專利名稱：：用于定量測定小而密ldl的試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于測定小而密脂蛋白(LDL)中膽固醇的試劑，這對于動脈硬化的診斷是重要的。
背景技術(shù)：
：低密度脂蛋白(LDL)在血液中的膽固醇運輸中起主要作用并且是動脈硬化的危險因素。已知小而密的脂蛋白(小而密LDL(小顆粒低密度脂蛋白))，其在LDL中粒度特別小，與標準LDL相比，其比重更高，具有以高于標準LDL幾倍的水平引發(fā)動脈硬化的能力。小而密LDL的增加是動脈硬化的主要危險因素之一，因此在臨床上對該小而密LDL進行分級測定是很非常重要的。用于小而密LDL的常規(guī)測量的方法的例子包括超速離心方法、電泳方法、以及使用高效液相色譜的方法。然而，由于這些方法需要昂貴的i殳備和大量的測量時間，因此并不方^更。一種利用自動分析儀測量小而密LDL的方法例子是以下方法(參見曰本專利7>布(Kokai)號2003-28882A),該方法涉及利用在離子強度方面的差異，將小而密LDL混合并懸浮或溶解，然后利用在吸光度方面的差異測量小而密LDL。然而，根據(jù)該方法，在吸光度方面差異是基于濁度進行測量的，因此特異性和準確度不足。此外，已知一種方法(參見WO2004/053500)，該方法涉及通過使用分離劑的組合(其包括聚陰離子和二價陽離子以及適合于自動分析儀的試劑)來測量小而密LDL中的膽固醇或甘油三酸酯。該方法能夠比超速離心方法或電泳方法更方便地測量小而密LDL中的脂質(zhì)成分。此外，該方法的特異性和準確度極好，但是該方法需要預(yù)處理試樣并需要將小而密LDL從除這種LDL之外的LDL中分離出來的步驟。本發(fā)明公開本發(fā)明要達到的目的本發(fā)明的一個目的是提供一種用于無需預(yù)處理試樣的分級測量小而密LDL的試劑，其適用于迅速而方便的自動分析儀。達到該目的的方法作為追求該目的而集中研究的結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當利用膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶或膽固醇脫氬酶測量含各種脂蛋白的試樣中的膽固醇時，酶和小而密LDL的反應(yīng)速率與該相同的酶和除小而密LDL之外的脂蛋白的反應(yīng)速率相比能夠^fe改變。這種改變是通過以特定濃度使用特定表面活性劑來達到的，所以除小而密LDL之外的脂蛋白能夠被導(dǎo)向反應(yīng)系統(tǒng)之外。當具有特定濃度的表面活性劑被用于自動分析儀的試劑的第一步中時，與小而密LDL的酶反應(yīng)速率被降低，并且小而密LDL與酶之間的反應(yīng)被延遲了。同時，上述具有特定濃度的特定表面活性劑作用于除小而密LDL之外的脂蛋白，所以導(dǎo)致該脂蛋白與酶反應(yīng)并因此能夠?qū)⑵鋵?dǎo)向反應(yīng)系統(tǒng)之外。本發(fā)明人此外還已發(fā)現(xiàn)酶與除小而密LDL之外的脂蛋白的反應(yīng)速率增力口，同時膽固醇酯酶與小而密LDL的反應(yīng)速率被降低了，并且酶反應(yīng)由于指定酶的濃度而被延遲了。通過在如上所述第一步中將除小而密LDL之外的脂蛋白導(dǎo)向反應(yīng)系統(tǒng)之夕卜，然后在第二步中使剩余的小而密LDL與酶反應(yīng)，本發(fā)明人已經(jīng)在測量小而密LDL中的膽固醇方面取得了成功，因此本發(fā)明人已經(jīng)完成了本發(fā)明。本發(fā)明如下所述。一種用于定量測定試樣中小而密LDL中膽固醇的方法，該方法包括第一步在膽固醇酯酶和0.05g/L-1.0g/L的表面活性劑(該表面活性劑作用于除小而密LDL外的脂蛋白)的存在下消除試樣中除小而密LDL之外的脂蛋白；以及第二步定量測定在第一步之后剩余的小而密LDL中的膽固醇。根據(jù)[l]所述的用于定量測定小而密LDL中膽固醇的方法，其中在第一步中，作用于除小而密LDL之外的脂蛋白的表面活性劑是一種選自以下的非離子型表面活性劑聚氧化乙烯烷基醚、聚氧化乙烯烷基苯基醚、聚氧化乙烯烷基胺和烷氧基化月桂醇；一種選自以下的陰離子型表面活性劑聚氧化乙烯烷基醚硫酸鹽、烷基硫酸鹽、酰胺醚硫酸鹽、烷基牛磺酸鹽和磷酸鹽型表面活性劑；一種選自以下的陽離子型表面活性劑烷基曱基銨鹽、季銨鹽和單線性烷基型表面活性劑或選自以下的兩性表面活性劑月桂基甜菜堿、二甲基烷基甜菜堿、酰胺甜菜堿型表面活性劑、咪唑啉型表面活性劑，以及烷基二氨基乙基甘氨酸鈉。5[3]才艮據(jù)[1]或[2]所述的用于定量測定小而密LDL中膽固醇的方法，其中在第一步中采用的膽固醇酯酶的濃度范圍為0.6U/mL-3.0U/mL。根據(jù)[l]-[3]中任一項所述的用于定量測定小而密LDL中膽固醇的方法，其中在第一步中還添加膽固醇氧化酶和過氧化氫酶。