專利名稱：使用含高濃度氨基酸的培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于通過培養(yǎng)生產(chǎn)所希望的蛋白質(zhì)的細胞來制造這種 蛋白質(zhì)的方法和該方法中使用的培養(yǎng)基。詳細的是，本發(fā)明涉及一種 無血清培養(yǎng)法及蛋白質(zhì)制造方法，其特征在于在通過培養(yǎng)生產(chǎn)所希望
的蛋白質(zhì)的細胞來制造這種蛋白質(zhì)的方法中，通過將培養(yǎng)液中的絲氨 酸維持在高濃度來進行培養(yǎng)，還提供了在該方法中使用的細胞培養(yǎng)用
流力口培養(yǎng)基o
背景技術：
在通過培養(yǎng)動物細胞要獲得該動物細胞產(chǎn)生的天然型蛋白質(zhì)時、 或者在通過培養(yǎng)導入了編碼所希望的蛋白質(zhì)的基因的動物細胞制造所 希望的蛋白質(zhì)等時，除了鹽類、糖類、氨基酸類和維生素類等基礎營
養(yǎng)物外，為了該動物細胞的增殖， 一直以來，在培養(yǎng)基中在5~20%的 范圍內(nèi)添加哺乳動物來源的抽出物、具體是胎兒牛血清等血清，這種 哺乳動物來源的血清占培養(yǎng)基的成本的75~95%，由于品質(zhì)上存在批 次差異，因此存在無法獲得穩(wěn)定增殖的缺點。而且，哺乳動物來源的 血清由于無法用高壓滅菌器等滅菌，因此有可能被病毒或支原體污染， 盡管大多無害，但從穩(wěn)定生產(chǎn)的觀點出發(fā)，這會形成額外的未知的重 要因素。
近年來，人們擔憂哺乳動物來源的成分與瘋牛病(mad cow disease)、牛腦海纟帛狀病(Bovine Spongiform Encephalopathy: BSE)、 感 染 性 海 綿 狀 腦 病 (Transmissible Spongiform Encephalopathy: TSE)、 以及克雅(氏)病(Creutzfeld-Jakob Disease: CJD)等之間的關系，因此從安全性方面考慮理想的是出現(xiàn)不 含這些哺乳動物來源成分的動物細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基。此外，血清中含 有500種以上的蛋白質(zhì)，因此這使得從培養(yǎng)培養(yǎng)基中分離純化作為細胞產(chǎn)物的所希望的蛋白質(zhì)復雜化。
以往，為了解決上述問題，進行了用于在無血清存在下培養(yǎng)動物 細胞的無血清培養(yǎng)法的開發(fā)。無血清培養(yǎng)法中，逐步開發(fā)了添加了胎
球蛋白(fetuin)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、白蛋白等血漿蛋白質(zhì)、類固醇激素、胰 島素等激素類、增殖因子、氨基酸、維生素等營養(yǎng)因子等作為代替血 清效果的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)液。
無血清培養(yǎng)法中使用的胎球蛋白(fetuin)、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、 增殖因子等利用血清來源的純化的蛋白質(zhì)或重組生物來源的重組體蛋 白質(zhì)。通過使用這些物質(zhì)，存在以下問題即使微量，也包括生物來 源成分，必須使用高價制品，批次差異導致培養(yǎng)的偏差等問題。
近年來，盡管開發(fā)了利用蛋白質(zhì)加水分解物的無血清培養(yǎng)法，但 其存在與上述相同的含有生物來源成分，高價，批次差異導致制造偏 差等問題，很難說足以進行有用蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。
因此，理想的是使用盡可能不含生物來源成分，便宜而且批次差 異小的蛋白質(zhì)產(chǎn)量增強的合成培養(yǎng)基的培養(yǎng)法。近年來，對流加培養(yǎng) 時培養(yǎng)液中的葡萄糖和氨基酸的舉動進行分析，清楚了通過在流加培 養(yǎng)時增量谷氨酸，有助于增加抗凝血酶的產(chǎn)量(非專利文獻1)。然而， 這些認識，由于只通過表達谷氨酰胺合成酶的CH0細胞進行研究，因 此在通常的CH0細胞中沒有驗證，而且，其它氨基酸各自的效果也不 清楚。此外，蛋白質(zhì)產(chǎn)量也還不能說充分。因此，強烈期望使用產(chǎn)量 進一步增強的合成培養(yǎng)基的培養(yǎng)法。
非專利文獻1 : Journal of Bioscience and Bioengineering (2005)， 100(5)， 502-510
發(fā)明的內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題
本發(fā)明的目的在于，在通過極力排除了生物來源的培養(yǎng)基成分的 培養(yǎng)基進行流加培養(yǎng)時，通過改良培養(yǎng)基，使細胞中生產(chǎn)高產(chǎn)量的蛋 白質(zhì)。
用于解決問題的方法本發(fā)明人為了實現(xiàn)上述課題，反復進行了積極的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 通過使無血清培養(yǎng)液中往往枯竭的特定氨基酸的濃度維持在高濃度， 可以使細胞生產(chǎn)高產(chǎn)量的蛋白質(zhì)，基于這種認識，完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明提供以下內(nèi)容。
(1) 細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于在通過培養(yǎng)產(chǎn)生所希望的蛋白 質(zhì)的細胞制造該蛋白質(zhì)時，至少在細胞的增殖期開始時以后的一定時
間內(nèi)，培養(yǎng)液中的絲氨酸的濃度在lmM以上。
(2) 上述(1)的方法中，其還至少在細胞的增殖期開始時以后的一 定時間內(nèi)，培養(yǎng)液中的酪氨酸的濃度在lraM以上，和/或半胱氨酸的濃 度在起始培養(yǎng)基的濃度以上或0. 4mM以上。
(3) 動物細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基，其含有l(wèi)mM以上的絲氨酸或其鹽。
(4) 動物細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基，其含有l(wèi)mM以上的絲氨酸或其鹽， 并且至少含有l(wèi)mM以上的酪氨酸，和/或0. 4mM以上的半胱氨酸。
(5) 所希望的蛋白質(zhì)的制造方法，其特征在于使用上述(3)或(4) 所述的動物細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基，培養(yǎng)產(chǎn)生所希望的蛋白質(zhì)的細胞，制 造該蛋白質(zhì)。
(6) 細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于在培養(yǎng)產(chǎn)生所希望的蛋白質(zhì)的 細胞制造該蛋白質(zhì)時，至少在培養(yǎng)的細胞能夠充分增殖時或產(chǎn)生的所 希望的蛋白質(zhì)能夠充分產(chǎn)生的時間內(nèi)的一部分或所有時間內(nèi)培養(yǎng)液中 絲氨酸的濃度在lmM以上。
(7) 上述(6)的方法中，其還至少在培養(yǎng)的細胞能夠充分增殖時或 產(chǎn)生的所希望的蛋白質(zhì)能夠充分產(chǎn)生的時間內(nèi)的一部分或所有時間 內(nèi)，培養(yǎng)液中酪氨酸的濃度在lmM以上，和/或半胱氨酸的濃度在起始 培養(yǎng)基的濃度以上或0. 4齒以上。
(8) 細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于在通過培養(yǎng)產(chǎn)生所希望的蛋白 質(zhì)的細胞制造該蛋白質(zhì)時，至少在細胞的對數(shù)增殖期的一部分或全部 時間內(nèi)，培養(yǎng)液中絲氨酸的濃度在lmM以上。
