專利名稱：：純化茶氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及純化氨基酸茶氨酸的方法。
背景技術(shù)：
：能夠增強(qiáng)人體精神和身體方面的食物和飲料產(chǎn)品逐漸受到歡迎。特別地，能夠增強(qiáng)精神敏銳狀態(tài)的產(chǎn)品尤其具有商業(yè)價值。茶氨酸是一種在植物界中僅在茶葉(茶樹(Came〃/GW"e朋^))中被發(fā)現(xiàn)的氨基酸。已發(fā)現(xiàn)茶氨酸具有多種對人體和精神有益的效果。例如，據(jù)報道茶氨酸刺激哺乳動物大腦的a-波，使得個體在放松的情況下還能保持靈敏的精神狀態(tài)。在特定的劑量水平下，這些生理效果尤其明顯。例如，國際專利申請PCT/EP2005/012464(UnileverPLC等)描述了包含特定水平的茶氨酸和咖啡因的可食用的組合物，其顯示出使得服用該組合物的個體的專注度、精神集中和/或靈敏性明顯改善。盡管茶葉中相對富含茶氨酸，事實(shí)上，茶氨酸僅占茶樹材料中可提取的茶固體的大約2%重量。因此，已經(jīng)研發(fā)出合成的茶氨酸(例如TaiyoKagaku生產(chǎn)的Suntheanine)來滿足對于具有增強(qiáng)的茶氨酸水平的產(chǎn)品的日益增長的需求。但是，現(xiàn)代的消費(fèi)者特別喜歡天然健康的飲料，這已經(jīng)成為了現(xiàn)代健康生活方式的一部分。茶特別符合這種觀念，尤其是考慮到其天然抗氧化劑的含量。因此，需要提供在不添加合成化合物的情況下濃縮天然存在的茶氨酸的方法。在為了實(shí)現(xiàn)這種需求的嘗試中，已經(jīng)發(fā)展了使用膜過濾來濃縮茶提取物中的茶氨酸的方法。例如，國際專利申請PCT/EP2005/010376公開了提供富含茶氨酸的茶提取物的方法，包括以下步驟使用冷水提取茶樹材料，然后對提取物進(jìn)行納米過濾步驟。該方法產(chǎn)生了包含富含茶氨酸的茶固體的透過液(permeate)。但是我們發(fā)現(xiàn)，即使是這樣的透過液也包含相當(dāng)大量的雜質(zhì)。特別地，例如糖類和氨基酸的雜質(zhì)被證明難于從透過液中去除，這是由于它們在物理化學(xué)性質(zhì)上與茶氨酸相似。此外，一些雜質(zhì)的存在使得常規(guī)的透過液的常規(guī)干燥(例如噴霧干燥)變得特別困難。美國專利申請公布US2005/0084544(Procter&GambleCo.Inc.)描述了將茶提取物與吸收多酚材料的材料相接觸的方法。這個方法產(chǎn)生的富含茶氨酸的提取物基本上不含多酚。但是，在這種情況下，提取物中仍然存在許多需要通過進(jìn)一步的過濾步驟來去除的雜質(zhì)。美國專利5,922,380(ItoEnLtd.)公開了將茶提取物與陽離子交換樹脂相接觸的方法，該陽離子交換樹脂與鉀離子通過離子鍵合。該方法的目的在于從茶提取物中去除二價金屬離子，同時保留對茶的香味有貢獻(xiàn)的其它組分。因此，該方法包括在唯一的分離機(jī)制為陽離子交換的條件下使提取物流過由樹脂裝填的柱子。因此，US5,922,380中的方法將不會使得茶氨酸與非多價金屬離子的任何雜質(zhì)分離開。因此，我們認(rèn)識到需要提供一種從包含雜質(zhì)(包括一些中性和/或陰離子雜質(zhì))的混合物中純化茶氨酸的簡單的方法。我們還認(rèn)識到需要提供一種不需要使用合成化合物和/或有機(jī)溶劑的這樣的方法。定義雜質(zhì)此處所使用的術(shù)語"雜質(zhì)，，是指除茶氨酸或水以外的物質(zhì)。主要陽離子溶液中的主要陽離子是指比溶液中其它任何陽離子的摩爾濃度高的溶液中存在的陽離子。