根據(jù)[l]-[3]中任一項所述的用于定量測定小而密LDL中膽固醇的方法，其中在第一步中還添加膽固醇氧化酶和4-氨基安替比林。.-[5]中任一項所述的用于定量測定試樣中小而密LDL中膽固醇的方法，其中在第二步中在至少作用于小而密LDL的表面活性劑的存在下添加用于膽固醇測量的酶。根據(jù)[6]所述的用于定量測定小而密LDL中膽固醇的方法，其中在第二步中采用的至少作用于小而密LDL的表面活性劑是作用于所有脂蛋白的表面活性劑。根據(jù)[6]或[7]所述的用于定量測定小而密LDL中膽固醇的方法，其中在第二步中采用的至少作用于小而密LDL的表面活性劑是聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物或其衍生物、或聚氧化烯衍生物。-[8]中任一項所述的用于定量測定小而密LDL中膽固醇的方法，其中在第二步中采用的至少作用于小而密LDL的表面活性劑是在脂蛋白脂肪酶的存在下^支^f吏用的?！N用于消除試樣中除小而密LDL之外的脂蛋白的試劑，其包括膽固醇酯酶和0.05g/L-1.0g/L的作用于除小而密LDL之外的脂蛋白的表面活性劑的組合。根據(jù)[10]所述的用于消除除小而密LDL之外的脂蛋白的試劑，其中所述膽固醇酯酶的濃度范圍為0.6U/mL-3.0U/mL。[12]—種用于定量測定小而密LDL的試劑，其包括膽固醇酯酶、0.05g/L-1.0g/L的作用于除小而密LDL之外的脂蛋白的表面活性劑以及聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物或其衍生物、或聚氧化烯衍生物的組合。[13]根據(jù)[12]所述的用于定量測定小而密LDL的試劑，其包括第一試劑組合物和第二試劑組合物，其中所述第一試劑組合物包括膽固醇酯酶和0.05g/L-1.0g/L的作用于除小而密LDL之外的脂蛋白的表面活性劑，并且所述的第二試劑組合物包括聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物或其衍生物、或聚氧化烯衍生物。本發(fā)明的效果通過將含有本發(fā)明的特定表面活性劑的試劑加入含有脂蛋白的試樣中，在沒有利用過濾器或離心過濾進行分離的情況下，能夠直接并且選擇性地測量脂蛋白中的小而密LDL。本說明書包括日本專利申請?zhí)?007-49533的說明書和/或附圖所7^開的部分或全部內(nèi)容，它是本申請的優(yōu)先權(quán)文件。附圖的簡要說明圖1示出了在實施例1中在第一試劑反應(yīng)中各脂蛋白的反應(yīng)性，使得在引起小而密LDL選擇性地作用之前，在除小而密LDL之外的脂蛋白中的膽固醇^皮導(dǎo)向反應(yīng)系統(tǒng)之外，以便定量測定小而密LDL的膽固醇。圖2示出了在第一步中小而密LDL和大LDL關(guān)于表面活性劑濃度的反應(yīng)性。圖3示出了當膽固醇酯酶的活性變化時，大顆粒LDL和小而密LDL的反應(yīng)性。實施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明將祐J羊細i兌明如下?？蓪⒅鞍状致苑旨墳閂LDL、LDL和HDL。進一步將LDL分級為小而密LDL及其它亞級分。小而密LDL也被稱為小顆粒LDL、SLDL(小LDL)、致密性LDL、或sdLDL。除它們之外的LDL也可一皮稱為LLDL(大LDL)或輕LDL。根據(jù)粒度或比重，可將這些級分與亞級分區(qū)別開。VLDL的粒度(或粒徑)范圍為30nm-80nm(30nm-75nm),LDL的粒度(或粒徑)范圍為22nm-28nm(19nm-30nm)，而HDL的粒度(或粒徑)范圍為7nm-10nm，雖然該數(shù)字可隨研究人員的變4匕而變化。VLDL的比重為1.006或更小，LDL的比重范圍為1.019-1.063,而HDL比重范圍為1.063-1.21。LDL顆粒的直徑可通過梯度IO交電泳(GGE)(JAMA,260,p.1917-21,1988)或NMR(脂蛋白測試手冊，第二版，編者NaderRifai等人，HANDBOOKOFLIPOPROTEINTESTINGsecondEdition,EditedbyNaderRifaietal.p.609-623,AACCPRESS:TheFatsofLifeSummer2002,LVDD15YEARANNIVERSARYISSUE,VolumeAVINo.3,p.15-16)進行測量。比重可根據(jù)超速離心法分析進行測量(Atherosclerosis,106,p.241-253,1994:Atherosclerosis,83,p.59,1990)。