(9) 上述(8)的方法中，其還至少在細胞的對數(shù)增殖期的一部分或 全部時間內(nèi)，培養(yǎng)液中的酪氨酸濃度在lmM以上，和/或半胱氨酸濃度在起始培養(yǎng)基的濃度以上或0. 4mM以上。
(10) 上述(8)或(9)的方法，其至少在細胞的對數(shù)增殖期的一部分 或全部時間內(nèi)培養(yǎng)液中絲氨酸濃度在2mM以上。
(11) 細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于在通過培養(yǎng)產(chǎn)生所希望的蛋白 質(zhì)的細胞制造該蛋白質(zhì)時，至少在培養(yǎng)第3~ 10天的一部分和全部時 間內(nèi)，培養(yǎng)液中的絲氨酸濃度在lmM以上。
(12) 上述(11)的方法中，其還至少在培養(yǎng)第3~10天的一部分和 全部時間內(nèi)，培養(yǎng)液中的酪氨酸濃度在lmM以上，和/或半胱氨酸的濃 度在起始培養(yǎng)基的濃度以上或0. 4mM以上。
(13) 上述(11)或(12)的方法，其至少在培養(yǎng)第3~10天的一部分 和全部時間內(nèi)培養(yǎng)液中絲氨酸的濃度為2mM以上。
(14) 上述(1)、 (2)、 (5) ~ (13)任何一項的培養(yǎng)方法或制造方法中， 其通過分批培養(yǎng)法(batch culture)、重復分批培養(yǎng)法(repeated batch culture)、流力口培養(yǎng)法(fed-batch culture)、或重復流力口培 養(yǎng)法(repeated fed-batch culture)、 連續(xù)培養(yǎng)法(continuous culture)、灌流培養(yǎng)法(perfusion culture)培養(yǎng)細胞。
(15) 上述(l)、 (2)、 (5) ~ (13)任一項的培養(yǎng)方法或制造方法， 其通過纟危加培養(yǎng)法培養(yǎng)細胞。
(16) 上述(15)的方法，其通過逐次多次和連續(xù)流加向培養(yǎng)液提供 絲氨酸和酪氨酸和/或半胱氨酸。
(17) 上述(l)、 (2)、 (5) ~ (16)任一項的培養(yǎng)方法或制造方法， 所述細胞導入了編碼所希望的蛋白質(zhì)的基因。
(18) 上述(17)的方法，所述所希望的蛋白質(zhì)是抗體。
(19) 上述(l)、 (2)、 (5) ~ (18)任一項的方法，所述細胞是哺乳 動物細胞。
(20) 上述(19)的方法，所述哺乳動物細胞是CHO細胞。
(21) 含有濃度為10mM 1000mM的絲氨酸的細胞培養(yǎng)用流加培養(yǎng)基。
(22) 含有濃度為20mM~ 500mM的絲氨酸的細胞培養(yǎng)用流加培養(yǎng)基。
(23) 上述(21)或(22)的流加培養(yǎng)基，其還添加了半胱氨酸和/或酪氨酸。
(24) 上述(21)或(22)的流加培養(yǎng)基，其還添加了半胱氨酸和酪氨酸。
(25) —種通過流加培養(yǎng)法培養(yǎng)細胞的方法，其特征在于添加上述(21) ~ (24)任一項所述的流加培養(yǎng)基。
(26) —種蛋白質(zhì)的制造方法，其特征在于在通過培養(yǎng)細胞制造所希望的蛋白質(zhì)的方法中，使用上述(l)、 (2)、 (6) ~ (20)任一項所述的方法進行培養(yǎng)。
(27) —種藥物的制造方法，其以用上述(5)或(26)中所述的制造方法制造的蛋白質(zhì)作為有效成分。
發(fā)明的效果
本發(fā)明，可對于生理活性肽或蛋白質(zhì)的生產(chǎn)極為有利地使用。本發(fā)明的特征在于，通過采用不含生物來源的成分的合成培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，可以增大蛋白質(zhì)的生產(chǎn)性。此外，本發(fā)明中使用的流加培養(yǎng)基由于添加極純的氨基酸，因此是成分組成清楚，批次間差異小，而且均一的培養(yǎng)基。因此荻得更均一的蛋白質(zhì)的可能性高，是有利于工業(yè)生產(chǎn)的培養(yǎng)基。具體的是，例如可極大有助于藥品用抗體等的大量供應。
附圖的簡要說明表示培養(yǎng)期間抗體濃度的變化。(實施例1)[圖2]表示培養(yǎng)期間的存活率的變化。(實施例1)[圖3]表示培養(yǎng)期間乳酸濃度的變化。(實施例1)[圖4]表示培養(yǎng)期間抗體濃度的變化。(實施例2)[圖5]表示培養(yǎng)期間存活率的變化。(實施例2)〖圖6]表示培養(yǎng)期間乳酸濃度的變化。(實施例2)[圖7]表示培養(yǎng)期間抗體濃度的變化。(實施例3)[圖8]表示培養(yǎng)期間絲氨酸濃度的變化。(實施例3)[圖9]培養(yǎng)期間的酪氨酸濃度的變化。(實施例3)[

圖10]表示牛磺酸轉(zhuǎn)運蛋白的氨基酸序列和編碼其的基因的堿基序列。(參考例1)表示牛磺酸轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構。(參考例1)表示表達質(zhì)粒pHyg/TauT的結(jié)構。(參考例2)
用于實施發(fā)明的最佳方式
以下，對本發(fā)明的實施方式進行更詳細的說明。
本發(fā)明的方法的特征在于，在通過培養(yǎng)生產(chǎn)所希望的蛋白質(zhì)的細胞，制造該蛋白質(zhì)時，通過培養(yǎng)液中的絲氨酸維持在高濃度進行培養(yǎng)。具體的是，特征在于至少在細胞的增殖期開始時以后的一定時間內(nèi)培養(yǎng)液中的絲氨酸濃度在lmM以上、優(yōu)選在2mM以上。
因此，含有l(wèi)mM以上的絲氨酸或其鹽的動物培養(yǎng)用培養(yǎng)基是本發(fā)明的一個方式。本發(fā)明中，所謂"含有l(wèi)mM以上的絲氨酸(或其鹽)的動物培養(yǎng)用培養(yǎng)基，，，不僅包括起始培養(yǎng)基的絲氨酸濃度在lmM以上的培養(yǎng)基，還包括通過添加流加培養(yǎng)基等，至少在細胞的增殖期開始時以后的一定時間內(nèi)培養(yǎng)液中絲氨酸的濃度調(diào)整到lmM以上、優(yōu)選2mM以上的培養(yǎng)基。
此外，本發(fā)明的方法中，特征在于在培養(yǎng)液中，除了高濃度的絲氨酸外，還補充酪氨酸和/或半胱氨酸進行培養(yǎng)。具體是，至少在細胞的增殖期開始時之后的一定時間內(nèi)，設法使培養(yǎng)液中的酪氨酸的濃度在lmM以上、和/或半胱氨酸的濃度在起始培養(yǎng)基的濃度以上。其中，由于起始培養(yǎng)基的半胱氨酸濃度通常在0. 4mM左右，因此前述半胱氨酸濃度無論起始培養(yǎng)基的半胱氨酸濃度怎樣，至少在細胞的增殖期開始時之后的一定時間內(nèi)培養(yǎng)液中半胱氨酸的濃度可以在0. 4mM以上，優(yōu)選在lmM以上。
因此，含有l(wèi)mM以上的絲氨酸或其鹽，還至少含有l(wèi)mM以上的酪氨酸、和/或0. 4mM以上的半胱氨酸的動物培養(yǎng)用培養(yǎng)基是本發(fā)明的一種方式。本發(fā)明中，所謂"含有l(wèi)mM以上的酪氨酸的動物培養(yǎng)用培養(yǎng)基"，不僅包括起始培養(yǎng)基的酪氨酸濃度為lmM以上的培養(yǎng)基，還包
10括通過添加流加培養(yǎng)基等，至少在細胞的增殖期開始時以后的一定時
間內(nèi)培養(yǎng)液中酪氨酸的濃度調(diào)整到lmM以上的培養(yǎng)基。同樣，所謂"含有OMmM以上的半胱氨酸的動物培養(yǎng)用培養(yǎng)基，，，不僅包括起始培養(yǎng)基的半胱氨酸濃度為Q. 4mM以上的培養(yǎng)基，還包括通過添加流加培養(yǎng)基等，至少在細胞的增殖期開始時以后的一定時間內(nèi)培養(yǎng)液中的半胱氨酸的濃度調(diào)整到0. 4mM以上的培養(yǎng)基。
這樣一來通過維持培養(yǎng)液中的絲氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)的濃度進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)的細胞能夠充分增殖時或產(chǎn)生的所希望的蛋白質(zhì)能夠充分產(chǎn)生的時間內(nèi)的一部分或所有時間內(nèi)，培養(yǎng)液中的絲氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)的濃度維持在預定濃度以上，就可以使細
