專利名稱：：具有改善的噬菌體抗性的培養(yǎng)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了涉及調(diào)節(jié)細胞針對耙核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法和組合物。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了使用一個或多個cas基二i實施方^中，本發(fā)明提^了^開發(fā)和使用菌林組合及起子培養(yǎng)物輪換中使用的方法和組合物。在其它的實施方案中，本發(fā)明提供了用于標記和/或鑒定細菌的方法。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了使用CRISPR基因座確定噬菌體對細胞的潛在毒力和使用CRISPR-cay調(diào)整噬菌體的遺傳序列以提高毒力水平的方法。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了用于開發(fā)和使用噬菌體作為生物控制劑的方法和組合物。
背景技術(shù)：
：培養(yǎng)物并且尤其起子培養(yǎng)物廣泛地在食品工業(yè)中用于制造發(fā)酵產(chǎn)品，包括乳產(chǎn)品(例如酸奶、酪乳和干酪)、肉產(chǎn)品、焙烘產(chǎn)品、酒和蔬菜產(chǎn)品。培養(yǎng)物的制備是耗費工時的，占用大量空間和設(shè)備，并且在增殖步驟期間存在腐敗細菌和/或噬菌體污染的相當(dāng)大的風(fēng)險。因細菌噬菌體(噬菌體)感染和增殖所致的細菌培養(yǎng)失敗是伴隨工業(yè)使用細菌培養(yǎng)物的主要問題。存在眾多不同種類的噬菌體并且新毒抹持續(xù)出現(xiàn)。另外，需要用于追蹤此類培養(yǎng)物中所用的細菌的方法和組合物。實際上，盡管培養(yǎng)物開發(fā)取得*,還存在為工業(yè)用途改善培養(yǎng)物的持續(xù)需要。發(fā)明概述本發(fā)明提供了涉及調(diào)節(jié)細胞針對耙核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法和組合物。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了使用一個或多個c肪基二i實施方^中:本發(fā)明提4了i開發(fā);使用菌林組合及起子培養(yǎng)物輪換中使用的方法和組合物。在其它的實施方案中，本發(fā)明提供了用于標記和/或鑒定細菌的方法。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了使用CRISPR基因座確定噬菌體對細胞的潛在毒力和使用CRISPR-cm調(diào)整噬菌體的遺傳序列以提高毒力水平的方法。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了用于開發(fā)和使用噬菌體作為生物控制劑的方法和組合物。本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生至少一種噬菌體抗性變異菌株的方法，包括步驟(a)使包含CRISPR基因座的至少一部分的親代細菌菌林暴露于至少一種核酸序列以產(chǎn)生包含至少一種噬菌體抗性變異菌林的細菌混合物，其中所述的噬菌體抗性變異菌林包含經(jīng)修飾的CRISPR基因座；(b)從所述細菌混合物中選出噬菌體抗性變異菌林；(c)從步驟(b)中選出的噬菌體抗性菌抹中選擇在經(jīng)修飾的CRISPR基因座中包含額外核酸片段的噬菌體抗性變異菌林；和(d)分離至少一種噬菌體抗性變異菌林，其中所述菌林在經(jīng)修飾的CRISPR基因座中包含額外的核酸片段。在一些優(yōu)選的實施方案中，該方法還包括步驟比較親代細菌菌林的CRISPR基因座或其部分和噬菌體抗性變異菌林的經(jīng)修飾的CRISPR基因座，以鑒定在經(jīng)修飾的CRISPR基因座中包含從該親代細菌菌林的CRISPR基因座中缺少的至少一個額外核酸片段的噬菌體抗性變異菌林。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，該方法還包括選擇噬菌體抗性變異菌林的步驟，其中所述的噬菌體抗性變異菌株在經(jīng)修飾的CRISPR基因座中包含額外的核酸片段。在一些實施方案中，使親代細菌菌林暴露于兩種或多種核酸序列。在一些優(yōu)選的實施方案中，親代細菌菌株同時暴露于兩種或多種核,列，而在一些備選的實施方案中，使親代細菌菌林依次暴露于兩種或多種核酸序列。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，使親代細菌菌林通過由包含所述核酸序列的至少一種噬菌體感染而暴露于該核酸序列。在一些其他的優(yōu)選實施方案中，至少一種噬菌體選自由覆蓋噬菌體科(Corticoviridae)、嚢狀噬菌體科(Cystoviridae)、絲桿狀噬菌體科(Inoviridae)、光滑噬菌體科(Leviviridae)、孩t小噬菌體科(Microviridae)、肌尾嗟菌體科(Myoviridae)、短尾喧菌體科(Podoviridae)、長尾噬菌體科(Siphoviridae)和復(fù)層噬菌體科(Tectiviridae)組成的組。在一些額外的優(yōu)選實施方案，至少一種噬菌體是天然存在的噬菌體，而在其他優(yōu)選的實施方案中，所述至少一種噬菌體是使用噬菌體抗性細菌通過選擇壓力所獲得的突變噬菌體。在另外的其他優(yōu)選實施方案中，使所述親代細菌菌林通過天然的核酸攝取機制暴露于該核酸。在一些實施方案中，天然的核酸攝取機制包括天然感受態(tài)。在一些其它實施方案中，天然的核酸攝取機制通過接合或轉(zhuǎn)化親代細菌菌抹。仍在其他的實施方案中，噬菌體抗性菌林是噬菌體不敏感性突變體。又在其它的實施方案中，親代細菌菌林是噬菌體不敏感性突變體。在一些其他實施方案中，親代細菌菌抹的CRISPR基因座的5，端和/或3，端與所述噬菌體抗性變異菌林的經(jīng)修飾的CRISPR基因座比較。仍在一些其他實施方案中，親代細菌菌林的CRISPR基因座的至少第一CRISPR重復(fù)序列或至少第一CRISPR間隔區(qū)序列的5，端和/或3，端與噬菌體抗性變異菌林的經(jīng)修飾的CRISPR基因座比較。在進一步的實施方案中，噬菌體抗性變異菌林在經(jīng)修飾的CRISPR基因座中包含至少一個額外核酸片段。在一些其它實施方案中，親代細菌菌林的CRISPR基因座的至少一部分和噬菌體抗性變異菌林的經(jīng)修飾的CRISPR基因座的至少一部分通過擴增所述CRISPR基因座的至少一部分和經(jīng)修飾的CRISPR基因座的至少一部分進行比較，以產(chǎn)生擴增的CRISPR基因座序列和擴增的經(jīng)修飾的CRISPR基因座序列。在進一步的實施方案中，使用聚合酶鏈反應(yīng)開展擴增。在一些優(yōu)選的實施方案中，親代細菌菌林的CRISPR基因座的至少一部分和噬菌體抗性變異菌林的經(jīng)修飾的CRISPR基因座的至少一部分通過對所述CRISPR基因座的至少一部分和經(jīng)修飾的CRISPR基因座的至少一部分測序進行比較。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，該方法還包括步驟對擴增的CRISPR基因座序列和擴增的經(jīng)修飾的CRISPR序列基因座測序。在一些其它實施方案中，經(jīng)修飾的CRISPR基因座中的額外核酸片段是額外的重復(fù)序列-間隔區(qū)單元。在一些優(yōu)選的實施方案中，該額外的重復(fù)序列-間隔區(qū)單元包含至少約44個核苷酸。在一些備選的優(yōu)選實施方案中，額外的重復(fù)序列-間隔區(qū)單元包含約44個-約119個核苷酸。然而，不意圖使本發(fā)明限于這些具體的大小范圍，因為在本發(fā)明中使用了其他大小范圍，如本文中所述。在一些實施方案中，所述額外重復(fù)序列-間隔區(qū)單元包含與親代細菌菌林的CRISPR基因座中的CRISPR重復(fù)序列具有至少約95%同一性的至少一個核苷酸序列。在一些其他實施方案中，所述的額外重復(fù)序列-間隔區(qū)單元包含與至少一種噬菌體的基因組中的核苷酸序列具有至少約95%同一性的至少一個核苷酸序列。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，親代細菌菌林是工業(yè)用菌林。在一些其它實施方案中，親代細菌菌林易受至少一種噬菌體感染。在一些其他的優(yōu)選實施方案中，該親代細菌菌林包含選自起子培養(yǎng)物、益生培養(yǎng)物(probioticculture)和膳食^卜充培養(yǎng)物(dietarysupplementculture)的培養(yǎng)物。在一些優(yōu)選的實施方案中，該親代細菌菌林包含從培養(yǎng)物獲得的菌抹。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，該培養(yǎng)物是起子培養(yǎng)物、益生培養(yǎng)物和/或膳食補充培養(yǎng)物。在其它的實施方案中，親代細菌菌林選自埃希氏菌屬(五sc/^7'c/^0、志賀氏菌屬(5^/^//)、沙門氏菌屬(5^/附0^//")、歐文氏菌屬(五nW/wVi)、耶爾森氏菌屬(FemVi,'")、芽抱桿菌屬(jB""7/附)、弧菌屬(K幼Wo)、軍團菌屬(Z^g/owe//fl)、假單胞菌屬CPse"^附o/ifls)、奈瑟氏球菌屬(A^s^Wfl)、博德特氏菌屬08^&&//)、螺桿菌屬(^^//"&"^)、利斯特氏菌屬(ZisterZ")、農(nóng)桿菌屬(/4gfv6flcteriVi)、葡萄球菌屬(&"p//ococc附)、鏈球菌屬(5V"/i/ij^cocc"s)、腸球菌屬(五"tencocc附)、梭菌屬(0仍加7//"附)、棒桿菌屬(CWy"e^"er/wm)、分枝桿菌屬(Afj;cMflcfen'"附)、密螺旋體屬(7V印州e附")、疏螺旋體屬CBo/re/iVi)、弗朗西絲菌屬(Fmwci'w/to)、布魯氏菌屬(51"http://")、彎曲桿菌屬(CVwm/^/o6""w)、克雷伯氏菌屬(AfeAs/e/Zff)、弗蘭克氏菌屬CFmwWfl)、巴爾通氏體屬CB"fto"e/to)、立克次氏體屬(/ZcA:ete,Vi)、希瓦氏菌屬(5/^>^^//")、沙雷氏菌屬(Swmri")、腸桿菌屬(￡>^e/Y^""er)、變形菌屬(尸AY^附)、普羅威登斯菌屬(戶wW&""Vi)、索絲菌屬(5wc/io,/^/x)、雙歧桿菌屬(5,yM0^cteWww)、短桿菌屬(J"v幼"cten'"附)、丙酸4干菌屬(/Vop/o"幼fl"eri'M挑)、孚L球菌屬(丄tfctoc0cc"s)、孝(j軒菌屬(/""o6flfc,7/ws)、片球菌屬(尸ed/ococc"s1)、明串珠菌屬(丄ewcwiostoc)和酒球菌本發(fā)明也提供了使用本文中所述方法獲得的至少一種噬菌體抗性變異菌林。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了噬菌體抗性變異菌林，其中所述噬菌體抗性變異菌林是工業(yè)用菌林。在一些優(yōu)選的實施方案中，該噬菌體抗性變異菌抹包含工業(yè)用菌林，其中所述工業(yè)用菌抹是起子培養(yǎng)物、益生培養(yǎng)物、膳食補充培養(yǎng)物和/或其他有用培養(yǎng)物的至少一種組分。本發(fā)明也提供了組合物，該組合物包含使用本文中所迷方法產(chǎn)生的噬菌體抗性變異菌4朱。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了這樣的組合物，該組合物包含使用本文中所述方法產(chǎn)生的至少兩種噬菌體抗性變異菌林。本發(fā)明也提供了包含這些組合物中的至少一種組合物的食物和/或飼料。本發(fā)明也提供了用于制備食物和/或飼料的方法，所述方法包括添加這些組合物中的至少一種組合物至所述食物或飼料。本發(fā)明也提供了包含這些組合物中的至少一種組合物的起子培養(yǎng)物、益生培養(yǎng)物、膳食補充培養(yǎng)物和其他有用培養(yǎng)物。本發(fā)明也提供了發(fā)酵方法，所述方法包括添加這些組合物中的至少一種組合物至起子培養(yǎng)物。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了發(fā)酵方法，所述方法包括添加這些組合物中的至少一種組合物至發(fā)酵培養(yǎng)基，在這樣的條件下所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分的發(fā)酵發(fā)生了。在一些實施方案中，該發(fā)酵不受噬菌體的存在影響。在一些實施方案中，該發(fā)酵培養(yǎng)基是食品。在一些優(yōu)選的實施方案中，此食品是乳制品。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，該乳制品是乳。在一些其他實施方案中，使包含兩種或多種噬菌體抗性變異菌林的至少兩種不同組合物依次暴露于所述發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明也提供了用于減少發(fā)酵培養(yǎng)基中有害噬菌體群體的方法，所述方法包括使發(fā)酵培養(yǎng)基暴露于使用本文中所述方法產(chǎn)生的至少一種噬菌體抗性變異菌林，在這樣的條件下減少了所述噬菌體群體。本發(fā)明也提供了用于產(chǎn)生至少一種噬菌體抗性變異菌林的方法，包括步驟(a)使包含CRISPR基因座的至少一部分的親代細菌菌林暴露于至少一種核酸序列以產(chǎn)生包含至少一種噬菌體抗性變異菌^K的細菌混合物，其中所述的噬菌體抗性變異菌林包含經(jīng)修飾的CRISPR基因座；(b)從所述細菌混合物選擇噬菌體抗性變異菌株；(c)比較親代細菌菌抹的CRISPR基因座或其部分和噬菌體抗性變異菌林的經(jīng)修飾的CRISPR基因座，以鑒定在經(jīng)修飾的CRISPR基因座中包含在該親代細菌菌林的CRISPR基因座中缺少的至少一個額外核酸片段的噬菌體抗性變異菌林；(d)選擇在經(jīng)修飾的CRISPR基因座中包含額外核酸片段的噬菌體抗性變異菌林;(e)分析經(jīng)修飾的CRISPR基因座中的至少一個額外核酸片段，以鑒定至少一種噬菌體抗性變異菌4朱；和(f)分離所述至少一種噬菌體抗性變異菌林。本發(fā)明也提供了用于產(chǎn)生CRISPR逃逸噬菌體突變體(CRISPR-escapephagemutants)的方法，所述方法包才舌(a)獲得至少一種親代噬菌體和包含至少一個CRISPR基因座的噬菌體抗性細菌菌林，其中所述CRISPR基因座包含與至少一種親代噬菌體的基因組中的至少一個原型間隔區(qū)(protospacer)序列至少約95%同一的核酸序列；(b)-使所述至少一種親代噬菌體暴露于所述噬菌體抗性細菌菌抹，在這樣的條件下產(chǎn)生了至少一種噬菌體變體；和(c)選擇至少一種噬菌體變體，其中所述的至少一種噬菌體變體顯示感染該噬菌體抗性細菌菌林的能力并且是CRISPR逃逸噬菌體突變體。在一些實施方案中，該噬菌體抗性細菌菌株是使用本文中所述方法獲得的噬菌體抗性變異菌林。在一些實施方案中，該方法還包括步驟將該噬菌體變體中至少一個原型間隔區(qū)序列的至少一部分和位于所述至少一個原型間隔區(qū)序列附近的CRISPR基序與親代噬菌體的至少一個原型間隔區(qū)序列和CRISPR基序比較。又在其它的實施方案中，該方法還包括步驟選擇感染噬菌體抗性細菌菌林的變異噬菌體，其中所述的變異噬菌體包括CRISPR逃逸噬菌體突變體，并且其中該CRISPR逃逸噬菌體突變體在該CRISPR逃逸噬菌體突變體的至少一個原型間隔區(qū)序列中和/或CRISPR基序中包含至少一個突變。又在其它的實施方案中，所述方法使用CRISPR逃逸噬菌體突變體和包含至少一個CRISPR基因座的不同CRISPR噬菌體抗性細菌菌林反復(fù)重復(fù)進行一次或多次，其中所述14CRISPR基因座包含與該CRISPR逃逸噬菌體突變體的基因組中的至少一個原型間隔區(qū)序列至少約95%同一的核酸序列。仍在其它的實施方案中，至少一種噬菌體選自由覆蓋噬菌體科、嚢狀噬菌體科、絲桿狀噬菌體科、光滑噬菌體科、微小噬菌體科、肌尾噬菌體科、短尾噬菌體科、長尾噬菌體科和復(fù)層噬菌體科組成的組。在其它的實施方案中，親代細菌菌抹選自埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、歐文氏菌屬、耶爾森氏菌屬、芽孢桿菌屬、弧菌屬、軍團菌屬、假單胞菌屬、奈瑟氏球菌屬、博德特氏菌屬、螺桿菌屬、利斯特氏菌屬、農(nóng)桿菌、葡萄球菌屬、腸球菌屬、梭菌屬、彎曲桿菌屬、棒桿菌屬、分枝桿菌屬、密螺旋體屬、疏螺旋體屬、弗朗西絲菌屬、布魯氏菌屬、克雷伯氏菌屬、弗蘭克氏菌屬、巴爾通氏體屬、立克次氏體屬、希瓦氏菌屬、沙雷氏菌屬、腸桿菌屬、變形菌屬、普羅威登斯菌屬、索絲菌屬、雙歧桿菌屬、短桿菌屬、丙酸桿菌屬、乳球菌屬、乳桿菌屬、片球菌屬、明串珠菌屬、鏈球菌屬和酒球菌屬。本發(fā)明也提供了使用本文中所述方法獲得的CRISPR逃逸噬菌體突變體。在一些實施方案中，該CRISPR逃逸噬菌體突變體包含存在于至少兩個原型間隔區(qū)序列和/或在CRISPR基序中的兩個或多個突變。本發(fā)明也提供了CRISPR逃逸噬菌體突變體，其中所述CRISPR逃逸噬菌體突變體的基因組受到基因修飾以在至少一個原型間隔區(qū)和/或CRISPR基序中包含突變。在一些實施方案中，至少一個CRISPR基序在該CRISPR逃逸噬菌體突變體中是突變的，而在一些備選的實施方案中，至少一個CRISPR基序在CRISPR逃逸噬菌體突變體中是缺失的。本發(fā)明也提供了包含至少一種CRISPR逃逸噬菌體突變體的組合物。本發(fā)明也提供了用于控制產(chǎn)物中細菌種群的方法，所述方法包括使包含至少一種CRISPR逃逸噬菌體突變體的組合物暴露于發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有至少一個不希望的細菌種群，在這樣的條件下減少了所述的不希望的細菌種群的種群，并且該發(fā)酵培養(yǎng)基用來產(chǎn)生所述產(chǎn)物。在一些實施方案中，該產(chǎn)物選自食物、飼料、化妝品、個人護理產(chǎn)品、保健產(chǎn)品、獸醫(yī)產(chǎn)品和膳食補充劑。在一些其他實施方案中，該方法重復(fù)至少一次并且輪換使用不同的組合物和/或包含不同CRISPR逃逸噬菌體突變體的組合物。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了使用一個或多個c肪基因或蛋白以調(diào)節(jié)細胞中針對耙核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的組合物和方法。在一些其它實施方案中，本發(fā)明提供了使用包含至少一個c做基因和至少兩個CRISPR重復(fù)序列連同至少一個CRISPR間隔區(qū)的重組核酸序列的組合物和方法，其中至少一個CRISPR間隔區(qū)是異源于至少一個c做基因和/或至少兩個CRISPR重復(fù)序列的，旨在調(diào)節(jié)針對耙核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性。仍在其它的實施方案中，本發(fā)明提供了包含至少一個c做基因的至少一種核,列。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了包含至少一個cs基因和至少兩個CRISPR重復(fù)序列的至少一種核酸序列。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了包含至少一個ow基因和至少一個CRISPR間隔區(qū)的核酸序列。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了包含至少一個CflS基因、至少一個CRISPR間隔區(qū)和至少兩個CRISPR重復(fù)序列的核酸序列。在其他實施方案中，本發(fā)明提供了包含至少一個基因和至少兩個CRISPR重復(fù)序列連同至少一個CRISPR間隔區(qū)的重組核酸序列，其中所述CRISPR間隔區(qū)是異源于至少一個c似基因和/或至少兩個CRISPR重復(fù)序列的。本發(fā)明也提供了包含本文中所述的一種或多種核酸序列的構(gòu)建體。又在其它的實施方案中，本發(fā)明提供了包含本文中所述的一種或多種核,列或一種或多種構(gòu)建體的載體。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了包含本文中所述的核酸序列或構(gòu)建體或載體的細胞。本發(fā)明也提供了用于調(diào)節(jié)(例如賦予或提高)細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法，所述方法包括步驟(i)在生物中鑒定序列(例如保守序列)(在一些實施方案中，這是對該生物的功能或存活為必需的序列)；(ii)制備與所鑒定序列同源的CRISPR間隔區(qū)；(iii)制備包含至少一個c做基因和至少兩個CRISPR重復(fù)序列連同所述CRISPR間隔區(qū)的核酸(例如重組核酸)；和(iv)將該核酸導(dǎo)入細胞，因而使該細胞抗耙核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。本發(fā)明也提供了用于調(diào)節(jié)(例如賦予或提高)細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法，所述方法包括步驟(i)在抗靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的生物中鑒定一個或多個CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)；(ii)制備包含至少一個cm基因或蛋白和至少兩個CRISPR重復(fù)序列連同已鑒定的一個或多個間隔區(qū)的重組核酸；和(iii)將該重組核酸導(dǎo)入細胞，因而使該細胞抗靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。本發(fā)明也提供了用于調(diào)節(jié)(例如賦予或提高)包含至少一個或多個cas基因或蛋白和兩個或多個CRISPR重復(fù)序列的細胞針對耙核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法，所述方法包括步驟(i)在抗靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的生物中鑒定一個或多個CRISPR間隔區(qū)；和(iiM資飾該細胞中一個或多個CRISPR間隔區(qū)的序列，從而所述CRISPR間隔區(qū)與該生物中的CRISPR間隔區(qū)具有同源性。本發(fā)明也提供了用于調(diào)節(jié)(例如減低或降低)包含至少一個或多個c做基因或蛋白和兩個或多個CRISPR重復(fù)序列的細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法，所述方法包括步驟(i)在基本上抗靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的生物中鑒定一個或多個CRISPR間隔區(qū)；(iiyf務(wù)飾該細胞中至少一個或多個CRISPR間隔區(qū)的序列，從而所述CRISPR間隔區(qū)與該生物中的間隔區(qū)具有程度降低的同源性。本發(fā)明也提供了用于調(diào)節(jié)(例如減低或降低)包含至少一個或多個CflS基因或蛋白和兩個或多個CRISPR重復(fù)序列的細胞針對耙核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法，所述方法包括修飾該細胞中的一個或多個c做基因或蛋白和/或兩個或多個CRISPR重復(fù)序列。本發(fā)明也提供了用于鑒定CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)，旨在用來調(diào)節(jié)細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法，所述方法包括步驟(i)制備包含至少兩個CRISPR重復(fù)序列和至少一個cs基因或蛋白的細胞；(ii)在基本上抗靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的生物中鑒定至少一個CRISPR間隔區(qū)或4艮CRISPR間隔區(qū)；(iii)修飾該細胞中CRISPR間隔區(qū)的序列，從而該CRISPR間隔區(qū)與此生物的間隔區(qū)具有同源性；和(iv)確定該細胞是否調(diào)節(jié)針對所述靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性，其中調(diào)節(jié)該細胞針對耙核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性表明所述CRISPR間隔區(qū)調(diào)節(jié)該細胞的抗性。本發(fā)明也提供了用于鑒定c肪基因，旨在用來調(diào)節(jié)細胞針對耙核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法，所述方法包括步驟(i)制備包含至少一個CRISPR間隔區(qū)和至少兩個CRISPR重復(fù)序列的細胞；(ii)工程化該細胞，從而該細胞包含至少一個ow基因；和(iii)確定該細胞是否調(diào)節(jié)針對所述乾核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性，其中調(diào)節(jié)該細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性表明該cos基因可以用來調(diào)節(jié)該細胞的抗性。本發(fā)明也提供了用于鑒定旨在用來調(diào)節(jié)細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的CRISPR重復(fù)序列的方法，所述方法包括步驟(i)制備包含至少一個CRISPR間隔區(qū)和至少一個ow基因的細胞；(ii)工程化該細胞，從而該細胞含有所述CRISPR重復(fù)序列；(iii)確定該細胞是否調(diào)節(jié)針對所述靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性，其中調(diào)節(jié)該細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性表明該CRISPR重復(fù)序列可以用來調(diào)節(jié)抗性。本發(fā)明也提供了用于鑒定c肪基因和CRISPR重復(fù)序列的功能性組合的方法，所述方法包括步驟(a)確定該c^基因和該CRISPR重復(fù)序列的序列；(b)鑒定c"s基因的一個或多個簇，這通過序列比較分析確定；(c)鑒定CRISPR重復(fù)序列的一個或多個簇；和(d)組合屬于相同簇的那些c做基因和CRISPR重復(fù)序列，其中相同簇內(nèi)cfls基因和CRISPR重復(fù)序列的組合表明該組合是功能性組合。本發(fā)明也提供了用于調(diào)節(jié)包含一個或多個cm基因或蛋白和兩個或多個CRISPR重復(fù)序列的細菌細胞的溶菌型的方法，所述方法包括步驟(i)鑒定噬菌體的基因組序列中的一個或多個假CRISPR間隔區(qū)，其中針對所述噬菌體的抗性待調(diào)節(jié)；和(ii)修飾細菌細胞的一個或多個CRISPR間隔區(qū)的序列，從而細菌細胞的CRISPR間隔區(qū)與噬菌體的假CRISPR間隔區(qū)具有同源性，其中針對所述噬菌體的抗性待調(diào)節(jié)。本發(fā)明也提供了用于調(diào)節(jié)(例如賦予或提高)細菌細胞針對噬菌體的抗性的方法，所述方法包括步驟(i)在噬菌體中鑒定序列(例如保守序列)(優(yōu)18選地，對該噬菌體的功能或存活為必需的序列)；(ii)制備與所鑒定序列同源的CRISPR間隔區(qū)；(iii)制備包含至少一個基因和至少兩個CRISPR重復(fù)序列連同所述CRISPR間隔區(qū)的核酸；和(iv)將該核酸導(dǎo)入細菌細胞，因而使該細菌細胞抗靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。本發(fā)明也提供了用于調(diào)節(jié)(例如賦予或提高)細菌細胞針對噬菌體中乾核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法，所述方法包括步驟(i)在噬菌體基因組中鑒定一個或多個假CRISPR間隔區(qū)，其能夠提供針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性；(ii)制備包含至少一個cm基因和至少兩個CRISPR重復(fù)序列連同已鑒定的一個或多個假CRISPR間隔區(qū)的重組核酸；和(iii)將該重組核酸導(dǎo)入細菌細胞，因而使該細菌細胞抗靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。本發(fā)明也提供了用于調(diào)節(jié)包含一個或多個cm基因或蛋白和兩個或多個CRISPR重復(fù)序列的細菌細胞針對噬菌體中靼核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法，所述方法包括步驟(i)在噬菌體中鑒定一個或多個假CRISPR間隔區(qū)，其能夠提供針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性；(ii)在其中抗性待調(diào)節(jié)的細菌細胞中鑒定一個或多個CRISPR間隔區(qū)；和(iii)修飾其中抗性待調(diào)節(jié)的細菌細胞中的CRISPR間隔區(qū)的序列，從而所述CRISPR間隔區(qū)與噬菌體的假CRISPR間隔區(qū)具有較高程度的同源性，其中針對所述噬菌體的抗性待調(diào)節(jié)。本發(fā)明也提供了用于確定細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法，所述方法包括鑒定該細胞中的一個或多個功能性CRISPR重復(fù)序列-cm組合和一個或多個CRISPR間隔區(qū)。本發(fā)明也提供了使用本文中提供的方法獲得或可獲得的細胞。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了通過本文中所述方法獲得或可獲得的CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了通過本文中所述方法獲得或可荻得的ow基因。在一些進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了通過本文中所述方法獲得或可獲得的CRISPR重復(fù)序列。又在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了通過本文中所述方法獲得或可獲得的功能性組合。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了包含至少一個CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)和/或至少一個c氾基因和/或至少一個CRISPR重復(fù)序列和/或功能性組合的重組CRISPR基因座。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了使用細胞、至少一個CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)、至少一個cas基因、至少一個CRISPR重復(fù)序列或其功能性組合來調(diào)節(jié)細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法。在一些進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了細胞培養(yǎng)物用于調(diào)節(jié)細胞針對耙核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性，其中所述的細胞培養(yǎng)物包含至少一個細胞、至少一個CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)、至少一個cm基因、至少一個CRISPR重復(fù)序列或其功能性組合。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了包含本文中所提供的培養(yǎng)物的食品和/或飼料。在一些其它實施方案中，本發(fā)明提供了用于制備包含本文中所提供的培養(yǎng)物的食品和/或銅料的方法。又在其它的實施方案中，本發(fā)明提供了通過本文中所提供方法獲得或可獲得的食品和/或飼料。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了使用本文中所提供的培養(yǎng)物來制備食品和/或飼料的方法。本發(fā)明還提供了包含或由SEQIDNO:7-10和SEQIDNO:359-405中所述任一序列組成的核苷酸序列，以及其變體、片段、同源物(homologues)和衍生物。本發(fā)明也提供了由本文中所述核苷酸序列編碼的氨基酸。又在其他實施方案中，本發(fā)明提供了構(gòu)建體和/或載體，其包含本文中提供的一個或多個核苷酸序列。本發(fā)明也提供了宿主細胞，其包含本文中提供的構(gòu)建體和/或核苷酸序列至少之一。在一些實施方案中，一個或多個cas基因或蛋白與兩個或多個CRISPR重復(fù)序列組合使用。在一些其他實施方案中，一個或多個cas基因或蛋白和/或兩個或多個CRISPR重復(fù)序列從相同的細IW汙生。在一些其他實施方案中，一個或多個cas基因或蛋白和兩個或多個CRISPR重復(fù)序列天然地共存于相同細胞中。在一些進一步的實施方案中，一個或多個cas基因或蛋白與一個或多個CRISPR間隔區(qū)組合使用。在一些實施方案中，所述CRISPR間隔區(qū)從這樣的生物衍生，其中所述生物不同于4汙生一個或多個cas基因或蛋白和/或兩個或多個CRISPR重復(fù)序列的細胞。在一些實施方案中，間隔區(qū)從抗靼核酸的細胞獲得。在一些實施方案中，該CRISPR間隔區(qū)是合成的核酸序列。在一些其他實施方案中，該CRISPR間隔區(qū)與靶核酸具有同源性。在一些實施方案中，該CRISPR間隔區(qū)與革巴核酸在至少CRISPR間隔區(qū)核心長度的范圍內(nèi)具有100%同一性。在一些實施方案中，一個或多個c肪基因或蛋白與至少一個或多個CRISPR間隔區(qū)和至少兩個或多個CRISPR重復(fù)序列組合使用。在一些實施方案中，靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從噬菌體DNA衍生。又在其他實施方案中，耙核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從至少一種質(zhì)粒衍生。在一些其他實施方案中，靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從至少一種可移動遺傳元件DNA衍生。在一些實施方案中，靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從轉(zhuǎn)座元件和/或插入序列衍生。在一些備選實施方案中，靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從抗生素/抗微生物劑抗性基因衍生。在一些其它實施方案中，耙核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從編碼至少一種毒力因子的核酸衍生。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述毒力因子包括毒素、內(nèi)化蛋白、溶血素和/或其他毒力因子。在本發(fā)明的一些實施方案中，一個或多個c做基因或蛋白和兩個或多個CRISPR重復(fù)序列從相同的細胞衍生。在一些備選實施方案中，一個或多個cs基因和兩個或多個CRISPR重復(fù)序列天然地共存于相同細胞中。又在其他實施方案中，CRISPR間隔區(qū)從這樣的生物衍生，其中所述生物不同于衍生一個或多個cos基因和/或兩個或多個CRISPR重復(fù)序列的細胞。在一些實施方案中，細胞是受體細胞或宿主細胞。在一些實施方案中，一個或多個c似基因或蛋白和/或兩個或多個CRISPR重復(fù)序列從相同的細胞衍生。在一些實施方案中，間隔區(qū)從這樣的生物衍生，其中所述生物不同于包含一個或多個c似基因或蛋白和/或兩個或多個CRISPR重復(fù)序列的細胞。在一些實施方案中，一個或多個c船基因或蛋白和兩個或多個CRISPR重復(fù)序列天然地共存于相同細胞中。在一些實施方案中，修"飾包括插入一個或多個CRISPR間隔區(qū)和/或假CRISPR間隔區(qū)到細胞中。在一些實施方案中，修飾包含基因工程地改造該細胞的CRISPR間隔區(qū)。在一些實施方案中，細胞的間隔區(qū)與所迷生物的CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)具有100%同源性。在一些實施方案中，修飾了細胞中間隔區(qū)的全部或部分。在一些實施方案中，4務(wù)飾包括對重組間隔區(qū)的修飾。在一些實施方案中，修飾通過自發(fā)突變或誘變進行。在一些實施方案中，細胞中至少一個或多個CRISPR間隔區(qū)是缺失的。在一些實施方案中，細胞中至少一個或多個CRISPR重復(fù)序列是缺失的。在一些實施方案中，一個或多個c做基因是缺失的。在一些實施方案中，CRISPR和/或一個或多個c肪基因是缺失的。在一些實施方案中，細胞中一個或多個cw基因或蛋白和/或兩個或多個CRISPR重復(fù)序列是缺失的。在一些實施方案中，ow基因和CRISPR重復(fù)序列的核苷酸序列從相同或不同的菌林f汙生。在一些實施方案中，cm基因和CRISPR重復(fù)序列的核苷^列從相同或不同的物種衍生。在一些實施方案中，基因和CRISPR重復(fù)序列的核苷酸序列從相同或不同的屬衍生。在一些實施方案中，c肪基因和CRISPR重復(fù)序列的核苷酸序列從相同或不同的生物衍生。在本發(fā)明的一些實施方案中，噬菌體中的靶核酸是高度保守的核^列。在一些實施方案中，噬菌體中的靶核酸編碼宿主特異性蛋白質(zhì)。在一些其他實施方案中，噬菌體中的靶核酸編碼編碼對該噬菌體存活、復(fù)制或生長為必需的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，噬菌體中的靼核酸編碼解旋酶、引發(fā)酶、頭部或尾部結(jié)構(gòu)蛋白、具有保守結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(例如穴蛋白、細胞溶素等)或重要噬菌體基因當(dāng)中的至少一個保守序列。在一些實施方案中，用于確定細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法包括額外的步驟將細胞中一個或多個CRISPR間隔區(qū)的序列與靶核酸的序列比較。在一些備選的實施方案中，用于確定細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法包括額外的步驟確定細胞的抗性譜。22在一些實施方案中，所述培養(yǎng)物是起子培養(yǎng)物或益生培養(yǎng)物。本發(fā)明也提供了抵抗噬菌體的"標記細菌"(即"噬菌體不敏感性突變體"；"BIM")。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了這樣的細菌，所述細菌包含整合到該細菌的CRISPR基因座中的源自至少一種噬菌體基因組的一個或多個序列。這種噬菌體衍生的序列提供了通過其位置和/或序列和/或毗鄰序列而可鑒定的標記物。在一些備選的實施方案中，本發(fā)明提供了重復(fù)序列(例如重復(fù)的CRISPR重復(fù)序列)，所述的重復(fù)序列源自親代細菌并且也反復(fù)地、依次地、同時地或基本上同時地連同源自噬菌體基因組的序列一起整合。另外，本發(fā)明提供了促進一個或多個不同噬菌體序列整合到細菌菌林CRISPR基因座中的方法。在一些實施方案中，不同噬菌體序列在細菌菌林CRISPR基因座中的整合是一個隨機事件。在一些備選的實施方案中，不同噬菌體序列在細菌菌林CRISPR基因座中的整合不是一個隨機事件。因此，并不總是噬菌體基因組的相同基因座整合到細菌CRISPR基因座中。然而，一旦它整合，則它維持下來并且因而變成標記和/或追蹤該細菌的耐用標簽。因此，源自噬菌體基因組的一個或多個序列相對于親代細菌的CRISPR基因座不僅是新的，而且是每種細菌獨有的標記物。因此，本文中提供了用于標記(例如加標簽)和/或鑒定細菌的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法是"天然"的并且不導(dǎo)致基因修飾生物的產(chǎn)生。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了用于標記細菌的方法，所述方法包括步驟(a)使親代細菌暴露于噬菌體；(b)選擇噬菌體不敏感性突變體；(c)比較來自親代細菌和所述噬菌體不敏感性突變體的CRISPR基因座或其部分；和(d)選擇在CRISPR基因座中包含在親代細菌中不存在的額外DNA片段的標記細菌。本發(fā)明也提供了使用本發(fā)明方法獲得的標記細菌。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了包含至少一種標記細菌菌林的細胞培養(yǎng)物。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了包含標記細菌的食物和/或飼料，所述的食物和/或飼料包括但不限于包含此類標記細菌的細胞培養(yǎng)物。本發(fā)明也提供了用于制備包含至少一種標記細菌菌株的食物和/或飼料的方法。在一些實施方案中，該方法包括添加至少一種標記細菌菌林或細胞培養(yǎng)物至所述食物和/或銅料。本發(fā)明也提供了用于產(chǎn)生CRISPR變體的方法，所述方法包括步驟(a)使親代細菌暴露于噬菌體；(b)選擇噬菌體抗性細菌(即"噬菌體不敏感性突變體")；(c)比較來自親代細菌和所述噬菌體不敏感性突變體的CRISPR基因座或其部分；(d)選擇在CRISPR基因座中包含在親代細菌中不存在的額外DNA片段的標記細菌；和(e)分離和/或克隆和/或?qū)⒋祟~外DNA片段測序。本發(fā)明也提供了使用本文中所述方法產(chǎn)生的CRISPR變體。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，CRISPR變體是這樣的噬菌體抗性突變菌株，其具有帶額外間隔區(qū)的經(jīng)修飾的CRISPR基因座。在一些其它實施方案中，本發(fā)明也提供了使用從噬菌體獲得或可獲得的至少一個核苷酸序列以標記和/或鑒定細菌的方法，其中所述核苷酸序列整合在親代細菌的CRISPR基因座中。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了使用至少一個核苷酸序列來標記和/或鑒定細菌的方法，其中所述的核苷酸序列通過如下方式獲得或可獲得(a)使親代細菌暴露于噬菌體；(b)選擇噬菌體不敏感性突變體；(c)比較來自親代細菌和所述噬菌體不敏感性突變體的CRISPR基因座或其部分；和(d)選擇在CRISPR基因座中包含在親代細菌中不存在的額外DNA片段的標記細菌。又在其它的實施方案中，本發(fā)明提供了用于鑒定標記細菌的方法，所述方法包括對細菌篩選該細菌的CRISPR基因座中額外DNA片段的步驟，這也在本發(fā)明的進一步的方面提供。又在其他實施方案中，本發(fā)明提供了用于鑒定標記細菌的方法，所述方法包括步驟(a)篩選該細菌的CRISPR基因座中的額外DNA片段；(b)確定該額外DNA片段的核苷*列；(c)將額外DNA片段的核苷i^列與通過本發(fā)明方法獲得或可獲得的標記細菌的數(shù)據(jù)庫比較；和(d)鑒定標記細菌的數(shù)據(jù)庫中匹配該額外DNA片段的核苷酸序列。在一些優(yōu)選的實施方案中，將親代細菌的CRISPR基因座的5，端和/或3，端與標記細菌比較。在一些備選的優(yōu)選實施方案中，至少比較了在CRISPR基因座5'端的第一CRISPR重復(fù)序列或笫一CRISPR間隔區(qū)(例如第一CRISPR間隔區(qū)核心)。又在其他實施方案中，至少比較了在CRISPR基因座3'端的最末CRISPR重復(fù)序列或最末CRISPR間隔區(qū)(例如最末CRISPR間隔區(qū)核心)。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法包括選擇標記細菌的步驟，所述的標記細菌包含在CRISPR基因座5，端和/或3，端的在親代細菌中不存在的額外DNA片段。在一些備選的實施方案中，該方法還包括使親代細菌同時或依次地暴露于兩種或多種噬菌體。又在其他實施方案中，來自親代細菌和噬菌體不敏感性突變體的CRISPR基因座或其部分通過擴增來自親代細菌和/或噬菌體不敏感性突變體的CRISPR基因座或其部分進行比較。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，使用PCR進行擴增。在一些備選的實施方案中，來自親代細菌和噬菌體不敏感性突變體的CRISPR基因座或其部分通過對來自親代細菌和/或噬菌體不敏感性突變體的CRISPR基因座或其部分測序進行比較。在一些優(yōu)選的實施方案中，來自親代細菌和噬代細菌和/或噬菌體不敏感性突變體的CRISPR基因座或其部分測序進行比較。在一些備選的優(yōu)選實施方案中，該額外DNA片段具有至少44個核苷酸長度。在一些額外的優(yōu)選實施方案，選擇了包含兩個或三個或多個額外DNA片段的標記細菌。又在其他實施方案中，該額外DNA片段包含與親代細菌菌林的CRISPR基因座中的CRISPR重復(fù)序列具有至少約95%同一性或優(yōu)選100%同一性的至少一個核苷酸序列。在進一步的實施方案中，該額外DNA片段包含與用來選擇標記細菌的噬菌體的基因組中的核苷酸序列具有至少約95。/。同一性，并且在一些實施方案中，優(yōu)選地具有約100%同一性的至少一個核苷酸序列。在一些實施方案中，本發(fā)明也提供了包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的至少一個額外DNA片段，其中所述核苷酸序列的至少一個核苷酸序列與用來選擇標記細菌的噬菌體的基因組中的核苷酸序列具有至少約95%同一性，或在一些優(yōu)選的實施方案25中，具有約100%同一性。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了適合用作起子培養(yǎng)物、益生培養(yǎng)物和/或膳食補充劑的親代細菌。在一些實施方案中，親代細菌選自任何合適的屬，所述屬包括但不限于埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、歐文氏菌屬、耶爾森氏菌屬、芽孢桿菌屬、弧菌屬、軍團菌屬、假單胞菌屬、奈瑟氏球菌屬、博德特氏菌屬、螺桿菌屬、利斯特氏菌屬、農(nóng)桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、梭菌屬、棒桿菌屬、分枝桿菌屬、密螺旋體屬、疏螺旋體屬、弗朗西絲菌屬、布魯氏菌屬、雙歧桿菌屬、短桿菌屬、丙酸桿菌屬、乳球菌屬、乳桿菌屬、片球菌屬、明串珠菌屬和酒球菌屬。在一些實施方案中，所述噬菌體選自合適的病毒科，所述的病毒科包括但不限于覆蓋噬菌體科、嚢狀噬菌體科、絲桿狀噬菌體科、光滑噬菌體科、微小噬菌體科、肌尾噬菌體科、短尾噬菌體科、長尾噬菌體科和復(fù)層噬菌體科。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了選自起子培養(yǎng)物、益生培養(yǎng)物和/或膳食補充劑的細胞培養(yǎng)物。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了用于鑒定標記細菌的方法，所述方法包括將至少一個額外DNA片段與噬菌體序列數(shù)據(jù)庫和/或細菌序列數(shù)據(jù)庫比較的步驟。本發(fā)明也提供了包含從噬菌體獲得或可獲得的序列的嗜熱鏈球菌(5".幼mw印/iZ/"s)菌林，其中所述序列包含來自嗜熱鏈球菌菌林DGCC7778的CRISPR間隔區(qū)，在本文中稱作SEQIDNO:680(caacacattcaacagattaatgaagaatac;SEQIDNO:680)。又在其它的實施方案中，本發(fā)明提供了包含從噬菌體獲得或可獲得的序列的嗜熱鏈球菌菌林，其中所述序列包含在至少一個CRISPR基因座中的第一CRISPR重復(fù)序列下游(例如緊接下游)的SEQIDNO:680。在其他實施方案中，本發(fā)明提供了包含從噬菌體獲得或可獲得的序列的嗜熱鏈球菌菌林，其中所述序列包含來自嗜熱鏈球菌菌林DGCC7778的CRISPR間隔區(qū)(5'畫3')(tccactcacgtacaaatagtgagtgtactc;SEQIDNO:681)。又在其它的實施方案中，本發(fā)明提供了包含從噬菌體獲得或可獲得的序列的嗜熱鏈球菌菌林，其中所述序列包含在至少一個CRISPR基因座中的第一CRISPR重復(fù)序列下游(例如緊接下游)的SEQIDNO:681。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了包含從噬菌體獲得或可獲得的序列的嗜熱鏈球菌菌林，其中所述序列包含SEQIDNO:683:嗜熱鏈球菌菌林DGCC7710-RH1的CRISPR1序列(5'-3，)caaggacagttattgattttataatcactatgtgggtataaaaacgtcaaaatttcatttgagGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACtcaacaattgcaacatcttataacccacttGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACtgtttgacagcaaatcaagattcgaattgtGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaatgacgaggagctattggcacaacttacaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACcgatttgacaatctgctgaccactgttatcGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACacacttggcaggcttattactcaacagcgaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACctgttccttgttcttttgttgtatcttttcGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACttcattcttccgtttttgtttgcgaatcctGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACgctggcgaggaaacgaacaaggcctcaacaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACcatagagtggaaaactagaaacagattcaaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACataatgccgttgaattacacggcaaggtcaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACgagcgagctcgaaataatcttaattacaagGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACgttcgctagcgtcatgtggtaacgtatttaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACggcgtcccaatcctgattaatacttactcgGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaacacagcaagacaagaggatgatgctatgGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACcgacacaagaacgtatgcaagagttcaagGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACacaattcttcatccggtaactgctcaagtgGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaattaagggcatagaaagggagacaacatgGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACcgatatttaaaatcattttcataacttcatGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACgcagtatcagcaagcaagctgttagttactGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACataaactatg站attttataatttttaagaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaataatttatggtatagcttaatatcattgGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACtgcatcgagcacgttcgagtttaccgtttcGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACtctatatcgaggtcaactaacaattatgctGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaatcgttcaaattctgttttaggtacatttGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaatcaatacgacaagagttaaaatggtcttGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACgcttagctgtccaatccacgaacgtggatgGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACcaaccaacggt站cagctactttttacagtGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACataactgaaggataggagcttgtaaagtctGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACtaatgctacatctcaaaggatgatcccagaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaagtagttgatgacctctacaatggtttatGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACacctagaagcatttgagcgtatattgattgGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaattttgccccttctttgccccttgactagGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaccattagcaatcatttgtgcccattgagtGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAGTTtgattcaacataaaaagccagttcaattgaacttggcttt(SEQIDNO:683)又在其它的實施方案中，本發(fā)明提供了包含從噬菌體獲得或可獲得的序列的嗜熱鏈球菌菌林，其中所述序列包含在至少一個CRISPR基因座中的第一CRISPR重復(fù)序列下游(例如緊接下游)的SEQIDNO:683。嗜熱鏈球菌菌林包含從噬菌體獲得或可獲得的序列，其中所述序列包含SEQIDNO:685(即5，TACGTTTGAAAAGAATATCAAATCAATGA-3，)。又在其它的實施方案中，本發(fā)明提供了包含從噬菌體獲得或可獲得的序列的嗜熱鏈球菌菌抹，其中所述序列包含在至少一個CRISPR基因座中的第一CRISPR重復(fù)序列下游(例如緊接下游)的SEQIDNO:685。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了在開發(fā)和使用菌林組合及起子培養(yǎng)物輪換中使用的方法和組合物。在一些其它實施方案中，提供在起子培養(yǎng)物中同時使用一個或多個CRISPRBIM(即BIM的組合)。在一些其他實施方案中，提供在輪換方案中使用一個或多個CRISPRBIM。在一些其他實施方案中，提供在輪換方案中使用一個或多個CRISPRBIM組合。本發(fā)明也提供了分析靶生物CRISPR的方法，旨在進行間隔區(qū)序列與生物控制噬菌體基因組之間的比較。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了預(yù)測噬菌體毒力并選擇針對至少一種耙微生物的至少一種生物控制噬菌體的方法。本發(fā)明也提供了使用CRISPR-c氾(即在一些優(yōu)選實施方案中，天然誘變)來構(gòu)建至少乾;微生物的至少一種噬菌體抗性CRISPR變體的方法和組合物，其中所述的噬菌體抗性CRISPR變體隨后用來產(chǎn)生通過所述噬菌體內(nèi)部的突變而避開CRISPR-ow抗性的突變噬菌體，其中所述噬菌體內(nèi)部的突變對應(yīng)于選自間隔區(qū)序列、假間隔區(qū)序列、近側(cè)序列、識別基序等的序列，以增強該噬菌體的毒力。在一些優(yōu)選的實施方案中，具有增強毒力的噬菌體用作生物控制劑。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了適用于產(chǎn)生與親代噬菌體相比時具有增強的毒力的噬菌體的組合物和方法。在一些實施方案中，將至少一種克隆的間隔區(qū)導(dǎo)入活性CRISPR-ow基因座以產(chǎn)生用于生成突變噬菌體的逸菌體抗性細胞變體。在一些優(yōu)選的實施方案中，該方法包括導(dǎo)入充當(dāng)噬菌體基因組序列的特異性靶的序列(例如，作為間隔區(qū)靶或識別序列對間隔區(qū)宿主摻入高度易感的區(qū)域)。在一些其它實施方案中，本發(fā)明提供了用于定向改造噬菌體的方法和組合物，以至因此突變了對應(yīng)于該間隔區(qū)的基因組序列。本發(fā)明也提供了這樣的方法，該方法旨在使用所獲得的相應(yīng)宿主菌抹的CRISPR噬菌體抗性指導(dǎo)給定噬菌體的進化，以產(chǎn)生毒力更強，因而更有效的生物控制劑。附圖簡述圖1提供示意圖，該示意圖顯示CRISPR間隔區(qū)整合到嗜熱鏈球菌的CRISPR基因座中提供了針對與該CRISPR間隔區(qū)顯示同一性的噬菌體的抗性。親代DGCC7710對噬菌體敏感，并且BIMDGCC7710RH1對噬菌體抵抗。