專利名稱：用于檢測(cè)炎性腸病的方法
用于檢測(cè)炎性腸病的方法 發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及炎性腸病發(fā)病機(jī)制中的基因表達(dá)序型。此方法可用于炎性腸
病的4僉測(cè)和i貪斷。
背景技術(shù)：
炎性腸病(IBD)(胃腸道的一種慢性炎性病癥，美國由大約l百萬患者患 有此病)由兩大疾病組構(gòu)成潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩(Crohn)氏病(CD)。 在IBD的這兩種形式中，腸^f敬生物可能在遺傳上易感的個(gè)體中啟動(dòng)該疾病。 UC常常局限于結(jié)腸，而CD通常在小腸的回腸中和在結(jié)腸中發(fā)生(Podolsky, D.K., N. Engl. J. Med. 347:417-429 (2002))。對(duì)來自IBD患者的組織進(jìn)行的基 因表達(dá)序型分析提供了 一些關(guān)于治療和/或診斷的可能耙物的見識(shí)(參見例如 Dieckgraefe, B.K.等，Physiol. Genomics 4:1-11 (2000); Lawrance I,C.等，Hum Mol Genet. 10:445-456 (2001); Dooley T.P.等,Inflamm. Bowel Dis. 10:1-14 (2004);及UthoffS.M.，InU Oncol. 19:803-810 (2001))。對(duì)正在經(jīng)歷炎性腸病 的患者中基因失調(diào)的進(jìn)一步調(diào)查包括例如Lawrance, I.C.等，它們披露了UC 和CD中數(shù)種基因的區(qū)別性基因表達(dá)序型(Lawrance, I.C.等，Human Mol. Genetics 10(5):445-456 (2001))。 Uthoff, S.M.S.等披露了使用微陣列分析對(duì)于 UC和CD的候選基因的鑒定(Uthoff， S.M.S.等，Int，l. J. Oncology 19:803-810 (2001))。 Dooley, T.P.等披露了IBD中的基因表達(dá)與用于該病癥的藥物治療間 的相關(guān)性(Dooley, T.R等，Inflamm. Bowel Dis. 10(1): 1-14 (2004))。
需要鑒定炎性腸病的別的生物學(xué)標(biāo)志物，用于這種慢性疾病的診斷。本 公開內(nèi)容滿足了該需要。
通過述及將本文中所引用的所有參考文獻(xiàn)的整個(gè)內(nèi)容收入本文。
發(fā)明概述
本文中公開了LY6基因超家族的成員在鼠結(jié)腸炎模型中和在正在罹患 IBM的人類患者的腸組織中在腸上皮細(xì)胞(正C)的表面上上調(diào)的獨(dú)特發(fā)現(xiàn)，這免疫細(xì)胞分化的標(biāo)志物(Sunderkotter, C.等，J. Immunol. 172:4410-4417 (2004)),但難以闡明LY6家族所擁有的功能(Shevach, E.M.和P.E.Korty， Immunol. Today 10:195-200(1989))。有報(bào)告顯示，LY6分子 涉及一系列不同功能，包括T細(xì)胞激活(Zhang， Z.X.等，Eur. J. Immunol. 32:1584-1592 (2002)及Henderson, S.C等，J. Immunol. 168:118-126 (2002))、嗅 覺(Chou， J.H.等,Genetics 157:211-224 (2001))和細(xì)胞粘附(Jaakkola， I.等，J. Immunol. 170:1283-1290 (2003))。
就最廣泛的意義而言，本發(fā)明提供了檢測(cè)人LY6基因家族在腸組織中在 來自正在經(jīng)歷腸病癥的第一哺乳動(dòng)物的腸組織中相對(duì)于對(duì)照哺乳動(dòng)物升高 的表達(dá)的方法。就更加定向的意義而言，所述方法適用于涉及如下腸病癥的 病癥的診斷，所述腸病癥與人LY6H、 LYPD1、 LYPD3、和LYPD5表達(dá)有關(guān)， 包括但不限于炎性腸病(IBD)，諸如潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩氏病(CD)。 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可用于^r測(cè)IBD治療方案的響應(yīng)者和不響 應(yīng)者。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述IBD是潰瘍性結(jié)腸炎(UC)。在一個(gè)實(shí)施方案 中，所述IBD是克羅恩氏病(CD)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述腸組織是結(jié)腸組 織。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)腸組織是乙狀結(jié)腸。在一個(gè)實(shí)施方案中， LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5基因表達(dá)在IBD、 UC或CD哺乳動(dòng)物中的 腸組織(諸如結(jié)腸組織)中相對(duì)于不是正在罹患IBM、 CD或UC的哺乳動(dòng)物 的正常組織(諸如正常結(jié)腸組織)升高。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LY6H基 因包含SEQIDNO:l的核酸序列且編碼包含SEQIDNO:2的LY6H多肽。在一 個(gè)實(shí)施方案中，所述LYPD1基因包含SEQIDNO:3或4的核酸且編碼包含SEQ ID N0:5的LYPD1多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LYPD3基因包含SEQ ID NO:6的核酸且編碼包含SEQIDNO:7的LYPD3多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所 述LYPD5基因包含SEQ ID NO:8或9的核酸且編碼包含SEQ ID NO:10的 LYPD5多肽。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括在懷疑正在經(jīng)歷腸病癥的測(cè)試哺 乳動(dòng)物獲得組織樣品，使所述組織接觸能與LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或 LYPD5蛋白或與編碼LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5的核酸相互作用的 檢測(cè)劑，并測(cè)定相對(duì)于對(duì)照組織的LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5表達(dá)、 LYPD3和/或 LYPD5表達(dá)指示所述測(cè)試哺乳動(dòng)物中存在IBD。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述測(cè) 試腸組織中相對(duì)于對(duì)照腸組織中升高的LY6H、 LYPD1 、 LYPD3和/或LYPD5 表達(dá)指示所述測(cè)試哺乳動(dòng)物中存在UC。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述測(cè)試腸組 織中相對(duì)于對(duì)照腸組織升高的LY6H、 LYPD1 、 LYPD3和/或LYPD5表達(dá)指示 所述測(cè)試哺乳動(dòng)物中存在CD。在一個(gè)實(shí)施方案中，來自所述測(cè)試和對(duì)照哺 乳動(dòng)物的所述組織或細(xì)胞來自結(jié)腸。
在一個(gè)實(shí)施方案中，LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5表達(dá)是通過檢 測(cè)組織樣品或細(xì)胞中的基因表達(dá)，諸如通過檢測(cè)編碼LY6H、 LYPD1、 LYPD3 和/或LYPD5的mRNA來測(cè)定的。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)照樣品是自已知不是 正在經(jīng)歷胃腸病癥(諸如IBD、 UC或CD)的哺乳動(dòng)物獲得的相同組織或細(xì) 胞類型的組織或細(xì)胞的樣品。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)照樣品是包含來自數(shù)個(gè) 正常組織或來自多個(gè)細(xì)胞系的RNA的通用標(biāo)準(zhǔn)品。在微陣列分析中，此類通 用標(biāo)準(zhǔn)品可用于監(jiān)測(cè)和控制實(shí)驗(yàn)內(nèi)和實(shí)驗(yàn)間變化。在一個(gè)實(shí)施方案中，通用 標(biāo)準(zhǔn)品(或通用參照RNA (URR))是如Novoradovskaya, N.等，(2004) BMC Genomics 5:20所提供而制備的，在此通過述及完整收錄該參考文獻(xiàn))。在一 個(gè)實(shí)施方案中，為了在小鼠RNA的微陣列分析中用作對(duì)照，URR是來自 Stratagene (產(chǎn)品目錄#740100, Stratagene , La Jolla， CA)的通用小鼠參照物 RNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，為了在人RNA的微陣列分析中用作對(duì)照，URR 是來自Stratagene (產(chǎn)品目錄tf7M000)的通用人參照RNA。在一個(gè)實(shí)施方案 中，為了在大鼠RNA的微陣列分析中用作對(duì)照，URR是來自Stratagene (產(chǎn) 品目錄^740200)的通用大鼠參照RNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述RNA是 小鼠RNA,用于提取總RNA的細(xì)胞系包含自胚胎、胚胎成纖維細(xì)胞、腎、肝 的肝細(xì)胞、肺的肺泡巨噬細(xì)胞、B-淋巴細(xì)胞、T-淋巴細(xì)胞(胸腺)、乳腺、 肌肉成肌細(xì)胞、皮膚、和睪丸衍生的細(xì)胞系。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述 RNA是人RNA,用于提取總RNA的細(xì)胞系包含自乳腺的腺癌、肝的成肝細(xì) 胞瘤、宮頸的腺癌、胚胎的癌瘤或睪丸、腦的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、黑素瘤、脂肪 肉瘤、組織細(xì)胞的淋巴瘤(巨嗟細(xì)胞、組織細(xì)胞)、T-淋巴母細(xì)胞成淋巴細(xì) 胞性白血病、B-淋巴細(xì)胞漿細(xì)胞瘤黑素瘤衍生的細(xì)胞系。在一個(gè)實(shí)施方案中， 其中所述RNA是大鼠RNA,用于提取總RNA的細(xì)胞系包含自血液嗜堿白血 病、血液T-淋巴細(xì)胞淋巴瘤、血液B-淋巴母細(xì)胞雜交瘤、腦的神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胚胎卵黃嚢癌瘤、胚胎正常成纖維細(xì)胞、正常腎、肝的肉瘤(hepatoma)、肺 的正常肺泡巨噬細(xì)胞、肺的正常肺泡II型、乳腺的腺癌、肌肉成肌細(xì)胞、正 常皮膚、和睪丸萊迪希(Leydig)細(xì)胞瘤衍生的細(xì)胞系。
一方面，本發(fā)明涉及制品，其包含容器和裝在所述容器內(nèi)的組合物，其 中所述組合物包含編碼LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5的核酸或其互補(bǔ) 物，和/或抗LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5抗體，或所述抗體的抗LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5結(jié)合片段，其中所述核酸和/或抗體是可片企測(cè)的。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含這樣的檢測(cè)劑，該檢測(cè)劑用于檢測(cè)核酸 結(jié)合，諸如但不限于編碼LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5的核酸或其互 補(bǔ)物與懷疑正在經(jīng)歷腸病癥的測(cè)試哺乳動(dòng)物的組織樣品中的LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5核酸的核酸結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含 這樣的檢測(cè)劑，該檢測(cè)劑用于檢測(cè)抗體結(jié)合，例如檢測(cè)抗體對(duì)懷疑正在經(jīng)歷 腸病癥的測(cè)試哺乳動(dòng)物的組織樣品中的LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5 的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物的所述抗體是可檢測(cè)標(biāo)記的。在一 個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物的所述抗體是通過第二抗體而可檢測(cè)的，其中所 述第二抗體是可檢測(cè)的或可檢測(cè)標(biāo)記的。所述制品可進(jìn)一步任選地包含貼在 所述容器上的標(biāo)簽，或包括在所述容器內(nèi)的包裝插頁，其提到LY6H、 LYPD1 、 LYPD3和/或LYPD5核酸或其互補(bǔ)物和/或抗LY6H、抗LYPD1、抗LYPD3和/ 或抗LYPD5抗體，或所述抗體的LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5結(jié)合片 段在檢測(cè)LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5在腸組織(包括但不限于結(jié)腸 組織)中的升高的表達(dá)中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述腸病癥是IBD。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述腸病癥是UC或CD。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述LYPD1 多肽和所述抗LYPD1抗體分別是US7,157，558和US7，144,990中所披露的抗 體。
一方面，本發(fā)明涉及診斷腸病癥在哺乳動(dòng)物中的存在的方法，包括"險(xiǎn)測(cè) 編碼LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5多肽的基因(a)在自所述哺乳動(dòng)物獲 得組織或細(xì)胞的測(cè)試樣品中和(b)在來自不是正在經(jīng)歷腸病癥的哺乳動(dòng)物的 相同組織起源或類型的已知正常細(xì)胞的對(duì)照樣品中的表達(dá)水平，其中LY6H、 LYPD1 、 LYPD3和/或LYPD5多肽在所述測(cè)試樣品中的表達(dá)水平比所述對(duì)照 樣品高指示用于獲取所述測(cè)試樣品的所述哺乳動(dòng)物中存在腸病癥。在一個(gè)實(shí) 施方案中，所述腸病癥是IBD。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述IBD是UC。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述IBD是CD。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述檢測(cè)是通過使針對(duì) LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5多肽的抗體或所述抗體的結(jié)合片段接觸 所述測(cè)試和對(duì)照樣品并測(cè)定抗體-多肽復(fù)合物形成的量?？贵w-多肽復(fù)合物形 成在所述測(cè)試樣品中的水平相對(duì)于所述對(duì)照樣品高指示所述測(cè)試哺乳動(dòng)物 中存在腸病癥，諸如IBD、 UC或CD。本發(fā)明的抗體是可檢測(cè)標(biāo)記的，或者 所述抗體是通過可檢測(cè)的第二抗體的后續(xù)結(jié)合來檢測(cè)的。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及"^斷腸病癥在哺乳動(dòng)物中的存在的方 法，包括(a)使包含自所述測(cè)試哺乳動(dòng)物獲得的組織或細(xì)胞的測(cè)試樣品接觸能 在高嚴(yán)格條件下與LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5核酸(或其互補(bǔ)物) 雜交的寡核苷酸或能特異性結(jié)合LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5多肽的 抗體，并(b)檢測(cè)所述測(cè)試樣品中所述寡核苷酸或抗體分別與LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5核酸(或其互補(bǔ)物)或LY6H、 LYPD1 、 LYPD3和/或LYPD5 多肽之間復(fù)合物的形成，其中此類復(fù)合物在所述測(cè)試樣品中的形成相對(duì)于對(duì) 照樣品多指示所述測(cè)試哺乳動(dòng)物中存在腸病癥(諸如IBD、 UC或CD)。在一 個(gè)實(shí)施方案中，所述腸病癥是IBD。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述病癥是UC。在 一個(gè)實(shí)施方案中，所述病癥是CD。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述測(cè)試和對(duì)照哺 乳動(dòng)物的所述組織是結(jié)腸組織。任選的是，本發(fā)明的方法所采用的LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5多肽結(jié)合片段或LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或 LYPD5基因雜交寡核香酸是可檢測(cè)的、可檢測(cè)標(biāo)記的、附著至固體支持物的、 諸如此類，和/或所述組織或細(xì)胞的測(cè)試樣品是自懷疑正在經(jīng)歷腸病癥的個(gè)體 獲得的，其中所述病癥是IBD，諸如但不限于UC或CD。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及(a) LY6H、 LYPD1 、LYPD3和/或LYPD5 多肽，(b)編碼LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5多肽的核酸或包含(a)的 核酸的載體或宿主細(xì)胞，(c)抗LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5多肽抗 體，或(d)LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5結(jié)合寡肽在制備可用于哺乳動(dòng) 物的腸組織(包括但不限于結(jié)腸組織)中的腸病癥的診斷性;險(xiǎn)測(cè)的藥物中的 用途，所述腸病癥包括但不限于IBD、 CD或UC。
應(yīng)答的方法，其中所述方法包括相對(duì)于對(duì)照哺乳動(dòng)物的對(duì)照胃腸組織測(cè)定測(cè) 試哺乳動(dòng)物的胃腸組織中的LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5表達(dá)，其中 LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5在測(cè)試組織中的表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組
9織高指示疾病狀態(tài)或疾病狀態(tài)的繼續(xù)。所述測(cè)試組織中的LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5表達(dá)不顯著高于正常對(duì)照表達(dá)水平或它們之間的差異在 一群哺乳動(dòng)物中的LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5正常表達(dá)水平范圍內(nèi) 表示腸病癥的改善或解決，所述改善或解決可歸于所述治療劑。在一個(gè)實(shí)施 方案中，當(dāng)LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5在用治療劑處理的哺乳動(dòng)物
LY6H、 LYPD1 、 LYPD3和/或LYPD5水平低于所述哺乳動(dòng)物在處理前的LY6H、 LYPD1、 LYPD3和/或LYPD5表達(dá)水平)，確定治療得到了應(yīng)答。
在閱讀本說明書后，本發(fā)明的其它實(shí)施方案對(duì)于熟練技術(shù)人員會(huì)是顯而 易見的。
附圖簡述


圖1A和IB描繪了編碼人LY6H多肽的核酸序列(SEQ ID NO:l)和人LY6H 多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
圖2A和2B描繪了編碼人LYPD1多肽的核酸序列(SEQ ID NOS:3和4),而 圖2C顯示了人LYPD1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。
圖3A和3B描繪了編碼人LYPD3多肽的核酸序列(SEQ ID NO:6)和人 LYPD3多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。
圖4A和4B描繪了編碼人LYPD5多肽的核酸序列(SEQ ID NOS:8和9)，而 圖4C顯示了人LYPD5多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:IO)。
圖5A和5B描繪了編碼人LY6D多肽的核酸序列(SEQ ID NO:ll)和人 LY6D多肽的氨基餅列(SEQ ID NO:12)。
圖6A和6B描繪了編碼人LY6E多肽的核酸序列(SEQ ID NO:13)和人 LY6E多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:14)。
圖7A和7B描繪了編碼人LYPD2多肽的核酸序列(SEQ ID NO:15)和人 LYPD2多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO: 16)。
圖8A-8H描繪了GLG-1 (ESL-1)分子的序列(A-B)編號(hào)U64791 ，編碼人 GLG-1 (ESL-1)多肽(SEQ ID NO:18)的核酸序列(SEQ ID NO:17); (C-D)編號(hào) NM—012201 ，編碼人GLG-1 (ESL-1)多肽(SEQ ID NO:20)的核酸序列(SEQ ID NO:19); (E-F)編號(hào)AK172806，編碼人GLG畫1 (ESL-l)多肽(SEQ ID NO:22)的 核酸序列(SEQ ID NO:21);和編號(hào)AK131501,編碼人GLG-1 (ESL-l)多肽(SEQ ID NO:24)的核酸序列(SEQ ID NO:23)。
圖9A和9B描繪了編碼鼠LY6A多肽的核酸序列(SEQ ID NO:25)和鼠 LY6A多肽的氨基斷列(SEQ ID NO:26)。
