專利名稱：：微生物種群分析的制作方法微生物種群分析本發(fā)明涉及分析微生物種群，像不同分類學(xué)群組的細菌種群的方法，所述細菌種群在懷疑含有所述微生物、引物、引物組和適合用于本方法的成對引物組的環(huán)境中，和將該方法用于測定外部因子像藥物、營養(yǎng)素和殺蟲劑對這樣的種群的作用。在最近的文章(Science(2005)Volume308(5728)1635-8)中，Eckburg和同事描述了巨大多樣性的人類腸微生物菌群。他們報道至少395細菌種系型(phylotype)的存在，其中至少244個是新的，80%代表來自未被培養(yǎng)的物種的序列。所指微生物大多是硬壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌(Bacteroidetes)門的成員，大多數(shù)硬壁菌門序列是梭菌(Clostridia)綱的成員。其它檢測到的門是變形菌門(Proteobacteria)>lifΠ(Actinobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)禾口撫微菌門(Verrucomicrobia)。通常接受的是更好地理解腸微生物菌群的組成將對于理解微生物菌群在健康和疾病中(例如在Crohn疾病、免疫、代謝疾病、過敏、益生菌活動中的失調(diào)、防止細胞損傷、調(diào)節(jié)宿主脂肪儲存、刺激腸血管發(fā)生等等中)的基本作用是決定性重要的，但是這些生態(tài)系統(tǒng)的類型仍然是未完全鑒定的并且沒有很好地定義其多樣性。一個主要的缺點是為了獲得如Eckburg描述的這樣的數(shù)據(jù)，不得不進行非常費力和耗時的實驗。雖然提供的信息對科學(xué)界是無價的，但是在常規(guī)和日?；A(chǔ)上，例如在醫(yī)學(xué)實踐中進行這樣的分析是太費力和耗時的。另外沒有充分地研究與時間、飲食和健康狀況相關(guān)的微生物組成的變化。缺少可靠、可重復(fù)和耗時較少或較不費力的分析這些微生物種群的方法限制和阻礙了對這樣的細菌種群的理解。另一個人們相信微生物群落的組成是很重要的環(huán)境的例子是水。如Ibekwe描述(在J.Appl.Microbiol.102(4)=921-936(2007)中)有50%植物覆蓋的濕地可以促進那些幫助在表面水中的化學(xué)污染物降解的各種微生物群落的生長，并且改善水質(zhì)。更好地理解這樣的系統(tǒng)和這些系統(tǒng)如何被外部因素影響將幫助改善水質(zhì)。然而另一個例子是在食物材料中的細菌生態(tài)系統(tǒng)。例如，El-Baradei(在ApplEnvironMicrobiol.2007Feb；73(4)1248-55中)描述在傳統(tǒng)埃及Domiati奶酪中的細菌生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性。通過PCR-實時溫度凝膠電泳(TTGE)和PCR-變性梯度凝膠電泳(DGGE)研究了奶酪中的生物多樣性。鑒定出優(yōu)勢的乳酸細菌，但還發(fā)現(xiàn)了非乳酸細菌。El-Baradei提出這些細菌在成熟過程中具有重要作用。換句話說，更好地理解涉及奶酪成熟的微生物種群對于進一步的產(chǎn)品改進有用。但是，由于缺少可靠、可重復(fù)和耗時較少的可以適合分析未知組成的這樣的復(fù)雜微生物群落的方法現(xiàn)在限制了對微生物種群的理解及其使用和研究。在本領(lǐng)域中描述了幾種適合鑒定已知細菌的方法。WO00/52203描述了鑒定細菌的方法，包括使用作為一個引物的簡并引物組擴增存在于樣品中的一部分23SrDNA,引物組含有由基本上具有序列5‘GCGATTTCYGAAYGGGGRAACCC的DNA組成的一個或更多DNA分子，另一個弓丨物由具有序列5'TTCGCCTTTCCCTCACGGTACT的DNA組成；和通過與一個或更多個設(shè)計用于鑒定一個或更多細菌的寡核苷酸探針雜交而測試獲得的擴增子。該方法限于鑒定已知的細菌并且需要使用特異性針對這樣的細菌的探針。WO02/090582涉及基于分枝桿菌的23S/5S空間區(qū)檢測分枝桿菌的方法。其描述為了分析所述分枝桿菌可以選擇對該屬特異的第一引物，而可以選擇種特異性的第二引物。WO01/23606涉及可以鑒定細菌或細菌群組的核酸分子。含有23S/5SrDNA的區(qū)域和屬于細菌基因組的區(qū)域用作檢測細菌的靶向序列。根據(jù)發(fā)明人，仔細考察了16S/23SrDNA關(guān)于用于鑒定細菌的區(qū)域。通過進行一致性PCR(consensusPCR)，然后通過擴增DNA鑒定細菌群組，所述DNA是通過使用隨后鑒定不同分類水平的細菌的更多特異性引物獲得的。通過提供在同樣的分類水平(例如屬，因此在一個PCR中擴增兩個屬)中不同群組的引物可以進行這樣的一致性PCR。