胞中產(chǎn)生高產(chǎn)量的蛋白質(zhì)。
這樣一來，在培養(yǎng)產(chǎn)生所希望的蛋白質(zhì)的細胞時，通過使用將絲氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)的濃度調(diào)整到預定濃度以上的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，制造該蛋白質(zhì)的方法是本發(fā)明的一個側(cè)面。因此，所希望的蛋白質(zhì)的制造方法也是本發(fā)明的一個方式，該方法的特征在于通過使用上述的含有l(wèi)mM以上的絲氨酸或其鹽的動物培養(yǎng)用培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)生所希望的蛋白質(zhì)的細胞來制造該蛋白質(zhì)。此外，特征在于通過使用含有l(wèi)mM以上的絲氨酸或其鹽，還至少含有l(wèi)mM以上的酪氨酸和/或0. 4mM以上的半胱氨酸的動物培養(yǎng)用培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)生所希望的蛋白質(zhì)的細胞來制造該蛋白質(zhì)的所希望的蛋白質(zhì)的制造方法也是本發(fā)明的一個方式。
本發(fā)明中，如上所述培養(yǎng)液中的絲氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)的濃度維持在預定濃度以上的時期，可以只維持增殖期開始時開始到終止時的一部分時間，或者可以在從增殖期開始時一直到終止時的所有時間或培養(yǎng)期的整個時間里都維持。
其中，所謂"增殖期開始時期"是指培養(yǎng)細胞的增殖的誘導期開始移行到加速期的時期。然后，從加速期開始移行到對數(shù)增殖期、減速期、停止期、死亡期。(小林猛、本多裕之著、r生物化學工學J、東京化學同人、應用生命科學系列8、發(fā)刊年「 2002年J)。本發(fā)明的另一個側(cè)面中，本發(fā)明的培養(yǎng)法中，培養(yǎng)液中的絲氨酸 (和酪氨酸和/或半胱氨酸)濃度維持在預定濃度以上的時期，可以在培 養(yǎng)細胞能夠充分增殖的時期或產(chǎn)生的所希望的蛋白質(zhì)能夠充分產(chǎn)生的 時期的一部分或全部維持，具體可以在培養(yǎng)細胞的增殖期開始時一直
到結(jié)束時的一部分或全部時間里維持。尤其是，由于在培養(yǎng)第3天后 起始培養(yǎng)基中的氨基酸含量逐漸減少，培養(yǎng)第3天后的一定時間內(nèi)將 培養(yǎng)液中的絲氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)濃度維持在預定濃度以 上十分重要。因此，本發(fā)明的這個側(cè)面中，更具體的是，在需要將培 養(yǎng)液中絲氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)的濃度維持在預定濃度以上 的時期，可以是至少在培養(yǎng)第3天起培養(yǎng)細胞的減速期到停止期這一 時期的一部分或整個時期，優(yōu)選培養(yǎng)第3天起培養(yǎng)細胞的對數(shù)增殖期 一直到減速期這一段時期的一部分或整個時期。
作為更具體的方式，作為將培養(yǎng)液中絲氨酸(和酪氨酸和/或半胱 氨酸)的濃度維持在預定濃度以上的優(yōu)選時期，可以是從至少細胞的增 殖期開始時(通常在培養(yǎng)第l天時)的4日后(通常在培養(yǎng)5天后)，優(yōu) 選至少在增殖期開始時的3天后(通常在培養(yǎng)4天后)后，更優(yōu)選在至 少增殖開始時的2天后(通常在培養(yǎng)3天后)后，更優(yōu)選在增殖期開始 之后。此外，作為需要將培養(yǎng)液中絲氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸) 的濃度維持在預定濃度以上的時期，在培養(yǎng)期在兩周內(nèi)時，可以是至 少一直維持到培養(yǎng)結(jié)束的5天前，優(yōu)選4天前，更優(yōu)選3天前。培養(yǎng) 期超過兩周時，可以至少維持到培養(yǎng)第10天，優(yōu)選到培養(yǎng)結(jié)束的5 天前，更優(yōu)選培養(yǎng)結(jié)束的4天前，更優(yōu)選培養(yǎng)結(jié)束的3天前。
本發(fā)明的另 一個側(cè)面中，作為將培養(yǎng)液中絲氨酸(和酪氨酸和/或 半胱氨酸)的濃度連續(xù)維持在預定濃度以上的優(yōu)選時期，可以是至少在 細胞對數(shù)增殖期的一部分時間內(nèi)。具體是，對數(shù)增殖期開始時的4天 以后，優(yōu)選對數(shù)增殖期開始時的3天后，更優(yōu)選對數(shù)增殖期開始時以 后。其中，所謂"細胞的對數(shù)增殖期的部分時期，，是指，可以只維持 對數(shù)增殖期的部分時間，或在對數(shù)增殖期開始時開始直到終止時的所 有時間內(nèi)，直到終止時為止的所有時間，或整個培養(yǎng)期的所有時間內(nèi)200880013018.8
維持。
典型的細胞培養(yǎng)中，對數(shù)增殖期開始時間通常是培養(yǎng)第3天時。 因此，本發(fā)明更具體的方式中，特征在于在至少培養(yǎng)第3天后部分或 整個培養(yǎng)時期中培養(yǎng)液中的絲氨酸的濃度為lmM以上，優(yōu)選2mM以上。 此外，酪氨酸和/或半胱氨酸的濃度在預定濃度以上時，至少在培養(yǎng)第 3天后的部分或所有培養(yǎng)時期中，設法使培養(yǎng)液中酪氨酸的濃度達到 lmM以上，和/或半胱氨酸的濃度達到起始培養(yǎng)基的濃度以上。其中， 起始培養(yǎng)基的半胱氨酸濃度通常在0. 4mM左右，因此前述半胱氨酸濃 度無論起始培養(yǎng)基的半胱氨酸濃度怎樣，在培養(yǎng)第3天后的部分或整 個培養(yǎng)時期中培養(yǎng)液中半胱氨酸的濃度可以是O. 4mM以上，優(yōu)選在lmM 以上。
本發(fā)明中，所謂"至少在培養(yǎng)第3天后的部分或整個培養(yǎng)時期" 可以是培養(yǎng)第4天、第5天、第6天或第7天以后的培養(yǎng)時期等，相 反，可以是包括培養(yǎng)開始時，培養(yǎng)第1天或第2天后，培養(yǎng)第3天后 的部分或整個培養(yǎng)時期的培養(yǎng)時期。
此外，培養(yǎng)時期在兩周以內(nèi)時，作為培養(yǎng)液中絲氨酸(和酪氨酸和 /或半胱氨酸)的濃度連續(xù)維持在預定濃度以上的優(yōu)選時期，可以是至 少到培養(yǎng)結(jié)束5天前為止，優(yōu)選4天前，更優(yōu)選3天前。培養(yǎng)時期超 過兩周時，可以是至少到培養(yǎng)第IO天為止，優(yōu)選到培養(yǎng)結(jié)束5天前為 止，更優(yōu)選到培養(yǎng)結(jié)束4天前為止，更優(yōu)選到培養(yǎng)結(jié)束3天前為止。
因此，本發(fā)明的另一個方式的特征在于至少在培養(yǎng)第3~10天的 一部分和全部時間內(nèi)培養(yǎng)液中的絲氨酸濃度在lmM以上，優(yōu)選在2mM 以上。此外，在酪氨酸和/或半胱氨酸的濃度在預定濃度以上時，至少 在培養(yǎng)第3 ~ 10天的一部分和全部時間內(nèi)設法使培養(yǎng)液中酪氨酸的濃 度達到lmM以上、和/或半胱氨酸的濃度達到起始培養(yǎng)基的濃度以上。 由于起始培養(yǎng)基的半胱氨酸濃度通常在0.4mM左右，因此前述半胱氨 酸濃度無論起始培養(yǎng)基的半胱氨酸濃度如何，在培養(yǎng)第3~10天的部 分或整個時期中培養(yǎng)液中半胱氨酸的濃度可以在0. 4mM以上，優(yōu)選在 lmM以上。本發(fā)明中所謂"至少在培養(yǎng)第3~10天的部分或整個時期"可以 是培養(yǎng)第4天、第5天、第6天或第7天以后的培養(yǎng)時期等，相反， 可以是包括培養(yǎng)開始時，培養(yǎng)第1天或第2天以后培養(yǎng)第3~10天的 部分或整個培養(yǎng)時期的培養(yǎng)時期。