BIMDGCC7710RH1在CRISPR基因座中具有與噬菌體序列顯示100。/。同一性的新間隔區(qū)(Sn)。如步驟(B)中所示，用噬菌體858攻擊該菌林并且選擇噬菌體抗性突變體。如步驟(C)中所示，該突變體的CRISPRI基因座具有與噬菌體的31.921-31.950bp區(qū)域共有100%同一性的額外間隔區(qū)。圖2提供示意圖，該示意圖顯示CRISPR間隔區(qū)整合到嗜熱鏈球菌的CRISPR基因座中提供了針對與該CRISPR間隔區(qū)顯示同一性的噬菌體的抗性。親代DGCC7710對噬菌體敏感，并且BIMDGCC7710RH2對噬菌體抵抗。BIMDGCC7710RH2在CRISPR基因座中具有與噬菌體序列顯示100。/。同一性的新間隔區(qū)(Sn)。如步驟(B)中所示，用噬菌體858攻擊該菌林并且選擇噬菌體抗性突變體。如步驟(C)中所示，獨立地重復(fù)該實驗并且選擇另一突變體。該突變體的CRISPRI基因座具有與噬菌體的17.125-17.244bp區(qū)域共有100%同一性的額外間隔區(qū)(不同于RH1中的間隔區(qū))。圖3提供了說明制備其中通過同源重組破壞基因的CAS1KO構(gòu)建體的圖示。圖4提供了使用旨在從S1S2構(gòu)建體產(chǎn)生RT構(gòu)建體的限制性酶制備RT構(gòu)建體的圖示。在重復(fù)序列中存在允許該構(gòu)建體的"中間"部分被切除的限制性位點。酶消化后，使用連接酶來將兩個末端片段拼接在一起，因而產(chǎn)生具有RT、但沒有間隔區(qū)的新構(gòu)建體。圖5提供整合RT構(gòu)建體的圖示。圖6提供了顯示使用特異性引物和反復(fù)PCR反應(yīng)的S1S2構(gòu)建體工程化設(shè)計的圖示。第一分圖顯示所用的全部引物和頭兩個PCR反應(yīng)的組成(反應(yīng)針用引物P1和P2，而反應(yīng)弁2用引物P2和P3)。第二分圖顯示從頭兩個PCR反應(yīng)獲得的PCR產(chǎn)物，左邊是來自反應(yīng)#1的產(chǎn)物，而右邊是來自反應(yīng)#2的產(chǎn)物。第三分圖顯示第三PCR反應(yīng)，使用如下組合來自頭兩個PCR的產(chǎn)物作為第三PCR反應(yīng)的模板，和來自第一反應(yīng)的引物Pl及來自笫二反應(yīng)的引物P4。第四分圖顯示了技術(shù)上產(chǎn)生S1S2構(gòu)建體的PCR#3的產(chǎn)物。圖7提供引物2和3的引物設(shè)計細節(jié)的圖示，其中所述引物含有對于該實驗關(guān)鍵的序列，此序列從與噬菌體序列相同的間隔區(qū)衍生(從這些PCR引物衍生的PCR產(chǎn)物將產(chǎn)生最終提供針對噬菌體的抗性的間隔區(qū))。圖8提供S1S2構(gòu)建體整合的圖示。圖9提供概觀圖示，該圖示顯示嗜熱鏈球菌CRISPR1基因座、噬菌體抗性突變體中新獲得的間隔區(qū)和相應(yīng)的噬菌體敏感性。DGCC7710(WT)的CRISPR1基因座在頂端。WT的重復(fù)序列/間隔區(qū)在中間重復(fù)序列(黑色菱形)、間隔區(qū)(編號的灰色框)、前導(dǎo)序列(L，白色框)和末端重復(fù)序列(T，黑色菱形)。在底部，在左邊詳細顯示噬菌體抗性突變體中位于基因座的前導(dǎo)序列側(cè)的間隔區(qū)內(nèi)容物，連同新獲得的間隔區(qū)(白色框，Sl-S14)。在右邊，將每個菌林對噬菌體858和2972的敏感性顯示為成斑效率(EOP)直方圖，所述的成斑效率是突變菌林與野生型的蝕斑計數(shù)比。圖IO提供CRISPR間隔區(qū)的工程、c肪基因失活和相應(yīng)的噬菌體敏感性。I,突變的WTa>858+slS2;II，其中CRISPR1缺失的突變WT0858+S1S2ACRISPR1;III，其中CRISPR14皮替代并且被替代為獨特重復(fù)序列的突變WTo>858+slS2::pR;IV,菌林WT02972+S4的突變體WT<i>2972+S4::pSlS2，其中CRISPR1被替代并且被替代為含有Sl和S2的形式；V,cw5失活的WT刺58+siS2::pc肪5-;VI，c氾5失活的WT郵58+s^::pow7-。pORI表示整合的質(zhì)粒(12)。將每個菌株對噬菌體858和2972的噬菌體敏感性在底部顯示為成斑效率(EOP)直方圖。圖11提供了顯示S1S2構(gòu)建體的構(gòu)建的示意圖。圖12提供了顯示W(wǎng)T刺s8+s^ACRISPRl的構(gòu)建的示意圖。圖13提供CRISPR間隔區(qū)Sl與噬菌體858的相應(yīng)基因組區(qū)及兩種突變噬菌體的比對結(jié)果，其中所述的噬菌體已經(jīng)規(guī)避了菌林WTo>858+slS2的CRISPR抗性。圖14提供構(gòu)建第一水平噬菌體抗性變體的示意圖。每種變體在CRISPR中具有單個的額外間隔區(qū)。額外間隔區(qū)是彼此不相關(guān)的(例如，每個額外間隔區(qū)具有不同的序列)。全部間隔區(qū)均源自噬菌體P。圖15提供構(gòu)建笫二水平噬菌體抗性變體的示意圖，其中所述的第二水平噬菌體抗性變體呈現(xiàn)提高的噬菌體抗性。最終變體(Al.n和A2.n)源自菌抹A并且在其CRISPR內(nèi)具有依次整合的額外間隔區(qū)，其中全部間隔區(qū)均是彼此不同的并且均源自噬菌體P。圖16提供構(gòu)建第二水平噬菌體抗性變體的示意圖，其中所述的第二水平噬菌體抗性變體呈現(xiàn)擴大的噬菌體抗性。最終變體(Aipqr)源自菌林A并且在其CRISPR內(nèi)具有依次整合的源自3種不同噬菌體(即來自噬菌體P、Q和R)的額外間隔區(qū)。圖17提供實施例7至實施例16中所述的嗜熱鏈球菌菌抹的CRISPR1基因座(分圖A)和CRISPR3基因座(分圖B)的示意圖。菌林名稱在圖的左側(cè)給出。黑色箭頭代表CRISPR重復(fù)序列，"R"代表重復(fù)序列和"RT"代表末端重復(fù)序列。在A部分中從1至32編號并且在B部分中從1至12編號的灰色箭頭分別代表CRISPR1間隔區(qū)和CRISPR3間隔區(qū)，如它們在DGCC7710中那樣。從S4至S35編號的白色箭頭代表所述菌株特有的CRISPR額外間隔區(qū)。圖18提供顯示本發(fā)明實施方案的示意圖，其中標簽序列和CRISPR重復(fù)序列整合在CRISPR基因座的一端。在分圖A中，顯示了CRISPR基因座和元件，其包括重復(fù)序列(R)、間隔區(qū)(S)、上游前導(dǎo)序列及下游非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)，其中末端重復(fù)序列(RT)毗鄰于非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)，和鄰近的c氾基因(本文中名為c肪/至ca^的4種cflw基因沒有按比例尺畫出)。cas基因可以位于兩個末端的任意末端上或分離并位于兩端。另夕卜，cas基因可以位于兩條DNA鏈的任意鏈上。分圖B顯示具有序列(Sn)的片段的噬菌體序列，其中使用所述片段作為額外間隔區(qū)(即標簽序列)。分圖C顯示在CRISPR基因座的一端(本實例中，在CRISPR基因座5'端靠近前導(dǎo)序列)在兩個重復(fù)序列之間插入新間隔區(qū)(Sn)(即標簽序列)。分圖D提供了親代細菌與突變細菌(即標記細菌)之間CRISPR基因座內(nèi)容物的比較，其中新間隔區(qū)(Sn)(即標簽序列)整合在CRISPR基因座的一端(本實例中靠近前導(dǎo)序列)，位于重復(fù)序列之間。所述新間隔區(qū)(Sn)構(gòu)成突變細菌(即標記細菌)特有的標簽序列。在一些實施方案中，該方法的使用導(dǎo)致添加來自噬菌體序列的一個或多個間隔區(qū)。圖19提供顯示本發(fā)明實施方案的示意圖，其中兩個標簽序列和兩個CRISPR重復(fù)序列整合在CRISPR基因座的一端。在分圖A中，顯示了(A)CRISPR基因座和元件，其包括重復(fù)序列(R)、間隔區(qū)(S)、上游前導(dǎo)序列及下游非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)，其中末端重復(fù)序列(RT)毗鄰于非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)，和鄰近的cfls基因(本文中名為cm2至c肪4的4種c"s基因沒有按比例尺畫出)。CM基因可以位于兩個末端的任意末端上或分離并位于兩端。CtfS基因可以位于兩條DNA鏈的任意鏈上。分圖B以黑色顯示具有兩個序列片段(Sn和Sn，)的噬菌體序列，其中使用所述片段作為額外間隔區(qū)(即標簽序列)。分圖C顯示在CRISPR基因座的相同末端(本實例中，在5'端靠近前導(dǎo)序歹寸)插入新間隔區(qū)(即標簽序列)(Sn和Sn，)，其中每個新間隔區(qū)均位于兩個重復(fù)序列之間。分圖D提供了親代細菌與突變細菌(即標記細菌)之間CRISPR基因座內(nèi)容物的比較，其中兩個新間隔區(qū)(Sn和Sn')整合在CRISPR基因座的相同末端(本實例中，在5'端靠近前導(dǎo)序列)，每個新間隔區(qū)位于重復(fù)序列之間。新間隔區(qū)Sn和Sn'構(gòu)成所述突變體特有的標簽序列。在一些實施方案中，該方法導(dǎo)致添加來自噬菌體序列的一個或多個間隔區(qū)。圖20提供示意圖，該示意圖顯示用DGCC7710(黑色菱形)或用DGCC卵36(空心矩形)發(fā)酵期間含有107pfu/mlD2972的乳中的謹菌體計數(shù)的演變。乳是在水中的10。/。(w/v)乳粉。溫育溫度是42。C。圖21提供示意圖，該示意圖顯示發(fā)酵期間含有107pfu/mlD2972的乳中，針對WTphi2972+S加和WTphi2972+S"的累積噬菌體計數(shù)的演變，其中發(fā)酵用WTphi2972+S2D(間斷線)或用WTphi2972+S21(淺灰色)或用WTphi2972+S2(>和WTpW2972+S"(深灰色)接種。乳是在水中的10。/。(w/v)乳粉。溫育溫度是42。C。圖22提供CRISPR1基序NNAGAAW(SEQIDNO:696)的WebLogo。圖23提供所選CRISPR3原型間隔區(qū)和側(cè)翼區(qū)的比對結(jié)果，以及CRISPR3基序NGGNG(SEQIDNO:723)的WebLogo。在本圖中，提供了S42DGCC7710pbi2972+S40phi3821+S41S42(SEQIDNO:724)、S41DGCC7710phi2972+S40phi3821+s41S42(SEQIDNO:699)、S41DGCC7710phi858+sls2deltaCRISPR1phi848+S43(SEQIDNO:700)和S78LMD-9phi424+S78(SEQIDNO:701)。發(fā)明描述本發(fā)明提供了涉及調(diào)節(jié)細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法和組合物。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了使用一個或多個CflS基因或蛋白調(diào)節(jié)細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的組合物和方法。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了在開發(fā)和使用菌抹組合及起子培養(yǎng)物輪換中使用的方法和組合物。在其它的實施方案中，本發(fā)明提供了用于標記和/或鑒定細菌的方法。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了使用CRISPR基因座確定噬菌體對細胞的潛在毒力和使用CRISPR-c"s調(diào)整噬菌體的遺傳序列以提高毒力水平的方法。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了用于開發(fā)和使用噬菌體作為生物控制劑的方法和組合物。嗜熱鏈球菌是低G+C含量的革蘭氏陽性細菌物種，它是在配制乳品培養(yǎng)系統(tǒng)以產(chǎn)生酸奶和干酪中所用的關(guān)鍵物種。親緣關(guān)系密切的嗜熱鏈球菌菌林的比較基因組分析先前已經(jīng)揭示遺傳多態(tài)性主要在超變基因座如e/W和f/w操縱子以及兩個成簇的有規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(CRISPR)基因座處出現(xiàn)(見例如，Jansen等人，Mol.Microbiol.,43:152002；Bolotin等人，Microbiol"151:2551[2005；和Bolotin等人，Nat.Biotechnol.，22:1554[2004])。如本文中更詳細地描述，CRISPR基因座一般由幾個不連續(xù)同向重復(fù)序列組成，其中所述的不連續(xù)同向重復(fù)序列由稱作間隔區(qū)的可變序列片段分隔，并且往往與c^(CRISPR-相關(guān))基因相鄰。雖然還沒有在生物學(xué)上確立CRISPR基因座的功能，計算機(,Viw7i'co)分析間隔區(qū)已經(jīng)揭示了與包括噬菌體和質(zhì)粒序列在內(nèi)的外來元件的序列同源性(見，例如上文的Bolotin等人，Microbiol.;上文的Mojica等；和上文的Pourcel等)。僅僅基于計算機分析，已經(jīng)提出幾個假設(shè)來建議CRISPR和c氾基因的作用，這包括借助基于RNA千擾的機制提供針對外來遺傳元件的免疫性(見，Makarova等人，Biol.Direct.,1:7[2006)。然而，不意圖使本發(fā)明限于任何特定機制和/或作用方式。工業(yè)中用來將噬菌體感染和所致細菌培養(yǎng)物失效減至最低程度的現(xiàn)有策略包括使用(i)混合的起子培養(yǎng)物；和(ii)使用具有不同噬菌體易感性譜的備選菌林(即菌林輪換)。傳統(tǒng)上，乳品工業(yè)中使用的起子培養(yǎng)物是乳酸細菌菌抹的混合物?；旌系钠鹱优囵B(yǎng)物的復(fù)雜組成確保提供某種水平的針對噬菌體侵襲的抗性。然而，重復(fù)傳代培養(yǎng)混合的菌林培養(yǎng)物導(dǎo)致各個菌林分布的不可預(yù)測性改變并且最終往往逐漸導(dǎo)致不利菌抹占優(yōu)勢。這轉(zhuǎn)而可以導(dǎo)致噬菌體侵襲易感性和發(fā)酵失敗風(fēng)險提高。輪換對不同噬菌體敏感的所選細菌菌林是目前用來限制噬菌體發(fā)展的另一種方法。然而，鑒定并選擇足夠數(shù)量的具有不同噬菌體類型譜的菌林以提供高效和可靠的輪換程序是困難和費力的。此外，菌林的連續(xù)使用要求仔細監(jiān)測新的感染性噬菌體并禽要迅速用抗性細菌菌林置換感染的菌林。遠在使用以前就制備的大量大體積起子培養(yǎng)物的制造廠中，這種快速反應(yīng)通常是不可能的。因此，已經(jīng)進行幾種嘗試以改善工業(yè)用培養(yǎng)物的抗性。另外，雖然擁有標記的起子培養(yǎng)物從而可能確定其起源將是有用的，然而還沒有這樣做。實際上，盡管使用重組DNA技術(shù)將合成的寡核苷酸插入菌林中以標示或標記該菌抹是可行的，不過該標記菌林將被視為一種遺傳修飾生物并且可能因而在商業(yè)應(yīng)用中面臨管理規(guī)章問題。因此，本領(lǐng)域需要適合將可能用來鑒定和/或追蹤細菌的獨特序列導(dǎo)入細菌的天然方法和纟且合物。噬菌體可辯論地是這個星球上最豐富的生物實體(見，Breitbart和Rohwer，TrendsMicrobiol.，13:2782005)。其廣泛分布和豐富性對孩￡生物生態(tài)和細菌基因組的演化具有重要影響(見，Chibani-Chennoufi等人，J.Bacteriol.，186:3677[2004)。因此，細菌已經(jīng)發(fā)展了以噬菌體生活周期的多個步驟為靶標的多種天然防御機制，尤其是阻斷吸附、防止DNA注入、限制輸入性DNA和無效感染系統(tǒng)。這些抗病毒屏障也可以改造和操縱以更好地控制噬菌體群體(見，例如上文的Chibani-Chennoufi等；以及Sturino和Klaenhammer，NatRev.Microbiol"4:395[2006)。眾多細菌已經(jīng)由人類選擇并廣泛地用于發(fā)酵和生物技術(shù)工藝。不幸地是，工業(yè)應(yīng)用中所用的馴化細菌往往對噬菌體侵襲易感，所述馴化細菌包括廣泛用作乳品培養(yǎng)物的那些屬和種(見，Brussow，Ann.Rev.Microbiol.,55:282001)。因此，工業(yè)界已經(jīng)基于菌林多樣性、噬菌體不敏感性突變體和攜帶噬菌體抗性機制的質(zhì)粒而創(chuàng)造了多種策略來對抗噬菌體。定義除非本文另外定義，本文中所用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所理解的相同意義。盡管與本文所述的那些方法和材料相似或等效的任意方法和材料用于實施本文中所述內(nèi)容，然而在本文中描述了示例性方法和材料。如本文中所用，單數(shù)"一個"、"一種"和"該，，包括復(fù)數(shù)稱謂，除非上下文另外清楚地說明。除非另外說明，核酸從左至右以5'至3，方向書寫；氨基酸序列從左至右以氨基至羧基方向書寫。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所描述的具體方法學(xué)、方案和試劑，因為根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員使用它們的條件，這些內(nèi)容可以變化。意圖在本說明書通篇范圍內(nèi)給出的每個最大數(shù)字界限包括每個較小的數(shù)字界限，如同在本文中清楚地寫出此類較小的數(shù)字界限。在本說明書通篇范圍內(nèi)給出的每個最小數(shù)字界限將包括每個較高的數(shù)字界限，如同在本文中清楚地寫出此類較高的數(shù)字界限。在本說明書通篇范圍內(nèi)給出的每個數(shù)字范圍將包括屬于這種較寬泛數(shù)字范圍內(nèi)的每個較窄的數(shù)字界限，如同在本文中清楚地寫出此類較窄的數(shù)字界限。如本文中所用，術(shù)語"天然存在的"指在自然界中存在的要素和/或過程。如本文中所用，術(shù)語"構(gòu)建體"、"綴合物"、"盒"和"雜交體"包括與另一個序列(例如調(diào)節(jié)序列，如啟動子)直接或間接結(jié)合的核苷酸序列。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了包含與這種調(diào)節(jié)序列有效連接的核苷酸序列的構(gòu)建體。術(shù)語"有效連接的"指其中所述組件處在允許它們以其意圖方式發(fā)揮功能的關(guān)系毗連。與編碼序列"有效連接，，的調(diào)節(jié)序列以這樣的方式連接，從而在與該調(diào)控序列相容的條件下實現(xiàn)編碼序列的表達。如本文中所用，術(shù)語"調(diào)節(jié)序列，，包括啟動子和增強子和其他表達調(diào)節(jié)信號。如本文中所用，術(shù)語"啟動子"按照本領(lǐng)域的常規(guī)意思使用，例如RNA聚合酶結(jié)合位點。在一些實施方案中，構(gòu)建體包含或表達標記物，所述的標記物允許在例如細菌中選擇核苷酸序列構(gòu)建體。存在可以使用的多種標記物，例如提供抗生素/抗孩i生物劑抗性的那些標記物。在一些實施方案中，構(gòu)建體包括載體(例如質(zhì)粒)。在一些其他實施方案中，本發(fā)明提供了包含本文所述的一個或多個構(gòu)建體或序列的載體。如本文中所用，術(shù)語"載體，，包括表達載體、轉(zhuǎn)化載體和穿梭載體。術(shù)語"轉(zhuǎn)化載體，，意指能夠從一種實體轉(zhuǎn)移至另一種實體的構(gòu)建體，其中所迷的實體可以是相同物種或可以是不同物種。能夠從一種物種轉(zhuǎn)移至另一種物種的構(gòu)建體有時候稱作"穿梭載體"。在一些實施方案中，將載體轉(zhuǎn)化到如本文中所述的合適宿主細胞中。在一些實施方案中，所述載體是這樣的質(zhì)?；蚴删w載體，其配有復(fù)制起點、任選地配有表達多核苷酸的啟動子并且任選地配有該啟動子的調(diào)節(jié)物。在一些實施方案中，所述載體含有一個或多個選擇標記核苷酸序列。對工業(yè)微生物最合適的選擇系統(tǒng)是由不要求宿主生物中突變的選擇標記組所形成的那些選擇系統(tǒng)。在一些實施方案中，在體外使用載體(例如用于產(chǎn)生RNA或用來轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細胞)。在一些實施方案中，將多核苷酸摻入重組載體(一般是復(fù)制型載體)，如克隆載體或表達載體。該載體用于在相容性宿主細胞中復(fù)制核酸?？梢酝ㄟ^多種方法將核酸(例如噬菌體、構(gòu)建體或載體)導(dǎo)入細胞。例如，在一些實施方案中，可以使用轉(zhuǎn)導(dǎo)法、轉(zhuǎn)化法、磷酸鈣轉(zhuǎn)染法、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法、陰離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法、電穿孔法、轉(zhuǎn)導(dǎo)法或感染法。實際上，可以在本發(fā)明中使用本領(lǐng)域已知的任意合適方法。在一些實施方案中，含有(借助噬菌體、構(gòu)建體或載體導(dǎo)入的)外源核酸的細胞因使用本領(lǐng)域已知的任意合適方法選擇。在本領(lǐng)域中充分記錄了關(guān)于轉(zhuǎn)化細胞的教導(dǎo)，例如見Sambrook等(Molecularcloning:ALaboratoryManual,第2版，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress)和Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology(1995)，JohnWiley&Sons,Inc。在導(dǎo)入核酸到細胞中的情況下，在一些實施方案中，優(yōu)選術(shù)語"導(dǎo)入"意指轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、接合或轉(zhuǎn)導(dǎo)中的一種或多種情況。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，使細菌菌林(例如親代細菌菌林、變異細菌菌林等)"暴露"于至少一種逸菌體，從而噬菌體核酸被導(dǎo)入此細菌菌林的細胞。如本文中所用，術(shù)語"核酸序列"、"核苷i^f列"和"核酸"指任意核酸序列，包括DNA、RNA、基因組的、合成的、重組的(例如，cDNA)核酸序列。該術(shù)語意圖包括雙鏈和/或單鏈序列，無論是否代表有義鏈或反義鏈或其組合。重組核酸序列通過利用任何合適的重組DNA技術(shù)制備。在一些實施方案中，如本文中所述，提供的核酸序列包括編碼CRISPR、Cas和其他序列的基因序列。實際上，如在本文中所使用，本發(fā)明包括這樣的核#列，其編碼多種CRISPR序列(包括但不限于間隔區(qū)、假間隔區(qū)、前導(dǎo)序列等)以及序列及其他細菌核酸序列和噬菌體("細菌噬菌體，，)核酸序列。術(shù)語"編碼......的核酸分子"、"編碼......的核酸序列"、"編碼......的DNA序列"、"編碼......的DNA"指脫氧核糖核苷酸沿脫氧核糖核酸鏈的次序或順序。這些脫氧核糖核苷酸的次序決定氨基酸沿多肽(蛋白質(zhì))鏈的次序。DNA序列因而編碼氨基酸序列。如本文在導(dǎo)入核酸序列至細胞中的情況下所用，術(shù)語"導(dǎo)入"指適用于將該核酸序列轉(zhuǎn)移到細胞中的任意方法。用于導(dǎo)入的此類方法包括但不限于原生質(zhì)體融合法、轉(zhuǎn)染法、轉(zhuǎn)化法、接合法和轉(zhuǎn)導(dǎo)法。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，核酸通過噬菌體感染細胞后導(dǎo)入受體細胞。在一些實施方案中，本文中提供的核,列和核酸是分離的或基本上純化的。"分離的"或"基本上純化的"意指核酸分子或其生物活性片段或變體、同源物或衍生物是基本上或?qū)嵸|(zhì)上不含這樣的組分，其中通常發(fā)現(xiàn)所述組分與該核酸在天然狀態(tài)下相關(guān)聯(lián)。此類組分包括但不限于其他細胞材料、培養(yǎng)基、來自重組生產(chǎn)的材料和在化學(xué)合成所述核酸中使用的多種化學(xué)品。在一些實施方案中，"分離的"核^列或核酸一般不含在衍生該核酸的生物的基因組中分布在目的核酸側(cè)翼的核酸序列(例如，在5'或3'端存在的編碼序列)。然而，所述分子可以包括不以有害方式影響組分的基本特征的一些額外堿基或部分。如本文中所用，術(shù)語"修飾"指在核酸和/或氨基酸序列內(nèi)部產(chǎn)生的改變。在一些實施方案中，使用基因工程(例如重組)方法完成修飾，而在其他實施方案中，使用天然存在的遺傳機制進行修飾。意圖使用本發(fā)明的方法修飾序列的全部或部分。在一些優(yōu)選的實施方案中，修飾的核酸包括一個或多個天然存在的或重組產(chǎn)生的CRISPR間隔區(qū)、cs基因或蛋白、CRISPR重復(fù)序列、CRISPR基因座以及噬菌體核酸。在本發(fā)明中使用本領(lǐng)域已知的任意合適方法，包括但不限于使用PCR法、克隆法、位點定向誘變法等。實際上，在本發(fā)明中使用市售試劑盒。在一些實施方案中，使用合成的寡核苷酸。在一些實施方案中，使用了這樣的方法如同源重組法(例如，用于插入或缺失CRISPR間隔區(qū))。在一些實施方案中，基因工程包括激活一個或多個核酸序列(例如CRISPR基因座、CRISPR重復(fù)序列、CRISPR間隔區(qū)、cm基因或蛋白、c"s基因或蛋白與CRISPR重復(fù)序列的功能性組合、或它們的組合)。在一些實施方案中，將一個或多個CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)插入至少一個CRISPR基因座。在一些其他實施方案中，所述修飾不破壞至少一個CRISPR基因座的一個或多個ciw基因。在一些實施方案中，一個或多個cm基因保持完整。在一些其他實施方案中，所述修飾不破壞至少一個CRISPR基因座的一個或多個CRISPR重復(fù)序列。在一些實施方案中，一個或多個CRISPR重復(fù)序列保持完整。在一些實施方案中，將一個或多個CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)插入或插到至少一個CRISPR基因座內(nèi)。在一些實施方案中，將一個或多個CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)插在至少一個CRISPR基因座的5，端。在一些實施方案中，修飾包括將至少一個CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)插入細胞(例如受體細胞)。在一些其他實施方案中，修飾包括將一個或多個CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)插入受體細胞的一個或多個CRISPR間隔區(qū)(例如旨在修飾或替換)。在一些實施方案中，細胞的CRISPR間隔區(qū)是相同的，而在其他實施方案中，它們是不同的。在一些實施方案中，修飾包括將源自供體生物的至少一個CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)插入受體細胞。在一些其他實施方案中，修飾包括將源自供體生物的一個或多個CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)在適合修飾或替換受體細胞的一個或多個CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)的條件下插入該受體細胞。在一些實施方案中，將源自供體生物的一個或多個CRISPR間隔區(qū)或《艮CRISPR間隔區(qū)插入細胞的一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列。在一些優(yōu)選的實施方案中，至少一個功能性CRISPR重復(fù)序列-c"s組合在細胞中仍是完整的。在一些其他實施方案中，插入過程毗鄰一個或多個(優(yōu)選兩個或多個)CRISPR間隔區(qū)或假間隔區(qū)發(fā)生。如本文中所用，術(shù)語"毗鄰，，意指在其最廣泛意義上的"鄰近"并且包括"緊鄰于"。因此，在一些實施方案中，"緊鄰于"于受體細胞的一個或多個CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)地插入來自生物的一個或多個CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)。(即如此所述插入CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)，以至于在間隔區(qū)之間不存在間插核苷酸)。在一些其它實施方案中，如此插入CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)，以至于在間隔區(qū)之間存在至少約2個、約3個、約4個、約5個、約6個、約7個、約8個、約9個、約10個、約15個、約20個、約25個、約30個、約35個、約40個、約45個、約50個、約55個、約60個、約65個、約70個、約75個、約80個、約85個、約90個、約95個、約100個、約200個、約300個、約400個、約500個、約600個、約700個、約800個、約卯0個、約1000個、約10,000個、約100,000個或約l，OOO，OOO個或更多個間插核苷酸。在一些其他實施方案中，間插核苷酸稱作"前導(dǎo)序列"。這些術(shù)語在本文可互換地使用。前導(dǎo)序列在不同細菌中可以具有不同長度。在一些實施方案中，前導(dǎo)序列具有至少約20個、約25個、約30個、約35個、約40個、約45個、約50個、約55個、約60個、約65個、約70個、約75個、約80個、約85個、約90個、約95個、約100個、約200個、約300個、約400個或約500個或更多個核苷酸長度。在一些優(yōu)選的實施方案中，前導(dǎo)序列位于最末ois基因(在3'端)與CRISPR基因座的第一CRISPR重復(fù)序列(在5，端)之間。在一些實施方案中，前導(dǎo)序列具有約20-500個核苷酸長度。在一些實施方案中，毗鄰于受體細胞的一個或多個c做基因插入來自供體生物的一個或多個CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)，其中所述ms基因是相同的或不同的。在一些其它實施方案中，毗鄰于受體細胞的相同或不同間隔區(qū)插入來自供體生物的一個或多個CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)。在另一個實施方案中，毗鄰于細胞的相同或不同CRISPR重復(fù)序列分別插入一個或多個CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)-如來自供體生物的一個或多個CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)。在另一個實施方案中，毗鄰于受體細胞的相同或不同基因分別插入一個或多個CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)-如來自供體生物的一個或多個CRISPR間隔區(qū)或布支CRISPR間隔區(qū)。在一些其他實施方案中，提供來自供體生物的一個或多個CRISPR間隔區(qū)的序列，在這樣的條件下受體細胞受到了修飾，以至受體細胞的同源性。在一些實施方案中，CRISPR間隔區(qū)與該供體生物的CRISPR間隔區(qū)具有100%同源性。在一些實施方案中，CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)包含基因組、合成或重組來源的DNA或RNA。在一些實施方案中，CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)是雙鏈的，而在其他實施方案中，它們是單鏈的，無論是否代表有義鏈或反義鏈或其組合。如本文中所述，構(gòu)思了通過使用重組DNA技術(shù)(例如重組DNA)制備CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)。在一些實施方案中，^f務(wù)飾包括將源自供體生物的一個或多個CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)插入基本上敏感細胞的一個或多個CRISPR基因座，其中所述的供體生物基本上抗靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在一些實施方案中，在基本上敏感細胞中的至少兩個CRISPR重復(fù)序列和至少一個基因的功能性組合處或在所述至少兩個CRISPR重復(fù)序列和至少一個ois基因的功能性組合之間發(fā)生插入。在一些實施方案中，修飾包括修飾(例如突變)受體細胞的DNA(例如質(zhì)粒DNA或基因組DNA)，從而在細胞的DNA中產(chǎn)生一個或多個c做基因。在一些實施方案中，使用任意合適的方法，將ois基因克隆到構(gòu)建體、質(zhì)?；蜉d體等中，其隨后轉(zhuǎn)化到細胞中。在一些實施方案中，修飾包括修飾(例如突變)受體細胞的DNA(如質(zhì)粒DNA或基因組DNA),從而在細胞的DNA中產(chǎn)生一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列。在一些實施方案中，使用任意合適的方法，將CRISPR重復(fù)序列克隆到構(gòu)建體、質(zhì)粒或栽體等中，其隨后轉(zhuǎn)化到細胞中。在一些其他實施方案中，修飾包括修飾(例如突變)受體細胞的DNA(例如質(zhì)粒DNA或基因組DNA)，從而在細胞的DNA中產(chǎn)生一個或多個ow-CRISPR重復(fù)序列功能性組合。在一些實施方案中，使用任意合適的方法，將所述ow-CRISPR重復(fù)序列功能性組合克隆到構(gòu)建體、質(zhì)?；蜉d體中，其隨后轉(zhuǎn)化到細胞中。在一些實施方案中，修飾包括修飾(例如突變)受體細胞的DNA(例如質(zhì)粒DNA或基因組DNA)從而在細胞的DNA中產(chǎn)生一個或多個CRISPR間隔區(qū)。在一些實施方案中，使用任意合適的方法，可以將CRISPR間隔區(qū)克隆到構(gòu)建體、質(zhì)?；蜉d體中，其隨后轉(zhuǎn)化到細胞中。在一些優(yōu)選的實施方案中，一個CRISPR間隔區(qū)在側(cè)翼具有兩個CRISPR重復(fù)序列(即，一個CRISPR間隔區(qū)在每一側(cè)具有至少一個CRISPR重復(fù)序列)。在一些實施方案中，修飾包括靠近(例如毗鄰于/緊鄰于)一個或多個c肪基因和/或前導(dǎo)序列插入一個或多個CRISPR間隔區(qū)(例如異源的CRISPR間隔區(qū))。因此，在一些實施方案中，在插入一個或多個CRISPR間隔區(qū)后，維持了天然存在的CRISPR基因座的組織結(jié)構(gòu)。如本文中所用，術(shù)語"耙核酸"指這樣的任意核醋列或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，針對其調(diào)節(jié)細胞(例如受體細胞)的抗性。在一些實施方案中，所述抗性是針對耙核酸序列本身。有利地，這賦予細胞針對衍生耙核酸的供體生物的抗性。因此，在一些實施方案中，將衍生自噬菌體的假CRISPR間隔區(qū)或與所述一個或多個假CRISPR間隔區(qū)互補或同源的CRISPR間隔區(qū)插入受體細胞賦予了針對該噬菌體的抗性。因此，在一些優(yōu)選的實施方案中，將衍生自噬菌體的假CRISPR間隔區(qū)的兩個CRISPR重復(fù)序列或與所述一個或多個假CRISPR間隔區(qū)互補或同源的CRISPR間隔區(qū)插入受體細胞賦予了針對該噬菌體的抗性。在又一方面，提供了用于調(diào)節(jié)受體細胞針對乾核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法。本發(fā)明也提供了用于確定細胞針對耙核酸的抗性譜的方法。如本文中所用，術(shù)語"抗性譜"意指細胞對其敏感或抵抗的一種或多種實體。因此，在一些實施方案中，細胞的抗性i普反映細胞抵抗第一種噬菌體，對第二種噬菌體敏感，抵抗第一種可移動遺傳元件并且對第一種抗生素抗性基因敏感等。在一些實施方案中，檢測和/或?qū)⒓毎麅?nèi)的一個或多個CM基因或蛋白、一個或多個CRISPR重復(fù)序列、一個或多個cw基因、一個或多個cs-CRISPR重復(fù)序列功能性組合、一個或多個CRISPR間隔區(qū)和/或一個或多個CRISPR間隔區(qū)等測序，從而預(yù)測/確定特定細胞的可能抗性謙。在一些其他實施方案中，細胞內(nèi)的一個或多個CRISPR間隔區(qū)被檢測和/或測序，從而預(yù)測/確定特定細胞的可能抗性譜。合適的檢測方法包括但不限于PCR、DNA-DNA雜交、DNA-RNA雜交、DNA微P車列等。實際上，意圖在本發(fā)明中使用任意合適的方法。在其它的實施方案中，使用特定細菌細胞針對一種或多種噬菌體的可能抗性i普作為微生物選擇的溶菌型預(yù)測指標。在一些其他實施方案中，除一個或多個CRISPR間隔區(qū)之外，還對一個或多個c氾基因和/或一個或多個CRISPR重復(fù)序列測序，旨在驗證c做基因-CRISPR重復(fù)序列組合的相容性或鑒定新的成對相容性c做/重復(fù)序列組合。如本文中所用，術(shù)語"調(diào)節(jié)抗性"指抑制、減低、降低、誘導(dǎo)、賦予、恢復(fù)、升高、增加或以另外方式影響細胞針對靼核酸的抗性，這一點根據(jù)上下文取意。如本文中所用，術(shù)語"抗性"不意圖暗示細胞100%抗靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，但包括耐受靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的細胞。如本文中所用，術(shù)語"針對靼核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性"意指賦予針對包含或產(chǎn)生所述靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的細胞或生物(例如噬菌體)的抗性。在一些實施方案中，為賦予針對靶核酸或其表達產(chǎn)物的免疫性或抗性所需要的最少組分是分布在間隔區(qū)側(cè)翼的至少一個c肪基因(或一個Cas蛋白)和至少兩個CRISPR重復(fù)序列。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)(例如賦予或提高)細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法，所述方法包括步驟在生物中鑒定序列(例如保守序列)(優(yōu)選地，對該生物的功能或存活為必需的序列)；制備包含與所鑒定序列同源(例如100%同一)的CRISPR間隔區(qū)；制備包含至少一個cfls基因和至少兩個CRISPR重復(fù)序列連同CRISPR間隔區(qū)的核酸；和(iv)用該核酸轉(zhuǎn)化細胞，因而使細胞抗粑核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。如本文中所用，術(shù)語"保守序列，，在生物中鑒定保守序列的情況下不必定是在其最嚴格意義下的保守，因為來自給定生物的一種序列的知識是充分的。此外，該序列無需是主要實體的部分。然而，在一些實施方案中，該保守序列是對生物或細胞的功能和/或存活和/或復(fù)制和/或感染性等為必需的序列。在一些實施方案中，該保守序列包括解旋酶、引發(fā)酶、頭部或尾部結(jié)構(gòu)蛋白、具有保守結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(例如穴蛋白、細胞溶素和其他蛋白等)或重要噬菌體基因當(dāng)中的保守序列。在一些其他實施方案中，本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)(例如賦予或提高)細胞針對乾核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法，所述方法包括步驟在抗靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的生物中鑒定一個或多個CRISPR間隔區(qū)；制備包含至少一個cfls基因或蛋白和至少兩個CRISPR重復(fù)序列連同已鑒定的一個或多個間隔區(qū)的重組核酸；和用該重組核酸轉(zhuǎn)化細胞，因而使該受體細胞抗靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)(例如賦予或提高)包含至少一個或多個cm基因或蛋白和一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列的細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法，所述方法包括步驟在抗把核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的生物中鑒定一個或多個CRISPR間隔區(qū)；和修飾細胞中一個或多個CRISPR間隔區(qū)的序列，從而CRISPR間隔區(qū)與該生物中的CRISPR間隔區(qū)具有同源性。在一些實施方案中，受體細胞中的一個或多個CRISPR間隔區(qū)被修飾(例如，基因工程化改造)，從而CRISPR間隔區(qū)與基本上抗靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的供體生物中的一個或多個CRISPR間隔區(qū)具有同源性，旨在^f吏細胞抗靶核酸。在一些優(yōu)選的實施方案中，細胞中的一個或多個基因或蛋白和一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列是如本文中所述的功能性組合。所述基因工程方法包括本領(lǐng)域已知的任意合適方法，包括但不限于添加(例如插入)、缺失(例如除去)或修飾(例如突變)細胞中的一個或多個CRISPR間隔區(qū)和/或一個或多個假CRISPR間隔區(qū)的序列，從而CRISPR間隔區(qū)與供體生物的一個或多個CRISPR間隔區(qū)具有同源性(例如經(jīng)所述基因工程后提高的同源性)。這個工程工程化改造步驟導(dǎo)致基本上對耙核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物敏感的細胞基本上抗所述靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在一些其它實施方案中，本發(fā)明提供了用于降低或減低包含至少一個或多個基因或蛋白和一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列的受體細胞針對靼核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法。在一些實施方案中，該方法包括步驟在基本上抗靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的生物中鑒定一個或多個CRISPR間隔區(qū)；和4務(wù)飾細胞中一個或多個CRISPR間隔區(qū)的序列，從而CRISPR間隔區(qū)與該生物中的CRISPR間隔區(qū)具有程度降低的同源性。在其他實施方案中，用于調(diào)節(jié)(例如降低)包含一個或多個c肪基因或蛋白和一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列的細胞針對革巴核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法包括步驟在包含靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的生物中鑒定CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)，其中針對所述生物的抗性待調(diào)節(jié)；和在待調(diào)節(jié)抗性的生物中鑒定CRISPR間隔區(qū)；和修文待調(diào)節(jié)抗性的生物中的RISPR間隔區(qū)的序列，從而該CRISPR間隔區(qū)與包含所述靼核度的同源性，其中針對所述生物的抗性待調(diào)節(jié)。工程化改造基本上抗性細胞中的一個或多個CRISPR間隔區(qū)旨在使細胞對靶核酸敏感。可用的基因工程方法包括但不限于添加(例如插入)、缺失(例如除去)或修飾所迷基本上抗性細胞中的一個或多個功能性CRISPR重復(fù)序列-ow組合或其部分或片段，和/或添加(例如插入)、缺失(例如除去)或<奮飾所述基本上抗性細胞中的一個或多個CRISPR間隔區(qū)或其部分或片段。這個工程化改造步驟導(dǎo)致對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基本上抵抗的細胞變得對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基本上敏感。在一些實施方案中，為了賦予細胞敏感性，構(gòu)思了除去、缺失或^務(wù)飾來自基本上抗性細胞的一個或多個CRISPR間隔區(qū)、一個或多個ow基因或蛋白、一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列和/或一個或多個功能性CRISPR重復(fù)序列-c肪組合，從而不再賦予抗性。在一些實施方案中，制備對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物敏的細胞，從而可以按需要調(diào)節(jié)(例如降低)它們在給定培養(yǎng)物(例如起子培養(yǎng)物)中的水平。因此，在一些實施方案中，開發(fā)了含有兩種或多種細菌菌林的起子培養(yǎng)物，從而該培養(yǎng)物的全部成員對相同物質(zhì)(例如相同的噬菌體)敏感。因此，當(dāng)不再需要該培養(yǎng)物有活力的時間到來時，使此培養(yǎng)物與相同的單一物質(zhì)接觸以殺死該培養(yǎng)物的全部成員。在一些實施方案中，針對一種或多種物質(zhì)(例如噬菌體)調(diào)節(jié)細胞的敏感性，從而該物質(zhì)僅殺死給定培養(yǎng)物中的某個比例的細胞(例如該培養(yǎng)物中約10、約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約卯或約95%的細胞。在一些實施方案中，工程化改造了受體細胞，從而它包含CRISPR間隔區(qū)或?qū)?yīng)于假CRISPR間隔區(qū)的序列，因而使此細胞抗靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。合適地是，工程化改造了細胞，從而CRISPR間隔區(qū)或?qū)?yīng)于假CRISPR間隔區(qū)的序列與功能性c肪基因-CRISPR重復(fù)序列組合如本文中所述一起使用。在一些實施方案中，工程化改造了抗靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的細胞，從性c肪基因-CRISPR重復(fù)序列組合的細胞，從而使細胞抗靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在一些其他實施方案中，確定了抗靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的細胞的一個或多個CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)的序列。隨后工程化改造受體細胞，從而該受體細胞包含CRISPR間隔區(qū)和功能性基因-CRISPR重復(fù)序列組合的序列，因而使細胞抗靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在一些其它實施方案中，制備了來自受體細胞的CRISPR間隔區(qū)和來自相同或不同細胞(例如相同或不同受體細胞)的功能性ois基因-CRISPR重復(fù)序列組合。隨后工程化改造又一種受體細胞，從而該受體細胞包含CRISPR間隔區(qū)序列和功能性ow基因-CRISPR重復(fù)序列組合，因而使細胞抗耙核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在一些實施方案中，所述抗性是抗靶核酸序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(例如耙核酸序列的轉(zhuǎn)錄物，尤其是RNA或mRNA)、轉(zhuǎn)錄物(例如，有義或反義RNA轉(zhuǎn)錄物)或多肽轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在一些實施方案中，這賦予細胞針對衍生所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的供體生物的抗性。在一些實施方案中，靶核苷酸序列包含基因組、合成或重組來源的DNA或RNA。在一些其他實施方案中，該核苷酸序列是雙鏈的，而在其他實施方案中，它是單鏈的，無論是否代表有義鏈或反義鏈或其組合。又在其它的實施方案中，通過使用重組DNA技術(shù)(例如重組DNA)制備該核苷酸序列。在進一步的實施方案中，該核苷酸序列與天然存在的形式相同，而在其他實施方案中中，該核苷酸序列從天然存在的形式衍生。還在其他實施方案中，靶核酸序列從基因衍生。在一些其他實施方案中，靶核*列從基因的變體、同源物、片段或衍生物衍生。在一些優(yōu)選的實施方案中，靶核酸序列是噬菌體的或者是從噬菌體衍生。在一些實施方案中，靶核酸序列從質(zhì)粒DNA衍生。在一些實施方案中，耙核酸序列從可移動遺傳元件衍生。在一些其它實施方案中，耙核酸序列從轉(zhuǎn)座元件或插入序列衍生。還在其它的實施方案中，靼核酸序列從賦予抗性的基因衍生。在一些其他實施方案中，靶核酸序列從賦予抗生素或抗^:生物劑抗性的基因衍生。在一些實施方案中，靶核酸序列從毒力因子衍生。在一些其它實施方案中，靶核^列從毒素、內(nèi)化蛋白或溶血素衍生。在一些實施方案中，靶核酸序列或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從一種或多種細菌衍生。在一些優(yōu)選的實施方案中，使用本發(fā)明的方法和組合物調(diào)節(jié)細菌細胞的抗性。在一些優(yōu)選的實施方案中，靶核苷酸序列從這樣的基因衍生，其中所述基因與細菌中針對質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的抗性相關(guān)。在一些實施方案中，修飾了細胞中的一個或多個CRISPR間隔區(qū)，從而細胞的CRISPR間隔區(qū)與細菌細胞的質(zhì)粒DNA中所含的CRISPR間隔區(qū)和/或假CRISPR間隔區(qū)具有同源性，因而提供針對特定質(zhì)粒的抗性。因此，防止了外來DNA轉(zhuǎn)移到細胞中。在一些優(yōu)選的實施方案中，以質(zhì)粒DNA內(nèi)部的特定區(qū)域為耙標，從而提供針對質(zhì)粒DNA的免疫性。例如，在一些實施方案中，以該質(zhì)粒的復(fù)制起點內(nèi)部的序列或編碼復(fù)制蛋白的基因內(nèi)部的序列為靶標。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，所述方法包括步驟鑒定從細菌細胞的質(zhì)粒DNA衍生的CRISPR間隔區(qū)和/或假CRISPR間隔區(qū)，其中針對所述細菌細胞的抗性待調(diào)節(jié)；和修飾待調(diào)節(jié)抗性的細胞中的CRISPR間隔區(qū)的序列，從而所述細月包的CRISPR間隔區(qū)與前述細菌細胞的質(zhì)粒DNA中所含的CRISPR間隔區(qū)和/或假CRISPR間隔區(qū)具有同源性。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了用于賦予細胞針對質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的抗性的方法，所述方法包括步驟鑒定從質(zhì)粒DNA衍生的CRISPR間隔區(qū)和/或假CRISPR間隔區(qū)；鑒定對該質(zhì)?；旧厦舾械募毎械囊粋€或多個功能性CRISPR重復(fù)序列-c做基因組合；和工程化改造基本上敏感細胞中的一個或多個CRISPR基因座，從而這些CRISPR基因座包含來自該質(zhì)粒的一個或多個CRISPR間隔區(qū)和/或假CRISPR間隔區(qū)，因而使此細胞具有抗性。在一些實施方案中，靶核苷*列從基因衍生，其中所述的基因與針對一種或多種可移動遺傳元件的抗性相關(guān)。在一些實施方案中，從一種或多種可移動遺傳元件衍生的特定CRISPR間隔區(qū)和/或4艮CRISPR間隔區(qū)添加在細胞的CRISPR基因座內(nèi)，從而提供針對可移動遺傳元件(例如轉(zhuǎn)座元件和插入序列)的抗性，因而防止外來DNA轉(zhuǎn)移和遺傳漂變。在一些實施方案中，以轉(zhuǎn)座子和插入序列內(nèi)部的特定區(qū)域為靶標，從而提供針對可移動遺傳元件的免疫性。例如，在一些實施方案中，靶標包括但不限于接合轉(zhuǎn)座子(Tn9/6)、II類轉(zhuǎn)座子(Tn5W)、插入序列(IS26)和轉(zhuǎn)座酶基因。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，所述方法包括步驟鑒定從細胞的一種或多種可移動遺傳元件衍生的CRISPR間隔區(qū)和/或假CRISPR間隔區(qū)，其中針對所述細胞的抗性待調(diào)節(jié)；和l務(wù)飾待調(diào)節(jié)抗性的細胞中的CRISPR間隔區(qū)的序列，從而所述細胞的CRISPR間隔區(qū)和/或假CRISPR間隔區(qū)與前述細胞的可移動遺傳元件中所含的CRISPR間隔區(qū)具有同源性。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了用于賦予細胞針對一種或多種可移動遺傳元件的抗性的方法，所述方法包括步驟鑒定從一種或多種可移動遺傳元件衍生的CRISPR間隔區(qū)和/或假CRISPR間隔區(qū)；鑒定對所述一種或多種可移動遺傳元件基本上敏感的細胞中的一個或多個功能性CRISPR重復(fù)序列-c^基因組合；和工程化改造基本上敏感細胞中的一個或多個CRISPR基因座，從而這些CRISPR基因座包含來自所述一種或多種可移動遺傳元件的一個或多個CRISPR間隔區(qū)和/或假CRISPR間隔區(qū)或與之具有同源性，以使此細胞具有抗性。在一些實施方案中，靶核苷酸序列從基因衍生，其中所述基因與抗生素和/或抗微生物劑的抗性相關(guān)。如本文中所用，術(shù)語"抗微生物劑"指殺死微生物或抑制其生長或繁殖的任意組合物。意圖該術(shù)語應(yīng)當(dāng)包括抗生素(即由其他微生物產(chǎn)生的組合物)，以及合成產(chǎn)生的組合物。抗微生物劑抗性基因包4舌4旦不限于6/a<em、6/flr06、6/flsftv、a"d丑、""cC7、"ficC2、flwicC、<wic^4、附ec/i、vaw^、wm好、vaw乂、sat4、acrCy4-a/;/^r、v^、vga、wwv4sw/和/或抗孩i生物劑抗性基因包括從細菌物種獲得的那些抗孩史生物劑抗性基因，所述的細菌物種包括但不限于埃希氏菌屬、克雷伯氏菌屬、假單胞菌屬、變形菌屬、鏈球菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、嗜血桿菌屬(/y"e/iio/;/fi'/附)和莫拉氏菌屬(肘^";^//")。抗微生物劑抗性基因包括從細菌物種獲得的那些抗微生物劑抗性基因，所述的細菌物種包括但不限于大腸桿菌(Esc/ier/c/^flco//)、肺炎克雷伯氏菌(1/^5^//"/7"^附<"|7^)、銅綠假單胞菌(jRsew^附owffs"er"g/w仍a)、奇異變形桿菌(/^ofe"s附/m6/Ws)、肺炎鏈球菌(&fl/7/^/ococcws/we"附o/i/"e)、金黃色葡萄球菌(&"http://^/ococc"sfl""附)、表皮葡萄球菌(/S似p/^/0C0CC附印/fifef7IMV/is)、糞腸球菌(￡>lfe/YC0CC"S/fl"tf//s)、腐生葡萄球菌(5Y"http://^tococc"ssa/r印/^ftc附)、酉良膿鏈球菌C^flpAj;/tf/7j;0gew")、流感嗜血桿菌(/f"e附0/^,7附/"/7股"^0和卡他莫拉菌(^^^0^//"c"^rA"fc)。在一些實施方案中，在受體細胞的CRISPR基因座內(nèi)添加從抗微生物劑抗性編碼基因衍生的特定CRISPR間隔區(qū)和/或假CRISPR間隔區(qū)，在這樣的條件下防止了抗性基因轉(zhuǎn)移。因此，減低了獲得抗微生物劑抗性基因(即標記)的風(fēng)險。在一些實施方案中，靶標也包括va"及(即萬古霉素抗性)、fe伙(即四環(huán)素抗性)和/或提供p-內(nèi)酰胺酶抗性的抗性因子。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了這樣的方法，所述方法包括步驟鑒定從包含一個或多個抗微生物劑抗性基因或標記的細胞衍生的一個或多個CRISPR間隔區(qū)和/或假CRISPR間隔區(qū)；和修飾不包含或不表達所述抗微生物劑抗性基因或標記的細胞中的CRISPR間隔區(qū)的序列，從而細胞的CRISPR間隔區(qū)與在包含一個或多個抗樣支生物劑抗性基因或標記的細月包中所含的一個或多個CRISPR間隔區(qū)和/或假CRISPR間隔區(qū)具有同源性。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)細胞中獲得抗微生物劑抗性標記的方法，所述方法包括步驟鑒定從包含一個或多個抗微生物劑抗性基因或標記的細胞衍生的一個或多個CRISPR間隔區(qū)和/或假CRISPR間隔區(qū)；鑒定不包含或不表達所述抗微生物劑抗性基因或標記的細胞中的一個或多個CRISPR基因座；和修飾不包含或不表達所述抗微生物劑抗性基因或標記的細胞中的CRISPR間隔區(qū)的序列，從而所述CRISPR間隔區(qū)和/或假CRISPR間隔區(qū)與抵抗賦予針對一種或多種抗微生物劑的抗性基因轉(zhuǎn)移的細胞中所含的CRISPR間隔區(qū)具有同源性。在一些實施方案中，靶核苷^列從與毒力因子關(guān)聯(lián)的至少一個基因衍生。在一些實施方案中，在細菌CRISPR基因座內(nèi)添加從編碼毒力因子的基因衍生的特定CRISPR間隔區(qū)和/或假CRISPR間隔區(qū)以提供針對賦予毒力基因轉(zhuǎn)移到細菌中的抗性。在一些實施方案中，以通常提供(例如病原體中)微生物毒力的因子如毒素、內(nèi)化蛋白、溶血素和其他毒力因子為靶標。本發(fā)明還提供了這樣的方法，所述方法包括步驟鑒定從包含一種或多種毒力因子的細胞衍生的一個或多個CRISPR間隔區(qū)和/或假CRISPR間隔區(qū)；和修"飾不包含或不表達所迷毒力因子或標記的細胞中的CRISPR間隔區(qū)的序列，從而細胞的CRISPR間隔區(qū)與在包含一種或多種毒力因子的細胞中所含的一個或多個CRISPR間隔區(qū)和/或假CRISPR間隔區(qū)具有同源性。