缺點是不得不進行隨后的反應(yīng)，引入關(guān)于分析的精確度或準確度的不確定性，而不能提供關(guān)于例如特定微生物在這樣種群中的相對量的數(shù)據(jù)。換句話說，當(dāng)人們已經(jīng)知道想要什么時上述方法可以是有用的，但是當(dāng)要研究的種群由于存在許多和/或未知細菌而高度復(fù)雜時，該方法的用途較小。另外，不是單個微生物，而是在種群中的復(fù)雜相互作用和微生物的相對量的概念獲得流行。但是，所述的方法只在這樣的理解中具有有限的用途。因此，明顯的需要用于分析微生物種群(組成)的不費力的可靠的方法。這樣的方法應(yīng)該適用于常規(guī)基礎(chǔ)并且提供至少關(guān)于種群的全部組成的信肩、ο本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)可以通過如隨附權(quán)利要求所述的主題內(nèi)容解決至少一個上述問題。更特別的是發(fā)現(xiàn)了用于分析微生物種群而解決至少一個上述問題的方法，所述微生物例如在懷疑含有所述微生物的環(huán)境中的不同分類群組的細菌種群，該方法包括下列步驟a.提供獲自所述環(huán)境的DNA并至少向其提供i.第一引物組P1，其含有至少一個引物pl，pl針對于對選自門、綱、目或科的第一分類群組特異的至少一個保守位置Ll；ii.第二引物組P2，其含有至少一個引物p2，p2針對于對選自門、綱、目或科的第二分類群組特異的至少一個保守位置L2；iii.第三引物組P3，其含有至少一個引物p3，p3針對于至少對屬于第一分類群組的微生物特異的至少一個保守位置L3；iv.第四引物組P4，其含有至少一個引物p4，p4針對于至少對屬于第二分類群組的微生物特異的至少一個保守位置L4；并且其中引物組Pl和P3適于擴增所述保守區(qū)Ll和L3之間的區(qū)域并且其中引物組P2和P4適于擴增所述保守區(qū)L2和L4之間的區(qū)域；b.使用所述引物組進行擴增反應(yīng)，從而產(chǎn)生在大小、數(shù)量、核苷酸序列和/或標(biāo)記方面具有可檢測差異的片段；并且c.檢測所述差異。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)用該方法現(xiàn)在可能以可靠、不費力的方式檢測微生物種群，例如細菌種群的全部組成。如對本領(lǐng)域技術(shù)人員明確的，在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的引物和引物組，與本領(lǐng)域中已有的方法相反，不是針對于鑒定種群中的個體微生物(細菌)，而是分析全部種群，都是關(guān)于特異的分類群組和關(guān)于其他差異，如獲得的片段的長度、大小和序列的差異。如技術(shù)人員所理解的術(shù)語“至少一個引物”不是指引物存在的拷貝數(shù)，而是使用的引物的類型(如通過其序列定義的)。這樣的分析現(xiàn)在第一次使得以簡單和直接的方式獲得微生物種群例如細菌種群的“指紋圖譜”成為可能。這樣的指紋圖譜含有至少關(guān)于存在于微生物種群中的不同分類群組的信息，和例如在上述方法中提及的這樣分類群組的全部組成(如通過獲得片段的長度、序列等等差異而表示)的信息。如上面明確的，可以使用根據(jù)本發(fā)明的同時存在于一個樣品中的引物組有利地進行實驗。換句話說，有利地，對于根據(jù)本發(fā)明的含有DNA的樣品，至少引物組PI、P2、P3和P4(或至少根據(jù)本發(fā)明的引物pl、p2、p3和p4)存在于(或加入)相同的樣品中。因此，并且有利的，在對于所有引物等同的條件下進行PCR。關(guān)于貫穿本公開的不同術(shù)語的使用適用下列定義-“細菌種群”是占據(jù)特定環(huán)境的細菌的群組。熟知的例子是胃腸種群、生物被膜、細菌墊、生長于土壤或在植物的根際(rizosphere)中和水環(huán)境中如水中的細菌的群組。-“微生物種群”是，如在本發(fā)明上下文中使用的，占據(jù)特定環(huán)境的微生物群組。-“分類群組”具有所有其下屬分類單元和它們的個體的分類單元。技術(shù)人員已知的分類群組的例子是(從總的至更特異的)域、界、門、綱、目和科。屬和種也是分類單元。-“環(huán)境”是指其中微生物種群所處的復(fù)雜的周圍環(huán)境、條件或影響。非限制性例子是胃腸道、牙窩、土壤、根際。-“引物”是作為DNA復(fù)制的起始點的核酸鏈(或相關(guān)分子)。特別的引物可以由3-50個核苷酸，通常和優(yōu)選地由10-30個核苷酸組成。-“引物組”是含有至少一個引物的組。在本發(fā)明的上下文中，所述引物可以針對至少一個保守位置。-“保守位置”是含有多重核苷酸和在引物針對的分類群組中共享高同源性的序列。