此外，在前述方式中，至少在培養(yǎng)笫3天后的部分或整個時期培 養(yǎng)液中絲氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)的濃度維持在預定濃度以上， 如果培養(yǎng)期短于IO天時，在培養(yǎng)第3天后的部分或整個時期中培養(yǎng)液 中絲氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)的濃度如果維持在預定濃度以上 就包含在本發(fā)明中。
通過這種用本發(fā)明的方法培養(yǎng)細胞，就可以使細胞產(chǎn)物生產(chǎn)高產(chǎn) 量蛋白質(zhì)，通過從培養(yǎng)基中分離該蛋白質(zhì)進行純化，可以制造所希望 的蛋白質(zhì)。
作為用于將培養(yǎng)液中的絲氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)維持在 預定濃度進行培養(yǎng)的手段，可以在細胞培養(yǎng)的最初階段起使培養(yǎng)基中 含有高濃度的絲氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)，或通過在培養(yǎng)中追加 含有高濃度的絲氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)的培養(yǎng)基來補充這些 氨基酸。
為了使培養(yǎng)液中絲氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)的濃度維持在 預定濃度以上，作為開始向培養(yǎng)液中補充氨基酸的時期，理想的是至 少在培養(yǎng)液中的上述氨基酸降低到預定濃度以下的3天以內(nèi)，優(yōu)選1 天以內(nèi)、最優(yōu)選氨基酸降低到預定濃度以下前開始補充。作為補充氨 基酸的方法，可以一次或連續(xù)多次分開補充，也可以連續(xù)補充。此外， 還可以在起始培養(yǎng)基中含有整個培養(yǎng)期間，維持預定濃度所必需的氨 基酸量的全部。
一般來說，細胞培養(yǎng)方法被分為分批培養(yǎng)法(batch culture)、連 續(xù)培養(yǎng)法(continuous culture)、流力口培養(yǎng)法(fed-batch culture)。 本發(fā)明的方法中可以使用任意一種方法，但優(yōu)選使用流加培養(yǎng)法或連 續(xù)培養(yǎng)法，尤為優(yōu)選使用流加培養(yǎng)法。
分批培養(yǎng)法是這樣的方法，即向培養(yǎng)基中加入少量種子培養(yǎng)液，
14并且培養(yǎng)中不新添加培養(yǎng)基或不排出培養(yǎng)液，使細胞增殖的培養(yǎng)方法。 本發(fā)明中使用分批培養(yǎng)法時，從細胞培養(yǎng)的最初階段起使培養(yǎng)基中含 有高濃度的絲氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)。
連續(xù)培養(yǎng)法是培養(yǎng)中連續(xù)添加培養(yǎng)基，且連續(xù)使之排出的培養(yǎng)方
法。而且，連續(xù)法還包括灌流培養(yǎng)(perfusion culture)。
流加培養(yǎng)法由于處于分批培養(yǎng)法和連續(xù)培養(yǎng)法之間，因此也稱為 半分批培養(yǎng)法(semi-batch culture),培養(yǎng)中連續(xù)地或逐次地添力口培 養(yǎng)基，但不進行連續(xù)培養(yǎng)法的這種連續(xù)的培養(yǎng)液排出的培養(yǎng)方法。流 加培養(yǎng)時添加的培養(yǎng)基(以下稱為流加培養(yǎng)基)不需要與已經(jīng)在培養(yǎng)中 使用的培養(yǎng)基(以下稱為起始培養(yǎng)基)相同，可以添加不同的培養(yǎng)基， 也可以只添加特定成分。
本發(fā)明中所謂起始培養(yǎng)基通常是指在細胞培養(yǎng)的最初階段使用的 培養(yǎng)基。但是，在多次分別添加流加培養(yǎng)基時，分別添加流加培養(yǎng)基
前的培養(yǎng)基也可以作為起始培養(yǎng)基。
本發(fā)明中，在使用流加培養(yǎng)法或連續(xù)培養(yǎng)法時，可以使在培養(yǎng)途 中添加的培養(yǎng)基中含有高濃度的絲氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)，還 可以使從細胞培養(yǎng)的最初階段起在培養(yǎng)基中含有高濃度的絲氨酸(和 酪氨酸和/或半胱氨酸)。重要的是，如上所述，在培養(yǎng)的至少預定階 段內(nèi)設法使絲氨酸的濃度，或絲氨酸和酪氨酸的濃度，或絲氨酸和半 胱氨酸的濃度，或絲氨酸和酪氨酸和半胱氨酸的濃度維持在預定濃度 以上。因此，例如，通過適時分析培養(yǎng)液中絲氨酸(和酪氨酸和/或半 胱氨酸)的濃度，添加的培養(yǎng)基中這些氨基酸的濃度，可以控制培養(yǎng)液 中這些氨基酸的濃度。或者，可以釆用例如，根據(jù)細胞數(shù)判斷培養(yǎng)中 的細胞增殖的階段，從而控制氨基酸的補給的方法。
下面，就具有本發(fā)明的特征的培養(yǎng)液中的成分-絲氨酸、酪氨酸和 半胱氨酸進行詳細說明。
絲氨酸可以采用單品、其衍生物、其鹽中的任一種。此外，還可 以使用天然絲氨酸或采用合成法或基因重組法制造的絲氨酸。溶液中 的濃度的特征是，例如至少在培養(yǎng)中的預定時期中培養(yǎng)液中絲氨酸的濃度在lmM以上，優(yōu)選在2mM以上。由于以往一直使用的含絲氨酸的 培養(yǎng)基，典型的是含有約0. 5mM絲氨酸，因此可以說本發(fā)明中絲氨酸 濃度是極高濃度(Dulbecco， R ， Freeman, G. Virology 8， p396 (1959)， Nature, New Biology (1971) 230， p52)。
就酪氨酸而言，同樣也可使用單品、其衍生物、其鹽中的任意一 種。此外，還可以使用天然酪氨酸或采用合成法或基因重組法制造的 酪氨酸。就半胱氨酸而言，可以采用單品、其衍生物、其鹽中的任一 種，包括半胱氨酸的二聚體、胱#^酸。還可以使用天然半胱氨酸或采 用合成法或基因重組法制造的半胱氨酸。溶液中的濃度的特征是，例 如至少在培養(yǎng)中的預定時期中培養(yǎng)液中酪氨酸的濃度在ImM以上、和/ 或半胱氨酸的濃度在起始培養(yǎng)基的濃度以上。
本發(fā)明中，在使用流加培養(yǎng)法作為細胞培養(yǎng)方法時，通過使高濃 度的絲氨酸和酪氨酸和/或半胱氨酸溶解于流加培養(yǎng)基中，向培養(yǎng)中中 連續(xù)的或逐次的追加流加培養(yǎng)基，可以將這些氨基酸的濃度維持在預 定濃度以上。具體而言，例如在流加培養(yǎng)基的濃度中，可使用含有約 10~ 1000mM，優(yōu)選20 500mM、更優(yōu)選50 200mM的L-絲氨酸的流加 培養(yǎng)基。此外，可以使用含有約0.01~ 1000mM、優(yōu)選l 200mM、更優(yōu) 選10~ 100mM的L-酪氨酸的流加培養(yǎng)基、而且，可以使用含有約0. 01 ~ 500mM、優(yōu)選0. 1 ~ 50mM、更優(yōu)選1 ~ 10mM的L-半胱氨酸鹽酸鹽的流加 培養(yǎng)基。
本發(fā)明中在培養(yǎng)液中添加前述流加培養(yǎng)基時，流加培養(yǎng)基量，可 以使用在整個培養(yǎng)時期，連續(xù)的或一定時期、或逐次地添加起始培養(yǎng) 基量的1~150%、優(yōu)選5~50%、更優(yōu)選8~20%。