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了用于賦予細胞針對一種或多種毒力因子或標記的抗性的方法，所述方法包括步驟鑒定從一種或多種毒力因子或標記衍生的CRISPR間隔區(qū)和/或假CRISPR間隔區(qū)；鑒定對所述一種或多種毒力因子或標記基本上敏感的細胞中的一個或多個功能性CRISPR重復(fù)序列-c^基因組合；和工程化改造基本上敏感細胞中的一個或多個CRISPR基因座，從而這些CRISPR基因座包含來自所述一種或多種毒力因子或標記的一個或多個CRISPR間隔區(qū)和/或假CRISPR間隔區(qū)，以^_此細胞具有抗性。本發(fā)明包括變體、同源物、衍生物和其片段的用途，所述的變體、同源物、衍生物和其片段包括CRISPR基因座、CRISPR間隔區(qū)、假CRISPR間隔區(qū)、cm基因或蛋白、CRISPR重復(fù)序列、功能性CRISPR重復(fù)序列-(^基因組合和靶核#列或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的變體、同源物、衍生物和片段。術(shù)語"變體"用來意指不同于野生型序列的天然存在的多肽或核苷#列。術(shù)語"片段，，表明多肽或核苷列包含野生型序列的一部分。它可以包含序列的一個或多個大的連續(xù)區(qū)段或多個小區(qū)段。該序列也可以包含序列的其他元件，例如，它可以是與另一蛋白質(zhì)的融合蛋白。優(yōu)選地，該序列包含至少50%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少80V。、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少96%、更優(yōu)選至少97%、更優(yōu)選至少98%、最優(yōu)選至少99%的野生型序列。優(yōu)選地，所述片段保留野生型多肽或核苷酸序列的50%、更優(yōu)選60%、更優(yōu)選70%、更優(yōu)選80%、更優(yōu)選85%、更優(yōu)選90%、更優(yōu)選95%、更優(yōu)選96%、更優(yōu)選97%、更優(yōu)選98%或最優(yōu)選99%活性。優(yōu)選地，CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)包含至少50%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少96%、更優(yōu)選至少97%、更優(yōu)選至少98%、最優(yōu)選至少99%的野生型序列。優(yōu)選地，CRISPR間隔區(qū)保留野生型多肽或核苷酸序列的50%、更優(yōu)選60%、更優(yōu)選70%、更優(yōu)選80%、更優(yōu)選85%、更優(yōu)選卯％、更優(yōu)選95%、更優(yōu)選96%、更優(yōu)選97%、更優(yōu)選98%或最優(yōu)選99%活性。優(yōu)選地，ms基因包含至少50%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少卯％、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少96%、更優(yōu)選至少97%、更優(yōu)選至少98%、最優(yōu)選至少99%的野生型序列。優(yōu)選地，c氾基因保留野生型多肽或核苷酸序列的50%、更優(yōu)選60%、更優(yōu)選70%、更優(yōu)選80%、更優(yōu)選85%、更優(yōu)選卯％、更優(yōu)選95%、更優(yōu)選96%、更優(yōu)選97%、更優(yōu)選98%或最優(yōu)選99%活性。優(yōu)選地，Cas蛋白包含至少50%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少卯％、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少96%、更優(yōu)選至少97%、更優(yōu)選至少98%、最優(yōu)選至少99%的野生型序列。優(yōu)選地，Ow蛋白保留野生型多肽或核苷酸序列的50%、更優(yōu)選60%、更優(yōu)選70%、更優(yōu)選80%、更優(yōu)選85%、更優(yōu)選卯％、更優(yōu)選95%、更優(yōu)選96%、更優(yōu)選97%、更優(yōu)選98%或最優(yōu)選99%活性。優(yōu)選地，CRISPR重復(fù)序列包含至少50%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少96%、更優(yōu)選至少97%、更優(yōu)選至少98%、最優(yōu)選至少99%的野生型序列。優(yōu)選地，CRISPR重復(fù)序列保留野生型多肽或核苷酸序列的50%、更優(yōu)選60%、更優(yōu)選70%、更優(yōu)選80%、更優(yōu)選85%、更優(yōu)選90%、更優(yōu)選95%、更優(yōu)選96%、更優(yōu)選97%、更優(yōu)選98%或最優(yōu)選99%活性。優(yōu)選地，功能性CRISPR重復(fù)序列-c肪組合包含至少50%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少96%、更優(yōu)選至少97%、更優(yōu)選至少98%、最優(yōu)選至少99%的野生型序列。優(yōu)選地，功能性CRISPR重復(fù)序列-cas組合保留野生型多肽或核苷酸序列的50%、更優(yōu)選60%、更優(yōu)選70%、更優(yōu)選80%、更優(yōu)選85%、更優(yōu)選90%、更優(yōu)選95%、更優(yōu)選96%、更優(yōu)選97%、更優(yōu)選98%或最優(yōu)選99%活性。優(yōu)選地，靶核酸序列包含至少50%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少卯％、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少96%、更優(yōu)選至少97%、更優(yōu)選至少98%、最優(yōu)選至少99%的野生型序列。優(yōu)選地，靶核酸序列保留野生型多肽或核苷酸序列的50%、更優(yōu)選60%、更優(yōu)選70%、更優(yōu)選80%、更優(yōu)選85%、更優(yōu)選90%、更優(yōu)選95%、更優(yōu)選96%、更優(yōu)選97%、更優(yōu)選98°/。或最優(yōu)選99%活性。在一些實施方案中，片段是功能性片段。分子的"功能性片段"理解為基本上保留或擁有與該完整分子相同的生物學(xué)活性的片段。在全部情況下，分子的功能性片段保留該完整分子的至少10%和至少約25%、約50%、約75%、約80%、約85%、約卯％、約95%、約96%、約97%、約98%或約99。/。的生物學(xué)活性。術(shù)語"同源物"意指與主題氨基酸序列和主題核苷酸序列具有某種程度同源性的實體。這里，術(shù)語"同源性，，可以等同于"同一性"。在上下文中，同源序列意指包括這樣的氨基酸序列，其可以與主*列至少75、85或90%同一、優(yōu)選地至少95%、96%、97%、98%或99%同一。盡管同源性也可以就相似性方面進行考慮(即具有相似化學(xué)屬性/功能的氨基酸殘基)，在本發(fā)明上下文中，優(yōu)選就序列同一性方面表述同源性。在上下文中，同源序列意指包括這樣的核苷酸序列，其可以與主*列至少75、85或90%同一、優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99%同一。盡管同源性也可以就相似性方面進行考慮(即具有相似化學(xué)屬性/功能的氨基酸殘基)，在本發(fā)明上下文中，優(yōu)選就序列同一性方面表述同源性。同源性比較可以通過肉眼或更常見地借助輕易可獲得的序列比較程序進行。這些市售計算機程序可以計算兩個或多個序列之間的同源性百分數(shù)?？梢栽谶B續(xù)序列范圍內(nèi)計算同源性百分數(shù)(％)(即一個序列與另一個序列比對并且一個序列中的每個氨基酸與另一個序列中的相應(yīng)氨基酸直接比較，一次一個殘基)。這叫做"無空位，，比對。一般，這類無空位比對僅在相對小數(shù)目的殘基范圍內(nèi)進行。盡管這是極其簡單和一致的方法，然而它沒有考慮當(dāng)進行全局比對時，例如在否則是相同的序列對中，一個插入或缺失將導(dǎo)致后續(xù)氣基酸殘基,皮排出比對，因此可能同源性百分數(shù)大大降低。因此，大部分序列比較方法設(shè)計旨在產(chǎn)生優(yōu)化比對結(jié)果，所述的優(yōu)化比對結(jié)果考慮了可能的插入和缺失，而沒有不當(dāng)?shù)貙φw同源性分值進行罰分。通過在序列比對中插入"空位，，以使局部同源性最大化而做到這一點。然而，這些較復(fù)雜的方法將"空位罰分"賦予比對結(jié)果中出現(xiàn)的每個空位，從而對相同數(shù)目的相同氨基酸而言，具有盡可能少的空位的序列比對結(jié)果-這反映比較的兩個序列之間的較高相關(guān)性—將比具有眾多空位的序列實現(xiàn)更高的評分。通常使用"親合空位成本(Affinegapcost)"，其中所述的親合空位成本對空位的存在要求相對高的成本并且對空位中的每個后續(xù)殘基要求較小罰分。這是最常用的空位評分系統(tǒng)。高空位罰分當(dāng)然將產(chǎn)生具有較少空位的優(yōu)化比對結(jié)果。大多數(shù)比對結(jié)果程序允許調(diào)整空位罰分。然而，使用此類軟件用于序列比較時，優(yōu)選使用默認值。例如，使用GCGWisconsinBestfit軟件包時，氨基酸序列的默認空位罰分是空位-12和每個延伸-4。計算最大同源性百分數(shù)因而首先要求在考慮空位罰分的情況下產(chǎn)生最佳比對結(jié)果。用于開展此類比對的合適計算機程序是GCGWisconsinBestfit軟件包(美國威斯康辛大學(xué)；Devereux等人，1984，7V"c/e/c爿"Vfcinward12:387)。可以執(zhí)行序列比較的其他軟件的實例包括但不限于BLAST軟件包(見Ausubd等人，1999，同上文-第18章)、FASTA(Atschul等人，1990，J.Mol.Biol.，403-410)、GENEWORKS套裝比較工具和CLUSTAL。BLAST和FASTA均可用于離線和在線搜索(見Ausubel等人，1999，同上文，第7-58頁至第7-60頁)。然而，對于一些應(yīng)用，優(yōu)選使用GCGBestfit程序。稱作BLAST2Sequences的一個新工具也可用于比較蛋白質(zhì)和核苷酸序列(見FEMSMicrobiolLett1999174(2):247-50;FEMSMicrobiolLett1999177(1):187-8)。盡管可以就同一性方面測定最終的同源性百分數(shù)，然而比對過程本身一般不基于全或無配對比較。相反，通常使用比例相似性評分矩陣，該評分矩陣基于化學(xué)相似性或進化距離對每個成對比較結(jié)果分配評分。此類通常使用的矩陣的實例是BLOSUM62矩陣-即程序BLAST套裝的默認矩陣。GCGWisconsin程序通常使用公共默認值，或者若提供了定制符號比較表的話，使用定制符號比較表(詳細信息見用戶手冊)。對于一些應(yīng)用，優(yōu)選使用GCG軟件包的7>共默認值，或在其他軟件的情況下，優(yōu)選使用默認矩陣-如BLOSUM62。一旦軟件已經(jīng)產(chǎn)生最佳比對結(jié)果，則可能計算同源性百分數(shù)，優(yōu)選序列同一性百分數(shù)。軟件一般將此作為序列比較的一部分并產(chǎn)生數(shù)字結(jié)果。確定序列同一性時，應(yīng)當(dāng)使用空位罰分，隨后適度地使用以下^t:對于BLAST空位開口0空位延伸0對于CLUSTALDNA蛋白質(zhì)字大小21Ktriple空位罰分1010空位延伸0.10.1對于多肽序列比較，可以使用以下設(shè)置空位產(chǎn)生罰分3.0和空位延伸罰分O.l。適度地，同一性程度就氨基酸序列而言在至少5個連續(xù)氨基酸范圍內(nèi)確定，在至少10個連續(xù)氨基酸范圍內(nèi)、在至少15個連續(xù)氨基酸范圍內(nèi)、在至少20個連續(xù)氨基酸范圍內(nèi)、在至少30個連續(xù)氨基酸范圍內(nèi)、在至少40個連續(xù)氨基酸范圍內(nèi)、在至少50個連續(xù)氨基酸范圍內(nèi)或在至少60個連續(xù)氨基酸范圍內(nèi)確定。序列也可以具有氨基酸殘基的缺失、插入或替代，這產(chǎn)生沉默改變并且產(chǎn)生功能等同的物質(zhì)?？梢曰跉埢鶚O性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性本質(zhì)的相似性進行人為氨基酸替代，只要此物質(zhì)的二級結(jié)合活性仍保留。例如，帶負電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；并且具有相似親水性值的具有不帶電荷極性首基的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以例如根據(jù)下表進行保守性替代。在第二列中處于相同格內(nèi)并且優(yōu)選處于第三列相同行中的氨基酸可以互相替代。<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>說法以意指以備選殘基交換現(xiàn)有的氨基酸殘基)，即相似對相似的替代-如堿性對堿性，酸性對酸性、極性對極性等。也可以進行非同源替代，即來自一個類別的殘基對另一個類別的殘基或備選地涉及包括非天然氨基酸-如鳥氨酸(以下稱作Z)、二氨基丁酸鳥氨酸(以下稱作B)、正亮氨酸鳥氨酸(以下稱作O)、吡咬基甘氨酸、噻吩基甘氨酸、萘基甘氨酸和苯基甘氨酸。也可以由非天然氨基酸進行替換，所述的非天然氨基酸包括；0^和a-雙取代*氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的鹵化衍生物-如三氟酪氨酸*、p-Cl-苯丙氨酸*、p-Br-苯丙氨酸*、p-I-苯丙氨酸*、L-烯丙基-甘氨酸*、B-丙氨酸*、L-a-氨基丁酸*、L-y-氨基丁酸*、L-a-氨基異丁酸*、L-s-氨基己酸弁、7-氨基庚酸*、L-曱疏氨酸砜弁*、L-正亮氨酸*、L-正纈氨酸*、p-硝基丄-苯丙氨酸*、L-羥脯氨酸弁、L-疏代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物-如4-甲基-Phe、五甲基-Phe*、L-Phe(4-絲)#、L-Tyr(甲基)*、L-Phe(4-異丙基)*、L-Tic(1,2，3，4-四氬異會啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸#和L-Phe(4-節(jié)基)*。出于上文討論的目的(涉及同源替代或非同源替代)，注釋*用來表示衍生物的疏水性質(zhì)，而#用來表示所述衍生物的親水性質(zhì)，#*表示兩親性特征。變異氨基酸序列包含了適于在該序列的任意兩個氨基酸殘基之間插入的合適間隔基團，除了氨基酸間隔區(qū)外-如甘氨酸或P-丙氨酸殘基外，所述間隔基團還包括烷基如曱基、乙基或丙基。本領(lǐng)域技術(shù)人員將完全理解，變異的另一個形式包括一個或多個氨基酸殘基以擬肽形式存在。為避免疑問，"擬肽形式，，用來指其中a-碳取代基位于該殘基的氮原子上而非a-碳上的變異氨基酸殘基。用于制備擬肽形式的肽的方法是本領(lǐng)域熟知的。本發(fā)明中所用的核苷酸序列可以在其中包括合成的或修飾的核苷酸。眾多不同類型的寡核苷酸J'務(wù)飾法是本領(lǐng)域已知的。這些j務(wù)飾包括磷酸曱酯和疏代磷酸酯主鏈和/或在分子的3'和/或5，端添加吖啶或聚賴氨酸鏈。出于本發(fā)明的目的，應(yīng)當(dāng)理解可以通過本領(lǐng)域中可用的任意方法修飾核苷酸序列?？梢詫嵤┐祟愋揎梺碓鰪姳景l(fā)明中有用的核苷#列的體內(nèi)活性或壽命。CRISPRsCRISPR(成簇的有關(guān)見律間隔的短回文重復(fù)序列)；又稱作SPIDR(間隔區(qū)散在的同向重復(fù)序列)構(gòu)成一個新近描述的DNA基因座家族，其通常是特定細菌物種特有的。CRISPR基因座是最初在大腸桿菌中認知到的一類獨特的散置短序列重復(fù)序列(SSRs)(Ishino等人，J.BacterioL，169:5429-5431987；和Nakata等人，J.Bacteriol"171:3553-3556[1989)。已經(jīng)在地中海富鹽菌(/fflto/emx附e&term"e/)、釀膿鏈球菌、魚腥藻(Jfm6MWff)和結(jié)核分支桿菌(A0^6tfcteWM附似^rcr"/^/力中鑒定到相似的散置SSR(見，Groenen等人，Mol.Microbiol.，10:1057-101993；Hoe等人，Emerg.Infect.Dis"5:254-21999；Mas印ohl等人，Biochim.Biophys.Acta1307:26-30[1996];和Mojica等人，Mol.Microbiol"17:85-93[1995)。CRISPR基因座與其他SSR的不同在于重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)，其中所述的重復(fù)序列已經(jīng)被命名為有規(guī)律間隔的短重復(fù)序列(SRSR)(J等人，OMICSJ.Integ.Biol"6:23-33[2002；和Mojica等人，Mol.Microbiol"36:244-246[20001)。重復(fù)序列是成簇存在的短元件，所述短元件總是被具有恒定長度的獨特間插序列有規(guī)律地隔開(上文的Mojica等人，20001)。雖然所述重復(fù)序列在菌林之間是高度保守的，然而散置重復(fù)序列的數(shù)目和間隔區(qū)的序列在菌林間彼此不同(vanEmbden等人，J.Bacteriol.，182:2393-2401[2000)。CRISPR基因座由通常24至40bp的短且高度保守的部分回文DNA重復(fù)序列組成，其中所述的部分回文DNA重復(fù)序列含有多達11bp的內(nèi)部和末端反向重復(fù)序列。已經(jīng)報道這些重復(fù)序列出現(xiàn)1至140次。盡管已經(jīng)檢測了分離的元件，然而它們通常排列在重復(fù)單元簇(每基因組多達約20或更多個簇)中，其中所迷的重復(fù)單元簇由20-58bp的獨特間插序列隔開。迄今，已經(jīng)在單條染色體內(nèi)找到多達20個不同的CRISPR基因座。CRISPR通常在給定基因組內(nèi)部是均一的，同時它們大部分是相同的。然而，存在不均一性的實例，例如在古細菌(Archaea)中(上文的Mojica等人，[2000)。如本文中所用，術(shù)語"CRISPR基因座"指包括全部CRISPR重復(fù)序列的DNA節(jié)段，其中所述DNA節(jié)段始于第一CRISPR重復(fù)序列的第一核苷酸并以最末(末端)CRISPR重復(fù)序列的最末核苷酸結(jié)尾。雖然CRISPR基因座的生物學(xué)功能是未知的，已經(jīng)提出一些假設(shè)。例如，已經(jīng)提出它們可以參與染色體與細胞結(jié)構(gòu)的結(jié)合，或參與染色體復(fù)制和復(fù)制子分配(Jansen等人，OMICS6:23-33[2002；Jansen等人，Mol.Microbiol"43:1565-1575[2002；和Pourcel等人，Microbiol"151:653-663[2005)。Mojica等(Mojica等人，J.Mol.Evol"60:174-182[2005)假設(shè)CRISPR可以參與賦予針對外來DNA的特異免疫性并且Pourcel等(上文)假設(shè)CRISPR是能夠攫取外來DNA碎片作為防雄卩機制的一部分的結(jié)構(gòu)。Bolotin等(上文)提出CRISPR間隔區(qū)元件是染色體外元件過去入侵的蹤跡，并且4艮設(shè)它們通過編碼反義RNA為細胞提供針對噬菌體感染并且更一般地針對外來DNA表達的免疫性。Bolotin等(上文)還提出cas基因?qū)τ贑RISPR形成是必需的。然而，不意圖使本發(fā)明限于任何特定機制、功能、理論以及作用方式。嗜熱鏈球菌LMG18311的基因組含有3個CRISPR基因座；36-bp重復(fù)序列在CRISPR1(34個重復(fù)序列)、CRISPR2(5個重復(fù)序列)和CRISPR3(單個序列)中是不同。然而，它們優(yōu)選地在每個基因座中是保守的。CRISPR1和CRISPR2重復(fù)序列分別由30bp長度的33個和4個序列分隔。全部這些分隔性序列是彼此不同的。它們也不同于在菌抹CNRZ1066(在CRISPR1內(nèi)的41個分隔性序列)和菌林LMD-9(在CRISPR1內(nèi)的16個分隔性序列和在CRISPR3內(nèi)的8個分隔性序歹'J)存在的那些分隔性序列，其中所述兩個菌林均是嗜熱鏈球菌。用于鑒定CRISPR基因座的多種方法是本領(lǐng)域已知的。例如，Jensen等(上文的Jensen等人，[2002)描述了一種基于計算機的方法，其中使用位于美國伊利諾伊州阿貢地區(qū)阿貢國家實驗室數(shù)學(xué)與計算機科學(xué)部服務(wù)器的PATSCAN程序搜索核苷紗列的CRISPR基序。用于鑒定CRISPR基序的算法是pl=fl...6c..^/plc...flfplc..."pl，其中flr和6是重復(fù)序列大小的下限值和上限值，并且pl和c和d是間隔區(qū)序列大小的下限值和上限值。tf、6、c和d的值可以從約15至約70bp以約5bp增量變化。在一些優(yōu)選的實施方案中，使用點陣圖(dotplot)(例如通過使用Dotter計算機程序)鑒定CRISPR基因座。本領(lǐng)域已知的任意合適方法可用于分析序列相似性。例如，如本領(lǐng)域已知，可以使用NCBIBLAST連同微生物基因組數(shù)據(jù)庫和GenBank進行分析。另外，核苷酸序列，包括本文中提供的那些核苷酸序列容納于數(shù)據(jù)庫中(例如，GenBank或JGI基因組網(wǎng)站)。如本文中所用，"上游，，意指5'方向并且"下游"意指3'方向。在其它的實施方案中，本發(fā)明的方法使用擴增方法(見例如，上文的Mojica等人，2005；和上文的Poured等人，2005)。擴增DNA的所需區(qū)域可以通過包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)在內(nèi)的本領(lǐng)域已知的任意方法完成。"擴增"指產(chǎn)生核酸序列的額外拷貝。通常使用本領(lǐng)域熟知的PCR技術(shù)實施這個過程。"聚合酶鏈反應(yīng)"("PCR")是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在本發(fā)明中，設(shè)計寡核苷酸引物以用在PCR反應(yīng)中擴增完整或部分的CRISPR基因座。術(shù)語"引物"指這樣的寡核苷酸，無論天然存在(如在純化的限制性消化產(chǎn)物中)或合成產(chǎn)生，其中當(dāng)置于這樣的條件(即在核苷酸和誘導(dǎo)物質(zhì)(如DNA聚合酶)存在時并在適宜的溫度和pH)下時，所述寡核苷酸能夠充當(dāng)合成的起始點，其中在所述條件下誘導(dǎo)了與一條核酸鏈互補的引物延伸產(chǎn)物的合成。在一些實施方案中，為擴增中的最大效率，引物是單鏈的，不過在其他實施方案中，引物是雙鏈的。在一些實施方案中，引物是寡脫氧核糖核苷酸。引物必須具有足夠的長度以在誘導(dǎo)物質(zhì)存在下引發(fā)延伸產(chǎn)物合成。引物的確切長度取決于眾多因素，這包括溫度、引物來源和所使用的方法。PCR引物一般是至少約IO個核苷酸長度，和最常見是至少約20個核苷酸長度。用于設(shè)計和開展PCR的方法是本領(lǐng)域熟知的，并且包括但不限于使用成對引物、巢式引物、單特異性引物、簡并引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分錯配引物等的方法。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案中，使用本領(lǐng)域已知的任意合適方法比較來自親代細菌和標記細菌的CRISPR基因座或其部分。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案中，來自親代細菌和標記細菌的CRISPR基因座或其部分通過擴增CRISPR基因座或其部分進行比較。除了熟知的循環(huán)擴增方法(例如PCR、連接酶鏈反應(yīng)等)之外，在本發(fā)明中還使用其他方法，包括但不限于等溫擴增方法。在本發(fā)明中使用的熟知的等溫擴增方法包括但不限于鏈置換擴增(SDA)、Q-P-復(fù)制酶、基于核酸的序列擴增(NASBA)法和自我維持的序列復(fù)制法。在本發(fā)明的一些其他優(yōu)選實施方案中，來自親代細菌和標記細菌的來自親代細菌和標記細菌的CRISPR基因座或其部分通過擴增并隨后對CRISPR基因座或其部分測序進行比較。在一些實施方案中，比較了CRISPR基因座的一端，而在其他實施方案中，比較了該基因座的5'和3，端。在一些優(yōu)選的實施方案中，比較了CRISPR基因座的一端(例如5，端)。又在其他實施方案中，比較了在CRISPR基因座3'端的至少最末CRISPR重復(fù)序列和/或在CRISPR基因座3'端的至少最末CRISPR間隔區(qū)(例如最末CRISPR間隔區(qū)核心)和/或在CRISPR基因座5'端的至少第一CRISPR重復(fù)序列和/或在CRISPR基因座5'端的至少第一CRISPR間隔區(qū)(例如第一CRISPR間隔區(qū)核心)。在一些優(yōu)選的實施方案中，比較了在CRISPR基因座5，端的至少第一CRISPR重復(fù)序列和/或在CRISPR基因座5'端的至少第一CRISPR間隔區(qū)(例如第一CRISPR間隔區(qū)核心)。在一些額外的優(yōu)選實施方案中，比較了在CRISPR基因座3'端的至少最末CRISPR間隔區(qū)(例如最末CRISPR間隔區(qū)核心)和/或在CRISPR基因座5'端的至少第一CRISPR間隔區(qū)(例如第一CRISPR間隔區(qū)核心)。在一些其他的優(yōu)選實施方案中，比較了在CRISPR基因座5，端的至少第一CRISPR間隔區(qū)(例如第一CRISPR間隔區(qū)核心)。在一些實施方案中，該CRISPR基因座包含DNA，而在其他實施方案中，該CRISPR基因座包含RNA。在一些實施方案中，核酸U因組來源的，而在其他實施方案中，它是合成或重組來源的。在一些實施方案中，CRISPR基因座是雙鏈的，而在其他實施方案中，它們是單鏈的，無論是否代表有義鏈或反義鏈或其組合。在一些實施方案中，本文中所述，通過使用重組DNA技術(shù)(例如重組DNA)制備CRISPR基因座。本發(fā)明也提供了用于產(chǎn)生CRISPR變體的方法。使用本領(lǐng)域已知的任意合適方法表達、分離、克隆和/或?qū)@些變體測序。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，CRISPR變體是這樣的噬菌體抗性突變菌林，其具有帶額外間隔區(qū)的經(jīng)修飾的CRISPR基因座。在一些其它實施方案中，這些變體用作耙標，用于檢測/鑒定目的或用于工程化改造針對核酸分子的抗性。在進一步的實施方案中，這些變體用于開發(fā)生物控制劑。在本發(fā)明的上下文中，CRISPR基因座具有如下文所述的定向。CRISPR前導(dǎo)序列是具有定義大小的保守DNA節(jié)段。使用以下特征建立嗜熱鏈球菌CRISPR1基因座的定向。CRISPR與相鄰cm(CRISPR相關(guān)序歹'j)基因的相對位置；CRISPR1位于4個cfls基因(CNRZ1066染色體序列內(nèi)部的基因str0657、str0658、str0659和str0660)的下游。這種重復(fù)序列具有形成發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)的潛能，盡管它不是完全回文的，并且反向互補序列(5-GTTGTACAGTTACTTAAATCTTGAGAGTACAAAAAC畫3';SEQIDNO:695)不同于正向序列(5'-GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAAC-3';SEQIDNO:l)。通常，該正向序列的5，端比所述反向互補序列的5'端含有更多的核苷酸G和T。此外，由于G-T堿基配對作用優(yōu)于A-C堿基配對作用，故該發(fā)夾結(jié)構(gòu)通常在正鏈上更堅固；并且如本文中所用，末端重復(fù)序列的位置是在其3，端顯示序列變異的末端重復(fù)序列。CRISPR前導(dǎo)序列是具有定義大小的保守DNA節(jié)段，其緊鄰第一重復(fù)序列的上游定位。例如，嗜熱鏈球菌CRISPR1的前導(dǎo)序列是緊鄰基因str0660的終止密碼子后開始并正好在第一重復(fù)序列之前結(jié)束的DNA節(jié)段。CRISPR前導(dǎo)序列位于CRISPR基因座的5，端。CRISPR前導(dǎo)序列緊鄰CRISPR基因座的第一CRISPR重復(fù)序列的上游定位。CRISPR非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)是具有定義大小的保守DNA節(jié)段，其緊鄰末端重復(fù)序列的下游定位。例如，嗜熱鏈球菌CRISPR1的非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)序列是緊鄰末端重復(fù)序列后開始并正好在(位于相對DNA鏈上的)基因str0661的終止密碼子之前結(jié)束的DNA節(jié)段。CRISPR非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)位于CRISPR基因座的3，端。CRISPR非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)緊鄰末端重復(fù)序列的下游定位。例如，嗜熱鏈球菌菌林CNRZ1066的CRISPR1基因座中的CRISPR前導(dǎo)序列和CRISPR非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)序列是CRISPR前導(dǎo)序列5'-CAAGGACAGTTATTGATTTTATAATCACTATGTGGGTATAAAAACGTCAAAATTTCATTTGAG畫3'(SEQIDNO:688)CRISPR非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)5'-TTGATTCAACATAAAAAGCCAGTTCAATTGAACTTGGCTTT-3'(SEQIDNO:691)CRISPR前導(dǎo)序列對應(yīng)于嗜熱鏈球菌全基因組(CP000024)的第625038至625100位置，并且CRISPR非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)對應(yīng)于嗜熱鏈球菌全基因組的第627845至627885位置。如本文中所用，術(shù)語"上游"意指5'方向并且"下游"意指3'方向。如本文中所用，在CRISPR基因座的上下文中的術(shù)語"其部分"意指CRISPR基因座的至少約10個核苷酸、約20個核苷酸、約24個核苷酸、約30個核苷酸、約40個核苷酸、約44個核苷酸、約50個核苷酸、約60個核苷酸、約70個核苷酸、約80個核苷酸、約卯個核苷酸、約98個核苷酸或甚至約100個或更多個核苷酸(例如至少約44-98個核苷酸)。在一些優(yōu)選的實施方案中，術(shù)語"其部分"意指CRISPR基因座從一端或兩端(即5，和/或3，端)的至少約IO個核苷酸、約20個核苷酸、約24個核苷酸、約30個核苷酸、約40個核苷酸、約44個核苷酸、約50個核苷酸、約60個核苷酸、約70個核苷酸、約80個核苷酸、約90個核苷酸、約98個核苷酸或約100個或更多個核苷酸(例如至少約44-98個核苷酸)。在一些優(yōu)選的實施方案中，術(shù)語"其部分，，指在CRISPR基因座的5'端的至少約前"個核苷酸或在CRISPR基因座的3，端的約44個最末核苷酸。在一些其他實施方案中，在CRISPR基因座的上下文中的術(shù)語"其部分，，意指在CRISPR基因座5，端距離第一CRISPR重復(fù)序列的第一核苷酸下游或在CRISPR基因座3，端距離最末CRISPR重復(fù)序列的最末核苷酸上游的至少開頭約IO個核苷酸、約20個核苷酸、約24個核苷酸、約30個核苷酸、約40個核苷酸、約44個核苷酸、約50個核苷酸、約60個核苷酸、約70個核苷酸、約80個核苷酸、約卯個核苷酸、約98個核苷酸或約100個或更多個核苷酸(例如至少約44-98個核苷酸)。在一些優(yōu)選的實施方案中，術(shù)語"其部分，，指在CRISPR基因座5'端距離笫一CRISPR重復(fù)序列的第一核苷酸下游的至少開頭44個核苷酸或在CRISPR基因座3，端距離最末CRISPR重復(fù)序列的最末核苷酸上游的至少約44個核苷酸。在一些實施方案中，重復(fù)序列的最小長度是約24個核苷酸并且標簽序列的最小長度是約20個核苷酸。因此，在一些優(yōu)選的實施方案中，在CRISPR基因座的上下文中的術(shù)語"其部分"意指至少44個核苷酸。在一些實施方案中，重復(fù)序列的最大長度是約40個核苷酸并且標簽序列的最大長度是約58個核苷酸。因此，在一些實施方案中，在CRISPR基因座的上下文中的術(shù)語"其部分"意指至少約98個核苷酸。在一些優(yōu)選的實施方案中，在CRISPR基因座的上下文中的術(shù)語"其部分"意指至少約44-98個核苷酸。當(dāng)比較來自親代細菌和標記細菌的CRISPR基因座或其部分時，比較了CRISPR基因座的至少約10個核苷酸、約20個核苷酸、約24個核苷酸、約30個核苷酸、約40個核苷酸、約44個核苷酸、約50個核苷酸、約60個核苷酸、約70個核苷酸、約80個核苷酸、約90個核苷酸、約98個核苷酸或約100個(例如至少約44-98個核苷酸)。在一些優(yōu)選的實施方案中，比較了在CRISPR基因座一端或兩端的至少約10個核苷酸、約加個核苷酸、約24個核苷酸、約30個核苷酸、約40個核苷酸、約44個核苷酸、約50個核苷酸、約60個核苷酸、約70個核苷酸、約80個核苷酸、約90個核苷酸、約98個核苷酸或約100個或更多個核苷酸(例如至少約44-98個核苷酸)。在一些優(yōu)選的實施方案中，比較了在CRISPR基因座5'端或在CRISPR基因座3，端的至少開頭約10個核苷酸、約20個核苷酸、約24個核苷酸、約30個核苷酸、約40個核苷酸、約44個核苷酸、約50個核苷酸、約60個核苷酸、約70個核苷酸、約80個核苷酸、約卯個核苷酸、約98個核苷酸或約100個或更多個核苷酸(例如至少約44-98個核苷酸)。在一些優(yōu)選的實施方案中，至少比較了在CRISPR基因座5，端的約開頭44個核苷酸或在CRISPR基因座3，端的最后約44個核苷酸。在一些實施方案中，比較了在CRISPR基因座5'端距離第一CRISPR重復(fù)序列的第一核苷酸下游或在CRISPR基因座3'端距離最末CRISPR重復(fù)序列的最末核苷酸上游的至少開頭約IO個核苷酸、約20個核苷酸、約24個核苷酸、約30個核苷酸、約40個核苷酸、約44個核苷酸、約50個核苷酸、約60個核苷酸、約70個核苷酸、約80個核苷酸、約90個核苷酸、約98個核苷酸或約100個或更多個核苷酸(例如至少約44-98個核苷酸)。在一些優(yōu)選的實施方案中，比較了在CRISPR基因座5'端距離第一CRISPR重復(fù)序列的第一核苷酸下游的至少開頭44個核苷酸或在CRISPR基因座3，端距離最末CRISPR重復(fù)序列的最末核苷酸上游的至少約44個核苷酸。在一些實施方案中，該重復(fù)序列的最小長度是約24個核苷酸并且該標簽序列的最小長度是約20個核苷酸。在一些優(yōu)選的實施方案中，比較了至少44個核苷酸。在一些備選實施方案中，該重復(fù)序列的最大長度是約40個核苷酸并且該標簽序列的最大長度是約58個核苷酸。在一些優(yōu)選的實施方案中，比較了至少98個核普酸。在一些備選的優(yōu)選實施方案中，比較了至少約44-98個核苷酸。如本文中所用，術(shù)語"CRISPR重復(fù)序列"具有如本領(lǐng)域使用的常規(guī)含義(即多重短同向重復(fù)序列，其在給定CRISPR基因座中不顯示或顯示^f艮小的序列變異)。如本文中所用，在上下文中，"CRISPR重復(fù)序列"與術(shù)語"CRISPR"同義。除存在CRISPR間隔區(qū)之外，CRISPR基因座包含一個或多個CRISPR重復(fù)序列。因此，CRISPR重復(fù)序列對應(yīng)于CRISPR基因座內(nèi)的重復(fù)序列。例如，除了末端重復(fù)序列之外，嗜熱鏈^^菌CRISPR1序列的常見重復(fù)序列是5'-GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAAC-3，(SEQIDNO:l)。已經(jīng)觀察到這種重復(fù)序列的點變異，但是這些點變異極稀少。與這種常見重復(fù)序列相比，末端重復(fù)序列總在其3，端顯示相同的變異。也已經(jīng)觀察到這種末端重復(fù)序列的點變異，但是這些點變異極稀少。CRISPR重復(fù)序列可以天然存在于親代細菌中。CRISPR1序列的GenBank登錄號包括CP000023、CP000024、DQ072985、DQ072986、DQ072987、DQ072988、DQ072989、DQ0729卯、DQ072991、DQ072992、DQ072993、DQ072994、DQ072995、DQ072996、DQ072997、DQ072998、DQ072999、DQ073000、DQ073001、DQ073002、DQ073003、DQ073004、DQ073005、DQ073006、DQ073007、DQ073008和AAGS01000003。如本文中進一步詳述，重復(fù)序列從親代細菌衍生、可從親代細菌衍生、從親代細菌獲得或可從親代細菌獲得。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述序列包含親代細菌的基因組DNA。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，重復(fù)的CRISPR重復(fù)序列(例如在相同的CRISPR基因座中)反復(fù)、依次、同時或基本上同時地連同標簽序列一起整合到親代細菌中，以產(chǎn)生標記的細菌。在一個重復(fù)序列中的核苷酸數(shù)通常是約20至約40堿基對(例如36堿基對)，不過在其他實施方案中是約20至約39堿基對、約20至約37g對、約20至約35堿基對、約20至約33^對、約20至約30堿基對、約21至約40堿基對、約21至約39堿基對、約21至約37堿基對、約23至約40堿基對、約23至約39堿基對、約23至約37堿基對、約25至約40堿基對、約25至約39堿基對、約25至約37堿基對、約25至約35堿基對或約28或29堿基對。在一個重復(fù)序列中的核苷酸數(shù)通常是約20至約40堿基對，不過可以是約20至約39堿基對、約20至約37堿基對、約20至約35威基對、約20至約33堿基對、約20至約30堿基對、約21至約40堿基對、約21至約39堿基對、約21至約37堿基對、約23至約40堿基對、約23至約39堿基對、約23至約37堿基對、約25至約40堿基對、約25至約39堿基對、約25至約37堿基對、約25至約35堿基對或約28或29堿基對。重復(fù)序列的數(shù)目可以是從約1至約140、從約I至約IOO、從約2至約100、從約5至約100、從約10至約100、從約15至約100、從約20至約100、從約25至約100、從約30至約100、從約35至約100、從約40至約100、從約45至約100、從約50至約100、從約1至約135、從約1至約130、從約1至約125、從約1至約120、從約1至約115、從約1至約110、從約1至約105、從約1至約100、從約1至約95、從約1至約卯、從約1至約80、從約1至約70、從約1至約60、從約1至約50、從約10至約140、從約10至約130、從約10至約120、從約10至約110、從約10至約95、從約10至約90、從約20至約80、從約30至約70、從約30至約60、從約30至約50、從約30至約40或約32。在一些其他實施方案中，在一個重復(fù)序列中的核苷酸數(shù)是約20至約39堿基對、約20至約37堿基對、約20至約35堿基對、約20至約33堿基對、約20至約30堿基對、約21至約40堿基對、約21至約39堿基對、約21至約37堿基對、約23至約40堿基對、約23至約39堿基對、約23至約37堿基對、約25至約40堿基對、約25至約39堿基對、約25至約37堿基對、約25至約35堿基對或約28或29堿基對。在一些實施方案中重復(fù)序列的數(shù)目是從約1至約144個、從約1至約100個、從約2至約100個、從約5至約100個、從約10至約100個、從約15至約100個、從約20至約100個、從約25至約100個、從約30至約100個、從約35至約100個、從約40至約100個、從約45至約100個、從約50至約100個、從約1至約135個、從約1至約130個、從約1至約125個、從約1至約120個、從約1至約115個、從約1至約110個、從約1至約105個、從約1至約100個、從約1至約95個、從約1至約90個、從約1至約80個、從約1至約70個、從約1至約60個、從約1至約50個、從約10至約140個、從約10至約130個、從約10至約120個、從約10至約110個、從約10至約95個、從約10至約卯個、從約20至約80個、從約30至約70個、從約30至約60個、從約30至約50個、從約30至約40個或約30、31、32、33、34或35個重復(fù)序列。在一些實施方案中，重復(fù)序列的數(shù)目是從約2至約140、從約2至約67100、從約2至約100、從約5至約100、從約10至約100、從約15至約100、從約20至約100、從約25至約100、從約30至約100、從約35至約100、從約40至約100、從約45至約100、從約50至約100。在一些其他實施方案中，重復(fù)序列的數(shù)目是從約2至約135、從約2至約130、從約2至約125、從約2至約120、從約2至約115、從約2至約110、從約2至約105、從約2至約100、從約2至約95、從約2至約卯、從約2至約80、從約2至約70、從約2至約60、從約2至約50、從約2至約40、從約2至約30、從約2至約20、從約2至約10、從約2至約9、從約2至約8、從約2至約7、從約2至約6、從約2至約5、從約2至約4或從約2至約3。在一些實施方案中，該CRISPR重復(fù)序列包含DNA，而在其他實施方案中，該CRISPR重復(fù)序列包含RNA。在一些實施方案中，核酸是基因組來源的，而在其他實施方案中，它是合成或重組來源的。在一些實施方案中，CRISPR重復(fù)序列基因是雙鏈的或單鏈的，無論是否代表有義鏈或反義鏈或其組合。在一些實施方案中，本文中所述，通過使用重組DNA技術(shù)(例如重組DNA)制備CRISPR重復(fù)序列基因。在一些實施方案中，使用一個或多個CRISPR重復(fù)序列來工程化改造細胞(例如受體細胞)。在一些優(yōu)選的實施方案中，使用一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列來工程化改造細胞(例如受體細胞)，其中所述的CRISPR重復(fù)序列與一個或多個my基因或蛋白和一個或多個CRISPR間隔區(qū)的組合調(diào)節(jié)細胞針對耙核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性。例如，在一些實施方案中，使用本領(lǐng)域已知的任意合適方法，將CRISPR重復(fù)序列插入細胞的DNA(例如受體細胞的質(zhì)粒和/或基因組DNA)。在其它的實施方案中，CRISPR重復(fù)序列用作模板，根據(jù)所述模板來修飾(例如突變)細胞的DNA(例如受體細胞的質(zhì)粒和/或基因組DNA)，從而在細胞的DNA中產(chǎn)生或工程化CRISPR重復(fù)序列。在其它的實施方案中，CRISPR重復(fù)序列存在于至少一個構(gòu)建體、至少一個質(zhì)粒和/或至少一個載體等中。在其他實施方案中，使用本領(lǐng)域已知的任意合適方法，將CRISPR重復(fù)序列導(dǎo)入細胞。在其它的實施方案中，本發(fā)明提供了用于鑒定旨在用來調(diào)節(jié)細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的CRISPR重復(fù)序列的方法，所述方法包括步驟(i)制備包含至少一個CRISPR間隔區(qū)和至少一個cm基因的細胞；(ii)工程化細胞，從而細胞含有CRISPR重復(fù)序列；(iii)確定細胞是否調(diào)節(jié)針對所述靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性，其中調(diào)節(jié)細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性表明該CRISPR重復(fù)序列可以用來調(diào)節(jié)抗性。在一些其他實施方案中，將一個或多個CflS基因或蛋白與一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列和任選一個或多個CRISPR間隔區(qū)一起使用或與它們組合使用。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，CflS基因或蛋白質(zhì)和CRISPR重復(fù)序列形成如下所述的功能性組合。在一些實施方案中，CRISPR重復(fù)序列包含在SEQIDNO:l-22中所述的任意核苷酸。SEQIDNO:l-12來自嗜熱鏈球菌，而SEQIDNO:13-16來自無乳鏈球菌(5^印to""ws"ga/fl"/"e)，SEQNO:17來自變異鏈球菌(51.ww似附)，并且SEQIDNO:18-22來自釀膿鏈球菌(51./"gewes)。CRISPR間隔區(qū)如本文中所用，"CRISPR間隔區(qū)"包括存在于CRISPR基因座的多重短同向重復(fù)序列(即CRISPR重復(fù)序歹'J)之間的非重復(fù)性間隔區(qū)序列。在本發(fā)明的一些實施方案中，"CRISPR間隔區(qū)"指在側(cè)翼為兩個CRISPR重復(fù)序列的核酸節(jié)段。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CRISPR間隔區(qū)往往與多種可移動DNA分子(例如噬菌體和質(zhì)粒)具有顯著的相似性。在一些優(yōu)選的實施方案中，CRISPR間隔區(qū)位于兩個相同的CRISPR重復(fù)序列之間。在一些實施方案中，通過對位于兩個CRISPR重復(fù)序列之間的DNA段進行序列分析來鑒定CRISPR間隔區(qū)。在一些優(yōu)選的實施方案中，CRISPR間隔區(qū)天然地存在于作為回文的兩個相同的多重短同向重復(fù)序列之間。令人感興趣的是，攜帶這些CRISPR間隔區(qū)的細胞不能夠被含有與間隔區(qū)同源的序列的DNA分子感染(Mojica等2005)。在一些優(yōu)選的實施方案中，CRISPR間隔區(qū)與靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或鑒定的序列同源。盡管同源性也可以就相似性方面進行考慮，然而在本發(fā)明上下文中，優(yōu)選就序列同一性方面表述同源性。同源序列視為包括CRISPR間隔區(qū)，其可以與耙核酸序列或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或鑒定的序列至少約70、約75、約80、約85或約90%同一，或至少約91、約92、約93、約94、約95、約96、約97、約98或約99%同一。在一些優(yōu)選的實施方案中，CRISPR間隔區(qū)與耙核*列約100%同一。也應(yīng)當(dāng)指出在給定CRISPR基因座中CRISPR間隔區(qū)的數(shù)目在物種之間可以是不同的。另外，間隔區(qū)的數(shù)目是從約1至約140、從約1至約100、從約2至約100、從約5至約100、從約10至約100、從約15至約100、從約20至約100、從約25至約100、從約30至約100、從約35至約100、從約40至約100、從約45至約100或從約50至約100。在一些優(yōu)選的實施方案中，間隔區(qū)的數(shù)目是從約1至約135、從約1至約130、從約1至約125、從約1至約120、從約1至約115、從約1至約110、從約1至約105、從約1至約100、從約1至約95、從約1至約卯、從約1至約80、從約1至約70、從約1至約60、從約1至約50、從約1至約40、從約1至約30、從約1至約20、從約1至約10、從約1至約9、從約1至約8、從約1至約7、從約1至約6、從約1至約5、從約1至約4、從約1至約3、或從約1至約2。在一些優(yōu)選的實施方案中，通過對位于兩個CRISPR重復(fù)序列之間的DNA段進行序列分析來鑒定CRISPR間隔區(qū)。如本文中所述，本發(fā)明提供了促進一個或多個CM基因或蛋白與一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列組合使用的方法和組合物，其中所述的CRISPR重復(fù)序列適于在受體細胞中賦予針對至少一個CRISPR間隔區(qū)的免疫特異性。在一些優(yōu)選的實施方案中，至少一個c肪基因或蛋白和至少一個CRISPR重復(fù)序列以功能性組合方式使用，用來在細胞中賦予針對至少一個CRISPR間隔區(qū)的免疫特異性。如本文中所用，術(shù)語"免疫特異性"意指使用特定的CRISPR間隔區(qū)或本文中所示，給定CRISPR間隔區(qū)不賦予針對任意核酸序列或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性，而僅賦予針對同源于CRISPR間隔區(qū)或假CRISPR間隔區(qū)的那些核酸序列或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(例如，約100%同一的那些核酸序列或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)的抗性。在一些實施方案中，CRISPR間隔區(qū)從不同于受體細胞的供體生物獲得。在一些優(yōu)選的實施方案中，供體細胞和受體細胞是不同的細菌菌林、物種和/或?qū)?。在一些?yōu)選的實施方案中，至少一個c肪基因或蛋白和/或至少一個CRISPR重復(fù)序列從不同于受體生物的生物獲得。在一些優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)移了至少兩個CRISPR重復(fù)序列。在一些額外的優(yōu)選實施方案中，從與所述受體生物異源的生物或從另一種供體細胞獲得CRISPR間隔區(qū)，其中從與所述受體生物異源的生物或從另一種供體細胞獲得至少一個cm基因和/或蛋白質(zhì)和/或至少一個CRISPR重復(fù)序列。在一些備選的優(yōu)選實施方案中，從與所述受體生物同源的生物或從另一種供體細胞獲得CRISPR間隔區(qū)，其中從與所述受體生物同源的生物或從另一種供體細胞獲得至少一個cm基因和/或蛋白質(zhì)和/或至少一個CRISPR重復(fù)序列。在一些優(yōu)選的實施方案中，使用本領(lǐng)域已知的重組方法設(shè)計和產(chǎn)生CRISPR間隔區(qū)。實際上，意圖是使用本領(lǐng)域已知的任意合適方法產(chǎn)生CRISPR間隔區(qū)。在一些實施方案中，CRISPR間隔區(qū)與受體細胞是異源的，其中從所述受體細胞獲得至少一個aw基因或蛋白和/或至少一個CRISPR重復(fù)序列，并且在一些實施方案中，優(yōu)選2個或多個CRISPR重復(fù)序列。在一些備選實施方案中，CRISPR間隔區(qū)與受體細胞是同源的，其中從所述受體細胞獲得至少一個ow基因或蛋白和/或至少一個CRISPR重復(fù)序列，并且在一些實施方案中，優(yōu)選2個或多個CRISPR重復(fù)序列。實際上，意圖是在方法中所用的任意元件是異源或同源的。在一些實施方案中，當(dāng)使用多種元件(例如，CRISPR間隔區(qū)、CRISPR重復(fù)序列、c做基因和Cas蛋白的任意組合)時，一些元件是彼此同源的并且一些元件是彼此異源的(例如，在一些實施方案中，CRISPR間隔區(qū)和c"s基因是同源的，但是CRISPR重復(fù)序列是異源的)。因此，在一些實施方案中，CRISPR間隔區(qū)不與RISPR重復(fù)序列和/或c肪基因和/或功能性CRISPR重復(fù)序列-c肪基因組合天然地相關(guān)聯(lián)。實際上，意圖在本發(fā)明中使用異源元件和同源元件的任意組合。又在其它的實施方案中，供體細胞和受體細胞是異源的，而在其他實施方案中，它們是同源的。還意圖的是供體細胞和受體細胞中所含的元件是同源和/或異源的。使用本領(lǐng)域已知的任意合適方法，將所述元件(例如CRISPR間隔區(qū))導(dǎo)入受體細胞的質(zhì)粒和/或基因組DNA。72在一些優(yōu)選的實施方案中，使用至少一個CRISPR間隔區(qū)來工程化改造細胞(例如受體細胞)。在一些其它實施方案中，將一個或多個CRISPR間隔區(qū)與一個或多個c肪基因或蛋白和/或一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列組合(在一些優(yōu)選的實施方案中，使用其一個或多個功能性組合)用來調(diào)節(jié)細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性，以產(chǎn)生工程化改造的細胞。在一些其他實施方案中，CRISPR間隔區(qū)用作模板，根據(jù)所述模板來修飾(例如突變)細胞(例如受體細胞)的質(zhì)粒和/或基因組DNA，從而在細胞的DNA中產(chǎn)生CRISPR間隔區(qū)。在一些實施方案中，將CRISPR間隔區(qū)克隆到至少一個構(gòu)建體、質(zhì)?；蚱渌d體中，其中隨后使用本領(lǐng)域已知的任意合適方法，用所述構(gòu)建體、質(zhì)?；蚱渌d體轉(zhuǎn)化受體細胞。在一些其他實施方案中，本發(fā)明提供了用于鑒定旨在用來調(diào)節(jié)細胞針對靼核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的CRISPR間隔區(qū)的方法，所述方法包括步驟制備包含至少兩個CRISPR重復(fù)序列和至少一個cfls基因或蛋白的細胞；鑒定生物(例如供體生物)中的至少一個CRISPR間隔區(qū)；修飾細胞的CRISPR間隔區(qū)的序列，從而該CRISPR間隔區(qū)的序列與包含靶核酸的供體生物的CRISPR間隔區(qū)具有同源性；和確定細胞是否調(diào)節(jié)針對所述靶核酸的抗性，其中調(diào)節(jié)細胞針對所述耙核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性表明該CRISPR間隔區(qū)調(diào)節(jié)細胞針對所述靶核酸的抗性。在一些優(yōu)選的實施方案中，CRISPR間隔區(qū)包含或由SEQIDNO:23-460和/或SEQIDNO:522-665中任意一個或多個所述的核苷酸序列組成。SEQIDNO:23-339，359-408，522-665來自嗜熱鏈球菌，而SEQIDNO:340-358來自前庭鏈球菌(S.v"Ww/"Ws)，SEQIDNO:409-446來自無乳鏈球菌，SEQIDNO:447-452來自變異鏈球菌并且SEQIDNO:453-460來自釀膿鏈球菌。