圖10A和10B描繪了編碼鼠LY6C多肽的核酸序列(SEQ ID NO:27)和鼠 LY6C多肽的氨基酉餅列(SEQ ID NO:28)。
圖11A和11B描繪了編碼鼠LY6D多肽的核酸序列(SEQ ID NO:29)和鼠 LY6D多肽的氨基賄列(SEQ ID NO:30)。
圖12A和12B描繪了編碼鼠LY6E多肽的核酸序列(SEQ ID NO:31)和鼠 LY6E多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:32)。
圖13A和13B描繪了編碼鼠LY6F多肽的核酸序列(SEQ ID NO:33)和鼠 LY6F多肽的氨基酉踏列(SEQ ID NO:34)。
圖14A和14B描繪了編碼鼠LY6I多肽的核酸序列(SEQ ID NO:35)和鼠 LY6I多肽的氨基斷列(SEQ ID NO:36)。
圖15A和15B描繪了編碼鼠LY6K多肽的核酸序列(SEQ ID NO:37)和鼠 LY6K多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:38)。
圖16A和16B描繪了編碼鼠LYPD3多肽的核酸序列(SEQ ID NO:45)和鼠 LYPD3多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:46)。
圖17A和17B描繪了編碼鼠LY6H多肽的核酸序列(SEQ ID NO:47)和鼠 LY6H多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:48)。
圖18A和18B描繪了編碼鼠LYPD1多肽的核酸序列(SEQ ID NO:49)和鼠 LYPD1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:50)。
圖19A和19B描繪了編碼鼠LYPD2多肽的核酸序列(SEQ ID NO:51)和鼠 LYPD2多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:52)。
圖20A和20B描繪了編碼鼠LY6g5c多肽的核酸序列(SEQ ID NO:53)和鼠 LY6g5c多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:54)。
圖21A和22B描繪了編碼鼠LY6g6c多肽的核酸序列(SEQ ID NO:55)和鼠 LY6g6c多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:56)。
圖22A和22B描繪了編碼鼠SLURP2/LYNX1多肽的核酸序列(SEQ ID N0:57)和鼠SLURP2/LYNX1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:58)。
圖23顯示了 LY6家族成員在結(jié)腸炎的鼠模型中在正C中上調(diào)。通過LCM 分離IL10^(圖23A)和CD45RBHi轉(zhuǎn)移結(jié)腸炎模型(圖Z3B ) 二者中的IEC，并純化RNA。如實(shí)施例中所描述地實(shí)施并分析微陣列分析。數(shù)值代表結(jié)腸炎小 鼠較之健康小鼠，與通用標(biāo)準(zhǔn)品RNA相比的倍數(shù)變化的均值。熱圖(heatmap) 下面的數(shù)值指示各只小鼠的炎癥得分。
圖24A-24D顯示了 LY6分子的表面表達(dá)在IL10;結(jié)腸炎模型中對(duì)正C的上 調(diào)。野生型(圖24A)或IL10一小鼠(圖24B)是針對(duì)LY6A的表面表達(dá)染色 的(綠色，用DAPI復(fù)染)。類似地，野生型(圖24C)或IL10一小鼠(圖24D) 是針對(duì)LY6C的表面表達(dá)染色。
圖25A-25I顯示了LY6A和LY6C的表面表達(dá)應(yīng)答炎性細(xì)胞因子(特別是 IFNy)而上調(diào)。將YAMC細(xì)胞用所示細(xì)胞因子處理15小時(shí)并針對(duì)LY6C (圖 25A)和LY6A (圖25B)的表面表達(dá)染色。將YAMC細(xì)胞在存在遞增劑量的 IFNY的情況中培養(yǎng)15小時(shí)并通過流式細(xì)胞術(shù)分析LY6C(圖25C)和LY6A(圖 25D)的表達(dá)。在所示各個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集IFNy刺激的YAMC細(xì)胞，并通過流式 細(xì)胞術(shù)分析LY6C (圖25E)和LY6A (圖25F)的表達(dá)。IL-22上調(diào)LY6C (圖 25G)和LY6A (圖25H) 二者的表達(dá)。LY6A和LY6C二者的水平在鼠IEC系 CMT93中應(yīng)答IFNY處理而上調(diào)(圖251)。
圖26A-26E,脂筱消減導(dǎo)致對(duì)LY6C介導(dǎo)的趨化因子生成的抑制。如所示 的，將膽固醇消減的(深色柱)或未消減的(空心柱)YAMC細(xì)胞與板上結(jié) 合的抗KLH或抗LY6C—起溫育15小時(shí)。收集RNA并測(cè)定CXCL2、 CXCL5、 和CCL7的表達(dá)水平(圖26A-26C)。 LY6A (圖26D)和LY6C (圖26E)的表 面水平應(yīng)答膽固醇消減而降低。
調(diào)。將YAMC細(xì)胞在經(jīng)抗KLH對(duì)照、抗LY6A或抗LY6C包被的板上溫育24小 時(shí)，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析LY6C (圖27A)或LY6A (圖27B)的表達(dá)。將細(xì) 胞用100U/mlIFNY預(yù)處理12小時(shí)，類似地涂布在抗體包被板上，并分析LY6C (圖27C)或LY6A (圖27D)的表達(dá)。
圖28A-28C顯示了交聯(lián)LY6C而非LY6A誘導(dǎo)趨化因子分泌。圖28A:如所 示的，將YAMC細(xì)胞與100U/mlIFNr"起預(yù)溫育15小時(shí)或不進(jìn)行預(yù)溫育，在 經(jīng)10ng/ml抗LY6A (黑色柱)或抗LY6C (陰影柱)或抗KLH對(duì)照(空心柱) 包被的板上培養(yǎng)。在24小時(shí)(左)、48小時(shí)(中)和72小時(shí)(右)時(shí)分離RNA, 并分析CXCL5或CCL7的表達(dá)(A)。數(shù)據(jù)表示與未處理的同種型交聯(lián)細(xì)胞相 比的倍數(shù)變化(如通過2-AACt方法所測(cè)定的)的均值± SD。圖28B:如上所
12述，在48小時(shí)時(shí)在用1、 5或10 |ag/ml (如所示的)抗體交聯(lián)的細(xì)胞中收集上清液，并通過ELISA測(cè)定進(jìn)入上清液的CXCL5分泌。*<0.05。圖28C: CXCL5和CXCL2二者應(yīng)答LY6C交聯(lián)的水平在LY6C水平用siRNA敲低時(shí)降低。
圖29A-29B顯示了結(jié)腸炎中的正C擁有相似的趨化因子基因表達(dá)樣式。通過LCM分離IL10一 (圖29A)和CD45RBHi轉(zhuǎn)移結(jié)腸炎模型(圖29B) 二者中的IEC并純化RNA。如實(shí)施例中所描述地實(shí)施并分析微陣列分析。數(shù)值代表結(jié)腸炎小鼠較之健康小鼠，與通用標(biāo)準(zhǔn)品RNA相比的倍數(shù)變化的均值。熱圖下面的數(shù)值指示各只小鼠的炎癥得分。
圖30A-30C顯示了人LY6家族基因的表達(dá)在用細(xì)胞因子處理的結(jié)腸細(xì)胞
顯示了人LY6H (圖30A)、人LYPD3 (圖30B)、和人LYPD5 (圖30C)的表達(dá)相對(duì)于人(3-肌動(dòng)蛋白對(duì)照的倍數(shù)變化。
圖31A-31B顯示了克羅恩氏病患者在結(jié)腸中具有升高的LYPD1 (圖31A)和LYPD5(圖31B)水平。自人IBD患者獲得組織樣品，并測(cè)定LYPD1和LYPD5基因表達(dá)。在CD患者的炎癥組織中觀察到LYPD1和LYPD5的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著升高。在UC患者的炎癥組織中也觀察到LYPD5表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著升高。Y軸值反映了相對(duì)于通用RNA標(biāo)準(zhǔn)品的基因表達(dá)。
圖32A和32B顯示了用LYPD5-Fc蛋白染色的(A)未轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞和(B)經(jīng)GLG-1 (ESL-l)多肽轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞。
圖33A描繪了GLG-1或ESL-1及各種適合于表征LYPD5結(jié)合的片段的結(jié)
圖34A描繪了 GLG-1或ESL-1及各種適合于表征LYPD5結(jié)合的片段的結(jié)構(gòu)，而圖34B顯示了表征LYPD5和LYPD5配體結(jié)合的免疫共沉淀研究的結(jié)果。圖35A描繪了 GLG- 1或ESL-1及各種適合于表征LYPD5結(jié)合的片段的結(jié)
的結(jié)果。
圖36A和36B描繪了編碼人整聯(lián)蛋白P7的核酸序列(SEQ ID NO: 68)和人整聯(lián)蛋白(3 7多肽的氨基醋列(SEQ ID NO: 69)。
發(fā)明詳述
定義"炎性腸病，，或"IBD"在本文中可互換地用于指引起炎癥和/或潰癡的 腸疾病，而且包括但不限于克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎。
"克羅恩氏病"(CD)或"潰瘍性結(jié)腸炎"(UC)是病因未知的慢性炎性腸 病。與潰瘍性結(jié)腸炎不同，克羅恩氏病能侵襲腸的任何部分?？肆_恩氏病的 最突出特征是腸壁的顆粒狀、紅紫色半透明(edematous)增厚。隨著炎癥的發(fā) 生/發(fā)展，這些肉芽腫常常失去它們的局限邊界并與周圍組織整合。腹瀉和腸 梗阻是主要的臨床特征。與潰瘍性結(jié)腸炎一樣，克羅恩氏病的病程可以是連 續(xù)的或復(fù)發(fā)的，輕度的或重度的，但是與潰瘍性結(jié)腸炎不同，克羅恩氏病不 能通過切除所涉及的腸段來治愈。大多數(shù)克羅恩氏病患者在有些(時(shí)間)點(diǎn) 需要手術(shù)，但是常常隨后復(fù)發(fā)且通常繼續(xù)醫(yī)學(xué)治療。
克羅恩氏病可涉及消化道的任何部分，從口到肛門，盡管它通常出現(xiàn)在 回結(jié)腸、小腸或結(jié)腸-肛門直腸區(qū)。在組織病理學(xué)上，疾病表現(xiàn)為不連續(xù)的 肉芽肺病、隱窩膿腫、裂隙和口瘡性潰瘍。炎性滲入物是混合的，由淋巴細(xì) 胞(T和B兩種細(xì)胞)、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、和嗜中性粒細(xì)胞組成。分泌IgM 和IgG的漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞有不成比例的升高。
抗炎藥柳氮磺吡啶(sulfasalazine)和5-氨基水楊酸(5-ASA)對(duì)于治療輕度 活動(dòng)性結(jié)腸克羅恩氏病是有用的，而且常常開出處方來維持疾病的消退。 Metroidazole和環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)在功效上與柳氮磺吡咬類似，而且表 現(xiàn)出對(duì)于治療肛門周圍的疾病特別有用。在更嚴(yán)重的病例中，皮質(zhì)類固醇在 治療活躍的惡化中是有效的，而且甚至能維持消退。硫唑嘌呤和6-巰基嘌呤 也已經(jīng)顯示出在需要長期施用皮質(zhì)類固醇的患者是成功的。同樣有可能的 是，這些藥物在長期預(yù)防中可能起作用。不幸的是，在一些患者中起作用之 前可能有很長的延遲(可長達(dá)6個(gè)月)。
止瀉藥也能在一些患者中使癥狀緩解。營養(yǎng)療法或要素飲食能改善患者 的營養(yǎng)狀況并誘導(dǎo)急性病的癥狀改善，但它不誘導(dǎo)持久的臨床消退。抗生素 用于治療繼發(fā)性小腸細(xì)菌過度生長和治療化膿性并發(fā)癥。
"潰瘍性結(jié)腸炎，，(UC)侵襲大腸。該病的病程可以是連續(xù)的或復(fù)發(fā)的， 輕度的或重度的。最早的損傷是炎性浸潤，伴有Lieberkiihn隱窩基部的膿腫 形成。這些膨脹的和破裂的隱窩的聚并趨于將覆蓋在上面的粘膜與其血供分 開，導(dǎo)致潰瘍。該病的癥狀包括痛性痙攣、小腹痛、直腸出血、和頻繁的、 松散的排便，主要由血液、膿液和粘液及少量糞便顆粒組成。急性、重度或慢性、持續(xù)性潰瘍性結(jié)腸炎可能需要全結(jié)腸切除術(shù)。
UC的臨床特征是高度易變的，而且發(fā)作可以是隱匿的或暴發(fā)的，而且 可以包括腹瀉、里急后重和復(fù)發(fā)性直腸出血。在暴發(fā)性涉及整個(gè)結(jié)腸時(shí)，可 發(fā)生中毒性巨結(jié)腸(一種危及生命的急癥)。腸外表現(xiàn)包括關(guān)節(jié)炎、壞疽性
膿皮病(pyoderma gangrenoum)、葡萄膜炎、和結(jié)節(jié)性紅斑(erythema nodosum)。 UC的治療包括柳氮磺吡啶和相關(guān)的含水楊酸藥物(用于輕度病例)和 皮質(zhì)類固醇藥物(用于重度病例)。水楊酸或皮質(zhì)類固醇的表面施用有時(shí)是 有效的(特別是在疾病限于遠(yuǎn)端腸時(shí))，而且與系統(tǒng)使用相比與降低的副作 用有關(guān)。有時(shí)指示需要支持性措施(諸如施用鐵和止瀉藥)。有時(shí)也開出硫 唑嘌呤、6-巰基噤呤和曱氨蝶呤的處方，用于頑固性皮質(zhì)類固醇依賴性病例。 如本文中所使用的，"LY6基因家族成員"或"LY6基因超家族成員"在 本文中可互換地用于指與LY6基因家族具有同源性的基因，該基因家族成員 大多是PGI錨定的細(xì)胞表面糖蛋白，在造血起源的細(xì)胞上有廣泛分布，而在 非造血細(xì)胞中有受到較為限制的表達(dá)。此基因家族的成員用作免疫細(xì)胞的分 化標(biāo)志物(Sunderkotter, C.等，J. Immunol. 172:4410-4417 (2004))。已經(jīng)檢查了 LY6家族的基因(Shevach, E.M.和P.E. Korty, Immunol. Today 10:195-200 (1989)),其功能包括T細(xì)胞激活(Zhang， Z.X.等，Eur. J. Immunol. 32:1584-1592 (2002)和Henderson, S.C.等，J. Immunol. 168:118-126 (2002))、嗅覺(Chou， J.H. 等，Genetics 157:211-224 (2001))和細(xì)胞粘附(Jaakkola, I.等,J. Immunol. 170:1283-1290 (2003))。 LY6基因家族成員包括但不限于哺乳動(dòng)物L(fēng)Y6基因家 族，諸如小鼠或人的LY6家族基因。如本文中所使用的，"LY6基因"指LY6 基因家族成員，而"LY6多肽"指由LY6基因編碼的多肽。鼠LY6基因家族成 員包括但不限于LY6A(NM—010738,核酸SEQ IDNO:25，其編碼多肽SEQ ID NO:26)、 LY6C (NM—010741,核酸SEQ ID NO:27，其編碼多肽SEQ ID NO:28)、 LY6D (NM—003695，核酸SEQ ID NO:29,其編碼多肽SEQ ID NO:30)、 LY6E (NM—002346,核酸SEQ ID NO:31,其編碼多肽SEQ ID NO:32)、 LY6F (NM—008530,核酸SEQ ID NO:33，其編碼多肽SEQ ID NO:34 )、 LY6I( NM—020498,核酸SEQ ID NO:35,其編碼多肽SEQ ID NO:36)、 和LY6K (NM—017527,核酸SEQ ID NO:37，其編碼多肽SEQ ID NO:38)。人 LY6基因家族成員包括但不限于LY6H (NM—002347，核酸SEQ ID NO:l,其 編碼多肽SEQIDNO:2)、 LYPD1 (NM—144586,核酸SEQ ID NOS:3或4，其
15編碼多肽SEQ ID NO:5 )、 LYPD3 (NM—014400，核酸SEQ ID NO:6，其編 碼多肽SEQIDNO:7)、 LYPD5 (NM—182573，核酸SEQ ID NOS:8或9，其 編碼多肽SEQ ID NO:10)、 LY6D (NM—003695，核酸SEQ ID NO:ll，其編 碼多肽SEQIDNO:12)、 LY6E (NMNM—002346，核酸SEQ ID NO:13,其編 碼多肽SEQIDNO:14)、 LYPD2 (NM—205545,核酸SEQ IDNO:15，其編碼 多肽SEQIDNO:16)。在多個(gè)實(shí)施方案中，本文中所公開的每個(gè)LY6基因家族 成員的多核苷酸包含SEQIDNO:1,3, 4, 6, 8, 9, 11， 13, 15， 25， 27, 29,31,33， 35，37，45，47, 49，51,53，55，或57的至少15個(gè)、至少25個(gè)、至少50個(gè)、至少IOO 個(gè)、至少250個(gè)、至少500個(gè)、至少750個(gè)、至少1000個(gè)、至少1250個(gè)、至少 1500個(gè)、至少1750個(gè)、至少2000個(gè)、或至少2040個(gè)連續(xù)核苷酸，或LY6基因 家族成員多核苷酸包含SEQIDNO:1,3，4， 6, 8, 9, 11， 13, 15,25,27, 29,31,33: 35, 37, 45, 47, 49， 51, 53, 55,或57。在一個(gè)實(shí)施方案中，與LY6基因家族成員 多核苷酸(SEQIDNO:1,3, 4, 6, 8， 9， 11， 13， 15,25,27, 29,31,33, 35, 37,45， 47， 49， 51, 53， 55,或57 )或其片段結(jié)合的多核苷酸與LY6多肽或其片段具有 至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99% 或100%序列同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，LY6基因家族成員多肽包含SEQID NO:2， 5， 7, 10， 12, 14， 26， 28, 30， 32, 34, 36, 38, 46, 48, 50， 52， 54, 56,或58的 至少10個(gè)、至少25個(gè)、至少50個(gè)、至少75個(gè)、至少100個(gè)、至少125個(gè)、至少 150個(gè)、至少175個(gè)、至少200個(gè)、至少225個(gè)、至少250個(gè)、至少275個(gè)、至少 300、或至少325個(gè)、至少連續(xù)氨基酸，或LY6基因家族多肽包含SEQIDNO:2， 5, 7， 10, 12, 14， 26, 28, 30, 32, 34， 36， 38， 46， 48, 50， 52, 54, 56,或58。
任何LY6基因家族成員的"天然序列多肽"包括與衍生自自然界的相應(yīng) LY6基因家族成員多肽具有相同氨基酸序列的多肽。此類天然序列LY6多肽 可以從自然界分離，或者可以通過重組或合成手段生產(chǎn)。術(shù)語"天然序列LY6 多肽，，明確涵蓋天然存在的截短或分泌形式的特定LY6多肽(例如胞外域序 列)、多肽的天然存在變體形式(例如可變剪接形式)和天然存在等位變體。 在一個(gè)具體的方面，本文中所公開的天然序列LY6多肽是與圖1-7和SEQ ID NO:2， 5, 7， 10, 12, 14， 26, 28, 30, 32， 34， 36， 38, 46， 48, 50， 52, 54， 56,或58中 的序列對(duì)應(yīng)的成熟或全長天然序列多肽。
如本文中所使用的，"LY6多肽變體"意指與本文中所公開的全長天然序 列LY6多肽序列具有至少約80%氨基酸序列同 一性的LY6多肽，優(yōu)選其生物學(xué)活性形式(如本文中所定義的)，及其缺乏信號(hào)肽、胞外域、或全長天然序列LY6多肽的任何其它片段(諸如本文中所提到的那些)的變體形式。此類 變體多肽包括例如在全長天然氨基酸序列的N-或C-末端添加或刪除一個(gè)或 多個(gè)氨基酸殘基的多肽。在一個(gè)具體的方面，此類變體多肽與本文中所公開 的全長天然序列LY6多肽序列多肽及其缺乏信號(hào)肽、胞外域、或全長天然序 列LY6多肽的任何其它片段(諸如本文中所公開的那些)的變體形式具有至 少約80%的氨基酸序列同一性，或者至少約81%、 82%、 83%、 84%、 85%、 86%、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%或99°/。的氨基酸序列同一性。關(guān)于本文所鑒定的LY6多肽序列的"百分比(％)氨基酸序列同一性"定義 為對(duì)比序列并在必要時(shí)引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，且不將任 何保守替代視為序列同一性的一部分時(shí)，候選序列中與特定LY6多肽序列中 的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測(cè)定百分比氨基酸序列同 一性 目的的對(duì)比可以以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式實(shí)現(xiàn)，例如使用公眾可得到 的計(jì)算機(jī)軟件，諸如BLAST、 BLAST-2、 ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟 件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可決定用于測(cè)量對(duì)比的適宜參數(shù)，包括對(duì)所比較序列全 長實(shí)現(xiàn)最大對(duì)比所需的任何算法。然而，為了本發(fā)明的目的，％氨基酸序列 同 一性值是使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2產(chǎn)生的，其中下文表I中提供 了 ALIGN-2程序的完整源代碼。ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序由Genentech 公司編寫，下文表1所示源代碼已經(jīng)連同用戶文檔 一起提交給美國版權(quán)局 (U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559),并以美國版權(quán)注冊(cè)號(hào) TXU510087注冊(cè)。公眾可通過Genenteclv^司(South San Francisco, California) 得到ALIGN-2程序，或者可從下文表l中提供的源代碼編譯。ALIGN2程序應(yīng) 當(dāng)編譯成在UNIX操作系統(tǒng)，優(yōu)選數(shù)碼UNIX V4.0D上使用。所有序列比較參 數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)定且不變。如本文中所使用的，"LY6變異多核苷酸"或"LY6變異核酸序列"或"LY6 基因，，指編碼本文中所定義的LY6基因家族成員多肽(優(yōu)選其生物學(xué)活性形文中所鑒定的全長LY6多肽序列的任何其它片段(諸如那些由只代表全長 LY6多肽完整編碼序列的一部分的核酸編碼的)的核苦酸序列具有至少約 80%核酸序列同一性的核酸分子。通常，這樣的變異多核苷酸與編碼相應(yīng)的.4
何其它片段的核酸序列具有至少約80%的核酸序列同一性，或者至少約81%、 82%、 83%、 84%、 85%、 86%、 87%、 88%、 890/。、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%的核酸序列同一性。這樣的變異多核普 酸不涵蓋天然核香酸序列。
