專利名稱：EphB4作為診斷標(biāo)記和作為卵巢癌的治療靶標(biāo)的用途的制作方法
EphB4作為診斷標(biāo)記和作為卵巢癌的治療靶標(biāo)的用途相關(guān)申請(qǐng)?jiān)撋暾?qǐng)要求2007年3月12日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/906，727及2007年3月 12日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/906，764的優(yōu)先權(quán)。該引用申請(qǐng)的全部教導(dǎo)此處以其整體 引入作為參考。
背景技術(shù)：
卵巢癌是婦女中第二常見的婦科癌，在2005年美國(guó)約有22，220例新病例 (American Cancer Society，2005)。卵巢癌比女性生殖系統(tǒng)的其它任何癌引起更高的死 亡。絕大多數(shù)卵巢癌起源于上皮。卵巢癌在攜帶BRCA或錯(cuò)配修復(fù)基因突變的婦女中具有 更高的發(fā)病率(MataiS-GUiU，1998)。也已經(jīng)研究了雌激素在卵巢癌發(fā)展中的作用。相信雌 激素的某些代謝物可能幫助腫瘤生長(zhǎng)，而孕酮可能具有保護(hù)作用(Seeger，2006)。不存在有 效的卵巢癌篩選工具，并且在超過80%的病例中，直至疾病晚期才能做出診斷，這使得治療 非常具有挑戰(zhàn)性。目前總體5年存活率是44% ；然而，患有該疾病的婦女的相對(duì)5年存活 率僅為29% (American Cancer Society, 2005) 0因此需要鑒定在卵巢癌發(fā)病機(jī)理中起作 用的新的分子標(biāo)記，希望提供新的靶向生物療法。本公開內(nèi)容的目標(biāo)是提供用于抑制卵巢癌的血管發(fā)生和腫瘤生長(zhǎng)的試劑和治療 性治療。發(fā)明概述在某些方面，本公開內(nèi)容提供了治療卵巢癌的方法，所述方法包括向需要治療卵 巢癌的患者施用有效量的EphB4抑制劑。在某些實(shí)施方案中，所述抑制劑可以是多肽、多 肽類似物、擬肽、抗體、核酸、RNAi構(gòu)建體、核酸類似物或小分子。在某些實(shí)施方案中，所述 EphB4抑制劑是抗體或其抗原結(jié)合片段。在某些實(shí)施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段選自多克隆抗體、單克隆抗體或 抗體片段、雙抗體、嵌合的或嵌合抗體或抗體片段、人源化抗體或抗體片段、去免疫化人抗 體或抗體片段、完全人類抗體或抗體片段、單鏈抗體、FV、Fd、Fab、Fab，和F(ab，)2。在某些 實(shí)施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段是單克隆抗體。在某些實(shí)施方案中，所述抗體或其 抗原結(jié)合片段結(jié)合EphB4的胞外域。在某些實(shí)施方案中，EphB4的存在是EphB4的可檢測(cè)水平。在某些實(shí)施方案中，樣 品選自組織樣品、血液樣品或血清樣品。在某些實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段共價(jià)連接額外的功能部分。在某些實(shí) 施方案中，所述額外的功能部分是可檢測(cè)標(biāo)記。在某些實(shí)施方案中，所述可檢測(cè)標(biāo)記選自熒 光標(biāo)記或生色標(biāo)記。在某些實(shí)施方案中，所述可檢測(cè)標(biāo)記選自辣根過氧化物酶或堿性磷酸 酶。在某些實(shí)施方案中，所述額外的功能部分包含聚乙二醇(PEG)部分。在某些實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段抑制EphB4活性。在某些實(shí)施方案中， 抗體或其抗原結(jié)合片段激活EphB4激酶活性。在某些實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合到位于EphB4胞外部分中的表位 上。在某些實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合到位于人EphB4序列的氨基酸16-198內(nèi)的表位上。在某些實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合到位于人EphB4的氨基酸 327-427或428-537內(nèi)的表位上。在其它實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段包含重鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變 區(qū)包含一個(gè)或更多個(gè)⑶R區(qū)，所述⑶R區(qū)具有選自SEQ IDNO 261, SEQ ID NO 262和SEQ ID N0:263的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段包含輕鏈可變區(qū)，其 中所述輕鏈可變區(qū)包含一個(gè)或更多個(gè)⑶R區(qū)，所述⑶R區(qū)具有選自SEQ ID NO :264、SEQID NO 265和SEQ ID NO 266的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含免疫球蛋白重鏈和免 疫球蛋白輕鏈，其中所述重鏈包含包含SEQ ID NO :8的⑶Rl、包含SEQ ID NO :9的⑶R2 和包含SEQ ID NO 10的⑶R3 ；并且其中所述輕鏈包含包含SEQ ID NO 11的⑶R1、包含 SEQ ID NO 12的⑶R2和包含SEQ ID N0:13的⑶R3。在某些實(shí)施方案中，所述人源化抗 體或其抗原結(jié)合片段包含免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈，其中所述重鏈包含包含SEQ ID NO 14 的 CDR1、包含 SEQ ID NO 15 的 CDR2 和包含 SEQ ID NO 16 的 CDR3 ；并且其中所 述輕鏈包含包含SEQ ID NO 17的CDRl、包含SEQ ID NO 18的CDR2和包含SEQ ID NO 19 的 CDR3。在另一實(shí)施方案中，EphB4抑制劑是可溶性多肽，其選自(i)包含EphB4蛋白質(zhì) 胞外域的氨基酸序列的可溶性多肽，其中所述EphB4多肽是單體并特異性結(jié)合Ephrin B2 多肽；和(ii)包含Ephrin B2蛋白質(zhì)胞外域的氨基酸序列的可溶性多肽，其中所述可溶性 Ephrin B2多肽是單體并以高親和力結(jié)合EphB4多肽。在某些實(shí)施方案中，所述可溶性多肽 包含EphB4蛋白質(zhì)的球形結(jié)構(gòu)域。在其它方面，所述可溶性多肽包含與EphB4氨基酸序列 的1-522殘基至少90%同一的序列。在另一方面，所述可溶性多肽包含與EphB4氨基酸序 列的1-412殘基至少90%同一的序列。在其它實(shí)施方案中，所述可溶性多肽包含與EphB4 氨基酸序列的1-312殘基至少90%同一的序列。此外，所述可溶性多肽包含與EphB4氨基 酸序列的1-225殘基至少90%同一的序列。所述可溶性多肽還可以是融合蛋白，或可以包 含一個(gè)或更多個(gè)修飾的氨基酸殘基。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述可溶性多肽抑制Ephrin B2和EphB4之間的相互作用，或抑制Ephrin B2和EphB4的聚集。在其它實(shí)施方案中，所述 可溶性多肽抑制Ephrin B2或EphB4的磷酸化。在其它實(shí)施方案中，所述EphB4抑制劑選自核酸化合物和核酸類似物。在某些實(shí) 施方案中，所述核酸化合物的長(zhǎng)度為約15-100個(gè)核苷酸，在生理?xiàng)l件下與SEQ ID NO 267 中闡明的EphB4核酸序列雜交并降低所述EphB4的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，所述核酸 選自RNAi構(gòu)建體和反義寡核苷酸。在某些實(shí)施方案中，所述RNAi構(gòu)建體選自dsRNA或 siRNA。在某一實(shí)施方案中，所述siRNA的長(zhǎng)度約為19-30個(gè)核苷酸。在某一實(shí)施方案中， 所述siRNA的長(zhǎng)度約為21-23個(gè)核苷酸。在某一實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸的長(zhǎng)度約 為19-30個(gè)核苷酸。在某些方面，所述siRNA序列選自SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2。在某些方面，EphB4抑制劑具有抗癌活性。在某些實(shí)施方案中，所述抗癌活性選自 抑制腫瘤生長(zhǎng)、抑制癌細(xì)胞增殖、抑制癌細(xì)胞遷移、抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、抑制血管發(fā)生和引 起腫瘤細(xì)胞死亡。在某些實(shí)施方案中，所述腫瘤細(xì)胞死亡歸因于程序性細(xì)胞死亡。在某些 實(shí)施方案中，所述EphB4抑制劑通過胱天蛋白酶-8的活化來引起程序性細(xì)胞死亡。在某些 實(shí)施方案中，卵巢癌包含一個(gè)或更多個(gè)表達(dá)EphB4的癌細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，用藥學(xué)上可接受的載體配制所述EphB4抑制劑。