AGAACGTATTCCAAAACCTCTTTACGATTA(SEQIDNO:23)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TTCAT(SEQIDNO:552)CGATTTGACAATCTGCTGACCACTGTTATC(SEQIDNO:553)CTGTTCCTTGTTCTTTTGTTGTATCTTTTC(SEQIDNO:554)GAGCGAGCTCGAAATAATCTTAATTACAAG(SEQIDNO:555)GCAGTATCAGCAAGCAAGCTGTTAGTTACT(SEQIDNO:556)GCTGGCGAGGAAACGAACAAGGCCTCAACA(SE()IDNO:557)GCTTAGCTGTCCAATCCACGAACGTGGATG(SEQIDNO:558)GGCGTCCCAATCCTGATTAATACTTACTCG(SEQIDNO:559)GTTCGCTAGCGTCATGTGGTAACGTATTTA(SEQIDNO:560)TCTATATCGAGGTCAACTAACAATTATGCT(SEQIDNO:561)TGCATCGAGCACGTTCGAGTTTACCGTTTC(SE(JIDNO:562)TGTTTGACAGCAAATCAAGATTCGAATTGT(SEQIDNO:563)TTCATTCTTCCGTTTTTGTTTGCGAATCCT(SEQIDNO:564)TGACTTAGCGAATTTAATCGCTAAGATATC(SE(JIDNO:565)TTTATACTTTATCTTTTTAAAGAATGTATT(SEQIDNO:566)CCTAAAATCATTTTCAACGAGTTGCGATAC(SEQIDNO:567)AATAAATTGCTATGATACAGCGTACCGATA(SEQIDNO:568)TGCTCTCTATGCGATTGGACGTCTGTCTAA(SEQIDNO:569)AAGAAAGATAAGAAAAAAGTAACACTACTT(SEQIDNO:570)TCTCTTTCCATCGGTACTGGTATATCTCAT(SEQIDNO:571)ATTGGTAGCCAAGTAAATATCACCATTGAT(SEQIDNO:572)TTCTTCAAATTCACCGACTGCAAAATTACA(SEQIDNO:573)GCTTCCTAAGTGCATGAAAATCGCAAACGG(SEQIDNO:574)TATACCTGTCTATGTAAGGGAATTTAACTC(SEQIDNO:575)GGTGTAGGTGCTGTTGGTAAGTTGTTTAAT(SEQIDNO:576)GTGAAACAGGTTATCAAAAAACGTATATTG(SEQIDNO:577)TTATTCTTGGAATTATTACAGACCCTACTA(SEQIDNO:578)GCTTTCATTATATCACTTACTCATAAATCT(SEQIDNO:579)TAATCACCCCTTTTTCTAGCTCTTGATTGA(SEQIDNO:580)CAAGCAGTGTAAAGGTGGTTTAAATGTTAA(SEQIDNO:581)AACCCGCGTGGTTATGGGCTTGAGGAGTGT(SEQIDNO:582)ATATTAATAGCGATTCTATGCTACAACGTG(SEQIDNO:583)TCATCTTCTAAGTAAATACCACTGTCAGGG(SEQIDNO:584)TTTTCGCAAAGTAAGCGAAGCTCTACGTG(SEQIDNO:585)TTCTGTAGCCACTCCGTGGATGCCTTCAGC(SEQIDNO:586)TTCTTTAGTTCGGACACCCTCAACACCTAT(SEQIDNO:587)GCTTTGATTGGACGGAAAATGGTATCCCTG(SEQIDNO:588)TTCCTCATCTTTCTCCGCTTTTGCTAGACTT(SEQIDNO:589)TTAGACCAGATGGACAGATATTCTTCATCG(SEQIDNO:590)TCATCAGAGTCAACAATCACGGGAAAGACCT(SEQIDNO:591)ACACTCATCCTTATCCTGTAGTTCAAAACA(SEQIDNO:592)CAGCACTAGCCGCAAGCCCTTGTATATTAA(SEQIDNO:593)TAGAAATCAAGGAACTTGGATGAAAAGTAA(SEQIDNO:594)ATATGAAAGGGAAATGATATGAAGAATGAA(SEQIDNO:595)TTTTGGGATACAACACGCAGTCGTTGACTTG(SEQIDNO:596)GTTTGAGATGCCAATGTTTTTCAATCCTTG(SEQIDNO:597)GTATCAAAAGACGCATTCATGAAGCGAGCT(SEQIDNO:598)AAAAACAATTGAAATTCATAATCAGCGCTT(SEQIDNO:599)GCTTTTAACGTTTTAAGAGAATACCCTCT(SEQIDNO:660)GTGACGCTGCAATGACTTGCCATAGTAATT(SEQIDNO:601)ATACTGGTATATAGTAATTCATACTTCATC(SEQIDNO:602)TTGGTTTCATATTTACTCCTTTGTGTTTTG(SEQIDNO:603)CTGATTTGGTCTTGTTCTTTTGTCCCTTTT(SEQIDNO:604;GCAGCAGTTGAGAACTTTAGCGTCCAGTGG(SEQIDNO:605)TGCTACTATGAAGGACGCTGTTGATACTTT(SEQIDNO:606)TCTTCTTTAATCTTTTTTAACGTCAACGTT(SEQIDNO:607)GTATCCATTAATATAGTAGCATTTCTATCA(SEQIDNO:608)ATTCATTAATATCTGCAAGGATGTCTTGTT(SEQIDNO:609)GAGAAAGTAGCCCATTCGGCCCATTCGGGG(SEQIDNO:610)TACTTGAGTTAGCTCTGGAAGTCATTTATC(SEQIDNO:611)CTGCATTTGTAACCATGACTTCTTCGTCGT(SEQIDNO:612)AATTTGTCATCGACATCTACCAACGCCCAG(SE(JIDNO:613)ATAAAATTATGCCACGTTTTGGCACTAGAT(SEQIDNO:614)ATGTCTCTGAGGCTGTAGTAATTTACTTGT(SEQIDNO:615)CTTTAAAGAGTTGATTAAGTGCGTTACTGT(SEQIDNO:616)AAATGGGTTATGCTGTTCAATATGCGTCCC(SEQIDNO:617)AAACTGAAAACAACACAGACAATTCAACAA(SEQIDNO:618)GCCCAAAATGCTAGACGTTTGAATGACGGC(SE(JIDNO:619)ATGAAGAACGTGATTCACCTACGGTATGCT(SEQIDNO:620)GctttTGCAGAATTGTCTCCAGTGCCGATTT(SEQIDno:621)TGTACTCTATTGATTGCTTCATCTTTATTA(SEQIDNO:622)CTTTCAAGATACTCATCAACCATTGATGTCA(SEQIDNO:623)CTATGTCTTTACTGTTCTTCCAAAACCACC(SEQIDNO:624)TGCTACGTGCTCTGTACGGGCGCTATCAGC(SEQIDNO:625)CGTGGCAGCGTGGTCGGGTTTAATAGCCCG(SEQIDNO:626)AAGCCCAAGTCAGAGCATCCGTCCAAGCC(SEQIDNO:627)ATTGGGTTTCGGTAAGAACTAAACATACCA(SEQIDNO:628)CACAAAATAATTCGGTAGTTTTTACTAACT(SEQIDNO:629)TTTGACCGTTTATTTAGACGTGCTAAAGT(SEQIDNO:630)CTTCACCTCAAATCTTAGAGCTGGACTAAA(SEQIDNO:631)ATGTCTGAAAAATAACCGACCATCATTACT(SEQIDNO:632)GAAGCTCATCATGTTAAGGCTAAAACCTAT(SEQIDNO:633)TAGTCTAAATAGATTTCTTGCACCATTGTA(SEQIDNO:634)ATTCGTGAAAAAATATCGTGAAATAGGCAA(SEQIDNO:635)TCTAGGCTCATCTAAAGATAAATCAGTAGC(SEQIDNO:636)TAAAAACATGGGGCGGCGGTAATAGTGTAAG(SEQidno:637)ACAACCAGCAAAGAGAGCGCCGACAACATT(SEQIDNO:638)TATAACACAGGTTTAGAGGATGTTATACTT(SEQIDNO:639)CTAGAAGCTCAAGCGGTAAAAGTTGATGGCG(SEQIDNO:640)CTTTGAGGGCAAGCCCTCGCCGTTCCATTT(SEQIDNO:641)AACTACCAAGCAAATCAGCAATCAATAAGT(SEQIDNO:642)CTATAAGTGACAATCAGCGTAGGGAATACG(SEQIDNO:643)ATCAGTGCGGTATATTTACCCTAGACGCTA(SEQIDNO:644)AACAGTTACTATTAATCACGATTCCAACGG(SEQIDNO:645)AATTAGGGCGTCTTCCTTTATTCCGTGGTT(SEQIDNO:646)ATAGCTTCATTGCGCTTTTTAATTTGACCT(SEQIDNO:647)AACAACAAAGCAAATACAACAGTAACAACC(SEQIDNO:648)CTAAACTACGTTTGAAGGTCTCAACTCCGT(SEQIDNO:649)GAGGTTGAATAGTGAGTGCACCATGTTTGT(SEQIDNO:650)AGTAGAGAGACCAGCACACTACTGTACTAC(SEQIDNO:651)CTTCGCACGAAAGTTTATTAGACAACTCGC(SEQIDNO:652)TGATAGAGCTAGAATTGTCTTTTTTACCGA(SEQIDNO:653)AGATACTCTTGCTCGCCTCTGAACAACCAG(SEQIDNO:654)GGTGAAAAAGGTTCACTGTACGAGTACTTA(SEQIDNO:655)TCAATGAGTGGTATCCAAGACGAAAACTTA(SEQIDNO:656)CCTTGTCGTGGCTCTCCATACGCCCATATA(SEQIDNO:657)TGTTTGGGAAACCGCAGTAGCCATGATTAA(SEQIDNO-658)ACAGAGTACAATATTGTCCTCATTGGAGACAC(SEQIDNO:659)CTCATATTCGTTAGTTGCTTTTGTCATAAA(SE(JIDNO:660)AGAACTTTATCAAGATAAAACTACTTTAAA(SEQIDNO:661)ATAGTATTAATTTCATTGAAAAATAATTGT(SEQIDNO:662)GCTTTCTAGCTCGCTATAATTACCCATTCCTAGAAA(SEQIDNO:663)TCAAAATATGTTATTACCTTGTATTTCATAATTCAATTAA(SE()IDNO:664)CCACTTGCTGTGTACATCCTACCAGTTCCGCCTATGATG(SEQIDNO:665)在特別優(yōu)選的實施方案中，CRISPR間隔區(qū)的側(cè)翼為兩個CRISPR重復(fù)序列(即，一個CRISPR間隔區(qū)在每一側(cè)具有至少一個CRISPR重復(fù)序列)。雖然不意圖使本發(fā)明限于任何具體機制機制、理論或假說，認為一個給定CRISPR間隔區(qū)距離包含cm基因和/或前導(dǎo)序列的CRISPR基因座的5，端越遠，由該CRISPR間隔區(qū)賦予的抗性越低。因此，在本發(fā)明的一些實施方案中，修飾了來自CRISPR基因座5'端的開頭100個CRISPR間隔區(qū)中的一個或多個CRISPR間隔區(qū)，而在其他實施方案中，修飾了來自CRISPR基因座5，端的開頭50個CRISPR間隔區(qū)中的一個或多個CRISPR間隔區(qū)。在一些其它實施方案中，修飾了來自CRISPR基因座5，端的開頭40個CRISPR間隔區(qū)中的一個或多個CRISPR間隔區(qū)，而在其他實施方案中，l務(wù)飾了來自CRISPR基因座5，端的開頭30個CRISPR間隔區(qū)中的一個或多個CRISPR間隔區(qū)，并且又在一些其它實施方案中，修飾了來自CRISPR基因座5，端的開頭20個CRISPR間隔區(qū)中的一個或多個CRISPR間隔區(qū)，并且仍在更多的施方案中，修飾了來自CRISPR基因座5，端的開頭15個CRISPR間隔區(qū)中的一個或多個CRISPR間隔區(qū)。在一些優(yōu)選的實施方案中，修飾了來自CRISPR基因座5，端的開頭10個CRISPR間隔區(qū)中的一個或多個CRISPR間隔區(qū)。如本文中所示，不同細菌具有不同的數(shù)目的CRISPR間隔區(qū)，因而在一些實施方案中，4奮飾了多個間隔區(qū)。CRISPR間隔區(qū)核心對于微生物物種中的特定CRISPR類型，CRISPR間隔區(qū)一般由定義的優(yōu)勢長度代表，盡管該大小可以變動。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)迄今所述的CRISPR類型含有在約20bp和約58bp之間的優(yōu)勢間隔區(qū)長度。如本文中所用，術(shù)語"CRISPR間隔區(qū)核心"指在CRISPR類型中觀察到的最短間隔區(qū)的長度。因此，例如在嗜熱鏈球菌CRISPR類型l(CRISPRl)中，優(yōu)勢間隔區(qū)長度是30bp，而少數(shù)間隔區(qū)的大小在28bp和32bp之間。因此，在嗜熱鏈球菌CRISPR類型1中，CRISPR間隔區(qū)核心定義為一個28bp的連續(xù)段。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案中，CRISPR間隔區(qū)核心與耙核酸、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或鑒定的序列在該核心序列的長度范圍內(nèi)同源。如上所示，盡管同源性也可以就相似性方面進行考慮，然而在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案中，以序列同一性表述同源性。因此，在一些實施方案中，同源序列包括這樣的CRISPR間隔區(qū)核心，其可以在該核心序列的長度范圍內(nèi)與乾核酸、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或鑒定的序列至少約卯％同一，或至少約91、約92、約93、約94、約95、約96、約97、約98或約99%同一。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，CRISPR間隔區(qū)核心與靶核酸序列、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或鑒定的序列在該核心序列的長度范圍內(nèi)約100o/。同一。在研發(fā)本發(fā)明期間，分析了多種嗜熱鏈球菌菌林的CRISPR序列，包括親緣關(guān)系密切的工業(yè)菌林和噬菌體抗性變體。主要在CRISPR1基因座內(nèi)觀察到間隔區(qū)的數(shù)目和類型的不同，值得注意的是，噬菌體敏感性似乎與CRISPR1間隔區(qū)內(nèi)容物相關(guān)。具體而言，間隔區(qū)內(nèi)容物在親代菌林與喧菌體抗性衍生物之間幾乎相同，除了在噬菌體抗性衍生物存在額外的間隔區(qū)之外。這些研究結(jié)果提示了額外間隔區(qū)的存在與在給定菌林的噬菌體敏感性方面觀察到的差異之間存在潛在聯(lián)系。此觀察結(jié)果推動了對噬菌體抗性突變體中存在的額外間隔區(qū)的起源和功能的研究。假CRISPR間隔區(qū)如本文中所用，術(shù)語"假CRISPR間隔區(qū)，，指在生物(例如供體生物，包存活和/或復(fù)制和/或感染性等是必需的并且包含CRISPR間隔區(qū)。在一些實施方案中，假CRISPR間隔區(qū)用于產(chǎn)生與該假CRISPR間隔區(qū)互補或同源的CRISPR間隔區(qū)序列。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，這些序列用于調(diào)節(jié)抗性。在一些實施方案中，與至少一個假CRISPR間隔區(qū)互補或同源的至少一個假CRISPR間隔區(qū)和CRISPR間隔區(qū)用來工程化改造受體細胞。在一些優(yōu)選的實施方案中，與至少一個假CRISPR間隔區(qū)互補或同源的至少一個假CRISPR間隔區(qū)或CRISPR間隔區(qū)與一個或多個c必基因或蛋白和/或一個或多個CRISPR重復(fù)序列(例如其一個或多個功能性組合)組合使用，以工程化改造受體細胞，從而調(diào)節(jié)該受體細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性。在一些實施方案中，使用本領(lǐng)域已知的任意合適方法，插入與一個或多個假CRISPR間隔區(qū)互補或同源的假CRISPR間隔區(qū)或CRISPR間隔區(qū)到受體細胞的質(zhì)粒和/或基因組DNA中。在一些其它實施方案中，假CRISPR間隔區(qū)用作模板，根據(jù)所述模板來修飾(例如突變)受體細胞的質(zhì)粒和/或基因組DNA，從而在細胞的質(zhì)粒和/或基因組DNA中產(chǎn)生CRISPR間隔區(qū)。在一些其他實施方案中，使用本領(lǐng)域已知的任意合適方法，克隆與一個或多個假CRISPR間隔區(qū)互補或同源的假CRISPR間隔區(qū)或CRISPR間隔區(qū)到構(gòu)建體、質(zhì)粒和/或載體等中，其中將所述的構(gòu)建體、質(zhì)粒和/或載體等導(dǎo)入宿主細胞。CAS和cfls基因如本文中所用，術(shù)語"CM基因"具有如本領(lǐng)域使用的常規(guī)含義并且指通常偶聯(lián)、關(guān)聯(lián)或靠近或位于CRISPR基因座側(cè)翼附近的一個或多個c"s基因。Cas蛋白家族的詳盡綜述由Haft等(Haft等人，PLoS.Comput.Biol.，1(6):e60[2005)描述，在所述綜述中除了4個先前已知的基因家族夕卜，還描述了41個新確認的CRISPR相關(guān)(ow)基因家族。如該綜述中所述，CRISPR系統(tǒng)屬于不同類別，具有不同的重復(fù)模式、基因群和物種范圍。如本文中所示，c肪基因在給定CRISPR基因座中的數(shù)目可以在物種之間變動。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了使用(單獨的或與一個或多個CRISPR間隔區(qū)任意組合的)一個或多個cas基因或蛋白以調(diào)節(jié)細胞(例如受體細胞)針對靼核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法和組合物。在一些實施方案中，一個或多個CflS基因和/或蛋白天然地存在于受體細胞中，并且毗鄰于一個或多個cm基因或蛋白整合或插入一個或多個異源間隔區(qū)。在一些實施方案中，一個或多個ow基因和/或蛋白與受體細胞是異源的并且一個或多個間隔區(qū)是同源或異源的。在一些優(yōu)選的實施方案中，毗鄰于一個或多個ow基因或蛋白整合或插入間隔區(qū)。在一些其他實施方案中，本發(fā)明提供了使用一個或多個c肪基因或蛋白和至少兩個CRISPR重復(fù)序列以調(diào)節(jié)細胞(例如受體細胞)針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法和組合物。又在其它的實施方案中，本發(fā)明提供了使用一個或多個cm基因或蛋白、至少兩個CRISPR重復(fù)序列和至少一個CRISPR間隔區(qū)以調(diào)節(jié)細胞(例如受體細胞)針對耙核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法和組合物。CRISPR結(jié)構(gòu)一般存在于名為ow7至cfl^的4個基因附近。這些基因的最常見排列是c"W-cflW-oiW-c"s2。Cas3蛋白似乎是一種解旋酶，而Cas4與核酸外切酶的RecB家族相似并且含有富含半胱氨酸的基序，提示具有DNA結(jié)合作用。Casl通常是高度堿性的并且是在含有CRISPR基因座的全部物種中總是找得到的唯一Cas蛋白。Cas2仍待表征。casl-4的特征通常是它們密切靠近CRISPR基因座并且廣泛分布在細菌物種和古細菌物種中。盡管不是全部awJ-4基因都與所有CRISPR基因座關(guān)聯(lián)，然而在多個亞型中都發(fā)現(xiàn)了它們。另外，在許多細菌物種中存在與CRISPR結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)的三種基因(在本文中稱作c"W5、cfls5和c似6)的另一個簇(見，上文的Bolotin等人，[2005)。應(yīng)當(dāng)指出的是cas基因的命名是處于經(jīng)常變化的狀態(tài)中。因此，必須在上下文中理解文本。在一些實施方案中，c做基因選自c做7、cW、c做3、ctfW、caslB、ow5和/或ca"。在一些優(yōu)選的實施方案中，c肪基因是c肪J。又在一些實施方案中，cas基因選自ais2、c似2、c肪3、cflW、caslB、cas5和/或c^6片段、變體、同源物和/或其衍生物。在一些其它實施方案中，使用兩種或多種cm基因的組合，包括任意的合適組合，所述的合適組合包括在通過引用方式并入本文的WO07/025097中提供的那些組合。在一些實施方案中，提供多個ms基因。在一些實施方案中，存在多個不同和/或相同的ow基因或其任意組合，如WO07/025097中所述。在一些實施方案中，ow基因包含DNA,而在其他實施方案中，coy基因包含RNA。在一些實施方案中，核酸是基因組來源的，而在其他實施方案中，它是合成或重組來源的。在一些實施方案中，c"s基因是雙鏈的或單鏈的，無論是否代表有義鏈或反義鏈或其組合。在一些實施方案中，如本文中所述，通過使用重組DNA技術(shù)(例如重組DNA)制備aw基因。如本文中所述，在一些實施方案中，CM基因包含CflS基因的一個片段(即cas基因的這個片段包含野生型序列的一部分)。在一些實施方案中，該序列包含野生型序列的至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約卯％、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%。在一些實施方案中，優(yōu)選c肪基因是最靠近CRISPR基因座S，端處前導(dǎo)序列或第一CRISPR重復(fù)序列的c"s基因，如或c""。又在一些實施方案中，Cas蛋白選自Casl、Cas2、Cas3、Cas4、CaslB、Cas5和/或Cas6，以及其片段、變體、同源物和/或4汙生物。又在一些實施方案中，Cas蛋白選自Casl、Cas2、Cas3、Cas4、CaslB、Cas5和/或Cas6，以及其組合，如WO07/02509中所述。又在其它的實施方案中，Cas蛋白選自Casl、Cas2、Cas3、Cas4、CaslB、Cas5和/或Cas6中的一種或多種、或多個相同和/或不同的Cas蛋白，它們?yōu)槿我夂线m數(shù)目和/或組合。術(shù)語"Cas蛋白，，也包括多個Cas蛋白(例如，約2個和約12個Cas蛋白之間、更優(yōu)選約3個和約ll個Cas蛋白之間、更優(yōu)選約4個和約10個Cas蛋白之間、更優(yōu)選約4個和約9個Cas蛋白之間、更優(yōu)選約4個和約8個Cas蛋白之間和更優(yōu)選約4個和約7個蛋白之間；如4、5、6或7個Cas蛋白)。在一些實施方案中，Cas蛋白由包含DNA的c肪基因編碼，而在其他實施方案中，該ow包含RNA。在一些實施方案中，核酸是基因組來源的，而在其他實施方案中，它是合成或重組來源的。在一些實施方案中，編碼Cas蛋白的ow基因是雙鏈或單鏈的，無論是否代表有義鏈或反義鏈或其組合。在一些實施方案中，如本文中所述，通過使用重組DNA技術(shù)(例如重組DNA)制備ow基因。本發(fā)明也提供了用于鑒定旨在用來調(diào)節(jié)細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的c船基因的方法，所述方法包括步驟制備包含至少一個CRISPR間隔區(qū)和至少兩個CRISPR重復(fù)序列的細胞；工程化改造細胞，從而細胞包含至少一個cfls基因；并且確定細胞是否調(diào)節(jié)針對所述靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性，其中調(diào)節(jié)細胞針對靼核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性表明該ow基因可用于調(diào)節(jié)細胞的抗性。在一些其他實施方案中，本發(fā)明提供了用于工程化改造細胞(例如受體細胞)的方法和一個或多個c^基因。在一些優(yōu)選的實施方案中，使用一個或多個c^基因來工程化改造細胞(例如受體細胞)，其中所述的ow基因與一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列和一個或多個CRISPR間隔區(qū)的組合用于調(diào)節(jié)細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性。例如，在一些實施方案中，使用本領(lǐng)域已知的任意合適方法，將cs基因插入細胞的DNA(例如受體細胞的質(zhì)粒和/或基因組DNA)。在一些其它實施方案中，c氾基因用作才莫板，根據(jù)所述4莫板來修飾(例如突變)細胞的DNA(例如受體細胞的質(zhì)粒和/或基因組DNA)，從而在細胞的DNA中產(chǎn)生或形成c肪基因。在一些實施方案中，c船基因存在于至少一個構(gòu)建體、至少一個質(zhì)?；蛑辽僖粋€載體中，其中隨后使用本領(lǐng)域已知的任意合適方法，將所述構(gòu)建體、質(zhì)?；蜉d體導(dǎo)入細胞。在一些實施方案中，c做基因包含至少一個ois蔟，其中所述的cm簇選自SEQIDNO:461、466、473、478、488、493、498、504、509和517中的任意一種或多種序列。在其他實施方案中，c^基因包含SEQIDNO:462-465、467-472、474-477、479-487、489-492、494-497、499-503、505-508、510-517中的任意一種或多種，它們單獨使用或以任意合適的組合一起使用。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述的簇與一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列和任選一個或多個CRISPR間隔區(qū)組合4吏用。在一些其它實施方案中，一個或多個c氾基因或蛋白以合適的組合使用。如本文中所示，給定的一組cw基因或蛋白總是與特定CRISPR基因座中的給定重復(fù)序列關(guān)聯(lián)。因此，c^基因或蛋白似乎對給定的DNA重復(fù)序列是特異的(即cs基因或蛋白和所述重復(fù)序列形成功能性配對)。因此，使用一個或多個基因或蛋白和一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列的特定組合，旨在使CRISPR間隔區(qū)在細胞(例如受體細胞)中賦予針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性。因此，已經(jīng)出乎意料地發(fā)現(xiàn)不可能僅使用任意c肪基因或蛋白或任意CRISPR重復(fù)序列。相反，本發(fā)明的一個特征是該組合具有功能。在本文中所述的CRISPR重復(fù)序列-c似基因或蛋白組合的上下文中，術(shù)語"功能的"意指與CRISPR間隔區(qū)一起用來時，該組合能夠賦予針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性，其中所述的CRISPR間隔區(qū)與靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物一致或同源。如本文中所用，術(shù)語"功能性CRISPR重復(fù)序列-c"s組合"和"功能性CRISPR重復(fù)序列-c似基因組合"包括其中c氾是cm基因或Cas蛋白的功能性組合。適宜地，一個或多個cas基因或蛋白和/或一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列從相同細胞(例如相同受體細胞)衍生。在一些實施方案中，術(shù)語"可衍生的，，與術(shù)語"可獲得的"同義，如上下文中使用。在一些優(yōu)選的實施方案中，如上下文中使用，術(shù)語"可衍生的"也與術(shù)語"衍生"同義，因為不意圖使本發(fā)明具體地限于衍生的元件。在一些實施方案中，術(shù)語"衍生的"與術(shù)語"獲得的"同義，如上下文中使用。在一些實施方案中，一個或多個cas基因或蛋白和/或一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列從基因組或質(zhì)粒中的相同CRISPR基因座衍生、優(yōu)選從相同菌林、物種或?qū)俚幕蚪M或質(zhì)粒中的相同CRISPR基因座衍生。在一些其它實施方案中，一個或多個cas基因或蛋白和/或一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列從單一基因組或質(zhì)粒中的相同CRISPR基因座衍生、優(yōu)選從相同菌林、物種或?qū)俚膯我换蚪M或質(zhì)粒中的相同CRISPR基因座衍生。在一些實施方案中，一個或多個c^基因或蛋白和一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列天然地共存。又在其它的實施方案中，一個或多個cas基因或蛋白和/或一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列天然地共存于相同細胞(例如受體細胞)中。在其他實施方案中，一個或多個cas基因或蛋白和/或一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列天然地共存于細胞(例如受體細胞)的相同基因組中。仍在其他優(yōu)選的實施方案中，一個或多個cas基因或蛋白和/或一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列天然地共存于菌林、物種或?qū)俚南嗤蚪M中。在一些其他優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了核酸的任意合適的組合，所述的組合基本上由至少兩個CRISPR重復(fù)序列和至少一個CflS基因或蛋白組成。在一些實施方案中，術(shù)語"基本上由......組成"指至少兩個CRISPR重復(fù)序列和至少一個ois基因或蛋白的組合，并且不包括CRISPR基因座的至少一種其它組分(例如，缺少一個或多個CRISPR間隔區(qū)和/或缺少CRISPR基因座的一個或多個共同前導(dǎo)序列)。在一些備選實施方案中，術(shù)語"基本上由......組成"指僅至少兩個CRISPR重復(fù)序列和至少一個ow基因或蛋白的組合，并且不包括CRISPR基因座的全部其他組分(例如，天然存在的CRISPR基因座)。在一些其他實施方案中，術(shù)語"基本上由……組成，，指僅至少兩個CRISPR重復(fù)序列和至少一個c"s基因或蛋白的組合，并且不包括CRISPR基因座的至少一種其它組分、優(yōu)選地不包括天然存在的CRISPR基因座的至少一種其它組分。仍在一些其他實施方案中，術(shù)語"基本上由......組成"指至少兩個CRISPR重復(fù)序列和至少一個基因或蛋白的組合，前提是天然存在的CRISPR基因座的至少一種其它組分缺少(例如，基本上缺少)。因此，該術(shù)語意圖在上下文中使用。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了至少兩個CRISPR重復(fù)序列和至少一個cw基因或蛋白的任意適宜組合，前提是CRISPR基因座的全部其他組分缺少(例如，基本上缺少)，優(yōu)選CRISPR重復(fù)序列和cm基因的天然組合的CRISPR基因座的全部其他組分缺少。在一些進一步的實施方案中，一個或多個ow基因或蛋白與一個或多個CRISPR間隔區(qū)組合或一起使用。在一些其它實施方案中，一個或多個cffs基因或蛋白與至少一個或多個CRISPR間隔區(qū)和至少一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列組合或一起4吏用。在一些實施方案中，CRISPR間隔區(qū)從這樣的生物(例如供體生物)衍生，其中所述的生物與4汙生一個或多個cm基因或蛋白和/或一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列的細胞(例如受體細胞)不同。提供了以多種方式排列CRISPR重復(fù)序列和c做基因或蛋白質(zhì)、尤其功能性CRISPR重復(fù)序列-ois組合。在一些實施方案中，該組合包括約9個、約10個、約11個、約12個、約13個、約14個、約15個、約16個、約17個、約18個、約19個或約20個CRISPR重復(fù)序列中的至少任一項和約1個、約2個、約3個、約4個、約5個、約6個、約7個、約8個、約9個、約10個、約11個、約12個、約13個、約14個、約15個、約16個、約17個、約18個、約19或約20個ow基因或蛋白中的任一項的組合(例如16個CRISPR重復(fù)序列和12個cas基因或蛋白或18個CRISPR重復(fù)序列和20個c做基因或蛋白或其任意其他組合)、由所述組合組成或基本上由所述組合組成。本發(fā)明提供了以多種方式排列的CRISPR重復(fù)序列和cas基因，如WO07/025097中所提供。在cas基因和CRISPR重復(fù)序列的組合包含多于一個cm基因的一些實施方案中，理解為CRISPR重復(fù)序列插入在c做基因的3，端處、ais基因5，端處或在aw基因之間，條件是aw基因的至少之一仍保留功能。在一些實施方案中，第一CRISPR重復(fù)序列-cfls基因或蛋白組合(包含至少一個aw基因或蛋白和至少兩個CRISPR重復(fù)序列，兩者均從基因組內(nèi)的相同CRISPR基因座衍生)與第二CRISPR重復(fù)序列-c肪基因或蛋白組合使用(包含至少一個cw基因或蛋白和至少兩個CRISPR重復(fù)序列，其中兩者均從基因組內(nèi)的相同或不同CRISPR基因座衍生)。因此，在本發(fā)明的這些實施方案中，所述第一和第二組合從基因組內(nèi)相同或不同的CRISPR基因座衍生。因此，在一些實施方案中，如本文中進一步詳述，所述第一和第二CRISPR重復(fù)序列-ow基因或蛋白組合來自不同基因組(例如，來自相同簇內(nèi)的不同基因組)。仍在本發(fā)明的其他實施方案中，第一和/或第二CRISPR重復(fù)序列-ow基因或蛋白組合(包含從基因組內(nèi)相同CRISPR基因座衍生的至少一個cw基因和至少兩個CRISPR重復(fù)序列)與約3個、約4個、約5個、約6個、約7個、約8個、約9個或約10個或更多個CRISPR重復(fù)序列-c肪基因或蛋白組合(每個組合包含從基因組內(nèi)的相同或不同CRISPR基因座衍生的至少一個ow基因或蛋白和至少兩個CRISPR重復(fù)序列)以組合方式使用。因此，在本發(fā)明的這些實施方案中，所述組合從基因組內(nèi)的相同或不同CRISPR基因座衍生。在本發(fā)明的一些其他實施方案中，如本文中進一步詳述，所迷組合來自不同的基因組(例如，相同簇內(nèi)的不同基因組)。因此，在一些實施方案中，對于賦予抗性的CRISPR重復(fù)序列-ois基因或蛋白組合，CRISPR重復(fù)序列和c做基因或蛋白天然地共存于基因組的給定CRISPR基因座中。在一些實施方案中，CRISPR重復(fù)序列和c氾基因或蛋白天然地共存于基因組的相同CRISPR基因座中。在一些實施方案中，這些功能性組合共同地賦予針對靼核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性。在一些其他實施方案中，本發(fā)明提供了用于鑒定基因或蛋白和CRISPR重復(fù)序列的功能性組合的方法，所述方法包括步驟分析c做基因或蛋白和CRISPR重復(fù)序列的序列(例如核酸或蛋白質(zhì)序列)；鑒定c肪基因或蛋白的一個或多個簇；鑒定CRISPR重復(fù)序列的一個或多個簇；和組合屬于相同簇的那些cm基因或蛋白和CRISPR重復(fù)序列。在一些其它的實施方案中，本發(fā)明提供了用于鑒定c船基因或蛋白和CRISPR重復(fù)序列的功能性組合以用來調(diào)節(jié)細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法，所述方法包括步驟制備包含一個或多個c氾基因或蛋白和一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列的組合的細胞；工程化改造細胞，從而它含有一個或多個CRISPR間隔區(qū)；和確定細胞是否調(diào)節(jié)針對靶核酸的抗性，其中調(diào)節(jié)了細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性則表明該組合可以用來調(diào)節(jié)細胞針對耙核酸的抗性。在一些實施方案中，c肪基因和/或蛋白和/或CRISPR重復(fù)序列的序列從相同或不同的菌林、物種、屬和/或生物衍生。在一些實施方案中，該組合包含基因組、重組或合成來源的DNA和/或RNA。在一些實施方案中，CRISPR重復(fù)序列包含基因組、重組和/或合成來源的DNA和/或RNA。在一些實施方案中，c必基因包含基因組、重組和/或合成來源的DNA和/或RNA。實際上，意圖是本發(fā)明包括每種元件(例如aw基因和/或CRISPR重復(fù)序列)的DNA和/或RNA的任意組合。在一些實施方案中，使用本領(lǐng)域已知的任意合適方法分析所述元件。在一些優(yōu)選的實施方案中，使用點陣圖分析法開展該分析。在一些實施方案中，CRISPR重復(fù)序列和/或c^基因是雙鏈的，而在其他實施方案中，它們二者之中任何一個是單鏈的，無論是否代表有義鏈或反義鏈或其組合。在一些實施方案中，使用本文中所述的一個或多個功能性組合來工程化改造細胞(例如受體細胞)。在一些優(yōu)選的實施方案中，使用一個或多個功能性組合來工程化改造細胞(例如受體細胞)，其中所述的功能性組合與一個或多個CRISPR間隔區(qū)的組合用于調(diào)節(jié)細胞針對耙核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性。在一些實施方案中，使用本領(lǐng)域已知的任意合適的方法，將所述功能性組合插入受體細胞的DNA(例如，細胞的質(zhì)粒或基因組DNA)。在一些其它實施方案中，所述功能性組合用作模板，根據(jù)所述模板來修飾(例如突變)受體細胞的DNA(例如質(zhì)粒和/或基因組DNA)，從而在細胞的DNA中產(chǎn)生所述功能性組合。又在其它的實施方案中，^使用方法如本文中所述和本領(lǐng)域已知的那些方法，將功能性組合克隆至構(gòu)建體、質(zhì)?；蜉d體等中，所述的構(gòu)建體、質(zhì)?；蜉d體隨后轉(zhuǎn)化至細胞中。在一些實施方案中，功能性組合通過下述方法獲得或可獲得，所述方法包括步驟分析c^基因和CRISPR重復(fù)序列的序列；鑒定c做基因的一個或多個簇；鑒定CRISPR重復(fù)序列的一個或多個簇；和組合屬于相同簇的那些基因和CRISPR重復(fù)序歹'j，其中相同簇內(nèi)c似基因和CRISPR重復(fù)序列的組合表明該組合是功能性組合。如上所述，出人意料地發(fā)現(xiàn)不可能僅交換任意細胞(例如，細胞的任意菌林、物種或?qū)?之間的CRISPR重復(fù)序列-ow組合，因為這不必然產(chǎn)生功能性CRISPR重復(fù)序列-cm組合。實際上，對于有功能的CRISPR重復(fù)序列-cfls組合而言，它們需要是相容的。因此，認為不可能交換不同CRISPR基因座之間的c"s基因或CRISPR重復(fù)序列，除非它們來自相同的簇。甚至更出人意料的是該簇不遵循"生物"的系統(tǒng)發(fā)生過程。具體而言，在一種生物內(nèi)，可以存在多于一個CRISPR。這些CRISPR可以屬于不同的簇，既使它們在相同生物中存在。因此，認為功能性CRISPR重復(fù)序列-ow組合要求該組合應(yīng)當(dāng)在一個簇內(nèi)轉(zhuǎn)換，這一點與在一個生物內(nèi)轉(zhuǎn)換相對立。為避免疑問，如本文中所用的術(shù)語"簇"不指位于相同基因座的基因簇(通常形成操縱子)，而指來自序列比較分析(例如，多重序列比較分析和/或多重序列比對和/或點陣圖分析)的結(jié)果。因此，在一些實施方案中，使用本領(lǐng)域已知的多種方法(例如，本文中所述的點陣圖分析)或使用多重比對隨后進行系統(tǒng)進化樹計算，進行CRISPR基因座的簇分析。在一些實施方案中，所述簇是一類、一系、一組序列。有利地，天然共存性CRISPR重復(fù)序列-ow組合的使用提供了在給定物種內(nèi)部和在給定物種之間相互交換該組合，因而有可能使用來自不同菌林的組合工程化改造一種菌林的抗性。噬菌體如本文中所用，術(shù)語"細菌噬菌體(bacterophage)"(或"噬菌體(phage)")具有如本領(lǐng)域所理解的其常規(guī)含義(即，選擇性地感染一個或多個細菌物種的病毒)。眾多噬菌體對具體屬或物種或菌林的細菌是特異的。在一些優(yōu)選的實施方案中，噬菌體能夠感染親代細菌和/或宿主細胞。在一些實施方案中，噬菌體對親代細菌有毒力。在一些實施方案中，噬菌體是裂解性的，而在其他實施方案中，噬菌體是溶原性的。裂解性噬菌體是通過完成裂解周期，沿裂解途徑前進而不進入溶原途徑的噬菌體。裂解性噬菌體經(jīng)歷病毒復(fù)制，造成細胞膜裂解、摧毀細胞并釋放能夠感染其他細胞的子代噬菌體粒子。溶原性噬菌體是能夠進入溶原性途徑的那種噬菌體，在所述溶原性途徑中，噬菌體在完成其裂解循環(huán)之前變成細胞基因組的蟄伏、不活潑部分。在本發(fā)明中使用的噬菌體包括但不限于屬于以下病毒科的噬菌體覆蓋噬菌體科、嚢狀噬菌體科、絲桿狀噬菌體科、光滑噬菌體科、微小噬菌體科、肌尾噬菌體科、短尾噬菌體科、長尾噬菌體科或復(fù)層噬菌體科。在一些實施方案中，感染對植物和/或動物(包括人)致病的細菌的噬菌體特別有用。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，調(diào)節(jié)了細胞針對噬菌體的抗性。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的噬菌體包括但不限于能夠感染天然包含一個或多個CRISPR基因座的細菌的那些噬菌體。已經(jīng)在超過40種原核生物中鑒定到CRISPR基因座(見例如，Jansen等人，Mol.Microbiol"43:1565-1575[2002];和Mojica等人，[2005]),所迷的原核生物包括但不限于氣熱菌屬(j^v/;,w附)，熱棒菌屬(iVr0^rcw/"/n),硫化葉菌屬(iS"(^/oft"力、古球狀菌屬(^4rc/rfleog/o6"s)、鹽盒菌屬(/ira/0Cfl/TM/fl)、曱烷桿菌屬(M^/mwo^z"e/7"附)，甲烷球菌屬(M^/^"ococc"力、甲烷八疊球菌屬(Af"/^WOStffT,Vl")、超高溫曱烷菌屬(Afe溈"wo/7jT附)、火J求菌屬(尸j;coccms)、嗜酸古菌屬CP/cro/7/ti7Ms)、熱原體屬(r/rciM0/7/flS附a)、才奉桿菌屬、分枝桿菌屬、鏈霉菌屬(Ar印to附FM)、產(chǎn)水菌屬(Aquifex)、卟啉菌屬(Porphyromonas)、綠菌屬(C7^iYto附)、棲熱菌屬(7Z^濯MS)、芽孢桿菌屬、利斯特氏菌屬、葡萄球菌屬、梭菌屬、高溫厭氧桿菌屬(T^^7woflAifle/y6fl"er)、支/^體屬(7kfj;a/;/as附a)、梭軒菌屬(F"sy6flcteWw附)、固氮弓菌屬(^ZflrcMS)、色桿菌屬(!WMo6ffcfeW"附)、奈瑟氏球菌屬、亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、脫硫弧菌屬(D"w//ovf'6n'o)、地桿菌屬(G^Mfl"c)、粘球菌屬(Myxococcus)、彎曲桿菌屬(CV!附/^/o6a"w)、沃廉菌屬(^^//"^/")、不動桿菌屬(Jc/"eto^cter)、歐文氏菌屬、埃希氏菌屬、軍團菌屬、甲基球菌屬(AfW/^/0C0"附)、巴氏桿菌屬(戶做&""http://￡|)、發(fā)光桿菌屬CP/roto^i"eW"/w)、沙門氏菌屬、黃單胞菌屬(JVa"^o附柳"s)、耶爾森氏菌屬、密螺旋體屬和熱袍菌屬(r&r附0togfl)。在一些實施方案中，所述噬菌體包括但不限于能夠感染屬于以下屬的細菌的那些噬菌體埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、歐文氏菌屬、耶爾森氏菌屬、芽孢桿菌屬、弧菌屬、軍團菌屬、假單胞菌屬、奈瑟氏球菌屬、博德特氏菌屬、螺桿菌屬、利斯特氏菌屬、農(nóng)桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、梭菌屬、棒桿菌屬、分枝桿菌屬、密螺旋體屬、疏螺旋體屬、弗朗西絲菌屬、布魯氏菌屬和黃單胞菌屬。在其它的實施方案中，噬菌體包括但不限于能夠感染(或轉(zhuǎn)導(dǎo))乳酸細菌、雙歧桿菌屬、短桿菌屬、丙酸桿菌屬、乳球菌屬、鏈球菌屬、乳桿菌屬(例如，嗜酸乳桿菌(X.a"Vfe/;似/wW)、腸球菌屬、片球菌屬、明串珠菌屬和酒球菌屬細菌的那些噬菌體。在進一步的實施方案中，噬菌體包括但不限于能夠感染乳酸乳球菌(Lactoa"附/ac他)(例如乳酸乳球菌乳酸亞種(丄./"c泡subsp./""/s)和乳酸乳球菌乳脂亞種(L./fl"/ssubsp，"e附^^)和乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙酰生物變種(L,/"c他subsp.to"/y6/ov"frf/a"印/fl"/s))、嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌{呆力口利亞亞種(Ztf"。6a"7/附rfe/6rw"Ai/subsp，6"/g"Wc"力，瑞士乳桿菌(丄acto6a"7/"s臉/vWc附)、乳雙歧桿菌CB訴fitoA""c"附嗜酸乳桿菌(Z^c似6""7/"sa"Vto/^i/"》、干酪乳桿菌(l""M""7/鄉(xiāng)'嬰兒雙歧桿菌(i,y^oAfl"e/7w附/"/""ris)、類干酪乳桿菌(丄fl"o6flC"/附/wrflc肪")、唾液乳桿菌(丄fl"o6fldZ/wss"/iV""'ms)、植物豸L桿菌(丄"cto6a"7/附//awtofw附)、路氏乳桿菌(Iflcto6""7/附/rwten〕、戈氏乳桿菌(l"cto6flCf7/"sg"Meri)、約氏享L桿菌(Z^cto6w7/附y(tǒng)0A附oin7)或長雙歧桿菌CB訴flfo^"iw/w附/owg"附)的夷卩些噬菌體。又在其他實施方案中，噬菌體包括但不限于能夠感染易受噬菌體感染破壞的任何發(fā)酵細菌的那些噬菌體，其中所述的發(fā)酵細菌包括但不限于參與抗生素、氨基酸和溶劑產(chǎn)生過程的發(fā)酵細菌。已知經(jīng)歷過噬菌體感染的由發(fā)酵產(chǎn)生的產(chǎn)物和相應(yīng)的被感染的發(fā)酵細菌包括切達干酪和農(nóng)家干酪(乳酸乳球菌乳酸亞種CLflcto"cc附subsp,/"c泡)、乳酸乳球菌乳脂亞種(丄fl"ococc附/"c/issubsp.cre附or/y))、酸奶(德氏乳桿菌保力卩利亞亞種、嗜熱鏈球菌)、瑞士干酪(嗜熱鏈球菌、乳酸乳桿菌、瑞士乳桿菌)、青紋千酪(乳脂明串珠菌(丄e"cowwtocc"/ww&))、意大利干酪(保加利亞乳桿菌(丄.6"&Wcm)、嗜熱鏈球菌)、芬蘭傳統(tǒng)酸奶(viili)(乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙酰生物變種(jLflcto"cc"ssubsp./"c泡6iVmw&ace<v/fl"&)、乳脂明串珠菌)、雅庫特(干酪乳桿菌)、酪素(乳酸乳球菌乳脂亞種)、納豆(枯草芽孢桿菌納豆變種(丑""'//附5"6說&varmi加))、酒(酒明串珠菌(丄ewc0wostocoewos))、清酒(腸膜明串珠菌(丄e"cYw^tocw^e"^wVfes))、多粘菌素(多粘芽孢桿菌06^///附/10/3;附>^:"))、祐桿菌素(肉毒芽孢桿菌(Bacilluscolistrium))、桿菌肽(地衣芽孢桿菌(5""7/"sWc/rew《/of7mX))、L-谷氨酸(專'L發(fā)酵短桿菌(5/^v幼",c/w附/fi"o/c附ew似附)、嗜氨小桿菌(Af/croA""e/7"附"附附"附"/;/7"附))、以及丙酮和丁醇(丙酮丁醇梭菌(C7oWriV//M/w、C7o5tnVZ/"附在一些優(yōu)選的實施方案中，在本發(fā)明中使用的細菌包括但不限于嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和/或嗜酸乳桿菌。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，噬菌體包括但不限于能夠感染包含一個或多個異源的CRISPR基因座的細菌的那些噬菌體。在一些實施方案中，細菌包含一個或多個異源的CRISPR基西座和/或一個或多個異源的cfls基因和/或一個或多個異源的CRISPR重復(fù)序列和/或一個或多個異源的CRISPR間隔區(qū)。細菌被噬菌體感染是由噬菌體DNA注入或轉(zhuǎn)移到細胞中所致。在一些實施方案中，感染導(dǎo)致噬菌體核酸在細胞內(nèi)表達(即轉(zhuǎn)錄和翻譯)和噬菌體生活周期持續(xù)。在涉及重組噬菌體的一些實施方案中，噬菌體基因組內(nèi)的重組序列(例如才艮道核酸)也表達。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)原核生物中的CRISPR間隔區(qū)序列往往與多種DNA分子具有顯著相似性，所述的多種DNA分子包括遺傳元件如染色體、噬菌體和接合質(zhì)粒。已經(jīng)報道了攜帶這些CRISPR間隔區(qū)的細胞不能夠被含有與間隔區(qū)同源的序列的DNA分子感染(見，Mojica等2005)。在本發(fā)明的一些實施方案中，在細胞(例如受體細胞)的CRISPR基因座內(nèi)添加衍生自與一個或多個假CRISPR間隔區(qū)互補或同源的噬菌體DNA或CRISPR間隔區(qū)的一個或多個特定假間隔區(qū)，旨在調(diào)節(jié)(例如提供)針對特定噬菌體的抗性，因而基本上防止噬菌體侵襲。在一些優(yōu)選的實施方案中，將噬菌體基因組內(nèi)的特定區(qū)域作為靶標以制^f艮間隔區(qū)，所述的特定區(qū)域包括但不限于編碼宿主特異性蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)包括提供特定噬菌體-宿主識別作用的那些蛋白質(zhì)，如解旋酶、引發(fā)酶、頭部或尾部結(jié)構(gòu)蛋白、具有保守結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(例如穴蛋白、細胞溶素等其他蛋白等)或具有重要噬菌體基因當(dāng)中的保守序列的蛋白質(zhì)。當(dāng)源自噬菌體基因組的任意核酸插入例如活性CRISPR基因座中的兩個重復(fù)序列之間時，源自該噬菌體基因組的任意核酸可以賦予針對該噬菌體的免疫性。在一些實施方案中，當(dāng)CRISPR間隔區(qū)對應(yīng)于噬菌體基因的內(nèi)部序列時，免疫性是較"高效，，的。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，當(dāng)該基因編碼"必需，，蛋白質(zhì)(例如抗受體)時，使得免疫性甚至更"高效"。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了用于賦予細胞(例如細菌細胞)針對噬菌體的抗性方法，所述方法包括步驟(a)提供來自至少一種噬菌體的一個或多個假CRISPR間隔區(qū)；(b)在對該噬菌體基本上敏感的至少一種細胞中鑒定一個或多個功能性CRISPR重復(fù)序列-c^組合；和(c)工程化改造所述基本上敏感的細胞中的所述一個或多個CRISPR基因座，從而這些CRISPR基因座包含來自噬菌體的一個或多個假CRISPR間隔區(qū)和/或與所述一個或多個假CRISPR間隔區(qū)互補或同源的一個或多個CRISPR間隔區(qū)，以使此細胞具有抗性。又在其它的實施方案中，本發(fā)明提供了用于賦予細胞(例如細菌細胞)針對噬菌體的抗性方法，所述方法包括步驟(a)提供來自至少一種噬菌體的一個或多個假CRISPR間隔區(qū)；(b)鑒定對該噬菌體基本上敏感的至少一種細胞中的一個或多個功能性CRISPR重復(fù)序列-c似組合；和(c)插入來自該噬菌體的一個或多個假CRISPR間隔區(qū)或與所述一個或多個假CRISPR間隔區(qū)互補或同源的一個或多個CRISPR間隔區(qū)到所述基本上敏感的細胞，從而使細胞基本上抵抗該噬菌體。又在其它的實施方案中，本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)細菌細胞溶菌型的方法，所述方法包括步驟(a)提供來自至少一種噬菌體的一個或多個假CRISPR間隔區(qū)；(b)鑒定對該噬菌體基本上敏感的至少一種細胞中的一個或多個功能性CRISPR重復(fù)序列-cfls組合；和(c)工程化改造所述基本上敏感的細胞中的一個或多個CRISPR基因座，從而這些CRISPR基因座包含來自噬菌體的一個或多個假CRISPR間隔區(qū)和/或與所述一個或多個假CRISPR間隔區(qū)互補或同源的一個或多個CRISPR間隔區(qū)。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)細菌細胞溶菌型的方法，所述方法包括步驟(a)提供來自至少一種噬菌體的一個或多個假CRISPR間隔區(qū)；(b)鑒定對該噬菌體基本上敏感的至少一種細胞中的一個或多個功能性CRISPR重復(fù)序列-c^組合；和(c)插入來自噬菌體的一個或多個假CRISPR間隔區(qū)和/或與所述一個或多個假CRISPR間隔區(qū)互補或同源的一個或多個CRISPR間隔區(qū)到所述基本上敏感的細胞中。又在一些其他優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了用于賦予細胞(例如細菌細胞)針對噬菌體的抗性方法，所述方法包括步驟i)鑒定包含靼核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的噬菌體中的假CRISPR間隔區(qū)，其中針對所述靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性待調(diào)節(jié)；和(ii)修飾細胞的CRISPR間隔區(qū)的序列，從而細胞的CRISPR間隔區(qū)與包含所述靶核酸的噬菌體的假CRISPR間隔區(qū)具有同源性。在一些其他實施方案中，本發(fā)明提供了用于賦予細胞(例如細菌細胞)針對噬菌體的抗性的方法，所述方法包括步驟i)鑒定包含靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的噬菌體中的假CRISPR間隔區(qū)，其中針對所述靼核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性待調(diào)節(jié)；和(ii)修飾細胞的CRISPR間隔區(qū)的序列，從而細胞的CRISPR間隔區(qū)與包含所述靶核酸的噬菌體的假CRISPR間隔區(qū)具有100%同源性或同一性。又在其它的實施方案中，本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)細菌細胞的溶菌型的方法，所述方法包括步驟i)鑒定包含靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的噬菌體中的假CRISPR間隔區(qū)，其中針對所述乾核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性待調(diào)節(jié)；和(ii)修飾細胞的CRISPR間隔區(qū)的序列，從而細胞的CRISPR間隔區(qū)與包含所述乾核酸的噬菌體的假CRISPR間隔區(qū)具有同源性。在一些其他實施方案中，本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)細菌細胞的溶菌型的方法，所述方法包括步驟i)鑒定包含靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的噬菌體中的假CRISPR間隔區(qū)，其中針對所述靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性待調(diào)節(jié)；和(iiyf務(wù)飾細胞的CRISPR間隔區(qū)的序列，從而細胞的CRISPR間隔區(qū)與包含所述耙核酸的噬菌體的假CRISPR間隔區(qū)具有100%同源性或同一性。在一些實施方案中，細菌細胞的CRISPR間隔區(qū)與包含靶核酸的噬菌體中的序歹'j(如假CRISPR間隔區(qū))具有100%同源性或同一性。在一些備選的實施方案中，細菌細胞的CRISPR間隔區(qū)形成包含如本文中所述的功能性CRISPR重復(fù)序列-ow組合的CRISPR基因座的組成部分。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，噬菌體中的靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是高度保守的核酸序列。在一些其他實施方案中，噬菌體中的靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是編碼宿主特異性蛋白質(zhì)的基因。在一些其他實施方案中，噬菌體中的靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物編碼對該噬菌體存活、復(fù)制和/或生長為必需的酶。在其它的實施方案中，噬菌體中的靼核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物編碼解旋酶、引發(fā)酶、頭部或尾部結(jié)構(gòu)蛋白、具有保守結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(例如穴蛋白、細胞溶素等)。在一些優(yōu)選的實施方案中，制備了具有"降低的噬菌體增殖或感染易感性，，的細菌細胞。如本文中所用，該術(shù)語指在(例如乳制品培養(yǎng)基中)培養(yǎng)時與野生型細菌相比，具有低噬菌體增殖或感染易感性或無噬菌體增殖或感染易感性的細菌。在一些實施方案中，一些細菌細胞顯示"低噬菌體增殖易感性"。該術(shù)語指細菌中的噬菌體增殖水平低于會在給定時間期間對培養(yǎng)物造成有害作用的水平。這種對培養(yǎng)物的有害作用包括但不限于在生產(chǎn)發(fā)酵乳產(chǎn)品(例如酸奶或干酪)期間乳凝結(jié)、在生產(chǎn)發(fā)酵乳產(chǎn)品(例如酸奶或干酪)期間pH不充分或緩慢降低、干酪成熟緩慢和/或食物質(zhì)地退化到引不起食欲或不適合消費的程度。對于等同的培養(yǎng)條件集合，通常相對于野生型細菌表述針對本發(fā)明噬菌體的細菌易感性。在一些實施方案中，所述細菌具有約100倍較低的(成斑效率[EOPl=1(T2)、優(yōu)選約1000倍較低的(EOP=10-3)、更優(yōu)選10,000倍較低的(EOP=10力并且最優(yōu)選約100,000倍較低的(EOP-l(T5)。在一些優(yōu)選的實施方案中，在溫育培養(yǎng)物約14小時后、更優(yōu)選在約12小時后、甚至更優(yōu)選在約7小時后、仍更優(yōu)選在約6小時后、還更優(yōu)選在約5小時后并且最優(yōu)選在約4小時后測定培養(yǎng)物中的噬菌體增殖水平。在其它的實施方案中，本發(fā)明提供了用于賦予細胞(例如細菌細胞)針對噬菌體的敏感性的方法，所述方法包括步驟(a)提供來自至少一種噬菌體的假CRISPR間隔區(qū)；(b)鑒定對該噬菌體基本上抵抗的細胞中的一個或多個功能性CRISPR重復(fù)序列-cm組合；和(c)工程化改造基本上敏感的細胞中的一個或多個CRISPR基因座，從而這些CRISPR基因座包含一個或多個假CRISPR間隔區(qū)或一個或多個CRISPR間隔區(qū)，其中所述的假CRISPR間隔區(qū)或CRISPR間隔區(qū)互補或同源于與所述基本上抵抗的細胞中的所述一個或多個CRISPR基因座相比時同源性程度降低的一個或多個假CRISPR間隔區(qū)。在其他實施方案中，本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)(例如減少)包含一個或多個ow基因或蛋白和一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列的細胞(例如細菌細胞)的溶菌型的方法，所述方法包括步驟i)鑒定噬菌體中的假CRISPR間隔區(qū)，其中針對所述噬菌體的抗性待調(diào)節(jié)；和(ii)修飾細胞的CRISPR間隔區(qū)的序列，從而細胞的CRISPR間隔區(qū)與包含耙核酸的噬菌體的假CRISPR間隔區(qū)具有降低程度的同源性。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)(例如減少或降低)包含一個或多個ois基因或蛋白和一個或多個、優(yōu)選兩個或多個CRISPR重復(fù)序列的細菌細胞針對噬菌體的抗性的方法，所述方法包括步驟(i)鑒定噬菌體中的一個或多個假CRISPR間隔區(qū)，其中針對所述噬菌體的抗性待調(diào)節(jié)；(ii)鑒定其中待調(diào)節(jié)抗性的細菌細胞中與所述假CRISPR間隔區(qū)同源的CRISPR間隔區(qū)；和(iii)修飾其中待調(diào)節(jié)抗性的細菌細胞中的CRISPR間隔區(qū)的序列，從而CRISPR間隔區(qū)與逸菌體的假CRISPR間隔區(qū)具有較低程度的同源性，其中針對所述噬菌體的抗性待調(diào)節(jié)。在一些實施方案中，與待調(diào)節(jié)針對其抗性的噬菌體的假CRISPR間隔區(qū)相比較時，細胞的CRISPR間隔區(qū)具有降低程度的同源性(例如同源性降孑氐約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約90%或約95%)。在一些實施方案中，使用本發(fā)明的方法制備細菌細胞，從而細胞具有"提高的噬菌體增殖易感性"。如本文中所用，該術(shù)語指在(例如乳制品培養(yǎng)基中)培養(yǎng)時與野生型細菌相比，具有提高或更高的噬菌體增殖易感性的細菌。在一些實施方案中，術(shù)語"高噬菌體增殖易感性"指細菌中的噬菌體增殖水平高于會在給定時間期間對培養(yǎng)物造成有害作用的水平。這種對培養(yǎng)物的有害作用包括但不限于在生產(chǎn)發(fā)酵乳產(chǎn)品(例如酸奶或干酪)期間乳凝結(jié)、在生產(chǎn)發(fā)酵乳產(chǎn)品(例如酸奶或干酪)期間pH不充分的或緩慢降低、干酪成熟緩慢和/或食物質(zhì)地退化到引不起食欲或不適合消費的程度。對于等同的培養(yǎng)條件集合，通常相對于野生型細菌表述針對本發(fā)明噬菌體的細菌易感性。