桿菌W3350(包含X原噬菌體)的染色體的相當(dāng)于attR的區(qū)域通過(guò)PCR擴(kuò)增得到的具有attR(SEQIDNO:58)的PstI-HindIII片段(182bp)。這些引物包含Pstl和HindIII的附加識(shí)別位點(diǎn)。3)pMW118-ter—rrnB的BglII-HindIII大片段(3916bp)。質(zhì)粒pMWl18-ter—rrnB是通過(guò)連接以下3個(gè)DNA片,殳而得到的?！鰌MWl18的具有AatII-EcoRI片段的大片段(2359bp)。該片段是通過(guò)用EcoRI消化pMW118,并用DNA聚合酶I克列諾片段進(jìn)行處理，再用AatII進(jìn)行消化而得到的。具有氨芐青霉素抗性(ApR)的基因bla的pUC19的Aatn-BglII小片段(l194bp)。該片段是使用引物P5和P6(SEQIDNO:59和60)對(duì)pUC19質(zhì)粒的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增而得到的。這些引物中包含Pstl、AatII和BglII的附加識(shí)別位點(diǎn)。.轉(zhuǎn)錄終止子ter—rrnB的BglII-PstI小片段(363bp)。該片段是通過(guò)使用引物P7和P8(SEQIDNO:61和62)對(duì)大腸桿菌MG1655染色體的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增而得到的。這些引物包含PstI、BglII和PstI的附加識(shí)別位點(diǎn)。4)具有四環(huán)素抗性基因和ter—thrL轉(zhuǎn)錄終止子的pML-Tc-terJhrL的EcoRI-PstI小片段(1388bp)(SEQIDNO:63)。pML-Tc-ter—thrL質(zhì)粒是通過(guò)如下的2個(gè)步驟獲得的。.將pML-MCS質(zhì)粒(Mashko，S.V.etal.2001.Biotekhnologiya(俄語(yǔ))no.5,3-20)用Xbal和BamHI消化，然后將大片段(3342bp)與包含ter—thrL終止子的XbaI-BamHI片段(68bp)連接。該包含terJhrL終止子的片段是使用引物P9和P10(SEQIDNO:64和65)對(duì)大腸桿菌MG1655染色體的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行PCR而得到的。這樣，得到了pML-ter_thrL質(zhì)粒。這些引物包含Pstl、Xbal和BamHI的附加識(shí)別位點(diǎn)。.將pML-ter一thrL質(zhì)粒用Kpnl和Xbal消化，然后用DNA聚合酶I克列諾片段處理，再與具有四環(huán)素抗性基因的pBR322的EcoRI-Van911小片段(1317bp)連接，從而得到了pML-Tc-ter—thrL質(zhì)粒。而且，將pBR322用EcoRI和Van911消化，然后再用DNA聚合酶I克列諾片段進(jìn)行了處理。〔實(shí)施例1〕L-谷氨酸排出基因的探索L-谷氨酸排出基因的探索如下所述進(jìn)行。L-谷氨酸可以在谷氨酸脫氫酶的作用下一步轉(zhuǎn)變?yōu)樽鳛槿人嵫h(huán)中間體的2-酮戊二酸，因而，可以推測(cè)許多具有谷氨酸脫氫酶、三羧酸循環(huán)的微生物中L-谷氨酸容易被代謝掉。但是，2-酮戊二酸脫氬酶缺損的菌抹無(wú)法分解谷氨酸，因此在高濃度的谷氨酸存在下生長(zhǎng)受到抑制。這里，作為2-酮戊二酸脫氫酶缺損抹，使用了由朋朋加'sSC17sucA抹(特開(kāi)平2001-333769號(hào)公報(bào)參照)衍生的菌體外多糖生物合成系統(tǒng)缺損才朱SC17sucAams，以高濃度L-谷氨酸抗性為指標(biāo)，進(jìn)行了獲取L-谷氨酸排出系統(tǒng)基因的嘗試。39當(dāng)在含糖源的瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，SC17sucA抹會(huì)生成顯著量的菌體外多糖，因而操作非常困難。因此，通過(guò)缺損其編碼菌體外多糖生物合成系統(tǒng)基因的ams操縱子抑制菌體外多糖的生成。以pMW118-(XattL-Km^attR)為模板，使用SEQIDNO:6和SEQIDNO:7的寡核苦酸進(jìn)行PCR，擴(kuò)增了這樣的基因片段其是在卡那霉素抗性基因的兩端分別添加X(jué)噬菌體的attL以及attR序列，進(jìn)一步在其外側(cè)分別添加amsl基因的上游50bp、amsC基因下游50bp的序列而成的。將該片段使用WizardPCRPrepDNAPurificationSystem(Promega乂>司制造)進(jìn)^f亍了純4b。然后，將SC17(0)用RSF-Red-TER轉(zhuǎn)化，得到了SC17(0)/RSF-Red-TER株。將該菌株在含有25mg/L氯霉素的L培養(yǎng)基(細(xì)菌用胰蛋白胨10g、酵母抽提物5g、NaCl5g含于純水1L中而得的培養(yǎng)基，pH7.0)中培養(yǎng)過(guò)夜，將該過(guò)夜培養(yǎng)液以1/100量接種至含有25mg/L氯霉素和lmM異丙基-P-D-吡喃半乳糖香的L培養(yǎng)基lOOmL中，34。C培養(yǎng)3小時(shí)。將這樣制備的菌體收集起來(lái)，用冰冷的10%甘油清洗菌體3次后，最終將其懸浮于0.5mL的10%甘油中，以此作為感受態(tài)細(xì)胞使用GENEPULSERII(BioRad公司制造)以電場(chǎng)強(qiáng)度18kV/cm、電容器容量25pF、電阻值200Q的條件導(dǎo)入前面制備的PCR片段100ng。向細(xì)胞懸浮液中添加預(yù)先冰冷的SOC培養(yǎng)基(細(xì)菌用胰蛋白胨20g/L、酵母抽提物5g/L、NaCl0.5g/L、葡萄糖10g/L),34。C振蕩培養(yǎng)2小時(shí)，將其涂布于在L培養(yǎng)基(細(xì)菌用胰蛋白胨10g、酵母抽提物5g、NaCl5g、瓊脂15g含于純水1L而得到的培養(yǎng)基，pH7.0)中添加極限培養(yǎng)基成分(每1L中含葡萄糖5g、石克酸鎂2mM、磷酸二氫鉀3g、氯化鈉0.5g、氯化銨lg、磷酸氫二鈉6g)和40mg/L的卡那霉素而得到的培養(yǎng)基上。將出現(xiàn)的菌落用該培養(yǎng)基純化后，通過(guò)PCR確認(rèn)了ams基因已經(jīng)被卡那霉素抗性基因取代。由ams基因缺損才朱4吏用EdgeBiosystems^>司制造的BacterialGenomicDNAPurificationKit抽提了染色體。另一方面，將SC17sucA抹用在L培養(yǎng)基添加前述極限培養(yǎng)基成分而得到的瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜。用接種環(huán)刮取菌體、用預(yù)先冰冷的10%甘油清洗菌體3次，向菌體中加入10%甘油使得最終為500|iL并將其懸浮，以此作為感受態(tài)細(xì)胞。使用GENEPULSERII(BioRad公司制造)以電場(chǎng)強(qiáng)度17.5kV/cm、電容器容量25pF、電阻值200Q的條件，向感受態(tài)細(xì)胞中導(dǎo)入前述的染色體DNA600ng。向細(xì)胞懸浮液中添加預(yù)先冰冷的SOC培養(yǎng)基，34。C振蕩培養(yǎng)2小時(shí)后，將其涂布于在L培養(yǎng)基中添加前述極限培養(yǎng)基成分和40mg/L卡那霉素而得到的瓊脂培養(yǎng)基上。將出現(xiàn)的菌落用該培養(yǎng)基純化后、通過(guò)PCR確認(rèn)ams基因已被卡那霉素抗性基因取代，將該菌抹命名為SC17sucAams抹。