富含雜質(zhì)的帶富含雜質(zhì)的帶是指一種色譜帶，其中，雜質(zhì)的濃度(表示為帶中總5固體的百分比)比此方法剛開始時水溶液中雜質(zhì)的濃度(表示為水溶液中總固體的百分比)高。富含茶氨酸的帶富含茶氨酸的帶是指一種色譜帶，其中，茶氨酸的濃度(表示為帶中總固體的百分比)比此方法剛開始時水溶液中茶氨酸的濃度(表示為水溶液中總固體的百分比)高。茶提取物此處所使用的術(shù)語"茶提取物，，是指來自中國茶(Came〃/aW"e"^svar.wwe服s)和/或普珥茶(Came〃/aWwe艦'5var.tm^w/ca)的葉和/或莖的干物質(zhì)。葉和/或莖可以經(jīng)過了所謂的"發(fā)酵"步驟，其中，它們被某些在生產(chǎn)"紅茶"的早期階段釋放的內(nèi)源性酶氧化。該氧化甚至還可以通過外源性酶(例如氧化酶、漆酶和過氧化物酶)的作用進(jìn)行補(bǔ)充?？蛇x地，茶葉可以是經(jīng)過部分發(fā)酵的("烏龍"茶)或者基本上不發(fā)酵的("綠茶")。色諶術(shù)語術(shù)語"流動相"、"柱子"、"柱體積，，、"洗脫"和"帶(zone)，，為《CompendiumofAnalyticalNomenclature:DefinitiveRules1997》IUPAC第三版第九章中定義的標(biāo)準(zhǔn)色譜術(shù)語。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種從含有主要陽離子并包含雜質(zhì)的水溶液中純化茶氨酸的方法，該方法包括以下步驟a.將2-20%柱體積(Ve)的量(Va)的所述水溶液添加到柱上，其中，該柱子由陽離子交換樹脂裝填，所述陽離子交換樹脂具有與所述主要陽離子相同的陽離子；然后b.將pH為2.5至8.5的水性流動相添加到柱上，以先洗脫富含雜質(zhì)6的帶，再洗脫富含茶氨酸的帶；然后c.回收所述富含茶氨酸帶的至少一個洗脫份(fraction);然后d.任選地濃縮和/或干燥所述富含茶氨酸帶的至少一個洗脫份。按照描述進(jìn)行該方法的操作確保了主要的分離機(jī)理為離子排斥分離機(jī)理，并使得茶氨酸和雜質(zhì)分離在實(shí)質(zhì)上不同的帶中。具體實(shí)施例方式用于純化茶氨酸的水溶液包含雜質(zhì)。雜質(zhì)可以包括陽離子、陰離子、中性分子或其混合物。典型地，雜質(zhì)將包括糖類、氨基酸或其混合物。糖類可以為單糖、二糖、寡糖、多糖或其混合物。雜質(zhì)還可以另外地或可選地包含多酚、咖啡因或其混合物。茶氨酸優(yōu)選來自天然來源。最優(yōu)選的茶氨酸來源為茶葉。因此，在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，水溶液為茶的水提取物。特別優(yōu)選的是，茶提取物為紅茶提取物?？梢酝ㄟ^使用水直接提取茶葉來提供茶的水提取物。可選地，茶的水提取物在提取之后可以經(jīng)過一個或更多個純化和/或濃縮步驟。例如，茶提取物可以使用PCT/EP2005/010376中的方法進(jìn)行納米過濾，在此引入PCT/EP2005/010376作為參考。所述水溶液將包含一種或多種陽離子。在大多數(shù)情況下(特別是如果水溶液是茶的水提取物)，主要陽離子是鉀(K+)。優(yōu)選地，所述水溶液基本上不含多價陽離子。多價陽離子很難從樹脂上去除，因此污染了柱子，使得樹脂的壽命變短。因此，所述水溶液優(yōu)選包含多于溶液中陽離子的80%重量的單價陽離子，更優(yōu)選多于90%，最優(yōu)選為95%至99.99%。