通常，這樣的變異多核苷酸的長度相對(duì)于天然序列多肽變化至少約50個(gè) 核苦酸，或者長度變異可以是至少約50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95、 100、 105、 110、 115、 120、 125、 130、 135、 140、 145、 150、 155、 160、
165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、230、240、250、
260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、
390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、
520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、
650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、
780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、
910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000個(gè)核苦酸,其中在
此語境中，術(shù)語"約，，意指所述核苷酸序列長度加上或減去該所述長度的
10%。
關(guān)于本文中所定義的LY6基因多肽編碼核酸序列的"百分比(％)核酸序列 同一性，，定義為對(duì)比序列并在必要時(shí)引入缺口以獲取最大百分比序列同一性 后，候選序列中與目的LY6基因核酸序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分率。 為測(cè)定百分比核酸序列同 一性目的的序列對(duì)比可以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多 種方式進(jìn)行，例如使用公眾可得到的計(jì)算機(jī)軟件，諸如BLAST、 BLAST-2、 ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟件。然而，為了本發(fā)明的目的，°/。核酸序 列同 一性值是使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2獲得的，其中下文表l中提 供了 ALIGN-2程序的完整源代碼。ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序由Genentech 公司編寫，下文表l所示源代碼已經(jīng)連同用戶文檔一起提交給美國版權(quán)局(US Copyright O伍ce, Washington D.C.， 20559),并以美國版權(quán)注冊(cè)號(hào)TXU510087 注冊(cè)。公眾可通過Genentech 司(South San Francisco, California)得到 ALIGN-2程序，或者可從下文表l中提供的源代碼編譯。ALIGN2程序應(yīng)當(dāng)編 譯成在UNIX操作系統(tǒng)，優(yōu)選數(shù)碼UNIX V4.0D上使用。所有序列比較參數(shù)由 ALIGN-2程序設(shè)定且不變。在采用ALIGN-2來比較核酸序列的情況中，給定核酸序列C相對(duì)于(to)、 與(with)、或針對(duì)(against)給定氨基酸序列D的。/。核酸序列同一性(或者可表 述為具有或包含相對(duì)于、與、或針對(duì)給定核酸序列D的某一。/。核酸序列同一 性的給定核酸序列C)如下計(jì)算
分?jǐn)?shù)W/Z 乘 100
的核苷酸數(shù)，且其中Z是D中的核苷酸總數(shù)?？梢灶I(lǐng)會(huì)，若核酸序列C的長度 與核酸序列D的長度不相等，則C相對(duì)于D的。/。核酸序列同一性將不等于D相 對(duì)于C的。/。核酸序列同一性。作為計(jì)算％核酸序列同一性的例子，表4和5演 示了如何計(jì)算指派為"比較DNA"的核酸序列相對(duì)于指派為"REF-DNA" 的核酸序列的。/。核S交序列同一性，其中"REF-DNA"代表目的假設(shè)LY6基因 編碼核酸序列，"比較DNA'，代表目的"REF-DNA"核酸分子針對(duì)其進(jìn)行比 較的核酸分子的核苦酸序列，而"N"、 "L"和"V"各自代表不同假設(shè)核苷 酸。除非另有具體說明，本文中所使用的所有％核酸序列同一性值都是依照 上一段所述，使用ALIGN-2計(jì)算機(jī)程序獲得的。
在其它實(shí)施方案中，LY6基因變異多核苷酸是編碼LY6多肽且能夠與編 碼全長LY6多肽的核苷酸序列雜交(優(yōu)選在嚴(yán)格雜交和清洗條件下)的核酸 分子，如本文中所公開的。所述變異多肽可以是那些由所述變異多核苷酸編 碼的。
在用于描述本文中所公開的各種LY6多肽時(shí)，"分離的"意指已經(jīng)鑒定且 與/由其天然環(huán)境的一種成分分開和/或回收的多肽。多肽的天然環(huán)境的污染 性成分指通常會(huì)干擾其診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋 白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將此類多肽純化至(1)
的程度，或(2)根據(jù)使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選的銀染色的非還原性或還原性條件 下的SDS-PAGE，達(dá)到同質(zhì)。既然來自其天然環(huán)境的LY6多肽的至少一種成 分不會(huì)存在，那么此類分離的多肽包括重組細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)原位多肽。然而， 此類分離的多肽通常通過至少一個(gè)純化步驟來制備。
"分離的，，LY6多肽編碼核酸指已經(jīng)鑒定且與多肽編碼核酸的天然來源中
19通常與之關(guān)聯(lián)的至少一種污染性核酸分子分開的核酸分子。任何上述此類分 離的核酸分子不同于在自然界中發(fā)現(xiàn)它時(shí)的形式或背景。任何此類核酸分子 因此與存在于天然細(xì)胞中時(shí)的特定多肽編碼核酸分子有區(qū)別。
術(shù)語"控制序列"指在特定宿主生物體中表達(dá)可#:作連接的編碼序列所 必需的DNA序列。例如，適于原核生物的控制序列包括啟動(dòng)子、任選的操縱 基因序列、和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動(dòng)子、多腺苷酸化信號(hào)、 和增強(qiáng)子。
若一段核酸與另 一段核酸序列處于功能性相互關(guān)系中，則它是"可操作
連4妻的"。例如，若前序列(presequence)或分泌前導(dǎo)(secretory leader)的DNA 表達(dá)成參與多肽分泌的前蛋白質(zhì)(preprotein),則它與該多肽的DNA可操作連 接；若啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與該序列可操作連接；或 者，若核糖體結(jié)合位點(diǎn)的位置促進(jìn)翻譯，則它與編碼序列可操作連接。 一般 而言，"可操作連接的，，意味著相連的DNA序列是相鄰的，而且在分泌前導(dǎo)的 情況中意味著相鄰且處于閱讀狀態(tài)。然而，增強(qiáng)子不必相鄰。連接可以通過 在方便的限制性位點(diǎn)處的連接來實(shí)現(xiàn)。若沒有此類位點(diǎn)，則依照常規(guī)實(shí)踐使 用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。
如本文中所使用的，"表達(dá)"在應(yīng)用于基因表達(dá)時(shí)指編碼蛋白質(zhì)的基因 轉(zhuǎn)錄生成mRNA,以及該mRNA翻譯生成該基因所編碼的蛋白質(zhì)。如此，升 高的或降低的表達(dá)指基因的升高的或降低的轉(zhuǎn)錄和/或自轉(zhuǎn)錄得到的mRNA 的升高的或降低的翻譯。
雜交反應(yīng)的"嚴(yán)格性"可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定，而且通 常根據(jù)探針長度、洗滌溫度和鹽濃度憑經(jīng)驗(yàn)計(jì)算。 一般而言，較長的探針要 求較高的溫度以正確退火，而較短的探針需要較低的溫度。雜交通常依賴于 當(dāng)互補(bǔ)鏈存在于低于其解鏈溫度的環(huán)境中時(shí)變性DNA重新退火的能力。探針 和可雜交序列之間的期望同源性程度越高，可使用的相對(duì)溫度也越高。結(jié)果 是，推斷出較高相對(duì)溫度將趨向于使反應(yīng)條件更為嚴(yán)格，而較低溫度也就較 不嚴(yán)格。關(guān)于雜交反應(yīng)嚴(yán)格性的其它細(xì)節(jié)和解釋，參見Ausubel等人，《Current Protocols in Molecular Biology》，Wiley Interscience Publishers, 1995。
"嚴(yán)格條件，，或"高嚴(yán)格條件"，如本文中所定義的，可如下鑒定(1)采 用低離子強(qiáng)度和高溫進(jìn)行清洗，例如0.015M氯化鈉/ 0.0015M檸檬酸鈉/ 0.1%十二烷基硫酸鈉，于50。C; (2)在雜交過程中采用變性劑，諸如曱酰胺，例如50% (v/v)曱酰胺及0.1%牛血清清蛋白/ 0.1% Ficoll / 0.1%聚乙烯吡 咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液，pH6.5，以及750mM氯化鈉，75mM檸檬酸 鈉，42°C;或(3)在采用50%曱酰胺，5x SSC (0.75MNaCl, 0,075M檸檬酸 鈉)，50mM磷酸鈉(pH6.8), 0.1%焦磷酸鈉，5x Denhardt氏溶液，超聲處理的 鮭魚精DNA (50嗎/ml)， 0.1% SDS，和10%碌L酸右旋糖苷的溶液中于42。C雜 交過夜，及于42。C在0.2xSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中清洗10分鐘，接著于55 。C在含EDTA的0.1x SSC中進(jìn)行10分鐘高嚴(yán)格性清洗。
"中等嚴(yán)格條件，，可以如Sambrook等人，《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》，New York, Cold Spring Harbor Press, 1989中所述鑒定， 包括使用比上文所述較不嚴(yán)格的清洗溶液和雜交條件(例如溫度、離子強(qiáng)度 和％ SDS)。中等嚴(yán)格條件的一個(gè)例子是于37"在含20%曱酰胺，5x SSC (150mM NaCl， 15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH 7.6), 5x Denhardt氏溶 液，10%硫酸右旋糖香，和20mg/ml變性剪切的鮭魚精DNA的溶液中溫育 過夜，接著于約37-50。C在lx SSC中清洗濾膜。普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到如何 在必要時(shí)調(diào)整溫度、離子強(qiáng)度等以適應(yīng)諸如探針長度等因素。
術(shù)語"表位標(biāo)記的"在用于本文時(shí)指包含LY6多肽或LY6多肽結(jié)合劑且 其與"標(biāo)簽多肽，，融合的嵌合多肽。標(biāo)簽多肽具有足夠殘基以提供表位而可 制備針對(duì)其的抗體，但又足夠短使得其不干擾與其融合的多肽的活性。標(biāo)簽 多肽優(yōu)選還是足夠獨(dú)特的，使得此類抗體基本上不與其它表位發(fā)生交叉反 應(yīng)。合適的標(biāo)簽多肽通常具有至少6個(gè)氨基酸殘基，通常在約8個(gè)和約50個(gè)氨 基酸殘基之間(優(yōu)選在約10個(gè)和約20個(gè)氨基酸殘基之間)。
"有活性的，，或"活性"為了本發(fā)明的目的指保留了天然的或天然存在 的多肽的生物學(xué)和/或免疫學(xué)活性的多肽形式，其中"生物學(xué)"活性(或是抑 制性的或是刺激性的)指由天然或天然存在多肽引起的，除誘導(dǎo)針對(duì)天然或 天然存在多肽所擁有的抗原性表位的抗體生成的能力外的生物學(xué)功能，而 "免疫學(xué)"活性指誘導(dǎo)針對(duì)天然或天然存在多肽所擁有的抗原性表位的抗體 生成的能力。如本文中所使用的，有活性的多肽指就定性或定量的觀點(diǎn)看在 IBD組織中相對(duì)于其在未患IBD的類似組織上的表達(dá)差異表達(dá)的抗原。
術(shù)語"拮抗劑"以最廣義^f吏用，包括部分或完全阻斷、抑制、或中和本 文中所公開的天然多肽的生物學(xué)活性的任何分子。合適的拮抗劑分子明確包 括拮抗性抗體或抗體片段、天然多肽的片段或氨基酸序列變體、肽、反義寡核苷酸、有機(jī)小分子、等。用于鑒定拮抗劑的方法可包含使這樣的多肽(包 括編碼它的細(xì)胞)接觸候選激動(dòng)性或拮抗性分子，并測(cè)定通常與此類多肽有 關(guān)的 一 項(xiàng)或多項(xiàng)生物學(xué)活性的可;f全測(cè)變化。
"處理"或"治療"或"改善"或"緩和"指治療性處理和預(yù)防性或防 范性措施二者，其中目的是預(yù)防或減緩(減輕)疾病的進(jìn)展。治療還可指對(duì)
IBD進(jìn)展的改變。
"診斷"指鑒定或確定疾病(包括但不限于IBD、 UC和/或克羅恩氏病) 的區(qū)別性特征的過程。診斷過程有時(shí)也表述成基于嚴(yán)重程度或疾病進(jìn)展以及 定位(諸如例如胃腸道內(nèi)或沿著胃腸道，發(fā)現(xiàn)炎癥和/或改變的基因表達(dá)的位 置)的分期或疾病分類。
需要診斷的受試者包括那些已經(jīng)異常LY6表達(dá)的，以及那些傾向于具有 異常LY6表達(dá)的或那些要預(yù)防異常LY6表達(dá)的受試者。因而，本發(fā)明的一個(gè)
其中所述方法包括相對(duì)于對(duì)照測(cè)定測(cè)試哺乳動(dòng)物的胃腸組織中的Ih LY6表 達(dá)，并確定LY6表達(dá)水平在沒有顯著不同于正常對(duì)照表達(dá)水平的范圍內(nèi)。在 一個(gè)實(shí)施方案中，在用治療劑處理的哺乳動(dòng)物的LY6表達(dá)水平不同時(shí)(表達(dá) 與正常對(duì)照更相似，即LY6表達(dá)水平低于治療前哺乳動(dòng)物中的LY6表達(dá)水 平)，確定有治療響應(yīng)。
上述用于評(píng)估疾病的成功治療和改善的參數(shù)易于通過內(nèi)科醫(yī)師所熟悉 的例行規(guī)程來測(cè)量。對(duì)于IBD療法，可通過例如評(píng)估疾病進(jìn)展前時(shí)間(timeto disease progression, TTP)和/或測(cè)定響應(yīng)率(response rate, RR)來測(cè)量功歲丈，并 進(jìn)行活檢來評(píng)估基因表達(dá)和觀察來自患者的胃腸組織的組織病理學(xué)。本文中 所描述的，涉及預(yù)后和/或診斷過程的發(fā)明涉及LY6基因表達(dá)上調(diào)的測(cè)定和評(píng) 估。
出于IBD的治療、癥狀減輕或診斷的目的，"哺乳動(dòng)物"或"哺乳動(dòng)物受 試者，，指任何歸入哺乳類的動(dòng)物，包括人，家畜和牲畜，及動(dòng)物園中的動(dòng)物、 體育用動(dòng)物、或?qū)櫸飫?dòng)物，諸如犬、貓、牛、馬、綿羊、豬、山羊、家兔、 貂(ferrets)等。優(yōu)選的是，哺乳動(dòng)物指人。
與一種或多種其它治療劑"聯(lián)合"施用包括同時(shí)(共同)施用和任何次 序的序貫施用。
"載體"在用于本文時(shí)包括藥劑學(xué)可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，它
22們?cè)谒捎玫膭┝亢蜐舛葘?duì)暴露于其的細(xì)胞或哺乳動(dòng)物是無毒的。通常，生理學(xué)可接受的載體是pH緩沖水溶液。生理學(xué)可接受載體的例子包括緩沖劑，
諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA;糖醇，諸如甘露醇或山梨醇；成鹽反荷離子，諸如鈉；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEEN⑧、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS⑧。
"固相"或"固體支持物"意指本發(fā)明的多肽、核酸、抗體或LY6結(jié)合劑可粘著或附著其上的非水性基質(zhì)。本文中所涵蓋的固相的例子包括那些部分或完全由玻璃(例如可控孔徑玻璃)、多糖(例如瓊脂糖)、聚丙埽酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和聚硅氧烷(silicone)制成的固相。在某些實(shí)施方案中，才艮據(jù)語境，固相可包括測(cè)定板的孔；在其它實(shí)施方案中，它指純化柱(例如親和層析柱)。此術(shù)語還包括離散顆粒的不連續(xù)固相，諸如美國專利No.4,275，149中所記載的。
"脂質(zhì)體"指由各種類型的脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑構(gòu)成的，可用于對(duì)哺乳動(dòng)物投遞藥物的小嚢泡。脂質(zhì)體的成分通常排列成雙層形式，與生物膜的脂質(zhì)排列相似。
"小，，分子或"有機(jī)小分子"在本文中定義為具有低于約500道爾頓的分子量。
拮抗劑的"有效量"指足以帶來生理學(xué)效應(yīng)的量，所述生理學(xué)效應(yīng)諸如但不限于部分或完全抑制基因的或其編碼的蛋白質(zhì)的功能。關(guān)于此目的，可憑經(jīng)驗(yàn)且以常規(guī)方式來確定"有效量"。
術(shù)語"治療有效量"指拮抗劑或其它藥物有效"治療"受試者或哺乳動(dòng)物中的疾病或病癥的量。就IBD而言，藥物的治療有效量會(huì)將異常LY6表達(dá)恢復(fù)成正常生理水平；減輕胃腸炎癥；減少胃腸病灶數(shù)目；和/或一定程度地減輕與IBD、 UC和/或CD有關(guān)的一種或多種癥狀。參見本文中"治療"的定義。
拮抗劑的"生長抑制量，，指能夠在體外或在體內(nèi)抑制細(xì)胞，尤其是胂瘤，例如癌細(xì)胞生長的數(shù)量。為了抑制腫瘤性細(xì)胞生長的目的，可憑經(jīng)驗(yàn)且以常規(guī)方式來確定這樣的量。
拮抗劑的"細(xì)胞毒性量"指能夠在體外或在體內(nèi)引起細(xì)胞，尤其是正在增殖的細(xì)胞，例如癌細(xì)胞破壞的量。為了抑制胂瘤性細(xì)胞生長的目的，可憑經(jīng)驗(yàn)且以常規(guī)方式來確定這樣的量。
術(shù)語"抗體"以最廣義使用，明確覆蓋例如抗LY6單克隆抗體(包括拮抗性和中和性抗體)、具有多表位特異性的抗LY6抗體組合物、多克隆抗體、單鏈抗LY6抗體、多特異性抗體(例如雙特異性)、及所有上文列舉的抗體的抗原結(jié)合片段(見下文)，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)或免疫學(xué)活性。術(shù)語"免疫球蛋白"(Ig)在本文中與抗體可互換使用。
"分離的，，抗體指已經(jīng)鑒定且自其天然環(huán)境的一種成分分開和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指將會(huì)干擾該抗體的診斷或治療用途的物
質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將抗體純化至(l)根據(jù)Lowry法的測(cè)定，抗體重量超過95%,最優(yōu)選重量超過99°/。， (2)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得至少15個(gè)殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE及使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選的銀染色，達(dá)到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分不會(huì)存在，那么分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至少一個(gè)純化步驟來制備。
基本的4鏈抗體單元是由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)構(gòu)成的異四聚體糖蛋白(IgM抗體由5個(gè)基本的異四聚體單元及稱作J鏈的另外多肽組成，因此包含10個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)；而分泌型IgA抗體可聚合而形成包含2-5個(gè)基本的4鏈單元及J鏈的多價(jià)裝配物)。在IgG的情況中，4鏈單元通常是約150,000道爾頓。每條輕鏈通過一個(gè)共價(jià)二石克4建與重鏈相連，而兩條重鏈通過一個(gè)或多個(gè)二硫4定彼此相連，二硫鍵的數(shù)目取決于重鏈的同種型。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規(guī)律的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在N-末端具有一個(gè)可變區(qū)(VH)，接著是三個(gè)(對(duì)于a和Y鏈)或四個(gè)(對(duì)于p和s同種型)恒定區(qū)(CH)。每條輕鏈在N-末端具有一個(gè)可變區(qū)(VL),接著是其另一端的一個(gè)恒定區(qū)(CL)。 VL與VH排列在一起，而CL與重鏈第一恒定區(qū)(CH1)排列在一起。認(rèn)為特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變區(qū)之間形成界面。 一個(gè)VH和一個(gè)VL一起配對(duì)而形成一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。關(guān)于不同類別抗體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，參見i"列:^口Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terrand Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT， 1994, page 71and Chapter 6。
根據(jù)其恒定域氨基酸序列，來自任何脊推動(dòng)物物種的L鏈可歸入兩種截
然不同類型中的一種，稱作卡帕(K)和拉姆達(dá)(X)。根據(jù)其重鏈恒定域(CH)氨基
酸序列，免疫球蛋白可歸入不同的類別或同種型。有五類免疫球蛋白IgA、IgD、 IgE、 IgG和IgM,分別具有稱作a、 S、 s、 丫和p的重鏈。根據(jù)Ch序列和功能的較小差異，Y和a類可進(jìn)一步分為亞類，例如人類表達(dá)下列亞類IgGl、IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgAl和IgA2。
術(shù)語"可變的"指可變域中的某些區(qū)^殳在抗體間序列差異廣泛的實(shí)情。