將來(lái)自朋朋atoAJ13355林的染色體DNA用限制酶Sau3AI部分消化后，回收約10kb的片段，將其導(dǎo)入pSTV28(TaKaRaBio公司)的BamHI位點(diǎn)，制作了質(zhì)粒文庫(kù)。通過(guò)電穿孔將該質(zhì)粒文庫(kù)導(dǎo)入采用常M^方法制備的SC17sucAams斗朱的感受態(tài)細(xì)胞中。以氯霉素抗性為指標(biāo)，用在L培養(yǎng)基(細(xì)菌用胰蛋白胨10g、酵母抽提物5g、NaC15g、瓊脂15g含于純水lL而得到的培養(yǎng)基，pH7.0)中添加極限培養(yǎng)基成分(葡萄糖0.5g、硫酸鎂2mM、磷酸二氫鉀3g、氯化鈉0.5g氯化銨lg、磷酸氫二鈉6g含于純水lL中而得到的培養(yǎng)基)而得到的平板，對(duì)導(dǎo)入了質(zhì)粒文庫(kù)的SC17sucAams林進(jìn)行選擇，獲得了轉(zhuǎn)化體。將該轉(zhuǎn)化體涂布在SC17sucAams無(wú)法形成菌落的、含高濃度L-谷氨酸的葡萄糖極限培養(yǎng)基(葡萄糖極限培養(yǎng)基中混合最終濃度0.2M的L-谷氨酸鈉及賴氨酸、曱硫氨酸、二氨基庚二酸各100mg/L而得到的培養(yǎng)基)上。34。C培養(yǎng)3天，對(duì)于出現(xiàn)的菌落中的64個(gè)克隆，再次用相同的平板使之形成單一菌落，結(jié)果得知，其中有11個(gè)克隆在48小時(shí)后形成菌落，其余的克隆在72小時(shí)后形成菌落。然后、對(duì)導(dǎo)入各轉(zhuǎn)化體的載體中插入的基因進(jìn)行了解析。分別從各轉(zhuǎn)化體抽提質(zhì)粒，測(cè)定了堿基序列，結(jié)果得知，48小時(shí)后形成菌落的11個(gè)克隆中，有IO個(gè)克隆包含相同的基因座，它們中的任何一個(gè)均包含與大腸桿菌的功能未知基因ybjL顯示同源性的基因。而且，在WO2005/085419所述的獲取谷氨酸排出系統(tǒng)基因yhfK的條件下不能獲得該ybjL基因，反過(guò)來(lái)，在本次選擇的條件下也不能獲得yhfK基因。為了確認(rèn)賦予該谷氨酸抗性的因子是ybjL,進(jìn)行了ybjL基因的克隆。以AJ13355抹的染色體DNA為模板，使用SEQIDNO:8和SEQIDNO:9所示的寡核苷酸ybjL-Fl，ybjL-R2進(jìn)行了PCR,擴(kuò)增出了包含P.ananatis的ybjL基因的約1.8kb的片段。將該片段使用WizardPCRPrepDNAPurificationSystem(Promega公司制造)進(jìn)行純化后，用限制酶Kpnl和SphI進(jìn)行處理，將其與用相同酶處理的pSTV28(寶酒造林式會(huì)社制造)連接，從41而得到了pSTV-PanybjL。用該pSTV-PanybjL質(zhì)粒和比較對(duì)照用質(zhì)粒pSTV28(寶酒造林式會(huì)社制造)轉(zhuǎn)化SCHsucA株，構(gòu)建了SC17sucA/pSTV-PanybjL抹、SC17sucA/pSTV28抹。將SC17sucA/pSTV-ybjL涂布于含谷氨酸的極限培養(yǎng)基(葡萄糖0.5g或蔗糖0.5g、硫酸鎂2mM、磷酸二氫鉀3g、氯化鈉0.5g、氯化銨lg、磷酸氫二鈉6g、L-谷氨酸鈉0.2M、賴氨酸、甲硫氨酸和二氨基庚二酸各100mg、瓊脂15g含于純水1L中而得到的培養(yǎng)基)。34。C培養(yǎng)2天，結(jié)果發(fā)現(xiàn)作為對(duì)照一朱的載體導(dǎo)入4朱SC17sucA/pSTV284朱無(wú)法形成菌落，而SC17sucA/pSTV-ybjL能夠在極限培養(yǎng)基上形成菌落。然后，將SC17sucA/pSTV-PanybjL抹用含有谷氨酸的液體極限培養(yǎng)基(葡萄糖0.5g、硫酸鎂2mM、磷酸二氫鉀3g、氯化鈉0.5g、氯化銨lg磷酸氫二鈉6g、L-谷氨酸鈉0.2M、賴氨酸、曱硫氨酸、二氨基庚二酸各100mg/L含于純水1L中而得到的培養(yǎng)基)進(jìn)行培養(yǎng)，考察了在高濃度L-谷氨酸存在下的生長(zhǎng)。結(jié)果如圖3所示。可見(jiàn)，與作為對(duì)照林使用的SC17sucA/pSTV28株相比，ybjL基因增強(qiáng)的SC17sucA/pSTV-PanybjL在高濃度L-谷氨酸存在下的生長(zhǎng)大幅提高。因此可以確認(rèn)ybjL是對(duì)L-谷氨酸顯示抗性的因子。〔實(shí)施例2〕<ybjL基因擴(kuò)增對(duì)中性pH下的L-谷氨酸生產(chǎn)的效果〉然后，為了研究該基因?qū)-谷氨酸生產(chǎn)的影響，將ybjL擴(kuò)增用質(zhì)粒pSTV-PanybjL導(dǎo)入到具有SEQIDNO:10所示的L-谷氨酸生產(chǎn)用質(zhì)粒RSFCPG的L-谷氨酸生產(chǎn)菌SC17sucA/RSFCPG(參照特開(kāi)平2001-333769號(hào)公報(bào))中，考察了L-谷氨酸生產(chǎn)率。通過(guò)電穿孔向SC17sucA/RSFCPG中分別導(dǎo)入pSTV-PanybjL和比較對(duì)照用的pSTV28(寶酒造抹式會(huì)社制造)，以氯霉素抗性為指標(biāo)獲得了轉(zhuǎn)化體。對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行確認(rèn)后，將導(dǎo)入了ybjL擴(kuò)增用質(zhì)粒的菌抹命名為SC17sucA/RSFCPG+pSTV-PanybjL，將導(dǎo)入了pSTV28的菌林命名為SC17sucA/RSFCPG+pSTV28。然后，使用SC17sucA/RSFCPG+pSTV-PanybjL和作為對(duì)照抹的SC17sucA/RSFCPG+pSTV28進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)L-谷氨酸的生產(chǎn)能力進(jìn)行了研究。培養(yǎng)基的組成如下?！才囵B(yǎng)培養(yǎng)基組成〕〔A區(qū)〕蔗糖30g/LMgS04.7H200.5g/L〔B區(qū)〕KH2P042.0g/L酵母提取物2.0g/LFeS04.7H200.02g/LMnS04.5H200.02g/LL-賴氨酸鹽酸鹽0.2g/LDL-曱硫氨酸0.2g/L二氨基庚二酸0.2g/L(用KOH調(diào)整至pH7.0)〔C區(qū)〕CaC0320g/LA區(qū)、B區(qū)分別于115。C高壓滅菌器滅菌10分鐘、C區(qū)于180。C干熱滅菌3小時(shí)，然后進(jìn)行混合，添加四環(huán)素鹽酸鹽/氯霉素至濃度分別為12.5mg/L和25mg/L。將SC17sucA/RSFCPG+pSTV29和SC17sucA/RSFCPG+pSTV畫(huà)PanybjL用在L瓊脂培養(yǎng)基(細(xì)菌用胰蛋白胨10g、酵母抽提物5g、NaCl5g、瓊脂15g含于純水1L而得到的培養(yǎng)基pH7.0)中添加極限培養(yǎng)基成分(葡萄糖0.5g、硫酸鎂2mM、磷酸二氫鉀3g、氯化鈉0.5g、氯化銨lg、磷酸氫二鈉6g含于純水1L中而得到的培養(yǎng)基)和25mg/L的氯霉素、12.5mg/L的四環(huán)素而得到的培養(yǎng)基進(jìn)行前培養(yǎng)，適量地接菌到裝有前述培養(yǎng)基5mL的試管中。培養(yǎng)17.5小時(shí)后，測(cè)定了培養(yǎng)液中的菌體濃度、L-谷氨酸濃度以及殘留糖。菌體濃度通過(guò)使用用水稀釋至51倍的培養(yǎng)液、用分光光度計(jì)(U-200OA日立制作所)測(cè)定620nm的濁度來(lái)考察。