在本公開內(nèi)容方法的某些實(shí)施方案中，相比于來自相當(dāng)組織的非癌細(xì)胞，卵巢癌 細(xì)胞表達(dá)更高水平的EphB4。在某些實(shí)施方案中，所述卵巢癌是轉(zhuǎn)移的。在其它實(shí)施方案 中，所述卵巢癌依賴血管發(fā)生。在其它實(shí)施方案中，所述卵巢癌不依賴血管發(fā)生。在某些方面，本公開內(nèi)容的方法還包括至少一種額外的抗癌化學(xué)治療劑，其與 EphB4抑制劑以累加或協(xié)同方式抑制卵巢癌細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述化學(xué)治療劑和所 述EphB4抑制劑順序施用。在某些實(shí)施方案中，所述化學(xué)治療劑和所述EphB4抑制劑同時(shí) 施用。在某些實(shí)施方案，本公開內(nèi)容的方法還包括至少一種額外的抗血管發(fā)生劑，其與 EphB4抑制劑以累加或協(xié)同的方式抑制血管發(fā)生。在某些實(shí)施方案中，所述抗血管發(fā)生劑和 所述EphB4抑制劑順序施用。在某些實(shí)施方案中，所述抗血管發(fā)生劑和所述EphB4抑制劑 同時(shí)施用。在某些方面，本公開內(nèi)容提供了在受試者中降低卵巢癌生長(zhǎng)速率的方法，所述方 法包括施用一定量的EphB4抑制劑以降低卵巢癌的生長(zhǎng)速率。在其它方面，所述公開內(nèi)容 提供了治療患有卵巢癌患者的方法，所述方法包括(a)在患者中鑒定具有表達(dá)EphB4的大 量癌細(xì)胞的腫瘤；和(b)向所述患者施用EphB4抑制劑。在某些方面，本公開內(nèi)容提供了在 受試者中降低卵巢癌生長(zhǎng)速率的方法，所述方法包括施用足以降低卵巢癌生長(zhǎng)速率的量的 EphB4抑制劑。在某些方面，本公開內(nèi)容提供了 EphB4抑制劑在制備用于治療卵巢癌的藥物中的 用途。在另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝藱z測(cè)受試者是否患有卵巢癌或是否具有發(fā)生卵巢癌風(fēng) 險(xiǎn)的方法，所述方法包括(a)從所述受試者中獲得樣品；和(b)評(píng)估樣品中EphB4蛋白質(zhì) 和/或mRNA的水平，其中EphB4蛋白質(zhì)和/或mRNA的水平升高表明所述受試者患有卵巢 癌或處于發(fā)生卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)中。在一些實(shí)施方案中，EphB4蛋白質(zhì)或mRNA的水平是正常卵 巢組織中水平的至少兩倍。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是人類。在某些實(shí)施方案中，所述 卵巢癌是轉(zhuǎn)移性卵巢癌。在一些方面，在基于抗體的測(cè)定中評(píng)估EphB4蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。 在某些實(shí)施方案中，所述方法可在處于發(fā)生卵巢癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者、患有早期疾病的受試者 和患有晚期疾病的受試者中進(jìn)行辨別。在某些方面，本公開內(nèi)容提供對(duì)患有卵巢癌的患者進(jìn)行預(yù)后的方法，所述方法包 括(a)從所述受試者中獲得樣品；(b)評(píng)估樣品中EphB4蛋白質(zhì)和/或mRNA的表達(dá)水平， 其中EphB4蛋白質(zhì)和/或mRNA的水平升高表示預(yù)后不良。在某些實(shí)施方案中，EphB4蛋白 質(zhì)和/或mRNA的高水平是正常卵巢組織中EphB4水平的兩倍。在某些實(shí)施方案中，EphB4 的高水平是正常卵巢組織中EphB4水平的四倍。在某些實(shí)施方案中，EphB4的高水平是正 常卵巢組織中EphB4水平的十倍。在某些實(shí)施方案中，EphB4的高水平是正常卵巢組織中 可檢測(cè)水平的EphB4。在某些實(shí)施方案中，樣品選自組織樣品、血液樣品或血清樣品。在某些實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是人類。在某些實(shí)施方案中，所述卵巢癌是轉(zhuǎn)移 性卵巢癌。在另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁〦phB4抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含重鏈可變區(qū)和輕 鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含包含SEQ ID NO :261的⑶R1、包含SEQ ID NO 262的CDR2和包含SEQ ID NO 263的CDR3 ；并且其中所述輕鏈可變區(qū)包含包含SEQ ID NO 264 的CDR1、包含SEQ IDNO 265的CDR2和包含SEQ ID NO 266的CDR3。在某些實(shí)施方案中， 所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :42的氨基酸序列，并且所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO: 39的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，所述抗體是人源化抗體或其抗體片段。在另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┯糜谠\斷卵巢癌的試劑盒，其包含抗EphB4抗體或抗 EphB4結(jié)合抗體片段、可檢測(cè)標(biāo)記和使用所述試劑盒的說明書。在某些實(shí)施方案中，所述可 檢測(cè)標(biāo)記是熒光的或生色的。在某些實(shí)施方案中，所述試劑盒包含辣根過氧化物酶或堿性 磷酸酶。在某些實(shí)施方案中，所述抗體或其抗體片段結(jié)合EphB4的C末端部分。本申請(qǐng)涵蓋了任何上述方面和實(shí)施方案的組合。附圖簡(jiǎn)述

圖1A-1C顯示EphB4在人卵巢腫瘤樣品中表達(dá)并與晚期、腹水存在及低存活率相 關(guān)。(A)陰性(缺少一級(jí)抗體)對(duì)照(a)、正常卵巢上皮(b)和侵入性卵巢癌(c)中EphB4 的代表性免疫組織化學(xué)過氧化物酶染色。在X200的原始放大倍數(shù)下獲取所有圖片。(B)臨 床和病理學(xué)變量與卵巢癌中EphB4的過表達(dá)之間的相關(guān)性。(C)患有侵入性卵巢癌的患者 使用log-rank統(tǒng)計(jì)方法，基于EphB4染色強(qiáng)度的Kaplan-Meier存活。圖2A-2D顯示卵巢癌細(xì)胞系表達(dá)受孕酮下調(diào)的功能EphB4。(A)來自各卵巢癌細(xì) 胞系的20 μ g總細(xì)胞裂解物在4-20% Tris-甘氨酸凝膠上跑膠并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。該膜 依次用抗EphB4、抗EphrinB2和抗β肌動(dòng)蛋白抗體探測(cè)。(B)Hey細(xì)胞血清饑餓過夜并在所 示的多個(gè)時(shí)期用3 μ g/ml聚集的EphrinB2/Fc或單獨(dú)用Fc進(jìn)行刺激。EphB4從100 μ g全 細(xì)胞裂解物中免疫沉淀下來并通過抗磷酸酪氨酸抗體免疫印跡(上圖)分析磷酸化狀態(tài)。 以一式兩份的膜探測(cè)EphB4，以記載免疫沉淀作用的效率(下圖)。(C)用不同劑量的孕酮 和雌激素處理Hoc-7 (卵巢癌)和MCV-50 (卵巢囊腺瘤)細(xì)胞36小時(shí)并通過免疫印跡分析 細(xì)胞裂解物的EphB4、EphrinB2和β肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。(D)將IXlO4 Hoc-7細(xì)胞接種于 48孔板的各孔中并用不同劑量的孕酮和雌激素處理72小時(shí)。通過MTT測(cè)定評(píng)估細(xì)胞活力 并將存活表述為相對(duì)于未處理細(xì)胞的吸光度的百分比。圖3A-3E顯示EphB4擊倒(knockdown)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞程序性死亡。(A)用EphB4 特異性siRNA (EphB4-siRNA)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hev細(xì)胞，并在48小時(shí)后，通過免疫印跡分析20 μ g 全細(xì)胞裂解物的EphB4和β肌動(dòng)蛋白水平(上圖)。用突變的EphB4 siRNA Δ或天然的 EphB4-siRNA轉(zhuǎn)染1 X IO4Hey細(xì)胞并接種于48孔板中。在48小時(shí)，通過MTT測(cè)定評(píng)估細(xì) 胞活力，并將存活表述為吸光度相對(duì)于未處理細(xì)胞的百分比(下圖)。(B)用多種劑量的 EphB4特異性O(shè)DN(AS-IO)處理Hey細(xì)胞。72小時(shí)后，通過免疫印跡分析20 μ g總細(xì)胞裂解 物的EphB4和β肌動(dòng)蛋白水平(上圖)。用亂序的或AS-IO ODN處理IX IO4 Hey細(xì)胞。在 72小時(shí)，通過MTT測(cè)定評(píng)估細(xì)胞活力，并將存活表述為吸光度相對(duì)于未處理細(xì)胞的百分比。 (C)用 EphB4 特異性 siRNA(EphB4-siRNA)或突變的 siRNA (EphB4_siRNA Δ )瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hey 細(xì) 胞。