性并非均勻分布于可變域跨越的大約110個(gè)氨基酸。事實(shí)上，V區(qū)由15-30個(gè)氨基酸，稱作框架區(qū)(FR)的相對(duì)不變異的區(qū)段及將框架區(qū)分開的每個(gè)長度為9-12個(gè)氨基酸，稱作"高變區(qū)"的極度變異的較短區(qū)域組成。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個(gè)FR，它們大多采取p-折疊片構(gòu)象，通過形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成P-折疊片結(jié)構(gòu)一部分的三個(gè)高變區(qū)連接。每條鏈中的高變區(qū)通過FR非常接近的保持在一起，并與另 一條鏈的高變區(qū)一起促成抗體的4元原結(jié)合4立點(diǎn)的形成(參見Kabat d a/" Se《wewc&s o/戶rafez'ra o//w腿wo/ogz'ca/ /" emyf, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda,MD (1991))。恒定域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)器功能，諸如抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)中抗體的參與。術(shù)語"高變區(qū)"在用于本文時(shí)指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)一般包含來自"互補(bǔ)決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(例如VL中的Kabat殘基24-34 (Ll)、 50-56 (L2)和89-97 (L3)附近及VH中的Kabat殘基31-35B(Hl)、 50-65 (H2)和95-102 (H3)附近；Kabat et al.， Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes ofHea他，Bethesda,MD. (1991))和/或那些來自"高變環(huán)"的殘基(例如VL中的Chothia殘基26-32 (Ll)、 50-52 (L2)和91-96 (L3)及VH中的殘基26-32 (Hl)、52A-55 (H2)和96-101 (H3)附近；Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917(1987))。
術(shù)語"單克隆抗體"在用于本文時(shí)指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同和/或結(jié)合相同表位，除了生產(chǎn)單克隆抗體的
25過程中可能產(chǎn)生的可能變體外，此類變體一般以極小量存在。此類單克隆抗體典型的包括包含結(jié)合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結(jié)合多肽序列是通過包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結(jié)合多肽序列在內(nèi)的過程得到的。例如，選擇過程可以是從眾多克隆諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組DNA克隆的集合中選擇獨(dú)特克隆。應(yīng)當(dāng)理解，選定的靶物結(jié)合序列可進(jìn)一步改變，例如為了提高對(duì)靶物的親和力、將靶物結(jié)合序列人源化、提高其在細(xì)胞培養(yǎng)物中的產(chǎn)量、降低其在體內(nèi)的免疫原性、創(chuàng)建多特異性抗體等，而且包含改變后的靶物結(jié)合序列的抗體也是本發(fā)明的單克隆抗體。與典型的包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，單克隆抗體制備物的每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。在它們的特異性以外，單克隆抗體制備物的優(yōu)勢(shì)在于它們一般未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語"單克隆"指示抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，有待依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過多
種技術(shù)來生成，包括例如雜交瘤法(例如Kohler " a/., Atowre 256:495 (1975);Harlow ef a/"爿wf/6oc /es:爿ia60rato7 Mmwa/, Cold Spring Harbor LaboratoryPress,第2版,1988; Hammerling a/"于Mo"oc/owaZ v4"幼Wes朋c/ 71Ce////;;Z>nWomas, 563-681, Elsevier, N.Y" 1981)、重組DNA法(參見例如美國專利No. 4,816,567)、噬菌體展示技術(shù)(參見例如Clackson " 〗Vamw 352:624-628(1991); Marks a "/.， Jkfo/.所o/. 222:581-597 (1991); Sidhu J! Afo/.萬fo/.338(2):299-310 (2004); Lee a a/.， 《/ Mo/.脂.340(5): 1073-1093 (2004);Fellouse， /Voc. A^, Jc^/. 5W. 101 (34): 12467-12472 (2004); Lee " a/.,^wmmo/. MeAoA284(l-2):119-132(2004))、及用于在具有部分或整個(gè)人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動(dòng)物中生成人或人樣抗體的技術(shù)(參見例如WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO1991/10741; Jakobovits a/" Prac.編.Zcad 5W. 90:2551 (1993);
Jakobovits & iV(3組e 362:255-258 (1993》Bruggemann ^ 0/.， ；fearr/mm柳o. 7:33 (1993);美國專利No. 5,545,806; 5,569,825; 5，591，669 (都屬于GenPharm); 5,545,807; WO 1997/17852;美國專利No. 5,545,807; 5,545,806;5,569,825; 5,625,126; 5，633，425; 5,661,016; Marks a/" 5z.o/歸m /ogy10:779-783 (1992); Lonberg " a/., M fwe 368:856-859 (1994); Morrison, A^wm368:812-813 (1994); Fishwild 胸廳14:845-851 (1996);Neuberger， A"她re所otec/ wo/c^ 14:826 (1996); Lonberg and Huszar, /"fem.
/mm朋o/. 13:65-93 (1995))。 "嵌合"抗體(免疫球蛋白)中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物 種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余 部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相 同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(美國 專利No. 4,816,567; Morrison " a/";V"http://.t/5^4 81:6851-6855 (1984))。本文中所使用的人源化抗體是嵌合抗體的一個(gè)子集。
非人(例如鼠)抗體的"人源化，，形式指最低限度包含衍生自非人免疫 球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受 體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供 體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動(dòng)物的高變區(qū)殘基替換的免疫球 蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘 基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有找到的殘基。 進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能諸如結(jié)合親和力。 一般而言，人 源化抗體將包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)基本上整個(gè)如下可變域，其中所有或基 本上所有高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR 是人免疫球蛋白序列的FR,盡管FR可包含一處或多處提高結(jié)合親和力的氨 基酸替代。FR中這些氨基酸替代的數(shù)目通常在重鏈中不超過6處，在輕鏈中 不超過3處。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常 是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見Jones " a/., Atow^ 321:522-525 (1986); Riechmann d a/" Atow廠e 332:323-329 (1988);和Presta, Cwr. 歷o/. 2:593-596 (1992)。
"抗體片段"包含完整抗體的一部分，優(yōu)選完整抗體的抗原結(jié)合或可變 區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、 Fab'、 F(ab')2和Fv片段；雙抗體；線性抗體(參 見美國專利5,641,870,實(shí)施例2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995));單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。
用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱作"Fab"片 段，和一個(gè)殘余"Fc"片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。Fab片段由 一條完整輕鏈及一條重鏈的可變區(qū)(VH)和第一恒定區(qū)(CHl)組成。每個(gè)Fab片 段對(duì)于抗原結(jié)合是單價(jià)的，即它具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。胃蛋白酶處理抗體
27產(chǎn)生一個(gè)較大F(ab')2片段，它粗略相當(dāng)于兩個(gè)通過二硫鍵相連的Fab片段，具 有二價(jià)抗原結(jié)合活性且仍能夠交聯(lián)抗原。Fab，片段因在Ch1結(jié)構(gòu)域的羧基末 端增加了少數(shù)殘基而與Fab片段有所不同，所述殘基包括來自抗體鉸鏈區(qū)的 一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab，-SH是本文中對(duì)其中恒定區(qū)半胱氨酸殘基攜帶游 離硫醇基的Fab，的稱謂。F(ab')2抗體片段最初是作為成對(duì)Fab，片段生成的， 在Fab，片段之間具有鉸鏈半胱氨酸。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。
Fc片段包含通過二硫鍵保持在一起的兩條H鏈的羧基末端部分。抗體的 效應(yīng)器功能由Fc區(qū)中的序列來決定，該區(qū)域也是受到在某些類型的細(xì)^Ji找 到的Fc受體(FcR)識(shí)別的部分。
"Fv"是包含完整抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。該片段由緊密、 非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的二聚體組 成。從這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的折疊結(jié)構(gòu)中生發(fā)出六個(gè)高變環(huán)(重鏈和輕鏈各3個(gè)環(huán))， 其貢獻(xiàn)出供結(jié)合抗原的氨基酸殘基并賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即 使是單個(gè)可變域(或是只包含對(duì)抗原特異性的三個(gè)CDR的半個(gè)Fv)也具有識(shí) 別和結(jié)合抗原的能力，只是親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。
"單鏈Fv"，也可縮寫為"sFv"或"scFv，，,是包含連接成一條多肽鏈
的抗體VH和VL結(jié)構(gòu)域的抗體片段。優(yōu)選的是，SFV多肽在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間
還包含多肽接頭，使得sFv形成抗原結(jié)合期望的結(jié)構(gòu)。關(guān)于sFv的綜述參見 Pliickthun ，《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，vol. 113, Rosenburg 和Moore編，Springer-Verlag, New York, pp. 269-315, 1994; Borrebaeck 1995,
見下文。
如本文中所使用的，"LY6結(jié)合多肽"指結(jié)合，優(yōu)選特異性結(jié)合LY6多肽、 配體或信號(hào)傳導(dǎo)構(gòu)件的寡肽，或其LY6結(jié)合部分或片段。此類寡肽可使用已 知的寡肽合成方法學(xué)而化學(xué)合成，或者可使用重組技術(shù)來制備和純化。此類 寡肽的長度通常是至少約5個(gè)氨基酸，或者長度為至少約6、 7、 8、 9、 10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、
28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、
45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、
62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、
79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、
96、 97、 98、 99或100個(gè)氨基酸或更多。此類寡肽可使用眾所周知的技術(shù)無需過多實(shí)驗(yàn)就得以鑒定。在這點(diǎn)上，注意到用于對(duì)寡肽文庫篩選能夠特異性 結(jié)合多肽靶物的寡肽的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如美國專利
5，556，762， 5，750,373， 4，708，871, 4,833,092, 5，223，409, 5,403,484， 5,571,689， 5，663，143; PCT7/^開號(hào)W0 84/03506和WO 84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. 81: 3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 178-182 (1985); Geysen et al" in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al.， J. Immunol. Meth. 102: 259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol. 140: 611-616 (1988); Cwirla， S. E. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378 (1990); Lowman， H. B. et al., Biochemistry 30: 10832 (1991); Clackson, T. et al.， Nature 352: 624 (1991); Marks, J. D. et al., J. Mol. Biol. 222: 581 (1991); Kang， A. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8363 (1991);及 Smith, G P., Current Opin. Biotechnol. 2: 668 (1991))。
"結(jié)合，，感興趣靶抗原(例如LY6)的LY6拮抗劑(例如抗體、多肽、 寡肽或小分子)指以足夠親和力結(jié)合靶物，從而成為靶向表達(dá)該抗原的細(xì)胞 或組織的有用診斷劑、預(yù)后劑和/或治療劑，且與其它蛋白質(zhì)沒有顯著交叉反 應(yīng)的拮抗劑。對(duì)非期望的標(biāo)志物多肽的結(jié)合程度將小于對(duì)特定期望靶物的結(jié) 合的約10%,這通過常用技術(shù)諸如熒光激活細(xì)胞分揀(FACS)或放射免疫沉淀 (RIA)來測(cè)定。
此外，術(shù)語"特異結(jié)合"或"特異性結(jié)合"特定LY6多肽或特定LY6多 肽靶物上的表位或?qū)ζ?特異，，意味著可測(cè)量的不同于非特異相互作用的結(jié) 合。特異結(jié)合可通過例如測(cè)定分子的結(jié)合并與對(duì)照分子的結(jié)合比較來測(cè)量， 所述對(duì)照分子通常是結(jié)構(gòu)相似但沒有結(jié)合活性的分子。例如，特異結(jié)合可通 過與對(duì)照分子的竟?fàn)巵頊y(cè)定，所述對(duì)照分子與靶物相似，例如過量的未標(biāo)記 靶物。在這種情況中，若經(jīng)標(biāo)記靶物與探針的結(jié)合受到過量未標(biāo)記靶物的竟 爭性抑制，則指示特異結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，此類術(shù)語指這樣的結(jié)合， 其中分子結(jié)合特定多肽或特定多肽上的表位，而基本上不結(jié)合任何其它多肽 或多肽表位?；蛘?，此類術(shù)語可以描述為分子所具有的對(duì)靶物的Kd為至少約 IO.4 M、 10-5M、 10-6M、 It)-7 M、 10_8M、 10-9M、 10.10M、 10-11M、 1(T12M 或更大。
"過表達(dá)"LY6的胃腸細(xì)胞或組織指與同 一組織類型的正常胃腸細(xì)胞或 組織相比，該細(xì)胞或組織顯示出在細(xì)胞中具有升高的編碼LY6的核酸，或者該細(xì)胞或組織過度生成和分泌LY6蛋白質(zhì)。此類過表達(dá)可以源自基因擴(kuò)增或 升高的轉(zhuǎn)錄或翻譯。已知多種診斷性或預(yù)后性測(cè)定法能測(cè)量改變的表達(dá)水 平，其導(dǎo)致升高的或降低的細(xì)胞表面水平或升高的或降低的分泌蛋白水平，
包括但不限于使用抗LY6抗體的免疫組織化學(xué)測(cè)定法、FACS分析等?；蛘?， 可測(cè)量細(xì)胞中編碼LY6的核酸或mRNA的水平，例如通過熒光原位雜交，使 用對(duì)應(yīng)于編碼LY6的核酸或其互補(bǔ)鏈的基于核酸的探針(FISH;參見WO 98/45479，公開于1998年10月)；Southern印跡；Northern印跡；或聚合酶鏈 式反應(yīng)(PCR)技術(shù)，諸如實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)?；蛘撸ㄟ^測(cè)量生物學(xué)流 體(諸如血清)中的脫落抗原來測(cè)定LY6多肽過表達(dá)，例如使用基于抗體的 測(cè)定法(還可參見例如美國專利No. 4,933,294， 1990年6月12日7>告； WO91/05264, 1991年4月18日公布；美國專利No. 5,401,638， 1995年3月28 日公告；和Sias等，J. Immunol. Methods 132:73-80 (19卯))。在上文測(cè)定法之 外，熟練從業(yè)人員可利用各種體內(nèi)測(cè)定法。例如，可將患者身體內(nèi)的細(xì)胞暴 露于任選用可^r測(cè)標(biāo)記物(例如》文射性同位素)標(biāo)記的抗體，并且可評(píng)估抗 體對(duì)患者中細(xì)胞的結(jié)合，例如通過外部掃描放射性或通過分析取自先前暴露 于治療劑的患者的活檢物。
在用于本文時(shí)，術(shù)語"免疫粘附素"指將異源蛋白質(zhì)("粘附素")的結(jié) 合特異性與免疫球蛋白恒定域的效應(yīng)器功能聯(lián)合起來的抗體樣分子。在結(jié)構(gòu) 上，免疫粘附素包括不同于抗體的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)(即是"異源"的)、 具有期望結(jié)合特異性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定域序列的融合物。免疫 粘附素分子的粘附素部分典型的是至少包含受體或配體的結(jié)合位點(diǎn)的連續(xù) 氨基S交序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以從任何免疫球蛋白 獲得，諸如IgG-l、 IgG-2、 IgG-3或IgG-4亞型、IgA(包括IgA-l和IgA-2 )、 IgE、 IgD或IgM。
術(shù)語"標(biāo)記物，，在用于本文時(shí)指與抗體、寡肽或其它有機(jī)分子直接或間 接偶聯(lián)，以生成"帶標(biāo)記物的"或"經(jīng)標(biāo)記的，，抗體、寡肽或其它有機(jī)分子 的可纟企測(cè)化合物或組合物。標(biāo)記物可以是自身可檢測(cè)的(例如放射性同位素 標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物)，或者在酶標(biāo)記物的情況中，可催化可;f企測(cè)的底物化 合物或組合物的化學(xué)改變。
術(shù)語"細(xì)胞毒劑，，在用于本文時(shí)指抑制或防止細(xì)胞的功能和/或引起細(xì)胞 破壞的物質(zhì)。該術(shù)語意圖包括放射性同位素，例如At211、 I131、 I125、 Y90、
30Re'86、 Re188、 Sm153、 Bi212、 p32和Lu的放射性同位素；化療劑；酶及其片段， 諸如溶核酶；抗生素；和毒素，諸如小分子毒素或者細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng) 物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體；及下文披露的各種抗腫瘤藥或抗 癌藥。下文記載了其它細(xì)胞毒劑。殺腫瘤藥引起胂瘤細(xì)胞的破壞。