L-谷氨酸濃度是通過(guò)將培養(yǎng)液上清用水稀釋適當(dāng)倍率后，使用BIOTECHANALYSER(AS-210SAKURASI)來(lái)測(cè)定。結(jié)果如表l所示。與對(duì)照SC17sucA/RSFCPG+pSTV28相比，ybjL擴(kuò)增抹SC17sucA/RSFCPG+pSTV-PanybjL的L-谷氨酸蓄積上升了約3g/L、相對(duì)于糖的收率上升了約9%。表1表1OD620咖(X1/51)L-谷氨酸(g/L)相對(duì)于糖的收率(％)SC17sucA/RSFCPG+pSTV280.38515.044.5SC17sucA/RSFCPG+pSTV-PanybjL0.28018.053.7〔實(shí)施例3〕<大腸桿菌的ybjL基因的擴(kuò)增效果〉然后，將大腸桿菌的ybjL基因?qū)隨C17sucA/RSFCPG抹中，考察了對(duì)Glu生產(chǎn)能力的效果。以登錄于GeneBankAP009048的大腸桿菌的ybjL的序列(SEQIDNO:3)為基礎(chǔ)，使用示于SEQIDNO:11、12的寡核苷酸，以大腸桿菌W3110抹(ATCC27325)的染色體為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到了含ybjL基因的約1.7kb的片段。將該片段用KpnI、Sphl處理，并連接在pSTV28(寶酒造林式會(huì)社制造)的相同位點(diǎn)上。將所得的大腸桿菌ybjL擴(kuò)增用質(zhì)粒作為ybjL擴(kuò)增用質(zhì)粒pSTV-EcoybjL。將所得的大腸桿菌ybjL基因擴(kuò)增用質(zhì)粒pSTV-EcoybjL通過(guò)電穿孔導(dǎo)入上述的SC17sucA/RSFCPG林，以氯霉素抗性為指標(biāo)得到了轉(zhuǎn)化體。將所得菌林命名為大腸桿菌ybjL基因擴(kuò)增抹SC17sucA/RSFCPG+pSTV-EcoybjL。然后，使用SC17sucA/RSFCPG+pSTV-EcoybjL和對(duì)照株SC17sucA/RSFCPG+pSTV28進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)L-谷氨酸的生產(chǎn)能力進(jìn)行了研究。i咅，l的纟且^J口"F?！才囵B(yǎng)培養(yǎng)基組成〕〔A區(qū)〕蔗糖30g/LMgS04.7H200.5g/L〔B區(qū)〕KH2P042.0g/L酵母提取物2.0g/LFeS04.7H200.02g/LMnS04.5H200.02g/LL-賴氨酸鹽酸鹽0.2g/LDL-曱硫氨酸0.2g/L二氨基庚二酸0.2g/L(用KOH調(diào)整至pH7.0)〔C區(qū)〕CaC0320g/LA區(qū)、B區(qū)分別于115。C高壓滅菌器滅菌10分鐘、C區(qū)于18(TC干熱滅菌3小時(shí)，然后將它們混合，添加四環(huán)素鹽酸鹽和氯霉素至濃度分別為12.5mg/L和25mg/L。將SC17sucA/RSFCPG+pSTV28和SC17sucA/RSFCPG+pSTV-EcoybjL用在L瓊脂培養(yǎng)基(細(xì)菌用胰蛋白胨10g、酵母抽提物5g、NaCl5g、瓊脂15g含于純水1L而得到的培養(yǎng)基pH7.0)中添加極限培養(yǎng)基成分(葡萄糖0.5g、硫酸鎂2mM、磷酸二氫鉀3g、氯化鈉0.5g、氯化銨lg、磷酸氫二鈉6g含于純水1L中而得到的培養(yǎng)基)和25mg/L的氯霉素、12.5mg/L的四環(huán)素而得到的培養(yǎng)基進(jìn)行前培養(yǎng)，適量接菌到裝有前述培養(yǎng)基5mL的試管中。培養(yǎng)17.5小時(shí)后，如實(shí)施例2那樣測(cè)定了培養(yǎng)液中的菌體濃度以及L-谷氨酸濃度。結(jié)果如表2所示。與對(duì)照SC17sucA/RSFCPG+pSTV28相比，ybjL擴(kuò)增抹SC17sucA/RSFCPG+pSTV-EcoybjL的L-谷氨酸蓄積上升了約2g/L，相對(duì)于糖的收率上升了約7%。表2表2<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>〔實(shí)施例4〕<大腸桿菌中ybjL基因擴(kuò)增對(duì)L-氨基酸生產(chǎn)能力的效果〉然后，將i^"foea來(lái)源的ybjL基因、大腸桿菌來(lái)源的ybjL基因?qū)氪竽c桿菌中，研究了擴(kuò)增效果。將上述的aw朋ato來(lái)源的ybjL基因擴(kuò)增用載體pSTV-PanybjL、大腸桿菌來(lái)源的ybjL基因擴(kuò)增用載體pSTV-EcoybjL、以及對(duì)照用質(zhì)粒pSTV28通過(guò)電穿孔導(dǎo)入大腸桿菌野生抹W3110林中，得到了顯示氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化體。將尸朋toea來(lái)源的ybjL擴(kuò)增抹命名為W3110/pSTV-PanybjL，將大腸桿菌來(lái)源的ybjL擴(kuò)增才朱命名為W3110/pSTV-EcoybjL,將對(duì)照pSTV28導(dǎo)入沖朱命名為W3110/pSTV28。然后，使用ybjL擴(kuò)增抹W3110/pSTV-PanybjL和W3110/pSTV-EcoybjL、以及對(duì)照W3110/pSTV28，研究了L-谷氨酸的生產(chǎn)能力。將W3110/pSTV-PanybjL、W3110/pSTV-EcoybjL和對(duì)照W3110/pSTV28用在L培養(yǎng)基(細(xì)菌用胰蛋白胨10g、酵母抽提物5g、NaC15g、瓊脂15g含于純水1L中而得到的培養(yǎng)基，pH7.0)中添加氯霉素而得到的培養(yǎng)基進(jìn)行前培養(yǎng)，用Nunc公司制造的lmL容量接種環(huán)取1環(huán)上述菌體，接菌到裝有具有以下組成的培養(yǎng)基5mL的試管中，37。C振蕩培養(yǎng)11.5小時(shí)。如實(shí)施例2那樣測(cè)定了培養(yǎng)液中的菌體濃度以及L-谷氨酸濃度。結(jié)果如表3所示?！才囵B(yǎng)培養(yǎng)基組成〕〔A區(qū)〕葡萄糖MgS04-7H20〔B區(qū)〕(NH4)2S04KH2P04酵母提取物FeS04.7H20MnS04.5H20(用KOH調(diào)整至pH7.0)〔C區(qū)〕碳酸釣30g/L0.5g/L20g/L2.0g/L2.0g/L20mg/L20mg/L20g/LA區(qū)、B區(qū)分別于115。C高壓滅菌器滅菌IO分鐘、C區(qū)于18(TC干熱滅菌3小時(shí)，然后將它們混合，添加氯霉素使其為25mg/L。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>與對(duì)照載體導(dǎo)入抹W3110/pSTV29株相比，作為戶a"toeaybjL基因擴(kuò)增抹的大腸桿菌W3110/pSTV-ybjL的L-谷氨酸生產(chǎn)能力大幅提高。然后，對(duì)ybjL擴(kuò)增抹的生產(chǎn)其它L-氨基酸的能力進(jìn)行了研究。將W3110/pSTV-PanybjL與對(duì)照的W3110/pSTV28用在L培養(yǎng)基(細(xì)菌用胰蛋白胨10g、酵母抽提物5g、NaCl5g、瓊脂15g含于純水1L而得到的培養(yǎng)基，pH7.0)中添加氯霉素而得到的培養(yǎng)基進(jìn)行前培養(yǎng)，用Nunc公司制造的5mL容量接種環(huán)取1環(huán)上述菌體，將其接菌到裝有5mL具有以下組成的培養(yǎng)基的試管中，37。C振蕩培養(yǎng)7小時(shí)。