總的來說這意味著所述序列基本上與已知屬于所述分類群組的微生物具有至少60%同一性，優(yōu)選70%，更優(yōu)選80%，甚至更優(yōu)選90%的同一性，并且其中基本上相同的意思是不多于8，更優(yōu)選不多于7、6、5、4、3、2或1個核苷酸是不同的。在任何情況下，當(dāng)其適用于結(jié)合引物和可以將微生物從一個分類群組與另一個分類群組區(qū)分時(即當(dāng)其不結(jié)合或基本上不結(jié)合來自另一個分類群組的已知微生物的大部分序列并且用根據(jù)本發(fā)明的方法分析時，該引物對于至少一個分類群組是特異的)，該位置在本發(fā)明的上下文中被認為是保守的。例如一個引物可以檢測門A和B，但不是門C。在這樣的情況下，該引物對門A和B是特異的，并且因此針對門A和B中的保守位置，而所述保守位置在門C中缺失。-術(shù)語“門”、“綱”、“目”或“科”的術(shù)語和結(jié)果對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。-在上面方法中使用的“針對”涉及與引物預(yù)期用于的特定分類群組的微生物已知基因組的至少60%，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，最優(yōu)選至少90%雜交的引物或引物組(還見上面的“保守位置”下的內(nèi)容)。-如上述方法中所述的“區(qū)”是指兩個保守位置之間的核苷酸序列。通常所述序列可以含有10-1500個核苷酸。-“擴增反應(yīng)”是指適用于擴增本文所述的兩個保守位置之間區(qū)域的DNA序列的任何過程。適合的例子包括PCR。-“大小差異”或“長度差異”是指不同核苷酸長度的片段，例如由于在不同微生物如細菌(見例如Gurtler等人，Microbiology.1995；1411255-65)之間擴增長度多態(tài)性。-“量的差異”是指在微生物種群中發(fā)現(xiàn)的片段拷貝數(shù)的差異，所述差異是特定種群中微生物相對量的指征。異。-“檢測所述差異”可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的方法。_如在本發(fā)明的上下文中使用的術(shù)語“微生物”包括細菌、古菌、原生生物、真菌還有病毒。在本發(fā)明的上下文中，當(dāng)使用術(shù)語細菌的、細菌種群或細菌時，還可以包括上述微生物的種群或物種，除非另外聲明。-如本文給定的引物和寡核苷酸的序列用標(biāo)準的IUB/IUPAC核酸代碼表示。-貫穿本公開使用的術(shù)語“指紋圖譜”是指如應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的關(guān)于分析微生物的一套實驗結(jié)果。通常這樣的“指紋圖譜”含有關(guān)于微生物種群如門、微生物的相對量的信息并且可以例如在圖1和圖2中顯示的顯像密度計曲線(densiometriccurves)中圖解表現(xiàn)。因此這樣的指紋圖譜描述微生物種群并且本身不用于描述這樣種群中的個體細菌，雖然明確的是例如通過比較含有特定個體細菌物種的參考樣品可以獲得這樣的信肩、ο在優(yōu)選的具體實施方式中，第一和/或第二分類群組是門。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)谝缓?或第二分類群組是門時，可以有利地應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的方法。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)引物組Pl或P2分別針對保守位置Ll或L2時，并且對門是特異的，現(xiàn)在不僅可能檢測具有大小、數(shù)量和/或核苷酸序列方面的可檢測差異的片段，還通過應(yīng)用合適的檢測方法(見下面)區(qū)分不同的門。通過進行這樣的方法，極大地增強了分析微生物種群，例如細菌種群的敏感度。例如，現(xiàn)在不僅可以就大小、數(shù)量的差異區(qū)分擴增片段，還可以將特定的片段歸于特定的門。換句話說，當(dāng)不使用對不同門特異的所述引物時，只有在例如獲得片段的大小差異的水平上的分析是可能的，現(xiàn)在，在同樣的方法中，人們還可以在同樣的樣品中區(qū)分不同的門。這提供了關(guān)于存在于環(huán)境中的微生物種群如細菌種群(組成)，和因此關(guān)于所述種群的“指紋圖譜”的另外的和重要的信息。另外，人們現(xiàn)在可以將未知的微生物，如未知細菌物種直接分配至特定分類群組，例如未知物種所屬的門。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的具體實施方式中，引物組P3和P4是相同的。