因?yàn)樘砑拥街系乃芤旱牧肯鄬^小，所述溶液優(yōu)選包含高固體含量，以使分離效率最大化，并使待去除的水的量最小化-如果步驟c之后需要干燥洗脫份的話。因此，水溶液包含的總固體含量優(yōu)選為溶液的至少2%重量，更優(yōu)選為至少5%,最優(yōu)選為至少10%。但是，固體含量不應(yīng)該太高，否則樣品會變得太粘，以及/或者在分離過程中，可能會產(chǎn)生不溶物形成的問題。因此，固體含量優(yōu)選小于溶液的50%重量，更優(yōu)選小于40%,最優(yōu)選小于30%。為了使茶氨酸的產(chǎn)率最大化，總固體包含的茶氨酸的量優(yōu)選為固體的至少1%重量，更優(yōu)選為至少2%，更優(yōu)選為至少4%,最優(yōu)選為至少6%。典型地，總固體包含小于固體的80%重量的茶氨酸。該方法特別適于從水溶液中純化茶氨酸，其中，總固體包含小于總固體的60%重量或者甚至小于40%的茶氨酸。為了確保分離機(jī)理為離子排斥分離機(jī)理，茶氨酸在接近其pl的pH下洗脫。因此水溶液的pH范圍優(yōu)選為2.5至8.5，更優(yōu)選為3.5至7.5,更優(yōu)選為4至7，最優(yōu)選為5至6。尤其重要的是，如果流動相不是緩沖的，溶液的pH在這些范圍內(nèi)。將2-20%柱體積(VJ的量(Va)的所述水溶液添加到柱上。這確保了水溶液僅占柱子的一小部分，因此使得在洗脫時茶氨酸和雜質(zhì)分離開。但是，該量也不應(yīng)該太小，否則會損害該方法的效率。Va優(yōu)選為Vc的3-15M,更優(yōu)選為5_10%。柱子由具有與主要陽離子相同陽離子的陽離子交換樹脂裝填。通常這意味著樹脂為鉀(K+)形式。合適的樹脂包括那些包含用于陽離子交換的官能團(tuán)的樹脂，該官能團(tuán)例如磺酸基(-S03M)、磷酸基(-PO(OM)2)或羧基(-COOM);其中，M為主要陽離子。特別優(yōu)選的是包含磺酸基的樹脂，例如磺酸化聚苯乙烯樹脂。這樣的樹脂包括苯乙烯-二乙烯苯共聚物樹脂。合適的市售樹脂包括DiaionUBK系列，包括UBK530、UBK535、UBK550和OBK555(由MitsubishiKagakuCo.制造)。一旦添加水溶液到柱上之后，接著添加水性流動相來洗脫該溶液。為了將茶氨酸和雜質(zhì)進(jìn)行分離，需要流動相的組成不同于所述水溶液的組成。特別地，流動相應(yīng)該基本上不含茶氨酸。優(yōu)選地，流動相包含的茶氨酸應(yīng)該小于流動相的0.01%重量，更優(yōu)選小于0.001%,最優(yōu)選小于0.0001%。水性流動相的pH為2.5至8.5，以保證茶氨酸為中性形式。流動相的pH優(yōu)選為3.5至7.5，更優(yōu)選為4至7,最優(yōu)選為5至6。如果水溶液是強(qiáng)酸性或堿性(例如pH在2.5至8.5的范圍之外)，那么可能需要流動相是緩沖的。在這種情況下，流動相將會包含緩沖鹽。例如，流動相可以包含磷酸鹽緩沖液。但是，優(yōu)選避免使用任何化學(xué)添加劑。因此，在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，流動相是基本上純的水。例如，流動相可以包含小于1000ppm的總固體，更優(yōu)選小于500ppm,最優(yōu)選為1ppm至100ppm。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，流動相為去離子水。流動相還優(yōu)選基本上不含多價陽離子。多價陽離子難于從樹脂上去除，因此污染了柱子，使得樹脂的壽命變短。因此，流動相包含的單價陽離子優(yōu)選多于流動相中陽離子的80%重量，更優(yōu)選多于90%，最優(yōu)選為95-99.99%。