如方法部分中詳細(xì)說明，使用全細(xì)胞裂解物通過ELISA分析程序性細(xì)胞死亡的胞質(zhì)核 小體。(D)在這些細(xì)胞中通過比色分析法測(cè)定胱天蛋白酶_8和胱天蛋白酶-9的激活并將其 表述為相對(duì)于脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺(lipofectamine)處理細(xì)胞的百分比活性。(E) wit脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺單 獨(dú)處理(對(duì)照)或 25nM EphB4 特異性 siRNA (EphB4 siRNA)或突變體 siRNA (EphB4siRNA Δ ) 處理36小時(shí)的Hey細(xì)胞的細(xì)胞周期分析。指出了 GO、Gl、S、G2和M期中細(xì)胞的％。在三組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中獲得了類似的結(jié)果。圖4A-4B顯示EphB4有助于腫瘤細(xì)胞遷移和侵入。(A)用塑料巴斯德吸管刮Hey 細(xì)胞的匯合培養(yǎng)物，以產(chǎn)生3mm寬的單層無細(xì)胞區(qū)。超過9小時(shí)后評(píng)估轉(zhuǎn)染25nM EphB4特 異性(EphB4 siRNA)或突變體siRNA(EphB4 siRNAA)后細(xì)胞遷移并閉合傷口的能力。(B) 如方法中所述，研究了 Hey細(xì)胞向基質(zhì)膠(Matrigel)包被的inserts的侵入。將響應(yīng)下層 室中l(wèi)Oyg/ml EGF侵入insert下面的細(xì)胞固定并用吉姆薩(Giemsa)染色。顯示了代表 性的顯微照片。圖5A-5B顯示EphB4特異性反義ODN在鼠類卵巢癌異種移植模型中抑制腫瘤生 長(zhǎng)。㈧將2X106 Hey細(xì)胞植入10到12周大雌性Balb/C裸鼠的脅腹中，并如方法部分詳 細(xì)說明來測(cè)定腫瘤體積。從細(xì)胞植入后第4天開始每天經(jīng)腹膜內(nèi)向小鼠單獨(dú)施用載體(載 體)，或10mg/kg亂序ODN (亂序的)或EphB4特異性反義ODN(AS-IO)。5周后處死動(dòng)物并 收集腫瘤。(B)用蘇木精/曙紅對(duì)福爾馬林固定的石蠟包埋切片的5μπι切片進(jìn)行染色并 通過免疫組織化學(xué)分析Ki-67和⑶31的表達(dá)。使用原位程序性細(xì)胞死亡染色試劑盒通過 TUNEL來評(píng)估程序性細(xì)胞死亡。不知情的觀察者在5個(gè)隨機(jī)高倍視野下將陽性染色的細(xì)胞 數(shù)進(jìn)行平均，并在各顯微照片中進(jìn)行了說明。AS-IO與對(duì)照組之間* ρ <0.05。左下圖中的 標(biāo)尺在H/E中表示200 μ m，在⑶31中表示100 μ m，在其它顯微照片中表示75 μ m。圖6顯示MAB265可變輕鏈序列與種系序列的比對(duì)。圖7顯示MAB265可變重鏈序列與種系序列的比對(duì)。圖8顯示針對(duì)EphB4產(chǎn)生的單克隆抗體和這些抗體表位作圖。顯示了 EphB4胞外 域的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，包括球形結(jié)構(gòu)域(G)、富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(C)和兩個(gè)纖連蛋白類型3結(jié) 構(gòu)域(Fl和F2)。圖9顯示了 B4ECv3蛋白質(zhì)的氨基酸序列(顯示了包括未切割Eph B4前導(dǎo)肽的前 體序列)。圖10顯示了 B4ECv3NT蛋白質(zhì)的氨基酸序列(顯示了包括未切割EphB4前導(dǎo)肽的 前體的序列)。圖11顯示了 B4ECv3-FC蛋白質(zhì)的氨基酸序列(顯示了包括未切割Eph B4前導(dǎo)肽 的前體的序列)。圖12顯示了 B2EC蛋白質(zhì)的氨基酸序列(顯示了包括未切割EphrinB2前導(dǎo)肽的 前體的序列)。圖13顯示了 B2EC-FC蛋白質(zhì)的氨基酸序列(顯示了包括未切割Ephrin B2前導(dǎo) 肽的前體的序列)。圖14顯示了人Ephrin B2的氨基酸序列。發(fā)明詳述I.綜述本發(fā)明部分基于這樣的發(fā)現(xiàn)，通過印hrin/印hrin受體(印hrin/印h)途徑的信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)卵巢腫瘤發(fā)生。申請(qǐng)人檢測(cè)了卵巢腫瘤組織中EphB4的表達(dá)，并開發(fā)了用于阻斷 通過eph的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗腫瘤治療劑。因此，在某些方面，本公開內(nèi)容提供了可用于治療卵 巢癌的許多化合物(試劑)。卵巢癌是由一個(gè)或兩個(gè)卵巢生殖腺內(nèi)細(xì)胞快速生長(zhǎng)和分裂產(chǎn)生的疾病，在所述生殖腺中產(chǎn)生卵，或卵子和雌性激素。卵巢含有在正常環(huán)境下生殖以維持組織健康的細(xì)胞。當(dāng) 失去了生長(zhǎng)控制并且細(xì)胞分裂太多并太快時(shí)，就會(huì)形成細(xì)胞塊或腫瘤。如果所述腫瘤限制 在少數(shù)細(xì)胞層中，例如表面細(xì)胞中，并且它并不侵入周圍組織或器官，認(rèn)為它是良性的。如 果所述腫瘤擴(kuò)散到周圍組織或器官中，認(rèn)為它是惡性的或癌性的。當(dāng)癌細(xì)胞從最初的腫瘤 中逃選出來，經(jīng)血液或淋巴管前進(jìn)，并在身體其它部分內(nèi)生長(zhǎng)時(shí)，該過程稱作轉(zhuǎn)移?？梢詫⒙殉材[瘤廣義地分為三種類別，來自表面上皮、生殖細(xì)胞和特化基質(zhì)的那 些腫瘤。來自卵巢表面的腫瘤占卵巢腫瘤的絕大多數(shù)(大約80%)并被稱作表面上皮腫 瘤。這些腫瘤組成了通常認(rèn)為的“卵巢癌”。表面上皮腫瘤進(jìn)一步細(xì)分為三種類別良性的、 邊緣的(低惡性潛在性[LMP]或不規(guī)則增殖)和侵入性癌。良性腫瘤和侵入性癌的行為是 很好理解的，但圍繞中間(邊緣)組的診斷、預(yù)后和治療卻有大量的爭(zhēng)論。這些腫瘤傾向于 在更年輕的婦女中發(fā)生并可經(jīng)常進(jìn)行保守治療。保守治療允許婦女保持她們的生育力并保 留卵巢激素的產(chǎn)生，在侵入性癌治療進(jìn)行時(shí)，如果去除兩個(gè)卵巢，則所述卵巢激素的產(chǎn)生將 會(huì)喪失。然而，保守治療依賴于正確的組織學(xué)(病理學(xué))診斷。卵巢腫瘤診斷的大多數(shù)失 誤發(fā)生在“邊緣”腫瘤范疇內(nèi)。表面上皮腫瘤基于細(xì)胞分化模式和腫瘤級(jí)別也可進(jìn)行細(xì)分。 最后，手術(shù)后殘留腫瘤的階段和量提供了用于預(yù)測(cè)行為并設(shè)計(jì)后續(xù)治療的重要信息(交叉 參考)。生殖細(xì)胞腫瘤是最不常見的卵巢腫瘤，占卵巢腫瘤的大約10-15%。它們來自卵 母細(xì)胞(卵子)。這些腫瘤，像表面上皮腫瘤也可以是良性的或惡性的。然而沒有中間組。 良性腫瘤幾乎總是成熟的囊性畸胎瘤或所謂的“皮樣囊腫”，并通過去除腫瘤的同時(shí)保留未 涉及的卵巢組織而得到成功治療。其它治療不是必需的。惡性生殖細(xì)胞腫瘤在去除后需要 加強(qiáng)的多劑化學(xué)療法。所述治療與手術(shù)治療表面上皮腫瘤后施用的化學(xué)治療完全不同。最后，占卵巢腫瘤大約5-10%的最少見類型的卵巢腫瘤是來自卵巢基質(zhì)成分的那 些腫瘤。因?yàn)榧に氐漠a(chǎn)生(雌性激素如雌二醇和孕酮，雄性激素如睪酮、脫氫表雄酮[DHEA] 和androstendione)在基質(zhì)中發(fā)生，來自卵巢該部分的腫瘤可與性類固醇激素的異常產(chǎn)生 相關(guān)。這可導(dǎo)致在生殖年齡和絕經(jīng)后婦女中異常的陰道出血和兒童的性早熟。產(chǎn)生雄性激 素的卵巢腫瘤可引起多毛癥(身體多個(gè)部位毛發(fā)生長(zhǎng)增快)，并且在極端情況下會(huì)引起男 性化，其特征在于體毛增多、聲音深沉、禿頭、肌肉塊增大和陰蒂增大。 如此處所用，術(shù)語“Ephrin”和“Eph”分別用于指配體和受體。它們可來自多種動(dòng) 物(例如，哺乳動(dòng)物/非哺乳動(dòng)物、脊椎動(dòng)物/無脊椎動(dòng)物，包括人類)中的任何一種。此處描述的工作(尤其是在實(shí)施例中描述的工作)指Ephrin B2和EphB4。然 而，本發(fā)明涵蓋了它們各自家族中的任何ephrin配體和/或Eph受體，所述家族在卵巢腫 瘤中表達(dá)。所述ephrin (配體)有兩種結(jié)構(gòu)類型，其在序列關(guān)系的基礎(chǔ)上可進(jìn)一步細(xì)分，并 且在優(yōu)先結(jié)合的基礎(chǔ)上，它們?cè)诠δ苌巷@示出兩種相應(yīng)的受體亞組。在結(jié)構(gòu)上，有兩種類型 的^hrin 通過甘油磷脂酰肌醇(GPI)連接膜錨定的那些類型和通過跨膜結(jié)構(gòu)域錨定的那 些類型。通常，配體分成Ephrin-A亞類，其為優(yōu)先結(jié)合EphA受體的GPI連接的蛋白質(zhì)，和 Ephrin-B亞類，其為一般優(yōu)先結(jié)合EphB受體的跨膜蛋白質(zhì)。Eph家族受體是受體蛋白酪氨酸激酶家族，其與Eph相關(guān)，所述Eph以其在產(chǎn)生促 紅細(xì)胞生成素的人類肝細(xì)胞癌細(xì)胞系中的表達(dá)命名。