在本發(fā)明上下文中的術(shù)語“相同的”是指針對于對第一分類群組特異的至少一個保守位置L3的引物組P3由至少一個引物組成，其中所述引物組P3的引物同時對第二分類群組是特異的，換句話說，可以用作兩個被檢測的分類群組的引物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)所述引物組P3和P4相同時，相對于當(dāng)所述引物組P3和P4不相同的時候，可以獲得分析(“指紋圖譜”)微生物種群如細菌種群的方法的進一步改進。不限于或受制于任何理論，相信當(dāng)所述引物組P3和P4相同時，似乎在樣品中較少有非特異性或假的片段擴增。因此獲得更可靠和可重復(fù)的種群的分析。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)引物組P3和P4相同時，當(dāng)涉及種群中存在的微生物的量時，用該方法獲得的信息增進可靠性。相信這主要是由于以下事實當(dāng)所述組相同時，去除了引物組P3和P4結(jié)合至保守位置的效率的可能差異。在另一個優(yōu)選的具體實施方式中，提供了一種檢測存在于環(huán)境中的微生物種群如(例如)細菌種群的改變的方法，包括下列步驟a.在第一時間點t0在獲自所述環(huán)境的DNA上進行根據(jù)本發(fā)明的方法；和b.在第二時間點tl在獲自所述環(huán)境的DNA上進行根據(jù)本發(fā)明的方法；和c.比較在步驟a和b獲得的結(jié)果。如貫穿本說明書解釋的，通過進行所述方法，現(xiàn)在可以檢測存在于環(huán)境中的微生物種群(例如細菌種群)的改變。特別地現(xiàn)在例如可以有效地和可靠地監(jiān)測例如在嬰兒胃腸道中，例如由于飲食(例如母乳相對于人工嬰兒營養(yǎng)素和配方奶)或用藥物治療發(fā)生的改變。現(xiàn)在還可以監(jiān)測例如在用例如抗生素治療后微生物種群的再生。如在例子中顯示的，現(xiàn)在甚至可以檢測在不同地方或在相同的器官(例如結(jié)腸或皮膚或口腔)中微生物種群組成的變化，而同時經(jīng)典的方法如培養(yǎng)取樣于這樣的組織的細菌不能實現(xiàn)這樣的檢測(例如由于在收集樣品后微生物不存活的事實)。通過比較在第一時間點獲自環(huán)境的擴增片段與在較后的時間點獲自環(huán)境的結(jié)果，可以確定是否在這兩個時間點之間和例如由于外部因素如藥物的結(jié)果而發(fā)生了種群的改變。同樣地，通過應(yīng)用所述方法可以例如及時監(jiān)測微生物種群是否穩(wěn)定、波動或在特定的方向發(fā)展，例如向著已知健康的或有益的微生物種群(例如細菌種群)(組成)的方向發(fā)展。換句話說，比較獲得的結(jié)果還可以是微生物種群(例如涉及已知的情況如疾病或污染)的特定“指紋圖譜”。特別地已經(jīng)發(fā)現(xiàn)比較可以在門、綱、目、科、屬或種的水平上，優(yōu)選在門的水平上進行。在本發(fā)明的上下文中術(shù)語“在水平上”意思是所獲得結(jié)果之間的比較是通過比較關(guān)于提及的分類群組獲得的信息而進行，例如通過在時間點to和tl就特定分類群組的不同片段的數(shù)目、數(shù)量和大小的差異而比較不同的門。通過根據(jù)本發(fā)明的方法，通過比較在不同時間點獲得的“指紋圖譜”所述比較現(xiàn)在成為可能。通過在特定的分類群組中，優(yōu)選門中的比較，并且無需知道存在于種群中的個體微生物(例如細菌物種)的細節(jié)，現(xiàn)在可以有利地和在常規(guī)的基礎(chǔ)上測定是否例如發(fā)生了種群的改變，無需詳細知道哪種特異的微生物(例如細菌)是增加或變化。通過將所述信息與已知涉及這樣的有益情況的微生物種群(例如細菌種群)(組成)比較，現(xiàn)在可以容易地將例如門的水平上的信息用于分析是否例如有益的改變及時發(fā)生。例如，現(xiàn)在可以容易地監(jiān)測是否在用藥物如抗生素治療后，微生物種群(例如細菌種群)(組成)是否正在恢復(fù)并且向著健康或有益種群發(fā)展。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的方法，引物組Pl由一個引物組成和/或引物組P2由一個引物組成。如上面所述，引物組Pl和/或引物組P2可以含有針對于對特定的第一分類群組特異的至少一個保守位置的多個引物(但是還可以含有多個引物或含有針對不同保守位置的引物)。雖然當(dāng)所述引物組含有多個引物時獲得有益的結(jié)果，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)引物組Pl和/或引物組由一個引物組成時，獲得特別有益的結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是明顯地引物組Pl和引物組P2是不相同的(與引物組P3和P4的情況不同)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)引物組Pl由一個引物組成時，相對于當(dāng)引物組Pl包含一個以上的引物，根據(jù)本發(fā)明的方法就所獲得的結(jié)果獲得改進。