在一些實施方案中，所述細菌具有約100倍較低的(成斑效率[EOPI=10力、優(yōu)選約1000倍較低的(EOP=1(T3)、更優(yōu)選10，000倍較低的(EOP=10,并且最優(yōu)選約100,000倍較低的(EOP-l(T5)。在一些優(yōu)選的實施方案中，在溫育培養(yǎng)物約14小時后、更優(yōu)選在約U小時后、甚至更優(yōu)選在約7小時后、仍更優(yōu)選在約6小時后、還更優(yōu)選在約5小時后并且最優(yōu)選在約4小時后測定培養(yǎng)物中的噬菌體增殖水平。在一些優(yōu)選的實施方案中，一個CRISPR間隔區(qū)在側(cè)翼為兩個CRISPR重復(fù)序列(即，一個CRISPR間隔區(qū)在每一側(cè)具有至少一個CRISPR重復(fù)序列)。在本發(fā)明的一些實施方案中，使親代細菌(例如"親代細菌菌林")(例如反復(fù)、依次、同時或基本上同時地)暴露于多于一種噬菌體(例如一種或多種噬菌體的混合物)。在一些實施方案中，該親代細菌菌林對混合物中親代細菌菌林所暴露的每種噬菌體敏感，而在其他實施方案中，該細菌菌株對所述噬菌體的某些敏感，但抵抗其他噬菌體。如本文中所用，術(shù)語"標簽序列"指額外DNA片段的部分，其從一種或多種噬菌體的基因組例如一種或多種噬菌體的基因組的正鏈)衍生，其中根據(jù)本發(fā)明方法使親代細菌暴露于所述噬菌體，并且用作為標記或標簽(例如提供獨特標記或獨特標簽)。標簽序列一般是噬菌體中作為天然存在的序列的序列。優(yōu)選地，該標簽序列與^菌體中的天然存在的序列(例如衍生該標簽序列的噬菌體基因組)具有至少約卯％、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%同一性。在一些最優(yōu)選的實施方案中，該標簽序列與噬菌體中的天然存在的序列(例如衍生該標簽序列的噬菌體基因組)具有約100%同一性。在一些實施方案中，標簽序列與標記細菌的一個或多個CRISPR基因座中的任何其他CRISPR間隔區(qū)或CRISPR間隔區(qū)核心具有小于約40%、約30%、約20%、約10%、約5%、約4%、約3%、約2%、約1%或約0%同一性。在一些實施方案中，標簽序列與標記細菌的一個或多個CRISPR基因座中的任何其他序列具有小于約40%、約30%、約20%、約10%、約5%、約4%、約3%、約2%、約1%或約0%同一性。在一些其它實施方案中，標簽序列具有與細菌的CRISPR基因座中的序列(例如CRISPR間隔區(qū))相同的序列。在一些其他實施方案中，標簽序列具有這樣的序列，所述序列除一個或多個單核苷酸多態(tài)性(例如一個或兩個單核苷酸多態(tài)性)之外與此細菌的CRISPR基因座中的序列(例如CRISPR間隔區(qū))相同。在一些優(yōu)選的實施方案中，該標簽序列具有至少約20個核苷酸長度，而在一些特別優(yōu)選的實施方案，它具有約20個至約58個核苷酸長度。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，將至少一個標簽序列整合到親代細菌中。在一些其它實施方案中，還整合了從親代細菌的基因組或親代細菌的一個或多個質(zhì)粒(例如，巨質(zhì)粒(megaplasmid))衍生的至少一個重復(fù)序歹ij(例如，重復(fù)的CRISPR重復(fù)序列)。不意圖使本發(fā)明限于任何特定機制或理論。然而，認為至少一個重復(fù)序列從親代細菌的基因組中被拷貝或復(fù)制。特別地，認為CRISPR基因座中的CRISPR重復(fù)序列一般,皮重復(fù)并且標簽序列在該細菌的基因組中緊鄰新的重復(fù)的CRISPR重復(fù)序列之后(即下游)整合。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，所述至少一個重復(fù)序列是與親代細菌和/或標記細菌的一個或多個CRISPR基因座中的CRISPR重復(fù)序列具有至少約卯％、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性的CRISPR重復(fù)序列。最優(yōu)選地，所述至少一個重復(fù)序列是與親代細菌和/或標記細菌的一個或多個CRISPR基因座中的CRISPR重復(fù)序列具有至少約100。/。同一性的CRISPR重復(fù)序列。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述重復(fù)的序列具有至少約24個核苷酸長度，而在一些特別優(yōu)選的實施方案中，它具有約24個至約40個核苷酸長度。在一些優(yōu)選的實施方案中，至少一個標簽序列和至少一個重復(fù)序列整合到親代細菌中。不意圖使本發(fā)明限于任何特定機制或理論。然而，認為每次一個標簽序列整合到親代細菌的基因組中，這伴有反復(fù)、依次、同時或基本上同時地整合至少一個重復(fù)序列。因此，包含所述標簽序列和重復(fù)序列的至少一對序列整合到親代細菌中，由此產(chǎn)生標記的細菌。在一些優(yōu)選的實施方案中，至少一個標簽序列和至少一個重復(fù)序列彼此毗鄰地整合。更優(yōu)選地，至少一個標簽序列和至少一個重復(fù)序列彼此毗鄰地整合，從而所述序列之間不存在間插核苷酸。在一些實施方案中，重復(fù)序列結(jié)合、連接或融合到標簽序列的一端(例如5'或3，端)。優(yōu)選地，重復(fù)序列結(jié)合、連接或融合到標簽序列的5，端。因此，在整合單個序列對之后，重復(fù)序列是在CRISPR基因座5，端的第一序列并且標簽序列會是CRISPR基因座中在該重復(fù)序列下游的第二(例如，下一個)序列。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述序列直接結(jié)合、直接連接或直接融合，從而在重復(fù)序列與標簽序列之間無間插核苷酸。因此，在一些實施方案中，將重復(fù)序列和標簽序列對整合到親代細菌的基因組中，以產(chǎn)生標記細菌。該重復(fù)序列從親代細菌的基因組衍生、可衍生、獲得或可獲得，并且標簽序列從用來感染該親代細菌的噬菌體的基因組衍生、可衍生、獲得或可獲得。出人意料地，甚至已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在一些實施方案中，多重序列對,皮整合到親代細菌的基因組中。根據(jù)這些實施方案，所述的多重序列對包含含有重復(fù)序列和標簽序列的第一序列對和含有第二重復(fù)序列和第二標簽序列的第二序列對。第二重復(fù)序列一般包含與第一重復(fù)序列相同的序列(例如大于約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%同一性)。該標簽序列一般包含與第一標簽序列不同的序列(例如小于約40%、約30%、約20%、約10%、約5%、約4%、約3%、約2%、約1%或約0%同一性)。這在整合了額外序列對的實施方案中也是如此。因此，多重序列對的構(gòu)成一般包含)，所述的原核生物包括但不限于氣熱菌屬、熱棒菌屬、硫化葉菌、古球狀菌屬、鹽盒菌屬、曱烷桿菌屬、甲烷球菌屬、甲烷八疊球菌屬、超高溫甲烷菌屬、火球菌屬、嗜酸古菌屬、熱原體屬、棒桿菌屬、分枝桿菌屬、鏈霉菌屬、產(chǎn)水菌屬、卟啉菌屬、綠菌屬、棲熱菌屬、芽孢桿菌屬、利斯特氏菌屬、葡萄球菌屬、梭菌屬、高溫厭氧桿菌屬、支原體屬、梭桿菌屬、固氮弓菌屬、色桿菌屬、奈瑟氏球菌屬、亞硝化單胞菌屬、脫硫弧菌屬、地桿菌屬、粘球菌屬、彎曲桿菌屬、沃廉菌屬、不動桿菌屬、歐文氏菌屬、埃希氏菌屬、軍團菌屬、甲基球菌屬、巴氏桿菌屬、發(fā)光桿菌屬、沙門氏菌屬、黃單胞菌屬、耶爾森氏菌屬、密螺旋體屬和熱袍菌屬。在一些實施方案中，親代細菌包含一個或多個異源的CRISPR間隔區(qū)、一個或多個異源的CRISPR重復(fù)序列和/或一個或多個異源的c"s基因。在一些備選的實施方案中，親代細菌包含一個或多個異源的CRISPR基因座，優(yōu)選一個或多個完整CRISPR基因座。在一些其他實施方案中，親代細菌天然地包含一個或多個CRISPR基因座并且還包含一個或多個異源的CRISPR間隔區(qū)、一個或多個異源的CRISPR重復(fù)序列和/或一個或多個異源的c^基因。在一些其它實施方案中，親代細菌天然地包含一個或多個CRISPR基因座并且還包含一個或多個異源的CRISPR基因座、優(yōu)選一個或多個完整CRISPR基因座。在一些優(yōu)選的實施方案中，通過親代細菌暴露于至少一種噬菌體所產(chǎn)生的噬菌體抗性亞群是純培養(yǎng)物。然而，不意圖使本發(fā)明限于細菌菌林的純培養(yǎng)物、變體或噬菌體。實際上，意圖是本發(fā)明包括細胞和噬菌體的混合培養(yǎng)物。在一些實施方案中，所述混合培養(yǎng)物是與相同和/或不同CRISPR基因座處的不同整合事件對應(yīng)的不同突變體的混合物。盡管不意圖對本發(fā)明進行如下限制，不過優(yōu)選的親代細菌屬是鏈球菌屬和乳桿菌屬。實際上，意圖在本發(fā)明中使用任何細菌物種，所述細菌物種包括但不限于埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、歐文氏菌屬、耶爾森氏菌屬、芽孢桿菌屬、弧菌屬、軍團菌屬、假單胞菌屬、奈瑟氏球菌屬、博德特氏菌屬、螺桿菌屬、利斯特氏菌屬、農(nóng)桿菌、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、梭菌屬、棒桿菌屬、分枝桿菌屬、密螺旋體屬、疏螺旋體屬、弗朗西絲菌屬、布魯氏菌屬、雙歧桿菌屬、短桿菌屬、丙酸桿菌屬、乳球菌屬、乳桿菌屬腸球菌屬、片球菌屬、明串珠菌屬、酒球菌屬和/或黃單胞菌屬。在一些實施方案中，親代細菌是乳酸細菌或從其中衍生，所述的乳酸細菌包括但不限于雙歧桿菌屬、短桿菌屬、丙酸桿菌屬、乳球菌屬、鏈球菌屬、乳桿菌屬(例如嗜酸乳桿菌)、腸球菌屬、片球菌屬、明串珠菌屬和/或酒球菌屬。在其他實施方案中，親代細菌是以下細菌或從其中衍生乳酸乳球菌(例如乳酸乳球菌乳酸亞種和乳酸乳球菌乳脂亞種和乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙酰生物變種)、德氏乳桿菌保加利亞亞種、瑞士乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、類干酪乳桿菌、唾液乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌(I.""ten)、加氏乳桿菌(I.g"weW)、約氏乳桿菌、乳雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌和/或嗜熱鏈球菌。在本發(fā)明的一些實施方案中，親代細菌是"食品級細菌"(即，在食物和/或飼料制備和/或生產(chǎn)中使用并認為安全的細菌)。在一些優(yōu)選的實施方案中，親代細菌適合用作起子培養(yǎng)物、益生培養(yǎng)物和/或膳食補充劑。在其它的實施方案中，親代細菌用于發(fā)酵肉(包括牛肉、豬肉、羊肉和禽肉)，所述的親代細菌包招—旦不限于乳酸細菌、啤酒片球菌、植物乳桿菌、短乳桿菌、清酒乳桿菌、彎曲乳桿菌、孩史球菌屬(Micrococcus)物種、戊糖片球菌、木糖葡萄球菌、小牛乳桿菌及其混合物(見例如Knorr(編輯)，F(xiàn)oodBiotechnology,在第538-39頁1987；和Pederson,MicrobiologyofFermentedFoods,在第210-34頁，第2版，[1979；和美國專利號2,225,783，通過引用的方式并入本文)。在其它的實施方案中，親代細菌用于發(fā)酵蔬菜(例如胡蘿卜、黃瓜、番茄、辣椒和巻心菜)，所述親代細菌包括但不限于植物乳桿菌、短乳桿菌、腸膜明串珠、戊糖片球菌及其混合物(見例如上文的Knorr;上文的Pederson;和美國專利號3，024，116、3，403，032、3，932，674和3,897,307)。又在其他施方案中，親代細菌用于發(fā)酵從谷物(例如小麥、黑麥、稻、燕麥、大麥和玉米)形成的面團。在進一步的實施方案中，親代細菌用于通過發(fā)酵果汁(如葡萄汁)產(chǎn)生酒。在一些其它實施方案中，親代細菌用于乳的發(fā)酵(例如德氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌及其混合物(見，上文的Knorr;和上文的Pederson,在第105-35頁)。在一些優(yōu)選的實施方案中，親代細菌用于產(chǎn)生干酪，所述親代細菌包括但不限于德氏乳桿菌保加利亞亞種、瑞士乳桿菌、乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙酰生物變種、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌屬、腸J求菌屬等及其混合物(見例如上文的Knorr和上文的Pederson,在第135-51頁)。又在其他實施方案中，親代細菌用于卵的發(fā)酵，所述親代細菌包括但不限于戊糖片球菌、植物乳桿菌及其混合物(見，上文的Knorr)。在一些實施方案中，親代細菌用于發(fā)酵以生產(chǎn)多種產(chǎn)品，所述的產(chǎn)物包括切達干酪和農(nóng)家干酪(例如乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種)、酸奶(德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌)、瑞士干酪(例如，嗜熱鏈球菌、乳酸乳桿菌和瑞士乳桿菌)、青紋千酪(乳脂明串珠菌)、意大利干酪(保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌)、芬蘭傳統(tǒng)酸奶(乳酸乳球菌乳118脂亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙酰生物變種、乳脂明串珠菌)、雅庫特(干酪乳桿菌)、干酪素(乳酸乳球菌乳脂亞種)、納豆(枯草芽孢桿菌納豆變種)、酒(酒明串珠菌)、清酒(腸膜明串珠菌)、多粘菌素(多粘芽孢桿菌)、黏桿菌素(肉毒芽孢桿菌)、桿菌肽(地衣芽孢桿菌)、L-谷氨酸(乳糖發(fā)酵短桿菌和嗜氨小桿菌)和丙酮與丁醇(丙酮丁醇梭菌和CtoWn'必"附saa^ffl/Y/7er6""/tfce似fi/cM/w)。在一些優(yōu)選的實施方案中，親代細菌物種選自嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和/或嗜酸乳桿菌。在其它的實施方案中，親代細菌用于包括但不限于抗生素生產(chǎn)、氨基酸生產(chǎn)、溶劑生產(chǎn)的方法，和用于產(chǎn)生其他經(jīng)濟上有用的材料。仍然在其他的實施方案中，親代細菌用于化妝品、治療用組合物和/或藥物組合物中。在一些實施方案中，所述組合物具有特殊活性，所述活性包括但不限于使皮膚再生，這包括但不限于抗皺特性、去除陳舊疤痕、修復(fù)燒傷組織、促進皮膚愈合、消除色素斑等。在一些實施方案中，所述組合物促進或抑制指(趾)甲、頭發(fā)或毛發(fā)的生長。在一些其它實施方案中，所述組合物包含了使用本發(fā)明的方法和組合物產(chǎn)生的至少一種微生物培養(yǎng)物和/或標記細菌和/或細胞培養(yǎng)物。在其他實施方案中，親代細菌是噬菌體不敏感性突變體。因此，在一些實施方案中，親代細菌對一種或多種噬菌體不敏感。在一些優(yōu)選的實施方案中，親代細菌在本發(fā)明使用期間對所暴露的噬菌體而言不是噬菌體不敏感性突變體。起子培養(yǎng)物起子培養(yǎng)物廣泛地在食品工業(yè)中用于制造發(fā)酵產(chǎn)品，包括乳產(chǎn)品(例如酸奶和千酪)、以及肉產(chǎn)品、焙烘產(chǎn)品、酒和蔬菜產(chǎn)品。在制造眾多發(fā)酵乳、干酪和黃油產(chǎn)品中使用的起子培養(yǎng)物包括通常分類為乳酸細菌的細菌的培養(yǎng)物。此類細菌起子培養(yǎng)物通過執(zhí)行多種功能而賦予多種乳制品特定特征。細菌的商用非濃縮培養(yǎng)物在工業(yè)上稱作"母培養(yǎng)物，，并且在添加至可食用的原材料(如乳)用于發(fā)酵之前，在生產(chǎn)地點(例如奶油干酪制造場)增殖。在生產(chǎn)地點增殖以接種到可食用原材料中的起子培養(yǎng)物稱作"生產(chǎn)用起始物(bulkstarter),，。合適用于本發(fā)明中的起子培養(yǎng)物包括在食品、化妝品或制藥工業(yè)中使用的任意生物(即，"工業(yè)用培養(yǎng)物，，或"工業(yè)用菌林，，)。起子培養(yǎng)物通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)制備(見例如美國專利號4，621，058，該文獻通過引用的方式并入本文)。在一些實施方案中，通過如下方式制備起子培養(yǎng)物，即導(dǎo)入接種物例如細菌至生長培養(yǎng)基(例如發(fā)酵培物。土-、、，。土，"、。土，。干燥的起子培養(yǎng)物通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)制備(見例如美國專利號4,423,079和4,140,800)。千燥起子培養(yǎng)物的任何合適形式在本發(fā)明中使用，所述的形式包括可濕性、噴霧干燥、冷凍干燥或凍干的固體制品(例如片劑、丸劑、膠嚢劑、粉劑、顆粒劑和散劑)。在一些實施方案中，用于本發(fā)明中的干燥起子培養(yǎng)物處于深冷丸劑形式或冷凍干燥粉末形式。根據(jù)本領(lǐng)域已知的任意合適方法制備處于深冷丸劑形式或冷凍干燥粉末形式的干燥起子培養(yǎng)物。在一些實施方案中，本發(fā)明中使用的干燥起子培養(yǎng)物處于包含極高濃度一種或多種細菌菌抹的濃縮物形式。在一些實施方案中，所述濃縮物用水稀釋或重懸于水或其他的合適稀釋劑(例如適宜的生長培養(yǎng)基、礦物油或植物油)中。才艮據(jù)本領(lǐng)域已知的方法(例如離心、過濾或此類^t支術(shù)的組合)制備濃縮物形式的本發(fā)明的干燥起子培養(yǎng)物。在一些實施方案中，所述起子培養(yǎng)物合適用于乳品工業(yè)中.在乳品工業(yè)中使用時，該起子培養(yǎng)物往往選自乳酸細菌物種、雙歧桿菌屬物種、短桿菌屬物種、丙酸桿菌屬物種。乳酸細菌群組的合適起子培養(yǎng)物包括乳球菌屬物種、鏈球菌屬物種、乳桿菌屬物種(包括嗜酸乳桿菌)、腸球菌屬物種、片球菌屬物種、明串珠菌屬物種和酒球菌屬物種的常用菌林。乳酸細菌的培養(yǎng)物通常用在制造發(fā)酵乳產(chǎn)品(例如酪乳、酸奶或酸奶油)和用在制造黃油和干酪(例如法國布里干酪(brie)或丹麥半硬牛奶干酪(havarti))中。乳球菌屬物種包括廣泛使用的乳酸乳球菌(lactococc"s所述乳酸乳球菌包括乳酸乳球菌乳酸亞種和乳酸乳球菌乳脂亞種。其他乳酸細菌物種包括明串珠菌屬物種、嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和瑞士乳桿菌。另外，益生菌林(例如乳球菌屬物種)包括廣泛使用的乳酸乳球菌，所述乳酸乳球菌包括乳酸乳球菌乳酸亞種和乳酸乳球菌乳脂亞種。乳酸細菌的嗜溫培養(yǎng)物通常用于制造發(fā)酵乳產(chǎn)品(例如酪乳、酸奶或酸奶油)和用于制造黃油和干酪(例如法國布里干酪(brie)或丹麥半硬牛奶干酪(havarti))。其它的乳球菌屬物種包括乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌、明串珠菌屬物種、乳酸乳球菌乳酸亞種生物變種(丄"ctococc":y/fl"issubsp./"/sMmir)、嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和瑞士乳桿菌。另外，在一些實施方案中，在制造期間添加益生菌林如乳雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、千酪乳桿菌以增強風(fēng)味或促進健康。在制造法國切達干酪和蒙特里干酪千酪(montereyjackcheeses)中通常使用的乳酸細菌培養(yǎng)物包括嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌乳酸亞種和乳酸乳球菌乳脂亞種或其組合。制造意大利干酪如(帕斯塔菲拉塔干酪(pastafilata)或珀爾梅散干酪(parmesan))中通常使用的乳酸細菌的嗜熱培養(yǎng)物包括嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種。在制造期間添加其他乳桿菌屬物種(例如瑞士乳桿菌)以獲得所需的風(fēng)味。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述起子培養(yǎng)物的生物包含或由以上乳酸細菌菌林或任何其他起子培養(yǎng)物菌株之一的根據(jù)本文中所提供方法制備的基因修飾菌林組成。選擇用于本發(fā)明起子培養(yǎng)物的生物將取決于待制備或處理的產(chǎn)物的具體類型。因此，例如對于制造干酪和黃油而言，廣泛使用乳球菌屬物種、明串珠菌屬物種和乳桿菌屬物種的嗜溫培養(yǎng)物，而對于酸奶和其他發(fā)酵乳產(chǎn)品，通常使用鏈球菌屬物種和乳桿菌屬物種的嗜熱菌林。在一些實施方案中，起子培養(yǎng)物是干燥的起子培養(yǎng)物、脫水的起子培養(yǎng)物、冷凍的起子培養(yǎng)物或濃縮的起子培養(yǎng)物。在一些實施方案中，該起子培養(yǎng)物用于直接接種發(fā)酵培養(yǎng)基或產(chǎn)物中。在一些實施方案中，起子培養(yǎng)物包含純培養(yǎng)物(即，僅包含一種細菌菌林)。在一些備選的實施方案中，該起子培養(yǎng)物包含混合的培養(yǎng)物(即，包含至少兩種不同的細菌菌林)。乳酸細菌用于本發(fā)明中的特別合適的起子培養(yǎng)物，尤其干燥的起子培養(yǎng)物包含乳酸細菌。如本文中所用，術(shù)語"乳酸細菌"指發(fā)酵糖伴有產(chǎn)生酸的革蘭氏陽性、微需氧性或厭氧性細菌，所述的酸包括作為優(yōu)勢酸產(chǎn)生的乳酸、乙酸、曱酸和丙酸。工業(yè)上最有用的乳酸細菌存在于乳球菌屬物種(如乳酸乳球菌)、乳桿菌屬物種、雙歧桿菌屬物種、鏈球菌屬物種、明串珠菌屬物種、片球菌屬物種和丙酸桿菌屬(iV印,》W幼WeWM附)物種。本發(fā)明的起子培養(yǎng)物可以包含一個或多個乳酸細菌物種，如乳酸乳球菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌或其組合。乳酸細菌起子培養(yǎng)物通常在食品工業(yè)中作為包含一個或多個物種的混合菌林培養(yǎng)物使用。對于眾多的混合菌林培養(yǎng)物，如包含菌林德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌的酸奶起子培養(yǎng)物，物種之間存在共生關(guān)系，其中與單一菌抹乳酸細菌的培養(yǎng)物相比較，乳酸的產(chǎn)生更多(見例如Rajagopal等人，J.DairySci"73:894-899[1990)。產(chǎn)品用于本發(fā)明中的合適產(chǎn)品包括但不限于食品、化妝產(chǎn)品或藥物產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明構(gòu)思了從培養(yǎng)物制備或包含該培養(yǎng)物的任何產(chǎn)品。這些產(chǎn)品包括但不限于水果、豆類和蔬菜(包括衍生產(chǎn)品)、谷物和谷物衍生產(chǎn)品、乳制品和乳制品衍生的產(chǎn)品、肉、家禽、海鮮、化妝品和藥物產(chǎn)品。術(shù)語"食物"在最廣泛的含義上使用并且包括飼料、食料、食物成分、食品補充劑和功能食品。如本文中所用，術(shù)語"食物成分，，包括添加或可以添加至食物的配方并且包括可以在需要例如酸化或乳化的多種產(chǎn)品中以低水平使用的配方。如本文中所用，術(shù)語"功能食品，，意指不僅能夠提供營養(yǎng)作用和/或滋味滿足，還能夠向消費者傳送其他有益作用的食物。盡管不存在功能食品的法律定義，本領(lǐng)域中的大部分利益團體認同因具有特定健康作用而銷售的術(shù)語"食物"包括人的食物以及動物的食物(即飼料)。在優(yōu)選的方面，該食物用于人類消費。在一些實施方案中，本文中所述的細胞包含于或被添加至食物成分、食品補充劑或功能食品。在一些實施方案中，該食物是液體形式(例如溶液)、凝膠、乳液或固體，這一點由施加和/或施用模式所要求。本文中所述的細胞用于制備如下一個或多個食品糖果產(chǎn)品、乳制品、肉產(chǎn)品、禽產(chǎn)品、魚產(chǎn)品和焙烘產(chǎn)品。在一些實施方案中，該細菌作為成分用于軟飲料、果汁、包含乳清蛋白的飲料、保健茶、可可飲料、乳飲料、乳酸細菌飲料、酸奶、飲用酸奶和酒等。也提供制備食物的方法，該方法包括將本發(fā)明的細胞與食物成分(如用于食物的原料)混合。用于制M物的方法也是本發(fā)明的另一個方面。適宜地，如本文中所述的食品是乳制品。在一些優(yōu)選的實施方案中，該乳制品是酸奶、干酪(例如酸凝乳干酪、硬干酪、半硬干酪、酪農(nóng)干酪等)、酪乳、粗制脫脂酸奶干酪(quark)、酸性稀奶油、克菲爾酸牛乳酒(kefir)、法式酸奶油(c"mefraiche)、基于乳清蛋白的發(fā)酵飲料、馬奶酒、乳飲料或酸奶々大料。如本文中所用，術(shù)語"食物"是含義極廣泛的，因為它意圖包括人的食物以及動物的食物(即銅料)。在一些優(yōu)選的實施方案中，食物用于人類消費。如本文中所用，術(shù)語"飼料"包括原始和加工的植物材料和非植物材料。該術(shù)語包括適于動物消費的任何飼料，所述的動物包括但不限于家畜、禽、魚、甲殼動物和/或?qū)櫸?。噬菌體抗性菌林和起子培養(yǎng)物的開發(fā)在研發(fā)本發(fā)明期間，已經(jīng)闡明了涉及CRISPR-c"s基因的噬菌體抗性，及它們在抗輸入外來DNA抗性中的作用以及插入在CRISPR內(nèi)部的間隔區(qū)在這種抗性的特異性中的作用。重要地，本發(fā)明提供了用于開發(fā)噬菌體抗性菌林和起子培養(yǎng)物的方法和組合物。在這些實施方案中，使親代菌林"A"暴露于噬菌體"P"并選擇噬菌體抗性變體(變體"A1.0")。分析變體"A1.0，，(例如通過PCR和/或DNA測序)以證實CRISPR基因座內(nèi)存在額外插入的間隔區(qū)。隨后測定該額外間隔區(qū)(間隔區(qū)Spl.0)的核苷酸序列。一般地，間隔區(qū)Spl.0是來自噬菌體P的大小大約30個核苷酸的片段，并且賦予針對噬菌體P和相關(guān)噬菌體("相關(guān)噬菌"是在其基因組中含有該間隔區(qū)序列的那些噬菌體，并且定義了一個噬菌體科)抗性。獨立于第一種噬菌體暴露，使相同親代菌林A暴露于相同的噬菌體P并且選出第二種噬菌體抗性變體(變體A2.0)。選擇變體A2.0旨在也具有插入CRISPR基因座內(nèi)的額外間隔區(qū)(間隔區(qū)Sp2.0)，但是間隔區(qū)Sp2.0的序列與間隔區(qū)Spl.O的序列不同。一般地，間隔區(qū)Sp2.0是來自噬菌體P的大小大約30個核苷酸的片段，并且賦予針對噬菌體P和相關(guān)噬菌體的抗性。類似地，在一些實施方案中，通過使相同菌林A暴露于相同的噬菌體P產(chǎn)生了變體A3.0至變體Ax.O。選擇全部"A，，變體，旨在也具有插入CRISPR基因座內(nèi)的額外間隔區(qū)(間隔區(qū)SplO至Spx.0)，但是全部"Sp"間隔區(qū)的序列彼此相互不同。一般地，"Sp"間隔區(qū)是來自噬菌體P的大小大約30個核苷酸的片段，并且它們均產(chǎn)生針對噬菌體P和相關(guān)噬菌體的抗性。盡管這些變體是有用的，然而就其抗性的范圍而言，它們是有限的。因此，在一些實施方案中，有利的是開發(fā)第二水平噬菌體抗性菌株。實際上，有利的是通過增加和擴展它們針對噬菌體的抗性而進一步開發(fā)出這些嗟菌體抗性變體。一般地，可以估計抗性的水平將大約是在噬菌體基因組中對應(yīng)于間隔區(qū)的序列內(nèi)出現(xiàn)的單一突變的水平(即大致10_4至10,。因此，在CRISPR基因座內(nèi)累積不同間隔區(qū)的噬菌體抗性菌株對于在謹菌體基因組中含有這些間隔區(qū)的序列的噬菌體具有提高的抗性水平(即因為要求在該噬菌體基因組內(nèi)出現(xiàn)多個單一突變)。在一些實施方案中，第二水平變體以如下方式產(chǎn)生，即通過使變體A1.0暴露于噬菌體P而分離突變噬菌體。一般，這種突變噬菌體(噬菌體P1.0)在其基因組中含有間隔區(qū)Spl.O序列的區(qū)域內(nèi)具有突變(缺失、點突變等)。變體A1.0對噬菌體P1.0敏感。隨后，使變體A1.0暴露于噬菌體P1.0并選擇噬菌體抗性變體(變體A1.1)(見圖15)。還選擇變體Al.l，從而該變體具有插入CRISPR基因座內(nèi)的額外間隔區(qū)(間隔區(qū)Spl.l)，但是間隔區(qū)Spl.l的序列與間隔區(qū)Spl.O、Sp2.0至Spx.0的序列不同。一般地，間隔區(qū)Spl.l是來自噬菌體P1.0的大小大約30個核苷酸的片段，并且將賦予針對噬菌體P1.0和相關(guān)噬菌體的抗性。變體Al.l抵抗噬菌體P1.0并優(yōu)選地具有針對噬菌體P的提高抗性，原因是間隔區(qū)Spl.O和Spl.l的積累。在其它的實施方案中，通過使變體Al.l暴露于噬菌體P1.0而產(chǎn)生新突變的噬菌體(噬菌體Pl.l)。隨后，在變體Al.l暴露于噬菌體Pl.l后，獲得含有一個新的額外間隔區(qū)(Spl.2)的新變體A1.2。該間隔區(qū)賦予針對噬菌體Pl.l的抗性并且優(yōu)選地提高針對噬菌體P1.0和P的抗性(即，因間隔區(qū)Spl.O、Spl.l、Spl.2積累所致)。又在其它的實施方案中，在菌抹A中借助變體A1，隨后變體Al.l，然后變體A1.2等反復(fù)積累不同的間隔區(qū)(例如2、3或4個)以獲得高度抵抗噬菌體的變體(變體Al.n)。在進一步的實施方案中，可以在相同菌株中借助變體A2，隨后變體A2.1，然后變體A2.2等積累額外的不同間隔區(qū)以平行地獲得菌林A的另一種高度抵抗噬菌體的變體(變體A2.n)。將相同的策略用于變體A3.0至Ax.O。在一些實施方案中，提供了抵抗多于一個噬菌體科的菌林。因為給定菌林可以對多于一個噬菌體科敏感，因而在一些實施方案中，希望通過在CRISPR基因座內(nèi)導(dǎo)入源自其余噬菌體科的額外間隔區(qū)而擴大菌林針對多個噬菌體科的抗性(見圖16)。例如，噬菌體P、Q和R是能夠感染菌抹A125的三個噬菌體科的代表性噬菌體。使用以上和本文中概述的方法，產(chǎn)生了抵抗全部三個噬菌體科的變體。在一些實施方案中，噬菌體P用來產(chǎn)生抵抗噬菌體P的變體AlP(含有間隔區(qū)Spl)。隨后，使變體A1P暴露于噬菌體Q并且選出噬菌體抗性變體(變體Alpq)。變體AlPq具有插入CRISPR基因座內(nèi)的一個額外間隔區(qū)(Sql)。一般地，間隔區(qū)Sql是來自噬菌體Q的大小大約30個核苷酸的片段，并且賦予針對噬菌體Q和相關(guān)噬菌體的抗性。變體Aipq抵抗p和Q噬菌體。接下來，使變體Aipq暴露于噬菌體R并且選出噬菌體抗性變體(變體Aipqi)。變體Al,具有插入CRISPR基因座內(nèi)的第三額外間隔區(qū)(Srl)。一般地，Srl是來自噬菌體R的大小大約30個核苷酸的片段，并且也賦予針對噬菌體R和相關(guān)噬菌體的抗性。變體A1,抵抗全部三種噬菌體。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，該變體也抵抗相關(guān)噬菌體。在其它的實施方案中，組合使用以上方法來產(chǎn)生提高和擴展的噬菌體抗性。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，這些變體具有針對多個噬菌體家族的高度抗性。在進一步的實施方案中，產(chǎn)生了這樣的菌林，其抵抗在具體工廠和/或發(fā)酵罐中造成問題的特定噬菌體或噬菌體科。CRISPR介導(dǎo)的免疫性和噬菌體抗性菌林的應(yīng)用與假設(shè)CRISPR或CRISPR間隔區(qū)可能涉及賦予特異免疫性的本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)相反，本發(fā)明部分地基于出乎意料的如下發(fā)現(xiàn)結(jié)果cm基因或蛋白是針對把核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的免疫所需要的。然而，不意圖使本發(fā)明限于任何特定機制、功能及作用方式。甚至更出人意料地，在研發(fā)本發(fā)明期間，發(fā)現(xiàn)一個或多個ow基因或蛋白與CRISPR基因座內(nèi)的兩個或多個CRISPR重復(fù)序列關(guān)聯(lián)。換句話說，cm基因或蛋白似乎對給定的DNACRISPR重復(fù)序列是特異的，這意味c做基因或蛋白和重復(fù)序列形成功能性配對。因此，一個或多個CRISPR間隔區(qū)可與一個或多個這些功能性配對(即CRISPR重復(fù)序列和c似基因)一起使用以調(diào)節(jié)細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性。在一個實施方案中，對于賦予免疫性至細胞的一個或多個CRISPR間隔區(qū)而言，CRISPR重復(fù)序列和cfls基因或蛋白形成功能性組合(即，CRISPR重復(fù)序列和ow基因或蛋白是相容的)。在額外的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了影響細菌對噬菌體的抗性的ow基因/蛋白。在額外的其他優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了用于預(yù)測、確定和/或〗務(wù)飾細菌針對噬菌體的抗性的至少兩個CRISPR重復(fù)序列和至少一個ow基因/蛋白。實際上，本發(fā)明提供了用于修飾細菌溶菌型(即針對多種噬菌體的抗性/敏感性)的方法。因此，鑒定和檢測細胞和噬菌體中的CRISPR基因座提供了確定、預(yù)測和修飾細胞抗性諳以及噬菌體-宿主相互作用的方法。有利地，一個或多個CRISPR基因座、兩個或多個CRISPR重復(fù)序列、一個或多個cfl^基因或蛋白和/或一個或多個CRISPR間隔區(qū)在基因工程中或敏感變體。如下文更詳細地討論，噬菌體是可以在發(fā)酵期間發(fā)育的細菌的天然寄生者。一旦被噬菌體感染，則細菌被殺死，這破壞了發(fā)酵過程。在乳品發(fā)酵中，這些噬菌體感染常常產(chǎn)生重大的經(jīng)濟影響，從降低發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量直至該產(chǎn)物徹底損失。為克服噬菌體問題，起子培養(yǎng)物公司已經(jīng)開發(fā)了多種策略。傳統(tǒng)的起子培養(yǎng)物程序依賴于噬菌體防御輪換策略(PDRS)以使得因噬菌體侵襲所致的失敗最小化(見例如Klaenhammer，Adv.Appl.Microbiol"30:1984];Lawrence等人,J.DairyRes.43:11976)以及Whitehead和Hunter,J.DairyRes.，15:111947j)。這些策略依賴于可能展示不同噬菌體敏感性譜(即不同溶菌型)的多種遺傳上不相關(guān)的菌林。當(dāng)噬菌體在使用定義菌林的發(fā)酵過程期間出現(xiàn)時，理想地是具有不同溶菌型(即，具有不同的噬菌體敏感模式)的菌林替換地用于該發(fā)酵。然而，歷史已經(jīng)證明難以鑒定足夠數(shù)量的不同溶菌型以成功地采用這些策略。實際上，眾多工業(yè)目的菌抹展示出稀有的功能性狀(例如，可快速酸化、組織化的嗜熱鏈球菌)。另外，并非全部菌林均展示適宜性狀以作為起子培養(yǎng)物產(chǎn)生。此外，因為其稀有性和乳品工廠規(guī)模增加，這些菌林被廣泛地使用。傳統(tǒng)的起子培養(yǎng)物輪換策略存在額外的問題。雖然一些菌林在導(dǎo)入時不受已存在的噬菌體侵襲，然而噬菌體往往最終還是出現(xiàn)，原因是侵襲新導(dǎo)入菌林的噬菌體突變、修飾和累積(見例如，Heap和Lawrence,N.Z.J.DairySci.Technol"11:11976；Limsowtin和Terzaghi，N.Z，J.DairySci.Technol"11:251[1976；Pearce，N.Z.J.DairySci.Technol"13:166[1978以及Sanders和Klaenhammer，Appl.Environ.Microbiol"40:5001980)。另外，在眾多情況下，復(fù)雜菌抹輪換的壽命和起子活性是不可預(yù)測的并且經(jīng)常導(dǎo)致早期失敗(見例如，Limsowtin等人，N.Z.J.DairySci.Technol.，13:1[1977;和Thunell等人，J.DairySci"64，22701981)。此外，涉及眾多菌林的延續(xù)輪換提高了污染工廠的噬菌體的水平和多樣性(見例如Heap和Lawrence,N.Z.J.DairySci.Technol.，12:2119811;Lawrence等人，J.DairySci"61:1181[1978;和Thunell等人，J.DairySci.64，2270[麗I)。為了對付噬菌體增殖，傳統(tǒng)的起子培養(yǎng)物程序依賴于使用具有相同或相似技術(shù)功能性但不同噬菌體敏感性的菌林。菌林輪換使用以進行連續(xù)發(fā)酵。這些程序在傳統(tǒng)上依賴于結(jié)果會展示不同噬菌體敏感性(溶菌型)譜的多種遺傳上不相關(guān)的菌林。備選方法(見例如美國專利號5，593，885)使用起子培養(yǎng)物程序，其中所述的起子培養(yǎng)物程序基于展示不同噬菌體敏感性的同基因菌林組，而不M示不同溶菌型的遺傳上不相關(guān)菌抹。如本文中所用，術(shù)語"等基因菌林組(setofisogenicstrains)，，定義了這樣的菌抹，其中從染色體的角度看，所述菌林是相同的，但是每種菌株因存在質(zhì)粒來源的一個或多個噬菌體抗性機制而不同。在這種起子培養(yǎng)物輪換程序中，當(dāng)噬菌體在使用定義菌林的發(fā)酵過程期間出現(xiàn)時，理想地是具有不同溶菌型(即，具有不同的噬菌體敏感性謙)的菌林替換地用于該發(fā)酵。因為這種不同的溶菌型，所述第二菌株不受環(huán)境中蟄伏的噬菌體影響。若該系統(tǒng)如預(yù)期那樣有效的話，大部分的蟄伏噬菌體群體隨后因后續(xù)發(fā)酵和清潔措施被128洗掉，并且當(dāng)?shù)谝痪衷俅斡糜诎l(fā)酵時被根除。本發(fā)明提供了適于解決發(fā)酵工業(yè)中這些問題的方法和組合物。實際上，本發(fā)明提供了用于發(fā)酵工業(yè)和尤其乳品工業(yè)的方法和組合物，其選擇適于滿足噬菌體防御輪換策略要求的菌抹。另外，本發(fā)明提供了適于定制具有適應(yīng)特定噬菌體環(huán)境的溶菌型的菌株的方法和組合物。具體而言，本發(fā)明提供了適于這樣的方法和組合物，所述的方法和組合物適于指導(dǎo)給定菌林向多種溶菌型進化，以產(chǎn)生僅噬菌體敏感性傳(溶菌型)不同而相互不同的菌林。如本文中所述，溶菌型的這種差異是CRISPR-cas系統(tǒng)的功能。在一些優(yōu)選的實施方案中，不同的溶菌型通過"調(diào)節(jié)"噬菌體抗性獲得。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，盡管溶菌型是不同的，然而這種類型的菌林具有相同的代謝(例如碳、氮等的代謝等)并且因此具有相同的功能性(例如，酸化、風(fēng)味、質(zhì)地等)。這提供了用于放大起子輪換構(gòu)建的手段。另外，噬菌體抗性菌林的工業(yè)加工性能是相同的(例如，營養(yǎng)需要、加工操作抗性等)，因而減少了開發(fā)特定生產(chǎn)工藝的要求。實際上，本發(fā)明提供了適于將因噬菌體侵襲所致的發(fā)酵失敗最小化的方法和組合物。在一些實施方案中，提供了用于通過聯(lián)合因溶菌型而不同的多種噬菌體抗性菌林，產(chǎn)生高度抵抗噬菌體的起子培養(yǎng)物的方法和組合物。在一些備選的實施方案中，提供了方法和組合物以產(chǎn)生待用于輪換乳品發(fā)酵中的具有嚴格相同的工業(yè)功能性的起子培養(yǎng)物。在其他實施方案中，提供了這樣的方法和組合物，所述的組合物和方法適于通過導(dǎo)入抵抗乳品廠中常見噬菌體侵襲的新細菌菌林，防止參與這些噬菌體侵襲的噬菌體而替換現(xiàn)有的起子培養(yǎng)物。在一些實施方案中，反復(fù)地使用這些方法和組合物，旨在對付依次的噬菌體侵襲。在一些其它實施方案中，起子培養(yǎng)物是混合的細菌培養(yǎng)物。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，該起子培養(yǎng)物包含等量的僅因其CRISPR和其噬菌體敏感性而不同的多種(即至少2種)噬菌體抗性變體。在一些實施方案中，這些變體屬于第一水平的噬菌體抗性變體(如上文所述，例如變體A1.0加A2.0)。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述變體選自處在第二水平的噬菌體抗性變體(如上文所述，例如變體A1.4加A2.4)中的那些變體。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，所述變體選擇自第三水平的噬菌體抗性變體。在此類混合的細菌培養(yǎng)物中，當(dāng)所述變體之一受給定噬菌體侵襲時，其余變體因其不同的噬菌體敏感性而不受該噬菌體侵襲，并且發(fā)酵沒有受到不利影響。在一些其他實施方案中，使用主要起子培養(yǎng)物和備份起子培養(yǎng)物。這種主要起子培養(yǎng)物由單一菌抹構(gòu)成。在一些實施方案中，該菌林屬于第一水平的噬菌體抗性變體，而在其他優(yōu)選的實施方案中，該菌林屬于第二水平，并且仍在其他更優(yōu)選的實施方案中，該菌林屬于第三水平。在一些優(yōu)選的實施方案中，備份起子培養(yǎng)物基于從相同的親代菌林中獨立獲得的噬菌體抗性變體。該第二種噬菌體抗性變體因其CRISPR而不同于其余變體并且屬于第一水平的噬菌體抗性變體，而在其他優(yōu)選的實施方案中，該菌林屬于第二水平，并且仍在其他更優(yōu)選的實施方案中，該菌林屬于第三水平。例如，在一些實施方案中，主要起子培養(yǎng)物由變體A14制成，并且備份起子培養(yǎng)物由菌抹A2.4制成。當(dāng)發(fā)酵期間噬菌體隨主要起子培養(yǎng)物首次出現(xiàn)后，將這種起子培養(yǎng)物拋棄并以備份起子培養(yǎng)物替換。在一些更優(yōu)選的實施方案中，還制備第三起子培養(yǎng)物作為備份起子培養(yǎng)物，所述的第三起子培養(yǎng)物將充當(dāng)該備份起子培養(yǎng)物的備份。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述起子分別由多種噬菌體抗性變體制成。在另外的其他實施方案中，本發(fā)明提供了適于輪換策略的方法和組合物。在一些實施方案中，作為拋棄常受噬菌體侵襲的起子的替代，以循環(huán)方式使用所述起子，即便觀察到噬菌體侵襲。該策略限制了待開發(fā)的起子的數(shù)目。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，所述起子分別由多種噬菌體抗性菌林而非單一噬菌體抗性菌抹制成。這提供了針對新出現(xiàn)的噬菌體的耐用性提高。在進一步的實施方案中，提供了定制的起子。在一些優(yōu)選的實施方案中，產(chǎn)生噬菌體抗性變體以專門對付在給定發(fā)酵工廠或設(shè)施內(nèi)存在的噬菌體。分型在本發(fā)明的又一方面，提供用于鑒定(例如分型)標記細菌的方法。在一個實施方案中，通過擴增(例如PCR擴增)CRISPR基因座或其部分開展鑒定步驟?？梢栽O(shè)計第一引物以與位于CRISPR基因座的第一CRISPR重復(fù)序列的上游的序列雜交。例如，第一引物可以與CRISPR基因座的共同前導(dǎo)序列的一部分雜交。又例如，第一引物可以與位于CRISPR基因座上游的相鄰基因雜交。第二引物可以距離第一CRISPR間隔區(qū)或至少第一CRISPR間隔區(qū)核心下游雜交。第二引物可以在遠至非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)內(nèi)或甚至在下游相鄰基因中雜交。優(yōu)選地，第二引物在CRISPR基因座內(nèi)雜交。優(yōu)選地，第二引物至少部分地與下游CRISPR間隔區(qū)或CRISPR間隔區(qū)核心雜交。擴增后，可以使用本領(lǐng)域已知的多種方法鑒定標簽序列。例如，可以通過確定擴增產(chǎn)物的限制性模式鑒定標簽序列。因此，一旦已經(jīng)擴增包含CRISPR基因座或其部分的DNA,可以用一個或多個限制性酶消化(例如切割)該DNA。如本文中所用，術(shù)語"限制性酶，，指均在特定核苷酸序列處或其附近切割雙鏈DNA的酶(例如細菌酶)。限制性酶是本領(lǐng)域熟知的并且可以輕易地獲得，例如從多個商業(yè)來源(例如，NewEnglandBiolabs，Inc.,Beverly,Massachusetts)獲得。類似地，使用限制性酶的方法通常也是本領(lǐng)域熟知且例行的。可以使用在切割CRISPR基因座或其部分時產(chǎn)生10-24個DNA片段的限制性酶。此類酶的實例包括但不限于M^/和r印5W7。使用限制性酶獲得的DNA片段可以例如作為條帶通過凝膠電泳進行檢測。限制性酶可以用來產(chǎn)生限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)。RFLP通過用限制性核酸內(nèi)切酶切割("限制")DNA分子產(chǎn)生。上百種此類酶已經(jīng)如同細菌天然產(chǎn)生的那樣;陂分離。本質(zhì)上，細菌^f吏用此類酶作為防御系統(tǒng)來識別并隨后切割(限制)可能進入細胞(例如病毒感染)的任意外來DNA分子。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)上百種不同限制性酶的每一種酶在組成全部DNA分子的4種堿性核苷酸(A、T、G、C)的不同序列處切割("切開"或"限制，，)DNA，例如，一種酶可能特異地并且僅僅識別序列A-A-T-G-A-C，而另一種酶可能特異地并且僅僅識別序列G-T-A-C-T-A等。取決于所涉及的獨特酶，此類識別序列的長度可以變化，從少至4個核苷酸至多達21個核苷酸。識別序列越大，將產(chǎn)生越少的限制性片段，因為識別位點越大，該序列在整個DNA中重復(fù)的概率越低。又例如，可以通過確定擴增產(chǎn)物或還通過確定擴增產(chǎn)物大小的差異來鑒定標簽序列?？梢酝ㄟ^適于分離DNA的任意方法實現(xiàn)分離，所述的方法包括但不限于凝膠電泳法、高效液相色鐠法(HPLC)、質(zhì)i普法和使用微流體裝置。在一個實施方案中，擴增產(chǎn)物或DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳法分離。凝膠電泳法借助不同大小的帶電荷分子在電流影響下運動穿過固定相凝膠的速率而將這些分子分離?？梢匀菀椎乜吹竭@些分開的擴增產(chǎn)物或DNA片段，例如通過用溴乙啶染色并在紫外線照射下觀察該凝膠。帶型反映了限制性消化的DNA或擴增產(chǎn)物的大小。又例如，可以通過對擴增產(chǎn)物測序來鑒定標簽序列。擴增產(chǎn)物的序列可以通過本領(lǐng)域已知的任意方法獲得，所述的方法包括自動測序法和手工測序法。見，例如Sambrook等(1989)Molecularcloning:爿JLfl6omtof^Af朋wa/(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork;Roe等(1996)DNA/so/"^w朋cfiS^"ewdwg(重要技術(shù)叢書，JohnWiley&Sons)。使用核酸分子作為探針，或使用能夠與特定核苷酸序列雜交的核酸分子的雜交方法也屬于本發(fā)明的范圍。見，例如Sambrook等(1989)Molecularcloning:爿丄fl60r"to7ikTaw"fl/(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork)。在雜交技術(shù)中，雜交探針可以是基因組DNA片段、PCR擴增產(chǎn)物或其他寡核苷酸，并且可以包含已知核苷酸序列的全部或部分。另外，它可以用可檢測基團(如"P)或任何其他可檢測標記物(如其他放射性同位素、熒光化合物、酶、或酶輔助因子)標記。就探針而言，術(shù)語"標記"意圖包括通過將可檢測物質(zhì)偶聯(lián)(即物理連接)至探針而直接標記該探針，以及通過與被間接標記的另一種試劑的反應(yīng)性而間接地標記該探針。間接標記的實例包括用生物素對DNA探針的末端標記，從而該DNA探針可以用熒光標記的鏈親和素檢測。還包括了包括檢測或區(qū)分細菌菌林的雜交技術(shù)在內(nèi)的方法。這些方法包括但不限于DNA印跡(見，例如VanEmbden等(1993)/CZ/m.AT/ciy^/o/.31:406-409)、遷移運動測定法(見，例如美國公開申請?zhí)?0030219778)、使用寡核苷酸陣列的測序測定法(見，例如Pease等(1994)iVoc.7Vfl汰JcW.tAS^91:5022-5026)、間隔區(qū)寡核苷酸分型(spoligotyping)(見，例如，Kamerbeek等(1997)/C/iii.M,VroM/.35:907-914)、熒光原位雜交(FISH)(見，例如，Amann等(1990)/5""e/7》/.172:762-770)和異雙鏈體追蹤測定或異雙鏈體移動分析(見，例如，White等(2000)/C7//i.M/cr仏38:477-482)。鑒定的標簽序列可以與噬菌體序列數(shù)據(jù)庫和/或細菌序列數(shù)據(jù)庫比較。一般地，該標簽序列將與噬菌體序列數(shù)據(jù)庫中而非與細菌序列數(shù)據(jù)庫中的一個或多個序列匹配。當(dāng)使用本文中所述的方法制備新的標記細菌時，可以產(chǎn)生允許特異性鑒定已經(jīng)^f支標記的細菌的標記數(shù)據(jù)庫。在一個方面，提供了從噬菌體獲得或可獲得的序列用于標記和/或鑒定細菌的用途(例如在制造標記細菌中)，其中所述的序列整合在親代細菌的CRISPR基因座的一端。在又一方面，提供從噬菌體獲得或可獲得的序列用于標記和/或鑒定細菌的用途(例如在制造標記細菌中)，其中所述的序列包含(i)與所述細菌的CRISPR基因座中的CRISPR重復(fù)序列同源(例如同一)的至少一個序列；和(ii)標簽序列。在又一方面，提供了序列(例如在制造標記細菌中)用于標記和/或鑒定細菌的用途，其中所述序列通過如下方式獲得或可獲得(a)使親代細菌暴露于噬菌體；(b)選擇噬菌體不敏感性突變體；(c)比較來自親代細菌和所述喧菌體不敏感性突變體的CRISPR基因座或其部分；和(d)在所述噬菌體不敏感性突變體的CRISPR基因座或其部分中選擇在親代細菌中不存在的序列。CRISPR和真核生物如本文中詳述，已經(jīng)證實CRISPR在原核生物中提供針對輸入性核酸的抗性。具體地，已經(jīng)證實與病毒DNA(例如噬菌體核酸)顯示同源性的CRISPR間隔區(qū)提供針對病毒的抗性，其中所述的病毒與至少一個間隔區(qū)序列共有序列同一性。然而，還構(gòu)思了針對目前還不含CRISPR基因座的細胞的CRISPR系統(tǒng)(包括ow基因和/或蛋白以及間隔區(qū)、重復(fù)序列、前導(dǎo)序列和非轉(zhuǎn)錄尾區(qū))將用于從頭提供針對核酸的抗性。實際上在一些實施方案中，此類操作用于多種真核生物，包括但不限于人類、其他動物、真菌等。構(gòu)思了使用本領(lǐng)域已知的任意合適方法(包括但不限于通過質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化法)將CRISPR系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到真核細胞中。在這些實施方案中，在質(zhì)粒DNA中包含CRISPR基因座以及必要的轉(zhuǎn)錄/翻譯信號，均用于該序列在真核細胞中的表達和功能。在一些其它實施方案中，如下設(shè)計間隔區(qū)序列，從而它們與感染所涉及宿主的目的病毒序列具有同一性。在一些優(yōu)選的實施方案中，這些方法和組合物向宿主細胞提供針對病毒的抗性，其中所述的病毒與導(dǎo)入細胞的CRISPR間隔區(qū)共有序列同一性。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，所述病毒包括但不限于HlV、正粘病毒、副粘病毒、假粘病泰pseudomyxoviruse)、RSV、流感病毒、麻滲病毒、水痘病毒、風(fēng)滲病毒、冠狀病毒、肝炎病毒、嵌杯4#、痘病毒、皰滲病毒、腺病毒、乳多空病毒、乳頭瘤病毒、腸病毒、蟲媒病毒、狂犬病毒、砂粒樣病毒、蟲媒病毒、鼻病毒、呼腸孤病毒、冠狀病毒、呼腸孤病毒、輪狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等。在其他實施方案中，特異地靶向CRISPR間隔區(qū)中高度保守的核酸序列導(dǎo)致真核細胞中針對此類病毒的抗性提高。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，所述真核細胞是人細胞。134CRISPR和噬菌體抗性突變體的產(chǎn)生在研發(fā)本發(fā)明期間，開展實驗以確定CRISPR基因座在天然產(chǎn)生謹菌體抗性突變體期間是否改變。選擇噬菌體-宿主模型系統(tǒng)，所述的模型系統(tǒng)由乳品工業(yè)中廣泛使用的噬菌體敏感的野生型嗜熱鏈球菌菌抹DGCC7710(WT)和從工業(yè)酸奶樣品分離的兩種不同但親緣密切的烈性謹菌體(即噬菌體858和噬菌體2972)組成(Levesque等人，Appl.Environ.Microbiol"71:4057[2005)。通過用噬菌體858、噢菌體2972或同時用這兩種噬菌體攻擊野生型菌林而獨立地產(chǎn)生9種噬菌體抗性突變體，并且分析它們的CRISPR基因座。在CRISPR1基因座中一致地觀察到差異，其中1至4個額外間隔區(qū)靠近野生型菌林中的32個間隔區(qū)處插入(見圖9)。應(yīng)答于噬菌體感染時新間隔區(qū)的添加似乎偏向于CRISPR1基因座的一端。這與在多種菌林中CRISPR基因座的前導(dǎo)序列末端處間隔區(qū)超變性的先前觀察結(jié)果(見例如Pourcel等人，Microbiol.，151:653[2005和Lillestol等人，Archaea2:59[2006)相一致。對插入多種噬菌體抗性突變體的CRISPR1基因座中的額外間隔區(qū)的序列分析揭示了與攻擊所用噬菌體的基因組中存在的序列的相似性。在整個噬菌體基因組范圍內(nèi)，在大部分功能性模塊(在編碼鏈和非編碼鏈上)中觀察到相似性。似乎沒有專門地以特定序列、基因或功能組為耙標。這些結(jié)果表明在變得抵抗噬菌體后，CRISPR1基因座通過整合顯然從噬菌體DNA衍生的新間隔區(qū)而受到修飾。然而，不意圖使本發(fā)明限于任何具體機制。出人意料地，觀察到一些菌林抵抗兩種噬菌體而其他菌株僅抵抗攻毒中所用的嗟菌體(見圖9)。噬菌體抗性譜似乎與間隔區(qū)內(nèi)容物相關(guān)，因而具有對兩種噬菌體中的保守序列顯示100%同一性的間隔區(qū)(如間隔區(qū)S3、S6和S7)的菌林抵抗兩種噬菌體。相反，在間隔區(qū)與噬菌體序列(在29或30個核苷酸范圍內(nèi)從1至15個SNP)之間觀察到核苷酸多態(tài)性時，該間隔區(qū)似乎不提供抗性，如間隔區(qū)S1、S2、S4、S5和S8(見圖9)。另外，當(dāng)插入幾個間隔區(qū)(S9-S14)時，噬菌體抗性水平較高。這些研究結(jié)果表明CRISPR1基因座易遭受由噬菌體暴露推動的動態(tài)和快的進化改變。這些結(jié)果表明實際上CRISPR基因座可以在產(chǎn)生噬菌體抗性突變體期間被改變并且可以建立CRISPR內(nèi)容物與噬菌體敏感性之間的聯(lián)系。因此，認為與噬菌體序列相同的CRISPR間隔區(qū)的存在提供了針對含有這種特定序列的噬菌體的抗性。為確定CRISPR間隔區(qū)內(nèi)容物是否定義噬菌體抗性，CRISPR1基因座通過添加和缺失間隔區(qū)進行改變，并且測試了針對噬菌體的菌抹敏感性。使用本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生全部構(gòu)建體并將它們整合到嗜熱鏈球菌染色體中(例如Russell和KIaenhammer，Appl.Environ.Microbiol"67:4361[2001)。將菌林WT則s8+s^的CRISPRl基因座中的間隔區(qū)和重復(fù)序列除去并替換為沒有任何間隔區(qū)的單個重復(fù)序列。所得菌抹WTo>S5/slS2ACRISPRl對噬菌體858敏感，表明原初的噬菌體抗性突變體(WT刺58+s^)的噬菌體抗性可能與Sl和S2的存在有關(guān)(見圖10)。另夕卜，為確定添加間隔區(qū)是否提供新的噬菌體抗性，將菌林WT02972+S4的CRISPR1基因座替換為僅含間隔區(qū)Sl和S2的形式。隨后測試所得構(gòu)建體的噬菌體敏感性。所得菌抹WTa>2972+S4::pSlS2獲得針對噬菌體858的抗性，表明這兩個間隔區(qū)具有從頭提供噬菌體抗性的能力(見圖10)。這些觀察到的修飾作用建立了CRISPR間隔區(qū)內(nèi)容物與噬菌體抗性之間的聯(lián)系。在產(chǎn)生菌林WT鵬8+s^ACRISPRl的過程中，產(chǎn)生了含有整合載體的變體WTo>858+slS2::pR，其中所述的整合載體具有在基因與天然CRISPR1基因座之間插入的單個重復(fù)序列(見圖10)。出乎意料地，菌抹WTo858+s^::pR對噬菌體858敏感，盡管間隔區(qū)S1和S2仍在染色體上存在(見圖10)。類似地，WTj>2972+s4::pSlS2構(gòu)建體丟失對噬菌體2972的抗性，盡管間隔區(qū)S4存在于染色體上(見圖10)。這些結(jié)果表明單靠間隔區(qū)無法提供抗性，并且也許它們不得不處在特定的遺傳環(huán)境中以發(fā)揮作用。雖然早期實驗提出參與DNA修復(fù)(Makarova等人，Nucl.AcidsRes.，30:482[2002)，現(xiàn)今假說是ois基因(Jansen等人，Mol.Microbiol"43:1520021;和Haft等人，PloSComput.Biol"l:e602005)參與了CRISPR介導(dǎo)的免疫性(Makarova等人，Biol.Direct.1:7[2006)。在額外的實驗中，使菌林WT則58+s^中的兩個cflw基因即ow5(COG3513)和cm7失活，所述的兩個coy基因分別等同于W/y657/y似M57和s/W66"/y似MM(見，Bolotin等人，NatBiotechnol"22:1554[2004;和Bolotin等人，Microbiol""1:2551[20051)。c"s5失活導(dǎo)致噬菌體抗性丟失(見圖10)。另外，有可能Cas5作為核酸酶發(fā)揮作用，因為它含有HNH型核酸酶基序。相反，c^7失活不改變針對噬菌體858的抗性(見圖10)。然而，不意圖使本發(fā)明限于任何特定機制。另夕卜，旨在從my7敲除中產(chǎn)生CRISPR1噬菌體抗性突變體的實驗沒有起作用。雖然不意圖使本發(fā)明限于任何特定機制，然而這可能是因為Cas7參與新間隔區(qū)和額外重復(fù)序列的合成和/或插入。在測試噬菌體抗性突變體的敏感性后，發(fā)現(xiàn)蝕斑形成大幅度減少，但是一個相對小的噬菌體群體仍保留感染該突變體的能力。進一步分析從噬菌體858衍生的保留感染W(wǎng)T鵬58+s^能力的噬菌體變體。特別地，研究兩種烈性噬菌體變體中與額外間隔區(qū)Sl和S2對應(yīng)的基因組區(qū)的序列。在這兩種情況下，將噬菌體變體的基因組序列突變并且在對應(yīng)于間隔區(qū)Sl的序列中鑒定到兩個不同的單核苷酸多態(tài)性(見圖13)?？傮w而言，原核生物似乎演化了一種基于核酸的"免疫性"系統(tǒng)，其中特異性由CRISPR間隔區(qū)內(nèi)容物決定，而抗性由Cas酶裝置提供。