如實(shí)施例2那樣，測(cè)定了培養(yǎng)液中的菌體濃度以及各L-氨基酸濃度。結(jié)果如表4所示。〔培養(yǎng)培養(yǎng)基組成〕A區(qū)、B區(qū)分別于115。C高壓滅菌器滅菌IO分鐘、C區(qū)于180。C干熱滅菌3小時(shí)，然后加以混合，添加氯霉素^f吏其為25mg/L?！睞區(qū)〕葡萄糖MgS04.7H20〔B區(qū)〕(NH4)2S04KH2P04酵母提取物FeS04.7H20MnS04.5H20(用KOH調(diào)整至pH7.0)〔C區(qū)〕碳酸4丐20g/L2.0g/L2.0g/L20mg/L20mg/L40g/L0.5g/L30g/L表4表4<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>*:未接菌的空白可見(jiàn)與對(duì)照載體導(dǎo)入抹W3110/pSTV28株相比，作為ybjL基因擴(kuò)增抹的大腸桿菌W3110/pSTV-PanybjL中，不僅是L-谷氨酸，L-天冬氨酸的蓄積量也有所^提高?！矊?shí)施例5〕<植生克雷伯氏菌中ybjL基因擴(kuò)增對(duì)L-谷氨酸生產(chǎn)能力的效果>將尸a"/oeaa"(3"ato來(lái)源的ybjL基因?qū)?直生克雷伯氏菌，研究了擴(kuò)增效果。通過(guò)電穿孔將上述的來(lái)源ybjL基因擴(kuò)增用載體pSTV-PanybjL與對(duì)照用質(zhì)粒pSTV28導(dǎo)入植生克雷伯氏菌的L-谷氨酸生產(chǎn)菌AJ13410抹(特愿平11-68324)中，得到了顯示氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化體。將來(lái)源的ybjL擴(kuò)增才朱命名為AJ13410/pSTV-PanybjL，將對(duì)照pSTV28導(dǎo)入林命名為AJ13410/pSTV28。然后，使用ybjL擴(kuò)增株AJ13410/pSTV-PanybjL、以及對(duì)照的AJ13410/pSTV28,研究了L-谷氨酸的生產(chǎn)能力。將AJ13410/pSTV-PanybjL和AJlM10/pSTV28用在L培養(yǎng)基(細(xì)菌用胰蛋白胨10g、酵母抽提物5g、NaC15g、瓊脂1Sg含于純水lL而得到的培養(yǎng)基，pH7.0)中添加氯霉素而得到的培養(yǎng)基進(jìn)行前培養(yǎng)，用Nunc公司制造的lmL容量接種環(huán)取1環(huán)上述菌體，將其接菌在裝有具有以下組成的培養(yǎng)基5mL的試管中，37。C振蕩培養(yǎng)17小時(shí)。如實(shí)施例2那樣，測(cè)定了培養(yǎng)液中的菌體濃度以及L-谷氨酸濃度。結(jié)果如表5所示?！才囵B(yǎng)培養(yǎng)基組成〕〔A區(qū)〕蔗糖30g/LMgSO4.7H200,5g/L〔B區(qū)〕KH2P042.0g/L酵母提取物2.0g/LFeSO4-7H200.02g/LMnSO4.5H200.02g/LL-賴氨酸鹽酸鹽0.2g/LDL-曱硫氨酸0.2g/L二氨基庚二酸0.2g/L(用KOH調(diào)整至pH7.0)'〔C區(qū)〕CaC0320g/LA區(qū)、B區(qū)分別于115。C高壓滅菌器滅菌IO分鐘、C區(qū)于180。C干熱滅菌3小時(shí)，然后加以混合，添加氯霉素使其為25mg/L。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>可見(jiàn)與對(duì)照載體導(dǎo)入抹AJ13410/pSTV28抹相比，來(lái)源的ybjL基因擴(kuò)增4朱植生克雷伯氏菌AJ13410/pSTV-PanybjL的L-谷氨酸生產(chǎn)能力有大幅提高。〔參考例4〕<大腸桿菌L，D-乳酸脫氫酶基因缺損抹的構(gòu)建〉該基因的缺失利用Datsenko和Wanner開(kāi)發(fā)的稱(chēng)為"Red驅(qū)動(dòng)整合(Red-drivenintegration)"的方法(Datsenko，K.A.和Wanner,B.L.2000.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97:6640-6645)與人噬菌體來(lái)源的切出系統(tǒng)(Cho，E.H.,Gumport，R.I.和Gardner,J.F.2002.J.Bacteriol.184:5200-5203)來(lái)實(shí)施。通過(guò)該方法，使用將目的基因的一部分設(shè)計(jì)在其5，側(cè)、將抗生素抗性基因的一部分設(shè)計(jì)在其3'側(cè)而得到的合成寡核苷酸作為引物得到PCR產(chǎn)物，利用這樣的PCR產(chǎn)物能夠一步構(gòu)建基因破壞抹。通過(guò)進(jìn)一步組合使用X噬菌體來(lái)源的切出系統(tǒng)，能夠除去整合到基因破壞林中的抗生素抗性基因。<1-1>編碼D-乳酸脫氬酶的ldhA基因缺損抹的構(gòu)建按照WO2005/010175的記載，使用下述合成寡核苷酸作為引物，以質(zhì)粒pMW118-attL-Cm-attR為模板進(jìn)行了PCR:所述引物在其5'末端具有對(duì)應(yīng)于ldhA基因的一部分的序列，在其3'末端具有對(duì)應(yīng)于人噬菌體的attL和attR的兩端的序列。pMWl18-attL-Cm-attR是在pMWl18(寶生物公司制造)中插入作為X噬菌體的附著位點(diǎn)的attL和attR基因以及抗生素抗性基因cat基因而得到的質(zhì)粒，其中，按attL-cat-attR的順序插入。用作引物的合成寡核苦酸的序列如SEQIDNO:13、14所示。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠純化，通過(guò)電穿孔將其導(dǎo)入攜帶具有溫度敏感型的復(fù)制能力的質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌MG1655抹中。然后，獲取質(zhì)粒pKD46已脫落的氨節(jié)青霉素敏感型菌抹，通過(guò)PCR確認(rèn)了ldhA基因缺失。PCR使用SEQIDNO:15，16所示的合成寡核苷酸作為引物進(jìn)行。親本抹的PCR產(chǎn)物為約1.2kb，而在缺損株中確認(rèn)到約1.9kb的條帶。而且，為了除去導(dǎo)入ldhA基因內(nèi)的att-cat基因，用輔助質(zhì)粒pMW-intxis-ts進(jìn)行轉(zhuǎn)化，選擇出氨千青霉素抗性抹。此外，上述的pMW-intxis-ts是具有X噬菌體來(lái)源的整合酶(Int)基因和切除酶(excisionase、Xis)，且復(fù)制是溫度敏感型的質(zhì)粒。然后，利用氨芐青霉素敏感性和氯霉素敏感性，通過(guò)PCR確認(rèn)了att-cat和pMW-intxis-ts脫落的菌抹。使用SEQIDNO:15、16所示的合成寡核苦酸作為引物進(jìn)行PCR，殘存有att-cat的抹的PCR產(chǎn)物為約1.9kb，與此相對(duì)的是，在att-cat脫落的菌林中確認(rèn)到了約0.3kb的條帶，將所得ldhA缺損林命名為MG1655AldhA林。<1-2>編碼L-乳酸脫氫酶的lldD基因缺損株的構(gòu)建按與ldhA基因缺損林的構(gòu)建相同的方法進(jìn)行了構(gòu)建。使用下述合成寡核苷酸作為引物，以質(zhì)粒pMW118-attL-Cm-attR為模板進(jìn)行了PCR，所述合成寡核苷酸引物在其5'末端具有對(duì)應(yīng)于lldD基因的一部分的序列，在其3'末端具有對(duì)應(yīng)于X噬菌體的attL和attR的兩端的序列。用作引物的合成寡核苷酸的序列如SEQIDNO:17、18所示。