由本發(fā)明方法測量的小而密LDL通常是LDL級分中直徑范圍約為22.0nm-25.5nm和比重范圍為1.040-1.063的亞級分。為什么要基于粒度對LDL進行亞分級的原因是LDL中的小LDL需要分級測量，因為這種具有小粒度的LDL具有引發(fā)動脈硬化的嚴重傾向并且比其它LDL具有特別更高程度的惡性。LDL的直徑和比重分布是連續(xù)的。因此，不可能清楚地確定比重為前述水平或更高的LDL導(dǎo)致了特別高程度的惡性。因此，范圍為1.040-1.063的比重不是構(gòu)成小而密LDL的確定特征，然而卻是通過將范圍為1.019-1.063的比重在中心點處分開而得到的值，這是一種已經(jīng)廣泛使用并且為大家所接受的方法。例如，在另一報告中，將小而密LDL在1.044-1.060的范圍內(nèi)分級(Atherosclerosis:106,241-253,1994)。關(guān)于如何設(shè)定小而密LDL的比重范圍，在研究人員中有一些不同。在所有情形中，當利用該比重范圍進行分級時，小而密LDL的存在與臨床惡性相關(guān)。在本發(fā)明中，術(shù)語"小而密LDL"是指在LDL中具有低的比重并且在臨床上具有比其它LDL更高的引發(fā)動脈硬化的傾向的LDL。優(yōu)選地，小而密LDL的比重高于在LDL的整個比重范圍內(nèi)的中心點。更優(yōu)選地，小而密LDL的比重在1.040-1.063范圍內(nèi)。本發(fā)明的方法通常在自動分析儀內(nèi)進行。在本發(fā)明方法的第一步中，使作用于除小而密LDL之外的LDL(以下也可稱為大LDL或LLDL)或其它脂蛋白例如VLDL和HDL的表面活性劑在膽固醇酯酶的存在下作用于試樣，由此由于從脂蛋白釋放出來而產(chǎn)生的膽周醇與在以下酶例如膽固醇氧化酶和膽固醇脫氳酶的存在下正在和膽固醇反應(yīng)的酶反應(yīng)，以將反應(yīng)產(chǎn)物導(dǎo)向反應(yīng)系統(tǒng)之外。這里，短語"作用于...的表面活性劑，，是指表面活性劑使脂蛋白降級以致脂蛋白中的膽固醇被釋放出來。在"作用于除小而密LDL之外的脂蛋白的表面活性劑"的情形中，不要求該表面活性劑從不作用于小而密LDL,但要求其主要作用于除小而密LDL的脂蛋白。例如，作用于除小而密LDL之外的脂蛋白的表面活性劑對小而密LDL的影響低于其對除小而密LDL之外的脂蛋白的影響。在第一步中與除小而密LDL之外的LDL(以下稱為大LDL)或其8它脂蛋白例如VLDL和HDL反應(yīng)的表面活性劑的例子包括非離子型表面活性劑例如聚氧化乙烯烷基醚、聚氧化乙烯烷基苯基醚、聚氧化乙烯烷基胺和烷氧基化月桂醇；陰離子型表面活性劑例如聚氧化乙烯烷基醚硫酸鹽、烷基硫酸鹽、酰胺醚硫酸鹽、烷基?；撬猁}和磷酸鹽類表面活性劑；陽離子型表面活性劑例如烷基甲基銨鹽、季銨鹽和單線性烷基型表面活性劑以及兩性表面活性劑例如月桂基甜菜堿、二曱基烷基甜菜堿；酰胺甜菜堿型表面活性劑、咪唑啉型表面活性劑，以及烷基二氨基乙基甘氨酸鈉。以上表面活性劑的具體例子包括非離子型表面活性劑例如EMULGEN120、EMULGEN920、EMULGENB-66和EMULGENA-90(Kao公司)，以及NONIONHS-220、NONIONHS-215、NONIONK-230、NONIONNS-220、NON腿NS國230、NYMEENF-215、NYMEENL-207和ADEKATOLLB-1520(ADEKA公司)，陰離子型表面活性劑例如EMAL20CM、EMAL20T、EMALE27C和LEVENOLWX(Kao公司),以及SUNAMIDECF-3、SUNAMIDECF國10、DIAPONK、DIAPONF、DIAPONK-SF、PERSOFTEF、PERSOFTEFT、PERSOFTEL、PERSOFTEP、PERSOFTEK、PERSOFTSL、POLYSTAROMP、ADEKACOLPS-440E和TRAXK-40(ADEKA公司)，陽離子型表面活性劑例如QUARTAMIN24P(Kao公司)、ADEKAMINEMAC-30(ADEKA公司),以及兩性表面活性劑例如AMPHITOL24B(Kao公司)、NISSANANONLG、NISSANANONBDF-R、NISSANANONBF、NISSANANONBL、NISSANANONBL-SF和NISSANANONGLM-R-LV。當使用濃度在特定范圍內(nèi)的該表面活性劑時，其選擇性地作用于除小而密LDL之外的脂蛋白，以便抑制膽固醇酯酶對小而密LDL中的膽固醇的作用。指定用于將小而密LDL與其它脂蛋白區(qū)分開和用于除小而密LDL之外的脂蛋白的選擇性反應(yīng)的以上表面活性劑的濃度是有效的。在第一步中，以上表面活性劑的濃度優(yōu)選范圍為0.05g/L-1.0g/L,更優(yōu)選范圍為0.1g/L-0.8g/L,以及進一步優(yōu)選范圍為0.3g/L-0.6g/L。