如上面解釋的，相信這是由于去除了存在于引物組中的不同引物對存在于樣品中的不同DNA中的保守位置Ll的結(jié)合效率的可能差異，可能將不確定性引入例如關(guān)于存在于樣品中的特定擴增片段的數(shù)量/濃度的結(jié)果。當(dāng)引物組由一個引物組成時，所述不確定性減少。在本方法的另一個優(yōu)選的具體實施方式中，本方法的特征是以引物組P3和/或P4由至少兩個，優(yōu)選至少三個不同的引物組成。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)引物組含有針對至少一個保守位置的至少兩個，優(yōu)選至少三個引物時，改進了對微生物種群(例如細菌種群)的分析。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過應(yīng)用這樣的引物組，與當(dāng)引物組由一個引物組成時相比，引物組可以在存在于樣品中的更多不同微生物(如細菌)中結(jié)合不同的保守位置(見上面關(guān)于“保守位置”)。如上面解釋的，術(shù)語“針對保守位置”意思是包含在特定引物組中的引物可以有效地用于檢測至少60%，優(yōu)選至少70%，甚至更優(yōu)選80%，甚至更優(yōu)選90%的已知屬于特定分類群組，例如門的不同微生物。換句話說，可以檢測至少提及到的百分比的已知屬于某種分類群組的微生物種類?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過結(jié)合上述的至少兩個，優(yōu)選至少三個不同引物，可以增加可檢測的屬于一個分類群組的微生物的百分比。例如，可以發(fā)現(xiàn)第一引物p3可以應(yīng)用于檢測達75%的不同種類的屬于特定分類群組的細菌，但是不能應(yīng)用于檢測未被檢出的25%細菌的至少一部分，這是由于例如下列的事實引物核苷酸序列中的錯配造成引物不有效地結(jié)合存在于所述細菌中的保守位置。通過將所述第一引物p3與第二引物p3，優(yōu)選與第三引物p3結(jié)合，現(xiàn)在引物組P3可以檢測至少90%種類的在種群中屬于特定分類群組的不同細菌(微生物)。為此，在引物組中含有的不同引物的序列將關(guān)于至少一個核苷酸(A、T、C或G)而彼此不同。通過擁有在引物組中這樣的引物，引物組現(xiàn)在還可以有效地結(jié)合含有至少對特定分類群組特異的保守位置的微生物，但是當(dāng)與另一個屬于相同分類群組的另一種微生物比較時，引物組在例如一個、兩個、三個的更多核苷酸中不同。與當(dāng)引物組P3由一個引物組成時比較，因此獲得的結(jié)果更有代表性和可靠?？梢韵胂笤趯Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員明確的環(huán)境下，這也可以適用于引物組Pl和P2，即在條件下同樣可以應(yīng)用含有至少兩個引物的引物組Pl和P2。進一步，從本說明書中明確的是在更優(yōu)選的具體實施方式中，引物組P3和P4是相同的，但是含有至少兩個，優(yōu)選至少三個不同的引物。雖然本發(fā)明如此不限于特定環(huán)境中的微生物種群(例如細菌種群)，根據(jù)本發(fā)明的方法優(yōu)選在來自環(huán)境的DNA上進行，所述環(huán)境選自存在于人類、植物、動物、水、食物(如乳產(chǎn)品)、酵母培養(yǎng)物(例如用于工業(yè))或土壤中的環(huán)境，更優(yōu)選選自來源于胃腸道、皮膚、肺、唾液、結(jié)腸、口、牙窩、腹水、排泄物、膿、潰瘍、傷口液體、創(chuàng)傷、血或心血管系統(tǒng)的環(huán)境。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解這些環(huán)境包括什么，并且其本身不需要任何進一步的闡明。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)在通過在來自所述環(huán)境的DNA上進行根據(jù)本發(fā)明的方法，無需非常詳細地分析可以存在于這樣樣品中的不同物種，可以提供存在于所述環(huán)境的微生物種群(例如細菌種群)(組成)的有用的、可靠的和可重復(fù)的數(shù)據(jù)。但是如本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的，還可以通過使用根據(jù)本發(fā)明的方法合適地和優(yōu)選地進行這樣的分析。例如因此獲得的“指紋圖譜”可以有效地用于研究微生物種群(例如細菌種群)的改變或發(fā)展之間的差別，所述研究通過比較涉及特定情況(例如感染的疾病)以前獲得的結(jié)果(指紋圖譜)或通過及時監(jiān)視變化而進行?；蛘?，通過一次確定例如在環(huán)境中的病原性細菌的存在(通過進一步應(yīng)用針對鑒定個體細菌的