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠純化，通過(guò)電穿孔將其導(dǎo)入攜帶具有溫度^t感型的復(fù)制能力的質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌MG1655AldhA林中。然后，獲取質(zhì)粒pKD46已脫落的氨芐青霉素敏感型菌抹，通過(guò)PCR確認(rèn)了lldD基因缺失。PCR使用SEQIDNO:19、20所示的合成寡核芬酸作為引物進(jìn)行。與親本4朱的PCR產(chǎn)物為約1.4kb相對(duì)，在缺損抹中確認(rèn)到約1.9kb的條帶。而且，為了除去導(dǎo)入lldD基因內(nèi)的att-cat基因，用輔助質(zhì)粒pMW-intxis-ts進(jìn)行轉(zhuǎn)化，選擇出氨千青霉素抗性林。然后，利用氨千青霉素敏感性和氯霉素敏感性，取得了att-cat和pMW-intxis-ts脫落的菌抹，并通過(guò)PCR進(jìn)行了確認(rèn)。使用SEQIDNO:19、20所示的合成寡核苦酸作為引物進(jìn)行PCR。與殘存有att-cat的菌抹的PCR產(chǎn)物為約1.9kb相對(duì)的是，在att-cat脫落的菌林中確認(rèn)到了約0.3kb的條帶，將所得lldD缺損林命名為MG1655AldhAAlldD抹?！矊?shí)施例6〕<琥珀酸生產(chǎn)菌ybjL基因增強(qiáng)林的構(gòu)建〉<6-1>基因擴(kuò)增用質(zhì)粒的構(gòu)建將質(zhì)粒pMW219::Pthr用于ybjL基因的擴(kuò)增。該質(zhì)粒在載體pMW219(日本GENE公司制造)的HindIII位點(diǎn)和BamHI位點(diǎn)中具有SEQIDNO:21所示的大腸桿菌基因組上的蘇氨酸操縱子(thrLABC)的啟動(dòng)子區(qū)域。將基因克隆在該質(zhì)粒的所述啟動(dòng)子的下游，能夠?qū)崿F(xiàn)基因的擴(kuò)增。<6-2>ybjL增強(qiáng)用質(zhì)粒的構(gòu)建基于大腸桿菌基因組序列的ybjL基因的堿基序列(GenBank登錄號(hào)U00096),使用具有BamHI位點(diǎn)的SEQIDNO:22所示的合成寡核苷酸作為5'引物、具有BamHI位點(diǎn)的SEQIDNO:23所示的合成寡核普酸作為3'側(cè)引物，以大腸桿菌MG1655抹的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR,并用限制酶BamHI進(jìn)行處理，從而得到了含ybjL基因的基因片段。將經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物與用BamHI處理后的載體pMW219::Pthr相連接，構(gòu)建了ybjL擴(kuò)增用質(zhì)粒pMW219::Pthr::ybjL。<6-3>ybjL擴(kuò)增抹的制備使用上述(6-2)中得到的pMW219::Pthr::ybjL和pMW219,通過(guò)電脈沖法轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655AldhAAlldD林，然后涂布在含卡那霉素25pg/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37。C培養(yǎng)約18小時(shí)。純化出現(xiàn)的菌落，按常規(guī)方法抽提質(zhì)粒，確認(rèn)了目的質(zhì)粒的導(dǎo)入。將所得菌林分別命名為MG1655AldhAAlldD/pMW219::Pthr::ybjL、MG1655AldhAAlldD/pMW219。此外，使用pMW219::Pthr::ybjL和pMW219采用電脈沖法轉(zhuǎn)化產(chǎn)氣腸桿菌AJ110637,然后涂布在含卡那霉素50嗎/ml的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37。C培養(yǎng)約18小時(shí)。對(duì)出現(xiàn)的菌落進(jìn)行純化，采用常規(guī)方法抽提質(zhì)粒，確認(rèn)了目的質(zhì)粒的導(dǎo)入。將所得菌片朱分別命名為AJ110637/pMW219::Pthr::ybjL、AJ110637/pMW219。〔實(shí)施例7〕埃希氏菌屬細(xì)菌琥珀酸生產(chǎn)抹中的ybjL擴(kuò)增的效果將MG1655AldhAAlldD/pMW219::Pthr::ybjL、MG1655AldhAAlldD/pMW219均勻涂布在含25jig/ml的卡那霉素的LB平板，37。C培養(yǎng)16小時(shí)。然后，使用安寧包(Anaeropack)(三菱氣體化學(xué)抹式會(huì)社)將該平板在厭氧條件下37。C培養(yǎng)16小時(shí)。將所得平板的菌體用0.8%的食鹽水清洗后，稀釋51倍將其制備成OD=1.0(600nm)。將該菌體懸浮液lOOjil與預(yù)先通過(guò)吹入氮?dú)鈱⑴囵B(yǎng)基中溶解的氣體置換為氮?dú)舛玫降纳a(chǎn)培養(yǎng)基(葡萄糖10g/l、蘋(píng)果酸二鈉10g/l、TES45.88g/l、Na2HP046g/l、KH2P043g/l、NH4C1lg/l，用KOH調(diào)整至pH7.3后，用濾膜過(guò)濾)1.3ml分裝到1.5ml容量的微量管中，使用微量管用攪拌器31.5。C培養(yǎng)10小時(shí)。培養(yǎng)后，通過(guò)液相色譜分析了培養(yǎng)基中蓄積的琥珀酸量。所使用的柱子是由兩根Shim-packSCR-102H(Simazu)柱串聯(lián)而成的，-使用5mM對(duì)曱苯石黃酸于50。C對(duì)樣品進(jìn)行洗脫。將洗脫液使用含5mM對(duì)曱苯磺酸和lOOpMEDTA的20mMBis-Tris水溶液進(jìn)行中和，通過(guò)使用CDD-lOAD(Simazu)測(cè)定電導(dǎo)率來(lái)測(cè)定琥珀酸。第10小時(shí)的琥珀酸蓄積見(jiàn)表6，琥珀酸蓄積的經(jīng)時(shí)變化如圖4所示。與對(duì)照的MG1655AldhAAlldD/pMW219相比，ybjL基因擴(kuò)增林MG1655AldhAAlldD/pMW219::Pthr::ybjL的琥珀酸蓄積顯著上升。表6表6琥珀酸生產(chǎn)菌MG1655AldhAAlldD中ybjL的擴(kuò)增效果<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>〔實(shí)施例8〕腸桿菌屬細(xì)菌琥珀酸生產(chǎn)抹中的ybjL擴(kuò)增的效果將AJ110637/pMW219::Pthr::ybjL、AJ110637/pMW219均勻涂布在含50嗎/ml卡那霉素的LB平板上，37。C培養(yǎng)16小時(shí)。然后，使用安寧包(AnaeroPack,三菱氣體化學(xué)抹式會(huì)社)將該平板在厭氧條件下37。C培養(yǎng)16小時(shí)。將所得平板的菌體用0.8%食鹽水清洗后，稀釋51倍制備成OD-1.0(600nm)。將該菌體懸浮液100^1與預(yù)先通過(guò)吹入氮?dú)鈱⑴囵B(yǎng)基中溶解的氣體置換為氮?dú)舛玫降纳a(chǎn)培養(yǎng)基(葡萄糖10g/l、蘋(píng)果酸二鈉10g/l、TES45.88g/l、Na2HP046g/l、KH2P043g/l、NH4CIlg/l，用KOH調(diào)整至pH7.3后，用濾膜過(guò)濾)1.3ml分裝在1.5ml容量的微量管中，用微量管用攪拌器31.5。C培養(yǎng)6小時(shí)。