當在第一步中該表面活性劑的濃度為1.5g/L或更大時，該表面活性劑作用于小而密LDL,以致難于將小而密LDL與除小而密LDL之外的脂蛋白區(qū)分開。使在第一步中由于表面活性劑的作用和與膽固醇酯酶反應(yīng)而產(chǎn)生的脂蛋白中的膽固醇與膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶等在該酶的存在下反應(yīng)。然后能夠?qū)⒃撃懝檀紝?dǎo)向該反應(yīng)系統(tǒng)之外。在本發(fā)明中，短語"導(dǎo)向反應(yīng)系統(tǒng)之夕卜，，是指HDL、VLDL、大LDL等等中含有的膽固醇被消除、聚集或抑制以避免其在隨后的步驟中反應(yīng)，例如為了防止HDL、VLDL、大LDL等等中含有的該膽固醇影響小而密LDL膽固醇的定量測定。通過將大LDL或其它脂蛋白如VLDL和HDL中的膽固醇導(dǎo)向反應(yīng)系統(tǒng)之外，小而密LDL單獨保留在隨后的步驟中。在本發(fā)明中，將除小而密LDL之外的脂蛋白導(dǎo)向反應(yīng)系統(tǒng)之外以便防止在隨后步驟中檢測到除小而密LDL之外的脂蛋白中的膽固醇的這種程序也可被描述為"將小而密LDL與除小而密LDL之外的脂蛋白區(qū)分開"。在本發(fā)明中，術(shù)語"消除"是指使試樣中的物質(zhì)降解，然后防止降解產(chǎn)物在隨后的步驟中被檢測到。即，短語"在第一步中消除試樣中除小而密LDL之外的脂蛋白，，是指使試樣中的除小而密LDL之外的脂蛋白降解，然后防止降解產(chǎn)物即來自除小而密LDL之外的脂蛋白的膽固醇在隨后的第二步中^皮檢測到。清除方法的例子包括(但不限于)以下方法一種包括利用過氧化氬酶使過氧化氫(通過使膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶發(fā)生作用來產(chǎn)生)降解成水和氧的方法和一種涉及利用過氧化物酶使氫給體與過氧化氫反應(yīng)的方法，以進行轉(zhuǎn)化成為無色醌。此外，通過指定在上述表面活性劑的存在下的膽固醇酯酶濃度可選擇性地消除除小而密LDL之外的脂蛋白。由于在第一步中試劑中含有的膽固醇酯酶濃度增加，特別大LDL(在LDL之中)與酶的反應(yīng)性-提高，反應(yīng)產(chǎn)物一皮導(dǎo)向反應(yīng)系統(tǒng)之外；然而，小而密LDL與酶的反應(yīng)性并未提高。當該濃度進一步增加時，小而密LDL與酶的反應(yīng)性提高。因此，采用一定濃度的膽固醇酯酶，使大LDL對于該酶的反應(yīng)性提高并且小而密LDL對于該酶的反應(yīng)性降低，使得選擇性測量小而密LDL成為可能。因此，通過指定膽固醇酯酶的濃度，能夠更有選擇性地測量小而密LDL。在第一步中，反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)膽固醇酯酶濃度的優(yōu)選范圍為0.6U/mL-3.0U/mL,更優(yōu)選范圍為0.9U/mL-2.4U/mL,特別優(yōu)選范圍為1.2U/mL-1.5U/mL。對于本發(fā)明中所采用的膽固醇酯酶沒有特別的限制，只要它是可水解膽固醇酯的酶。動物或微生物衍生的膽固醇酯酶能夠被采用。對于在此使用的膽固醇氧化酶沒有特別的限制，只要它是能夠?qū)⒛懝檀佳趸拿?。動物或微生物衍生的膽固醇氧化酶是能夠采用的。膽固醇氧化酶濃度的?yōu)選范圍為0.01U/mL-20U/mL,并且特別優(yōu)選范圍為0.1U/mL-1U/mL。對于在此使用的膽固醇脫氬酶沒有特別的限制，只要它是能夠?qū)⒛懝檀佳趸?吏氧化型輔酶減少的酶。動物或樣i生物衍生的膽固醇脫氫酶能夠被采用。膽固醇脫氫酶濃度的優(yōu)選范圍為0.01U/mL-200U/mL,并且特別優(yōu)選范圍為0.1U/mL-100U/mL。另外，為了調(diào)節(jié)對于各種脂蛋白的作用，在第一步中也可任意地將脂蛋白酶加入反應(yīng)溶液中。作為這種脂蛋白酶，可采用磷脂酶或脂蛋白脂肪酶。作為磷脂酶，可采用磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D、溶血磷脂酶等等，其濃度優(yōu)選范圍為0.01U/mL-10U/mL,更優(yōu)選范圍為0.01U/mLto5U/mL，并且特別優(yōu)選范圍為0.01U/mL-1U/mL。對于將要在此使用的脂蛋白脂肪酶沒有特別的限制，只要它是能夠使脂蛋白降解的酶。動物或微生物衍生的脂蛋白脂肪酶是能夠采用的。在此使用的這種脂蛋白脂肪酶濃度的優(yōu)選范圍為0.01U/mL-10U/mL,更優(yōu)選范圍為0.01U/mL-5U/mL,并且特別優(yōu)選范圍為O.lU/mL-1U/mL。