在它們胞外域序列的親緣關(guān)系和優(yōu)先 結(jié)合Ephrin-A蛋白質(zhì)或Ephrin-B蛋白質(zhì)的能力的基礎(chǔ)上，可將它們分成兩個(gè)亞組。優(yōu)先與Ephrin-A蛋白質(zhì)相互作用的受體是EphA受體，優(yōu)先與Ephrin-B蛋白質(zhì)相互作用的那些 受體是EphB受體(參閱出版的美國(guó)專利申請(qǐng)20050164965和20050249736)。Eph受體具有胞外域，其由配體結(jié)合球形結(jié)構(gòu)域、富含半胱氨酸區(qū)域后連一對(duì)纖連 蛋白類型III重復(fù)序列組成。胞質(zhì)區(qū)由含有兩個(gè)保守酪氨酸殘基的近膜區(qū)域；蛋白質(zhì)酪氨 酸激酶結(jié)構(gòu)域；無效的α-基序(SAM)和PDZ-結(jié)構(gòu)域結(jié)合基序組成。EphB4對(duì)膜結(jié)合配體 Ephrin B2 是特異性的(Sakano，S.等 1996 ；BrambiIla R.等 1995)。Ephrin B2 屬于 Eph 配體類，所述配體具有跨膜結(jié)構(gòu)域和具有5個(gè)保守酪氨酸殘基和PDZ結(jié)構(gòu)域的胞質(zhì)區(qū)。Eph 受體通過結(jié)合聚集的膜附著的^hrin而被激活(Davis S等，1994)，這說明Eph的激活需 要表達(dá)受體的細(xì)胞與表達(dá)配體的細(xì)胞之間的接觸。配體結(jié)合后，Eph受體二聚體化并將近膜酪氨酸殘基自磷酸化，以獲得完全的激活 (Kalo MS等，1999，Birms KS, 2000) 0除上述通過Eph受體的正向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)外，反向信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)可通過印hrin B發(fā)生。Ephrin的Eph銜接導(dǎo)致保守胞內(nèi)酪氨酸的快速磷酸化(Bruckner K，1997)和PDZ結(jié)合蛋白質(zhì)的些許較慢募集(Palmer A 2002)。近來，若干研究已經(jīng)顯示 Eph/ephrin的高表達(dá)可能與腫瘤生長(zhǎng)、致腫瘤性和轉(zhuǎn)移的潛力提高相關(guān)(Easty DJ, 1999 ； Kiyokawa E,1994 ；Tang XX，1999 ；Vogt T,1998 ；Liu W,2002 ；StephensonSA, 2001 ；Steube KG 1999 ；Berclaz G, 1996)。II.核酸治療劑本公開內(nèi)容涉及用于抑制或降低卵巢癌中印hrin和/或^hrin受體(Eph)的基 因表達(dá)的方法。“抑制”或“降低”指基因的表達(dá)，或核酸或編碼一種或更多種蛋白質(zhì)或蛋白 質(zhì)亞基(如Ephrin B2和/或EphB4)的等同核酸的水平降低到在本公開內(nèi)容核酸治療劑 缺失下觀察到的水平之下?！盎颉敝妇幋aRNA的核酸，例如核酸序列，包括但不限于編碼多 肽的結(jié)構(gòu)基因。如此處所用，術(shù)語“核酸治療劑”或“核酸試劑”或“核酸化合物”指任何基于核酸 的化合物，其含有核苷酸并對(duì)靶基因上具有想要的作用。核酸治療劑可以是單鏈、雙鏈或多 鏈的，并可包含修飾的或未修飾的核苷酸或非核苷酸或多種混合物，及其組合。本公開內(nèi)容 的核酸治療劑的實(shí)例包括，但不限于，反義核酸、dsRNA、siRNA和酶核酸化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容描述了一種或更多種核酸治療劑，所述核酸治療 劑單獨(dú)或組合調(diào)節(jié)編碼Ephrin B2蛋白質(zhì)(例如，Genbank登錄號(hào)NP_004084)的Ephrin B2基因或編碼EphB4蛋白質(zhì)(例如，Genbank登錄號(hào)NP_004435)的EphB4受體基因的表 達(dá)。在出版的美國(guó)專利申請(qǐng)20050164965和20050249736中列出了可根據(jù)該申請(qǐng)的方法使 用的核酸構(gòu)建體的實(shí)例，如下文列出的那些在本文中以其整體引入作為參考。表1.通過EphB4反義探針抑制EphB4基因表達(dá) A.反義核酸在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容涉及反義核酸。“反義核酸”指非酶核酸化合物，其 通過RNA-RNA、RNA-DNA或RNA-PNA (蛋白質(zhì)核酸)相互作用結(jié)合靶核酸并改變所述靶核酸 的活性(對(duì)于綜述，參閱Stein和Cheng，1993 Science 261，1004和Wool等，美國(guó)專利號(hào) 5，849，902)。通常，反義分子沿反義分子的單一相鄰序列與靶序列互補(bǔ)。然而，在某些實(shí)施 方案中，反義分子可形成環(huán)并結(jié)合形成環(huán)的底物核酸。因此，反義分子可與兩個(gè)(或更多) 不相鄰的底物序列互補(bǔ)，或者反義分子的兩個(gè)(或更多)不相鄰的序列部分可與靶序列互 補(bǔ)，或者兩者均可。對(duì)于目前反義策略的綜述，參閱Schmajuk等，1999，J.Biol· Chem.，274， 21783-21789，Delihas 等，1997，Nature,15，751-753，Stein 等，1997，Antisense N. A. Drug Dev.,7,151, Crooke,2000, Methods Enzymo1. ,313,3—45 ；Crooke,1998, Biotech. Genet. Eng. Rev.，15，121—157，Crooke,1997，Ad.Pharmacol.，40，1-49 此外，反義DNA通過DNA-RNA相互作用可用于靶定核酸，由此激活RNA酶H，其消化 雙鏈體中的靶核酸。反義寡核苷酸可包含一個(gè)或更多個(gè)RNA酶H激活區(qū)，其能夠激活RNA 酶H以切割靶核酸?？梢曰瘜W(xué)合成反義DNA或通過使用單鏈DNA表達(dá)載體或其等同物表達(dá) 反義DNA。“RNA酶H激活區(qū)”指能夠結(jié)合靶核酸以形成被細(xì)胞RNA酶H酶識(shí)別的非共價(jià)復(fù) 合體的核酸化合物的區(qū)域(通常長(zhǎng)度大于或等于4-25個(gè)核苷酸，優(yōu)選長(zhǎng)度為5-11個(gè)核苷 酸)(參閱例如Arrow等，美國(guó)專利號(hào)5，849，902 ；Arrow等，美國(guó)專利號(hào)5，989，912)。所述 RNA酶H酶結(jié)合核酸化合物-靶核酸復(fù)合體并切割所述靶核酸序列。RNA酶H激活區(qū)包含，例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、5 ‘-硫代磷酸 酯、氨基磷酸酯或甲基膦酸酯骨架化學(xué)或其組合。除上述一種或更多種骨架化學(xué)外，RNA酶 H激活區(qū)還可包含多種糖化學(xué)。例如，所述RNA酶H激活區(qū)可包含脫氧核糖、阿拉伯糖、氟代 阿拉伯糖或其組合、核苷酸糖化學(xué)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到上述為非限制性實(shí)例，并且核 酸的磷酸、糖和堿基化學(xué)的任何組合(其支持RNA酶H酶的活性)處于RNA酶H激活區(qū)的 定義和本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)。因此，本公開內(nèi)容的反義核酸包括天然類型的寡核苷酸和修飾寡核苷酸，其包括 硫代磷酸酯類型的寡脫氧核糖核苷酸、二硫代磷酸酯類型的寡脫氧核糖核苷酸、甲基膦酸 酯類型的寡脫氧核糖核苷酸、氨基磷酸酯_類型的寡脫氧核糖核苷酸、H膦酸酯類型的寡脫 氧核糖核苷酸、三酯類型的寡脫氧核糖核苷酸、α異頭物類型的寡脫氧核糖核苷酸、肽核 酸、其它人造核酸和核酸修飾的化合物。
其它修飾包括寡核苷酸分子內(nèi)部的或末端的那些修飾，并包括向分子添加核苷酸 間磷酸鍵，如膽固醇、膽固醇基或在氨基和末端核糖之間具有不同數(shù)目碳?xì)埢亩坊?物、脫氧核糖和磷酸修飾，其切割或與相反鏈或結(jié)合的酶或結(jié)合基因組的其它蛋白質(zhì)交聯(lián)。 這種修飾的寡核苷酸的實(shí)例包括具有修飾堿基和/或糖(如阿拉伯糖替代核糖)的寡核苷 酸，或3' ,5'取代的寡核苷酸，其具有在其3'和5'位置附著到除了羥基(在其3'位 置)和磷酸基團(tuán)(在其5'位置)之外的化學(xué)基團(tuán)的糖。糖修飾的其它實(shí)例包括核糖部分2'位置的修飾，其包括但不限于用含有1-6個(gè) 飽和或不飽和碳原子的一O-低級(jí)烷基、或--O-芳基、或具有2-6碳原子的烯丙基取代的 2' -0-，其中該一O-烷基、芳基或烯丙基可以是未被取代或被取代的(例如被鹵素、羥基、 三氟甲基、氰基、硝基、?；?、酰氧基、烷氧基、羧基、烷氧羰基或氨基取代)，或被氨基或鹵素 取代。本公開內(nèi)容的十分重要的寡核苷酸的非限制性實(shí)例在其3'、5'或31和5'末端具 有2' -0-烷基化的核糖核苷酸，其中至少4個(gè)或5個(gè)相鄰核苷酸被如此修飾。2' -0-烷 基化基團(tuán)的實(shí)例包括，但不限于，2' -0-甲基、2' -0-乙基、2' -0-丙基和2' -0-丁基。在某些情況下，例如可利用ABI (Applied Biosystems Inc.)制造的381ADNA合 成儀或394DNA/RNA合成儀，根據(jù)亞磷酰胺方法進(jìn)行天然類型反義核酸和修飾的反義核 酸的合成(參閱從 ABI,或 F. Eckstein, Oligonucleotidesand Analogues :A Practical Approach, IRL Press (1991)獲得的說明書)。