培養(yǎng)后，通過(guò)液相色譜分析了培養(yǎng)基中蓄積的琥珀酸量。所使用的柱子是由二根Shim-packSCR-102H(Simazu)串聯(lián)而成的，使用5mM對(duì)曱苯磺酸于50。C對(duì)樣品進(jìn)行洗脫。將洗脫液使用含5mM對(duì)曱苯磺酸和lOO^iMEDTA的20mMBis-Tris水溶液進(jìn)行中和，通過(guò)使用CDD-10AD(Simazu)測(cè)定電導(dǎo)率來(lái)測(cè)定琥珀酸。第6小時(shí)的琥珀酸蓄積見(jiàn)表7，琥珀酸蓄積的經(jīng)時(shí)變化如圖5所示。與對(duì)照的AJ110637/pMW219相比，ybjL基因擴(kuò)增才朱AJ110637/pMW219::Pthr::ybjL的琥珀酸蓄積顯著上升。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>產(chǎn)氣腸桿菌AJ110637在厭氧條件下于含糖源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，會(huì)生成顯著量的乙醇，因此，通過(guò)缺損編碼醇脫氫酶的adhE來(lái)抑制乙醇的生成。adhE缺損用基因片段是以WO2005/010175所述的質(zhì)粒pMW-attL-Tc-attR為才莫板使用SEQIDNO:72和SEQIDNO:73的寡核香酸通過(guò)PCR制備的。pMWl18-attL-Tc-attR是在pMWl18(寶生物公司制造)中插入作為X噬菌體的附著位點(diǎn)的attL和attR基因、以及抗生素抗性基因Tc基因而得到的質(zhì)粒，其中按照attL-Tc-attR的順序插入。通過(guò)所述PCR，擴(kuò)增出了在四環(huán)素抗性基因的兩端分別添加X(jué)噬菌體的attL和attR的序列、進(jìn)一步在其外側(cè)分別添加了adhE基因的上游60bp、下游59bp的序列而成的基因片段。將該片段使用WizardPCRPrepDNAPurificationSystem(Promega^>司制造)進(jìn)4亍了純化。然后，用RSF-Red-TER轉(zhuǎn)化產(chǎn)氣腸桿菌AJ110637，得到了產(chǎn)氣腸桿菌AJ110637/RSF-Red-TER林。將該菌株用含有40pg/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，將該培養(yǎng)液以1/100量接種到含40jig/ml氯霉素和0.4mM異丙基-P-D-吡喃半乳糖苷的LB培養(yǎng)基50mL中，31。C培養(yǎng)4小時(shí)。收集菌體，用冰冷的10%甘油清洗菌體3次后，最終將其懸浮于0.5mL的10%甘油中并以此作為感受態(tài)細(xì)胞，使用GENEPULSERII(BioRad公司制造)在電場(chǎng)強(qiáng)度20kV/cm、電容器容量25^F、電阻值200Q的條件下導(dǎo)入上項(xiàng)中制備的PCR片段。在細(xì)胞懸浮液中添加預(yù)先水冷的LB培養(yǎng)基，31。C振蕩培養(yǎng)2小時(shí)后，將其涂布于在LB培養(yǎng)基中添加25|ig/ml的四環(huán)素而得到的培養(yǎng)基上。將出現(xiàn)的菌落用該培養(yǎng)基純化后，通過(guò)PCR確認(rèn)了adhE基因已被四環(huán)素抗性基因取代。<9-2>AJl10637AadhE林中丙酮酸羧化酶基因增強(qiáng)林的構(gòu)建在產(chǎn)氣腸桿菌AJ110637AadhE林中，通過(guò)擴(kuò)增編碼谷氨酸棒桿菌來(lái)源的丙酮酸羧化酶的pyc,賦予其琥珀酸生成能力。為了在AJ110637AadhE林中表達(dá)谷氨酸棒桿菌來(lái)源的pyc，嘗試了獲取大腸桿菌MG1655抹的蘇氨酸操縱子啟動(dòng)子片段。大腸桿菌(大腸桿菌K-121453-1474(1997))?；谠撔蛄羞M(jìn)行了蘇氨酸操縱子(thrLABC)的啟動(dòng)子區(qū)域的PCR擴(kuò)增。使用具有Sacl位點(diǎn)的SEQIDNO:75所示的合成寡核苷酸作為5，引物、SEQIDNO:76所示的合成寡核苷酸作為3'側(cè)引物，以大腸桿菌MG1655株(ATCC47076，ATCC700926)的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，得到了蘇氨酸操縱子啟動(dòng)子片段(A)(SEQIDNO:77)。而且，獲取了谷氨酸棒桿菌2256株(ATCC13869)來(lái)源的pyc基因片段。使用SEQIDNQ78所示的合成寡核苷酸作為5'引物、具有Sacl位點(diǎn)的SEQIDNO:79所示的合成寡核苦酸作為3'側(cè)引物，以谷氨酸棒桿菌2256林(ATCC13869)來(lái)源的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，得到了pyc基因片段(B)(SEQIDNO:80)。54以上述片段(A)和(B)為模板，使用SEQIDNO:75和SEQIDNO:79的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得了由片段(A)和(B)連接而成的基因片段(C)。將該基因片段(C)用限制酶Sacl處理并進(jìn)行純化，將純化產(chǎn)物與用限制酶Sacl消化的質(zhì)粒載體pSTV28(寶生物公司制造)連接，構(gòu)建了pyc擴(kuò)增用質(zhì)粒pSTV28::Pthr::pyc。通過(guò)電穿孔將pyc擴(kuò)增用質(zhì)粒pSTV28::Pthr::pyc導(dǎo)入上述的產(chǎn)氣腸桿菌AJ110637AadhE林，得到了顯示四環(huán)素和氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化體。將產(chǎn)氣腸桿菌AJ110637AadhE的pyc擴(kuò)增4朱命名為AJ110637AadhE/pSTV28::Pthr::pyc。<9-3>AJ110637AadhE/pSTV28::Pthr::pyc中產(chǎn)氣腸桿菌來(lái)源的ybjL基因增強(qiáng)抹的構(gòu)建如上述那樣進(jìn)行了大腸桿菌(大腸桿菌K-12抹)的蘇氨酸操縱子(thrLABC)的啟動(dòng)子區(qū)域的PCR擴(kuò)增。使用SEQIDNO:81所示的合成寡核苷酸作為5，引物、SEQIDNO:82所示的合成寡核普酸作為3'側(cè)引物，以大腸桿菌MG1655抹(ATCC47076，ATCC700926)的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，得到了蘇氨酸操縱子啟動(dòng)子片段(A)(SEQIDNO:83)。然后，為了進(jìn)行產(chǎn)氣腸桿菌AJ110637抹的ybjL基因的克隆，使用SEQIDNO:84所示的合成寡核苷酸作為5'引物、SEQIDNO:85所示的合成寡核苷酸作為3'側(cè)引物，以產(chǎn)氣腸桿菌AJ110637抹的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，得到了ybjL基因片段(B)(SEQIDNO:86)。以上述片段(A)和(B)為模板，使用SEQIDNO:81和SEQIDNO:85的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到了片段(A)和(B)連接而成的基因片段(C)。將該基因片段(C)使用TaKaRaBKLKit(寶生物公司制造)進(jìn)行平滑末端化，再進(jìn)行5'末端的磷酸化。