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的方法)，人們可以將這樣的數(shù)據(jù)與新獲得的指紋圖譜比較以便確定這樣的病原性細菌是否存在，無需(至少最初需要)通過本領(lǐng)域中現(xiàn)在已知的方法證明所述細菌的存在。在另一個優(yōu)選的具體實施方式中，所述第一和第二引物組Pl和P2被標(biāo)記并且含有選自熒光標(biāo)記、優(yōu)選FAM、ΤΕΤ、HEX、Cy5、Cy5.5,Cy3、Cy3.5,Cy7、Tamra、ROX、JOE、FITC、TRITC或放射性標(biāo)記，優(yōu)選3H、14C、32P或33P、35S的標(biāo)記。在進行了根據(jù)本發(fā)明的擴增反應(yīng)后，獲得具有大小、數(shù)量和/或核苷酸序列方面可檢測差異的片段?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同方法檢測所述差異。例如，可以通過對單個獲得的片段測序確定核苷酸序列的不同?；蛘?，可以通過用核酸內(nèi)切酶處理而分析片段，因此提供例如含有部分獲得的片段的特異性模式。然后這些模式可以與已知模式比較以便進一步分析片段。或者，可以使用由對例如某種分類群組(例如門)特異的特定序列組成的探針。例如在獲得不同片段后，可以向樣品中加入放射性或熒光探針并且其特異性結(jié)合一個分類群組。然后可以通過不僅分析探針雜交(結(jié)合；連接)至哪個片段，還分析因此標(biāo)記的片段的大小的差異而獲得這個特定分類群組的指紋圖譜。同樣，可以對任何其它存在于樣品中的分類群組進行所述的檢測并且通過使用不同的引物擴增。其它的檢測方法包括質(zhì)譜。但是，這些方法可以引入關(guān)于分析的可重復(fù)性和可靠性的不確定性。相反，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)在引物組Pl和/或引物組P2中含有的引物用例如放射性標(biāo)記或都用熒光標(biāo)記標(biāo)記時(并且在兩個引物都被標(biāo)記的情況下，明顯地引物組用可以彼此區(qū)分的標(biāo)記而標(biāo)記；見實施例)上面的問題不出現(xiàn)?？梢酝ㄟ^使用例如這些熒光基團標(biāo)記的引物標(biāo)記擴增的DNA，只需要非標(biāo)記核苷酸用于標(biāo)準的酶的摻入。用標(biāo)記的引物標(biāo)記可以保證有效的和無偏向的摻入核苷酸，因為龐大的染料分子不干擾核苷酸的摻入，而另外極大改善了后來的檢測，最可能是由于在檢測中需要較少的步驟，因為可以通過使用AppliedBiosystems的ABIPrism3130x1遺傳分析儀、Genescan分析軟件(AppliedBiosystems)禾口軟件包BioNumerics4.61(AppliedMaths)，容易地分析標(biāo)記獲得的DNA片段，雖然可選的方法對技術(shù)人員是已知的和可以獲得的。上述的標(biāo)記對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的并且可以例如從Invitrogen(Carlsbad、California)獲得。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，優(yōu)選引物組Pl和引物組P2都用不同的標(biāo)記而標(biāo)記，使得容易地區(qū)分擴增的片段。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的具體實施方式，引物組Pl的標(biāo)記與引物組P2的標(biāo)記不同。例如引物組Pl的標(biāo)記是熒光的，引物組P2的標(biāo)記是放射性的。更優(yōu)選兩個標(biāo)記都是熒光的，但是可以彼此區(qū)分。如上面解釋的，根據(jù)本發(fā)明的方法不限于對一個分類群組例如門特異的引物組Pl和引物組P2，但是在方法中可以引入另外的引物組P。例如，第一引物組Pl針對第一個門，第二引物組P2針對第二個門，另外的引物組P-另1針對另一個門，以及當(dāng)然合適的引物組P3和P4和另外的引物組P-另2以便允許擴增保守位置L1-L3、L2-L4之間的區(qū)域和保守L-另外位置P-另1和P-另2之間的區(qū)域。