本發(fā)明中，向培養(yǎng)液中添加前述流加培養(yǎng)基的時期，包括至少從 培養(yǎng)的細胞的增殖期開始時期開始直到終止時期為止的部分或整個時 期。作為優(yōu)選時期，至少是培養(yǎng)中的細胞的對數(shù)增殖期開始時期(通常 為培養(yǎng)第3天時)的4天后，優(yōu)選對數(shù)增殖期開始時的3天之后，更優(yōu) 選對數(shù)增殖期開始時(通常是培養(yǎng)第3天時)以后。或，理想的是至少 在培養(yǎng)液中的上述氨基酸降低到預定濃度以下的3天以內(nèi)，優(yōu)選l天以內(nèi)，最優(yōu)選氨基酸降低到預定濃度以下前開始流加。此外，作為實 行或繼續(xù)流加的時期，在培養(yǎng)時期在兩周以內(nèi)時，可以是至少到培養(yǎng)
結(jié)束5天為止，優(yōu)選直到4天前，更優(yōu)選直到3天前。培養(yǎng)期超過兩 周時，可以至少到培養(yǎng)第IO天為止、優(yōu)選直到培養(yǎng)結(jié)束5天前為止， 更優(yōu)選到培養(yǎng)結(jié)束4天日前為止，更優(yōu)選可以到培養(yǎng)結(jié)束3天前為止。
本發(fā)明的方法中使用的培養(yǎng)液中的其它成分，通過可以適當使用 細胞(優(yōu)選動物細胞)培養(yǎng)培養(yǎng)基中使用的各成分，它們包括氨基酸、 維生素類、脂質(zhì)因子、能源、浸透壓調(diào)節(jié)劑、鐵源、pH緩沖劑。除上 述成分外，還可以添加例如微量金屬元素、表面活性劑、增殖輔助因 子、核苷等。此外，還可以分批分別添加含有本發(fā)明中使用的特征成 分的培養(yǎng)基成分，再用于細胞培養(yǎng)。具體的是，可以在細胞培養(yǎng)中同 時或變化時間使用例如單獨的高濃度絲氨酸和培養(yǎng)基成分。
作為培養(yǎng)液中其它成分，具體可以列舉，例如L-丙氨酸、L-精氨 酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-鳥氨酸、 L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-纈氨酸等、優(yōu)選L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨 酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨 酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-纈氨酸等氨基 酸類；i-環(huán)已六醇、生物素、葉酸、硫辛酸、煙堿、煙酸、p-氨基苯酸、 泛酸釣、鹽酸吡哆醛、鹽酸維生素B6、核黃素、鹽酸疏胺素、維生素 B12、抗壞血酸等、優(yōu)選生物素、葉酸、；克辛酸、煙酰胺、泛酸鈣、鹽 酸吡噴醛、核黃素、鹽酸硫胺素、維生素B12、抗壞血酸等維生素類； 氯化膽堿、酒石酸膽堿、亞油酸、油酸、膽固醇等、優(yōu)選氯化膽堿等 脂質(zhì)因子；葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等、優(yōu)選葡萄糖等能源；氯 化鈉、氯化鉀、硝酸鉀等、優(yōu)選氯化鈉等浸透壓調(diào)節(jié)劑；EDTA鐵、檸 檬酸鐵、氯化亞鐵、氯化鐵、硫酸亞鐵、硫酸鐵、硝酸鐵等、優(yōu)選氯 化鐵、EDTA鐵、檸檬酸鐵等鐵源類；碳酸氫、氯化鈣、磷酸二氫鈉、 HEPES、 M0PS等、優(yōu)選碳酸氬等pH緩沖劑。
17除上述成分外，還可以添加例如硫酸銅、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸 鎂、氯化鎳、氯化錫、氯化鎂、亞硅酸鈉等、優(yōu)選硫酸銅、疏酸鋅、
硫酸鎂等微量金屬元素；Tween80、 PluronicF68等表面活性劑；和重組 型胰烏素、重組型IGF、重組型EGF、重組型FGF、重組型PDGF、重組 型TGF-a、鹽酸乙醇胺、亞硒酸鈉、視黃酸、鹽酸腐胺等、優(yōu)選亞硒 酸鈉、鹽酸乙醇胺、重組型IGF、鹽酸腐胺等增殖輔助因子；脫氧腺苷、 脫氧胞啶、脫氧烏苷、腺噤呤核苷、胞啶、鳥普、尿普等核苷等。而 且在上述本發(fā)明的合適的例子中還可以含有鏈霉素、青霉素G鉀和慶 大霉素等抗生物質(zhì)、或酚紅等pH指示劑。
此外，培養(yǎng)液中其他成分的含量，氨基酸在0. 05-1500mg/L、維 生素類在0. 001-10mg/L、脂質(zhì)因子在0-200mg/L、能源在l-20g/L、 浸透壓調(diào)節(jié)劑在0. l-10000mg/L、鐵源在0. 1-500mg/L、 pH緩沖劑在 l-10000mg/L、」微量金屬元素在0. 00001-200mg/L、表面活性劑在 0-5000mg/L 、 增殖輔助因子在0. 05-10000 |i g/L和核苷在 0. 001-50mg/L的范圍是合適的，這可以根據(jù)培養(yǎng)細胞的種類、所希望
的蛋白質(zhì)的種類等來適當確定。
培養(yǎng)液的pH 4艮據(jù)培養(yǎng)細胞而不同， 一般而言pH6.8~7.6、許多 情況下pH7. 0~7.4是合適的。
本發(fā)明中，可以使用溶解了上述成分的完全合成培養(yǎng)基來培養(yǎng)細 胞?；蛘撸褂靡酝膭游锛毎囵B(yǎng)用培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基， 還可以向其中補充本發(fā)明中使用的特征成分。作為動物細胞培養(yǎng)用培 養(yǎng)基，如果要舉例市售的基礎培養(yǎng)基，可以使用D-MEM (Dulbeccc/s Modified Eagle Medium) 、D-MEM/F-12 1:1 Mixture (Dulbecco's Modified Eagle Medium : Nutrient Mixture F-12)、 腦I164(K CHO-S-SFMII (Invitrogen社)、CHO-SF (Sigma-Aldrich公司)、 EX-CEIX 301 (JRH biosciences公司)、CD-CHO (Invi trogen公司)、 IS CHO-V (Irvine Scientif ic公司)、PF-ACF-CH0 (Sigma-Aldrich 公司)等。在通過流加培養(yǎng)法培養(yǎng)細胞時，作為細胞培養(yǎng)的最初階段中 使用的起始培養(yǎng)基，可以使用這種市售的培養(yǎng)基。而且，為了將起始培養(yǎng)基中使用的培養(yǎng)基調(diào)制成高濃度，可以使用還補充了絲氨酸和酪 氨酸和/或半胱氨酸的培養(yǎng)基作為流加培養(yǎng)基。
本發(fā)明的培養(yǎng)方法沒有特別限定，可以用于各種細胞(例如、細菌 細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、植物細胞、動物細胞等)的培養(yǎng)。例如，
可以培養(yǎng)通過基因工程操作整合了編碼所希望的蛋白質(zhì)的基因的COS 細胞或CH0細胞、或產(chǎn)生抗體的以小鼠-人、小鼠-小鼠、小鼠-大鼠等 的雜交瘤為代表的融合細胞。本發(fā)明的方法可以在培養(yǎng)動物細胞要獲 得該動物細胞所產(chǎn)生的天然型蛋白質(zhì)時使用，除上述細胞外，還可以 用于培養(yǎng)BHK細胞、HeLa細胞等。
本發(fā)明中特別優(yōu)選的動物細胞是導入了編碼所希望的蛋白質(zhì)的基 因的CH0細胞。所希望的蛋白質(zhì)沒有特別限定，可以是天然抗體、抗 體片段、低分子化抗體、嵌合抗體、人源化抗體等抗體(例如、抗IL-6 受體抗體、抗Glypican-3抗體、抗CD3抗體、抗CD20抗體、抗 GPIIb/IIIa抗體、抗TNF抗體、抗CD25抗體、抗EGFR抗體、抗Her2/neu 抗體、抗RSV抗體、抗CD33抗體、抗CD52抗體、抗IgE抗體、抗CDlla 抗體、抗VEGF抗體、抗VLA4抗體等)或生理活性蛋白質(zhì)(粒細胞集落 刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞刺激因子(GM-CSF)、促紅細胞生成 素、干擾素、IL-1或IL-6等白細胞介素、t-PA、尿激酶、血清白蛋 白、血液凝固因子等)等任何蛋白質(zhì)，尤為優(yōu)選抗體。