然后，將其與用限制酶SmaI消化，再用堿性磷酸酶進(jìn)行了脫磷酸化處理的質(zhì)粒載體pMW218連接，從而構(gòu)建了ybjL擴(kuò)增用質(zhì)粒pMW218::Pthr::Ent-ybjL。通過(guò)電穿孔將上述的產(chǎn)氣腸桿菌AJ110637來(lái)源ybjL基因擴(kuò)增用載體pMW218::Pthr::Ent-ybjL與對(duì)照用質(zhì)粒pMW218分別導(dǎo)入產(chǎn)氣腸桿菌AJ110637AadhE/pSTV28::Pthr::pyc抹，得到了顯示四環(huán)素、氯霉素以及卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化體。將產(chǎn)氣腸桿菌AJ110637AadhE/pSTV28::Pthr::pyc抹來(lái)源的ybjL擴(kuò)增抹命名為AJ110637AadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218::Pthr::Ent-ybjL，將對(duì)照的pMW218導(dǎo)入4朱命名為AJ110637AadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218。<9—4>腸桿菌屬細(xì)菌中的產(chǎn)氣腸桿菌來(lái)源的ybjL擴(kuò)增的效果將AJ110637AadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218::Pthr::Ent-ybjL、AJ110637AadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218分別均勻涂布在含50嗎/ml卡那霉素、25昭/ml四環(huán)素以及40嗎/ml氯霉素的LB平板上，31.5。C培養(yǎng)16小時(shí)。然后，將其接菌在分裝有種子培養(yǎng)基(細(xì)菌用胰蛋白胨20g/1、酵母抽提物10g/1NaCl20g/L)3ml的試管中，31.5。C振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。將所得的培養(yǎng)液添加在琥珀酸生產(chǎn)培養(yǎng)基(葡萄糖100g/l、干熱滅菌3小時(shí)以上的碳酸鉤50g/L)3ml中后，用硅膠塞密閉，31.5。C振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后，通過(guò)液相色譜分析了培養(yǎng)基中蓄積的琥珀酸量。所使用的柱子是將兩根Shim-packSCR-102H(Simadzu)串聯(lián)而成的，使用5mM對(duì)曱苯磺酸于50。C洗脫樣品。洗脫液使用含5mM對(duì)曱苯磺酸和lOO(iMEDTA的20mMBis-Tris水溶液進(jìn)行中和，通過(guò)用CDD-10AD(Simadzu)測(cè)定電導(dǎo)率測(cè)定了琥珀酸。第24小時(shí)的琥珀酸蓄積如表8所示。與對(duì)照的AJ110637AadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218相比，ybjL基因擴(kuò)增抹AJ110637AadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218::Pthr::Ent-ybjL中，琥珀酸蓄積以及琥珀酸的相對(duì)消耗的糖的收率顯著上升。表8表8AJ110637AadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218AJ110637AadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218::Pthr::Ent-ybjE消耗的糖量(g/L)9.53(±1.85)9.10(±0.66)OD(600謡)8.90(士0.18)8.72(±0.95)琥珀酸蓄積量(g/L)3.40(±0,56)6.37(±0,51)琥珀酸相對(duì)消耗的糖的收率(％)35.80(±1.82)69.70(±1.79)56〔序列表說(shuō)明〕SEQIDNO:1:awawato的ybjL基因SEQIDNO:2:的YbjLSEQIDNO:3:大腸桿菌的ybjL基因SEQIDNO:4:大腸桿菌的YbjLSEQIDNO:5:尸"w/oea""awa/^與大腸桿菌的YbjL的共有序列SEQIDNO:6:ams基因破壞用引物SEQIDNO:7:ams基因石皮壞用引物SEQIDNO:8:戶.的ybjL擴(kuò)增用引物SEQIDNO:9:尸.""a"a^的ybjL擴(kuò)增用引物SEQIDNO:10RSFCPG質(zhì)粒序列SEQIDNO:11大腸桿菌W3110的ybjL擴(kuò)增用引物SEQIDNO:12大腸桿菌W3110的ybjL擴(kuò)增用引物SEQIDNO:13ldhA缺損用引物SEQIDNO:14ldhA缺損用引物SEQIDNO:15ldhA缺損確認(rèn)用引物SEQIDNO:16ldhA缺損確認(rèn)用引物SEQIDNO:17lldD缺損用引物SEQIDNO:18lldD缺損用引物SEQIDNO:19lldD缺損確認(rèn)用引物SEQIDNO:20lldD缺損確認(rèn)用引物SEQIDNO:21蘇氨酸啟動(dòng)子序列SEQIDNO:22大腸桿菌MG1655的ybjL擴(kuò)增用引物SEQIDNO:23大腸桿菌MG1655的ybjL擴(kuò)增用引物SEQIDNO:24鼠傷寒沙門(mén)氏菌的ybjL基因SEQIDNO:25鼠傷寒沙門(mén)氏菌的YbjLSEQIDNO:26鼠疫耶爾森氏菌的ybjL基因SEQIDNO:27鼠疫耶爾森氏菌的YbjLSEQIDNO:28胡蘿卜軟腐歐文氏菌的ybjL基因SEQIDNO:29胡蘿卜軟腐歐文氏菌的YbjLSEQIDNO:30霍亂弧菌的ybjL基因SEQIDNO:31:霍亂弧菌的YbjLSEQIDNO:32:嗜水氣單胞菌的ybjL基因SEQIDNO:33:嗜水氣單胞菌的YbjLSEQIDNO:34:深海發(fā)光桿菌的ybjL基因SEQIDNO:35:深海發(fā)光桿菌的YbjLSEQIDNO:36:大腸桿菌的ldhA基因SEQIDNO:37:大腸桿菌的LdhASEQIDNO:38:大腸桿菌的IWD基因SEQIDNO:39:大腸桿菌的LldDSEQIDNO:40:awawato的hisD基因的石威基序歹寸SEQIDNO:41:用于擴(kuò)增用于將Kmr基因?qū)雋isD基因的片段的引物SEQIDNO:42:用于擴(kuò)增用于將Kmf基因?qū)雋isD基因的片段的引物SEQIDNO:43:cat基因擴(kuò)增用引物SEQIDNO:44:cat基因擴(kuò)增用引物SEQIDNO:45:sacB基因擴(kuò)增用引物SEQIDNO:46:sacB基因擴(kuò)增用引物SEQIDNO:47:用于擴(kuò)增含PlacUV5啟動(dòng)子的DNA片段的引物SEQIDNO:48:用于擴(kuò)增含PlacUV5啟動(dòng)子的DNA片段的引物SEQIDNO:49:用于擴(kuò)增含WedaPY基因以及tL3的DNA片段的引物SEQIDNO:50:用于擴(kuò)增含XReda(3y基因以及tL3的DNA片段的引物SEQIDNO:51:用于擴(kuò)增含PlacUV5啟動(dòng)子和TrrnB的DNA片段的引物SEQIDNO:52:用于擴(kuò)增含PlacUV5啟動(dòng)子和TrrnB的DNA片段的引物SEQIDNO:53:attL擴(kuò)增用引物SEQIDNO:54:attL擴(kuò)增用引物SEQIDNO:55:attL的石威基序列SEQIDNO:56:attR擴(kuò)增用引物SEQIDNO:57:attR擴(kuò)增用引物SEQIDNO