在根據(jù)本發(fā)明方法的進一步具體實施方式中，并且當(dāng)?shù)谝换虻诙诸惾航M是門時，該門選自硬壁菌門(firmicutes)、梭桿菌門(fusobacterium)、脫鐵桿菌門(deferribacteres)、螺旋體門(spirochaetes)、藍細菌門(cyanobacteria)、乳桿菌門(acidobacteria)、硝酸刺菌門(nitrospina)、消化螺旋菌門(nitrospirae)、暖發(fā)菌門(caldithrix)、商素厭氧細菌門(haloanaerobiales),撫微菌門(verrucomicrobia)、衣原體(chlamydiae)、浮霉菌門(planctomycetes)、芽單胞菌門(gemmimonas)、纖維桿菌門(fibrobacteres)、綠菌門(chlorobi)、擬桿菌門(bacteroidetes)、變性菌門(proteobacteria(、熱抱菌門(thermotogae)、嗜熱獎桿菌門(corprothermobacter)、聯(lián)合菌門(synergites)、熱脫硫桿菌門(thermodesulfobacteria)、脫硫桿菌門(desulfurobacterium)、產(chǎn)水菌門(aquificae)、異常球菌-棲熱菌門(deinococcus-thermus)、綠彎菌門(chlorofIexi)或方文線菌門(actinobacteria)。特另Ij地，硬壁菌門、擬桿菌門、變形桿菌門和放線菌門是優(yōu)選的門。這些門對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的并且已經(jīng)例如被Schloss在MicrobiologyandMolecularBiologyReviews,Dec2004,volume68(4):686_91)中或在有名的BergeyManual,SecondEdition2004，Release5.O中有描述。例如擬桿菌門由三個大類的廣泛分布于環(huán)境，包括在土壤中、在沉淀物、海水中和在動物的膽中的細菌組成。到目前為止，最好地研究了擬桿菌類，包括擬桿菌屬(在包括人類的溫血動物排泄物中的豐富的生物；包括例如生酸擬桿菌(B.acidifaciens),吉氏擬桿菌(B.distasonis)、股薄肌擬桿菌(B.gracilis)、脆弱擬桿菌(B.fragilis)、奧利斯擬桿菌(B.oris)、卵形擬桿菌(B.ovatus)、腐敗擬桿菌(B.putredinis)、化膿擬桿菌(B.pyogenes)、便擬桿菌(B.stercoris)、豬擬桿菌(B.suis)、扭柱螺擬桿菌(B.tectus)、多形擬桿菌(B.thetaiotaomicron)、普通擬桿菌(B.vulgatus))和紫單胞菌屬(Porphyromonas)，其是生長于人類口腔的生物群組。擬桿菌屬的成員是條件病原體。另外兩種的成員極少對人類是致病的。例如，現(xiàn)在在硬壁菌門中有274個以上的屬，硬壁菌值得注意的屬包括桿菌、桿菌目(桿菌屬、李斯特菌屬、葡萄球菌屬)；桿菌，乳(酸)桿菌目(腸道球菌屬、乳酸桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬(Leuconostoc)、梳狀菌屬(Pectinatus)、足球菌屬(Pediococcus)、鏈球菌屬)；梭菌(嗜酸菌屬(Acetobacterium)、梭狀芽孢桿菌屬、真細菌屬、日光桿菌(Heliobacterium)屬、日光螺旋菌屬(Heliospirillum)、鼠孢菌屬(Sporomusa)；柔膜體(支原體屬、螺原體屬、脲原體屬、丹毒絲菌屬)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，特別地，根據(jù)本發(fā)明的方法可以適合用于分析其中所述門預(yù)期存在的微生物種群(例如細菌種群)(組成)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，特別地，在不同門的水平，該方法提供實驗結(jié)果/數(shù)據(jù)，其可以有利地用于研究例如外部因素對微生物種群(例如細菌種群)，例如在人類胃腸道中發(fā)展的作用。相信無需詳細研究在樣品中存在的多種不同的物種，在門水平的分析提供足夠的、可靠的和有用的數(shù)據(jù)。根據(jù)本發(fā)明的方法，因此現(xiàn)在可以通過簡單的過程獲得詳細的關(guān)于存在于環(huán)境中的微生物種群(例如細菌種群)的組成的信息，無需在屬或種的水平上的詳細分析，因此減少了實驗步驟的量和所需引物，強勁地改進了關(guān)于微生物種群(例如細菌種群)獲得的定量和定性數(shù)據(jù)的可靠性、可重復(fù)性。根據(jù)本發(fā)明的方法不僅允許分析微生物種群(例如細菌種群)(組成)，另外還允許分析在種群中(鑒定的或未鑒定的)微生物(如細菌)的相對存在。