在本發(fā)明的第二步中，在第一步中定量測定了未反應(yīng)的小而密LDL中的膽固醇量。為了定量測定第一步中殘留的未反應(yīng)的小而密LDL中的膽固醇，可采用用于定量測定的常^見方法。該方法的例子包括以下方法一種涉及添加LDL湊是結(jié)劑并然后通過比濁測定來定量測定由此形成的LDL-特異性聚集體含量的方法、一種包括具有LDL-特異性抗體的抗原抗體反應(yīng)的方法以及一種包括利用酶定量測定降解產(chǎn)物的方法。在這些方法中，此處優(yōu)選的方法涉及加入用于膽固醇測量的酶，例如膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶或膽固醇脫氬酶并且然后定量測定反應(yīng)產(chǎn)物。將至少作用于小而密LDL的表面活性劑用于小而密LDL中的膽固醇的定量測定中。至少作用于小而密LDL的這種表面活性劑可以是只作用于小而密LDL的表面活性劑、也作用于除小而密LDL之外的其它脂蛋白的表面活性劑、或者作用于所有脂蛋白的表面活性劑。作為與小而密LDL反應(yīng)的表面活性劑，可適當?shù)夭捎镁垩趸蚁?聚氧化丙烯共聚物或其衍生物。聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物或其衍生物的例子包4舌基于Pluromc(商標)的表面活性劑(例如BASF和ADEKA公司)例如Pluronic17R陽4、PluromcL-64、PluromcPE3100、PluronicP誦85、PluronicF-88、PluronicP-103和PluronicF-127。作為作用于所有脂蛋白的表面活性劑，可采用任何表面活性劑，只要其是用于所有膽固醇測量的試劑等中所采用的。該表面活性劑的優(yōu)選實例是HLB值為11或更大并且小于13,優(yōu)選為12或更大并且小于13的聚氧化烯衍生物。此外，與除小而密LDL之外的LDL(此后稱為大LDL)或其它脂蛋白如VLDL和HDL反應(yīng)的表面活性劑可以在給定濃度或更高濃度，例如1.5g/L或更高下#皮<吏用。在第二步中所采用的表面活性劑濃度優(yōu)選范圍為約0.1g/L-100g/L,并且更優(yōu)選范圍為約1g/L-50g/L。當采用膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶作為用于膽固醇測量的酶(與膽固醇反應(yīng))時，由酶反應(yīng)而產(chǎn)生過氧化氫。通過利用在過氧化物酶的存在下氫給體與氫受體的偶合反應(yīng)所形成的染料(有色醌)在400-700nm波長下測量可定量測定由此產(chǎn)生的過氧化氫。作為氫供體化合物，優(yōu)選苯胺衍生物。該苯胺衍生物的實例包括N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)-3,5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(3-磺基丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羥基-3-磺基丙基)-3,5-二曱氧基苯胺(HDAOS)、N-(3-磺基丙基)苯胺(HALPS)和N-(3-磺基丙基)-3-曱氧基-5-苯胺(HMMPS)。在此所采用的該氬給體濃度優(yōu)選最終濃度范圍為0.1mmol/L-1.5mmol/L。作為氫受體，可采用4-氨基安替比林、曱基苯并噻唑酮腙等等。當采用膽固醇酯酶和膽固醇脫氪酶作為用于膽固醇測量的酶時，通過酶反應(yīng)由NAD(P)產(chǎn)生NAD(P)H,可通過在330nm-400nm處測量吸光度來定量測定由此產(chǎn)生的NAD(P)H。在本發(fā)明中，單價陽離子和/或二價陽離子或其鹽可以被用作離子強度調(diào)節(jié)劑。添加該離子強度調(diào)節(jié)劑可促進小而密LDL與大LDL的區(qū)分。具體地，可采用氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、二氯化錳、氯化鈣、氯化鋰、氯化銨、硫酸鎂、硫酸鉀、硫酸鋰、硫酸銨、醋酸鎂等等。在此所釆用的濃度范圍為0mmol/L-100mmol/L。進行該反應(yīng)的溫度范圍優(yōu)選為2°C-45°C,更優(yōu)選為25°C-40°C。進4亍該反應(yīng)的時間優(yōu)選為1-30分鐘，更優(yōu)選為3-15分鐘。血清和血漿可以被用作本發(fā)明的試樣，但其例子不限于此。本發(fā)明采用的自動分析儀的例子包括TBA-120FR.200FR(Toshiba)、JCA-BM1250.1650.2250(JEOL有限公司)、HITACHI7180.7700(Hitachi)和AU2700(OLYMPUS)。