作為本發(fā)明的制造方法生產(chǎn)的抗體，包括人、小鼠、大鼠、倉鼠、 兔、猴等動物來源的單克隆抗體，還包括嵌合抗體、人源化抗體、雙 特異性抗體等人為進行了改變的基因重組型抗體。而且，抗體的免疫 球蛋白類型沒有特別限定，可以是IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG々等IgG、 IgA、 IgD、 IgE、 IgM等中的任一類型，但作為藥品^使用時優(yōu)選IgG和 IgM。而且本發(fā)明的抗體不僅包括完整的抗體，還包括Fv、 Fab、 F(ab)2 等抗體片段、用肽連接子等連接子結(jié)合了抗體的可變區(qū)域的1價或2 價以上的單鏈Fv(scFv、 sc(Fv)2等)低分子化抗體等。
由于培養(yǎng)條件根據(jù)使用細胞的種類而不同，因此可以確定適當?shù)?合適條件。例如，如果是CH0細胞，則通?？梢栽跉庀嗟?)2濃度為0-40%,優(yōu)選2-10%的氣氛下、30-39°C、優(yōu)選在37。C左右，培養(yǎng)1-50 天，更優(yōu)選1-14天培養(yǎng)。
此外，作為動物細胞培養(yǎng)用的各種培養(yǎng)裝置，可以使用例如發(fā)酵 槽型罐培養(yǎng)裝置、氣升型培養(yǎng)裝置、培養(yǎng)瓶型培養(yǎng)裝置、攪拌瓶 (spinner flask)型培養(yǎng)裝置、微載體型培養(yǎng)裝置、流動層型培養(yǎng)裝置、 中空纖維型培養(yǎng)裝置、轉(zhuǎn)瓶型培養(yǎng)裝置、充填槽型培養(yǎng)裝置等進行培 養(yǎng)。
通過用本發(fā)明的方法培養(yǎng)細胞(優(yōu)選動物細胞)，可以高產(chǎn)蛋白質(zhì)。 動物細胞蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，可以單獨進行培養(yǎng)，需要特殊操作時， 這些操作或條件等可以根據(jù)培養(yǎng)的動物細胞適當確定。例如在通過基 因工程操作轉(zhuǎn)化了含有編碼小鼠-人嵌合抗體的基因的載體的CH0細 胞中，在前述這種條件下實施培養(yǎng)，1-50天、優(yōu)選5-21天、更優(yōu)選 17-14天左右，就可以在培養(yǎng)基中荻得所希望的蛋白質(zhì)。通過常規(guī)方 法(例如參照抗體工學入門、地人書館、(1994)p. 102-104; Affinity Chromatography Principles & Methods 、 GE Health care(林)、 (2003)p. 56-60等)對這些蛋白質(zhì)進行分離、純化，可以獲得所希望的 蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，可以以高產(chǎn)量制造重組抗體(天然抗體、抗體片段、 低分子化抗體、嵌合抗體、人源化抗體、雙特異性抗體等)、基因重組 蛋白質(zhì)(粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞刺激因子 (GM-CSF)、促紅細胞生成素、干擾素、IL-1或IL-6等白細胞介素、 t-PA、尿激酶、血清白蛋白、血液凝固因子、等)等。
按照本發(fā)明的方法制造的蛋白質(zhì)或多肽(也稱為本發(fā)明的蛋白質(zhì)) 在具有可作為藥物利用的生物學活性時，通過將這種蛋白質(zhì)或多肽與 藥物上允許的載體或添加劑混合再制劑化，可以制成藥品。本發(fā)明的 蛋白質(zhì)和以本發(fā)明的蛋白質(zhì)作為有效成分的藥物也包含在本發(fā)明的范 圍中。
作為藥物中可允許的載體和添加劑的例子，可以列舉水、藥物上 允許的有機溶劑，骨膠原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基
20聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、褐藻酸鈉、水溶性葡聚糖、 羧曱基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、 酪蛋白、瓊脂、聚乙二醇、雙甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蠟、
硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、作 為藥物添加物被允許的表面活性劑等。
實際的添加物，可以根據(jù)本發(fā)明的藥物治療劑的劑型，從上述物 質(zhì)中單獨或適當組合地進行選擇，當然并不限于這些。例如，作為注 射用制劑使用時，將純化的多肽溶解于溶劑，例如生理食鹽水、緩沖 液、葡萄糖溶液等中，向其中加入吸附防止劑、例如Tween80、Tween20、 明膠、人血清白蛋白等后再使用。或者為了形成在使用前溶解再重新 構成的劑型，可以是經(jīng)冷凍干燥的劑型，作為用于冷凍干燥的賦形劑， 例如，可以使用甘露醇、葡萄糖等糖醇或糖類。
多肽的有效給藥量根據(jù)多肽的種類、作為治療或預防的對象的疾 病種類、患者的年齡、疾病的病重程度等適當選擇。例如，本發(fā)明的 蛋白質(zhì)為抗Glypican抗體等抗體時，其有效給藥量按每次體重每lkg， 從0. OOlmg至1000mg的范圍內(nèi)選擇?；蛘呖梢赃x擇按每位患者0. 01 ~ 100000mg/body的給藥量。但是，也不限于這些給藥量。
本發(fā)明的藥物給藥方法，可以是經(jīng)口，非經(jīng)口給藥中的任意一種， 但優(yōu)選非經(jīng)口給藥，具體可以列舉注射(例如，通過靜脈內(nèi)注射、肌肉 內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射等進行的全身或局部給藥)、經(jīng)鼻給藥、 經(jīng)肺給藥、經(jīng)皮給藥等。
實施例
以下，通過實施例和參考例對本發(fā)明具體的說明。而且，這些實 施例等是用于說明本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明的范圍。
〔實施例1〕通過含有高濃度絲氨酸、半胱氨酸、酪氨酸的低pH 流加培養(yǎng)基進行的流加培養(yǎng)(導入乖體基因的CH0細胞林)
培養(yǎng)基組成和制備方法如下所述。
起始培養(yǎng)基:對市售的動物細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基溶解后過濾滅菌。 流加培養(yǎng)基起始培養(yǎng)基中使用的動物細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基以相對于起始培養(yǎng)基3倍濃度溶解后，加入絲氨酸50mM、半胱氨酸鹽酸鹽一 水合物1. 8mM、酪氨酸14. 5mM，用鹽酸降低pH直至培養(yǎng)基成分全部溶 解(pH1.5附近)，確認培養(yǎng)基成分全部溶解后，過濾滅菌。
細胞人源化IgG(抗Glypican-3抗體)產(chǎn)生CHO細胞林(參照國 際公開第WO 2006/006693號小冊子)。
在瓶型細胞培養(yǎng)裝置中加入起始培養(yǎng)基，在其中按照2xl05細胞 /mL加入上述CHO細胞株，于37。C、 10% C02的條件下開始培養(yǎng)。培養(yǎng) 期間，在整個14天，pH下限為7. 0，進行溶解氧濃度40%的自動控制。 從培養(yǎng)第3天開始以一定流速一定流速(向1L起始培養(yǎng)基，1. Og/小時) 流加流加培養(yǎng)基，培養(yǎng)到第14天。在培養(yǎng)開始時和第3、 5、 7、 10、 12、 14天時取樣。對于各樣品的培養(yǎng)上清，通過采用蛋白質(zhì)A的親和 層析測定產(chǎn)生的抗體濃度，通過臺盼藍染色法測定存活率，通過固定 化酶法測定乳酸。如圖l所示，使用絲氨酸、半胱氨酸、酪氨酸不增 量的流加培養(yǎng)基進行流加培養(yǎng)(對照)時，在l4天的培養(yǎng)中，抗體濃度 為1.6 g/L左右。與之相對，使用高濃度絲氨酸、半胱氨酸、酪氨酸 增量的低pH流加培養(yǎng)基進行流加培養(yǎng)(Ser, Cys， Tyr)時，在l4天的培 養(yǎng)中，如果抗體濃度為2.2 g/L左右，則可以獲得約40 %的高抗體濃 度。圖2中表示了培養(yǎng)期間存活率的變化。此外，如圖3所示，乳酸 濃度在培養(yǎng)第3天后，使用高濃度絲氨酸、半胱氨酸、酪氨酸增量的 低pH流加培養(yǎng)基的流加培養(yǎng)時低乳酸濃度，相對于使用絲氨酸、半胱 氨酸、酪氨酸不增量的流加培養(yǎng)基的流加培養(yǎng)時的變化。