:58:attR的i威基序列SEQIDNO:59:用于擴(kuò)增含bla基因的DNA片段的引物SEQIDNO:60:用于擴(kuò)增含bla基因的DNA片段的引物SEQIDNO:61:用于擴(kuò)增含ter—rrnB的DNA片段的引物SEQIDNO:62用于擴(kuò)增含ter—rrnB的DNA片段的引物SEQIDNO:63含ter—thrL終止子的DNA片段的石成基序列SEQIDNO:64用于擴(kuò)增含ter一thrL終止子的DNA片段的引物SEQIDNO:65用于擴(kuò)增含ter_thrL終止子的DNA片段的引物SEQIDNO:66戶a她eaa加W(3fe的ams操縱子SEQIDNO:67尸awfoea的AmsHSEQIDNO:68尸awtoea的AmslSEQIDNO:69尸awto6aAfw朋加.51的AmsASEQIDNO:70P朋toea"wawato的AmsCSEQIDNO:71""awa^i的AmsBSEQIDNO:72:adhE缺損用引物的堿基序列SEQIDNO:73:adhE缺損用引物的石成基序列SEQIDNO:74:產(chǎn)氣腸桿菌AJlIO637adhE堿基序列(部分序列)SEQIDNO:75:蘇氨酸啟動(dòng)子擴(kuò)增用引物SEQIDNO:76:蘇氨酸啟動(dòng)子擴(kuò)增用引物SEQIDNO:77:蘇氨酸啟動(dòng)子基因片段SEQIDNO:78:丙酮酸羧化酶基因擴(kuò)增用引物SEQIDNO:79:丙酮酸羧化酶基因擴(kuò)增用引物SEQIDNO:80:丙酮酸羧化酶基因片段SEQIDNO:81:蘇氨酸啟動(dòng)子擴(kuò)增用引物SEQIDNO:82:蘇氨酸啟動(dòng)子擴(kuò)增用引物SEQIDNO:83:蘇氨酸啟動(dòng)子基因片段SEQIDNO:84:產(chǎn)氣腸桿菌AJl10637ybjL擴(kuò)增用引物的石威基序列SEQIDNO:85:產(chǎn)氣腸桿菌AJl10637ybjL擴(kuò)增用引物的石咸基序列SEQIDNO:86:產(chǎn)氣腸桿菌AJl10637ybjL的堿基序列SEQIDNO:87.產(chǎn)氣腸桿菌AJ110637YbjL的氨基酸序列SEQIDNO:88:埃希氏菌屬、泛菌屬和腸桿菌屬的YbjL的共有序列工業(yè)實(shí)用性通過(guò)使用本發(fā)明的微生物，能夠提高具有#友基的酸性物質(zhì)的生產(chǎn)效率。59權(quán)利要求1.一種微生物，其具備生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的能力，并且經(jīng)過(guò)修飾而增強(qiáng)了ybjL基因的表達(dá)。2.權(quán)利要求1所述的微生物，其經(jīng)過(guò)下述方式進(jìn)行修飾而增加了ybjL基因的表達(dá)提高ybjL基因的拷貝數(shù)或者修飾ybjL基因的表達(dá)調(diào)節(jié)序列。3.權(quán)利要求1或2所述的微生物，其中，ybjL基因是編碼下述(A)或(B)所述的蛋白質(zhì)的基因(A)具有SEQIDNO:2、4或87所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(B)具有在SEQIDNO:2、4或87所示的氨基酸序列取代、缺失、插入或添加了1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并且在微生物內(nèi)增強(qiáng)該蛋白質(zhì)的表達(dá)可提高微生物生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的能力。4.權(quán)利要求13中任一項(xiàng)所述的微生物，其中，ybjL基因?yàn)榫幋aSEQIDNO:5或88所示的蛋白質(zhì)的基因。5.權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的微生物，其中，所述微生物為屬于腸桿菌科的細(xì)菌。6.權(quán)利要求5所述的微生物，其中所述微生物選自下組埃希氏菌屬細(xì)菌、腸桿菌屬細(xì)菌、拉烏爾菌屬細(xì)菌、泛菌屬細(xì)菌和克雷伯氏菌屬細(xì)菌。7.權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的微生物，其中所述微生物為瘤胃細(xì)菌。8.權(quán)利要求7所述的微生物，其中所述微生物為產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌。9.權(quán)利要求18中任一項(xiàng)所述的微生物，其中，所述酸性物質(zhì)為選自琥珀酸、富馬酸、蘋(píng)果酸、草酰乙酸、檸檬酸、異檸檬酸以及a-酮戊二酸中的1種或2種以上的有機(jī)酸。10.權(quán)利要求18中任一項(xiàng)所述的微生物，其中，所述酸性物質(zhì)為L(zhǎng)-谷氨酸和/或L-天冬氨酸。11.一種生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1~10中任一項(xiàng)所述的微生物，從而在該培養(yǎng)基中生成并蓄積具有羧基的酸性物質(zhì)，并且從該培養(yǎng)基中收集具有羧基的酸性物質(zhì)。12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述酸性物質(zhì)為選自琥珀酸、富馬酸、蘋(píng)果酸、草酰乙酸、檸檬酸、異檸檬酸、以及a-酮戊二酸中的l種或2種以上的有^la酸。13.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述酸性物質(zhì)為L(zhǎng)-谷氨酸和/或L-天冬氨酸。14.一種生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的方法，其特征在于，通過(guò)使權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的微生物或該微生物的處理產(chǎn)物在含有碳酸根離子、碳酸氫根離子或二氧化碳?xì)怏w的反應(yīng)液中作用于有機(jī)原料來(lái)生成具有羧基的酸性物質(zhì)，并且收集該酸性物質(zhì)。15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述酸性物質(zhì)為選自琥珀酸、富馬酸、蘋(píng)果酸、草酰乙酸、檸檬酸、異檸檬酸、以及a-酮戊二酸中的l種或2種以上的有^/l酸。16.生產(chǎn)含琥珀酸的聚合物的方法，該方法包括通過(guò)權(quán)利要求12或15所述的方法生產(chǎn)琥珀酸的步驟，以及使所得的琥珀酸聚合的步驟。全文摘要通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具備生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)的能力且經(jīng)過(guò)修飾而增強(qiáng)了ybjL基因的表達(dá)的微生物，在該培養(yǎng)基中生成并蓄積具有羧基的酸性物質(zhì)，并從該培養(yǎng)基收集具有羧基的酸性物質(zhì)，來(lái)生產(chǎn)具有羧基的酸性物質(zhì)。文檔編號(hào)C12N15/09GK101688176SQ20088001248公開(kāi)日2010年3月31日申請(qǐng)日期2008年4月17日優(yōu)先權(quán)日2007年4月17日發(fā)明者原吉彥,川村和枝,松井和彥,田島義教,福井啟太,臼田佳弘申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社