當實施本發(fā)明的測量方法時，可將在此所采用的試劑分成多種試劑組合物。本發(fā)明所采用試劑的例子包括與除小而密LDL之外的LDL或其它脂蛋白如VLDL和HDL反應(yīng)的表面活性劑，聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物或其衍生物，用于膽固醇測量的酶，例如膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶，表面活性劑，降解過氧化氫的過氧化氫酶，用于通過偶合反應(yīng)由過氧化氬形成染料的過氧化物酶，氫給體，以及緩沖劑?？紤]到試劑的穩(wěn)定性等，適當?shù)貙⑦@些試劑分成不同的試劑組合物。例如，將各試劑分成兩種組合物第一試劑組合物和第二試劑組合物。第一試劑組合物可包括與除小而密LDL之外的LDL或其它脂蛋白如VLDL和HDL反應(yīng)的表面活性劑、用于膽固醇測量的酶，例如月旦固醇酯酶和膽固醇氧化酶等等，而第二試劑組合物可包括與小而密LDL反應(yīng)的表面活性劑或與所有脂蛋白反應(yīng)的表面活性劑，例如聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物或其衍生物，用于提高用于膽固醇測量的這種酶的活性的表面活性劑，等等。第二試劑組合物還可包括磷脂酶或脂蛋白脂肪酶。當采用這兩種試劑組合物時，將笫一試劑組合物加入試樣中，緊接著反應(yīng)1-IO分鐘，并且優(yōu)選為約5分鐘，然后加入第二試劑組合物，緊接著反應(yīng)1-10分鐘，并且優(yōu)選為約5分鐘，可定量測定由此形成的染料。在這種情形中，第一步包括加入第一試劑組合物以使除小而密LDL之外的LDL(以下稱為大LDL)或其它脂蛋白如VLDL和HDL作用于表面活性劑，用于與酶的反應(yīng)。第二步包括加入第二試劑組合物以使小而密LDL作用于表面活性劑，用于與酶的反應(yīng)，然后測量小而密LDL中的膽固醇。實施例下面將參考以下實施例來詳細描述本發(fā)明，雖然本發(fā)明并不限于此。制備具有以下組成的第一試劑組合物，作為含有作用于除小而密LDL之外的脂蛋白的表面活性劑的試劑例子。第一試劑組合物PIPES緩沖液(pH7.0)50mmol/L膽固醇酯酶0.6U/mL膽固醇氧化酶0.5U/mL聚氧化乙烯-聯(lián)苯乙烯苯基醚EMULGENA-900.3g/L牛血清白蛋白0.5%TOOS2,0mmol/L4-氨基安替比林4.0mmol/L過氧化物酶12.0unit/mL在以上試劑組合物中，EMULGENA-90(聚氧化乙烯-聯(lián)苯乙烯苯基醚)是作用于除小而密LDL之外的脂蛋白的表面活性劑。在該實施例中，為了揭示除小而密LDL之外的脂蛋白中的膽固醇被導(dǎo)向反應(yīng)系統(tǒng)之外，該反應(yīng)系統(tǒng)用于利用第一試劑組合物來進4亍定量測定，將用于形成醌染料所需的組分例如顯色底物、TOOS和4-氨基安替比林以及過氧化物酶加入第一試劑組合物中，然后測量吸光度。因此，在該實施例中，在本發(fā)明測量方法的第一步中小而密LDL試劑的反應(yīng)狀態(tài)^皮i正實了。將第一試劑(300mL)加入乳糜微粒-IDL級分、小而密LDL級分、除小而密LDL之外的LDL級分和HDL級分中每一種的4)iL試樣中，每一種具有100mg/dL的通過超速離心方法分離的膽固醇含量，然后在37。C反應(yīng)5分鐘。在各時間點測量吸光度(反應(yīng)時間過程)。圖1顯示了結(jié)果。如圖1中所示，在該實施例中，由于表面活性劑的作用，反應(yīng)組合物在反應(yīng)溶液中在第一個5分鐘內(nèi)對乳糜微粒-IDL級分、除小而密LDL之外的LDL(大LDL)級分和HDL級分表現(xiàn)出高反應(yīng)性，但是對于小而密LDL表現(xiàn)出低反應(yīng)性。當對小而密LDL膽固醇進行定量測定時，在第一步(該步驟是選擇性地作用于小而密LDL的反應(yīng)的初始步驟)中，通過將表面活性劑(在該實施例中所采用的)和與膽固醇反應(yīng)的酶等一起使用，使除小而密LDL之外的脂蛋白預(yù)先與酶反應(yīng)，這使得消除膽固醇并將其導(dǎo)向反應(yīng)系統(tǒng)之外成為可能。[實施例2]制備了第一和第二試劑組合物，每一種在第一試劑組合物中含有作用于除小而密LDL之外的脂蛋白的表面活性劑，并且具有如下所示的組成。第一試劑組合物_<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>在第一試劑組合物中，表面活性劑聚氧化乙烯千基苯基醚作用于除小而密LDL之外的脂蛋白。