在所述亞磷酰胺方法中，通過使用含受基 團(tuán)(如氰基乙基)保護(hù)的亞磷酰胺的試劑，在修飾的脫氧核糖核苷或修飾的核糖核苷的 3'-末端與另一修飾的脫氧核糖核苷、修飾的核糖核苷、修飾的寡脫氧核糖核苷酸或修飾 的寡核糖核苷酸的5' _末端之間進(jìn)行縮合來合成核酸相關(guān)分子。完成該合成的最后一個(gè) 循環(huán)，以產(chǎn)生具有結(jié)合到糖部分5'-末端的羥基上的保護(hù)基(例如，二甲氧基三苯甲基基 團(tuán))的產(chǎn)物。在室溫下合成的寡聚物從支持物上切割下來，并且其核苷酸和磷酸部分被去 保護(hù)。在該方式中，天然類型的寡核酸化合物以原始形式獲得。也可以通過亞磷酰胺方法， 使用來自ABI的合成儀以類似于上述天然類型的方式合成硫代磷酸酯類型的核酸。合成的 最后一個(gè)循環(huán)后的程序也與天然類型的相同?？梢猿Ｒ姺绞?，例如乙醇沉淀，或反相層析、高效液相層析(HPLC)中的離子交 換層析和凝膠過濾層析、超臨界流體層析來純化因此獲得的原始核酸(天然類型或被修 飾的)，并可以通過電泳進(jìn)一步純化。也可以使用用于反相層析的柱體，如tClS-packed SepPak Plus (long body/ENV) (Waters)。可通過HPLC來分析天然類型的和被修飾的(例 如，硫代磷酸酯類型的)核酸的純度。在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的反義核酸例如可以作為表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行遞送， 當(dāng)在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄時(shí)，所述表達(dá)質(zhì)粒產(chǎn)生與細(xì)胞mRNA的至少獨(dú)特部分互補(bǔ)的RNA，所述細(xì) 胞mRNA編碼印hrin B2或EphB4多肽。或者，所述構(gòu)建體是寡核苷酸，其離體產(chǎn)生，并且 當(dāng)引入細(xì)胞中時(shí)，通過與編碼^hrin B2或EphB4多肽的mRNA和/或基因組序列雜交引 起對(duì)表達(dá)的抑制。這種寡核苷酸探針是任選被修飾的寡核苷酸，其對(duì)內(nèi)源核酸酶(例如 外切核酸酶和/或內(nèi)切核酸酶)有抵抗力，并因此在體內(nèi)是穩(wěn)定的。用作反義寡核苷酸 的示例性核酸化合物是DNA的氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和甲基膦酸酯類似物(也參閱美 國(guó)專利號(hào) 5，176，996 ;5，264，564 ；和 5，256，775)。此外，例如，van der Krol 等，(1988) Biotechniques 6 :958_976 ；和 Stein 等，(1988)Cancer Res 48 :2659_2668 已經(jīng)綜述了構(gòu)建用于核酸療法的寡聚體的一般方法。B. dsRNA 和 RNAi 構(gòu)津體在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容涉及雙鏈RNA (dsRNA)和RNAi構(gòu)建體。如此處所 用，術(shù)語“dsRNA”指能夠RNA干擾(RNAi)的雙鏈RNA分子，包括siRNA(參閱例如，Bass, 2001，Nature,411,428-429 ；Elbashir 等，2001，Nature，411，494-498 ；和 Kreutzer 等， PCT 公布號(hào) WO 00/44895 ；Zernicka-Goetz 等，PCT 公布號(hào) WO 01/36646 ；Fire, PCT 公布 號(hào) W099/32619 ；Plaetinck 等，PCT 公布號(hào) WO 00/01846 ；Mello 和 Fire, PCT 公布號(hào) WO 01/29058 ；Deschamps-Depaillette, PCT 公布號(hào) WO 99/07409 ；和 Li 等，PCT 公布號(hào) WO 00/44914)。此外，RNAi是最初應(yīng)用于在植物和蠕蟲中觀察到的現(xiàn)象的術(shù)語，在所述植物和 蠕蟲中雙鏈RNA(dsRNA)以特異的和轉(zhuǎn)錄后的方式阻斷基因表達(dá)。RNAi提供了在體外或在 體內(nèi)抑制基因表達(dá)的有用方法。如此處所用，術(shù)語“短干擾RNA”、“siRNA”或“短干擾核酸”指當(dāng)適當(dāng)處理細(xì)胞時(shí)能 夠介導(dǎo)RNAi或基因沉默的任何核酸化合物。例如，所述siRNA可以是包含自身互補(bǔ)的有義 和反義區(qū)的雙鏈多核苷酸分子，其中所述反義區(qū)包含與靶核酸化合物(例如Ephrin B2或 EphB4)的互補(bǔ)性。所述siRNA可以是具有自身互補(bǔ)的有義和反義區(qū)的單鏈發(fā)夾多核苷酸， 其中所述反義區(qū)包含與靶核酸化合物的互補(bǔ)性。所述siRNA可以是環(huán)形單鏈多肽，其具有 兩個(gè)或更多個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和包含自身互補(bǔ)的有義和反義區(qū)的莖，其中所述反義區(qū)包含與靶核酸 化合物的互補(bǔ)性，并且其中可以在體內(nèi)或在體外處理所述環(huán)形多核苷酸，以產(chǎn)生能夠介導(dǎo) RNAi的活性siRNA。所述siRNA也可包含與靶核酸化合物具有互補(bǔ)性的單鏈多核苷酸，其 中所述單鏈多核苷酸可進(jìn)一步包含末端磷酸基，如5'-磷酸基(參閱例如Martinez等， 2002，Cell.，110,563-574)，或 5'，3' -二磷酸基。任選地，本公開內(nèi)容的SiRNA含有核苷酸序列，所述核苷酸序列在細(xì)胞生理?xiàng)l件 下與待抑制的基因(“靶”基因)的mRNA轉(zhuǎn)錄物至少一部分的核苷酸序列雜交。雙鏈RNA 僅需要與具有介導(dǎo)RNAi能力的天然RNA足夠類似。因此，本公開內(nèi)容具有能夠承受可能由 于遺傳突變、品系多態(tài)性或進(jìn)化趨異而造成序列變異的優(yōu)勢(shì)。靶序列與siRNA序列之間耐 受的核苷酸錯(cuò)配的數(shù)目不超過5個(gè)堿基對(duì)中1個(gè)、或10個(gè)堿基對(duì)中1個(gè)、或20個(gè)堿基對(duì)中1 個(gè)、或50個(gè)堿基對(duì)中1個(gè)。siRNA雙鏈體中心的錯(cuò)配是最重要的并可能基本上破壞靶RNA的 切割。相反，與靶RNA互補(bǔ)的siRNA鏈3'末端的核苷酸并不顯著促進(jìn)靶標(biāo)識(shí)別的特異性。可 通過本領(lǐng)域已知的序列比較和比對(duì)算法(參閱Gribskov和Devereux，Sequence Analysis Primer, Stockton Press，1991，及其中引用的參考文獻(xiàn))并通過如BESTFIT軟件程序中實(shí) 現(xiàn)的 Smith-Waterma 算法(例如 University of Wisconsin Genetic ComputingGroup)使 用默認(rèn)參數(shù)計(jì)算核苷酸序列之間的百分比差異來優(yōu)化序列同一性。優(yōu)選siRNA和靶基因 部分之間高于90%的序列同一性，或甚至100%的序列同一性?；蛘撸琑NA的雙鏈體區(qū)可在 功能上被定義為核苷酸序列，其能夠與靶基因轉(zhuǎn)錄物的部分進(jìn)行雜交(例如，400mM NaCl, 40mM PIPESpH 6. 4，ImM EDTA，50°C或 70°C雜交 12-16 小時(shí)，然后進(jìn)行洗滌)?？赏ㄟ^單條自身互補(bǔ)的RNA鏈、兩條互補(bǔ)RNA鏈，或DNA鏈和互補(bǔ)RNA鏈形成dsRNA 的雙鏈結(jié)構(gòu)。任選地，可在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外開始RNA雙鏈體形成。可以以允許遞送每個(gè)細(xì) 胞至少一個(gè)拷貝的量引入RNA。更高劑量(例如，每個(gè)細(xì)胞至少5、10、100、500或1000個(gè)拷 貝)的雙鏈材料可產(chǎn)生更有效的抑制，而更低劑量也可用于特定應(yīng)用。因?yàn)閷?duì)應(yīng)于RNA雙鏈體區(qū)的核苷酸序列是遺傳抑制的靶標(biāo)，所以抑制是序列特異性的。如此處所用，目的SiRNA長(zhǎng)度大約19-30個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選長(zhǎng)度為21_23個(gè)核 苷酸。所述siRNA理解為募集核酸酶復(fù)合體并通過與特異性序列配對(duì)將所述復(fù)合體引至靶 mRNA。結(jié)果，所述靶mRNA被蛋白質(zhì)復(fù)合體中的核酸酶降解。在特定實(shí)施方案中，21-23個(gè)核 苷酸的siRNA分子包含3'羥基。在某些實(shí)施方案中，可通過更長(zhǎng)雙鏈RNA，例如在切丁酶 的存在下進(jìn)行加工產(chǎn)生所述siRNA構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用果蠅體外系統(tǒng)。在該 實(shí)施方案中，dsRNA與來自果蠅胚胎的可溶性提取物混和，由此產(chǎn)生混合物。在將dsRNA被 加工成約21到約23個(gè)核苷酸的RNA分子的條件下維持所述混合物?