另外，推測不直接提供抗性的某些ow基因作為適應(yīng)性"免疫"應(yīng)答的一部分，實際地參與額外CRISPR間隔區(qū)和重復(fù)序列的插入。這種基于核酸的系統(tǒng)與真核生物中基于氨基酸的對應(yīng)系統(tǒng)形成對比，其中適應(yīng)免疫性是不可遺傳的。CRISPR間隔區(qū)的這種可遺傳性質(zhì)支持CRISPR基因座作為靶標用于進化、分型和比較基因組研究的用途(見，上文的Pourcel等；Groenen等人，Mol.Microbiol"10:1057[1993；Mongodin等人，J.Bacteriol"187:4935[2005；和DeBoy等人，J.Bacteriol.,188:2364[2006)。因為這種系統(tǒng)對噬菌體環(huán)境有反應(yīng)，它可能在原核生物進化和生態(tài)中發(fā)揮重要作用并且提供了了解噬菌體暴露的歷史視角以及噬菌體敏感性的預(yù)測工具。然而，不意圖使本發(fā)明限于任何特定機制。盡管如此，本發(fā)明提供了使用CRISPR/c肪系統(tǒng)作為病毒防御手段并且還潛在地減少可移動遺傳元件擴散和減少獲得不利性狀(如抗樣i生物劑的抗性基因和毒力標記)的方法和組合物。在一些實施方案中，還從噬菌體進化角度構(gòu)思了在CRISPR基因座中整合的謹菌體序列也提供額外的錨定點以促進后續(xù)噬菌體感染期間的重組，從而增大噬菌體可用的基因池(見，Hendrix等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:2192[1999)。因為CRISPR基因座存在于大多數(shù)細菌屬中并且普遍存在于古細菌(Archaea)中(見，上文Jansen等；上文Lillestol等；和Goode和BkkertonJ.Mol.Evol.，62:718[2006)，故而它們提供了關(guān)于原核生物與其先祖之間關(guān)系及共定向進化方面新的深刻i人識。生物控制噬菌體本發(fā)明也提供了用于開發(fā)噬菌體作為生物控制劑的方法和組合物。如本文中所示，細菌可以通過將噬菌體衍生序列(間隔區(qū))摻入活躍CRISPR基因座中變得抵抗噬菌體侵襲。噬菌體可以通過在對應(yīng)于該間隔區(qū)的基因組序列或?qū)?yīng)于給定Cas-CRISPR系統(tǒng)的CRISPR基序識別序列內(nèi)突變而逃避這種抗性。通過重復(fù)輪次的噬菌體攻擊以產(chǎn)生宿主菌林CRISPR介導(dǎo)的噬菌體抗性衍生物并且分離噬菌體逃逸突變體，本發(fā)明提供了在指導(dǎo)間隔區(qū)插入的CRISPR靼序列和/或推定的CRISPR識別位點內(nèi)已經(jīng)被改變的噬菌體。另外，本發(fā)明提供了已經(jīng)進行人工設(shè)計從而已消除針對給定Cas-CRISPR系統(tǒng)的CRISPR基序序列的噬菌體。作為混合物或以"依次輪換方案，，使用的這些"改變"的噬菌體降低靶細菌借助CRISPR系統(tǒng)修改抗性的能力。實際上，本發(fā)明提供了烈性噬菌體的多樣集合用作生物控制劑。在特別優(yōu)選的實施方案中，這種多樣性以CRISPR定向的噬菌體抗性機制為靶，從而嚴重降低或消除該宿主生物針對噬菌體4曼襲(通過CRISPR)迅速演化的能力。多樣性噬菌體的施用(作為混合物或以依次輪換方式)還減少宿主生物^^改或演化CRISPR定向的噬菌體抗性的可能性。噬菌體是天然的抗微生物劑，其已經(jīng)作為抗生素的備選治療劑得到廣泛研究。因多重抗生素耐藥性病原體的擴增，這種興趣最近再次興起。與抗生素的情況一樣，細菌已經(jīng)發(fā)展了多種機制來克服噬菌體侵襲。本發(fā)明提供了涉及在介導(dǎo)噬菌體抗性中使用Cas-CRISPR來產(chǎn)生多樣謹菌體群體、產(chǎn)生缺少CRISPR基序序列的人工噬菌體的方法和組合物，和使用此類噬菌體的方法，其中所述的噬菌體將降低靶生物發(fā)展針對該噬菌體的抗性的能力。如本文中詳述，已經(jīng)在包括病原生物屬實例的大范圍生物中描述了Cas-CRISPR系統(tǒng)。噬菌體感染后，可以發(fā)現(xiàn)逃脫裂解的細菌在CRISPR基因座中含有新的間隔區(qū)序列。這種新間隔區(qū)一般具有作為給定CRISPR基因座特征的定義長度并且從該新間隔區(qū)對噬菌體產(chǎn)生抗性的侵襲性噬菌體基因組衍生。因為單個間隔區(qū)的賦予抗性水平經(jīng)常不完全，故噬菌體可以逃避這種機制。對"逃逸噬菌體"的分析表明基因組在抗性宿主變體中發(fā)現(xiàn)的相應(yīng)間隔區(qū)序列內(nèi)或其附近是突變的。另外，所述"逃逸噬菌體"對于CRISPR介導(dǎo)的宿主變體具有完全毒力，其中所述逃逸噬菌體從所述宿主變體4汙生。治療性噬菌體與傳統(tǒng)抗生素相區(qū)別的一個獨特方面是以指數(shù)方式連同感染細菌一起增殖的能力。盡管從藥理學(xué)的角度看，這可以是有利的，不過這也為噬菌體提供了針對靶細菌對抗噬菌體侵襲的適應(yīng)性應(yīng)答而演化的獨特機會。細菌已經(jīng)發(fā)展了幾種針對烈性噬菌體的防御機制。如本文中所示，Cas-CRISPR基因座在賦予細菌的噬菌體抗性中發(fā)揮作用。在噬菌體感染后，分析幸存的細菌，發(fā)現(xiàn)一些細菌分離林已經(jīng)在其固有CRISPR基因座中插入了新間隔區(qū)元件，該間隔區(qū)元件的序列與相應(yīng)噬菌體基因組中存在的序列相同。當(dāng)用噬菌體攻擊時，第一代CRISPR-介導(dǎo)的這些噬菌體抗性變體產(chǎn)生蝕斑；發(fā)現(xiàn)其噬菌體對親代菌林和衍生物這兩者都完全感染。對這些"CRISPR逃逸，，噬菌體的分析表明其基因組在與噬菌體抗性變體攜帶的CRISPR間隔區(qū)對應(yīng)的序列或鄰近序列中是突變的，其中認為所述的鄰近序列指導(dǎo)間隔區(qū)插入并被鑒定為給定Cas-CRISPR系統(tǒng)特異的CRISPR基序。因此，"CRISPR逃逸"噬菌體潛在地比親代噬菌體和笫一代變體具有更強毒力，因為這種噬菌體能夠感染親代菌抹和第一代CRISPR變體。如上所示，已經(jīng)在包括已知病原體和腐敗^:生物的實例在內(nèi)的細菌的幾個屬/種中鑒定了CRISPR基因座。又如本文中所述，本發(fā)明提供了利用與Cas蛋白組合的CRISPR基因座來賦予對抗侵入性外來DNA、尤其噬菌體的"免疫性"的方法和組合物。又如本文中所述，攜帶了含有與噬菌體基因組內(nèi)的相應(yīng)序列同一的間隔區(qū)(即"原型間隔區(qū)")的"活性"CRISPR-c肪基因座的細菌菌抹賦予該細菌菌林針對噬菌體的抗性。在一些優(yōu)選的實施方案中，生物控制噬菌體的基因組序列是已知的。在一些特別優(yōu)選的方法中，對分離的靶微生物檢驗CRISPR基因座的存在。在一些優(yōu)選的實施方案中，使用這樣的PCR，其中所述的PCR使用針對分布在靶微生物CRISPR基因座側(cè)翼的保守序列的特異性引物。在一些優(yōu)選的實施方案中，將擴增產(chǎn)物測序并與生物控制噬菌體的基因組序列比較。在一些優(yōu)選的實施方案中，CRISPR噬菌體抗性變體的產(chǎn)生和對間隔區(qū)/原型間隔區(qū)的分析提供了鑒定具體CRISPR基序的方法。一旦鑒定，則使用序列信息來設(shè)計和合成缺少該CRISPR基序的噬菌體。因此，所得噬菌體對CRSPR-c"s介導(dǎo)的抗性不敏感。在這些評定中，缺少與噬菌體基因組具有相似性的間隔區(qū)表明耙^f敫生物對生物控制噬菌體易感。因此，該生物控制噬菌體具有作為生物控制劑的較大程度的毒力和效力。本發(fā)明提供了適用于食品、飼料、醫(yī)藥、和獸醫(yī)工業(yè)中產(chǎn)生具有更廣宿主范圍的噬菌體的方法和組合物，并提供了應(yīng)用更有效地生物控制細菌的方法。本發(fā)明提供了這樣的方法，所述方法產(chǎn)生足夠數(shù)量的經(jīng)改變噬菌體(反應(yīng)于CRISPR)以明顯降低天然細菌演化有效的CRISPR介導(dǎo)的抗性的能力。本發(fā)明也提供了如此設(shè)計從而明顯降低天然細菌進化速率的使用/施用方法。實驗提供以下實施例旨在展示和進一步說明本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案和方面，并且不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。在隨后的實驗公開內(nèi)容中，使用以下縮寫。C(攝氏度)；rpm(轉(zhuǎn)/分鐘)；EbO(水)；HC1(鹽酸)；aa(氨基酸)；bp(堿基對)；kb(千堿基對)；kD(千道爾頓)；gm(克)；ng和ug(微克)；mg(毫克)；ng(納克)；jil和ul(微升)；ml(毫升)；mm(毫米)；nm(納米)；fim和um(微米)；M(摩爾)；mM(毫摩爾)；nM和uM(微摩爾)；U(單位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(分鐘/分鐘)；hr(小時/小時)；MOI(感染復(fù)數(shù))；EOP(成斑效率)；PFU(噬斑形成單位)；MgCl2(氯化鎂)；NaCl(氯化鈉)；OD42q(在420nm處的光密度)；PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)；EtOH(乙醇)；PBS(磷酸鹽緩沖鹽水[150mMNaCl，10mM磷酸鈉緩沖液，pH7.2)；SDS(十二烷基硫酸鈉)；Tris(三(羥甲基)氨基甲烷)；w/v(重量體積比)；v/v(體積/體積)；Amicon(Amicon，Inc.,Beverly,MA);ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas,VA);Amersham(AmershamBiosciences,Inc.,Piscataway，NJ);NEB(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA);BectonDickinson(BectonDickinsonLabware,LincolnPark,NJ);BioRad(BioRad，Richmond,CA);Clontech(CLONTECHLaboratories,PaloAlto,CA);Difco(DifcoLaboratories,Detroit,MI);GIBCOBRL或GibcoBRL(LifeTechnologies,Inc.,Gaithersburg,MD);Sigma(SigmaChemicalCo"St.Louis，MO)和Sorvall(SorvallInstruments,DuPontCo.分公司，BiotechnologySystems,Wilmington,DE)。除非另外說明，本發(fā)明使用化學(xué)、分子生物學(xué)、；敞生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍。此類技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。如本文中所用，DGCC7710也稱作"WT";DGCC7710RH1也稱作"DGCC7710-RH1，，和"RH1，，；DGCC7710RH2也稱作"DGCC7710-RH2"和"RH-2";DGCC7778casl也稱作"DGCC7778caslKO"、"CASIKO"和"caslKO";DGCC7778cas4也稱作"DGCC7778cas4KO，，；DGCC7778也稱作"WT0)858+S1S2";DGCC7778RT也稱作"WTO)858+SlS2::pR";141DGCC7778RT，也稱作"WT0858+S1S2ACRISPR1，，；DGCC7710-R2也稱作"WTO)2972+S4"并且DGCC7710-R2S1S2也稱作"WT①2972+s4::pSlS2"。實施例1噬菌體特異性間隔區(qū)的操作在本實施例中，描述了為操作噬菌體特異性間隔區(qū)所實施的實驗。在一些實驗中，描述了將噬菌體特異性間隔區(qū)插入現(xiàn)存的功能性CRISPR以提供針對相應(yīng)噬菌體的抗性。所用的細菌菌林是嗜熱鏈球菌ST0089并且噬菌體是噬菌體2972。嗜熱鏈球菌ST0089是在制造酸奶中使用的工業(yè)上重要的菌一朱。它是遺傳上可操作的，并且對熟知的烈性噬菌體2972易感。在菌林ST0089中確定了CRISPR基因座。這優(yōu)選地通過對ST0089的全基因組測序確定。備選地，使用與先前鑒定的嗜熱鏈球菌CRISPR元件具有相同序列的引物組，通過PCR鑒定CRISPR基因座。一旦鑒定，則確定CRISPR基因座的序列以及含有相關(guān)c肪基因的相鄰區(qū)域。選擇至少一個特定的CRISPR-c船基因座用于進一步操作。通過計算機硅片(insilico)分析間隔區(qū)和它們與噬菌體DNA序列的同源性，確定該基因座的功能性(即，間隔區(qū)序列的不存在和/或存在，和噬菌體感染性與菌林ST0089的相關(guān)性)。在這種相關(guān)性不存在的情況下，基于文獻記錄的全部元件(即重復(fù)序列、間隔區(qū)、前導(dǎo)序列和推定的編碼全長蛋白質(zhì)的c肪基因)，假定有功能性。從噬菌體2972的基因組選擇合適的間隔區(qū)序列。用來選擇間隔區(qū)的標準通?；谠撻g隔區(qū)在所選CRISPR基因座中的長度和與噬菌體序列的同一性(優(yōu)選大約100%)。實際上，任意的合適噬菌體序列可用于本發(fā)明的多個實施方案中。在一些實施方案中，化學(xué)合成了由噬菌體2972間隔區(qū)序列組成的CRISPR單元，側(cè)翼為(與所選CRISPR基因座同一的)兩個重復(fù)元件。根據(jù)定義，這種合成的"CRISPR單元"具有大約100bp長度并且對于確保整合到CRISPR基因座中而言太短。因此，除這個CRISPR單元之外還構(gòu)建了額外的側(cè)翼DNA。產(chǎn)生了與所靶向的CRISPR基因座同一的分布在這種合成的CRISPR單元側(cè)翼的最小500bp同源DNA旨在促進整合。在其它的實施方案中，存在多種方法。在一個實施方案中，構(gòu)建體模擬了向現(xiàn)有CRISPR添加新間隔區(qū)。在一些備選的實施方案中，將完整CRISPR基因座替換為所述合成的CRISPR單元。所得的CRISPR整合體在生物學(xué)測試前通過CRISPR基因座的DNA測序進行-瞼證。另外，測試了該CRISPR整合體針對噬菌體2972的噬菌體敏感性才莫式并與親代菌林比較。構(gòu)建的CRISPR整合體成功展示了特定間隔區(qū)存在與CRISPR-cM的適宜環(huán)境之間的直接相關(guān)性。在額外的實驗中，將同源于噬菌體DNA的間隔區(qū)插入受體細胞。在這些實驗中，設(shè)計了來自噬菌體DNA的抗受體基因中的新CRISPR間隔區(qū)(與噬菌體DNA具有100%同一性)并將其插入細胞的CRISPR基因座中?？故荏w基因成為靶標，原因是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)來自其他菌株的CRISPR間隔區(qū)顯示與噬菌體抗受體基因的相似性。攜帶對噬菌體抗受體基因顯示同一性的間隔區(qū)的4個菌林抵抗這種特定噬菌體。使所述突變體暴露于噬菌體并發(fā)現(xiàn)其具有抗性。在額外的實驗中，將間隔區(qū)插入原初宿主，但不插在CRISPR基因座中。所得突變體保留對噬菌體的敏感性。因此，這些實驗證明間隔區(qū)需要存在于CRISPR和cas基因環(huán)境下的特定環(huán)境中。在其他實驗中，從天然存在的CRISPR基因座中缺失特定的CRISPR間隔區(qū)。這種缺失解除了針對給定噬菌體的免疫性并且宿主對與間隔區(qū)同源的噬菌體變得敏感(即，喪失抗性)。在圖10中提供來自這些實驗的結(jié)果。又在額外的實驗中，將完整的CRISPR重復(fù)序列-c"s組合插入受體細胞中，旨在提供針對新來的核酸的免疫性。在額外的實驗中，使用本文中所述的方法制備包含CRISPR間隔區(qū)的的細胞中的嘗試沒有成功，然而，可以將不含此間隔區(qū)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到細胞中。圖11和12顯示這些結(jié)果。在其他實驗中，交換了在兩個不同菌抹中存在的CRISPR-c做組合。證實這種間隔區(qū)的交換改變了菌林的表型(噬菌體敏感性/抗性)。如本文中所示，將S1S2導(dǎo)入帶有S4的菌林時，噬菌體敏感性發(fā)生轉(zhuǎn)換(見圖10)。在額外的實驗中，制備了不同的cfls-CRISPR重復(fù)序列組合。對于功能性而言，不僅需要cm基因或蛋白，還需要特定的cw-CRISPR重復(fù)序列配對物。當(dāng)提供來自另一CRISPR基因座的c肪基因或蛋白時，該菌抹仍對此噬菌體敏感。仍在額外的實驗中，缺失了(來自功能性CRISPR-c做單元的)一個或多個ow基因。cras基因是對待提供的免疫性而言必需的。C"s突變體仍對該噬菌體敏感，盡管存在與噬菌體DNA同一的間隔區(qū)。在這些實驗中，使c."^5(先前稱作ctf^0和c^7(先前稱作ms^)缺失。顯示C朋5是抗性所需要的。另外，證實cas7是新間隔區(qū)整合所需要的。在額外的實驗中，C肪基因以反式方式提供給宿主。在敲除CflS基因的情況下，免疫性恢復(fù)。實施例2CRISPR間隔區(qū)的整合在這些實驗中，顯示CRISPR間隔區(qū)整合到CRISPR基因座中提供了針對與該CRISPR間隔區(qū)顯示同一性的噬菌體的抗性。在這些實驗中，產(chǎn)生了嗜熱鏈球菌菌株DGCC7710RH1。嗜熱鏈球菌菌林DGCC7710(以編號CNCM1-2423保藏于法國"國家培養(yǎng)物與微生物保藏中心，，)擁有至少3個CRISPR基因座CRISPR1、CRISPR2和CRISPR3。在完整基因組序列已知(Bolotin等人，Microbiol.，151:2551-1561[2005]的嗜熱鏈球菌菌抹CNRZ1066和LMG18311中，CRISPR1位于相同的染色體基因座上在str0660(或stu0660)和str0661(或stu0661)之間。在菌林DGCC7710中，CRISPR1也位于相同的染色體基因座上，在高度相似的基因之間。菌抹DGCC7710的CRISPR1含有33個重復(fù)序列(包括末端重復(fù)序列)并且因此含有32個間隔區(qū)。全部這些間隔區(qū)是彼此不同的。大部分的這些間隔區(qū)是新的(即，在CRISPR基因座中先前未描述過)，不過靠近CRISPR1非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)的4個間隔區(qū)同一于已知的CRISPR1間隔區(qū)。DGCC7710的第28間隔區(qū)與菌林CNRZ1575的第31CRISPR1間隔區(qū)(Genbank登錄號DQ072991)100。/o同一；DGCC7710的第30間隔區(qū)與菌林CNRZ703的第27CRISPR1間隔區(qū)(Genbank登錄號DQ072990)100。/。同一；DGCC7710的第31間隔區(qū)與菌林CNRZ703的笫28CRISPR1間隔區(qū)(Genbank登錄號DQ072990)100%同一；DGCC7710的第32間隔區(qū)與菌林CNRZ703的第30CRISPR1間隔區(qū)(Genbank登錄號DQ072990)100。/。同一。在研發(fā)本發(fā)明期間，使用DGCC7710作為親代菌林并使用噬菌體D858作為烈性噬菌體，分離了作為天然噬菌體抗性突變體的嗜熱鏈球菌菌林DGCC7710RH1。使用一種屬于長尾噬菌體科病毒的噬菌體D858。菌林DGCC7710-RH1的CRISPR1含有34個重復(fù)序列(包括末端重復(fù)序列)并且因此含有33個間隔區(qū)。當(dāng)與嗜熱鏈球菌菌抹DGCC7710的CRISPR1序列比較時，嗜熱鏈球菌菌林DGCC7710-RH1的CRISPR1序列在CRISPR基因座的一端(即，在CRISPR基因座5，端處靠近前導(dǎo)序列)擁有一個額外的新間隔區(qū)(和一個分布在這個新間隔區(qū)側(cè)翼的額外重復(fù)序列)。CRISPR1基因座的其余全部間隔區(qū)保持不變。下文提供菌林DGCC7710-RH1的CRISPR1序列(5'-3，)caaggacagttattgattttataatcactatgtgggtataaaaacgtcaaaatttcatttgagGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACtcaacaattgcaacatcttataacccactttgtttgacagcaaatcaagattcgaattgtaatgacgaggagctattggcacaacttacacgatttgacaatctgctgaccactgttatcacacttggcaggcttattactcaacagcgactgttccttgttcttttgttgtatcttttcttcattcttccgtttttgtttgcgaatcctGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctGaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacjctggcgaggaaacgaacaaggcctcaacac:atagagtggaaaactagaaacagattcaaataatgccgttgaattacacggcaaggtca3agcgagctcgaaataatcttaattacaag2ttcgctagcgtcatgtggtaacgtatttajgcgtcccaatcctgattaatacttactcgaacacagcaagacaagaggatgatgctatgegacacaagaacgtatgcaagagttcaagacaattcttcatccggtaactgctcaagtgaattaagggcatagaaagggagacaacatgegatatttaaaatcattttcataacttcatgcagtatcagcaagcaagctgttagttactataaactatgaaattttataatttttaagaaataatttatggtatagcttaatatcattgtgcatcgagcacgttcgagtttaccgtttctctatatcgaggtcaactaacaattatgctaatcgttcaaattctgttttaggtacatttaatcaatacgacaagagttaaaatggtcttjcttagctgtccaatccacgaacgtggatgeaaccaacggtaacagctactttttacagtsitaactgaaggataggagcttgtaaagtcttaatgctacatctcaaaggatgatcccagaaagtagttgatgacctctacaatggtttatacctagaagcatttgagcgtatattgattgaattttgccccttctttgccccttgactagaccattagcaatcatttgtgcccattgagtgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacagtTtgattcaacataaaaagccagttcaattgaacttggcttt(SEQIDNO:682)在以上序列中，所述前導(dǎo)序列具有序列5，caaggacagttattgattttataatcactatgtgggtataaaaacgtcaaaatttcatttgag3，(SEQIDNO:688)包含CRISPR重復(fù)序列的整合序列—■._.'…'caacatcttataacccactt;SEQIDNO:689)以大寫字母顯示而CRISPR間隔區(qū)(即標簽序歹'J)以小寫字母顯示；兩者在上文均以灰色顯示。CRISPR重復(fù)序列的末端重復(fù)序列和非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)序列顯示如下末端重復(fù)序列5'gtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacagt3'(SEQIDNO:3)非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)序歹'J:5'ttgattcaacataaaaagccagttcaattgaacttggcttt3'(SEQIDNO:691)新間隔區(qū)的序列5-TCAACAATTGCAACATCTTATAACCCACTT(SEQIDNO:534)存在于D858噬菌體基因組中。該間隔區(qū)的序列存在于D858基因組的第31921和31950bp位置之間(即，在正鏈上)(并且與D858基因組序列具有30個核苷酸范圍內(nèi)的100%同一性。間隔區(qū)1tcaacaattgcaacatcttataacccactt30(SEQIDNO:534)D85831921tcaacaattgcaacatcttataacccactt31950(SEQIDNO:534)整合到嗜熱鏈球菌菌林DGCC7710-RH1的CRISPR1基因座中的新間隔區(qū)賦予該菌林針對噬菌體D858的抗性，如圖1和表2-l中所示。表2-l噬菌體2972噬菌體858菌抹B則on1噬菌體敏感性2間隔區(qū)-噬菌體同源性3噬菌體敏感性2間隔區(qū)-噬菌體同源性3DGCC7710s對照s對照DGCC7778858s>10個SNPR100%(2個間隔區(qū))DGCC77"10-RH1858R100%R100%DGCC7710-RH2858R100%R1加％DGCC7778RT858S>10個SNPS1加％但不在cas附近DGCC7778RT'858S>10個SNPS無間隔區(qū)DGCC7778cas"f858s>10個SNPS100%(2個間隔區(qū))但casfKODGCC7778cas4858s>10個SNPR100。/。P個間隔區(qū))但cas4KODGCC7710-R22972R1加％(1個間隔區(qū))S5個SNPDGCC7710-R2S1S22972S1加％但不在cas附近RS1S2100%同一于噬菌體8幼1用來產(chǎn)生噬菌體不敏感性突變體(BIMs)的噬菌體2.菌抹的噬菌體敏感性,S-敏感的，Rz抵抗的，通過斑點和空斑測定確定3.突變體的新間隔區(qū)和用來產(chǎn)生突變體的噬菌體的DNA序列之間的同源性噬菌體保留吸附至突變體的能力另夕卜，在研發(fā)本發(fā)明期間，使用嗜熱鏈球菌菌林DGCC7710作為親代菌林和噬菌體D858作為烈性噬菌體，分離了作為天然噬菌體抗性突變體的嗜熱鏈球菌菌林DGCC7710-RH2。嗜熱鏈球菌菌林DGCC7710-RH2的CRISPR1含有34個重復(fù)序列(包括末端重復(fù)序列)并且因此含有33個間隔區(qū)。與嗜熱鏈球菌菌林147DGCC7710的CRISPR1序列比較時，嗜熱鏈球菌菌林DGCC7710-RH2的CRISPR1序列在CRISPR基因座的一端(即，在CRISPR基因座5'端處靠近前導(dǎo)序列)擁有一個額外的新間隔區(qū)(和一個分布在這個新間隔區(qū)側(cè)翼的額外重復(fù)序列)。CRISPR1基因座的其余全部間隔區(qū)保持不變。下文顯示菌林DGCC7710-RH2的CRISPR1序列(5'-3'):caaggacagttattgattttataatcactatgtgggtataaaaacgtcaaaatttcatttgagGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACttacgtttgaaaagaatatcaaatcaatgatgtttgacagcaaatcaagattcgaattgtaatgacgaggagctattggcacaacttacacgatttgacaatctgctgaccactgttatcacacttggcaggcttattactcaacagcgaetgttccttgttcttttgttgtatcttttcttcattcttccgtttttgtttgcgaatcctgctggcgaggaaacgaacaaggcctcaacaeatagagtggaaaactagaaacagattcaaataatgccgttgaattacacggcaaggtcajagcgagctcgaaataatcttaattacaaggttcgctagcgtcatgtggtaacgtatttaggcgtcccaatcctgattaatacttactcgaacacagcaagacaagaggatgatgctatgcgacacaagaacgtatgcaagagttcaagacaattcttcatccggtaactgctcaagtgaattaagggcatagaaagggagacaacatgcgatatttaaaatcattttcatascttcatgcagtatcagcaagcaagctgttagttactataaactatgaaattttataatttttaagaaataatttatggtatagcttaatatcattgtgcatcgagcacgttcgagtttaccgtttctctatatcgaggtcaactaacaattatgctaatcgttcaaattctgttttaggtacatttaatcaatacgacaagagttaaa這tggtcttgcttagctgtccaatccacgaacgtggatgcaaccaacggtaacagctactttttacagtataactg站ggataggagcttgtaaagtcttaatgctacatctcaaaggatgatcccagaaagtagttgatgacctctacaatggtttatacctagaagcatttgagcgtatattgattgaattttgccccttctttgccccttgactag_accattagcaatcatttgtgcccattgagtGTTTTTOTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAGTttgattcaacataaaaagccagttcaattgaacttggcttt在以上序列中，所述前導(dǎo)序列是5'-caaggacagttattgattttataatcactatgtgggtataaaaacgtcaaaatttcatttgag-3'(SEQIDNO:688)包含CRISPR重復(fù)序列的整合序列以大寫字母顯示而CRISPR間隔區(qū)(即標簽序列)以小寫字母顯示；兩者在上文均以灰色顯示|GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTCTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaatatcaaatcaatga;SEQIDNO:694)。CRISPR重復(fù)序列的末端重復(fù)序列和非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)序列顯示如下末端重復(fù)序列5'-gtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacagt-3'(SEQIDNO:3)非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)序列5'-ttgattcaacataaaaagccagttcaattgaacttggcttt陽3'(SEQIDNO:691)已經(jīng)顯示所述新間隔區(qū)的序列存在于D858噬菌體基因組中。該間隔區(qū)的序列(SEQIDNO:535)存在于D858基因組的第17215和17244bp位置之間(即，在正鏈上)(并且與D858基因組序列具有30個核苷酸范圍內(nèi)的100%同一性。間隔區(qū)1ttacgtttgaaaagaatatcaaatcaatga30(SEQIDNO:535)D85817215ttacgtttgaaaagaatatcaaatcaatga17244(SEQIDNO:690)整合到嗜熱鏈球菌菌林DGCC7710-RH2的CRISPR1基因座中的新間隔區(qū)賦予嗜熱鏈球菌菌抹DGCC7710-RH2針對噬菌體D858的抗性，如圖2和表2-l中所示(還參見圖10)。實施例3構(gòu)建體整合和敲除在本實施例中，描述了用于構(gòu)建體整合和敲除的方法。在這些實驗中使用的菌林是嗜熱鏈球菌DGCC7710親代菌林，對噬菌體858和2972敏感抵抗858的嗜熱鏈球菌DGCC7778CRISPR突變體嗜熱鏈J求菌DGCC7778caslKO嗜熱鏈球菌DGCC7778cas4KO嗜熱鏈球菌DGCC7778RT嗜熱鏈球菌DGCC7778RT，抵抗2972的嗜熱鏈球菌DGCC7710R2CRISPR突變體嗜熱鏈球菌DGCC7710R2S1S2大腸桿菌EC1000提供pORI28(見，Russell和Klaenhammer,Appl.Environ.Microbiol.,67:43691-4364[2001D大腸桿菌pCR2.1TOPO提供pTOPO(見，Invitrogen目錄號弁K4500陽01)在這些實驗中使用了如下質(zhì)粒pTOPO，一種用于亞克隆多種構(gòu)建體的質(zhì)粒pTOPOoiWko含有的整合片段pTOPOc"Wko含有M5^的整合片段pTOPOSlS2含有S1S2間隔區(qū)構(gòu)建體pTOPORT含有RT末端重復(fù)序列構(gòu)建體pORI28是一種用于在嗜熱鏈球菌菌林染色體中整合多種構(gòu)建體的質(zhì)粒pORIowJko含有c肪/的整合片段pORIcflWko含有的整合片段pORISlS2含有S1S2間隔區(qū)構(gòu)建體pUrist含有RT末端重復(fù)序列構(gòu)建體在這些實驗中使用了下列引物Casl5，-caaatggatagagaaacgc-3，(SEQIDNO:670)和5，國ctgataaggtgttcgttgtcc-3，(SEQIDNO:671)Cas45，-ggagcagatggaatacaagaaagg-3，(SEQIDNO:672)和5，國gagagactaggttgtctcagca-3，(SEQIDNO:673)S1S2和RTPl5，誦acaaacaacagagaagtatctcattg誦3，(SEQIDNO:666)P25,-aacgagtacactcactatttgtacg-3，(SEQIDNO:667)P35，畫tccactcacgtacaaatagtgagtgtactcgtttttgtattctcaagatttaagtaactgtacagtttgattcaacataaaaag畫3，(SEQIDNO:668)P45'-ctttccttcatcctcgctttggtt-3，(SEQIDNO:669)菌林和噬菌體從Danisco培養(yǎng)物保藏中心或從所參考資料(Russell和Klaenhammer，Appl.Environ.Microbiol"67:43691-4364[2001；和Levesque等人，Appl.Environ.Microbiol"71:4057-4068[2005])獲得。使用本領(lǐng)域已知的方法實施噬菌體制備、純化和試驗(見例如，Duplessis等人，Virol"340:192-208[2005；和Levesque等人，Appl.Environ.Microbiol"71:4057-4068[2005])。嗜熱鏈球菌菌林在37°C或42°C在補充有0.5%乳糖或蔗糖的M17(Difco)中培育。對于噬菌體感染，將10mMCaCh在噬菌體感染之前添加至該培養(yǎng)基，如本領(lǐng)域已知(見例如，上文的Duplessis等；和上文的Levesque等》用來實施限制性消化和PCR的酶從Invitrogen購買并根據(jù)制造商的說明書使用。如本領(lǐng)域已知的在EppendorfMastercycler梯度熱循環(huán)4義上實施PCR(見例如，Barrangou等人，Appl.Environ.MicrobioL,68:2877-2884[20021)。如先前所述(上文的Russell和Klaenhammer)，使用大腸桿菌作為宿主，通過亞克隆到InvitrogenpCR2.1TOPO系統(tǒng)中，隨后在pORI系統(tǒng)中克隆，并且所述構(gòu)建體最后經(jīng)純化并轉(zhuǎn)化至嗜熱鏈球菌中，通過在嗜熱鏈球菌染色體中同源重組實施基因失活和質(zhì)粒的位點特異性插入。RT構(gòu)建體整合使用如圖4中所示而工程化設(shè)計的RT構(gòu)建體，將該構(gòu)建體緊鄰cas4之后插入，如圖5中所示。親代DGCC7778抵抗噬菌體858。該親代具有與噬菌體858DNA相同的2個間隔區(qū)(S1和D2)。所得菌林(RT)喪失對噬菌體858的抗性。該結(jié)果顯示c船基因需要緊鄰間隔區(qū)以賦予抗性。如圖3中所示，如此設(shè)計親代DGCC7778從而破壞基因，導(dǎo)致抗性喪失，這意味著需要ow7以賦予抗性。如圖3中所示，工程化設(shè)計親代DGCC7778從而co^基因被破壞。另外，S1S2構(gòu)建體整合到親代DGCC7710中，如圖6-8中所示。實施例4噬菌體抗性突變體的分離和CRISPR序列的證實在本實施例中，描述了在分離噬菌體抗性突變體和證實CRISPR序列中使用的方法。通過用噬菌體2972和/或噬菌體858攻擊野生型宿主菌林DGCC7710(又叫作"RD534，，)獲得嗜熱鏈球菌噬菌體抗性突變體(Levesque等人，Appl.Environ.Microbiol.,71:4057[2005)。該宿主菌林在42。C于10ml補充有0.5%乳糖的M17肉湯(LM17)中培育。當(dāng)光密度(600nm)達到0.3時，分別以終濃度107pfu/ml和50mM添加嗟菌體和lOmM氯化鈣。含有噬菌體的培養(yǎng)物在42°C溫育24小時并監(jiān)測裂解作用。隨后，將100fil裂解液接種到10ml新鮮的LM17中。將剩余裂解液離心并將沉淀物接種到含有10ml新鮮LM17的另一管中。這兩份培養(yǎng)物在42。C溫育16小時。最后，將這些培養(yǎng)物稀釋并涂布在LM17上。如本領(lǐng)域已知，對分離的菌落測試噬菌體敏感性(見，Moineau等人，Can.J.Microbiol"38:875[1992)。通過對PCR產(chǎn)物測序并使用本領(lǐng)域已知的相關(guān)噬菌體基因組信息驗證抗性分離林的CRISPR基因座(見，Levesque等人，Appl.Environ.Microbiol"71:4057[2005])。實施例5CRISPR間隔區(qū)工程化設(shè)計在本實施例中，描述了在一些實施方案中用于CRISPR間隔區(qū)工程化設(shè)計的方法。用來實施限制性消化和PCR的酶從Invitrogen購買并根據(jù)制造商的說明書使用。使用本領(lǐng)域已知的方法，在EppendorfMastercycler梯度熱循環(huán)儀上實施PCR。如本領(lǐng)域已知(見,Russell和Klaenhammer，Appl.Environ.Microbiol."67:4361[2001)，使用大腸桿菌作為宿主，通過亞克隆到pCR2.1TOPO系統(tǒng)(Invitrogen)中，隨后在pORI系統(tǒng)中克隆，并且所述構(gòu)建體最后經(jīng)純化并轉(zhuǎn)化至嗜熱鏈球菌中，通過在嗜熱鏈球菌染色體中同源重組實施基因失活和質(zhì)粒的位點特異性插入。在一個反應(yīng)中使用Pl(5'-acaaacaacagagaagtatctcattg-3';SEQIDNO:666)和P2(5'-aacgagtacactcactatttgtacg-3';SEQIDNO:667),并且在另一個反應(yīng)中使用P3(5'國tccactcacgtacaaatagtgagtgtactcgtttttgtattctcaagatttaagtaactgtacagtttgattcaacataaaaag-3;SEQIDNO:668)和P4(5'畫ctttccttcatcctcgctttggtt畫3';SEQIDNO:669)，利用來自突變體WT0858+S1S2的DNA作為模板以擴增兩個不同PCR片段。兩種PCR產(chǎn)物隨后在另一個PCR反應(yīng)中用作模板，使用引物Pl和P4根據(jù)圖11產(chǎn)生S1S2構(gòu)建體。將S1S2構(gòu)建體亞克隆到InvitrogenpCR2.1-TOPO系統(tǒng)中。該構(gòu)建體用A^I和好ZwdIII消化并隨后克隆到pORI的7VWI和歷VidIII位點處，產(chǎn)生pSlS2構(gòu)建體。通過在c肪7的3，端同源重組使pSlS2整合到WT配972+s4的CRISPR1基因座中，以產(chǎn)生WT02972+S4::pSlS2。pR構(gòu)建體使用pSlS2構(gòu)建體作為模板產(chǎn)生。具體而言，使用在CRISPR重復(fù)序列內(nèi)部切割的fisrGI消化亞克隆到pCR2.1-TOPO中的S1S2構(gòu)建體。隨后，使消化產(chǎn)物再連接，并且利用A^I和歷Vidl11，將含有單個重復(fù)序列且不含間隔區(qū)的質(zhì)粒隨后用于克隆到pORI中，產(chǎn)生pR。pR在c"s7的3，端通過同源重組整^^到WT0858+S1S2的染色體，產(chǎn)生了WTa858+slS2::pR，此系其中CRISPR1基因座凈皮替代并且在其位置中插入一個獨特重復(fù)序列的突變體。突變體WTa>858+slS2::pR隨后在紅霉素不存在的情況下培育，并且分析抗生素敏感變體以找到完4^:失CRISPR1基因座的突變體。所述缺失源自O(shè)RF的3，端處發(fā)生的同源重組(這與c肪7的3，端處發(fā)生的重組事件相反，其中所述的重組事件本來會導(dǎo)致WT鵬58+s182菌林恢復(fù))，產(chǎn)生WT鵬58+"S2ACRISPR1(見，圖12)，此系其中CRISPR1基因座缺失的突變153體(還參見圖10)。實施例6cw基因的失活為失活譜5,使用引物5'-caaatggatagagaaacgc-3'(SEQIDNO:670)和5'-ctgataaggtgttcgttgtcc-3'(SEQIDNO:671)，通過PCR擴增c^5的一個801-bp內(nèi)部片段并將其亞克隆到大腸桿菌pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中。該構(gòu)建體用五coRV和JT/"din消化并隨后克隆到pORI的五"RV和J^/"din位點。通過該基因的內(nèi)部片段的同源重組，此構(gòu)建體整合到WTo>858+slS2的ow5基因中，產(chǎn)生WT<p858+slS2::pc"s5-。類似地，使用引物5'-ggagcagatggaatacaagaaagg-3'(SEQIDNO:672)和5'國gagagactaggttgtctcagca畫3'(SEQIDNO:673)，通過PCR擴增c"s7的672-bp內(nèi)部片段并將其亞克隆到大腸桿菌pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中。該構(gòu)建體用五coRV和H/rtdIII消化并隨后克隆到pORI的五"RV和i//dIII位點。通過該基因的內(nèi)部片段的同源重組，此構(gòu)建體整合到WTo>858+slS2的cr做7基因中，產(chǎn)生WTo858+slS2::pc"s7-(見圖10-12)。實施例7用于在CRISPR基因座中插入額外序列的天然方法在本實施例中，描述了用來天然地激發(fā)在細菌菌林的CRISPR基因座內(nèi)插入額外序列的方法。如本文中所用，"額外序列"定義為與CRISPR重復(fù)序列相關(guān)的間隔區(qū)序列。更具體地，"額外序列"部分地源自能夠感染靶細菌的供體噬菌體并部分地來自CRISPR重復(fù)序列的復(fù)制。供體噬菌體DNA導(dǎo)入細菌細胞是因細胞被供體噬菌體感染所致。通過供體噬菌體提供的選擇壓力選擇含有額外序列的細胞，從而所選擇的經(jīng)修飾細胞抵抗此噬菌體。在這些實驗中，使親代菌抹暴露于供體噬菌體并且選出該親代菌林的噬菌體抗性變體(即變異菌林)。分析該變異菌抹(例如通過PCR和/或DNA測序)以證實CRISPR基因座內(nèi)存在額外序列。確定這個額外序列的核*酸序列。一般，該額外序列是來自與CRISPR重復(fù)序列連接(融合)的供體逸菌體的大小大約30個核苷酸的片段并且賦予針對該供體謹菌體的抗性。在一些實驗中，親代菌林在基于乳的培養(yǎng)基中于42°C預(yù)培養(yǎng)過夜?；谌榈呐囵B(yǎng)基隨后用該親代菌林的預(yù)培養(yǎng)物以0.1。/。(v/v)接種并用供體噬菌體混懸液以MOI10接種。在42。C溫育6小時后，將該培養(yǎng)物的稀釋物涂布在營養(yǎng)培養(yǎng)基上，以獲得分離的菌落。隨后測試分離林對此供體噬菌體的抗性(在這些實驗中使用本領(lǐng)域已知的任意合適方法)。隨后對變異菌林分析額外序列在其諸多CRISPR基因座中的一個CRISPR基因座內(nèi)的存在。通過PCR擴增CRISPR基因座，并且使用本領(lǐng)域已知的標準PCR和測序方法，通過DNA測序確定所得PCR產(chǎn)物的核苷酸序列。隨后4吏用本領(lǐng)域已知的標準方法，比較這些序列與親代菌林的序列。在一些實驗中，使用DGCC7710作為親代菌林并且使用D2972作為供體噬菌體。如上所述使親代嗜熱鏈球菌菌林DGCC7710暴露于供體噬菌體D2972。獲得名為WTphi2972+"的變異菌林(見表7-l)。表7-l也包括其他實施例中所描述的變異菌林的結(jié)果。在表7-l中，EOP相對于噬菌體D2972表述。除非另外說明，相對于噬菌體D2972給出所述額外序列在噬菌體基因組中的位置。表7.1對DGCC7710的CRISPR修飾變異菌抹的描述<table>tableseeoriginaldocumentpage155</column></row><table>表7.<table>tableseeoriginaldocumentpage156</column></row><table>表7.1對DGCC7710的CRISPR^"飾變異菌抹的描述<table>tableseeoriginaldocumentpage157</column></row><table>表7.1對DGCC7710的CRISPR修飾變異菌林的描述<table>tableseeoriginaldocumentpage158</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage159</column></row><table>100%同一。在一些額外的實驗中，使用WTphi8S8+slS2::po^5作為親代菌抹并且使用DSSS作為供體噬菌體。所得的名為WTphi柳+s^:p譜5ph鵬+s"的變異菌林(見表7-l)抵抗D858，EOP減少51og。從WTphi858+slS2::pow5phi8S8+S19提取DNA，并且使用一條正向引物(CR3一leadFl，5'-CTGAGATTAATAGTGCGATTACG;SEQIDNO:676)和一條反向引物(CR3—trailR2，5，-GCTGGATATTCGTATAACATGTC;SEQIDNO:677),通過PCR分析其CRISPR3基因座。確定PCR產(chǎn)物的序列并且將其與WTphi858+slS2::pc"s5的CRISPR3基因座的序列比較。與WTphi858+slS2。pc"s5相比，WTphi858+slS2"pcm5phi8S8+S19的區(qū)別之外是在其CRISPR3區(qū)5，端添加一個30bp間隔區(qū)序列及重復(fù)序列發(fā)生重復(fù)。該額外序列與D858基因組序列的比較顯示這個新間隔區(qū)序列與D858基因組從核苷酸33824至核苷酸33853的序列100%同一。在其他額外的實驗中，使用DGCC7809作為親代菌林并且使用D3743作為供體噬菌體。所得的名為DGCC7809phiD3743+s"的變異菌株(見表7-2)抵抗D3743,EOP減少81og。從DGCC7809ph氾3743+s28提取DNA，并且使用一條正向引物(CR3—leadFl,5，-CTGAGATTAATAGTGCGATTACG;SEQIDNO:676)和一條反向引物(CR3_trailR2，5，-GCTGGATATTCGTATAACATGTC;SEQIDNO:677)，通過PCR分析其CRISPR3基因座。確定PCR產(chǎn)物的序列并且與ST0189的CRISPR3基因座的序列比較。與DGCC7809相比，DGCC7809phiD3743+^的區(qū)別之處是在其CRISPR3區(qū)5，端添加了單個29bp間隔區(qū)序列及重復(fù)序列發(fā)生重復(fù)。噬菌體D3743的序列是未知的；然而，所述額外序列與其他鏈球菌噬菌體基因組序列的比較顯示這個新間隔區(qū)序列與噬菌體DT1基因組從核普酸6967至核苷酸6996的序列100%同一。在其他額外的實驗中，使用DGCC3198作為親代菌林并且使用D4241作為供體噬菌體。所得的名為DGCC3198phi4241+S29的變異菌林(見表7-2)抵抗D4241,EOP減少81og。從DGCC3198pW42"+"提取DNA，并且使用一條正向引物(YC70和/或SPIDR-ups(5，-gTCTTTAgAAACTgTgACACC-3，；SEQIDNO:674)和一條反向引物(YC31和/或SPIDR國dws(5'-TAAACAgAgCCTCCCTATCC;SEQIDNO:675)，通過PCR分析CRISPR1基因座。確定PCR產(chǎn)物的序列并且將其與DGCC3198的CRISPR1基因座的序列比較。與DGCC3198相比，DGCC3198phi424!+s29的區(qū)別之處是在其CRISPR1區(qū)5'端添加一個30bp間隔區(qū)序列及重復(fù)序列發(fā)生重復(fù)。噬菌體D4241的序列是未知的；然而，所述額外序列與其他鏈球菌噬菌體基因組序列的比較顯示這個新間隔區(qū)序列與噬菌體DT1基因組從核苷酸3484至核苷酸3455的序列100%同一。下文表7-2提供來自DGCC7809和來自DGCC3198的CRISPR修飾變異菌林的描述。在該表中，EOP相對于供體噬菌體表述。除非另外說明，相對于噬菌體DT1給出所述額外序列在噬菌體基因組中的位置。表7-2對來自DGCC7809和DGCC3198的CRISPR4務(wù)飾變異菌抹的描述<table>tableseeoriginaldocumentpage161</column></row><table>實施例8選擇來自相同親代菌抹的一組CRISPR修飾的變異菌林在本實施例中，描述了用于選擇來自相同親代菌的一組變異菌林的方法，其中所述變異菌林的差別在于源自相同噬菌體的額外序列。由于供體噬菌體的多個部分用作額外序列的來源，因而可以從給定供體噬菌體產(chǎn)生多種不同的變異菌株。另外，每種變異菌抹具有不同的額外序列。因此，除實施例7中所述變異菌林之外，還可以從相同親代菌林產(chǎn)生多種菌抹。在一些實驗中，通過使受體菌林暴露于相同的供體噬菌體產(chǎn)生這些額外菌林。認為所得的多種變異菌林呈現(xiàn)出不同的噬菌體敏感性譜。在獨立的培養(yǎng)物中，使親代菌林經(jīng)歷相同的供體噬菌體作用。對于每種培養(yǎng)物，如實施例7中所述分離單一噬菌體抗性變體并隨后進行分析。相互比較每種變異菌林中的額外序列。使用本領(lǐng)域已知的經(jīng)典微生物學(xué)方法確定變異菌林對供體噬菌體和其他噬菌體的敏感性譜。隨后比較多種菌林的敏感性譜。選擇的變異菌林是具有不同額外序列和不同噬菌體敏感性譜的那些變異菌林。在一些實驗中，使用D2972作為單一供體噬菌體，選擇DGCC7710的多種變異菌林。如實施例7中所述，使親代菌林DGCCT710暴露于4個獨立培養(yǎng)物中的供體噬菌體D2972。從每個培養(yǎng)物中，分離了變異菌林并分別命名為\￥1—2972+54、WTphi2972+s20、WTphi2972+S21#WTphi2972+S22(見表7-l)。這些變異菌抹顯示針對D2972的抗性，因為02972在這4個噬菌體抗性變體上的成斑效率(EOP)減少了3至5log。從\￥!^2972+84、WTphi2972+S20、WTphi2972+S"和WTphi2972+S^提取DNA，并且使用一條正向引物(YC70和/或SPIDR-ups(5，-gTCTTTAgAAACTgTgACACC;SEQIDNO:674)和一條反向引物(YC31和/或SPIDR-dws(5，-TAAACAgAgCCTCCCTATCC;SEQIDNO:675)的組合，使用本領(lǐng)域已知的方法(見，例如上文的Bolotin等[20051)，通過PCR進行分析。確定PCR產(chǎn)物的序列并且將其與DGCC7710的CRISPR1基因座的序列比較。與DGCC7710相比，WTphi2972+S4、WTphi2972+S20、WTphi2972+S"和WTphi2972+S22的差別是在其CRISPRl區(qū)5，端添加了一個30bp間隔區(qū)序列及重復(fù)序列發(fā)生重復(fù)，如圖17中所示。這些新間隔區(qū)序列與D2972基因組序列的比較顯示這些新間隔區(qū)序列分別與D2972基因組從核苷酸31582至核苷酸31611、從核苷酸25693至核苷酸25722、從同一。發(fā)現(xiàn)全部4個額外間隔區(qū)彼此不同并且不同于實施例7中所述的間隔區(qū)。實施例9用于在CRISPR基因座中插入第二額外序列的天然方法在本實施例中，描述了用來引起在CRISPR基因座中插入第二額外序列的天然方法。一旦在細菌CRISPR基因座中插入來自給定供體噬菌體的額外序列后，該變異菌抹對這種噬菌體變得抵抗或至少敏感性較低。因此，實施例7中所述的方法對于在該變異菌林的CRISPR基因座中插入額外序列并非效率更高。例如，使用D2972作為供體噬菌體時，該方法不能應(yīng)用于變異菌株WTphi2972+"(作為親代菌抹)，因為WTphi2972憤對D""具有顯著降低的敏感性(見實施例7)。在一些實驗中，通過使用從D2972衍生的突變供體噬菌體(即"突變噬菌體，，)解決這個問題，其中所述的突變供體噬菌體在其基因組內(nèi)包含至少一個特定<奮飾。通過使供體噬菌體暴露于變異菌抹而選擇這種突變噬菌體，從而親代噬菌體的修飾(即突變)致使此突變噬菌體對變異菌林有毒力。在一些實驗中，突變噬菌體在其基因組的含額外間隔區(qū)序列的區(qū)域內(nèi)具有突變，其中所述的額外間隔區(qū)序列是該變異菌林中的額外序列的一部分。該變異菌林對此突變噬菌體敏感。使該變異菌林暴露于此突變噬菌體并且選擇該變異菌林的噬菌體抗性新變體(第二代變體)。使用本領(lǐng)域已知的合適方法(例如PCR和測序)分析第二代變體以證實在CRISPR基因座內(nèi)存在額外序列。確定此額外序列的核苷酸序列。在一些實驗中，發(fā)現(xiàn)此額外序列含有來自該突變噬菌體的大小大約30個核苷酸的片段，其中所述片段賦予針對該突變噬菌體的抗性。在一些實驗中，該變異菌抹在適宜的基于乳的培養(yǎng)基中在"。C預(yù)培養(yǎng)過夜?；谌榈呐囵B(yǎng)基隨后用變異菌株的預(yù)培養(yǎng)物以濃度約106cfu/ml接種并用供體噬菌體混懸液以大于100的MOI接種。該培養(yǎng)物在42。C溫育過夜并隨后進行離心。收獲上清液并使用0.45jim濾器過濾。濾過的上清液的稀釋物用來接種營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(其中該營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基已用變異菌抹接種)，以使用本領(lǐng)域已知的任意合適方法獲得分離的噬菌體蝕斑。使用本領(lǐng)域已知的任意合適方法，在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中的變異菌林上培育分離的蝕斑。通過0.45jim濾器過濾該培養(yǎng)物獲得突變噬菌體的混懸液。此突變噬菌體隨后如上文所述(見實施例7)用來引起在變異菌株的CRISP驢因座中插入第二額外間隔區(qū)序列。在一些實驗中，使用WTphi2972+S6(見實施例7和表7-l)作為親代菌株并且使用D4724作為供體噬菌體。在高濃度的噬菌體D2972存在下培育變異菌林WTphi2972+S6。使用上文所述方法，通過來自該培養(yǎng)物的上清液在菌林WTphi2972+s6上形成蝕斑，分離了名為D4724的突變噬菌體。*汪了突變噬菌體D4724對WTphi2972+s6的毒力。使變異菌林\￥1^2972+86如實施例7中所述暴露于培養(yǎng)物中的突變噬菌體D4"4。獲得名為WTphi2972+S6phi4724+sls的噬菌體抗性變異菌林(見表7-1)。與WTphi2972+s6相比，該變異菌林顯示對D2972的抗性提高，因為D2972在WTphi2972+S6phi4724+sls上的成斑效率(EOP)減少超過8log(而非41og);另外，與WTphi2972+S6相比，這種抗性也擴大，因為該菌林展示針對D4724的一些抗性(見表9-1)。從WTphi2972+S6ph"724+S"提取DNA，并且使用如上所述的相同引物組合，通過如上所述的PCR分析其CRISPR1基因座。確定PCR產(chǎn)物的序列并且將其與WTphi2972+S6的CRISPR1基因座的序列比較。與WTphi2972+S6相比，WTphi2972+S6phi4724+S15的差別是在其CRISPR1區(qū)5，端添加了30bp間隔區(qū)序列及重復(fù)序列發(fā)生重復(fù)，如圖17中所示。該額外間隔區(qū)序列與D2972基因組序列的比較顯示第二額外間隔區(qū)序列與D2972基因組從核苷酸1113至核苷酸11"的序列100%同一。使用相同的實驗條件從獨立的培養(yǎng)物分離WTphi2972+S6phi4724+S17和WTphi2972+S6phi4724+S24變異菌林并進行分析(見表7-l)。與WTpW2972+S6相比，164這些變異菌林顯示對D2972的抗性提高，因為對于這兩個變異菌株而言，D2972在WTphi2972+S6ph"724+S"和WTphj2972+S6phi4724+S24上的成斑效率(EOP)減少超過81og;并且與WTphi2972+"相比，它們的這種抗性也擴大，因為它們展示針對D4724的一些抗性(見表9-1)。另外，這些變異菌林顯示了在CRISPR1中的額外間隔區(qū)序列，其中所述的額外間隔區(qū)序列分別與D2972列100%同一。在額外的實驗中，使用WTphi2972+S6phi4724+515作為親代菌林并且使用D4733作為供體噬菌體。使用上述方法以從噬菌體D4724產(chǎn)生突變噬菌體D4733。隨后，使用噬菌體D4733以從WTphi2972+s6phi4724+s"獲得噬菌體抗性變異菌林。所得變異菌林名為WTphi297嚴ph"724+Shi4733惡(見表7-l)。該變異菌林含有一個額外序列，其中所述的額外序列包含與來自D2972基因組的序列核苷酸29923至核普酸29894100%同一的間隔區(qū)序列。該變異菌林顯示對D2972的抗性提高，因為在\￥1^2972+86^4724+515內(nèi)4733+816上的成斑效率(EOP)減少超過81og并且其抗性擴大到噬菌體D4733(見表9-l)。表9-l提供對來自DGCC7710的一些CRISPR修飾變異菌林的噬菌體抗性的描述。在該表中，"nd"表示未測定結(jié)果。表9-l對來自DGCC7710的一些CRISPR修飾變異菌林的噬菌體抗性的描述<table>tableseeoriginaldocumentpage165</column></row><table>表9-l對來自DGCC7710的一些CRISPR修飾變異菌抹的噬菌體抗性的描述<table>tableseeoriginaldocumentpage166</column></row><table>仍在其他實驗中，使用WTphi2972+"作為親代菌林并且使用D4720作為供體噬菌體。使用如上文所述的相同方法，從噬菌體D2972產(chǎn)生突變噬菌體D4720。使用噬菌體D4720從WTphi2972+"獲得噬菌體抗性變體。獲得名為WTphi2972+S;4720+S"的變異菌林(見表7-l)。該變異菌林含有含有一個額外序列，其中所述的額外序列包括與來自D29"基因組從核苷酸33968至33997的序列100%同一的間隔區(qū)序列。該變異菌林顯示對D2972的抗性提高，因為D2972在WTphi2972+s4phi4724+S17上的成斑效率(EOP)減少61og(與5log相比)；并且其抗性擴大到噬菌體D4720(見表9-1)。