"化療劑"或"治療劑"指在病癥或疾病的治療中有用的化學(xué)化合物。 用于IBD治療的化療劑或治療劑的例子包括但不限于抗炎藥柳氮磺吡啶 (sulfasalazine)和5-氨基水楊酸(5-amino salisylic acid, 5-ASA); metroidazole和 環(huán)丙沙星在功效上與柳氮磺吡啶類似，而且表現(xiàn)出對(duì)于治療肛門周圍的疾病 特別有用；在更嚴(yán)重的病例中，皮質(zhì)類固醇在治療活躍的惡化中是有效的， 而且甚至能維持消退；硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤、和曱氨蝶呤也已經(jīng)顯示出在 需要長期施用皮質(zhì)類固醇的患者中是成功的；止瀉藥也能在一些患者中提供 癥狀緩解；營養(yǎng)療法或要素飲食能改善患者的營養(yǎng)狀況并誘導(dǎo)急性病的癥狀 改善；抗生素用于治療繼發(fā)性小腸細(xì)菌過度生長和治療化膿性并發(fā)癥。IBD 化療劑還包括生物制品和其它藥劑，如下抗P7抗體(參見例如 WO2006026759 )、 抗ot 4抗體(諸如ANTEGEN )、 抗TNF抗體 (REMICADE )或非蛋白質(zhì)化合物，包括但不限于5-ASA化合物 ASACOL 、 PENTASATM、 ROWASATM、 COLAZAL ,和其它化合物，諸 如Purinethol和類固醇，諸如潑尼松(prednisone)。用于癌癥治療的化療劑的例 子包括羥脲紫杉烷(諸如帕利他塞(paclitaxel)和多西他塞(doxetaxel))和/或 蒽環(huán)類抗生素；烷化劑類(alkylating agents)，諸如塞替派(thiotepa)和 CYTOXAN⑧環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide);磺酸烷基酯類(alkyl sulfonates), 諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)禾口艱泊舒凡(piposulfan); 氮丙 口定類(aziridines), i者如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派 (meturedepa)和烏瑞替派(uredepa);乙撐亞胺類(ethylenimines)和曱基蜜胺類 (methylamelamines)， 包4舌六曱蜜胺(altretamine)、 三乙撐蜜胺 (triethylenemelamine)、三乙4掌石奔酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙4掌石克4戈 碌酖胺(triethylenethiophosphoramide)和三鞋曱蜜胺(trimethylolomelamine);番 篇4支內(nèi)酉旨類(acetogenin)(尤其是布才立寸也辛(bullatacin)和布4立4也辛酉同 (bullatacinone) ) ; 5-9-四氬大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚 (dronabinol), MARINOL ); (3-拉帕醌(lapachone);拉帕醇(lapachol);秋水 仙素類(colchicines);白樺脂酸(betulinic acid);喜初于石威(camptothecin)(包4舌合成類似物托泊替康(topotecan) ( HYCAMTIN ) 、 CPT-11 (伊立替康 (irinotecan)， CAMPTOSAR )、乙酰喜樹石咸、東K菪亭(scopoletin)和9-氨基 喜樹堿)；苔蘚抑素(biyostatin); callystatin; CC-1065 (包括其阿多來新 (adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒 素(podophyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinic acid);替尼泊芬(teniposide); 隱'菜 素類(cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素8 );多拉司他汀(dolastatin); duocarmycin (包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1 );艾榴塞洛素 (eleutherobin); pancratistatin; sarcodictyin; 海纟帛4中素(spongistatin); 氮芥類 (nitrogen mustards),諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、茶氮芥(chlornaphazine)、 膽酰胺(cholophosphamide)、 雌莫司汀(estramustine)、 異環(huán)石岸酰胺 (ifosfamide)、雙氯乙基曱胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮齊(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇 (phenesterine)、〉發(fā)尼莫司汀(prednimustine)、 曲4f胺(trofosfamide)、尿口密口定氮 芥(uracil mustard); 亞硝'脲類(nitrosoureas)，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲 菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀 (nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素類，諸如烯二炔類抗生素 (enediyne)(如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素yll和加利車霉 素roll (參見例如Agnew， Chem. Intl. Ed. Engl. 33: 183-186 (1994));蒽環(huán)類抗 生素(dynemicin)， 包括dynemicin A;埃斯波霉素(esperamicin); 以及新制癌 素(neocarzinostatin)發(fā)色團(tuán)和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團(tuán))、阿克拉霉 素(aclacinomycin)、 放線菌素(actinomycin)、 氛茴霉素(anthramycin)、 偶氮絲 氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素C (cactinomycin)、 carabicin、 洋紅霉素(carminomycin)、 嗜癌霉素(carzinophilin)、 色霉素(chromomycin)、 放線菌素D (dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、 6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN⑧多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉 代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)、 表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、《尹達(dá)比星(idarubicin)、麻西羅霉 素(marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素C、霉酚酸 (mycophenolic acid)、諾拉霉素(nogalamycin)、揪欖霉素(olivomycin)、培洛霉 素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、噤吟霉素(puromycin)、三鐵阿霉素 (quelamycin)、 羅多比星(rodombicin)、 鏈黑菌素(streptonigrin)、 鏈佐星
32(streptozocin)、 殺結(jié)核菌素(tubercidin)、 烏苯美司(ubenimex)、 凈司他丁 (zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代謝物類，諸如曱氨蝶呤和5-氟尿嘧口定 (5-FU);葉酸類似物，諸如二曱葉酸(denopterin)、曱氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸 (pteropterin)、三曱曲沙(trimetrexate);噤呤類似物，諸如氟達(dá)拉濱(fludarabine)、 6-巰基噤p令(mercaptopurine)、碌u咪。票呤(thiamiprine)、石克鳥噤呤(thioguanine); 嘧p定類似物，i者如安西4也濱(ancitabine)、阿4U包香(azacitidine)、 6-氮尿芬、 卡莫氟(carmofUr)、阿糖月包苷(cytarabine)、雙脫氧尿苦(dideoxyuridine)、去氧 氟尿芬(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苦(floxuridine);雄激素類， i者^口卡魯睪酉同(calusterone)、 丙酸屈4也iU同(dromostanolone propionate)、表石克 ;難醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內(nèi)酯(testolactone);抗腎上&i類， 諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米4乇坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane); 葉酸補(bǔ)充劑，諸如亞葉酸(folinicacid);醋葡醛內(nèi)S旨(aceglatone);醛磷酰胺糖 香(aldophosphamide glycoside); 氛基乙酰丙酸(aminolevulinic acid); 恩尿嗜 口定(eniluracil); 安p丫口定(amsacrine); bestrabucil; t匕生群(bisantrene); 依達(dá)曲 沙、(edatraxate);;也石奔酰胺(defosfamide);;也美可辛(demecolcine); i也吖S毘 (diaziquone); elfornithine;依利醋餘(elliptinium acetate);埃坡霉素(epothilone); 依托格魯(etoglucid);硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼 達(dá)明(lonidamine);美登木素生物石威類(maytansinoids),諸如美登素(maytansine) 禾口美登醇(maytansinol); 安絲菌素(ansamitocin); 米4乇胍月宗(mitoguazone); 米 托蒽醌(mitoxantrone);莫哌達(dá)醇(mopidamol); 二胺硝吖吱(nitracrine);噴司 〗也丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet); p比柔比星(pirarubicin); 洛索蒽酉昆 (losoxantrone); 2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine); PSK 多糖復(fù)合物(JHS Natural Products, Eugene, OR);雷佐生(razoxane); 4艮霉素 (rhizoxin); 西索菲蘭(sizofiran);本累》走4者(spirogermanium); 細(xì)交鏈孑包菌酮酸 (tenuazonic acid);三亞胺醌(triaziquone); 2，2'，2"-三氯三乙胺；單端孢菌素類 (trichothecenes)(尤其是T畫2毒素、祝孑包菌素(verrucarin) A、軒孑包菌素(roridin) A和蛇行菌素(anguidin));烏拉坦(urethan);長春地辛(vindesine)( ELDISINE , FILDESIN );達(dá)卡巴。秦(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine); 二溴甘 露醇(mitobronitol); 二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol); 派泊溴烷(pipobroman); gacytosine;阿糖胞苷(arabinoside) ( "Ara-C");塞替派(thiotepa);類紫杉醇 (taxoids),例如TAXOL⑧紫杉醇(paclitaxel) (Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton, N丄)、ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的納 米顆粒齊'J型紫杉醇(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg， Illinois) 和TAXOTERE⑧多西他塞(doxetaxel) (Rh6ne-Poulenc Rorer， Antony, France ); 苯丁酸氮芥(chlorambucil);吉西他濱(gemcitabine) ( GEMZAR ); 6-石危鳥嘌 p令(thioguanine);巰基噤p令(mercaptopurine);曱氨蟲某p令(methotrexate);柏類似、 物，諸如順鉑(cisplatin)和卡柏(carboplatin);長春石威(vinblastine)( VELBAN ); 鉑；依托泊苷(etoposide) (VP-16 );異環(huán)磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌 (mitoxantrone);長春新堿(vincristine) (ONCOVIN );奧沙利柏(oxaliplatin); 亞葉酸(leucovorin);長春瑞濱(vinorelbine) ( NAVELBINE );能滅瘤 (novantrone); 依達(dá)曲沙(edatrexate); 道諾霉素(daunomycin); 氛基蝶呤 (aminopterin);伊本膦酸鹽(ibandronate);拓樸異構(gòu)酶抑制劑RPS 2000; 二氟 曱基烏氨酸(DMFO);類維A酸(retinoids)，諸如維A酸(retinoic acid);卡培他 濱(capecitabine) ( XELODA );任何上述物質(zhì)的藥學(xué)可接受鹽、酸或衍生物； 以及兩種或多種上述物質(zhì)的組合，諸如CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春 新堿和潑尼松龍聯(lián)合療法的縮寫)和FOLFOX (奧沙利鉑(ELOXATIN ) 耳關(guān)合5-FU和亞葉酸的治療方案的縮寫)。
術(shù)語"細(xì)胞因子，，是由一種細(xì)胞群釋放，作為細(xì)胞間介質(zhì)作用于另一細(xì) 胞的蛋白質(zhì)的通稱。此類細(xì)胞因子的例子有淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多 肽激素。細(xì)胞因子中包括生長激素，諸如人生長激素、N-曱硫氨酰人生長激 素和牛生長激素；曱狀旁腺素；曱狀腺素；胰島素；胰島素原；松馳素；松 馳素原；糖蛋白激素類，諸如促卵泡激素(FSH)、促曱狀腺激素(TSH)和促黃 體激素(LH);肝生長因子；成纖維細(xì)胞生長因子；促乳素；胎盤催乳激素； 腫瘤壞死因子-a和-P;穆勒氏(Mullerian)抑制性物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān) 肽；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO); 神經(jīng)生長因子，諸如NGF-(3;血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，諸如 TGF-a和TGF-p;胰島素樣生長因子-I和-II;紅細(xì)胞生成素(EPO);骨誘導(dǎo)因 子(osteoinductive factor);干擾素，諸如干擾素-a、-卩和-y;集落刺激因子(CSF), 諸如巨噬細(xì)胞CSF (M-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞CSF (GM-CSF)和粒細(xì)胞CSF (G-CSF);白介素(IL),諸如IL-1、 IL-lot、 IL-2、 IL-3、 IL畫4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL-9、 IL-ll、 IL-12;腫瘤壞死因子，諸如TNF-a或TNF-P;及其它多 肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。在用于本文時(shí)，術(shù)語細(xì)胞因子包括來自天然來源或來自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)及天然序列細(xì)胞因子的生物學(xué)活性
等效物。
術(shù)語"包裝插頁，，用于指通常包括在治療用產(chǎn)品的商業(yè)包裝中的說明書， 它們包含有關(guān)涉及此類治療用產(chǎn)品應(yīng)用的適應(yīng)征、用法、劑量、施用、禁忌 癥、和/或警告的信息。
"上皮"和"上皮的"指身體內(nèi)外表面的細(xì)胞覆蓋物(皮膚、粘液和漿 液)，包括腺體和自其衍生的其它結(jié)構(gòu)，例如角膜、食管、表皮、和毛嚢上
皮細(xì)胞。其它例示性上皮組織包括嗅上皮-內(nèi)襯鼻腔的嗅區(qū)且含有嗅覺受 體的假復(fù)層上皮；腺上皮-由分泌細(xì)胞扁平上皮構(gòu)成的上皮；扁平上皮-包 含一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞層，其中最淺表那層由扁平的、鱗片狀或板狀細(xì)胞構(gòu)成的 上皮。上皮也可指變移上皮，像特征性地見于由于收縮和擴(kuò)張而進(jìn)行巨大積^ 械變化的襯里中空器官的上皮，例如代表復(fù)層扁平和柱狀上皮間轉(zhuǎn)換的組 織。
細(xì)胞的"生長狀態(tài)"指細(xì)胞的增殖速率和/或細(xì)胞的分化狀態(tài)。"改變的 生長狀態(tài)，，指以異常增殖速率為特征的生長狀態(tài)，例如展現(xiàn)出相對(duì)于正常細(xì) 胞升高或降低的增殖速率的細(xì)胞。
術(shù)語"LY6"或"LY6多肽"在本文中用于一般性指哺乳動(dòng)物L(fēng)y6基因家 族的任何哺乳動(dòng)物同系物。術(shù)語"LY6"可用于描述蛋白質(zhì)或核酸。
術(shù)語"過表達(dá)"，如本文中所使用的，指組織中高于該組織正常表達(dá)水 平的細(xì)胞基因表達(dá)水平。術(shù)語"表達(dá)不足"，如本文中所使用的，指組織中 低于該組織正常表達(dá)水平的細(xì)胞基因表達(dá)水平。在任一情況中，在該項(xiàng)研究 的受控條件下，或高或低的表達(dá)顯著不同于正常表達(dá)。
"對(duì)照"包括為了在測(cè)定不是正在罹患IBM的哺乳動(dòng)物中的基線或正常 表達(dá)或活性中使用而獲得的樣品。因而，可通過多種手段來獲得對(duì)照樣品， 包括未患炎癥和/或IBD、 UC或CD (如通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)所確定的)的組織或細(xì) 胞；非IBD細(xì)胞或組織，例如不是正在罹患IBM的受試者的細(xì)胞；來自沒有 IBD、克羅恩氏病、或潰瘍性結(jié)腸炎病癥的受試者；來自不懷疑有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生 IBD、 CD或UC的受試者；或來自此類受試者的細(xì)胞或細(xì)胞系。對(duì)照還包括 先前已確立的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于測(cè)定法，諸如mRNA測(cè)定法，包括孩t陣列測(cè)定法， 對(duì)照可以是通用對(duì)照。此通用對(duì)照指自如下RNA獲得的特定LY6基因的RNA 表達(dá)信息，所述RNA分離自健康組織的混合物或分離自自各種組織衍生的細(xì)胞系的混合物，諸如但不限于本文中所公開的通用參照RNA。因而，任何依 照本發(fā)明進(jìn)行的測(cè)試或測(cè)定法可以與已確立的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，而且每次獲取 用于比較的對(duì)照樣品可能不是必須的。<formula>formula see original document page 37</formula>/* #include <stdio.h>
#include <ctype.h>
#defineMAXJMP16
#defineMAXGAP24
#defineJMPS1024
#defineMX4
#defineDMAT
#defineDMIS0
#deflneDINSO
#define腦Sl
P1NS08
#defineP1NS14
struct jmp {
Table 1 fcont, 1)
short unsigned short
/* max jumps in a diag */
/* don't continue to penalize gaps larger than this */ /* max jmps in an path */
/* save if there's at least MX-1 bases since last jmp
3 /* value of matching bases */ /* penalty for mismatched bases */ 8 /* penalty for a gap */ 1 penalt^ per base */
/* penalty for a gap */ /* permit^ per residue */
n[MAXJMP];/* size of jmp (neg for dely) x〖MAXJMP〗；/* base no. of jmp in seq x */ /* limits sqto2A16-l V
struct diag {
int score; long offset; short ijmp; struct jmp jp;
};
score at last jmp */ offset of prev block */
/* current jmp index list of jmps V
struct path {
int spc; /* number of leading spaces */
short n[JMPS]; /* size of jmp (gap) */
int x[JMPS]; /* loc of jmp (last elem before gap) */
};
char char char char
nt
nt
nt
nt
nt
nt
nt
nt
nt
long
struct diag struct path
char ch3r
*ofile; /* output file name */
*namex[2]; /* seq names: getseqs() */
*prog; /* prog name for err msgs */
*seqx2〗； /* seqs: getseqs( ) */
dmax( /* best diag: mv() */
d脂xO; /* final diag V
dna; /* set if dna: main〖)V
endgaps; /* set if penalizing end gaps
gapx， gapy; /* total gaps in seqs */
len0， lenl; /* seq lens "
ngapx， ng叩y; /* total size of gaps */
smax; /* max score: nw() */
*xbm; /* bitmap for matching */
offset; /* current offset in jmp file */
*dx; /* holds diagonals */
pp[2]; /* holds path for seqs */
*calloc( )， *malloc( )， *index( )， *strcpy(); *getseq( )， *g—calloc();
Page 1 of mv.hTable 1 fcont, 2)
/* Needleman-Wunsch alignment program
* usage: progs filel file2
* where filel and file2 are two dna or two protein sequences.