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人 員已知的許多技術(shù)來純化所述siRNA分子。例如，凝膠電泳可用于純化siRNA?；蛘撸亲?性方法，如非變性柱層析可用于純化siRNA。此外，層析(例如，大小排阻層析)、甘油梯度 離心、使用抗體的親和純化可用于純化siRNA。可通過化學(xué)合成方法或通過重組核酸技術(shù)進(jìn)行目的dsRNA(例如，siRNA)的制備。 被處理細(xì)胞的內(nèi)源RNA聚合酶可介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄，或者克隆的RNA聚合酶可用于體外轉(zhuǎn)錄。如 此處所用，本公開內(nèi)容的dsRNA或siRNA分子不必局限于僅含有RNA的那些分子，還包含化 學(xué)修飾的核苷酸和非核苷酸。例如，所述dsRNA可包括對(duì)磷酸-糖骨架或核苷的修飾，例如 以降低對(duì)細(xì)胞核酸酶的敏感性、提高生物利用率、改善配制特性，和/或改變其它藥物代謝 動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。為了說明，可修飾天然RNA的磷酸二酯鍵以包括至少一個(gè)氮或硫雜原子。可對(duì) RNA結(jié)構(gòu)中的修飾進(jìn)行定制，以避免在對(duì)dsRNA —般性響應(yīng)的同時(shí)允許特異性的遺傳抑制。 同樣，可修飾堿基，以阻斷腺苷脫氨酶的活性?？赏ㄟ^酶促產(chǎn)生dsRNA或通過部分/完全的 有機(jī)合成產(chǎn)生dsRNA，可通過體外酶促合成或有機(jī)合成引入任何被修飾的核糖核苷酸?？?調(diào)整化學(xué)修飾RNA分子的方法用于修飾dsRNA (參閱，例如，Heidenreich等(1997) Nucleic Acids Res，25:776-780 ;Wilson 等(1994)JMol Recog 7 :89_98 ;Chen 等(1995)Nucleic Acids Res 23 :2661_2668 ;Hirschbein 等(1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7 55-61)。僅為了說明，可使用硫代硫酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、嵌合甲基膦酸酯-磷 酸二酯、肽核酸、含5-丙炔基嘧啶的寡聚體或糖修飾(例如，2’-取代的核糖核苷，a-構(gòu)型) 修飾dsRNA的骨架。在某些情況下，本公開內(nèi)容的dsRNA缺少含2'-羥基(2' -0H)的核 苷酸。在特定實(shí)施方案中，siRNA分子的至少一條鏈具有長(zhǎng)度約1到約6個(gè)核苷酸的3' 突出端，然而也可以為2到4個(gè)核苷酸長(zhǎng)。更優(yōu)選地，所述3'突出端長(zhǎng)度為1-3個(gè)核苷酸。 在某些實(shí)施方案中，一條鏈具有3'突出端，另一條鏈?zhǔn)瞧侥┒嘶蛞部梢跃哂型怀龆?。?duì)于 每條鏈，突出端的長(zhǎng)度可以相同或不同。為了進(jìn)一步提高siRNA的穩(wěn)定性，可將3'突出端 穩(wěn)定化以防止降解。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過包括嘌呤核苷酸，如腺苷或鳥苷核苷酸來穩(wěn)定 RNA。或者，通過修飾的類似物取代嘧啶核苷酸，例如2' _脫氧胸苷取代3'突出端尿苷核 苷酸可被耐受并且不影響RNAi的效率。2'羥基的缺失顯著增強(qiáng)了組織培養(yǎng)基中突出端的 核酸酶抵抗力，并可能在體內(nèi)是有益的。在另一特定實(shí)施方案中，目的dsRNA也可以是長(zhǎng)雙鏈RNA的形式。例如，所述dsRNA 為至少25、50、100、200、300或400個(gè)堿基。在一些情況下，所述dsRNA長(zhǎng)度為400-800個(gè) 堿基。任選地，所述dsRNA在細(xì)胞內(nèi)被消化，例如以在細(xì)胞中產(chǎn)生siRNA序列。然而，在體 內(nèi)長(zhǎng)的雙鏈RNA的使用并不總是現(xiàn)實(shí)的，可能是因?yàn)橛刹灰蕾囆蛄械膁sRNA響應(yīng)引起的有害作用。在這樣的實(shí)施方案中，優(yōu)選使用降低干擾素或PKR效應(yīng)的局部遞送系統(tǒng)和/或試 劑。在其它特定實(shí)施方案中，dsRNA是發(fā)夾結(jié)構(gòu)形式(命名為發(fā)夾RNA)?？赏庠春铣?發(fā)夾RNA或通過在體內(nèi)從RNA聚合酶III啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄來形成發(fā)夾RNA。例如在Paddison 等，Genes Dev, 2002，16 :948_58 ；McCaffrey 等，Nature，2002，418 :38_9 ；McManus 等，RNA， 2002，8 :842-50 ;Yu 等，ProcNatl Acad Sci U S A，2002，99 6047-52)中描述了產(chǎn)生和使 用這種發(fā)夾RNA用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基因沉默的實(shí)例。優(yōu)選地，在細(xì)胞或動(dòng)物中改造這種 發(fā)夾RNA，以保證對(duì)想要基因持續(xù)并穩(wěn)定的抑制。本領(lǐng)域已知的是可通過在細(xì)胞中加工發(fā)夾 RNA來產(chǎn)生siRNA。PCT申請(qǐng)WO 01/77350描述了用于轉(zhuǎn)基因雙向轉(zhuǎn)錄以在真核細(xì)胞中產(chǎn)生同一轉(zhuǎn)基 因的有義和反義RNA轉(zhuǎn)錄物的示例性載體。因此，在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了具 有以下獨(dú)特性質(zhì)的重組載體其包含具有以相反方向排列的兩個(gè)重疊轉(zhuǎn)錄單位并位于目的 dsRNA的轉(zhuǎn)基因側(cè)翼的病毒復(fù)制子，其中所述兩個(gè)重疊轉(zhuǎn)錄單位在宿主細(xì)胞中從同一轉(zhuǎn)基 因片段產(chǎn)生有義和反義RNA轉(zhuǎn)錄物。C.酶核酸化合物在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容涉及酶核酸化合物?！懊负怂峄衔?，，指在底物結(jié) 合區(qū)與特定靶基因具有互補(bǔ)性，并還具有有效地特異性切割靶核酸的酶促活性的核酸化合 物。理解所述酶核酸化合物能夠在分子間切割核酸，并由此滅活靶核酸化合物。這些互補(bǔ) 區(qū)允許酶核酸化合物與靶核酸之間充分雜交，并因此允許切割。優(yōu)選100%互補(bǔ)性(同一 性)，但低至50-75 %的互補(bǔ)性也可用于該公開內(nèi)容(參閱例如Werner和Uhlenbeck，1995， Nucleic Acids Research,23,2092-2096 ；Hammann 等，1999, Antisenseand Nucleic Acid Drug Dev.，9，25-31)。可在堿基、糖和/或磷酸基處修飾酶核酸。如此處所述，術(shù)語“酶核 酸”與短語如核酶、催化性RNA、酶RNA、催化性DNA、aptaZyme或適配體結(jié)合核酶、調(diào)節(jié)性核 酶、催化性寡核苷酸、nuCle0Zyme、DNA酶、RNA酶、內(nèi)切核糖核酸酶、內(nèi)切核酸酶、“小”核酶、 leadzym^oligozyme或DNA酶可互換使用。所有這些術(shù)語均描述了具有酶促活性的核酸化 合物。本申請(qǐng)中描述的特異性酶核酸化合物不限于在本公開內(nèi)容中，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員 將認(rèn)識(shí)到在本公開內(nèi)容的酶核酸化合物中重要的是它具有與一個(gè)或更多個(gè)靶核酸區(qū)互補(bǔ) 的特異性底物結(jié)合位點(diǎn)，并且它在賦予核酸分子核酸切割和/或連接活性的底物結(jié)合位點(diǎn) 內(nèi)或周圍具有核苷酸序列(Cech等，美國(guó)專利號(hào)4，987，071 ；Cech等，1988，260 JAMA3030)。目前已知若干種天然發(fā)生的酶核酸。每種均可在生理?xiàng)l件下反式催化核酸磷酸二 酯鍵的水解(并因此切割其它核酸化合物)。通常，酶核酸首先通過結(jié)合到靶核酸上起作 用。這種結(jié)合通過酶核酸的靶結(jié)合部分發(fā)生，所述酶核酸保持在切割靶核酸的分子的酶促 部分附近。因此，所述酶核酸首先識(shí)別靶核酸，然后通過互補(bǔ)堿基配對(duì)結(jié)合靶核酸，并且一 旦結(jié)合到正確的位點(diǎn)上，其酶促切割所述靶核酸。這種靶核酸的策略切割將破壞其指導(dǎo)編 碼蛋白質(zhì)進(jìn)行合成的能力。酶核酸已經(jīng)結(jié)合并切割其核酸靶標(biāo)后，所述酶核酸從該核酸釋 放，以尋找另一靶標(biāo)并可以重復(fù)結(jié)合并切割新靶標(biāo)。在特定實(shí)施方案種，目的酶核酸是設(shè)計(jì)來催化切割mRNA轉(zhuǎn)錄物以防止mRNA翻譯 的核酶(參閱，例如PCT國(guó)際公開W090/11364，1990年10月4日公開；Sarver等，1990， Science 247 =1222-1225 ；和美國(guó)專利號(hào)5，093，246)。盡管在位點(diǎn)特異性識(shí)別序列處切割mRNA的核酶可用于破壞特定mRNA，但是優(yōu)選使用錘頭狀核酶。