實施例10在CRISPR基因座中插入第二額外序列的備選天然方法在本實施例中，描述了用于在CRISPR基因座中插入第二額外序列的備選天然方法。已知給定親代菌林可能對多于一個噬菌體科敏感。如本文中所述，敏感性的這種多樣性有利地用來在變異菌抹的CRISPR基因座中插入額外序列。在這些實驗中，通過測試所選擇噬菌體對親代菌株和對變異菌林的毒力選出第二供體噬菌體。目的第二供體噬菌體是對兩種菌株均有毒力的那些供體噬菌體。構(gòu)思的是這些噬菌體將有可能代表與初始供體噬菌體所代表的那些科不同的噬菌體科。在選擇后，所述第二供體噬菌體用來感染變異菌林。如上文方法中所述，分離第二代噬菌體抗性變異菌林并檢驗CRISP驢因座中的額外序列。在這些實驗中，使用本領(lǐng)域已知的經(jīng)典微生物學(xué)方法，針對親代菌林測試噬菌體收集物(或含有噬菌體的樣品)。然后使用相同的方法針對變異菌林測試對親代菌林有毒力的噬菌體(或樣品)。選擇對變異菌林有毒力的一種噬菌體(或樣品)作為第二供體噬菌體。在含有噬菌體的樣品的情況下，使用本領(lǐng)域已知的經(jīng)典微生物學(xué)方法在所述變異菌抹上純化一種烈性噬菌體至均一。在一些實驗中，測定了第二供體噬菌體的序列。在一些實驗中，所述第二供體噬菌體隨后如上文所述(見實施例7)用來引起在變異菌林的CRISPR^因座中插入第二額外序列。在一些實驗中，使用WTphi2972+S4(見實施例8和表7-l)作為親代菌林并且使用D858作為供體噬菌體。當(dāng)測試多種噬菌體后，發(fā)現(xiàn)菌林DGCC7710對噬菌體D2972和噬菌體D858均敏感。另外，發(fā)現(xiàn)D858對變異菌株WTphi2972+"有毒力。因此，選擇噬菌體D858作為一些實驗中的第二供體噔菌體。如實施例7中所述，使變異菌株WTphi2972+s4暴露于第二供體噬菌體D858。獲得名為\￥1^2972+84拜58+818的抵抗0858的噬菌體抗性變異菌林(見表9-l)。該菌林顯示對D2972的抗性提高，因為D""在WTphi2972+s、h鵬+s18上的成斑效率(EOP)減少超過810g(與WTphi2972+S4的5log相比，見表9-l)。從WTphi2972+S、hi8S8+S"提取DNA，并且使用如上所述的相同方法和引物，通過PCR分析其CRISPR1基因座。確定PCR產(chǎn)物的序列并且將其與WTphi2972+s4的CRISPR基因座的序列比較。與WTphi2972+S4相比，WTphi2972+S、h附8+S"的差別是在其CRISPRl區(qū)5，端添加了30bp間隔區(qū)序列及重復(fù)序列發(fā)生重復(fù)，如圖17中所示。該額外間隔區(qū)序列與D858基因組序列的比較顯示第二額外間隔區(qū)序列與D858基因組從核苷酸30"8至核苷酸30367的序列100%同一。使用該方法在獨立的實驗工作中，還獲得了名為WTphi2972+S、hj472o+S25的另一個變異菌林(見表7-l)。該變異菌抹含有一個額外序列，其中所述的額外序列包括與來自D858基因組從核苷酸33886至33915的序列100%同一的間隔區(qū)序列。該變異菌林顯示對D2972的抗性提高，因為D2972在WTphi2972+S4phi4724+S25上的成斑效率減少超過71og(見表9-l)。實施例11通過在CRISPR基因座中多次插入額外序列產(chǎn)生抵抗多種噬菌體的CRISPR修飾的變異菌林在本實施例中，描述了通過在CRISPR基因座中反復(fù)添加噬菌體序列而開發(fā)多重噬菌體抗性菌林，因為在CRISPR基因座中添加2種噬菌體序列不足以賦予給定菌抹針對全部噬菌體的抗性。例如，發(fā)現(xiàn)菌林WTphi，+S、hi858+S"(在實施例10中描述)對多種其他噬菌體敏感。在開發(fā)多重噬菌體抗性菌林的過程中，使親代菌抹經(jīng)受第一種噬菌體作用以選擇變異菌林，隨后該變異菌林經(jīng)受第二種噬菌體作用以選擇抵抗兩種噬菌體的第二代變異菌林。隨后，將第二代變異菌林反復(fù)經(jīng)受噬菌體作用，其中所述菌林對所述噬菌體是依然敏感的，直至獲得抵抗全部可獲得的噬菌體的最終變異菌林。使用本領(lǐng)域已知的方法，鑒定了一組10種參照噬菌體，這些噬菌體是能夠在菌林DGCC7710上發(fā)育的多種噬菌體的代表，即噬菌體D858、D1126、D2766、D2972、D3288、D3821、D4083、D4752、D4753和N1495。如實施例7中所述，使DGCC7710暴露于噬菌體D2972以產(chǎn)生變異菌林DGCC9705。發(fā)現(xiàn)除噬菌體D2972之外，DGCC9705還抵抗噬菌體D2766和D4752，但是對如表ll-l中所示的其余噬菌體仍敏感。DGCC9705在表11-1和圖17中描述。DGCC9705在CRISPR1中具有1個額外序列并且在CRISPR3中具有1個額外序列。才艮據(jù)實施例7中所述的方法對CRISPR1基因座的序列和CRISPR3基因座的序列進行分析。確定PCR產(chǎn)物的序列并且將其與DGCC7710的CRISPR1和3基因座的序列比較。DGCC9705在其CRISPR1基因座中具有1個額外間隔區(qū)并且在其CRISPR3基因座中具有l(wèi)個額外間隔區(qū)。間隔區(qū)序列與來自噬菌體D2972的序列相同。使用相同方法，隨后使DGCC9705暴露于噬菌體D3821并且隨后分離變異菌林DGCC9726。除了抵抗D2972之外，DGCC9726還具有針對嗟菌體D858、D3821、D4083和N1495的抗性(見表11-1)。與DGCC9705相比，DGCC9726在其CRISPR1基因座中具有1個額外間隔區(qū)序列(見表7-1和圖17)。該額外間隔區(qū)序列與來自D2972的序列相同。通過使菌抹DGCC9726暴露于噬菌體D3288，分離到DGCC9733。菌林DGCC9733額外地抵抗噬菌體D3288和D1126(見表11-1)。與DGCC9726相比，DGCC9733在其CRISPR1基因座中具有1個額外間隔區(qū)序列(見表7-l和圖17)。該間隔區(qū)序列與鏈球菌噬菌體7201的序列具有某些同一性(25/30堿基對同一性)。最后，通過最終反復(fù)暴露于噬菌體D4753，分離到抵抗全部噬菌體的DGCC9836(見表11-1)。DGCC9836在其CRISPR1基因座中具有2個額外間隔區(qū)序列并在其CRISPR3基因座中具有2個額外間隔區(qū)序列(見表7-l和圖17)。一個間隔區(qū)序列與噬菌體D2972中的一個序列相同，并且其它3個間隔區(qū)序列與噬菌體D858中的序列相同。表11-1提供了關(guān)于CRISPR修飾的變異菌抹DGCC9836和中間的CRISPR修飾的變異菌林的噬菌體敏感性的數(shù)據(jù)。在該表中，"S"表示敏感性并且"R"表示抗性。表11-1CRISPR修飾的變異菌抹DGCC9836和中間的CRISPR修飾的變異菌林的噬菌體敏感性菌抹親代菌林供體噬菌體噬菌體《《QIT)00Q00V)?？沾?0sso。DGCC7710SSSSSssSSsDGCC9705DGCC7710D2972RRRSssssSs169表11-1CRISPR修飾的變異菌林DGCC9836和中間的CRISPR修飾的變異菌林的噬菌體敏感性噬菌體DGCC9726DGCC9705D3821RRRRRRRSSSDGCC9733DGCC7710D3288RRRRRRRRRsDGCC9836DGCC7710D4753RRRRRRRRRR實施例12在CRISPR基因座中插入多個額外序列的天然方法在本實施例中，描述了在CRISPR基因座中插入多個額外序列的方法。在這些方法中，使親代菌林暴露于含有多種噬菌體的混合物，而非反復(fù)使用多種噬菌體。使用本領(lǐng)域已知的經(jīng)典微生物學(xué)方法，針對多個菌抹測試噬菌體收集物，旨在確定它們的宿主譜。選擇對親代菌林有毒力但是具有不同宿主譜的噬菌體。將選擇的噬菌體混合并在上文提供的方法中使用(見實施例7)，以引起在變異菌林的CRISPR基因座中插入額外序列。在一些實驗中，使用DGCC7710作為親代菌林并且使用D^S和D2972作為供體噬菌體。在測試多種噬菌體后，發(fā)現(xiàn)菌林DGCCT710對噬菌體D2972和噬菌體D858均敏感。然而，D2972和D858在菌株DGCC7778上測試時呈現(xiàn)不同的宿主鐠，表明這兩種噬菌體是不同的。使親代菌林DGCC7710如實施例7中所迷暴露于噬菌體D858和D2972的混合物。獲得名為WTph鵬phi2972+sw^的噬菌體抗性變異菌林(見表7-1)。該菌林顯示對D858的抗性，因為D858在WTphi8S8phi2972+S9S1QS11S12上的成斑效率減少超過7log,并且顯示對D2972的抗性，因為D2972在WTphi858phi2972+S9S1()S11S12上的成斑效率減少超過7log。從WTphi858phi，+s難s"^提取DNA，并且使用如上所述的相同方法和引物，通過PCR分析其CRISPR基因座。確定PCR產(chǎn)物的序列并且將其與DGCC7710的CRISPR1基因座的序列和CRISPR3基因座的序列比較。與DGCC7710相比，WTph鵬phi2972+s9訓(xùn)s""2的差別是在其CRISPRl區(qū)5'端添加了4個30bp間隔區(qū)序列及重復(fù)序列發(fā)生重復(fù)，如圖17中所示。所述額外間隔區(qū)序列與D2972基因組序列的比較顯示所述額外間隔區(qū)序列與D2972基因組從核苷酸7874至核苷酸7903、從核苷酸20650至核苷酸20621、從核苷酸8360至核苷酸8389和從核苷酸18998至核苷酸19027的序列100%同一。在其他實驗中，還按照這些方法獲得了菌林WTphi柳phi2972+S"S"(見表7-1)。該菌4朱顯示對D858的抗性，因為D858在WTphi858phi2972上的成斑效率減少7log，并且顯示對D2972的抗性，因為D2972在WTphi858ph頻2+s"s"上的成斑效率減少81og。所述額外間隔區(qū)序列與D2972基因組序列的比較顯示所述額外間隔區(qū)序列與D2972基因組從核苷酸33602至核苦酸33631和從核苷酸4830至核苷酸4801的序列100%同一。實施例13使用CRISPR修飾的變異菌林在發(fā)酵中對抗噬菌體在本實施例中，描述了通過使用變異菌抹而非親代(即野生型，受體)菌林在發(fā)酵中對抗噬菌體的方法。因此，本實施例提供了對由變異菌林所產(chǎn)生益處的又一種描述。在一些實驗中，在乳發(fā)酵中在噬菌體02972存在下進行了菌林DGCC7710與菌林WTphi2972+S2。和菌林WTphi2972+S26S27的比較。DGCC7710是用于乳發(fā)酵中的工業(yè)菌株。菌林WTphi2972+S"在表7-l和在實施例8描述，并且與菌林DGCC7710相比時，在其CRISPR1基因座中具有一個額外間隔區(qū)。與DGCC7710相比時，菌抹WTphi2972+s加顯示針對D"7Z的改善抗性。WTphi2972+s"s"是針對D2972顯示一些抗性的另一種變體(表7-l中描述)并且在其CRISPR1基因座中具有2個額外間隔區(qū)。用每種菌株進行連續(xù)發(fā)酵。首先，將10。/。乳粉培養(yǎng)基(w/v)用測試菌林的l。/。(v/v)預(yù)培養(yǎng)物接種并用104pfu/ml的噬菌體D29"接種。該培養(yǎng)物在42。C溫育6小時。在第一發(fā)酵后，建立第二發(fā)酵。使用完全相同的發(fā)酵條件，除了添加0.1%體積先前發(fā)酵的發(fā)酵物之外(添加前，使用(U5jam濾器m過濾該發(fā)酵物)。隨后，以如第二發(fā)酵所用的相同實驗條件進行后續(xù)發(fā)酵。通過阻抗滴定法記錄全部發(fā)酵。在每個發(fā)酵結(jié)束時，測試乳的凝結(jié)作用并且使用本領(lǐng)域已知的方法進行噬菌體的滴定。在噬菌體不存在的乳發(fā)酵情況下，采用DGCC7710的阻抗變化是在6小時內(nèi)高于2500nS。在D2972存在時(DGCC7710對噬菌體極敏感)，D2972噬菌體在第一培養(yǎng)期間形成高水平的種群并且發(fā)酵未能使乳凝結(jié)。阻抗變化在6小時時總是低于500nS。相反，在02972存在下用\￥1>2972+82°的乳發(fā)酵至少允許乳凝結(jié)直至第三個傳代培養(yǎng)并且注意到噬菌體水平的緩慢演進。阻抗的變化增加到超過2500nS，同樣直至第三個傳代培養(yǎng)。這表明變異菌林\￥1\^2972+82()比親代菌林DGCC7710更適合在噬菌體存在下用于乳酸化。進一步，在D2972存在下用WTphi2972+s"s"發(fā)酵乳則允許乳的凝結(jié)，直至最后的傳代培養(yǎng)，同時無噬菌體發(fā)展。另外，阻抗的變化增加到超過2500jtS，同樣直至最后的傳代培養(yǎng)。這表明變異菌林WTph。972+s"s"比親代菌林DGCC7710更適合并且甚至比WTphi2972+^更適合在噬菌體存在下用于乳酸化。重復(fù)所述實驗，并且在表13-1中呈現(xiàn)結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage173</column></row><table>在第二組實驗中，重復(fù)了在乳發(fā)酵中在噬菌體D2972存在下菌林DGCC7710與菌林WTphi2972+S20和菌林WTphi2972+S26S27的比較。另外，研究了菌林DGCC9836。菌林DGCC9836是DGCC7710的更為進化的變異菌抹，它是多重噬菌體攻擊的結(jié)果。該菌株在其CRISPR1基因座中具有5個額外間隔區(qū)并在其CRISPR3基因座中具有3個額外間隔區(qū)(見實施例ll和圖17)。DGCC9836抵抗全部測試的噬菌體。如上所述開展試驗。在表13-2中顯示結(jié)果。就第一組試驗而言，在D2972存在下用WTphi2972+S"的乳發(fā)酵允許乳凝結(jié)直至第5次傳代培養(yǎng)并且測定到嗟菌體水平的緩慢演進。阻抗的變化在頭5個傳代培養(yǎng)期間增加到超過2500pS，表明乳酸化不受噬菌體影響。在第6次傳代培養(yǎng)時，噬菌體水平顯著升高并且乳發(fā)酵被破壞。對于其他2個變異菌抹，乳發(fā)酵在全部6個傳代培養(yǎng)期間不受影響，噬菌體從未發(fā)生并且記錄的阻抗變化總是高于2500nS。這些實驗表明在其CRISPR1基因座中含有至少一個額外間隔區(qū)序列的菌林允許進行乳發(fā)酵，甚至在噬菌體存在時。當(dāng)菌抹在其CRISPR基因座中具有多于一個額外間隔區(qū)序列時，乳發(fā)酵甚至更安全。表13-2""^用DGCC7710的變異菌林在噬菌體D2972存在下的乳發(fā)酵的比較菌林傳代培養(yǎng)在6小時內(nèi)乳凝在發(fā)酵菌抹上的噬在6小時內(nèi)的阻抗變化物結(jié)菌體水平(tiS)、VT+S20W1phi29721是無31712是無2991是低28714是中等29345是中等2卯66否高6611是無29702是無29453是無26174是無27215是無26606是無2605DGCC98361是無30282是無31153是無27084是無2817是無28456是無2813實施例14使用CRISPR修飾的變異菌林的組合在發(fā)酵中對抗噬菌體在本實施例中，描述了通過使用變異菌株組合而非單一菌林在發(fā)酵中對抗噬菌體的方法。因此，該實施例展示了多于一種變異菌林(即，變異菌林組合)的同時4吏用。實際上，在此類應(yīng)用中使用顯示相同功能性、然而顯示不同噬菌體敏感性模式的菌林混合物。例如，在此類應(yīng)用中使用如本文中所述的2種或3種或更多種變異菌抹。使用在其CRISPR基因座中具有174添加的不同間隔區(qū)序列的變異菌林的組合使得發(fā)酵更容易抵抗新出現(xiàn)的任何突變噬菌體。在一些實驗中，在噬菌體D2972存在下，在乳發(fā)酵中所用的單一菌林WTphi2972+S"和3個菌林(即WTphi2972+S20、WTphi2972+^和WTphi2972+S22)組合之間進行比較。在表7-l和在實施例8中描述菌林WTphi2972+s加、WTphi2972+S21和WTphi2972+s22。它們是DGCC7710的獨立變異菌抹。與菌林DGCC7710相比時，每個變異菌林在其CRISPR1基因座中顯示獨特的額外間隔區(qū)序列(其源自噬菌體D2972)。單用菌林WTphi2972+S"或用三種菌林的組合進行連續(xù)發(fā)酵。首先，10%乳粉培養(yǎng)基(w/v)僅用1。/。(v/v)的所述菌林的預(yù)培養(yǎng)物或用菌林組合接種并且用104pfu/ml的噬菌體D2972接種。培養(yǎng)物在42。C溫育6小時。在第一發(fā)酵后，建立第二發(fā)酵溫。使用完全相同的發(fā)酵條件，除了添加0.1%體積先前發(fā)酵的發(fā)酵物之夕卜(添加前，使用0.45iam濾器過濾該發(fā)酵物)。隨后，使用與第二發(fā)酵所用的相同實驗條件進行后續(xù)發(fā)酵。通過阻抗滴定法記錄全部發(fā)酵。在每個發(fā)酵結(jié)束時，測試乳的凝結(jié)作用并且使用本領(lǐng)域已知的方法進行噬菌體的滴定。重復(fù)所述實驗，并且在表14-1中提供結(jié)果。表"-l~~SWTphi29^+^或用三菌林組合在噬菌體D2972存在下—的乳發(fā)酵的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage176</column></row><table>在兩個實驗中在噬菌體存在下用WTphi2972+S"進行的乳發(fā)酵在第三次傳代培養(yǎng)時失敗。這由發(fā)酵6小時后缺乏乳凝結(jié)和阻抗變化明顯降低顯示。相反，當(dāng)使用三菌林的混合物時，盡管產(chǎn)生了一些噬菌體D2972,然而成功地實施了發(fā)酵直至第五次傳代培養(yǎng)。在全部培養(yǎng)中記錄到乳的凝結(jié)并且阻抗變化在6小時溫育期間從未低于3000pS。這些實驗說明與使用單一變異菌抹相比，使用在其CRISPR1基因座中具有至少一個額外的獨特間隔區(qū)序列的菌林允許在噬菌體存在下進行乳發(fā)酵。實施例15使用CRISPR修飾的變異菌林輪換在發(fā)酵中對抗噬菌體176在額外的實驗中，輪換使用變異菌抹。在一些實驗中，所述菌林具有相同的功能性，但具有不同的噬菌體敏感性模式。因此，在本實施例中，描述了在輪換方案中就反復(fù)/接著使用幾種不同菌抹(即CRISPR修飾的變異菌抹)方面依次實施的實驗。在一些實驗中，在噬菌體D2972存在下，在乳發(fā)酵中僅使用單一菌抹WTphi2972+S21和依次(輪換)使用菌林WTphi2972+S2°、WTphi2972+S21及WTp,72+S"之間進行比較。第一乳發(fā)酵用菌林WTphi2972+^進行。隨后，菌林WTphi2972+^用于第二發(fā)酵，并且菌株WTphi2972+S"用于第三發(fā)酵。第四發(fā)酵隨后再次使用菌林\￥1>2972+82()進行，然后，用菌抹\￥1>2972+82進行發(fā)酵，隨后用WTphi2972+S21，依此類推。在上文表7-l中描述了菌株WTphi2972+s20、WTphi2972+S2>WTphi2972+s22。它們是菌林DGCC7710的獨立變異菌林。與菌林DGCC7710相比時，每個變異菌株在其CRISPR1基因座中顯示獨特的額外間隔區(qū)序列(其源自噬菌體D2972)。使用如實施例14中所述的相同實驗方法進行連續(xù)發(fā)酵。一式三份進行實驗；結(jié)果在表15-1中顯示。僅用WTph。972+s"接種的連續(xù)發(fā)酵是成功的，直至第三次傳代培養(yǎng)，如高于3000^S的阻抗變化值和乳凝結(jié)所示。下一次傳代培養(yǎng)不能使乳凝結(jié)并且記錄到高的噬菌體值。相反，通過輪換用3種不同的變異菌林(WTphi2972+S氣WTphi2972+S"和WTphi2972+S22)接種所產(chǎn)生的連續(xù)發(fā)酵成功進行直至第十次傳代培養(yǎng)。在這些實驗條件下，噬菌體不能增殖并保持低水平。該結(jié)果顯示與使用單一變異菌林相比，使用變異菌株的輪換導(dǎo)致發(fā)酵期間噬菌體抗性改善。表15-1用菌抹輪換在噬菌體D2972存在下的連續(xù)乳發(fā)酵的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage178</column></row><table>實施例16使用CRISPR修飾的變異菌林減少和控制噬菌體群體在本實施例中，描述了為確定CRISPR修飾菌林摧毀噬菌體的能力所實施的實驗，其中已經(jīng)使CRISPR修飾菌林具有抗性。具體地，設(shè)計實驗以確定噬菌體群體在CRISPR修飾菌林發(fā)酵期間是否降低到不可檢測的水平。在一些實驗中，DGCC9836(在實施例11和在圖17中描述)用來在噬菌體D2972存在下進行乳發(fā)酵，與用其親代菌林DGCC7710在D2972存在下進行的發(fā)酵比較。首先，10。/。乳粉培養(yǎng)基(w/v)用測試菌林的約106cfu/ml預(yù)培養(yǎng)物接種并用107pfu/ml的噬菌體D2972接種。培養(yǎng)物在42°C溫育24小時。在各個時間點，取得一小份試樣并且使用接種DGCC7710的雙層瓊脂平板，使用本領(lǐng)域已知的標準方法測定噬菌體群體。結(jié)果在圖20中顯示。在用DGCC7710進行的乳發(fā)酵中，噬菌體D2972發(fā)展成大于108pfu/ml的種群。相反，在用DGCC9836發(fā)酵期間，D2972噬菌體群體在溫育6小時后逐漸下降至非常低水平(120pfu/ml)，并且在在溫育24小時后幾乎檢測不到。這種最后結(jié)果表明噬菌體在用變異菌林DGCC9836發(fā)酵的過程期間被摧毀。與菌林對噬菌體不敏感但對噬菌體無害的傳統(tǒng)起子培養(yǎng)物輪換程序相比，變異菌抹摧毀噬菌體以及對噬菌體不敏感的特性代表了一種額外益處。實際上，通過使用變異菌林，蟄伏噬菌體的根除將通過洗掉噬菌體(就使用傳統(tǒng)起子培養(yǎng)物的輪換而言)和摧毀噬菌體的組合而進行。在其他實驗中，在乳發(fā)酵中在D2972存在下聯(lián)合了針對噬菌體D2972展示一些但不完全抗性的變異菌林。選擇的變異菌林包括如實施例8中和表7-1中所述的\￥1^2972+82()和WTphi2972+S21。這些菌林對噬菌體D2972顯示約5log的EOP降低。乳發(fā)酵如上文所述進行(細菌接種率106cfu/ml;噬菌體接種率1(Tpfll/ml)。用\￥1^2972+82()或用WTphi2972+S"或用這兩種菌林的混合物進行乳發(fā)酵。在多個時間點上，記錄噬菌體群體。為此目的，取得一小份試樣并且使用以\￥1^2972+82()或以WTphi2972+S"接種的雙層瓊脂平板，使用本領(lǐng)域已知的標準方法測定噬菌體群體。在圖21中呈現(xiàn)結(jié)果，所述結(jié)果顯示了對于每個乳發(fā)酵在WTphi2972+^和在WTphi2972+S21中檢測到的噬菌體的總數(shù)。當(dāng)單一菌抹(WTphi2972+^或WTphi2972+S")用于發(fā)酵時，在接種時檢測到的噬菌體的數(shù)目是約100pfu/ml(因5log的EOP降低)。當(dāng)培養(yǎng)后，這個噬菌體數(shù)(分另'j)升高到106或107，對應(yīng)于噬菌體增殖達4至51og。對于用2種菌林接種的乳發(fā)酵而言，噬菌體的增殖倍數(shù)低得多(2log)。實際上，噬菌體的數(shù)目從100pfu/ml升高到最大約104pfu/ml。這些結(jié)果結(jié)論性地證實與使用單一變異菌林進行的培養(yǎng)中的噬菌體繁殖率相比，在2種變異菌林共培養(yǎng)期間，噬菌體的繁殖率顯著降低。實施例17間隔區(qū)的插入在本實施例中，描述了用來在嗜熱鏈球菌DGC7710中插入兩個間隔區(qū)的方法和組合物。嗜熱鏈球菌菌株DGCC7710(以編號CNCM1-2423保藏于法國"國家培養(yǎng)物與微生物保藏中心")擁有至少3個CRISPR基因座CRISPR1、CRISPR2和CRISPR3。在已知完整基因組序列的菌林CNRZ1066和LMG18311中(見，上文的Bolotin等[2004)，CRISPR1位于相同的染色體基因座處在strOMO(或stuOMO)和strO^l(或stu0661)之間(見，圖18)。在菌林DGCC7710中，CRISPR1也位于相同的染色體基因座處，位于高度相似的基因之間。菌株DGCC7710的CRISPR1含有33個重復(fù)序歹'j(包括末端重復(fù)序列)并且因此含有32個間隔區(qū)(見，圖19)。全部這些間隔區(qū)是彼此不同的。先前沒有描述這些間隔區(qū)大部分處于CRISPR基因座中，不過靠近CRISPR1非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)的4個間隔區(qū)是與已知的CRISPR1間隔區(qū)同一的。例如，DGCC7710的第28間隔區(qū)與菌林CNRZ1575的第31CRISPR1間隔區(qū)(Genbank登錄號DQ072991)100。/o同一；DGCC7710的第30間隔區(qū)與菌林CNRZ703的第27CRISPR1間隔區(qū)(Genbank登錄號DQ072990)100。/o同一；DGCC7710的第31間隔區(qū)與菌林CNRZ703的第28CRISPR1間隔區(qū)(Genbank登錄號DQ072990)100%同一；并且DGCC7710的第32間隔區(qū)與菌林CNRZ703的第30CRISPR1間隔區(qū)(Genbank登錄號DQ0729卯)100。/。同一。下文在SEQIDNO:678中顯示菌林DGCC7710的CRISPR1序列(5'-3，)caaggacagttattgattttataatcactatgtgggtataaaaacgtcaaaatttcatttgagGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACtgtttgacagcaaatcaagattcgaattgtGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaatgacgaggagctattggcacaacttacaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACcgatttgacaatctgctgaccactgttatcGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACacacttggcaggcttattactcaacagcgaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACctgttccttgttcttttgttgtatcttttcGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACttcattcttccgtttttgtttgcgaatcctGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACgctggcgaggaaacgaacaaggcctcaacaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACcatagagtggaaaactagaaacagattcaaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACataatgccgttgaattacacggcaaggtcaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACgagcgagctcgaaataatcttaattacaagGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACgttcgctagcgtcatgtggtaacgtatttaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACggcgtcccaatcctgattaatacttactcgGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaacacagcaagacaagaggatgatgctatgGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACcgacacaagaacgtatgcaagagttcaagGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACacaattcttcatccggtaactgctcaagtgGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaattaagggcatagaaagggagacaacatgGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACcgatatttaaaatcattttcataacttcatGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACgcagtatcagcaagcaagctgttagttactGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACataaactatgaaattttataatttttaagaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaataatttatggtatagcttaatatcattgGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACtgcatcgagcacgttcgagtttaccgtttcGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAACTAACTGTACAACtctatatcgaggtcaactaacaattatgctGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaatcgttcaaattctgttttaggtacatttGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaatcaatacgacaagagttaaaatggtcttGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACgcttagctgtccaatccacgaacgtggatgGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACcaaccaacggtaacagctactttttacagtGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACataactgaaggataggagcttgtaaagtctGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACtaatgctacatctcaaaggatgatcccagaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaagtagttgatgacctctacaatggtttatGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACacctagaagcatttgagcgtatattgattgGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaattttgccccttctttgccccttgactagGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaccattagcaatcatttgtgcccattgagtGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAGTTtgattcaacataaaaagccagttcaattgaacttggcttt(SEQIDNO:678)在這些實驗中使用的噬菌體D858是屬于病毒長尾噬菌體科的噬菌體。其基因組序列已經(jīng)完全測定，它似乎仍待發(fā)表。該噬菌體對嗜熱鏈球菌菌林DGCC7710有毒力。使用DGCC7710作為親代菌林并使用噬菌體D858作為烈性噬菌體，分離作為天然噬菌體抗性突變體的嗜熱鏈球菌菌株DGCC7778。菌林DGCC7778的CRISPR1含有35個重復(fù)序列(包括末端重復(fù)序列)并且因此含有34個間隔區(qū)。與DGCC7710的CRISPR1序列比較時，DGCC7778的CRISPR1序列在CRISPR基因座的一端(即靠近前導(dǎo)序列)擁有兩個額外的、毗鄰的新間隔區(qū)(并且當(dāng)然擁有兩個額外的重復(fù)序列，其分布在所述新間隔區(qū)側(cè)翼)。CRISPR1基因座的其余全部間隔區(qū)是不變的。下文在SEQIDNO:679中顯示菌林DGCC7778的CRISPR1序列(5'-3'):caaggacagttattgattttataatcactatgtgggtataaaaacgtcaaaatttcatttgagGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACcaacacattcaacagattaatgaagaatacGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACtccactcacgtacaaatagtgagtgtactcGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACtgtttgacagcaaatcaagattcgaattgtGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaatgacgaggagctattggcacaacttacaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACcgatttgacaatctgctgaccactgttatcGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACacacttggcaggcttattactcaacagcgaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACctgttccttgttcttttgttgtatcttttcGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACttcattcttccgtttttgtttgcgaatcctGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACgctggcgaggaaacgaacaaggcctcaacaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACcatagagtggaaaactagaaacagattcaaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACataatgccgttgaattacacggcaaggtcaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACgagcgagctcgaaataatcttaattacaagGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACgttcgctagcgtcatgtggtaacgtatttaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACggcgtcccaatcctgattaatacttactcgGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaacacagcaagacaagaggatgatgctatgGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACcgacacaagaacgtatgcaagagttcaagGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTCTACAACacaattcttcatccggtaactgctcaagtgGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaattaagggcatagaaagggagacaacatgGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACcgatatttaaaatcattttcataacttcatGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACgcagtatcagcaagcaagctgttagttactGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTOTACAACataaactatgaaattttataatttttaagaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaataatttatggtatagcttaatatcattgGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACtgcatcgagcacgttcgagtttaccgtttcGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACtctatatcgaggtcaactaacaattatgctGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaatcgttcaaattctgttttaggtacatttGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaatcaatacgacaagagttaaaatggtcttGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACT(3TACAACgcttagctgtccaatccacgaacgtggatgGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACcaaccaacggtaacagctactttttacagtGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACataactgaaggataggagcttgtaaagtctGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACtaatgctacatctcaaaggatgatcccagaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaagtagttgatgacctctacaatggtttatGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACacctagaagcatttgagcgtatattgattgGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaattttgccccttctttgccccttgactagGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaccattagcaatcatttgtgcccattgagtGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAGTTtgattcaacataaaaagccagttcaattgaacttggcttt<SEQIDNO:679)在DGCC7778的情況下，第一間隔區(qū)(5'-caacacattcaacagattaatgaagaatac-3';SEQIDNO:680)和第二間隔區(qū)(5'-tccactcacgtacaaatagtgagtgtactc-3';SEQIDNO:681)構(gòu)成鑒定這種標記菌林的菌林特異性標簽。已經(jīng)確定這兩種新間隔區(qū)的序列存在于D858噬菌體基因組中。第二新間隔區(qū)的序列存在于D858基因組的第254"和25442bp位置之間(即在負鏈上)，具有一個錯配(在30個核苷酸范圍內(nèi)96.7。/。的相同核苷酸)。間隔區(qū)21tccactcacgtacaaatagtgagtgtactc30(SEQIDNO:681)D85825471tccactcacgtacaaatagtgagcgtactc25442(SEQIDNO:686)第一間隔區(qū)的序列存在于D858基因組的第31481和31410bp位置之間(即在負鏈上)(在30個核苷酸范圍內(nèi)100%的相同核苷酸)間隔區(qū)11caacacattcaacagattaatgaagaatac30(SEQIDNO:3)D85831481caacacattcaacagattaatgaagaatac31410(SEQIDNO:687)雖然不意圖使本發(fā)明限于任何具體機制和理論，構(gòu)思了需要在DGCC7778的CRISPR1基因座中存在的兩個新間隔區(qū)以賦予菌林DGCC7778針對噬菌體D858的新抗性。(如在DGCC7778中發(fā)現(xiàn)的)間隔區(qū)"2"連同一個重復(fù)序列一起首先在DGCC7710的CRISPR1基因座的一端插入該CRISPR1基因座(33個重復(fù)序列和32個間隔區(qū))中。這種插入產(chǎn)生由這種額外的新間隔區(qū)標記(因此攜帶34個重復(fù)序列和33個間隔區(qū))的謹菌體不敏感性突變體(中間菌林)。這種間隔區(qū)從D858基因組衍生，不過可能在插入過程期間出現(xiàn)復(fù)制錯誤或逆轉(zhuǎn)錄錯誤，導(dǎo)致點突變。因這種新獲得的間隔區(qū)與靶向的噬菌體序列之間的不完美匹配(即1個錯配)，這種中間菌林針對噬菌體D858的抵抗效率低。間隔區(qū)插入的第二事件在這種中間菌林(其比親代菌林DGCC7710更抵抗噬菌體D858,但因所述錯誤配而不是"完全"抵抗)中發(fā)生，從而導(dǎo)致在CRISPR1基因座的相同末端連同一個重復(fù)序列一起插入新的第二間隔區(qū)(即，如在DGCC7778中發(fā)現(xiàn)的間隔區(qū)"l")。這種第二插入產(chǎn)生了被分離并命名為DGCC7778的噬菌體不敏感性新突變體。DGCC7778比所述中間菌抹更抵抗D858，并且當(dāng)然其抗性比親代菌林DGCC7710高得多，原因是存在與所靶向的噬菌體序列100%同一的間隔區(qū)"1"。實施例18用于標記DGCC7710和選擇標記菌抹DGCC7778的方法在本實施例中，描述了用來標記DGCC7710和選擇標記DGCC7778菌林的方法。通過用約2.106cfu/ml的菌抹DGCC7710和用約1.105pfu/ml的噬菌體D858接種巴斯德法滅菌乳，由噬菌體D858感染/攻擊菌抹DGCC7710。接種的乳在35。C培育12小時。溫育后，使用感染的培養(yǎng)物的適宜稀釋物，在35°C于非選擇性培養(yǎng)基(乳瓊脂平板)上分離活細菌(即有可能是噬菌體不敏感性突變體的那些細菌)。在35°C于M17-葡萄糖液體培養(yǎng)基中增殖一林名為DGCC7778的分離林并且使用如本領(lǐng)域已知的經(jīng)典DNA提取方法提取其DNA。使用一條正向引物(YC70和/或SPIDR誦ups[5'-gTCTTTAgAAACTgTgACACCI;SEQIDNO:674)和一條反向引物(YC31和/或SPIDR-dws[5，-TAAACAgAgCCTCCCTATCC];SEQIDNO:675)的組合，使用本領(lǐng)域已知的PCR法(見例如上文的Bolotin等2005j)擴增該DNA提取物。確定PCR產(chǎn)物的序列并且將其與DGCC7710的CRISPR基因座的序列比較。實施例19第二標記菌林的產(chǎn)生在本實施例中，描述了用來產(chǎn)生第二標記菌林的方法。使用DGCC7710作為親代菌林并使用噬菌體D858作為烈性噬菌體，分離了作為天然噬菌體抗性突變體的嗜熱鏈球菌菌林DGCC7710-RH1。菌林DGCC7710-RH1的CRISPR1含有34個重復(fù)序列(包括末端重復(fù)序列)并且因此含有33個間隔區(qū)。與嗜熱鏈球菌菌林DGCC7710的CRISPR1序列比較時，嗜熱鏈球菌菌林DGCC7710-RH1的CRISPR1序列在CRISPR基因座的一端處(即在CRISPR基因座5，端處靠近前導(dǎo)序列)擁有一個額外的新間隔區(qū)(即標記序列)(并且當(dāng)然擁有一個分布在這個新間隔區(qū)側(cè)翼的額外重復(fù)序列)。CRISPR1基因座的其余全部間隔區(qū)是不變的。菌林DGCC7710-RH1的CRISPR1序列(5，-3')是caaggacagttattgattttataatcactatgtgggtataaaaacgtcaaaatttcatttgagGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAACSTAACTC3TACAACtcaacaattgcaacatcttataacccactttgtttgacagcaaatcaagattcgaattgtaatgacgaggagctattggcacaacttacacgatttgacaatctgctgaccactgttatcacacttggcaggcttattactcaacagcgaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACpTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAAC;GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAAqGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAAC:GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAAC'GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACIgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacbtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacaacctgttccttgttcttttgttgtatcttttcttcattcttccgtttttgtttgcgaatcctgctggcgaggaaacgaacaaggcctcaacacatagagtggaaaactagaaacagattcaaataatgccgttgaattacacggcaaggtcagagcgagctcgaaataatcttaattacaaggttcgctagcgtcatgtggtaacgtatttaggcgtcccaatcctgattaatacttactcgaacacagcaagacaagaggatgatgctatgcgacacaagaacgtatgcaagagttcaagacaattcttcatccggtaactgctcaagtgaattaagggcatagaaagggagacaacatgc:gatatttaaaatcattttcataacttcatgcagtatcagcaagcaagctgttagttactataaactatgaaattttataatttttaagaaataatttatggtatagcttaatatcattgtgcatcgagcacgttcgagtttaccgtttctctatatcgaggtcaactaacaattatgctaatcgttcaaattctgttttaggtacatttaatcaatacgacaagagttaaaatggtcttgcttagctgtccaatccacgaacgtggatgcaaccaacggtascagctactttttacagtataactgaaggataggagcttgtaaagtcttaatgctacatctcaaaggatgatcccagaaagtagttgatgacctctacaatggtttatacctagaagcatttgagcgtatattgattgaattttgccccttctttgccccttgactagaccattagcaatcatttgtgcccattgagtgtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacagtTtgattcaacataaaaagccagttcaattgaacttggcttt(SEQIDNO:682)前導(dǎo)序列是5'caaggacagttattgattttataatcactatgtgggtataaaaacgtcaaaatttcatttgag3，(SE()IDNO:688)。以灰色顯示包含CRISPR重復(fù)序列(大寫字母)和CRISPR間隔區(qū)(即標簽序列)的整合序列atcttataacccactt;SEQIDNO:689)，其中所述的CRISPR間隔區(qū)以小寫字母顯示。顯示了末端重復(fù)(5'gtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacagt3'(SEQIDNO:3)轉(zhuǎn)錄尾區(qū)序歹1〗5'ttgattcaacataaaaagccagttcaattgaacttggcttt3'(SEQIDNO:691)。因此，在嗜熱鏈球菌菌株DGCC7710-RH1的情況下，間隔區(qū)(5'-tcaacaattgcaacatcttataacccactt隱3';SEQIDNO:534)構(gòu)成了鑒定這種突變菌林(即標記細菌)的菌株特異性標簽序列。新間隔區(qū)的序列(即，標簽序列)存在于D858噬菌體基因組中。發(fā)現(xiàn)該間隔區(qū)的序列存在于D858基因組位置第31921和31950bp之間(即，在正鏈上)(并且與D858基因組序列具有30個核苷酸范圍內(nèi)的100%同一性。間隔區(qū)1tcaacaattgcaacatcttataacccactt30(SEQIDNO:534)D85831921tcaacaattgcaacatcttataacccactt31950(SEQIDNO:534)整合到嗜熱鏈球菌菌林DGCC7710-RH1的CRISPR1基因座中的新間隔區(qū)(即標簽序列)賦予該菌抹針對噬菌體D858的新抗性。實施例20第三標記菌林的產(chǎn)生在本實施例中，描述了用來產(chǎn)生第三標記菌林的方法。使用嗜熱鏈球菌菌林DGCC7710作為親代菌抹并使用噬菌體D858作為烈性噬菌體，分離了作為天然噬菌體抗性突變體的嗜熱鏈球菌菌株DGCC7710-RH2。嗜熱鏈球菌菌林DGCC7710-RH2的CRISPR1含有34個重復(fù)序歹'J(包括末端重復(fù)序列)并且因此含有33個間隔區(qū)。與嗜熱鏈球菌菌林DGCC7710的CRISPR1序列比較時，嗜熱鏈球菌菌林DGCC7710-RH2的CRISPR1序列在CRISPR基因座的一端處(即在CRISPR基因座S，端處靠近前導(dǎo)序列)擁有一個額外的新間隔區(qū)(即標記序列)(并且當(dāng)然擁有一個分布在這個新間隔區(qū)側(cè)翼的額外重復(fù)序列)。CRISPR1基因座的其余全部間隔區(qū)是不變的。菌林DGCC7710-RH2的CRISPR1序列(5'-3')是caaggacagttattgattttataatcactatgtgggtataaaaacgtcaaaatttcatttgagGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACttacgtttgaaaagaatatcaaatcaatga匕gtttgacagcaaatcaagattcgaattgtaatgacgaggagctattggcacaacttacaegatttgacaatctgctgaccactgttatcacacttggcaggcttattactcaacagcgactgttccttgttcttttgttgtstcttttcttcattcttccgtttttgtttgcgaatcctgctggcgaggaaacgaacaaggcctcaiacaeatagagtggaaaactagaaacagattcaaataatgccgttgaattacacggcaaggtcagagcgagctcgaaataatcttaattacaaggttcgctagcgtcatgtggtaacgtatttaggcgtcccaatcctgattaatacttactcgGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAAC:GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAAC;GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAAC:GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAAC200880014507.5GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAAC'GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACjGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAAOGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAAclGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAAC卜TTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAAC'GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaacacagcaagacaagaggatgatgctatgcgacacaagaacgtatgcaagsgttcaagacaattcttcatccggtaactgctcaagtgaattaagggcatagaaagggagacaacatgcgatatttaaaatcattttcataacttcatgrcagtatcagcaagcaagctgttagttactataaactatgaaattttataatttttaagaaataatttatggtatagcttaatatcattgtgcatcgagcacgttcgagtttaccgtttctctatatcgaggtcaactaacaattatgctaatcgttcaaattctgttttaggtacatttaatcaatacgacaagagttaaaatggtcttgcttagctgtccaatccacgaacgtggatgc:aaccaacggtaacagctactttttacagtataactgaaggataggagcttgtaaagtcttaatgctacatctcaaaggatgatcccagaaagtagttgatgacctctacaatggtttatacctagaagcatttgagcgtatattgattgaattttgccccttctttgccccttgactagaccattagcaatcatttgtgcccattgagt^rTTTTGTA6^T^A^TT^AAGTAACTGTACiGTTtgattcaacataaaaagccagttcaattgaacttggcttt(SEQIDNO:684)前導(dǎo)序列是5'caaggacagttattgattttataatcactatgtgggtataaaaacgtcaaaatttcatttgag3，(SEQIDNO:688)。以灰色顯示包含CRISPR重復(fù)序列(大寫字母)和CRISPR間隔區(qū)(即標簽序列)的整合序列(GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACttacgtttgaaaagaatatcaaatcaatga;SEQIDNO:694)，其中所述的CRISPR間隔區(qū)以小寫字母顯示。顯示了末端重復(fù)(5'gtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacagt(SEQIDNO:3)非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)序歹'J5'ttgattcaacataaaaagccagttcaattgaacttggcttt3'(SEQIDNO:691)。因此，在嗜熱鏈球菌菌抹DGCC7710-RH2的情況下，間隔區(qū)(5'畫ttacgtttgaaaagaatatcaaatcaatga-3';SEQIDNO:697)構(gòu)成了鑒定這種突變菌林(即標記細菌)的菌林特異性標簽。新間隔區(qū)的序列顯示存在于D858噬菌體基因組中。發(fā)現(xiàn)該間隔區(qū)的序列存在于D858基因組位置第17215和17244bp之間(即，在正鏈上)(并且與D858基因組序列具有超過30個核苷酸的100%同一性。間隔區(qū)1ttacgtttgaaaagaatatcaaatcaatga30(SEQIDNO:697)D85817215ttacgtttgaaaagaatatcaaatcaatga17244(SEQIDNO:698)整合到嗜熱鏈球菌菌株DGCC7710-RH2的CRISPR1基因座中的新間隔區(qū)賦予嗜熱鏈球菌菌抹DGCC7710-RH2針對噬菌體D858的新抗性。實施例21從噬菌體抗性細菌變體構(gòu)建"CRISPR逃逸，，噬菌體在本實施例中，描述了用于構(gòu)建CRISPR逃逸噬菌體的方法。首先如上文實施例中所述構(gòu)建噬菌體抗性宿主變體。在這些實驗中，使親代菌抹"A"暴露于噬菌體"P"并選擇噬菌體抗性變體(變體"A1.0")。分析變體"Al.O，，(例如通過PCR和/或DNA測序)以證實CRISPIL基因座內(nèi)存在額外的插入間隔區(qū)。隨后確定該額外間隔區(qū)(間隔區(qū)Spl.O)的核苷酸序列。一般地，間隔區(qū)Spl.0是來自噬菌體P的大小大約30個核苷酸的片段，并且賦予針對噬菌體P和相關(guān)噬菌體("相關(guān)噬菌體"是在其基因組中含有該間隔區(qū)序列的那些噬菌體，并且定義了一個噬菌體科)的抗性。獨立于第一次噬菌體暴露，使相同親代菌林A暴露于相同的噬菌體P并且選出第二種噬菌體抗性變體(變體A2.0)。選擇變體A2.0旨在也具有插入CRISPR&因座內(nèi)的額外間隔區(qū)(間隔區(qū)Sp2.0)，但是間隔區(qū)Sp2.0的序列與間隔區(qū)Spl.O的序列不同。一般地，間隔區(qū)Sp2.0是來自噬菌體P的大小大約30個核苷酸的片段，并且賦予針對噬菌體P和相關(guān)噬菌體的抗性。類似地，在一些實施方案中，通過使相同菌林A暴露于相同的噬菌體P產(chǎn)生了變體A3.0至變體Ax.0。選擇全部"A"變體，旨在也具有插入CRISPR&因座內(nèi)的額外間隔區(qū)(間隔區(qū)Sp3.0至Spx.0),但是全部"Sp，，間隔區(qū)的序列彼此相互不同。一般地，"Sp"間隔區(qū)是來自噬菌體P的大小大約30個核苷酸的片段，并且它們均產(chǎn)生針對噬菌體P和相關(guān)噬菌體的抗性。一般，可以估計抗性的水平大約是在噬菌體基因組中對應(yīng)于間隔區(qū)的序列內(nèi)出現(xiàn)的單一突變的水平(即大致10"至1(T6)。因此，逃避CRISPR介導(dǎo)的抗性的噬菌體容易分離。通過使變體A1.0暴露噬菌體P而產(chǎn)生突變噬菌體。一般地，突變的"CRISPR逃逸"噬菌體(Pl.O)在其對應(yīng)于間隔區(qū)Spl.O的基因組中攜帶至少一個突變(例如缺失、點突變等)，或在一些優(yōu)選的實施方案中，攜帶分布在Spl.0側(cè)翼的對應(yīng)于CRISPR基序增或減20bp的區(qū)域。變體A1.0對噬菌體P1.0敏感。