* The sequences can be in upper- or lower-case an may contain ambiguity
* Any lines beginning with'>' or '<' are ignored
* Max file length is 65535 (limited by unsigned short x in the jmp struct) * A sequence with 1/3 or more of its elements ACGTU is assumed to be DNA
* Output is in the file "align.out"
* The program may create a tmp file in /tmp to hold info about traceback.
* Original version developed under BSD 4.3 on a vax 8650
^include "nw.h" #include "day.h"
static _dbval26] = {
_ 1,14,2，13，0,0,4，1，0，0,12,0，3,15，0，0,0，5，6,8，8,7，9，0，10,0
};
static _pbval[26〗={
1, 21(1《('D'-'A'))I(1《('N'-'A'))， 4， 8, 16, 32， 64, 128,256， OxFFFFFFF， 1《10， 1《12， 1《13, 1 14,
1《15， 1 16, 1《17， 1《18， 1 19, 1《20, 1《21， 1《22， 1《23， 1《24, 1《251(1《(，E'-'A'))I(1《('Q'-'A，))
main(ac, av) main int ac; char*av['];
prog = av[O]; if(ac !=3) {
f^rintf(stderr，"usage: 0/os filel file2\n"， prog);
4)Hntf(stderr，"where filel and file2 are two dna or two protein sequences.\n"); f^rintf(stderr，"The sequences can be in upper- or lower-case\n，，)； 4>rintf^stderr，"Any lines beginning with ';' or '<' are ignored\n"); 4 rintf(stderr，'，Output is in the file \"align.out\"\n"); exit(l);
namex[O] = av[l];
namex〖1〗=av〖2〗；
seqx[O〗=getseq(namex[O], &len0);
seqx〖1〗=getseq(namexEl]， &lenl);
xbm = (dna) —dbval ; 一pbval;
endgaps = 0; ofile = "align.out";
nw(》
rea&jmps(); print(》
./* 1 to penalize endgaps */ /* output file */
/* fill in the matrix, get the possible jmps : /* get the actual jmps */ /* print stats， alignment V
clean叩(O); /* unlink any tmp files Page 1 of nw.cTable 1 (cont. 3)
do the alignment, return best score: main() * dna: values in Fitch and Smith, PNAS， 80， 1382-1386， 1983 ^ pro: PAM 250 values
When scores are equal, we prefer mismatches to any gap, prefer & a new gap to extending an ongoing gap， and prefer a gap in seqx
to a gap in seq y.
v()
int int int int int
register register register register
*px， *py; *ndely， *dely ndelx， delx; *tmp; mis;
ins0， insl; id;
*col0， y
yy;
XX
/* seqs and ptrs */ ;/* keep track of dely */ /* keep track of delx */ /* for swapping row0， rowl */ /* score for each type V /* insertion penalties */
/* diagonal index */ /* jmp index */ *coll; /* score for curr， last row /* index into seqs */
dx = (struct diag *)g—ca"oc("to get diags"， len0+lenl+l， sizeof(struct diag));
ndely = (int *)g—calloc("to get ndely", lenl + l， sizeof(int)); dely = (int *)g_calloc("to get dely", lenl+l， sizeof(int)); col& =〖int *〗g—calloc("to get coiO", lenl+l， sizeof(int)); coll =〖int巧g—calloc《"to get coll'，， lenl+l， sizeof(int)); insO = (dna) iJlNS0 : PINS0; insl =(dna& DINSl :PINSl;
smax--10000; if (endgaps) {
for《col0〖0〗=ddy[O] = -insO， yy = 1; yy <= lenl; yy++) { col0[yy〗=dely[yy] = coI0[yy陽l] - insl; ndely[yy] = yy;
colO[O] = 0; /* Waterman Bull Math Biol 84 */
else
for (yy = 1; yy <= Ienl; yy++) dely[yy] = -insO;
/* fill in match matrix
for (px = seqx[O]， xx = 1; xx <= lenO; px++， xx++) { /* initialize first entry in col
if (endgaps) { if (xx:
else
coH[O] = dek = -(insO+ins 1);
co,=delx = colO[O] - insl; ndelx = xx;
else {
delx = -ins(i; ndelx = 0;
page 2 of nw.c
40I寸
3.MUJ0 ￡經(jīng)d
K一3P J3A0 X一3P PS pp XUE J3A0 S〖E
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} s一3 {
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} (+4xc *++Ad "llsl ==v /CX "丁 /^A 一xb3s = Ad) joj
A￡，Tabk 1 (cont, 5)
id = xx - yy + lenl - 1; …nw if (mis >= delx && mis >= dely[yy])
coll[yy] = mis; else if (delx >= dely[yy]) {
coll[yy〗=3elx;
ij = dx[id].ijmp;
if (dx[id].jp.n[O] && (!dna || (ndelx >= MAXJMP && xx > dx〖id]._ip.x[ij]+MX) |1 mis > dx[id].score+DINSO)) { dx[id].ijmp++; if(++ij>= MAXJMP) { writejmps(id); ij = dx[id].ijmp = 0; dx[id].offset = offset;
offset += sizeof(struct jmp) + sizeof(offset);
dx[id].jp,n[ij] = ndelx; dxfid〗,jp.x〖ij卜xx; dxfid.score = delx;
else {
coll[yy] = dely[yy]; ij = dx[id],ijmp; if (dx[id]jp.n[O] && (!dna H (ndely[yy] >= MAXJMP
&& xx > dx[id].》.x[ij+MX) || mis > dx[id]細(xì)re+DINS0》{ dx[id].ijmp++; if(++ij>= MAXJMP) { writejmps(id); ij = dx[id].ijmp = 0; Sx[id] .offset = offset;
offset += sizeof(struct jmp) + sizeof(offset);
dx[id].jp.n[ij] = -ndely[yy]; dx〖id.jp.x〖ij〗=xx; dx〖id〗.score = dely[yy];
if (xx == lenO && yy < lenl) { /* last col
if (endgaps)
coll[yy] -= ins0+insl*(lenl-yy); if (coll [yy] > smax) {
smax= coll[yy];
dmax = id;
if (endgaps && xx < lenO)
coll[yy-1〗-=ins0+insl*(len0-xx); if (coll[yy-l] > smax) {
smax = coll[yy隱l];
dmax = id;
tmp = colO; colO = coll; coll = tmp;
(void) free((char *)ndely); (void) free((char "dely); (void) free((char "colO》 (void) free"char "coll》
Page 4 of nw.cTab，e 1 fcont. 6)
print() — only routine visible outside this module static:
getmat() — trace back best path, count matches: print()
pr一align() — print alignment of described in array p[]: print()
dumpblock() — dump a block of lines with numbers, stars: pr一align()
nums() — put out a number line: dumpblock()
putline() — put out a line (name， [num], s叫，[num]): dumpblock()
stars() - -put a line of stars: dumpblocf()
stdpname() — strip any path and prefix a seqname
#include "nw.h" #define SPC 3
弁define P—LINE 256 /* maximum output line */
#define P—SPC 3 /* space between name or num and seq
extern—day[26][26];
int olen; /* set output line length *
FILE
fx; /* output file
print
int lx, ly， firstgap， lastgap; /* overlap */
if ((fk = fopen(ofile， "w")) == 0) {
fj>rintf(stderr，"％s: can't write %s\n"， prog， ofile); cleanup(l);
fj)rintf(fx, "<frst sequence: %s (length = %d)\n"， namex[O]， lenO); fJDrintf(fx， "<second sequence: 0/。s (length = %d)\n"， namex[l]， lenl); olen = 60; lx = lenO; ly = lenl;
firstgap = lastgap = 0;
if (dmax < lenl - 1) { /* leading gap in x */ PP[O],spc = firstgap = lenl - dmax匿1; ly -= PP[O].spc;
else if (dmax 〉 lenl - 1) {/* leading gap in y */ pp[l].spc = firstgap = dmax - (lenl陽1); lx ; pp[l].spc;
if (dmaxO < lenO - 1) {/* trailing gap in x */ lastgap = lenO - dmaxO -1; lx -= lastgap;
else if (dmaxO > lenO - 1) { /* trailing gap in y */ lastgap = dmax6 - (lenO - 1); ly -= lastgap;
getmat(lx， ty， firstgap, lastgap); pr_align();
Page 1 of nwprint.c
43/*
* trace back the best path, count matches static
getmat(lx， ly, firstgap， lastgap)
int lx, ly; /* "core" (minus endgaps) */
int firstgap， lastgap; /* leading trailing overlap */
int nm， i0， il, siz0， sizl;
char outx[32]'， double pet; register n0， nl(
register char *p0， *pl;
/* get total matches, score
V
iO = il = sizO = sizl =0; p0 = seqx[O] + pp[l].spc; pi = s叫x〖1〗+ pp〖0〗,spc; n0 = ppfl j.spc + 1; nl = pp〖0〗.spc + 1;
nm = 0;
while (*p0 && *pl){ if (sizO) {
pl++; nl++; sizO--;
else if (sizl) { p0++; n0++; sizl—；
else {
if (xbm[*pO-'A']&xbm[*pl-'A'])
if(nO++==pp
.x,)
sizO = pp
.n[iO++]; if(nl++==pp[l].x[il])
sizl =pp[l].n[il++];
p0++; pl++;
/* pet homology:
* if penalizing endgaps, base is the shorter seq
* else, knock off overhangs and take shorter core
if (endgaps)
lx = (len0<lenl) lenO : lenl;
else
lx = (lx < ly) lx : ly; pet = 100.*(double)nm/(double)lx; &rintf(fx, "W');
$rintf《6c, "<%d match%s in an overlap of %d: %.2f percent similarityW, nm, (nm == l) "" : "es", lx, pet);
Page 2 of nwprint.cstati stat: stat stat: stat: stati stati stat: stat' stat
Table 1 Ccont. 8)
&rintf(fic， "<gaps in first sequence: %d", gapx); if (gapx) {
(void) sprintf(outx，" (0/od %s%s)",
ngapx, (dna) "base":"residue", (ngapx == l) "'':"s'');
f^rintf(fx,"0/os", outx);
&rintf(fx,", gaps in second sequence: %d"， gapy); if (gapy) {
(void) sprintf(outx，" (％d %s%s)",
ngapy, (dna) "base":"residue"， (ngapy == l) "":"s");
fj>rintf(fic，"％s'', outx》；
.getmat
if (dna)
^)rintf(fk，
"\n<score: %d (match = %d， mismatch = 0Ad， gap penalty = 0/>d + 0/od per base)\n" smax， DMAT, DMIS, DINSO, DINS1);
else
f^rintf(fx，
"\n<score: %d (Dayhoff PAM 250 matrix, gap penalty = %d + %d per residue)\n" smax， PINS0, PINS1); if (endgaps)
f^rintf(fx，
"<endgaps penalized, left endgap: %d 0/os%s, right endgap: %d %s%s\n", firstgap, (dna) "base": "residue", (firstgap == l) "": "s"， lastgap， (dna) "base": "residue", (iastgap l) '"': "s");
else
f^rintf(fx， "<endgaps not penalizedVn");
c nm; c lmax; c ij[2]; nc[2]; ni[2]; c siz[2]; c char *ps[2J; c char *po[2]; cchar out[2][PLINE]; cchar star[P—LlNE];
* matches in core — for checking */
* lengths of stripped file names */
* jmp index for a path */
* number at start of current line */
* current elem number — for gapping :
:ptr to current element V ptr to next output char slot: ;output line */ :set by stars() */
print alignment of described in struct path pp[]
static
pr一align()
{ 一
int int
register for (i =
pr—align
more;
char count */
15
0， lmax = 0; i <2; { nn = stripname(namex[i]); if (nn > lmax)
lmax = nn;
nc[i] = 1; ni[i]=l; siz[i] = ij[i] = 0; ps[i〗=seqx[i]; po[i] = out[i];
Page 3 of nwprint.c
45Table 1 fcont. 9)
for (nn = nm = 0, more = 1; more;) { ...pr—align for (i = more = 0; i < 2; i++) {
/承
* do we have more of this sequence1
if(!*ps[i])
continue)
more++;
if (pp[i],spc) {/* leading space */ *po[i]++ =''; PP[i]鄰c—;
else if (siz[i]) {/* in a gap */ *po[i]++ = siz[i]--;
else { /* we're putting a seq element
V
*po[i] = *ps[i]; if (islower(承ps[i]))
*ps[i] = toupper(*ps[i]);
po[i]++; ps[i〗++;
* are we at next gap for this seq if(ni[i]==pp[i].x[ij[i]
* we need to merge all gaps
* at this location
siz[i] =pp[i].n[ij[i]++]; while (ni[i] == pp〖i〗.x[則)
siz[i] += pp[i]—.n[ij[i]++];
ni[i]++;
if (++nn == olen || !more && nn) { dumpblock(》 for (i = 0; i < 2; i++) po[i] = outfi];
nn = 0;
* dump a block of lines, including numbers, stars: pr_align() static
dumpblock() dumpblock
register i;
for (i = 0; i < 2; i++) *po[i]— = '\0'; Page 4 of nwprint.c
46Table 1 (cont. 10)
(void) putc('\n'， fk); for (i = 0; i < 2; {
if(*out[i] && (*out[i] != if(i==0)
*(po[i]) !='')){
nums(i); if(i ==0&& *out[l])
stars(); putline(i);
if (i ==0&& *out[l]) fJDrintf(fx, star);
if(i =1)
nums(i);
dumpblock
put out a number line: dumpblock()
static
nums(ix)
int ix;
index in out[] holding seq line :
char nline[P—L羅]; register i，j; register char *pn， *px， *py;
for (pn =函e， i = 0; i < lmax+P—SPC; i++， pn++)
for (i = nc[ix], py = out[ix]; *py; py++, pn++) {
if(*py==,,ll *py== ,J)
else {
if (i%10 == 0 II (i 1 && nc[ix] != l)) { j = (i < 0) -i: i; for (px = pn; j; j /= 10, px—) *px=j%10 + '0';
if (i<0)
nums
else
*pn = '\0'; nc[ix] = i;
for (pn = nline; *pn; pn++)
(void) putc(*pn， fk); (void) putc('\n'， fk);
put out a line (name, [num], seq， [num]): d腦pblock()
static
putline(ix) int
putline
ix;
Page 5 of nwprint.c
47Table 1 fcont. 11)
hit i; register char
putline
卞x;
for (px = namex[ix]， i = 0; *px && (void) ptitc(*px, fx);
for (; i < lmax+P—SPC; i++) (void) putc(' '， 5c);
:px !=px++， i++)
/* these count from 1:
* ni[] is current element (from 1)
* nc[] is number at start of current line
for (px = out[ixj; *px; px++)
(void) putc(*px&0x7F， fx); (void) putc('W，的
:put a line of stars (seqs always in out[O]， out[l]): dumpblock()
static
stars()
stars
register char
*p0， *pl, cx, *px;
if ("out[O] II (*out
*(po
) == '') II
!*out[l] II (*out[l] ==''&& *(po[l])=='')) return; px = star;
for (i = lmax+P_SPC; i; i—) *px++ ='';
for (p0 = out
; *p0 && *pl; p0++, pl++) { if (isalpha(*p0) && isalpha(*pl)) {
if (xbm[*pO-'A']&xbm[*pl-'A']) { cx = '*'; nm++;
else if (!dna && —day[*pO-'A'][*pl-'A'] > 0)
cx =
else
cx ='';
}
*px++
cx = :cx;
*px++ = W; *px-'\0';
Page 6 of mvpriiU.cTable 1 Ccont. 12)
/*
* strip path or prefix from pn, return len: pr—align()
*/ -
static
stripname(pn) stripname cliar*pn; /* file name (may be path) */
register char *px， *py;
py-O;
for (px = pn; *px; px++) if(*px == 7，
py = px + 1;
if(py)
(void) strcpy(pn, py); return(strlen(pn));
Page 7 of rwprint.c
49Table 1 "out. 13)
/*
* cleanup( ) — cleanup any tmp file
* getseq〖j — read in seq， set dna， len， maxlen
* g—calloc() — calloc() with error checkin
* readjmps( ) — get the good jmps， from tmp file if necessary
* writejmps() — write a filled array of jmps to a tmp file: nw()
^include "nw.h" #incude <sys/file.h〉
char *jname = 7tmp/homgXXXXXX"; /* tmp file for jmps */
FILE *5;
int cleanup(); /* cleanup tmp file */
long lseek();
/*
* remove any tmp file if we blow
cleanup(i) cleanup int i;
if(S)
(void) unlink(jname);
exit(i);
/*
* read, return ptr to seq， set dna, len， maxlen
* skip lines starting with ';'， '<'， or ，>'
* seq in upper or lower case
getseq(flle, len) getseq char*file; /* file name */ int "en; /* seq len */
char line[1024]， *pseq;
register char *px， *pyj int natgc, tlen;
FILE
if , = fopen(file，"r")) = 0) {
印rintf(stcierr，'，o/os: can't read %s\n"， prog， file); exk(l);
tlen = natgc = 0;
while (fgets(line, 1024，柳{
if (*ine == ，;' || *line ==|| *line =='>')
continue; for (px = line; *px != 'Vn'; px++)
if (isupper(承px) || islower(*px)) tlen++;
if ((pseq = malloc((unsigned)(tlen+6))) 0) {
fJ5rintf(staerr，"％s: malloc()〖ailed to get %d bytes for %s\n", prog， tlen+6, file); exit(l);
pseq[O〗=pseq[l=pseq[2〗=pseq[3〗='\0'; Page 1 of nwsubr.cTable 1 fcont. 14)
5
py = pseq + 4; "en = tlen; rewind飾)；
while (fgets(line， 1024，柳{
if (*line == ';' || *line == '<， || *line '〉')
continue; for (px = line; *px != 'Vn'; px++) { if (isupper(*px))
*py++ = *px; else if (islower(*px》)
*py++ = toupper(*px); if (index("ATGCU"，*(py-l))) natgc++;
*py++ = '\0'; *py = '\0'; (void) fclose飾)； dna = natgc 〉 (tlen/3); return(pseq+4);
,.,getseq
char *
g—calloc(msg， nx， sz) char*msg; int nx, sz;
/* program, calling routine */ /* number and size of elements */
char
o){
if ((px = calloc((unsigned)nx， (unsigned)sz)): if (*msg) {
f^rintf(stderr， "％s: g—calloc() failed %s (n=%d， sz=%d)\n", prog, msg， nx, sz); exit(l); 一
retum(px》
get final jmps from dx[] or tmp file, set pp[]， reset dmax: main()
readjmps()
5
read jmps
int int
register if.