為了避免柱中形成可能干擾分離的空氣氣泡，在加到柱之前，流動相優(yōu)選經(jīng)過除氣處理?？梢允褂萌魏我阎某龤夥绞剑ǔ曁幚砘蚴褂盟蝗苄詺怏w(例如氮?dú)?進(jìn)行鼓泡處理。當(dāng)流動相沿著柱子向下流動時，中性的茶氨酸流動緩慢，以及/或者較弱地吸附在樹脂上，而其它不同大小和/或電荷的分子從樹脂上流出。因此，富含雜質(zhì)的帶在富含茶氨酸的帶之前形成。優(yōu)選在較高溫度下洗脫這些帶，以降低相對濃縮的帶的粘性對流速的影響。典型地，溫度的范圍為45至90。C，更優(yōu)選為55至80。C。使用高溫還降低了微生物污染柱子的危險。該方法的下一步涉及回收富含茶氨酸的帶的至少一個洗脫份。典型地，這是通過收集從柱上流出的洗脫液的份并保留那些包含顯著量的茶氨酸的洗脫份實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)收集多個洗脫份時，它們可以被集中在一起。通常棄去富含雜質(zhì)的帶的洗脫份。但是，如果這個帶富含有價值的雜質(zhì)，例如多酚類，那么該方法可以包括一個附加步驟來回收富含雜質(zhì)的帶的至少一個洗脫份。在c步驟中回收的富含茶氨酸的帶的至少一個洗脫份可以直接使用，無需進(jìn)一步處理。例如，它可被直接添加到食物或飲料產(chǎn)品中。特別地，由于高效的分離，在使用和/或干燥之前通常不需要進(jìn)一步純化洗9脫份，例如無需使用膜過濾步驟純化。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，所述富含茶氨酸帶的至少一個洗脫份被濃縮和/或干燥。這使得洗脫份可被長期穩(wěn)定地儲存。典型地，干燥洗脫份到濕度小于20%重量，更優(yōu)選小于10%和最優(yōu)選為1-7%的濕度。實(shí)施例實(shí)施例1該實(shí)施例顯示了從濃縮的茶的水提取物中純化茶氨酸。用水提取紅茶的碎混合茶末(Brokenmixedfarmings,BMF)。離心、納米過濾和干燥產(chǎn)生的提取物來產(chǎn)生茶提取物，其包含6wt。/。茶氨酸、16wt。/o單糖和二糖、15wt。/o灰分、6wty。多酚、6wt。/。茶氨酸以外的氨基酸和4wty?？Х纫?。然后將茶提取物重新溶于水中，使用5pm濾紙進(jìn)行過濾，產(chǎn)生的茶的水^提取物的總固體含量為20wt%和pH為4.85。使用的樹脂為K+形式的DiaionTMUBK550。這種樹脂為一種珠子形式的磺酸化聚苯乙烯聚合物，具有窄的大小分布，平均直徑為220pm。柱子半裝有除氣的去離子水。然后添加樹脂，使用熱水通過柱子循環(huán)30分鐘來調(diào)節(jié)樹脂水平。然后填裝柱子。這是通過兩次洗脫實(shí)現(xiàn)的，無需任何采樣或數(shù)據(jù)記錄，使用的流速為每小時4Vc。在注射產(chǎn)品然后再注射水之后，由于樹脂的膨脹和收縮造成了緊壓狀態(tài)。在兩次洗脫之后，通過調(diào)節(jié)柱塞來調(diào)節(jié)樹脂水平達(dá)到柱頂部。填裝的柱子的高度為113cm，直徑為1.5cm。因此柱體積(Vc)為200ml。柱子配有一個水套，并維持在60。C的溫度。炎承參W分岸將9ml(0.05Ve)量的茶提取物注射到柱上。然后以每分鐘5ml的速率(每小時1.5Ve)泵送流動相(除氣的去離子水)使其通過柱子。柱子的輸出端與一個分部收集器相連，每分鐘(相當(dāng)于每0.025Vc的洗脫產(chǎn)物)收集一個新鮮的洗脫份。分析每個洗脫份的總固體(使用Bellingham&StanleyRFM3000折射計的Brix測量儀)和茶氨酸(使用高效液相色譜法)含量。