錘頭狀核酶在與靶mRNA 形成互補(bǔ)堿基對(duì)的側(cè)翼區(qū)域指出的位置處切割mRNA。唯一需要的是所述靶mRNA具有以 下兩堿基序列5' -UG-3 ‘。錘頭狀核酶的構(gòu)建和產(chǎn)生為本領(lǐng)域所熟知并在HaselofT 和Gerlach，1988，Nature, 334 585-591中有更詳盡的描述。本公開內(nèi)容的核酶也包括 RNA內(nèi)切核糖核酸酶(下文稱“Cech-類型核酶”)，如在嗜熱四膜蟲中天然存在并已經(jīng) 被廣泛描述的一種酶(稱作IVS或L-19IVSRNA)(參閱，例如，Zaug，等，1984，Science, 224 574-578 ；Zaug 和 Cech，1986，Science,231 :470_475 ；Zaug,等，1986，Nature,324 429-433 ；UniversityPatents Inc.的國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)?W088/04300 ；Been 和 Cech, 1986， Cell,47 207-216)。在另一特定實(shí)施方案中，主題酶核酸是DNA酶。DNA酶整合了反義和核酶技術(shù)的 一些機(jī)械學(xué)特征。設(shè)計(jì)DNA酶，使得它們識(shí)別特定靶核酸序列，十分像反義寡核苷酸，然而 更像核酶，它們催化性并特異性切割靶核酸。簡(jiǎn)言之，為了設(shè)計(jì)特異性識(shí)別并切割靶核酸的 理想DNA酶，本領(lǐng)域技術(shù)人員必須首先鑒定獨(dú)特的靶序列。優(yōu)選地，獨(dú)特地或大體上序列是 富含G/C的大約18到22個(gè)核苷酸。高G/C含量幫助保證DNA酶與靶序列之間更強(qiáng)的相互 作用。當(dāng)合成所述DNA酶時(shí)，將靶定酶到信息上的特異性反義識(shí)別序列被分開，使得其包含 DNA酶的兩個(gè)臂，并且所述DNA酶環(huán)置于所述兩個(gè)特異性臂之間。制備和施用DNA酶的方法 可見于例如美國(guó)專利號(hào)6，110,462中。在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的核酸治療劑長(zhǎng)度可以在12到200個(gè)核苷酸之 間。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的示例性酶核酸化合物長(zhǎng)度在15到50個(gè)核苷酸之間， 包括例如長(zhǎng)度在25到40個(gè)核苷酸之間(例如參閱Jarvis等，1996，J. Biol. Chem.，271， 29107-29112)。在另一實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的示例性反義分子長(zhǎng)度在15到75個(gè)核 苷酸之間，包括例如長(zhǎng)度在20到35個(gè)核苷酸之間(參閱例如Woolf等，1992，PNAS.，89， 7305-7309 ；Milner 等，1997，Nature Biotechnology, 15，537-541)。在另一實(shí)施方案中，本 公開內(nèi)容的示例性siRNA長(zhǎng)度在20到27個(gè)核苷酸之間，包括例如長(zhǎng)度在21到23個(gè)核苷 酸之間。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到所有需要的是主題核酸治療劑的長(zhǎng)度和構(gòu)型足夠并適合 催化此處涵蓋的反應(yīng)。本公開內(nèi)容的核酸治療劑的長(zhǎng)度不限于所述的一般極限。III.核酸靶位點(diǎn)可以如Draper 等 30W0 93/23569 ；Sullivan 等，WO 93/23057 ；Thompson 等，WO 94/02595 ；Draper 等，WO 95/04818 ；McSwiggen 等，美國(guó)專利號(hào) 5，525，468 中描述來確定本 公開內(nèi)容的有用的核酸化合物(例如，反義核酸、dsRNA和酶核酸化合物)的靶標(biāo)。其它實(shí) 例包括疾病相關(guān)基因表達(dá)滅活的以下PCT申請(qǐng)WO 95/23225,WO 95/13380,WO 94/02595。 此處并非重復(fù)那些文件中提供的指導(dǎo)，下文提供了這些方法的特定實(shí)例，不限于本領(lǐng)域中 的那些。如那些申請(qǐng)中描述來設(shè)計(jì)這些靶標(biāo)的酶核酸化合物、siRNA和反義，并同樣如所述 來合成以在體外和體內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。例如，使用計(jì)算機(jī)折疊算法來篩選人Ephrin 82和/或 EphB4RNA的序列的最佳核酸靶標(biāo)位點(diǎn)。鑒定了潛在的核酸結(jié)合/切割位點(diǎn)。例如，對(duì)于本 公開內(nèi)容的酶核酸化合物，通過計(jì)算機(jī)折疊(Jaeger等，1989Proc. Natl Acad. Sci. USA,86, 7706)分別對(duì)所述核酸化合物進(jìn)行了分析，以評(píng)估所述序列是否折疊成正確的二級(jí)結(jié)構(gòu)。如 在結(jié)合臂與催化中心之間具有不利分子內(nèi)相互作用的那些核酸化合物可以不予考慮。
鑒定了目的核酸(例如，反義、RNAi和/或酶核酸化合物)結(jié)合/切割位點(diǎn)并將其 設(shè)計(jì)以退火至核酸靶標(biāo)(例如Ephrin B2和/或EphB4)中的多個(gè)位點(diǎn)。本公開內(nèi)容的酶 核酸化合物的結(jié)合臂與上述靶位點(diǎn)序列互補(bǔ)。設(shè)計(jì)反義和RNAi序列，以與所述核酸靶標(biāo)具 有部分或完全互補(bǔ)性?？苫瘜W(xué)合成所述核酸化合物。所用的合成方法遵循如下文及Usman 等，1987J Am. Chem. Soc. , 109, 7845 ；Scaringe 等，1990 Nucleic Acids Res.，18，5433 ； 和 Wincott 等，1995 Nucleic Acids Res. 23，2677-2684 ;Caruthers 等，1992，Methods in Enzymology 211,3-19中所述的用于正常DNA/RNA合成的程序。此外，預(yù)計(jì)具有CpG基序的核酸治療劑引起非特異性免疫應(yīng)答的可能性增加。通 常，CpG基序包括與5’方向的一個(gè)或更多個(gè)嘌呤及3’方向的一個(gè)或更多個(gè)嘧啶相鄰的 CG(胞嘧啶-鳥苷)。在本領(lǐng)域中可獲得已知CpG基序的列表。將選擇優(yōu)選的核酸療法，以 對(duì)靶基因具有選擇性效應(yīng)(可能影響其它緊密相關(guān)的基因)，而不觸發(fā)全身免疫應(yīng)答。通過 避免具有CpG基序的核酸治療劑，降低特定核酸將觸發(fā)免疫應(yīng)答的可能性是可能的。IV.核酸治療劑的合成使用自動(dòng)化方法合成長(zhǎng)度超過100個(gè)核苷酸的核酸是困難的，并且這些分子的治 療成本令人望而卻步。在本公開內(nèi)容中，小核酸基序(小是指長(zhǎng)度少于約100個(gè)核苷酸，優(yōu) 選長(zhǎng)度少于約80個(gè)核苷酸，并更優(yōu)選長(zhǎng)度少于約50個(gè)核苷酸的核酸基序(例如，反義寡核 苷酸、酶核酸和RNAi構(gòu)建體))優(yōu)選用于外源遞送。這些分子的簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)增強(qiáng)了核酸侵入 RNA結(jié)構(gòu)靶區(qū)域的能力。化學(xué)合成本公開內(nèi)容的示例性分子，并且可類似地合成其它分子。為了說明，如 Caruthers 等，1992，Methods in Enzymology 211,3-19, Thompson 等，國(guó)際 PCT 公布號(hào) WO 99/54459，Wincott 等，1995，NucleicAcids Res.23，2677-2684，Wincott 等，1997，Methods Mol. Bio.，74，59，Brennan 等，1998，Biotechnol Bioeng.，61，33-45，和 Brennan，美國(guó)專利 號(hào)6，001，311中所述，使用本領(lǐng)域已知的方案合成寡核苷酸(例如，DNA)。寡核苷酸的合 成利用常見的核酸保護(hù)和偶聯(lián)基團(tuán)，如5'末端的二甲氧基三苯甲基，和3'末端的亞磷酰 胺。在非限制性實(shí)例中，在394 AppliedBiosystems, Inc.合成儀上，以2' 甲基化核 苷酸的2. 5分鐘偶聯(lián)步驟和2' _脫氧核苷酸的45秒偶聯(lián)步驟進(jìn)行小規(guī)模合成?；蛘?，可 在96孔板合成儀(如由Protogene (Palo Alto, CA)生產(chǎn)的儀器)上，對(duì)循環(huán)做最小修改后 進(jìn)行合成。任選地，可分別合成本公開內(nèi)容的核酸化合物，并且例如通過連接在合成 后連接在一起(Moore 等，1992，Science 256，9923 ；Draper 等，國(guó)際 PCT 公布號(hào) WO 93/23569 ;Shabarova 等，1991， Nucleic Acids Research 19，4247 ;Bellon 等，1997， Nucleosides&Nucleotides,16,951 ；Bellon 等，1997, Bioconj ugate Chem. 8,204)。