證實了是否以0g/L-1.2g/L的濃度范圍使用的聚氧化乙烯苯曱基苯基醚在各濃度下作用于小而密LDL。此外，在第二試劑組合物中，所含有的濃度高達10g/L的聚氧化乙烯烷基苯基醚對小而密LDL起作用。將第一試劑組合物(300mL)加入通過超速離心法分離的膽固醇含量為100mg/dL的小而密LDL級分或大LDL級分中，緊接著在37。C反應(yīng)5分鐘(第一步)。在第一步之后，加入100)LiL的第二試劑組合物，然后反應(yīng)5分鐘(第二步)，然后在600nm測量吸光度。采用LDL-EXN"SEIKEN"作為與小而密LDL和大LDL兩者反應(yīng)的對照試劑。圖2顯示了結(jié)果。當加入低濃度的表面活性劑時(圖2),所得的小而密LDL的吸光度高于大LDL的吸光度。隨著表面活性劑濃度的增大，大LDL的吸光所吸收的大LDL量之間的差值減小。該結(jié)果提示，當表面活性劑的濃度低時，在第一步中除小而密LDL之外的脂蛋白被導(dǎo)向反應(yīng)系統(tǒng)之外，允許對小而密LDL進行精確測量。如實施例l中所述，當在本發(fā)明方法的第一步中采用低濃度的表面活性劑時，大LDL被選擇性地消除并然后被導(dǎo)向反應(yīng)系統(tǒng)之外，但小而密LDL不是這樣。當表面活性劑的濃度增大時，被消除的大LDL量減少直至其等量于小而密LDL。結(jié)果，通過在第一步中采用濃度優(yōu)選范圍為0.05g/L-0.9g/L、更優(yōu)選范圍為0.3g/L-0.6g/L的表面活性劑，能夠選擇性地測量小而密LDL中的膽固醇。[實施例3]制備了第一和第二試劑組合物，在第一試劑組合物中含有作用于除小而密LDL之外的脂蛋白的各種表面活性劑，并且具有如下所示的組成。第一試劑組合物PIPES緩沖液(pH7.0)50mmol/L膽固醇酯酶[AsahiKasei公司]1.2U/mL膽固醇氧化酶[Toyobo]0.5U/mL過氧化氬酶600U/mL各種表面活性劑0.3g/Lor0.6g/L牛血清白蛋白1.0%TOOS2.0mmol/L二試劑組合物PIPES緩沖液(pH7.0)50mmol/L聚氧化乙烯烷基苯基醚10g/L4-氨基安替比林4.0mmol/L過氧化物酶4.0umt/mL疊氮化鈉0.05%將第一試劑組合物(300|uL)加入通過超速離心法分離的膽固醇含量為100mg/dL的小而密LDL級分或大LDL級分中，緊接著在37。C反應(yīng)5分鐘(第一步)。在第一步后，加入100|LiL的第二試劑組合物，然后反應(yīng)5分鐘(第二步)，然后在600nm處測量吸光度。采用LDL-EXN"SEIKEN"作為與小而密LDL和大LDL兩者反應(yīng)的對照試劑。第一試劑組合物中含有的各種表面活性劑和結(jié)果被示于表1中。當在第一步中表面活性劑特異性地作用于大LDL并然后^^導(dǎo)向反應(yīng)系統(tǒng)之外時，如表l所示，大LDL的吸光度減小。此外，當在第一步中表面活性劑對小而密LDL不起作用時，如表1所示，小而密LDL的吸光度增大。如表l中所示，在該實施例中所采用的表面活性劑在第一步中特異性地作用于大LDL,將大LDL導(dǎo)向反應(yīng)系統(tǒng)之外，使得小而密LDL被選擇性地測量。表1顯示了當采用各種表面活性劑時，對于小而密LDL或大LDL的反應(yīng)性。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>[實施例4]制備了將要使其作用于脂蛋白的具有不同膽固醇酯酶活性(酶濃度)的以下試劑組合物，。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>將第一試劑(300mL)加入通過超速離心法分離的膽固醇含量為100mg/dL的小而密LDL級分或大LDL級分中每一種的4|iiL試樣中，然后在37。C反應(yīng)5分鐘(第一步)。反應(yīng)后，加入100iliL的第二試劑，然后反應(yīng)5分鐘(第二步)，然后在600nm處測量吸光度。圖3顯示了結(jié)果。如圖3中所示，隨著試劑中膽固醇酯酶活性的增加，大LDL的吸光度首先減小，然而，當試劑中膽固醇酯酶的活性進一步增加時，小而密LDL的吸光度隨后減小，因此，通過指定適當?shù)哪懝檀减ッ笣舛?，能夠有效地測量小而密LDL中的膽固醇。在第一步中采用濃度優(yōu)選范圍為0.6U/mL-3.0U/mL,更優(yōu)選范圍為0.9U/mL-2.4U/mL,以及還更優(yōu)選范圍為0.9U/mL-1.5U/mL的膽固醇酯酶，能夠選擇性地測量小而密LDL中的膽固醇。在此引用的所有出版物和專利申請以其全部通過參考文獻被引入。權(quán)利要求1.