〔實施例2〕用含有高濃度絲氨酸、半胱氨酸、酪氨酸的低pH流 加培養(yǎng)基進行的流加培養(yǎng)(導入了抗體基因和倉鼠'?；撬徂D(zhuǎn)運蛋白基 因的CHO細胞林)
培養(yǎng)基組成和制備方法如下。
起始培養(yǎng)基將市售的動物細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基溶解后過濾滅菌。 流加培養(yǎng)基起始培養(yǎng)基中使用的動物細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基以相對 于起始培養(yǎng)基3倍濃度溶解后，加入絲氨酸SOmM、半胱氨酸鹽酸鹽一 水合物1. 8mM、酪氨酸14. 5mM，用鹽酸降低pH直至培養(yǎng)基成分全部溶
22解(pHl. 5附近)，確認培養(yǎng)基成分全部溶解后，過濾滅菌。
細胞導入了?；撬徂D(zhuǎn)運蛋白基因的人源化IgG產(chǎn)生CH0細胞抹。 在瓶型細胞培養(yǎng)裝置中加入起始培養(yǎng)基，在其中按照2 x105細胞 /mL加入上述CH0細胞林，于37。C、 10% C02的條件下開始培養(yǎng)。培養(yǎng) 期間，在整個14天，pH下限為7.0，進行溶解氧濃度40%的自動控制。 從培養(yǎng)第3天開始以一定流速(向IL起始培養(yǎng)基，I. 5g/小時)流加流 加培養(yǎng)基，培養(yǎng)到第14天。在培養(yǎng)開始時和第3、 5、 7、 10、 12、 14 天時取樣。對于各樣品的培養(yǎng)上清，通過采用蛋白質(zhì)A的親和層析測 定產(chǎn)生的抗體濃度，通過臺盼藍染色法測定存活率，通過固定化酶法 測定乳酸。如圖4所示，使用絲氨酸、半胱氨酸、酪氨酸不增量的流 加培養(yǎng)基進行流加培養(yǎng)(對照)時，在14天的培養(yǎng)中，抗體濃度為1.3 g/L左右。與之相對，使用高濃度絲氨酸、半胱氨酸、酪氨酸增量的 低pH流加培養(yǎng)基進行流加培養(yǎng)(Ser,Cys，Tyr)時，在14天的培養(yǎng)中， 如果抗體濃度為2. 0 g/L左右，則可以獲得約54 %的高抗體濃度。如 圖5所示，使用絲氨酸、半胱氨酸、酪氨酸不增量的流加培養(yǎng)基進行 流加培養(yǎng)時，在14天的培養(yǎng)中第14天的存活率為52 %。與之相對， 使用高濃度絲氨酸、半胱氨酸、酪氨酸增量的低pH流加培養(yǎng)基進行流 加培養(yǎng)時，在14天的培養(yǎng)時，第14天的存活率可以維持78 %這樣高 的存活率。此外，如圖6所示，乳酸濃度在培養(yǎng)第3天后，使用高濃 度絲氨酸、半胱氨酸、酪氨酸增量的低pH流加培養(yǎng)基的流加培養(yǎng)時低 乳酸濃度相對于使用絲氨酸、半胱氨酸、酪氨酸不增量的流加培養(yǎng)基 進行流加培養(yǎng)時的變化。
〔實施例3〕為了確認高濃度絲氨酸、半胱氨酸、酪氨酸對抗體 高產(chǎn)化的作用而進行的流加培養(yǎng)(導入了抗體基因和倉鼠'?；撬徂D(zhuǎn)運 蛋白基因的CHO細胞林)
培養(yǎng)基組成和制備方法如下。
起始培養(yǎng)基:將市售的動物細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基溶解后過濾滅菌。 流加培養(yǎng)基(Ser， Cys， Tyr):起始培養(yǎng)基中使用的動物細胞培養(yǎng) 用培養(yǎng)基以相對于起始培養(yǎng)基3倍濃度溶解后，加入絲氨酸50mM、半胱氨酸鹽酸鹽一水合物1. 8mM、酪氨酸14. 5mM，用鹽酸降低pH直至培 養(yǎng)基成分全部溶解(pHl. 5附近)，確認培養(yǎng)基成分全部溶解后，過濾 滅菌。
流加培養(yǎng)基(Ser，Cys):起始培養(yǎng)基中使用的動物細胞培養(yǎng)用培 養(yǎng)基以相對于起始培養(yǎng)基3倍濃度溶解后，加入絲氨酸50mM、半胱氨 酸鹽酸鹽一水合物1. 8mM、酪氨酸14. 5mM，用鹽酸降低pH直至培養(yǎng)基 成分全部溶解(pHl. O附近)，確認培養(yǎng)基成分全部溶解后，過濾滅菌。
流加培養(yǎng)基(Ser，Tyr):起始培養(yǎng)基中使用的動物細胞培養(yǎng)用培 養(yǎng)基以相對于起始培養(yǎng)基3倍濃度溶解后，加入絲氨酸50mM、酪氨酸 14. 5mM,用鹽酸降低pH直至培養(yǎng)基成分全部溶解(pH1.0附近)，確認
培養(yǎng)基成分全部溶解后，過濾滅菌。
流加培養(yǎng)基(Cys，Tyr):起始培養(yǎng)基中使用的動物細胞培養(yǎng)用培 養(yǎng)基以相對于起始培養(yǎng)基3倍濃度溶解后，加入半胱氨酸鹽酸鹽一水 和物1. 8mM、酪氨酸14. 5mM，用鹽酸降低pH直至培養(yǎng)基成分全部溶解 (pHl. O附近)，確認培養(yǎng)基成分全部溶解后，過濾滅菌。
細胞導入了牛磺酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的人源化IgG產(chǎn)生CHO細胞抹。 在瓶型細胞培養(yǎng)裝置中加入起始培養(yǎng)基，在其中按照2 x105細胞 /mL加入上述CHO細胞林，于37。C、 10% C02的條件下開始培養(yǎng)。培養(yǎng) 期間，在整個14天，pH下限為7.0，進行溶解氧濃度40%的自動控制。 從培養(yǎng)第3天開始以一定流速(向IL起始培養(yǎng)基，I. 5g/小時)流加流 加培養(yǎng)基，培養(yǎng)到第14天。在培養(yǎng)開始時和第3、 5、 7、 10、 12、 14 天時取樣。對于各樣品的培養(yǎng)上清，通過采用蛋白質(zhì)A的親和層析測 定產(chǎn)生的抗體濃度，通過采用離子交換柱的氨基酸分析測定絲氨酸和 酪氨酸的氨基酸濃度。如圖7所示，采用絲氨酸、半胱氨酸、酪氨酸 不增量的流加培養(yǎng)基進行流加培養(yǎng)(對照)時，在14天的培養(yǎng)中，抗體 濃度為1.16g/L左右。與之相對，使用高濃度絲氨酸、半胱氨酸、酪 氨酸增量的低pH流加培養(yǎng)基進行流加培養(yǎng)(Ser，Cys，Tyr)時，在14 天的培養(yǎng)中抗體濃度為1.87g/L，使用高濃度絲氨酸、半胱氨酸增量 的低pH流加培養(yǎng)基進行的流加培養(yǎng)(Ser，Cys)時，在l4天的培養(yǎng)中抗
24培養(yǎng)中，可以獲得抗體濃度為1. 18 g/L 的抗體濃度測定結(jié)果。因此，這提示按照高濃度絲氨酸、半胱氨酸、 酪氨酸的順序，對抗體高產(chǎn)化作出貢獻。而且，還提示同時在流加培 養(yǎng)基中添加高濃度絲氨酸、半胱氨酸、酪氨酸，對抗體高產(chǎn)化貢獻最 大。
圖8、圖9表示14天的培養(yǎng)期中絲氨酸和酪氨酸的濃度變化。對 照組中在培養(yǎng)第5天時，絲氨酸為0. 63mM和酪氨酸為0. MmM，培養(yǎng) 第7天以后絲氨酸為0. 4mM以下和酪氨酸為0. 4爐以下，在使用補充 了絲氨酸的流加培養(yǎng)基進行的培養(yǎng)中，絲氨酸的濃度為2mM以上、使 用補充了酪氨酸的流加培養(yǎng)基進行的培養(yǎng)中酪氨酸的濃度維持在lmM 以上。
在以下的參考例中，記載了上述實施例2和3中使用的導入了牛 磺酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的人源化IgG產(chǎn)生CH0細胞林的制作。
〔參考例1〕 CHO細胞來源的倉鼠.牛磺酸轉(zhuǎn)運蛋白基因克隆