優(yōu)選地，廣泛修飾本公開內(nèi)容的核酸化合物，以通過用核酸酶抗性基團(tuán)，例如 2'-氨基、2' -C-烯丙基、2'-氟、2' -0-甲基、2' -H進(jìn)行修飾來提高穩(wěn)定性(對(duì)于 綜述，參閱 Usman 和 Cedergren，1992，TIBS 17，34 ;Usman 等，1994，Nucleic Acids Symp. Ser.31，163)。使用普通方法通過凝膠電泳來純化核酶或通過高壓液相層析(HPLC;見 Wincott等，上文，此處其整體引入作為參考)來純化核酶，并在水中將其重懸浮。V.優(yōu)化核酸化合物的活性具有修飾(例如，堿基、糖和/或磷酸)的核酸化合物可防止被血清核糖核酸酶降解，并由此提高它們的效能。本領(lǐng)域中有若干實(shí)例描述糖、堿基和磷酸修飾，其可被引 入核酸化合物，顯著提高它們的核酸酶穩(wěn)定性和功效。例如，通過用核酸酶抗性基團(tuán)，例如 2'-氨基、2' -C-烯丙基、2'-氟、2' -0-甲基、2' -H、核苷酸堿基修飾來修飾寡核苷 酸，以提高穩(wěn)定性和/或增強(qiáng)生物活性(對(duì)于綜述，參閱Usman和Cedergren，1992，TIBS 17, 34 ；Usman 等，1994, Nucleic Acids Symp. Ser. 31,163 ；Burgin 等，1996, Biochemistry, 35，14090)。已經(jīng)在本領(lǐng)域中廣泛描述了核酸化合物的糖修飾(參閱Eckstein等，PCT公 布號(hào) WO 92/07065 ；Perrault 等 Nature, 1990，344，565-568 ；Pieken 等 Science, 1991，253， 314-317 ；Usman 和 Cedergren, Trends in Biochem. Sci. ,1992,17,334-339 ；Usman 等 PCT 公布號(hào) W093/15187 ；Sproat，美國(guó)專利號(hào) 5，334，711 和 Beigelman 等，1995，J. Biol. Chem.， 270,25702 ；Beigelman 等，PCT 公布號(hào) WO 97/26270 ；Beigelman 等，美國(guó)專利號(hào) 5，716，824 ； Usman 等，美國(guó)專利號(hào) 5，627，053 ；Woolf 等，PCT 公布號(hào) WO 98/13526 ；Thompson 等，在 1998 年 4 月 20 日提交的 U. S. S No. 60/082，404 ；Karpeisky 等，1998，Tetrahedron Lett.，39， 1131 ；Earnshaw和 Gait, 1998, Biopolymers (Nucleic acid Sciences), 48, 39—55 ；Verma和 Eckstein, 1998，Annu. Rev. Biochem.，67，99-134 ；和 Burlina 等，1997，Bioorg. Med. Chem.， 5，1999-2010)。類似的修飾可用于修飾本公開內(nèi)容的核酸化合物。雖然用硫代磷酸酯、硫代磷酸酯和/或5'-甲基膦酸酯鍵進(jìn)行寡核苷酸核苷酸間 鍵的化學(xué)修飾提高了穩(wěn)定性，但過度修飾可產(chǎn)生毒性。因此，當(dāng)設(shè)計(jì)核酸化合物時(shí)，應(yīng)評(píng)估 這些核苷酸間鍵的量并適當(dāng)將其降到最少。這些鍵濃度的降低應(yīng)降低毒性，引起這些分子 的功效提高并且特異性更高。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的核酸化合物包括一個(gè)或更多個(gè)G-夾環(huán)核苷 酸。G-夾環(huán)核苷酸是被修飾的胞嘧啶類似物，其中所述修飾賦予雙鏈體內(nèi)互補(bǔ)性鳥嘌呤 Watson-Crick 和 Hoogsteen 面形成氫鍵的能力，參閱例如，Lin 和 Matteucci，1998，J. Am. Chem. Soc.，120,8531-8532。寡核苷酸內(nèi)單個(gè)G-夾環(huán)類似物取代可導(dǎo)致當(dāng)與互補(bǔ)性寡核苷 酸雜交時(shí)實(shí)質(zhì)提高的螺旋熱穩(wěn)定性和錯(cuò)配辨別。本公開內(nèi)容的核酸化合物中這些核苷酸的 包含導(dǎo)致與核酸靶標(biāo)的親和力和特異性增強(qiáng)。在另一實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的核酸化合 物包括一個(gè)或更多個(gè)LNA(鎖定核酸)核苷酸，如2' ,4' -C亞甲基二環(huán)核苷酸(參閱例如 Wengel 等，PCT 公布號(hào) WO 00/66604 和 W099/14226)。在另一實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容描述了靶向Ephrin B2和/或EphB4的核酸化合 物的綴合物和/或復(fù)合物。這種綴合物和/或復(fù)合物可用于促進(jìn)核酸化合物遞送至生物系 統(tǒng)，如細(xì)胞中。本公開內(nèi)容提供的綴合物和復(fù)合物可通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移治療化合物、改變藥物 代謝動(dòng)力學(xué)和/或調(diào)整本公開內(nèi)容的核酸化合物的定位來賦予治療活性。本公開內(nèi)容包括設(shè)計(jì)并合成用于跨細(xì)胞膜遞送分子的新綴合物和復(fù)合物，所述分 子包括但不限于小分子、脂類、磷脂、核苷、核苷酸、核酸、抗體、毒素、帶負(fù)電荷的聚合物和 其它聚合物，例如蛋白質(zhì)、肽、激素、碳水化合物、聚乙二醇或多胺。通常，設(shè)計(jì)所述轉(zhuǎn)運(yùn)子以 單獨(dú)使用或作為多組分系統(tǒng)的一部分使用，其具有或沒有可降解接頭。預(yù)計(jì)這些化合物能 在血清存在或缺失的情況下提高本公開內(nèi)容核酸化合物的遞送和/或定位至來自不同組 織的許多細(xì)胞類型中(參閱Sullenger和Cech，美國(guó)專利號(hào)5，854，038)。此處所述的分子 的綴合物可經(jīng)接頭附著到生物活性分子上，所述接頭是生物可降解的，如生物可降解的核 酸接頭分子。
如此處所用，術(shù)語“生物可降解核酸接頭分子”指設(shè)計(jì)用作生物可降解接頭以連 接一個(gè)分子與另一分子(例如，生物活性分子)的核酸化合物?？赏ㄟ^使用核糖核苷酸、 脫氧核糖核苷酸和化學(xué)修飾的核苷酸，例如2' -0-甲基、2'-氟、2'-氨基、2' -0-氨 基、2' -C-烯丙基、2' -0-烯丙基和其它2' _修飾的或堿基修飾的核苷酸的多種組合來 調(diào)節(jié)生物可降解核酸接頭分子的穩(wěn)定性。所述生物可降解核酸接頭分子可以是二聚體、三 聚體、四聚體或更長(zhǎng)的核酸化合物，例如長(zhǎng)度約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19或20個(gè)核苷酸的寡核苷酸，或可以包含具有基于磷連接，例如氨基磷酸酯或磷酸 二酯鍵的單個(gè)核苷酸。所述生物可降解核酸接頭分子也可包含核酸骨架、核酸糖，或核酸堿 基修飾。如此處所用，術(shù)語“生物可降解的，，指生物系統(tǒng)中的降解，例如酶促降解或化學(xué)降 解。外源遞送的治療性核酸化合物，如此處所述的分子在細(xì)胞內(nèi)最理想為穩(wěn)定的，直 至靶RNA的翻譯已被抑制到足以降低不想要的蛋白質(zhì)的水平。該時(shí)間期間根據(jù)疾病狀態(tài)為 數(shù)小時(shí)到數(shù)天之間。這些核酸化合物應(yīng)該對(duì)核酸酶具有抗性，以作為有效的細(xì)胞內(nèi)治療劑 起作用。在本公開內(nèi)容和本領(lǐng)域中所述的核酸化合物的化學(xué)合成的改進(jìn)已經(jīng)增強(qiáng)了通過引 入核苷酸修飾來修飾核酸化合物以如上所述提高它們的核酸酶穩(wěn)定性的能力。在另一方面，所述核酸化合物包含5'和/或3'帽結(jié)構(gòu)?！懊苯Y(jié)構(gòu)”指已經(jīng) 整合到寡核苷酸任一末端的化學(xué)修飾(參閱例如Wincott等，W097/26270)。這些末 端修飾保護(hù)核酸化合物免受外切核酸酶的降解，并可幫助在細(xì)胞內(nèi)的遞送和/或定 位。所述帽子可存在于5'末端(5'帽子)或3'末端(3'帽子)或存在于兩個(gè)末 端。在非限制性實(shí)例中，所述5'帽子包括反向的無堿基殘基(部分)、4' ,5'-亞 甲基核苷酸；1- ( β -D-erythrofuranosyl)核苷酸、4 ‘-硫代核苷酸、碳環(huán)核苷酸；1， 5-脫水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α -核苷酸；修飾的堿基核苷酸；二硫代磷酸酯連接； threo-pentofuranosyl核苷酸；無環(huán)3 ‘，4' -seco核苷酸；無環(huán)3，4-二羥基丁基核 苷酸；無環(huán)3，5_ 二羥基戊基核苷酸、3' -3'-反向核苷酸部分；3' -3'-反向無堿 基部分；‘-2'-反向核苷酸部分；3' -2'-反向無堿基部分；1，4_磷酸丁二醇； 3'-氨基磷酸酯；己基磷酸酯；氨基己基磷酸酯；3'-磷酸酯；3'-硫代磷酸酯；二硫 代磷酸酯；或橋或非橋甲基膦酸酯部分(對(duì)于更多細(xì)節(jié)參閱Wincott等，PCT
發(fā)明者A·K·索德, P·吉爾, V·卡拉斯諾佩洛夫 申請(qǐng)人:瓦斯基因治療公司;德克薩斯州大學(xué)系統(tǒng)董事會(huì)