fd = -l; siz， i0， il; i, j， xx;
for (i
(void) fclose(①；
if ((fd = open(j,e， O一RDONLY， 0)) < 0) {
f^rintf(stderr， ，,0/os: can't open() 0/os\n", prog， jname); cleanup(l);
i0 = il =0, dmaxO = dmax， xx = len0;; i++) { while (1) {
for (j - dx[dmax].ijmp; j >= 0 && dx[dmax] jp.x[j] >= xx; j—)
Page 2 of nwsubr.c
51<formula>formula see original document page 52</formula>Table 1 (cont. 16)
/*
* write a filled jmp struct offset of the prev one (if any): nw()
承/
writejmps(ix) writejmps int ixj
char*mktemp();
if(!fj){
if (mktemp(jname) < 0) {
^)rintf(stderr, "%s: can't mktemp() %s\n"， prog， jname); clea皿p(l);
if ((Q = fopen(jname， "w")) == 0) {
f^)rintf(stderr， "％s: can't write %s\n"， prog， jname); exit(l);
(void) fwrite((char *)&dx[ix].jp, sizeof(struct jmp)， 1, g); (void) fwrite〖(char "&dxfix〗.offset, sizeof(dx[ix].offset), 1， §);
Page 4 of nwsubr.c
53表2
參照 XXXXXXXXXXXXXXX (長度=15個(gè)氨基酸)
比較蛋白質(zhì) XXXXXYYYYYYY (長度=12個(gè)氨基酸)
%氨基酸序列同一性=
(ALIGN-2測(cè)定為兩種多肽序列之間相同匹配的氨基酸殘基數(shù))—(參照多肽 的氨基酸殘基總數(shù))=
5 + 15 = 33.3%
表3
參照 XXXXXXXXXX (長度=IO個(gè)氨基酸)
比較蛋白質(zhì) XXXXXYYYYYYZZYZ (長度=15個(gè)氨基酸)
%氨基酸序列同一性=
(ALIGN-2測(cè)定為兩種多肽序列之間相同匹配的氨基酸殘基數(shù))+ (參照多肽 的氨基酸殘基總數(shù))=
5 + 10 = 50%
表4
參照DNA NNNNNNNNNNNNNN (長度=14個(gè)核苷酸)
比較DNA NNNNNNLLLLLLLLLL (長度=16個(gè)核苦酸)
%核酸序列同一性=
(ALIGN-2測(cè)定為兩種核酸序列之間相同匹配的核苷酸數(shù))+ (參照DNA核酸 序列的核苷酸總數(shù))二
546+14 = 42.9%
表5
參照-DNA NNNNNNNNNNNN (長度=12個(gè)核苷酸)
比較DNA NNNNLLLVV (長度=9個(gè)核苷酸)
%核酸序列同一性=
(ALIGN-2測(cè)定為兩種核酸序列之間相同匹配的核苷酸數(shù))—(參照DNA核酸 序列的核苷酸總數(shù))=
4+12 = 33.3%
本發(fā)明的診斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋治療劑用于IBD的用途，該治療劑可特異性靶向其中 患病組織和/或細(xì)胞展現(xiàn)出相對(duì)于對(duì)照升高的LY6表達(dá)的病癥。因而，本發(fā)明 涵蓋升高的LY6表達(dá)的檢測(cè)，其可用于檢測(cè)哺乳動(dòng)物的胃腸組織中的IBD(諸 如CD或UC)，和/或鑒定會(huì)特別受益于在改善人類患者的IBD、 UC和/或CD 中有用的IBD治療劑(包括化療劑)處理的組織和病癥。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過直接檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄物或通過檢測(cè)蛋白質(zhì)水平 或活性來檢測(cè)LY6表達(dá)水平?？墒褂脴O其多種技術(shù)之任一來檢測(cè)轉(zhuǎn)錄物，這 些技術(shù)主要依賴于針對(duì)LY6 mRNA轉(zhuǎn)錄物的、針對(duì)自其合成的cDNA的、或 針對(duì)存在LY6基因擴(kuò)增處的DNA的探針或雜交。公知的技術(shù)包括轉(zhuǎn)錄物水平 的Northem印跡、逆轉(zhuǎn)錄酶PCR和微陣列分析。用于檢測(cè)LY6蛋白質(zhì)水平的方 法包括Westem印跡、免疫沉淀、二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D SDS-PAGE， 優(yōu)選針對(duì)已經(jīng)測(cè)定了LY6蛋白質(zhì)的位置的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較)、和質(zhì)譜。質(zhì)譜可 偶聯(lián)一系列純化步驟，以容許高通量地鑒定特定樣品中的許多不同蛋白質(zhì)水 平。質(zhì)譜和2DSDS-PAGE還可用于鑒定對(duì)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后修飾，包括蛋白水 解事件、遍在蛋白化、磷酸化、脂質(zhì)修飾等。也可通過分析對(duì)底物DNA的結(jié) 合或靶啟動(dòng)子的體外轉(zhuǎn)錄激活來評(píng)估LY6活性。凝膠位移測(cè)定法、DNA足跡 測(cè)定法和DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)測(cè)定法都是可用于評(píng)估能夠結(jié)合DNA上Gli結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)的存在的方法(J Mol. Med 77(6):459扁68 (1999); Cell 100(4): 423-34 (2000); Development 127(19): 4923-4301 (2000))。
在某些實(shí)施方案中，測(cè)量了LY6轉(zhuǎn)錄物水平，而且用IBD治療性化合物 處理顯示出相對(duì)于對(duì)照顯著升高的LY6水平的患有疾病或病癥的組織。因而， LY6表達(dá)水平是用于確定患者是否正在罹患IBM和患者是否應(yīng)當(dāng)接受IBD治 療劑的有力診斷措施。
供本發(fā)明方法中使用的抗體組合物 A. 抗LY6抗體
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗LY6抗體的用途，在本文中發(fā)現(xiàn)其 可用作治療、診斷和/或預(yù)后劑來確定炎性腸病諸如UC的存在、嚴(yán)重性和/ 或預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展?？捎糜诖四康牡氖纠缘目贵w包括多克隆、單克隆、人源 化、雙特異性、和異源偶聯(lián)抗體。術(shù)語"抗體"有時(shí)還包括抗原結(jié)合片段。 抗LY6抗體是商品化的，諸如例如R & D Systems, Minneapolis, MN。與作為 抗原的LY6特異性結(jié)合的抗體可通過商業(yè)途徑來獲得，或通過抗體和蛋白質(zhì) 化學(xué)領(lǐng)域已知的、用于在本發(fā)明的方法中4吏用的標(biāo)準(zhǔn)方法來制備。LYPD1的 抗體4皮露于例如US 7,144,990,在此通過述及完整收錄該專利的/>開內(nèi)容。
1. 多克隆抗體
多克隆抗體優(yōu)選通過在動(dòng)物中多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原 和佐劑來生成。將相關(guān)抗原(尤其在使用合成肽時(shí))與在待免疫的物種中有 免疫原性的蛋白質(zhì)偶聯(lián)可能是有用的。例如，可使用雙功能或衍生化試劑， 例如馬來酰亞胺苯曱酰磺基琥珀酰亞胺酯(經(jīng)半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基 琥珀酰亞胺(經(jīng)賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R^^ONR, 其中R和R'是不同的烴基，將抗原與匙孔咸血藍(lán)蛋白(KLH)、血清清蛋白、 牛曱狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑綴合。
通過將例如100嗎或5ng (分別用于兔或小鼠的)蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物與3倍 體積的弗氏完全佐劑混和，并將溶液皮內(nèi)注射于多個(gè)部位，由此使動(dòng)物對(duì)抗 原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物免疫。 一個(gè)月后，通過多個(gè)部位的皮下注射， 用初始量的1/5-1/10的溶于弗氏完全佐劑中的肽或偶聯(lián)物對(duì)動(dòng)物進(jìn)行強(qiáng)化免 疫。7-14天后，采集動(dòng)物的血液，并測(cè)定血清的抗體滴度。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行強(qiáng)化 免疫直到滴度達(dá)到穩(wěn)定。偶聯(lián)物還可在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中作為蛋白質(zhì)融合物來制備。同樣，適當(dāng)使用凝聚劑(諸如明礬)來增強(qiáng)免疫應(yīng)答。 2. 單克隆抗體
單克隆抗體可以通過最初由Kohler等，Nature 256: 495(1975)描述的雜交 瘤方法來制備，或者可通過重組DNA方法來制備(美國專利No. 4，816，567)。
在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合適的宿主動(dòng)物(如倉鼠) 以引發(fā)出生成了或能夠生成如下抗體的淋巴細(xì)胞，所述抗體能特異性結(jié)合用 于免疫的蛋白質(zhì)?；蛘撸梢栽隗w外免疫淋巴細(xì)胞。免疫后，分離淋巴細(xì)胞， 然后使用合適的融合劑(諸如聚乙二醇)將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系融合， 形成雜交瘤纟田月包(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1986)。
將如此制備的雜交瘤細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中接種和培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu) 選含有抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞(也稱作融合配偶)生長或存活的一種 或多種物質(zhì)。例如，如果親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃。票呤鳥噪呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移 酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的選擇性培養(yǎng)基通常將含有次黃。票呤、 氨基喋呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細(xì)胞生長。
優(yōu)選的融合配偶骨髓瘤細(xì)胞是那些高效融合的、支持所選擇的抗體生成 細(xì)胞穩(wěn)定的、高水平的生成抗體的、并對(duì)針對(duì)未融合親本細(xì)胞進(jìn)行選擇的選 擇性培養(yǎng)基敏感的骨髓瘤細(xì)胞。優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠源骨髓瘤系，諸如 可乂人Salk Institute Cell Distribution Center ( San Diege， California, 美國)獲 得的MOPC-21和MPC-11小鼠肺瘤所衍生的那些，以及可從American Type Culture Collection (Manassas, Virginia,美國)獲得的SP陽2及衍生細(xì)月包，例 如X63-Ag8-653細(xì)胞。用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓 瘤細(xì)胞系也已有描述(Kozbor, J. Immunol. 133: 3001(1984); Brodeur等， Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63， Marcel Dekker, Inc.， New York, 1987)。
測(cè)定雜交瘤細(xì)胞所生長的培養(yǎng)基中針對(duì)抗原的單克隆抗體的生成。優(yōu)選 的是，通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測(cè)試，諸如》文射性免疫測(cè)試(RIA)或酶 聯(lián)免疫吸附測(cè)試(ELISA)，測(cè)定由雜交瘤細(xì)胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異 性。
例如，單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過Munson等，Anal. Biochem. 107: 220 (19S0)所述的Scatchard分析來測(cè)定。
57一旦鑒定得到生成具有所需特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞，則可通過有限稀釋流程進(jìn)行亞克隆，并使用標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)該克隆
(Goding， Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103，Academic Press, 1986)。適于這一 目的的培養(yǎng)基包括如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞可在動(dòng)物中作為腹水瘤進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)，例如通過將細(xì)胞i.p.注射到小鼠中。
可通過常規(guī)抗體純化流程，例如親和層析(例如^f吏用蛋白A或蛋白G-Sepharose)或離子交換層析、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析等，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)基、腹水或血清適當(dāng)分開。
編碼單克隆抗體的DNA易于通過常規(guī)流程分離并測(cè)序(例如使用能夠特異性結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。雜交瘤細(xì)胞可用作為此類DNA的優(yōu)選來源。 一旦分離，可將DNA置于表達(dá)載體中，然后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到不另外產(chǎn)生抗體蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞中，諸如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，用以在重組宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成。關(guān)于編碼抗體的DNA在細(xì)菌中的重組表達(dá)的綜述性論文包括Skerra等，Curr. Opinion in Immunol. 5: 256-262 (1993)和Pliickthun, Immunol. Revs. 130: 151-188(1992)。
在另 一個(gè)實(shí)施方案中，可從使用McCafferty等，Nature 348: 552-554 (1990)所述的技術(shù)構(gòu)建的抗體噬菌體文庫中分離單克隆抗體或抗體片段。Clackson等，Nature 352: 624-628 (1991 )和Marks等，J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)分別描述了使用噬菌體文庫分離鼠和人抗體。后續(xù)出版物描述了通過鏈改組(Marks等，Bio/Technology 10: 779-783 (1992))、以及組合感染和體內(nèi)重組來構(gòu)建非常大的噬菌體文庫的策略(Waterhouse等，Nuc. Acids Res. 21:2265-2266(1993)),從而生成高親和力(nM范圍)的人抗體。因此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替換方法。
可以修飾編碼抗體的DNA以生成嵌合或融合抗體多肽，例如通過用人重鏈和輕鏈恒定域(CH和CL)序列替代同源鼠序列(美國專利No. 4，816，567;Morrison等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851(1984))來進(jìn)行，或通過融合免疫球蛋白編碼序列和非免疫球蛋白多肽(異源多肽)的整個(gè)或部分編碼序列來進(jìn)行。非免疫球蛋白多肽序列可替代抗體的恒定域，或者用它們替代抗體的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變域，從而產(chǎn)生嵌合二價(jià)抗體，其包含對(duì)一種抗
58原具有特異性的 一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)以及對(duì)不同抗原具有特異性的另 一個(gè)抗 原結(jié)合位點(diǎn)。
3. 人和人源化抗體
如鼠源)抗體的人源化形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的
嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、 Fab、 Fab'、 F(ab')2或抗 體的其它抗原結(jié)合子序列)。人源化抗體包括如下人免疫球蛋白(受體抗體)， 其中的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)殘基被具有所期望的特異性、親和力和能力的非人 物種(供體抗體)(諸如小鼠、大鼠或兔)的CDR殘基替換。在有些情況中， 將人免疫球蛋白的Fv框架殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。人源化抗體還可包含 在受體抗體或輸入CDR或框架序列中沒有發(fā)現(xiàn)的殘基。通常，人源化抗體包 含至少一個(gè)、通常兩個(gè)基本上完整的可變域，在該可變域中，所有或基本上 所有CDR區(qū)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些CDR區(qū)，且所有或基本上所有FR 區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的那些FR區(qū)。人源化抗體最好還包含至少部分免 疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)(Jones等，Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann等，Nature, 332: 323-329(1988);和Presta， Curr. Op. Struct. Biol.， 2: 593-596(1992))。
用于將非人抗體人源化的方法在本領(lǐng)域是現(xiàn)有公知的。通常，人源化抗 體具有一個(gè)或多個(gè)從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常 稱作"輸入"殘基，它們通常取自"輸入"可變域。人源化可基本上依照Winter 及其同事的方法進(jìn)行(Jones等，Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann等， Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen等,Science, 239: 1534-1536(1988》， 通過用嚙齒類CDR序列替代相應(yīng)的人抗體序列來進(jìn)行。因此，此類"人源化" 抗體是嵌合抗體(美國專利No. 4,816,567 )，其中用來自非人物種的相應(yīng)序列 替代基本少于整個(gè)人可變域。在實(shí)踐中，人源化抗體通常是如下的人抗體， 其中 一些CDR殘基和可能的一些FR殘基用來自嚙齒類抗體中類似位點(diǎn)的殘 基替代。
當(dāng)抗體意圖在于人類治療性用途時(shí)，用于制備人源化抗體的人可變域 (包括輕鏈和重鏈)的選擇，對(duì)于降低抗原性和HAMA應(yīng)答(人抗小鼠抗體) 都非常重要。根據(jù)所謂的"最適"方法，用嚙齒類抗體可變域序列對(duì)已知的整 個(gè)人可變域序列文庫進(jìn)行篩選。鑒定與嚙齒類最接近的人V結(jié)構(gòu)域序列，并
59接受其中的人框架區(qū)(FR)用于人源化抗體(Sims等，J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia等，J.Mol.Biol.， 196: 901 (1987》。另一種方法使用由特定 輕鏈或重鏈亞類的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架區(qū)。同 一框架可用 于數(shù)種不同的人源化抗體(Carter等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta等，J. Immunol. 151: 2623 (1993))。
更為重要的是，抗體在人源化后保持對(duì)抗原的高結(jié)合親和力以及其它有 利的生物學(xué)特性。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，依照一種優(yōu)選的方法，通過^f吏用親本 和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物的方法來 制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是可獲得的，且為本領(lǐng)域熟練技 術(shù)人員所熟悉。還可獲得計(jì)算機(jī)程序，其能圖解和顯示所選候選免疫球蛋白 序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。檢查這些顯示圖像能夠分析殘基在候選免疫球蛋 白序列行使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能 力的殘基。這樣，可從受體和輸入序列中選出FR殘基并進(jìn)行組合，從而獲得 所需抗體特征，如對(duì)靶抗原的親和力提高。通常，高變區(qū)殘基直接且最實(shí)質(zhì) 地涉及對(duì)抗原結(jié)合的影響。
設(shè)想了人源化抗LY6抗體的各種形式。例如，人源化抗體可以是抗體片 段，諸如Fab，其任選偶聯(lián)有一種或多種細(xì)胞毒劑以生成免疫偶^:物?；蛘?， 人源化抗體可以是完整的抗體，如完整的IgGl抗體。