類似地，同樣用噬菌體P攻擊獨立產(chǎn)生的攜帶獨特間隔區(qū)(分別是Sp2.0,Sp3.0，至Spx.O)的噬菌體P抗性變體(變體A2.0、A3.0、至Ax.0)以產(chǎn)生相應(yīng)的突變噬菌體(分別是P2.0、P3.0,至Px.O)。隨后，可以產(chǎn)生突變的烈性噬菌體匯集物，其中已經(jīng)特異性地使它們的基因組突變成預(yù)計作為CRISPR間隔區(qū)的序列。實際上，噬菌體D2792代表一種針對嗜熱鏈球菌菌抹DGCC7710(WT)的完全烈性的生物控制噬菌體。相反，分析相關(guān)菌林WTphi2972+S6、WTphi2972+S4、WTphi2972+S20、WTphi2972+S2>WTphi2972+S22的CRISPR&因座，表明存在與噬菌體D2972中發(fā)現(xiàn)的序列相似的間隔區(qū)序列，其中所述的序列表明噬菌體D2972具有針對這些菌林的減低毒力。成斑數(shù)據(jù)(見表7-l)證實噬菌體D2972對這些菌林的毒力減低。就已經(jīng)表征為因存在相應(yīng)CRISPR間隔區(qū)而抵抗噬菌體D2972的菌抹WTphi2972+"而言，篩選D2972相關(guān)噬菌體，對于充分提高了毒力的噬菌體D4724和D4733鑒定為生物控制劑的候選者(見表7-l)在額外的實驗中，使菌抹DGCC7710暴露于噬菌體以產(chǎn)生抗性變體WTphi2972+S6。當(dāng)菌林WTphi2972+"暴露于噬菌體D2972時，有可能分離到突變噬菌體，如D4724。發(fā)現(xiàn)該D4724噬菌體對DGCC7710和WTphi2972+"是有完全毒力的。在第二重復(fù)中，使WTphi2972+S6暴露于噬菌體D4724,旨在產(chǎn)生抗性變體WTphi2972+S6phi4724+sls。在該菌林暴露于D4724后，鑒定到對DGCC7710和WTphi2972+"具有完全毒力的突變噬菌體，如D4733。在一些實施方案中，使用連續(xù)重復(fù)(successiveiteration)以產(chǎn)生具有所需毒力水平的噬菌體。圖13中提供額外的噬菌體突變體實例。在該圖中，顯示從親代噬菌體D858衍生的突變噬菌體858-A和858-B。所述突變與源自受噬菌體D858攻擊的WT0858+S1S2中的間隔區(qū)Sl對應(yīng)。又在其他例子中，其中在CRISPR基序中鑒定到所述突變的完全烈性噬菌體突變體示于表20-1中。在該表中，顯示了野生型和突變噬菌體中與嗜熱鏈球菌菌株新獲得的間隔區(qū)對應(yīng)的核苷酸序列。AGAAW基序以灰色突出顯示。每個突變以大寫字母和下劃線顯示。*表示缺失。該表提供了噬菌體抗性CRISPR變體和烈性噬菌體突變體配對的序列DGCC7710巾858+s3/噬菌體2972.S3C、DGCC7710^72+S4/噬菌體2972.S4A或噬菌體2972.S4C、DGCC7710令2972+s6/噬菌體2972.S6A和DGCC7710^972+s8S8+S32/噬菌體858.S32A或噬菌體858.S32D。在該表中，新的間隔區(qū)對應(yīng)于SEQIDNO:535(DGCC7710^8+s3)。表20-l野生型和突變噬菌體中與嗜熱鏈球菌菌株新獲得的間隔區(qū)對應(yīng)的核苷酸序列來源序列SE(JIDNO:DGCC771048S8+S3TTACGTTTGAAAAGAATATCAAATCAATGASEQIDNO:535噬菌體2972TTACGTTTGAAAAGAATATCAAATCAATGA('(;AHAAAGASEQIDNO:725噬菌體2972，S3ATTACG丁丁TGAAAAGAATATCAAATTAATGA('(JAUAAAGASE(3IDNO:726噬菌體2972，S3BTTACGTTTGAAAAGAATATCAAATCAACGAC('AGAAAGASEQIDNO:727噬菌體2972,S3CTTACGTTTGAAAAGAATATCAAATCAATGA('(iAGA(:AGASECJIDNO:728噬菌體2972，S3DTTACGTTTGAAAAGAATATCAAATCIATGACi,\i,、-、.、(iASEQIDNO:729噬菌體2972,S3ETTACGTTTGAAAAGAATATCAATTCAATGA('(;AGAAAGASEQIDNO:730噬菌體2972，S3FTTACGTTTGAAAAGAATATCAAATIAATGGC(,"■、、、GATTACGTTTGAAAAGAATATCAAATTAATGGCGAGAAAGASE(JIDNO:731噬菌體2972,S3GTTACGTTTGAAAAGAAEATCAAATTAATGACGAGAAA(;ATTACGTTTGAAAAGAACATCAAATTAATGACGAGAAAGASEQIDNO:732DGCC7710,+s4CTCAGTCGTTACTGGTGAACCAGTTTCAATSEQIDNO:525噬菌體2972CTCAG丁CGT丁ACTGGTGAACCAGTTTCAATT(，AGAAAAASE(JIDNO:733噬菌體2972，S4ACTCAGTCGTTACTGGTGAACCAGTTTCAATT(;AAAAAAASEQIDNO:734噬菌體2972，S4BCTCAGTCGTTACTGGTGAACCAGTTTCGATTGA(iAAAAASEQIDNO:735噬菌體2972，S4CCTCAGTCGTTACTGGTGAACCAGTTTCAATTGAGAGA\ASEQIDNO:736噬菌體2972，S4DCTCAGTCGTTACTGGTGAACCGGTTTCAATTGAAAAAA-CTCAGTCGTTACTGGTGAACCGGTTTCAATTGAAAAAAASEQIDNO:737DGCC7710畫+s6GCCCTTCTAATTGGATTACCTTCCGAGGTGSE(JIDNO:524190表20-l野生型和突變噬菌體中與嗜熱鏈球菌菌株新獲得的間隔區(qū)對應(yīng)的核苦酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage191</column></row><table>實施例22第二水平"CRISPR逃逸"噬菌體在本實施例中，描迷了用于構(gòu)建第二水平(即具有針對多個間隔區(qū)的多重突變)CRISPR逃逸噬菌體的實驗.通過產(chǎn)生CRISPR介導(dǎo)的噬菌體抗性變體并隨后分離能夠克服cas-CRISPR機制的突變("CRISPR逃逸，，)噬菌體的反復(fù)過程，可以產(chǎn)生已經(jīng)"預(yù)先適應(yīng)"的具備針對潛在CRISPR介導(dǎo)抗性的多重突變的噬菌體。在一些實施方案中，第二水平變體以如下方式產(chǎn)生，即通過使變體A1.0暴露于噬菌體P而分離突變噬菌體。一般地，這種突變噬菌體(噬菌體P1.0)在其基因組中含有間隔區(qū)Spl.O的序列的區(qū)域內(nèi)或在分布于Spl.O側(cè)翼的對應(yīng)于CRISPR基序增或減20bp的區(qū)域內(nèi)具有突變(缺失、點突變等)。變體A1,0對噬菌體P1.0敏感。隨后，使變體A1.0暴露于噬菌體P1.0并選擇噬菌體抗性變體(變體"A1.1")(見圖15)。還選擇變體Al.l，從而該變體具有插入CRISPR基因座內(nèi)的額外間隔區(qū)(間隔區(qū)Spl.l)，但是間隔區(qū)Spl.l的序列與間隔區(qū)Spl.O、Sp2.0至Spx.O的序列不同。一般地，間隔區(qū)Spl.l是來自噬菌體Pl.O的大小大約30個核苷酸的片段，并且將賦予針對噬菌體Pl.O和相關(guān)噬菌體的抗性。變體Al.l抵抗噬菌體Pl.O并優(yōu)選地具有針對噬菌體P的提高抗性，原因是間隔區(qū)Spl.O和Spl.l的積累。在其它的實施方案中，通過使變體Al.l暴露于噬菌體Pl.O而產(chǎn)生新突變的噬菌體(噬菌體Pl.l)。隨后，在變體Al.l暴露于噬菌體Pl.l后，獲得含有一個新的額外間隔區(qū)(Spl.2)的新變體A1.2。該間隔區(qū)賦予針對噬菌體Pl.l的抗性并且優(yōu)選地提高針對噬菌體Pl.O和P的抗性(即，因間隔區(qū)Spl.O、Spl.l、Spl,2積累所致)。噬菌體Pl.l對親代菌林A及變體Al.O和Al.l具有完全感染性。又在其它的實施方案中，在菌抹A中通過變體Al,隨后變體Al.l，然后變體A1.2等反復(fù)積累不同的間隔區(qū)(例如2、3或4個)以獲得高度抵抗噬菌體的變體(變體Al.n)。在進一步的實施方案中，可以在相同菌抹中通過變體A2，隨后變體A2.1，然后變體A2.2等積累額外的不同間隔區(qū)以平行地獲得高度抵抗噬菌體的菌林A的另一種變體(變體A2.n)。將相同的策略用于變體A3.0至Ax.O。在產(chǎn)生CRISPR噬菌體抗性變體并分離突變的"CRISPR逃逸"噬菌體的反復(fù)過程(例如使變體Al.l暴露于噬菌體P1.1)后，產(chǎn)生了含有一個新的額外間隔區(qū)(Spl.2)的新變體A1.2，由此分離對變體A1.2、Al.l、A1.0和親代菌林A具有完全毒力的突變噬菌體(P1.2)。在一些實施方案中，組合突變通過這種方式積累，即反復(fù)地構(gòu)建組合有不同間隔區(qū)(例如Sp2.0、Sp3.0至Spx,0)的細菌變體，使之暴露于相應(yīng)的第一水平突變噬菌體(P2.0、P3.0至Px.O)并且分離第二水平突變噬菌體。在表22-l中顯示產(chǎn)生CRISPR噬菌體抗性變體和突變"CRISPR逃逸"噬菌體的反復(fù)組合突變的例子。該表提供一系列在CRISPR1中發(fā)現(xiàn)的新間隔和在喧菌體2972、858或DT1中的相應(yīng)區(qū)域。在該表中，"a"表示噬菌體858與2972之間100%同一的DNA區(qū)域。"5，位置"指噬菌體基因組中原型間隔區(qū)的5，位置。原型間隔區(qū)序列中加下劃線和陰影的核苷酸表示所述噬菌體與間隔區(qū)之間的錯配。星號(*)表示缺失。"3，側(cè)翼區(qū)"中表示噬菌體基因組中的3，側(cè)翼序列。對AGAAW基序中的錯配加下劃線并加灰色陰影。在名為"鏈/模塊"的列中，轉(zhuǎn)錄模塊是"E"(早期表達的基因)；"M"(中期表達的基因)；和"L"(晚期表達的基因)表20-2.—系列在CRISPRl中發(fā)現(xiàn)的新間隔和在噬菌體2972、858和DT1中的相應(yīng)區(qū)域<table>tableseeoriginaldocumentpage194</column></row><table>表20-2.—系列在CRISPR1中發(fā)現(xiàn)的新間隔和在噬菌體2972、858和DT1中的相應(yīng)區(qū)域<table>tableseeoriginaldocumentpage195</column></row><table>使DGCC7710暴露于噬菌體2972以產(chǎn)生CRISPR噬菌體抗性變體DGCC7710^2972+s6,從其產(chǎn)生CRISPR逃逸突變噬菌體2972.S6B。DGCC7710*2972+S6暴露于2972.S6B則產(chǎn)生CRISPR噬菌體抗性變體DGCC7710拜卞。0小2972.S6B，從其分離出CRISPR逃逸突變噬菌體2972.S20A的。在一些實施方案中，提供了抵抗多于一個噬菌體科的菌林。因為給定菌林可以對多于一個噬菌體科敏感，因而在一些實施方案中，希望通過在CRISPR基因座內(nèi)導(dǎo)入源自其它噬菌體科的額外間隔區(qū)來擴大該菌林針對多個噬菌體科的抗性(見圖16)。例如，噬菌體P、Q和R是能夠感染菌抹A的三個噬菌體科的代表性噬菌體。使用以上和本文中概述的方法，產(chǎn)生了抵抗全部三個噬菌體科的變體。在一些實施方案中，噬菌體P用來產(chǎn)生抵抗噬菌體P的變體A1P(含有間隔區(qū)Spl)。隨后，使變體A1P暴露于噬菌體Q并且選出噬菌體抗性變體(變體Alpq)。變體AlPq具有插入CRISPR基因座內(nèi)的一個額外間隔區(qū)(Sql)。一般地，間隔區(qū)Sql是來自噬菌體Q的大小大約30個核苷酸的片段，并且賦予針對噬菌體Q和相關(guān)噬菌體的抗性。變體Aipq抵抗p和Q噬菌體。接下來，使變體Aipq暴露于噬菌體R并且選出噬菌體抗性變體(變體Alpqn)。變體Al,有插入CRISPR基因座內(nèi)的第三額外間隔區(qū)(Srl)。一般地，Srl是來自噬菌體R的大小大約30個核苷酸的片段，并且也賦予針對噬菌體R和相關(guān)噬菌體的抗性。變體Aipqr抵抗全部三種噬菌體。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，該變體也抵抗相關(guān)噬菌體。這些CRISPR逃逸噬菌體用作生物控制/治療噬菌體。如上文所述，通過產(chǎn)生CRISPR介導(dǎo)的噬菌體抗性變體、暴露于噬菌體并分離烈性"CRISPR逃逸"噬菌體的過程，產(chǎn)生這樣的噬菌體物種混合物，它們攜帶耙向單個和/或多個噬菌體基因組序列的單個和/或多重突變，其中所述的噬菌體基因組序列是潛在的CRISPR間隔區(qū)靶標。由于靶宿主細菌可以通過摻入單一和/或多個間隔區(qū)而變得抵抗噬菌體并且Cas-CRISPR機制可以通過在對應(yīng)于此類間隔區(qū)的噬菌體基因組內(nèi)突變被克服，因而攜帶多個突成功獲得新間隔區(qū)并增殖的比率。在其它的實施方案中，對從相應(yīng)CRISPR噬菌體抗性變體中的間隔區(qū)確定的原型間隔區(qū)和側(cè)翼區(qū)進行分析促進了特定CRISPR的CRISPR基序的鑒定。在DGCC7710的例子中，用噬菌體2972或858攻擊后，產(chǎn)生了含有間隔區(qū)S1-S33的CRISPR1噬菌體抗性變體。使用軟件程序ClustalX比對來自噬菌體2972或858基因組的與間隔區(qū)S1-S33對應(yīng)的原型間隔區(qū)和側(cè)翼區(qū)，鑒定CRISPR1基序為NNAGAAW(SEQIDNO:696)，并使用WebLogo顯示(圖22)。在又一個例子中，用噬菌體858和3821攻擊后，從DGCC7710衍生了CRISPR3噬菌體抗性變體，以及用噬菌體4241攻擊后，從LMD-9衍生了CRISPR3噬菌體抗性變體。將來自分別的噬菌體基因組的原型間隔區(qū)和側(cè)翼區(qū)與分別的CRISPR3噬菌體抗性變體的相應(yīng)間隔區(qū)比對，鑒定了CRISPR3基序為NGGNG(SEQIDNO:723)(圖23)。分析特定CRISPR基序的存在提供了鑒定推定的原型間隔區(qū)在基因組內(nèi)或其他特定序列(例如，質(zhì)?；蛄硪环N可移動遺傳元件)的位置的手段。在已測序的噬菌體858、2972和DT1的例子中，對AGAAWCRISPR1基序分布的分析鑒定了潛在的原型間隔區(qū)在分別的基因組內(nèi)的位置。如本領(lǐng)域已知，利用遺傳密碼的簡并性和/或利用保守性氨基酸替代，在對噬菌體0X174所述的基因組化學(xué)合成的過程中消除了每個AGAAW基序。因此，該噬菌體對Cas-CRISPRl抗性系統(tǒng)變得不敏感。因此，不含特定CRISPR基序的DNA分子對相應(yīng)Cas-CRISPR系統(tǒng)不敏感。這些噬菌體和多種噬菌體類型的"混合物"在輪換策略中使用(例如，噬菌體的定義的依次施用)。作為由攜帶不同間隔區(qū)突變的噬菌體組成的單一混合物用途的延伸，在一些實施方案中，以定義的依次方式使用多種烈性噬菌體，其中每種烈性噬菌體攜帶不同的間隔區(qū)突變。例如，使用一組"CRISPR逃逸，，噬菌體(Pl.O、P2.0和P3.0,或P1.0、Pl.l、P1.2或其一些組合)，分別并且以定義的順序和輪次使用每種噬菌體(P.10>P2.0>P3.0>Pl.O，P10〉等)，從而靶細菌針對所述噬菌體發(fā)展CRISPR介導(dǎo)的抗性的可能性最小化。同樣，依次和輪換使用一組噬菌體混合物(即，該混合物中的每種噬菌體以及每種混合物擁有獨特的突變組合)。在一些實施方案中，噬菌體和/或混合物由單個噬菌體科組成，而在其他實施方案中，噬菌體和/或混合物由多個噬菌體科組成。實施例23功能性組合本實施例提供了在本發(fā)明中使用的多種功能性組合。僅作為示例，可以根據(jù)本發(fā)明使用以下功能性組合。功能性組合#1:如下所示的cos序列SEQIDNO:461至SEQIDNO:465和SEQIDNO:473至SEQIDNO:477(它們均是嗜熱鏈球菌序列)SEQIDNO:461:AAcPTTAGTGcKwGAccAAGGTAtAcA滿:5A/AASw脇wATTAGPccccccATTAteT丌cc^ATSAcgA，…訂M9GG^GGTT^tTASAcMGh^AwATAAP^ATACCAGGATGAAT^cAhccHGcmGASJcgGTtcAwTcGA9G^ATTAG^CCA，c，TTTGAAAAcAAGTAGLAGmAG，^GcATc2tATTGTAAAGAAGcTTGwGA5TATccATAGAAcAGGAGAAcTcccGT"GGA丁ATcAAAAcAAAAAGSAGAAGTAcGwJT^TAAGTTAAGTTAcAAcAVccmKccA5-cTTGGcAGAAGAcr訂^A"^GMTcA:cGGcTGATcAAAGGGAAGAAGAAAAGGGGAAATcGGAcGAAcAGcGATTAccc丁GAGcA丁GAAAGAGTTTccAAccccAGccGcGTAcccTTAAcGAAAGGAGGATTAcGAAAAcAccATTcAAGccTT丁cTTTGccTTcGAcAcAGAAAcAA:GAGccGTAcTTcGGAAAGAAAcAcGAAGAcGT丁cAAATcTTGAccATTcccAGGGA:ATAcGTGATATcAATAGTcGAAATTccGAGAAGAGGAAAcGcTGAcAGTTGGGGTTGcGGTTcc打AAAAA:AATGAATccGTGAATTAcTGcTTcccTTGTTGcATGGAAASA:AGATGDyAGGGMGGT込A:cGTGAGAcGTTTAcAAuTTMPA9cT乂TcwcA9GAAAAAT，TAA^AAwTTpAtTTcATc丁GGAccrGJATGGcTAGTTGTAAGcAAGATAGGGccAAGAcTcGGGAGAcTATcGAccGAAcAcGAAAMGGAGTAAccATTAGTTTTTTTGTA:TGAGTTTcSAAcMGAATTAGAAGAAAGGGAG汀AcAA:tGAtAA麗狙s……GTTTGGGAAcTAATTAAGAAAGcTTTTAAAc込AKGcA:GcTGA丁TGJTTAAAT丁A"^息愚AAGTTTATA…ccAcTAAAAGc1*.-AcATTAG」「/AA"，cATGAGT^AcTGi-ATrTGTATAAA:TG〕AA^cT^AAAGs丁TA……訂GGTATGAGAGAAcAAGTATTAAAAGAGGTTTAccGGAGTTAAGTTGGAcAcc丁AAATGTTTGTA9AwGMAGcuTJTA^A，AATTAccAGAGAG^GAA^GAwGGGAcAc^AAGAAGT199AAGTGwGA"ACMTTAATTccAAATGGcTcAGGATTAccGA■GTGATT3TG:AGGTGTGA-GcwTAScG、、r一8A,G-cS5AccTATGcAAGcT"cPMAGMAA^GGTGcAAcAGGcAGAGGAcGAGTGcccATGATTAGGGGcccAAAGTGG丁AAAAAATTc丁ccGcATTTAGGGGcTAAcGGTAAcAAAccAccAAGGTGAcTGAcAGGGcccAhTcAAAGTTccAAAAGAAAAAGcAccGAAGcTTlcLTA;ATGAAcGt:TTwAAwGGMAGMTAKcAAM5TIA;ATGT5GTAcAAATTAcAATTcTGAccGATAAAAGTccAATcAAMcTTAA!工TAAAcGGTAGGAAAAGGTTTTTAccTGAAAAcGAAAcccTAAcTTGGTTAGcGTGAAccTTAAAAAcAAAAAAAcTTcGcTcAGcAAAAAcAAAAGGTcAGccAGTccTATcAGccccTAAAAcAGcGATAAcGAATAcGGcccTTTGGATcccATAGTcGGAAGccGAAGTAGcTTAccAccccATTATAcTAGATGAAGTTGAcAAccTTAA:ScGTTGAGAAcTTccAAGAAcATAGAGAKAATGVGA"cG02TT■ATcAAAcTcAtAA5GyMAJAT冚ATA-AcAccATGTGAAAcTTATAGAAGAAGAcATTccccAcGGGcTTGGTGccTGAAAAcAAGTAGAVc5TA;cTTGATAAGAAAAcAAAAAAGGGTTTAAGTTGAcGAcccccGTTATAGTAcGAGcGcG………rJrg告…AAAG…TAAcccTAGTATTG-GATcGGA訂35MAMcA-GATGPAAAAAhGsGr\rjAcATAGtjcGATAAG一TcTcccATTAAGTAccAAGGATTTTcGAAGAAGAcAAAATTcTGAGAAcAGccMGn碰馬mAcATAcGTGGGTKcct:cAA^A5TAAJcATGGGcTMcTJcAJAtGwc2AATuA5A:5GTAGAcbGAG^AGAATGAAAAGATTTTTAA(SEQIDNO:462)SEQIDNO:463:AGTTTAGAGTGGAGAAAATAA(SEQIDNO:463)SEqIDNO:464:TATGA(SEQIDNO:464)SEQIDNO:465:ATAAATTTTTAGAAAGTAAGGATTGA(SEQIDNO:465)SEQIDNO:473:TATAGGATATwGATGAATTAcAAAAAAwAATAAAtATGrA)AwcMcTcTT:5AAAAATGAGGGAGATcGAAAAcAAcc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AAccGTAGTcccGGGcTTGGTTccGTAGcTTPGAGTTCAMGcA汀McTTGAAAGAccGTTcTTAAcAGGTcAAGcAcTGA5AGHcAwGcMTG，…AGSTAAATTTTGTcGTAccccTTTAGTcAccAGAGTGTAGTGTTGAcTGGAGTTTA;cA:AGAAGccGAAAccGccAAAcTATTA;cGAAGTTTGA:AAAGcGTcGGGGA:TGcTAcGGGAAAATcccGATGGTccTTAcA:cccTAAGGTTTTcG丁GAGcTAT丁AATAGAGcATAAGAAAAGGGAAAAAccAGGGGTcccATTccAAGAAAAGAGAAGccTTcAccTTTAcGGAAATcAGAAATTTGcGAAccGAGAGAAGGTTAGAGA5GMATAcGAcAA^AGA2TA丌GcTATcTGiAT^cTGAGrcGHAwTA打9cATcGKAGGAGTAAGAwG"GAcTA^cATAT"瞪CA)A5丁^T2GTccTTAhccTtGTAAA5cATTGgG汀AAAGTAATTGc9AAAJTATAccTAAGcAGGAcGGAccccAAAGTTAGAcTTTATTTAAcGGT丁GAc丁丁丁TA丁cTATcGGTAGGcAAGGAGAGATcATTccGTTAAccccGGAGTGGAAccAGcATcGT丁T206SEQIDNO:468:GGAGGGCATTAA(SEQIDNO:468)SEQIDNO:469:ACATTCTCTTCCCCTAA(SEQIDNO:469)SEQIDNO:470:TGAACTTTTAACTGCGGAGGTCTAA(SEQIDNO:470)SEQIDNO:471:(SEQIDNO:471)SEQIDNO:472:PAbAATcAG$cGcbTcAATTGcG^GMGGKATGGATwA"TGAcGATAGAAAcAcA丁PcGsKGGGcAGcTAAAcAGGAAAAAAGTTTTAcGTTcTcAAATGGAAAGcAGG丁GA:GGTATccATA:AGGwATGAAcAGchT^TTTAMcTAGTAcAAAGAATAAGtTTGGGGTATTTAAGTTGTTAAGcAcAGTAAcAATwTTAAGAJAAGAcATGATAG;ATTcAGGaATTGAGATScTcA2GTAGwGMTtGc丁PGGATGATGGGAAGTATAAAcAGAAAcGATGcAgATG1)Tycccrjc5c"GAAcwg訂GAATGGwAA:GAGAATAGGAHcc;5TAccTccGJTGGATcAATAccccGGAcAGAGATGcTTAAAccGAc丁TTAATTAGAAcGcTcGTAGAAccGTTcTTccAAGAGAAAAAGGAcccGAA^cATAGGcTSATPGTXcGPGcAATAGTAAAGAAAAGATTcAGcAAcAAAAAKTAAAG"G,AT;AGcTTGGGGcTTAAGGTTTAT碰s5AAGwcATAc,AAGTTcGTcAGAGAcTTAA^ATAATTTcGAAAcccA門cTcGAGGTTAcJGTGA:TAGwGcGcTAAMrT)rjuc……嘗G5AG5cS込h{AGT-cGTTGGTTccTTbMGTTAA^wcA0TcvTcGAAcGAccAGAAccwKcKT丌-AyTTccAGGAAGGAAG，，rjrTGccAArTGAGAGGAAAGAcTTAcAAGAAcAGcAGAA—G，5cGMAGSTATAGATTGAGTTTGcGGTTGGGAAcTGcGAAAGTTc\釘…s…T^TAr1rAfky工S^AMAMGt…而三McSAcG5GAA5Tc…雄l……g￡濕TTntAAGyTGGTATAcTAAcccGccAGTccccGAATAAATTAcAAGTTcA:GTAAAAG丁TAcccTTTcATTTGAAAAAAAAGTAcA丁TAAGAGATcccATATGAAGAGGGAGAcGTAAGccAATAGTAAATcTccTTTAcTGcTAAATGccGTAAAccGccAAcTATAccAGcTTATcGGGAATcccGGGATG5cTAAPTGcA^GATAGGTAGA^TtAAAIcPmGtTt:TbTMA9GAT^AGGGctAAATAcAGATAAAA:AAcATT;<A丁AAGATAGTAAcTATcccccTT，ATTAAccGAGAAGGM織GAAATAAATTGcGAG丁AAcTGGAGGcAAGTTTGAGAGTTcTccGTTAAccccGGAGGGAAccAGcA:cGTATcAAAGAGAcGGAAGAcccccATAcTcAGAAcAGGAAAAAAGTTTTAcTGAATTcTTTcAAGAGA訂TcGGGATTAGTTGAGAAcTAAAcGGAAGcGAcAATTcTTTTcTATcGATmA&AwMcA5GGgGJSAGAAcAG，GTAGTcAccAABTcPyAAAPT，AHAccAAiccyAA訂GASAASATAAAwTwG5wG^TA5GcATAGccATTATATccGGA^TAyA，§TGcGTG^cGcATGAAAcTccTTTGAKAGAAAAAAAGS3TAGGAmTT5G5TcAAcJcGAGTTcAcTAGAccGcA;MccQGTAA:fl<Jc了T丁TGTGcc208<formula>formulaseeoriginaldocumentpage209</formula>SEQIDNO:482:TTCATGATTAAGGAGATTGATAAATGA(SE(JIDNO:478)SEQIDNO:479:SEgIDNO:柳:GGAGGGCATTAA(SEQIDNO:480)SEQIDNO:481:CTCTTCTTCTAA(SEQIDNO:481)ATrcA^GwG5TAcGaATTTccAAcccGbcMAwG5c5AATATccTTTGbGAT9AMG^TTGGA1^F;:-TASTGSAGScTTAATAcGGGpAAGTG5wAAAA^SGTTTcGA.9AAATGAATTTcTAATGccGTAAAcc丁ccAAAcTTAAc丁訂cGAAG丁TGAAAAGTcGTcGGAGAGAGGTAATTGAAGcAATTAcGAGGccGAcTAGTccAAAAAcAGGcAAGATTGGAcAAAGTccr丁丁wJA5AAMSG^TTTTaAKG"AAGGAAGAGAAccTfiTS汀G^JTTcccTcA二「cRcA5GAAA丁A〕cGAAAAGGcAAAcTTAGGGAAATS汀MAtAAc二MAMAG汀wG5TA:TCGASAARAGcGT^AAGAAwAwA2TAAAGATTTT^cATcAtATcGTAGGAGTAAAMAGTAAcA:TAcATAGAAAcAAGcccGccTATTAccGGAAAcTGTATTGcGAGA:ccTAAGcAGGAcGGAccccAAAGTGcTAA!AcTGGTGTAAAccTTTcATTcTGGAGGcAA:GTTGAGAGATcTccGTTAAccccGGAGTGGAAccAGcAcGTTATGElGAcAT9r7Jo眼叨Gs_iGGGTKG5GcGGTGAAGTAcAATT<GA:GGtA5TCGAuaTAKTT汀TASAJCCATTGAAAG卩AAccccTA;TcwTcTGccGAAccTAAGGGGTTTAGGGTTcGAATcGGGcAAAAAGAATA:GTcGGG丁cGTT-證s織…、Ayec匸VT嵐^AwC了T昏GTA:AtcscG!AcTTAhGwAT"f、JrJ"MAGAATGTGThATywG9SAWctcMwcTAMAGSTTKGtcA冗ArcwTTA5AGGcATpATJccGTAAAGAAccGTAM訂"5眼AVTAwA^SA"化25cAATAcTATATnTcMMGM"G訂2S丌燈9cwGtPGtAJhTG^TcMAGSGGegTTGcAAGTGAAATGGTGGAATTATAATAAAcAAGcTAcGGATATTwccccG匿nTAGM9TAGGGmAAAGAATccATccATAGGAA210GATAAAGCTTGAAGAAAGAAAAGATTGA(SEQIDNO:482)SEQIDNO:483:TTCTCTATATCTATGAGATTAGAAAGGATTAG(SEQIDNO:483)SEQIDNO:484:TTAcTTTAcATTGTGGAGGGAJA5AAhcJGAcGAAccAJ<AtGS"cAAwT"AATAccAATGMGc9cAMGTTc^cAcGAcAcwA95cGMTAATSA丌5ccwA."5ccAKAA5cJTGcGKTMscGAATGg;Ac5tGaw區(qū)sA丁TMAGSAASACr丁丁GcP^^AMAGM5c^AT^AJ乂GAKG^AnTGSyASGATACCAAcAAAGAcAAAAcTTAAcGAAAAAGAcGTAAGTTGcATTAAGAGAGcA:GTTcAAcAGT5TtATTAcAAAG、JcA^GAyATgGG汀A9MAGr1AAc\ThcGK丌ASwGHGAHAt5TA皿sATST^AcAJGAGTGJA^ATtTATcAATA與重復(fù)序列SEQIDNO:ll和/或SEQIDNO:12。212(SEQIDNO:484)SEQIDNO:485:TGAACTTTTAACTGCGGAGGTCTAA(SEQIDNO:485)SEQIDNO:486:(SEQIDNO:486)SEGIDNO:487NO:487)GTGGTTccccGGAcAGAGATTTGcTTAAAccGcTTTTAATAGAATccTcAGTAGTccAAAcGTcTccGTAGTGcTTTAGTTccAGGGAAAAcTTAGcAAAAGAAATGAGM了^GAGAGMTAAGwTMGA丁GGGG￡Ttla匿PcTcGTTAcTA<^A^GATAc0TccAAAAA-，GPTcAGATSGcGTAGTcccGGGcTTGGTTTTAccGTAAGcccAGTATTAATGTcAATTccGTA:cTc7dAGA,cGcAAAGA麗隱d-STT一￡TGAGAGGAcGGcAGGAAT^K1)tcXTTrGPAATcGcAGTGATAGGATAGccA;AT丁TAcAGwGASG幻5AsGAgGGwACPAwA"T7)TMs訂T蓋wGA"TcH^ATAWSAG5ATA^GTSA叮MtA…1)APScGtlTc丌GGS，TwTc"ccAGcATTAAAAAGTATccTAAcATAT丁cAgTTAAT2cT丁TACTPcTcT訂9cAcJGAKAcAcGcAcPVGsA^TTGAw^AA9TAGGGAATAcA:Gcw汀MAT;Awc^AG^cTATAG"AA^AG^AA^AGGGGTTGAAGTTccGAGAGGAGGTGcTTA;AccAATTGTAGTAGcAAAGAAAAGGGAAAAAcAGGAGcGAAcGAATTTAccAGAAAcAGGTcGGGcGAGGGGcGTGGTTTTTTAAccAGc^QAEAscT5GAT*^AgTAAG^GAGAMs肌就gyTtTbTAAAcTGAAMGuGtAATTAcwAMc汀5TAcAc功能性組合#3:如下所示的c船序列SEQIDNO:488至SEQIDNO:508和SEQIDNO:517至SEQIDNO:521。SEQIDNO:488-497來自無乳鏈球菌，而SEQIDNO:498-503來自變異鏈球菌，并且SEQIDNO:504-508、517-521來自釀膿鏈球菌。SEQIDNO:488:TATAcGAGGGcGccAcTGGcTcAGTTccGGAAAcTTccGAATAAGTAAGAAcATTAATc丁ATGcAAA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riginaldocumentpage230</formula>功能性組合#4:如下所示的cas序列SEQIDNO:509至SEQIDNO:516(它們均來自酉良膿鏈球菌)SEQIDNO:509:SEQIDNO:520:AATCTTAA(SEQIDNO:520)SEQIDNO:521:TAACTAAAAATATGGTATAA(SEQIDNO:521)與重復(fù)序列SEQIDNO:13至SEQIDNO:19<蕓M5GS9ASAcAGAAcGcGTrl-丁AGAGscAhGAnATGTccGnKTGATTAGAGTAGGGTAmGGwTcAAcyAwAGA^A^AAPccGTccTAT丌TTATTAcAcTccAT汀cGATTAcATcTGAGGGTAGTTcTGAcTAATTAGGGTGGTGAG乂GAGAGAAGAAcGGAcAAAGTGGGTAAccTc_1cctcASAc…品TAccAAcTAGGflATATccGcccAAc丁/G,AA5丁TATAA.A;AA……AMcGMcG化AbHAT丁TJPAGT17ATwAJMcc5cA5Gc込TAAcGAATGcTTTGcTATTcGAAAAGcAAGGAGcGTcA;cAGGcAGccGAAGTTTGTTTcTGAGAGTA^G^TTTPGTA燈sGwT2GTAT^AGTTGJTGcAAcGAAAGAGAGcAAAGAGAcAAccTtAAMcTHMTpAtVAA……GA:AKGAcGAAAGcGGTTcTAAcAGGcGGAGA:ATTAccTTAGccAAGA:GATATTcccTTAATTcrTTCP,"TArTTATAATGcTyATG^ATAr.cAAcAGTAcAAAGAGAAAcGAGATTTTAGcccTTAGSs燈wGMMsTGAAGGGAAAGGcccAAG<image>imageseeoriginaldocumentpage232</image><formula>formulaseeoriginaldocumentpage233</formula>SE(5IDNO:511ATGCCATGGAGAAAGGAGAAAACTGA(SEQIDNO:511)SEQIDNO:512:AcTGAcAAAAcAGwTTcTATc^cGTTTTccTATTATGGAgcTMGcbcMATTAwG1)Tt:cGMAATTAAcGGAAGGAAGcGAGAcAA嵐GccGAAAGATccGGccGTAATGccAGGTTAGTGAGcAAGGAGAAAGAATGGcGAGTccTAAAGAcGGcTTATccAAGTTGAcAAcAcTTcccATTcG5，TAWcTgcc汀ATTT5S川GAATATCAMTTGGcAGGGGrA)wATT;AAAATAAc…c4"乂TAcTTAAAGccAcGGSTA…GGGAGTGTGGAc"A:AcScTKGGTGAGTAc丁cT叮t.ATTS9ATGcJAMGTnWATJM^AG5TGAAcTTTTTTTGTTTcccLeyGAScG§TAccGccccTAATcGA…AAAGAcAA5TA5A;ccGATATAGcAATGAGTGAAAAGcGATAAGAGGGTTcAAGGGAGGATGTcAGcTccAGTTMTgctGAAAcTGAAT一sw￡一TT叮AAgccAGATAGcAGAMG〉GAGGGTcAAATcGTATc星c)KccAATATTGTAGT.5-cAMGG"cT5TCATTcATAcTTGGcTAAAAccGATTAATGAGTTTTTTcAGTGccAAATcAAccTTAGA;cccTGGGTTccAGATTToGNyDTIGQcEAsTMTTGt:GrT)Tw5c1GyATcGAcTTAGcAAAMA汀AGGAGG5AMGAKGPGA1cG^GAGMcRAcAcAGGAAGTGAMGScTyGTGGAATGAGA2AJcGTccAGTcrcATAAAG5A5cAAAGATcTcATA丁TGGAATTGGAGAccGcATAAcATTccAGccGATTATcccGG丁TGc暨芬…ASM*<*r,-「cAGcTc幻s"7力TTgc^cAA…織面嵐GJ"SG趴KJGTTAJAGTecGAKAAT^GE3ATcGAGcTTTGTGATAABGA汀R5c5AcGcKACTAGGcMGTAMcGATGGTJJAAAATGAGcATGTTGcGTaGKAAAAcAAA汀Gc5DcGAAAG;<G^MGATAATTA:GPATTGccAGTGGTcAGAcGAcGAGAcGAAAAAGTTTcAGA;AGTcccTTcTTTTTTGG丁A;AcGGTATTAAGAcGGAAccGAccGGAGAAAcAGTcAAAGTGAcTAcA:TAAAAATTAAAAAAAGcccAGTGTTAcc丁A"c汀AAGATAAGATwGT.5TATcccGGGAGAAG訂gGtA^TAGTTAAcTTTAElAccAcccTcM亂GAGMAATAAATTAcAGcTGTcwTPTG汀AGwAcGTTTCCTAGAAGGACTCTAG(SEQIDNO:513)SEQIDNO:514:SE()IDNO:515:SEQIDNO:513:TAPG3TATGccGA5AAATcTccAGAccGAAcATcAGGAA0GAAAAGAG"GAAMGE，SG9cMTtc"TG5AATTGAcGAAAcGTTtAGwTTATT^AA9ccATcA7cATTS^ASTTKGTPG^^AMA:TA濕s窗usGMGC5GTSAG1cAcT,AATGATAAAATAGTGTGATTtAAtAcTGTAAAA叮A^Awc!::AcAGAAGGlGcTcTTTTATcGGcATcATcccGAGAAcGTTTATTAAAAAcAGGGAAcTAcTTAcAAATGGcAGAGcGAGAKTS夂TTwtAghA!TcAATTAAACSCcgA;，J8AAcAGGcGTTATAcwG「丄JSCATwVGcGTTccAATTc^cAuAcMSAfVGGTTATTcGTAAGcATT…織B8GTT-TTGGGAGTcGTAATT，TT1、KAAGTTTTGAAcAGcAcATAcAAA1.sNGcGATTQQEsTTPGAATAAcAcccA"GATccAcccAAAAcAAAAcTGcAAAGTAAccTTTAcGAcTTGGAcTGcGTAATTTTAGTGAAGcc丁TcTGGAccTGGTTcGAGAAAGcAAAAAGAAATTAcATTcccAATAGAcGAAAcTAcTTTTGGCAWcc5AJ^…GAMG告Tc5GtrJrl-f*cGTAGAGAGGA汀HMwG95§M<^cA5TAwGGMAuTc5cTAAGGS^A訂9cTAAGAAGcAcATTGcGcGGTAMG5AAAGAJTAGTAcTAGGGTAAcGcAcGGGAGJTGG汀ccMAmT謹gcbTAJAGcHGGcG^ATGPAAATA:cGAGTTTTMGPcTTTTTTA&GGA^AAGAAAchGmw訂ATSGGGTATA虹s狙sAcGTG趴TAcAAGATTAwASG"p)w^TMGGKAcAGGcJTGGGGGTTTTcTJGGccGgGcATGT^TTTcGTTAcTTTGTATTTGAAAcGTAAAcGAAGAAAGGAAGTTccGGTTGTAAAAccAAGGTGT1GmcAgWASpGgTGKAGM5wA1ATXAGTTGTGcGcATTAAAcTTccTAcAAAAcAGGGGAGcAAAwycg^c，)ATrcATtA、)TABCGAccAGGGcGGGGGTTTcATTTTGAATAGAAGGAccTTGGcAGAAAAGTcGTTGKoTHcccGGTccG^SA踐sgSwGGG1^…cMyG5GTMTT^AAATGmAT乂cJJTXG了2TTgGAKTT5TT5TG5AwAAPAGGmGTATcATAArjr汀GTATJGTAcccGJTKGTMTAGGc^ATGcccTGGA235員的水平。全部專利及出版物通過引用的方式以相同程度并入本文，如同專門且個別地指出通過引用方式并入每份單獨的出版物。本領(lǐng)域技術(shù)人員輕易地認識到本發(fā)明充分地適應(yīng)于實施所述目標并且獲得所提及的目的和優(yōu)勢，以及其中固有的那些目的和優(yōu)勢。本文所述的組合物和方法是優(yōu)選實施方案的代表，是示例性的，并且不意圖作為對本發(fā)明范圍的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員輕易地知道可以對本文披露的本發(fā)明進行各種替換和修改而不脫離本發(fā)明的范圍和精神。本文中示例性描述的本發(fā)明可以在缺少本文沒有具體披露的任意要素或諸要素、限制或諸限制的情況下實施。已經(jīng)使用的術(shù)語和表述作為描述性而非限制性術(shù)語使用，并且在使用此類術(shù)語和表述時不意圖排除所示或所述屬性或其部分的任意等效物，不過應(yīng)當(dāng)意識到在本發(fā)明范圍內(nèi)可能存在多種修改。因此，應(yīng)當(dāng)理解盡管本發(fā)明已經(jīng)通過優(yōu)選的實施方案和任選屬性具體地披露，然而本領(lǐng)域技術(shù)人員可以求助于本文所披露概念的修改和變化，并且將此類修改和變化認為屬于本發(fā)明的范圍。本發(fā)明已經(jīng)在本文中廣泛地且一般性地進行了描述。屬于一般性公開內(nèi)容的每個較小種類組和次級類屬組也形成本發(fā)明的部分。這包括用限制SEQIDNO:516:與重復(fù)序列SEQIDNO:20和SEQIDNO:22<AAAycJGAcGAATGAcAAGAGATTccTGAcAAGTGcTA-_>TGJAA^TSG訂KAScG會AnccHGAMAGwcAc^TGAGG2GT^TTATTGGAAThcT7ATccGGKTcGAGaAATGA^cf)AT^A-GTASMGcGAAAcc一cATT"T-〔T-AcwcA^yTwGGTTM叨A工1"「A^TGAcGAJG^2AAt蕓MSB叢星込sMGTAGSMhGA^TAAA:G5AMTctcGtcAwe。MA巻t訂AGPAGPATAJTATGwHA!濕ScT…MSGStA燈3GsG5M…肌HScGA"GMAA^TTTGcAAGsTGJcT認^G^ActAG汀^GH2TTbcGATTGGTAcATGATcccAATGTATTcAAAAGAAAGAGAAAAcTTTccAcAAGAGGAGcATGATGGAccccATcGAAAGATTTAGGGAGcAAcGGAATcGT5TcoGNASSEG。cGTAGAAAAAGGGTcGTccA.cAAAGGcTAAAGAGTATTccGTTTTGGG丁ccGGTTc〔AGoKPN1DEsAAGTATAuAGATAA汀AGPGAGGTA叮GTGGAAAGAc』aAPcASGcGTcTTcTccAGATAcGcAAA236條款或否定性限制條件對本發(fā)明的一般性描繪，其中所述的限制條款或否定性限制條件從所述類屬中排除任意主題，無論所排除的材料是否在本文中具體提及。權(quán)利要求1.用于產(chǎn)生至少一種噬菌體抗性變異菌株的方法，所述方法包括步驟(a)使包含CRISPR基因座的至少一部分的親代細菌菌株暴露于至少一種核酸序列，以產(chǎn)生包含至少一種含有經(jīng)修飾的CRISPR基因座的噬菌體抗性變異菌株的細菌混合物；(b)從所述細菌混合物選擇所述的噬菌體抗性變異菌株；(c)從步驟(b)中選出的所述噬菌體抗性菌株中選擇在所述經(jīng)修飾的CRISPR基因座中包含額外核酸片段的所述噬菌體抗性變異菌株；(d)分離所述的至少一種噬菌體抗性變異菌株，其中所述菌株在所述經(jīng)修飾的CRISPR基因座中包含額外的核酸片段。2，權(quán)利要求1的方法，其中所述的方法還包括步驟比較所述親代細菌菌株的所述CRISPR基因座或其部分和所述噬菌體抗性變異菌林的所述經(jīng)修飾的CRISPR基因座，以鑒定在所述經(jīng)修飾的CRISPR基因座中包含在所述親代細菌菌林的所述CRISPR基因座中缺少的至少一個額外核酸片段的噬菌體抗性變異菌抹。3.權(quán)利要求2的方法，所述方法還包括選擇在所述經(jīng)修飾的CRISPR基因座中包含額外核酸片段的所述噬菌體抗性變異菌林的步驟。4.權(quán)利要求1的方法，其中將所述的親代細菌菌林暴露于兩種或多種核酸序列。5.權(quán)利要求1的方法，其中將所述的親代細菌菌林同時暴露于兩種或多種核酸序列。6.權(quán)利要求1的方法，其中將所述的親代細菌菌林依次暴露于兩種或多種核酸序列。7.權(quán)利要求1的方法，其中所述的親代細菌菌抹通過被包含所述核酸序列的至少一種噬菌體感染而暴露于所述的核酸序列。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述的至少一種噬菌體選自以下病毒科覆蓋噬菌體科(Corticoviridae)、嚢狀噬菌體科(Cystoviridae)、絲桿狀嗟菌體科(Inoviridae)、光滑噬菌體科(Leviviridae)、」微小噬菌體科(Microviridae)、肌尾噬菌體科(Myoviridae)、短尾噬菌體科(Podoviridae)、長尾噬菌體科(Siphoviridae)和復(fù)層噬菌體科(Tectiviridae)。9.權(quán)利要求7的方法，其中所述的至少一種噬菌體是天然存在的噬菌體。10.權(quán)利要求7的方法，其中所述的至少一種噬菌體是使用噬菌體抗性細菌通過選擇壓力所獲得的突變噬菌體。11.權(quán)利要求l的方法，其中所述的親代細菌菌林通過天然的核酸攝取機制暴露于所述核酸。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述天然的核酸攝取機制包括天然感受態(tài)。13.權(quán)利要求11的方法，其中所述天然的核酸攝取機制是親代細菌菌林通過接合或轉(zhuǎn)化攝取核酸。14.權(quán)利要求1的方法，其中所述的噬菌體抗性菌林是噬菌體不敏感性突變體。15.權(quán)利要求1的方法，其中所述的親代細菌菌林是噬菌體不敏感性突變體。16.權(quán)利要求1的方法，其中親代細菌菌林的所述CRISPR基因座的5，端和/或3，端與所述噬菌體抗性變異菌林的所述經(jīng)修飾的CRISPR基因座比較。17.權(quán)利要求1的方法，其中所述親代細菌菌林的所述CRISPR基因座的至少第一CRISPR重復(fù)序列或至少第一CRISPR間隔區(qū)的5，端和/或3，端與所述噬菌體抗性變異菌林的所述經(jīng)修飾的CRISPR基因座比較。18.權(quán)利要求1的方法，其中所述的噬菌體抗性變異菌林包含在所述經(jīng)修飾的CRISPR基因座中的至少一個額外核酸片段。19.權(quán)利要求l的方法，其中所述親代細菌菌林的所述CRISPR基因座的所述至少一部分和所述噬菌體抗性變異菌林的所述經(jīng)修飾的CRISPR基因座的至少一部分通過擴增所述CRISPR基因座的至少一部分和所述經(jīng)修飾的CRISPR基因座的至少一部分，以產(chǎn)生擴增的CRISPR基因座序列和擴增的經(jīng)修飾CRISPR基因座序列而進行比較。20.權(quán)利要求19的方法，其中使用聚合酶鏈反應(yīng)實施所述的擴增。21.權(quán)利要求1的方法，其中所述親代細菌菌林的所述CRISPR基因座的所述至少一部分和所述噬菌體抗性變異菌林的所述經(jīng)修飾的CRISPR基因座的至少一部分通過對所述CRISPR基因座的至少一部分和所述經(jīng)修飾的CRISPR基因座的至少一部分測序而進行比較。22.權(quán)利要求19的方法，所述方法還包括步驟對所述擴增的CRISPR基因座序列和所述擴增的經(jīng)修飾的CRISPR基因座序列測序。23.權(quán)利要求1的方法，其中在所述經(jīng)修飾的CRISPR基因座中的所述額外核酸片段是額外的重復(fù)序列-間隔區(qū)單元。24.權(quán)利要求1的方法，其中所述額外的重復(fù)序列-間隔區(qū)單元包含至少約44個核苷酸。25.權(quán)利要求1的方法，其中所述額外的重復(fù)序列-間隔區(qū)單元包含約44個至約119個核苷酸。26.權(quán)利要求l的方法，其中所述額外的重復(fù)序列-間隔區(qū)單元包含與所述親代細菌菌林的所述CRISPR基因座中的CRISPR重復(fù)序列具有至少約95%同一性的至少一個核苷#列。27.權(quán)利要求l的方法，其中所述額外的重復(fù)序列-間隔區(qū)單元包含與至少一種噬菌體的基因組中的核苷酸序列具有至少約95%同一性的至少一個核苷酸序列。28.權(quán)利要求l的方法，其中所述的親代細菌菌林是工業(yè)用菌林。29.權(quán)利要求28的方法，其中所述的親代細菌菌林易受至少一種噬菌體感染。30.權(quán)利要求28的方法，其中所述的親代細菌菌林包含從培養(yǎng)物獲得的菌林，其中所述培養(yǎng)物選自起子培養(yǎng)物、益生培養(yǎng)物和膳食補充培養(yǎng)物。31.權(quán)利要求1的方法，其中所述的親代細菌菌林選自埃希氏菌屬、志賀氏菌屬C^/ge/Zfl)、沙門氏菌屬(^"/1^^//")、歐文氏菌屬COiW"/")、耶爾森氏菌屬(7wsZ"/a)、芽孢桿菌屬CBac說Ms)、弧菌屬(KZ6W0)、軍團菌屬(￡^*柳￡//)、假單胞菌屬(P^"fito附ow肪)、奈瑟氏球菌屬(A^y^Wtf)、博德特氏菌屬(^^^&//<1)、螺桿菌屬(HWcokcte。、利斯特氏菌屬(Z^m'fl)、農(nóng)桿菌屬(々rodacteriM附)、葡萄球菌屬(iSV"/7/y^cocc"5)鏈球菌屬(5^T/7似coccMS)、腸J求菌屬(iEyiferacocc"5)、梭菌屬(C7as,i7V/i'w/w)、棒桿菌屬(Co/^ie6fl"eri'wM)、分枝桿菌屬(Afyco6tfcten"附)、密螺旋體屬(7V印owe附")、疏螺旋體屬(^ire/,a)、弗朗西絲菌屬(/^朋^^//")、布魯氏菌屬(i5/^<^//fl)、彎曲桿菌屬(Oz附/y;A6tf、克雷伯氏菌屬(^fe"iW/")、弗蘭克氏菌屬(Frfl/iA:/a)、巴爾通氏體屬(J5"rtowe//fl)、立克次氏體屬(7/cA;eto/")、希瓦氏菌屬(57^>1^^//")、沙雷氏菌屬(Sermrifl)、腸桿菌屬(五w^"Mfl"c)、變形菌屬(/VWe附)、普羅威登斯菌屬(/Vov/^/i"Vi)、索絲菌屬(5roc/ro幼r/x:)、雙歧桿菌屬(jBzy^foAacten'"附)、^i桿菌屬(5rev幼flcten.M附)、丙酸桿菌屬(尸ro/7/0w/6acter/i/附)，專'LJ求菌屬、乳桿菌屬(Z^r"oA"c///"s)、片球菌屬(尸^/,Vcocc"s)、明串珠菌屬(丄ewccm仍toc)和酒球菌屬(C^WOCOCCM51)。32.使用權(quán)利要求1的方法獲得的至少一種噬菌體抗性變異菌抹。33.權(quán)利要求1的噬菌體抗性變異菌抹，其中所述的噬菌體抗性變異菌林是工業(yè)用菌林。34.權(quán)利要求1的噬菌體抗性變異菌抹，其中所述的噬菌體抗性變異菌林選自起子培養(yǎng)物、益生培養(yǎng)物和膳食補充培養(yǎng)物。35.組合物，其包含使用權(quán)利要求1所述的方法產(chǎn)生的噬菌體抗性變異菌林。36，組合物，其包含使用權(quán)利要求1所述的方法產(chǎn)生的至少兩種噬菌體抗性變異菌抹。37.食物或飼料，其包含權(quán)利要求35或36的組合物。38.用于制備食物或祠料的方法，其包括添加權(quán)利要求35或36的所述組合物至所述食物或飼料。39.起子培養(yǎng)物、益生培養(yǎng)物或膳食補充培養(yǎng)物，其包含權(quán)利要求35或36的纟且合物。40.發(fā)酵方法，其包括添加權(quán)利要求35或36的組合物至起子培養(yǎng)物。41.發(fā)酵方法，其包括添加權(quán)利要求35或36的組合物至發(fā)酵培養(yǎng)基，在這樣的條件下所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分的發(fā)酵發(fā)生了。42.權(quán)利要求41的方法，其中所述的發(fā)酵不受噬菌體的存在影響。43.權(quán)利要求41的方法，其中所迷的發(fā)酵培養(yǎng)基是食品。44.權(quán)利要求43的方法，其中所述的食品是乳制品。45.權(quán)利要求44的方法，其中所述的乳制品是乳。46.權(quán)利要求41的方法，其中將包含兩種或多種噬菌體抗性變異菌株的至少兩種不同組合物依次暴露于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基。47.用于減少發(fā)酵培養(yǎng)基中有害噬菌體群體的方法，所述方法包括使發(fā)酵培養(yǎng)基暴露于使用權(quán)利要求1的方法產(chǎn)生的至少一種噬菌體抗性變異菌林，在這樣的條件下減少了所述噬菌體群體。48.用于產(chǎn)生至少一種噬菌體抗性變異菌林的方法，所述方法包括步驟(a)使包含CRISPR基因座的至少一部分的親代細菌菌林暴露于至少一種核酸序列以產(chǎn)生包含至少一種噬菌體抗性變異菌株的細菌混合物，其中所述的噬菌體抗性變異菌林包含經(jīng)修飾的CRISPR基因座；(b)從所述細菌混合物選擇所述的噬菌體抗性變異菌林；(c)將所述親代細菌菌株的所述CRISPR基因座或其部分與所述噬菌體抗性變異菌株的所述經(jīng)修飾的CRISPR基因座進行比較，以鑒定在所述經(jīng)修飾的CRISPR基因座中包含在所述親代細菌菌株的所述CRISPR基因座中缺少的至少一個額外核酸片段的噬菌體抗性變異菌林；(d)選擇在所述經(jīng)修飾的CRISPR基因座中包含額外核酸片段的所述噬菌體抗性變異菌林；(e)分析所述經(jīng)修飾的CRISPR基因座中的所述至少一個額外核酸片段以鑒定所述至少一種噬菌體抗性變異菌抹；和(f)分離所述至少一種噬菌體抗性變異菌林。49.用于產(chǎn)生CRISPR逃逸噬菌體突變體的方法，所述方法包括(a)獲得至少一種親代噬菌體和包含至少一個CRISPR基因座的噬菌體抗性細菌菌林，其中所迷的CRISPR基因座包含與所述至少一種親代嗟菌體的基因組中的至少一個原型間隔區(qū)序列至少約95%同一的核*列；(b)使所述至少一種親代噬菌體暴露于所述噬菌體抗性細菌菌林，在這樣的條件下產(chǎn)生了至少一種噬菌體變體；和(c)選擇所述至少一種噬菌體變體，其中所述的至少一種噬菌體變體顯示感染所述噬菌體抗性細菌菌株的能力并且是CRISPR逃逸噬菌體突變體。50.權(quán)利要求49的方法，其中所述的噬菌體抗性細菌菌林是使用權(quán)利要求48中所述的方法獲得的噬菌體抗性變異菌林。51.權(quán)利要求49的方法，所述方法還包括步驟將所述噬菌體變體中所述至少一個原型間隔區(qū)序列的至少一部分和位于所述至少一個原型間隔區(qū)序列附近的CRISPR基序與所述親代噬菌體的至少一個原型間隔區(qū)序列和CRISPR基序比較。52.權(quán)利要求51的方法，所述方法還包括步驟選擇感染所述噬菌體抗性細菌菌抹的所述變異噬菌體，其中所述的變異噬菌體包含所述的CRISPR逃逸噬菌體突變體，并且其中所述的CRISPR逃逸噬菌體在該CRISPR逃逸噬菌體突變體的所述至少一個原型間隔區(qū)序列中和/或CRISPR基序中包含至少一個突變。53.權(quán)利要求49的方法，其中使用所述CRISPR逃逸噬菌體突變體和包含至少一個CRISPR基因座的不同的CRISPR噬菌體抗性細菌菌林，將所述方法反復(fù)重復(fù)一次或多次，其中所述的CRISPR基因座包含與所述CRISPR逃逸噬菌體突變體的基因組中的至少一個原型間隔區(qū)序列至少約95%同一的核酸序列。54.權(quán)利要求49的方法，其中所述的至少一種噬菌體選自以下病毒科覆蓋噬菌體科、嚢狀噬菌體科、絲桿狀噬菌體科、光滑噬菌體科、微小噬菌體科、肌尾噬菌體科、短尾噬菌體科、長尾噬菌體科和復(fù)層噬菌體科。55.權(quán)利要求49的方法，其中所述的噬菌體抗性細菌菌林選自埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、歐文氏菌屬、耶爾森氏菌屬、芽孢桿菌屬、弧菌屬、軍團菌屬、假單胞菌屬、奈瑟氏球菌屬、博德特氏菌屬、螺桿菌屬、利斯特氏菌屬、農(nóng)桿菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、梭菌屬、棒桿菌屬、分枝桿菌屬、密螺旋體屬、疏螺旋體屬、弗朗西絲菌屬、布魯氏菌屬、彎曲桿菌屬、克雷伯氏菌屬、弗蘭克氏菌屬、巴爾通氏體屬、立克次氏體屬、希瓦氏菌屬、沙雷氏菌屬、腸桿菌屬、變形菌屬、普羅威登斯菌屬、索絲菌屬、雙歧桿菌屬、短桿菌屬、丙酸桿菌屬、乳球菌屬、乳桿菌屬、片J求菌屬、明串珠菌屬和酒球菌屬。56.使用權(quán)利要求49的方法獲得的CRISPR逃逸噬菌體突變體。57.權(quán)利要求56的CRISPR逃逸噬菌體突變體，其中兩個或多個突變存在于至少兩個原型間隔區(qū)序列中和/或所述CRISPR基序中。58.CRISPR逃逸噬菌體突變體，其中所述CRISPR逃逸噬菌體突變體的基因組是經(jīng)基因工程化以在至少一個原型間隔區(qū)和/或所述CRISPR基序中包含突變。59.CRISPR逃逸噬菌體突變體，其中至少一個所述CRISPR基序突變。60.CRISPR逃逸噬菌體突變體,其中至少一個所述CRISPR基序缺失。61.組合物，其包含至少一種權(quán)利要求56的CRISPR逃逸噬菌體突變體。62.用于控制產(chǎn)品中細菌種群的方法，所述方法包括使權(quán)利要求61的所述組合物暴露于發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基含有至少一個不希望的細菌種群，在這樣的條件下減少了所述的不希望的細菌種群，并且所述的發(fā)酵培養(yǎng)基用來產(chǎn)生所述產(chǎn)品。63.權(quán)利要求62的方法，其中所述的產(chǎn)品選自食物、飼料、化妝品、個人護理產(chǎn)品、保健產(chǎn)品、獸醫(yī)產(chǎn)品和膳食補充劑。64.權(quán)利要求62的方法，其中所述方法重復(fù)至少一次并且輪換使用權(quán)利要求61所述的不同組合物。全文摘要本發(fā)明提供了涉及調(diào)節(jié)細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的方法和組合物。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了使用一個或多個cas基因或蛋白用來調(diào)節(jié)細胞針對靶核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗性的組合物和方法。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了在開發(fā)和使用菌株組合和起子培養(yǎng)物輪換中使用的方法和組合物。在其它的實施方案中，本發(fā)明提供了用于標記和/或鑒定細菌的方法。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了使用CRISPR基因座確定噬菌體對細胞的潛在毒力和使用CRISPR-cas調(diào)整噬菌體的遺傳序列以提高毒力水平的方法。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了用于開發(fā)和使用噬菌體作為生物控制劑的方法和組合物。文檔編號C12Q1/68GK101688241SQ200880014507公開日2010年3月31日申請日期2008年2月29日優(yōu)先權(quán)日2007年3月2日發(fā)明者C·弗雷莫,D·羅梅羅,P·伯亞瓦爾,P·霍瓦特,R·巴蘭古申請人:丹尼斯克有限公司