一種用于定量測定試樣中小而密LDL中膽固醇的方法，該方法包括第一步在膽固醇酯酶和0.05g/L-1.0g/L的表面活性劑的存在下消除試樣中除小而密LDL之外的脂蛋白，所述表面活性劑作用于除小而密LDL之外的脂蛋白；以及第二步定量測定在第一步之后剩余的小而密LDL中的膽固醇。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于定量測定小而密LDL中膽固醇的方法，其中在第一步中，作用于除小而密LDL之外的脂蛋白的表面活性劑是一種選自以下的非離子型表面活性劑聚氧化乙烯烷基醚、聚氧化乙烯烷基苯基醚、聚氧化乙烯烷基胺和烷氧基化月桂醇；一種選自以下的陰離子型表面活性劑聚氧化乙烯烷基醚硫酸鹽、烷基硫酸鹽、酰胺醚硫酸鹽、烷基牛磺酸鹽和磷酸鹽型表面活性劑；一種選自以下的陽離子型表面活性劑烷基曱基銨鹽、季銨鹽和單線性烷基型表面活性劑或選自以下的兩性表面活性劑月桂基甜菜堿、二曱基烷基甜菜堿、酰胺甜菜堿型表面活性劑、咪唑啉型表面活性劑以及烷基二氨基乙基甘氨酸鈉。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于定量測定小而密LDL中膽固醇的方法，其中在第一步中采用的膽固醇酯酶的濃度范圍為0.6U/mL-3.0U/mL。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的用于定量測定小而密LDL中膽固醇的方法，其中在第一步中還添加膽固醇氧化酶和過氧化氫酶。5.根據(jù)權(quán)利要求1_3中任一項所述的用于定量測定小而密LDL中膽固醇的方法，其中在第一步中還添加膽固醇氧化酶和4氨基安替比林。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的用于定量測定試樣中小而密LDL中膽固醇的方法，其中在第二步中在至少作用于小而密LDL的表面活性劑的存在下添加用于膽固醇測量的酶。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于定量測定小而密LDL中膽固醇的方法，其中在第二步中采用的至少作用于小而密LDL的表面活性劑是作用于所有脂蛋白的表面活性劑。8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的用于定量測定小而密LDL中膽固醇的方法，其中在第二步中釆用的至少作用于小而密LDL的表面活性劑是聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物或其衍生物、或聚氧化烯衍生物。9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項所述的用于定量測定小而密LDL中膽固醇的方法，其中在第二步中采用的至少作用于小而密LDL的表面活性劑是在脂蛋白脂肪酶的存在下被使用的。10.—種用于消除試樣中除小而密LDL之外的脂蛋白的試劑，其包括膽固醇酯酶和0.05g/L-l.Og/L的作用于除小而密LDL之外的脂蛋白的表面活性劑的組合。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用于消除除小而密LDL之外的脂蛋白的試劑，其中所述膽固醇酯酶的濃度范圍為0.6U/mL-3.0U/mL。12.—種用于定量測定小而密LDL的試劑，其包括膽固醇酯酶、0.05g/L-l.Og/L的作用于除小而密LDL之外的脂蛋白的表面活性劑以及聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物或其衍生物、或聚氧化烯衍生物的組合。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用于定量測定小而密LDL的試劑，其包括第一試劑組合物和第二試劑組合物，其中所述的第一試劑組合物包括膽固醇酯酶和0.05g/L-l.Og/L的作用于除小而密LDL之外的脂蛋白的表面活性劑，并且所述的第二試劑組合物包括聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物或其衍生物、或聚氧化烯衍生物。全文摘要提供了一種用于無需預(yù)處理試樣的分級測量小而密LDL的試劑，其適用于迅速而方便的自動分析儀。還提供了一種用于定量測定試樣中小而密LDL中膽固醇的方法，該方法包括第一步在膽固醇酯酶和0.05g/L-1.0g/L表面活性劑的存在下消除試樣中除小而密LDL之外的脂蛋白，所述表面活性劑作用于除小而密LDL之外的脂蛋白；以及第二步定量測定在第一步之后剩余的小而密LDL中的膽固醇。文檔編號C12Q1/44GK101663404SQ20088001308公開日2010年3月3日申請日期2008年2月28日優(yōu)先權(quán)日2007年2月28日發(fā)明者伊藤康樹申請人:電化生研株式會社