結(jié)果示于表l。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表l中的數(shù)據(jù)顯示，大部分的雜質(zhì)在前60%柱體積內(nèi)洗脫出來，而茶氨酸在此時才剛開始洗脫。與注射到柱上的茶的水提取物相比(基于干物質(zhì)，茶氨酸含量為6Wt%),這之后收集的洗脫份(洗脫份14之后)富含茶氨酸。權(quán)利要求1.一種從含有主要陽離子并包含雜質(zhì)的水溶液中純化茶氨酸的方法，該方法包括以下步驟a.將2-20％柱體積(Vc)量(Va)的所述水溶液添加到柱上，其中該柱子由陽離子交換樹脂裝填，所述陽離子交換樹脂具有與所述主要陽離子相同的陽離子；然后b.將pH為2.5至8.5的水性流動相添加到柱上，以先洗脫富含雜質(zhì)的帶，再洗脫富含茶氨酸的帶；然后c.回收所述富含茶氨酸帶的至少一個洗脫份。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述水溶液的總固體含量為該溶液的至少2%重量，優(yōu)選為至少5%,更優(yōu)選為至少10%。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述總固體包含茶氨酸的量至少為該固體的1%重量。4.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，所述雜質(zhì)包括糖類、氨基酸或其混合物。5.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，為4至7。6.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，%。7.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，子水。8.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，鉀(K+)。9.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，水提取物。10.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，包括以下附加步驟d.濃縮和/或干燥所述富含茶氨酸的帶的至少一個洗脫份。11.根據(jù)權(quán)利要求IO所述的方法，其中，所述至少一個洗脫份在步其中，所述流動相的pH其中，Va為Vc的3-15其中，所述流動相為去離其中，所述主要陽離子為其中，所述水溶液為茶的驟C和步驟d之間不經(jīng)過膜過濾。12.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，所述樹脂為磺酸化聚苯乙烯樹脂。全文摘要本發(fā)明提供了一種從含有主要陽離子并包含雜質(zhì)的水溶液中純化茶氨酸的方法。該方法包括步驟將2-20％柱體積的量的所述水溶液添加到柱上，其中，該柱子由陽離子交換樹脂裝填，所述陽離子交換樹脂具有與所述主要陽離子為相同的陽離子型的陽離子交換樹脂填裝；然后將pH為2.5至8.5的水性流動相添加到柱上，以先洗脫富含雜質(zhì)的帶，再洗脫富含茶氨酸的帶；然后回收所述富含茶氨酸帶的至少一個洗脫份。文檔編號A23F3/20GK101675030SQ200880014186公開日2010年3月17日申請日期2008年4月21日優(yōu)先權(quán)日2007年5月11日發(fā)明者S·X·博杜安申請人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司