從CH0 DXB11細胞中導入了抗IL-6受體抗體基因的抗IL-6受體 抗體產(chǎn)生細胞(特開平8-99902號公報)中提取總RNA后，合成依賴于 聚A的cDM。以用Sall、 Xhol、 EcoRI這三種限制性酶片段化的cDNA 作為模板，通過PCR獲得倉鼠'?；撬徂D(zhuǎn)運蛋白(倉鼠TauT)基因。PCR 引物采用設計成5， ，3，含有已知在大鼠/小鼠TauT間保守的基因序 列的引物?？寺〉幕?，測定堿基序列，根據(jù)與已知生物種的TauT的 同源性，確認編碼倉鼠TauT (圖10)。倉鼠TauT氨基酸序列與小鼠(96。/。 同一性)、大鼠(96%同一性)、人(93%同一性)TauT具有高同源性， 預料其是具有12個跨膜區(qū)域的轉(zhuǎn)運蛋白(圖11)。
〔參考例2〕導入了倉鼠'?；撬徂D(zhuǎn)運蛋白基因的CHO細胞林的
構建
在參考例1的通過克隆獲得的倉鼠TauT(以下TauT)基因中加入 25Kozak序列，構建出CMV啟動子表達質(zhì)粒pHyg/TauT(圖12)。通過電 穿孔法在親本林抗Glypican-3抗體產(chǎn)生CH0細胞(參照國際公開第WO 2006/006693號小冊子)中導入除去了 pHyg/TauT或TauT基因的對照 質(zhì)粒pHyg。在潮霉素(400jig/ml)存在下選擇表達質(zhì)粒導入細胞，所 有穩(wěn)定增殖的細胞抹擴大(pHyg/TauT: 8抹，pHyg: 7林)。制備TauT mRNA后，通過TaqMan法，能夠確認相對于親本抹有顯著表達的7林 為pHyg/TauT導入細胞。導入細胞(7林)的mRNA平均表達量是對照的 (7林)的約40倍。
<序列號1>序列號l表示編碼牛磺酸轉(zhuǎn)運蛋白的基因的堿基序列。 <序列號2>序列號2表示牛磺酸轉(zhuǎn)運蛋白的氨基酸序列。
權利要求
1、細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于在通過培養(yǎng)產(chǎn)生所希望的蛋白質(zhì)的細胞制造該蛋白質(zhì)時，至少在細胞的增殖期開始時以后的一定時間內(nèi)，培養(yǎng)液中的絲氨酸的濃度在1mM以上。
2、 根據(jù)權利要求1所述的方法，其還至少在細胞的增殖期開始時以后的一定時間內(nèi)，培養(yǎng)液中的酪氨酸的濃度在lmM以上，和/或半胱氨酸的濃度在起始培養(yǎng)基的濃度以上或0. 4mM以上。
3、 動物細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基，其含有l(wèi)mM以上的絲氨酸或其鹽。
4、 權利要求3所述的動物細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基，其還至少含有l(wèi)fflM以上的酪氨酸、和/或0. 4mM以上的半胱氨酸。
5、 一種所希望的蛋白質(zhì)的制造方法，其特征在于使用權利要求3或4所述的動物細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基，通過培養(yǎng)產(chǎn)生所希望的蛋白質(zhì)的細胞制造該蛋白質(zhì)。
6、 細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于在培養(yǎng)產(chǎn)生所希望的蛋白質(zhì)的細胞制造該蛋白質(zhì)時，至少在培養(yǎng)的細胞能夠充分增殖時或產(chǎn)生的所希望的蛋白質(zhì)能夠充分產(chǎn)生的時間內(nèi)的一部分或所有時間內(nèi)培養(yǎng)液中絲氨酸的濃度在lraM以上。
7、 根據(jù)權利要求6所述的方法，其還至少在培養(yǎng)的細胞能夠充分增殖時或產(chǎn)生的所希望的蛋白質(zhì)能夠充分產(chǎn)生的時間內(nèi)的一部分或所有時間內(nèi)，培養(yǎng)液中酪氨酸的濃度在lmM以上，和/或半胱氨酸的濃度在起始培養(yǎng)基的濃度以上或0. 4mM以上。
8、 細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于在通過培養(yǎng)產(chǎn)生所希望的蛋白質(zhì)的細胞制造該蛋白質(zhì)時，至少在細胞的對數(shù)增殖期的一部分或全部時間內(nèi)，培養(yǎng)液中絲氨酸的濃度在lmM以上。
9、 根據(jù)權利要求8所述的方法，其還至少在細胞的對數(shù)增殖期的一部分或全部時間內(nèi)，培養(yǎng)液中的酪氨酸濃度在lmM以上，和/或半胱氨酸濃度在起始培養(yǎng)基的濃度以上或0. 4mM以上。
10、 根據(jù)權利要求8或9所述的方法，其至少在細胞的對數(shù)增殖期的一部分或全部時間內(nèi)培養(yǎng)液中絲氨酸濃度在2mM以上。
11、 細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于在通過培養(yǎng)產(chǎn)生所希望的蛋白 質(zhì)的細胞制造該蛋白質(zhì)時，至少在培養(yǎng)第3~ 10天的一部分和全部時 間內(nèi)，培養(yǎng)液中的絲氨酸濃度在lmM以上。
12、 根據(jù)權利要求11所述的方法，其還至少在培養(yǎng)第3~ IO天的 一部分和全部時間內(nèi)，培養(yǎng)液中的酪氨酸濃度在lmM以上，和/或半胱 氨酸的濃度在起始培養(yǎng)基的濃度以上或0. 4mM以上。
13、 根據(jù)權利要求11或12所述的方法，至少在培養(yǎng)第3~10天 的一部分和全部時間內(nèi)培養(yǎng)液中的絲氨酸的濃度在2mM以上。
14、 根據(jù)權利要求l、 2、 5~ 13任一項所述的方法，其通過分批 培養(yǎng)法(batch culture)、重復分批培養(yǎng)法(repeated batch culture)、 ;充力口培養(yǎng)法(fed—batch culture)、 或重復^危力口培養(yǎng)法(repeated fed-batch culture)、 連續(xù)培養(yǎng)法(continuous culture)、灌流培養(yǎng) 法(perfusion culture)培養(yǎng)細胞。
15、 權利要求l、 2、 5~ 13任一項所述的方法，其通過流加培養(yǎng) 法培養(yǎng)細胞。
16、 ；f又利要求15所述的方法，其通過逐次多次和連續(xù)流加向培養(yǎng)液提供絲氨酸和酪氨酸和/或半胱氨酸。
17、 權利要求l、 2、 5~16任一項所述的方法，所述細胞導入了編碼所希望的蛋白質(zhì)的基因。
18、 權利要求17所述的方法，所述所希望的蛋白質(zhì)是抗體。
19、 權利要求l、 2、 5~18任一項所述的方法，所述細胞是哺乳 動物細胞。
20、 權利要求19所述的方法，所述哺乳動物細胞是CHO細胞。
21、 含有濃度為10mM~ 1000mM的絲氨酸的細胞培養(yǎng)用流加培養(yǎng)基。
22 、含有濃度為2OmM ~ 5OOmM的絲氨酸的細胞培養(yǎng)用流加培養(yǎng)基。
23、根據(jù)權利要求21或22所述的流加培養(yǎng)基，其還添加了半胱 氨酸和/或酪氨酸。
24、 根據(jù)權利要求21或22所述的流加培養(yǎng)基，其還添加了半胱 氨酸和酪氨酸。
25、 一種通過流加培養(yǎng)法培養(yǎng)細胞的方法，其特征在于添加權利 要求21 ~ 24任一項所述的流加培養(yǎng)基。
26、 一種蛋白質(zhì)的制造方法，其特征在于在通過培養(yǎng)細胞制造所 希望的蛋白質(zhì)的方法中，使用權利要求l、 2、 6~20任一項所述的方 法進行培養(yǎng)。
27、 一種藥物的制造方法，其以用權利要求5或26所述的制造方 法制造的蛋白質(zhì)作為有效成分。
全文摘要
提供一種用于通過培養(yǎng)生產(chǎn)所希望的蛋白質(zhì)的細胞制造該蛋白質(zhì)的新的培養(yǎng)方法，該方法采用極力排除生物來源的培養(yǎng)基成分的培養(yǎng)基。也就是說，提供一種特征在于將培養(yǎng)液中特定的氨基酸維持在高濃度進行培養(yǎng)的培養(yǎng)方法以及該方法中使用的細胞培養(yǎng)用流加培養(yǎng)基。
文檔編號C12N5/10GK101663391SQ200880013018
公開日2010年3月3日 申請日期2008年4月25日 優(yōu)先權日2007年4月26日
發(fā)明者定光信, 小平邦彥, 岸下升平, 松田廣記, 片山聰, 高木良智 申請人:中外制藥株式會社