作為人源化的替代方法，可生成人抗體。例如，現(xiàn)在有可能生成轉(zhuǎn)基因 動(dòng)物(例如小鼠)，其在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況下能夠由免疫而生 成完全的人抗體全集。例如，已經(jīng)描述了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連 接區(qū)(Jh)基因的純合缺失，其能導(dǎo)致內(nèi)源抗體生成的完全抑制。將大量人種 系免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)移到此類種系突變小鼠中將導(dǎo)致在抗原攻擊后生成人 抗體。參見如，Jakobovits等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 90: 2551 (1993); Jakobovits等，Nature, 362: 255-258(1993); Bruggemann等，Year in Immuno. 7: 33 (1993);美國專利No. 5,545,806， 5，569，825, 5,591,669 (都是GenPharm 的)；5,545,807;和WO 97/17852。
或者，噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等，Nature 348: 552-553 (1990))可 用于在體外從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)域基因全集生成人抗體 和抗體片段。根據(jù)這種技術(shù)，將抗體V結(jié)構(gòu)域基因以符合閱讀框的方式克隆 到絲狀噬菌體(如M13或fd)的主要或次要外殼蛋白基因中，并在噬菌體顆
60粒表面上展示為功能性抗體片段。因?yàn)榻z狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，根據(jù)抗體的功能特性進(jìn)行的選擇也就選擇了編碼展示那些特性的 抗體的基因。由此，噬菌體模擬B細(xì)胞的一些特性。噬菌體展示可以多種形 式進(jìn)4亍,纟宗述參見嗦口Johnson, Kevin S.禾口Chiswell， David J. ， Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993)。 V基因區(qū)段的數(shù)種來源可用于噬菌體 展示。Clackson等，Nature 352: 624-628 (1991)從衍生自經(jīng)免疫小鼠脾的小型 V基因隨機(jī)組合文庫中分離得到極其多種抗D惡唑酮抗體?；疽勒誐arks等， J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)或Griffith等，EMBO J. 12: 725-734 (1993)所 述技術(shù)，由未免疫人供體構(gòu)建V基因全集，并分離針對(duì)極其多種抗原(包括 自身抗原)的抗體。還可參見美國專利No. 5,565，332和5,573，卯5。如上所述，還可通過體外激活的B細(xì)胞(參見美國專利No. 5，567，610和 5,229,275 )來生成人抗體。4. 抗體片段在某些情況中，使用抗體片段而非完整抗體是有利的。較小的片段能被 快速清除，而保持著與相應(yīng)全長分子相似的抗原結(jié)合特異性，而且能改善對(duì) 實(shí)體瘤的進(jìn)入性。已經(jīng)開發(fā)了用于生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過蛋白水解消化 完整抗體來衍生這些片段(參見如Morimoto等，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992);和Brennan等，Science, 229: 81(1985))。然而，現(xiàn)在可直接由重組宿主細(xì)胞生成這些片段。Fab、 Fv和scFv 抗體片段都可在大腸桿菌中表達(dá)并由大腸桿菌分泌，由此可方便生成大量的 這些片段?？蓮纳衔挠懻摰目贵w噬菌體文庫中分離抗體片段?；蛘?，可直接 從大腸桿菌回收Fab'-SH片段，并通過化學(xué)方法偶聯(lián)形成F(ab')2片段(Carter等， Bio/Technology 10: 163-167 (1992))。依照另一種方法，可直接從重組宿主細(xì) 胞培養(yǎng)物分離F(ab')2片段。包含補(bǔ)救受體結(jié)合表位殘基、具有延長的體內(nèi)半 衰期的Fab和F(ab')2片段描述于美國專利5，869,046中。用于生成抗體片段的其 它技術(shù)對(duì)熟練從業(yè)人員是顯而易見的。在其他實(shí)施方案中，選擇的抗體是單 鏈Fv片段(scFv)。參見W093/16185;美國專利No. 5,571,894;和美國專利No. 5,587,458。 Fv和sFv是具有完整結(jié)合位點(diǎn)且缺乏恒定區(qū)的唯一種類；因此， 它們適合于在體內(nèi)使用過程中降低非特異性結(jié)合。可構(gòu)建sFv融合蛋白以在 sFv氨基末端或羧基末端生成效應(yīng)器蛋白的融合物。參見《AntibodyEngineering)), Borrebaeck編，同上。抗體片段還可以是"線性抗體"，例如美 國專利No. 5,641,870中描述的抗體。此類線性抗體片段可以是單特異性的或 雙特異性的。5. 雙特異性抗體雙特異性抗體對(duì)至少兩種不同表位具有結(jié)合特異性。示例性的雙特異性它此類抗體可將以上LY6結(jié)合位點(diǎn)與針對(duì)另 一種蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)聯(lián)合起 來。在雙特異性抗體在本發(fā)明的診斷方法中有用的情況中，第二抗體臂可結(jié) 合可檢測(cè)多肽?？蓪㈦p特異性抗體制備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2 雙特異性抗體)。用于制備雙特異性抗體的方法是現(xiàn)有已知的。全長雙特異性抗體的傳統(tǒng) 生成基于兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的共表達(dá)，其中兩種鏈具有不同的特 異性(Millstein等，Nature 305: 537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈 的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤)生成了潛在有10種不同抗體分子的 混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過親和層析步驟進(jìn) 行純化正確分子，這相當(dāng)麻煩，且產(chǎn)物產(chǎn)量低。WO 93/08829及Traunecker 等，EMBOJ. 10: 3655-3659 (1991)中公開了類似的流程。根據(jù)不同的方法，將具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗 體可變域與免疫球蛋白恒定域序列融合。優(yōu)選的是，融合使用包含至少部分 鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定域。優(yōu)選的是，在至少一種融合物中出現(xiàn)有包含輕鏈結(jié)合所必需位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CHl)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物以及(如果需要的)免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達(dá)載 體中，并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主細(xì)胞中。在用于構(gòu)建的三種多肽鏈比例不等時(shí) 提供期望雙特異性抗體的最佳產(chǎn)量的實(shí)施方案中，這為調(diào)整三種多肽片段的 相互比例提供了更大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比率表達(dá)產(chǎn)生高產(chǎn)量時(shí)或在該比率對(duì)期望鏈組合的產(chǎn)量沒有顯著影響時(shí)，有可能將兩種 或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同 一個(gè)載體。在本方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙特異性抗體由一個(gè)臂上具有第一 結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈、和另 一個(gè)臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個(gè)雙特異 性分子中的存在提供了分離的便利途徑，因此發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)便于將所62需雙特異性化合物與不想要的免疫球蛋白^r連組合分開。該方法〃^開于wo94/046卯。關(guān)于生成雙特異性抗體的進(jìn)一步細(xì)節(jié)參見如Suresh等，Methods in Enzymology 121: 210(1986)。根據(jù)美國專利No. 5，731,168中描述的另一種方法，可改造一對(duì)抗體分子 之間的界面，從而使從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收的異二聚體的百分比最大化。 優(yōu)選的界面包含至少部分CH3結(jié)構(gòu)域。在該方法中，將第一抗體分子界面的 一個(gè)或多個(gè)小氨基酸側(cè)鏈用較大側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過用 較小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換大氨基酸側(cè)鏈，從而在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生與大側(cè)鏈相同或相似大小的補(bǔ)償性"空腔"。這提供了提 高異二聚體產(chǎn)量的機(jī)制，而不是其它不想要的終產(chǎn)物，如同二聚體。雙特異性抗體包括交聯(lián)或"異源偶聯(lián)"抗體。例如，異源偶聯(lián)物中的一種 抗體可與親合素偶聯(lián)，另一種抗體與生物素偶聯(lián)。例如，此類抗體被建議用 于使免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國專利No. 4,676,980 )，及用于治療 HIV感染(WO 91/00360、 WO 92/200373和EP 03089 )。通過在每一個(gè)抗體上 提供(不同的或相同的)可檢測(cè)標(biāo)志物以實(shí)現(xiàn)改良的測(cè)定法檢測(cè)，異源偶聯(lián) 抗體也可在本發(fā)明的方法中找到用途。可使用任何便利的交聯(lián)方法制備異源 偶聯(lián)抗體。合適的交聯(lián)劑是現(xiàn)有公知的，并且連同許多交聯(lián)技術(shù)一起公開于 美國專利No. 4,676，980中。文獻(xiàn)中還描述了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可使用化 學(xué)連接來制備雙特異性抗體。Brennan等，Science 229: 81(1985)描述了 一種 方法，其通過蛋白水解切割完整抗體以生成F(ab')2片段。將這些片段在存在 二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉的情況下還原，以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二 硫鍵的形成。然后將產(chǎn)生的Fab，片段轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼趸郊姿狨?TNB)衍生物。 然后將Fab'-TNB衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢復(fù)成Fab'-硫醇，并與 等摩爾量的另一種Fab'-TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特 異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。最近的*使得從大腸桿菌中直接回收Fab'-SH片段變得更加容易，其可 化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。Shalaby等，J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) 描述了完全人源化雙特異性抗體F(ab')2分子的生產(chǎn)。每個(gè)Fab'片段由大腸桿 菌分開分泌，并在體外進(jìn)行定向化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。如此形成的 雙特異性抗體能夠結(jié)合過表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞和正常人T細(xì)胞，并觸發(fā)人細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞針對(duì)人乳房胂瘤靶物的溶解活性。從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中直接制備和分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)也被描述了。例如，已使用亮氨酸拉鏈來生成雙特異性抗體(Kostelny等，J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992))。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通 過基因融合與兩種不同抗體的Fab'部分連接?？贵w同二聚體在鉸鏈區(qū)還原而 形成單體，然后重新氧化而形成抗體異二聚體。這種方法也可用于生成抗體 同二聚體。由Hollinger等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)描 述的"雙抗體"技術(shù)提供了制備雙特異性抗體片段的替代機(jī)制。該片段包含通 過接頭相連的Vh和V。所述接頭太短使得同 一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)。因此，迫使一個(gè)片段上的VH和VL結(jié)構(gòu)域與另一個(gè)片段上的互補(bǔ)VL和VH結(jié)構(gòu)域配對(duì)，由此形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。還報(bào)道了通過使用單鏈Fv (sFv)二聚體制備雙特異性抗體片段的另一種策略。參見Gmber等，J. Immunol., 152: 5368 (1994)。本發(fā)明還設(shè)想了具有超過兩個(gè)效價(jià)的抗體。例如，可制備三特異性抗體 (Tutt等，J. Immunol. 147: 60 (1991))。6. 多價(jià)抗體多價(jià)抗體可以比二價(jià)抗體更快地被表達(dá)該抗體所結(jié)合抗原的細(xì)胞來內(nèi) 在化(和/或異化)。本發(fā)明的抗體可以是具有三個(gè)或更多抗原結(jié)合位點(diǎn)(例 如四價(jià)抗體)的多價(jià)抗體(不同于IgM類)，其可容易地通過編碼抗體多肽鏈 的核酸的重組表達(dá)而生成。多價(jià)抗體可包含二聚化結(jié)構(gòu)域和三個(gè)或更多抗原 結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選的二聚化結(jié)構(gòu)域包含F(xiàn)c區(qū)或鉸鏈區(qū)(或由其組成)。在這種 情況中，抗體將包含F(xiàn)c區(qū)及Fc區(qū)氨基末端的三個(gè)或更多抗原結(jié)合位點(diǎn)。本文 中優(yōu)選的多價(jià)抗體包含三個(gè)至約八個(gè)、但優(yōu)選四個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(或由其組 成)。多價(jià)抗體包含至少一條多肽鏈(且優(yōu)選兩條多肽鏈)，其中所述多肽鏈 包含兩個(gè)或多個(gè)可變域。例如，多肽鏈可包含VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc，其 中VD1是第一可變域，VD2是第二可變域，F(xiàn)c是Fc區(qū)的一條多肽鏈，Xl和 X2代表氨基酸或多肽，而n是0或l。例如，多肽鏈可包含VH-CHl-柔性接 頭-VH-CH1-Fc區(qū)鏈；或VH-CH1-VH-CH1-Fc區(qū)鏈。本文中的多價(jià)抗體優(yōu)選 還包含至少兩條(且優(yōu)選四條)輕鏈可變域多肽。例如，本文中的多價(jià)抗體 可包含約兩條至約八條輕鏈可變域多肽。本文設(shè)想的輕鏈可變域多肽包含輕 鏈可變域，且任選還包含Qi吉構(gòu)域。647. 效應(yīng)器功能的工程改造
可能希望在效應(yīng)器功能方面修飾本發(fā)明的抗體，例如用以增強(qiáng)抗體的抗
體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。這 可通過在抗體Fc區(qū)中引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代來實(shí)現(xiàn)。或者/另外，可在 Fc區(qū)中引入半胱氨酸殘基，從而使得在該區(qū)中形成鏈間二硫鍵。如此生成的 同二聚體抗體可具有改善的內(nèi)在化能力和/或提高的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和 抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)。參見Caron等，J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)和Shopes,B.， J. Immunol. 148:2918-2922(1992)。具有增強(qiáng)的抗胂瘤活 性的同二聚體抗體還可使用如Wolff等，Cancer Research 53: 2560-2565 (1993) 中描述的異雙功能交聯(lián)劑來制備?；蛘?，抗體可工程改造成具有雙重Fc區(qū)的， 由此可具有增強(qiáng)的補(bǔ)體溶解和ADCC能力。參見Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230(1989)。為了提高抗體的血清半衰期，人們可如美國 專利No. 5,739,277中所述將補(bǔ)救受體結(jié)合表位摻入抗體(尤其是抗體片段)。 本文所用的術(shù)語"補(bǔ)救受體結(jié)合表位"指IgG分子(例如IgGl、 IgG2、 IgG3或 IgG4 ) Fc區(qū)中負(fù)責(zé)提高IgG分子體內(nèi)血清半衰期的表位。
8. 免疫偶聯(lián)物
本發(fā)明還涉及包含偶聯(lián)有細(xì)胞毒劑的抗體的免疫偶聯(lián)物，所述細(xì)胞毒劑 諸如化療劑、生長抑制劑、毒素(如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶活性 毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶聯(lián)物)和/或可檢測(cè)標(biāo)記物。 a. 化療劑
上文已經(jīng)描述了可用于生成此類免疫偶聯(lián)物的化療劑?？墒褂玫拿富钚?毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈 (來自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒蛋白 A《連、a-帚曲霉素、油才同(j/ewnfes/oni/0蛋白、香石竹蛋白(dianthin proteins)、 美洲商陸(尸/^to/aca amen'c朋a)蛋白(PAPI、 PAPII和PAP-S )、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、月巴皂草(sapaonaria officinalis) 抑制劑、白樹毒蛋白、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉 素和單端孢菌素。多種放射性核素可用于生成放射偶聯(lián)抗體。實(shí)例包括^Bi、 131I、 I31In、 9Gy和^Re?？贵w和細(xì)胞毒劑的偶聯(lián)物可使用多種雙功能蛋白質(zhì) 偶聯(lián)劑來制備，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亞 氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二曱酯)、活性酯類(諸如
65辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對(duì) -疊氮苯曱?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對(duì)-重氮苯曱?；?乙二胺)、
二異氰酸酯(諸如曱苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如l,5-二氟 -2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如Vitetta等，Science 238: 1098(1987) 中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標(biāo)記的l-異硫氰酸苯曱基-3-曱基二 亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核普酸與抗體偶聯(lián)的示例性 的螯合劑。參見WO 94/11026。
本文還設(shè)想了抗體與一種或多種小分子毒素(如加利車霉素、美登木素 生物堿類、單端孢霉素和CC1065,及這些毒素具有毒素活性的衍生物)的 偶寫關(guān)物。
B. LY6結(jié)合寡肽
本發(fā)明的LY6結(jié)合寡肽指結(jié)合(優(yōu)選特異結(jié)合)本文所述LY6多肽的寡 肽。LY6結(jié)合寡肽可以使用已知的寡肽合成方法學(xué)化學(xué)合成，或者可使用重 組技術(shù)制備和純化。LY6結(jié)合寡肽的長度通常是至少約5個(gè)氨基酸，或者長度
為至少約6、7、 8、.9、10、11、12、13、14、 15、 16、 17、 18、 19、20、 21、
22、 23、 24、25、26、27、28、29、30、31、 32、 33、 34、 35、 36、37、 38、
39、 40、 41、42、43、44、45、46、47、48、 49、 50、 51、 52、 53、54、 55、
56、 57、 58、59、60、61、62、63、64、65、 66、 67、 68、 69、 70、71、 72、
73、 74、 75、76、77、78、79、80、81、82、 83、 84、 85、 86、 87、88、 89、
90、 91、 92、93、94、95、96、97、98、.99或100個(gè)氨基酸或更長,其中此
類寡肽能夠結(jié)合(優(yōu)選特異結(jié)合)本文所述的LY6多肽。LY6結(jié)合寡肽無需 過多試驗(yàn)就可使用公知技術(shù)來鑒定。在這方面，注意到用于對(duì)寡肽文庫篩選 能夠特異結(jié)合多肽靶物的寡肽的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的(參見例如美國專利No. 5,556,762; 5,750,373; 4,708,871; 4,833,092; 5,223,409; 5,403,484; 5,571,689; 5,663,143; PCT
發(fā)明者勞里·迪爾, 肯尼思·弗拉納根, 廉 莫 申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司