進一步公開了根據(jù)本發(fā)明的方法，其特征是如下面所述設(shè)計的成對的引物組P1-P3和/或成對的引物組P2-P4。特別地，提供了一種根據(jù)本發(fā)明的方法，其特征是通過提供下列物質(zhì)設(shè)計成對的引物組P1-P3和/或成對的引物組P2-P4a)含有至少一個引物A和一個引物B的第一對引物組P1-P3，其中i)所述引物A是含有至少3-50個，優(yōu)選10-30個核苷酸的引物，并且其中所述引物針對于對第一分類群組特異的保守位置；ii)所述引物B是含有至少3-50個，優(yōu)選10-30個核苷酸的引物，其中在引物A和引物B之間的區(qū)域是屬于第一分類群組的微生物中的10-5000個核苷酸；b)含有至少一個引物C和一個引物D的第二對引物組P2-P4，其中，i)所述引物C是含有至少3-50個，優(yōu)選10-30個核苷酸的引物，并且其中所述引物針對于對第二分類群組特異的保守位置；ii)所述引物D是含有至少3-50個，優(yōu)選10-30個核苷酸的引物，并且其中在引物C和引物D之間的區(qū)域是屬于第二分類群組的微生物中的10-5000個核苷酸。顯然，第一和第二分類群組彼此不同。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以用如下面所述設(shè)計的引物組獲得特別有利的結(jié)果。這樣的引物的特性在于其形成兩對引物組P1-P3和P2-P4，每個對一個分類群組特異，即可以區(qū)分不同的分類群組。可以通過擁有每個對不同分類群組特異的引物組Pi和引物組P2而實現(xiàn)，而引物組P3和P4不必對特異的分類群組特異(例如P3可以與P4相同)。另外，可以通過直接比較屬于特定分類群組的已知微生物的序列和比較用于第二分類群組而獲得的引物組而確定成對的引物組。在用于根據(jù)本發(fā)明的方法中的特定成對的引物組之間的區(qū)域可以例如在10至5000個核苷酸之間，而引物通常有3-50個核苷酸的長度，優(yōu)選10-30個核苷酸。通過設(shè)置引物的長度和一對引物組(例如P1-P3)中的兩個引物之間區(qū)域的長度，通過例如計算機分析微生物的已知序列，并且如果需要隨后分析區(qū)域(例如關(guān)于長度、大小或序列的差異)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用本文提供的公開確定合適的用于根據(jù)本發(fā)明方法中的引物組中的引物。這樣的引物，引物組、成對的引物組和其用途因此明確地包括在本發(fā)明中。通常，合適的成對的引物組可以如下設(shè)計如所述的，在引物組Pl中，至少含有針對保守位置Ll的第一引物pi(在本發(fā)明的上下文中的引物A)。這個保守位置Ll對第一分類群組，例如對于特定的門是特異的。因此，在設(shè)計合適的引物組的第一步中，基于從序列數(shù)據(jù)庫中獲得的序列信息，確定在至少第一個門的絕大部分已知物種中保守的位置和引物可以針對的位置。例如在至少3、4、5，優(yōu)選至少10個或更多已知的屬于第一分類群組的物種中確定所述序列。如已經(jīng)在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的，優(yōu)選的是引物優(yōu)選是至少3-50個核苷酸，更優(yōu)選10-30個核苷酸的長度。換句話說，需要確定的保守位置(在本發(fā)明的上下文中)優(yōu)選也是至少3-50個核苷酸，更優(yōu)選是10-30個核苷酸的長度。例如在如下顯示的核苷酸序列情況下，可以確定合適的引物門X、3個細菌物種X1、X2、X3XlacRttaacttcggccgggaaaggggggtttX2tacacRgtgagecatcatcatgggtttX3acRteateactgttcccccccgggttt一個合適的引物的例子是這樣的情況因此是針對如在序列XI、X2和X3中發(fā)現(xiàn)的保守位置Llg-的引物。同樣，可以通過分析已知的細菌X1、X2和X3的序列發(fā)現(xiàn)第二引物(在本發(fā)明的上下文中是引物B；因此是位置L3)。關(guān)于本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)優(yōu)選地在Ll和L2之間的區(qū)域應(yīng)該至少是約10并且最多是約5000個核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道例如，在長度多態(tài)性情況下，這樣的區(qū)域?qū)τ诓煌⑸?，例如對于不同的細菌XI、X2和X3將具有不同長度。換句話說，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對于適合于根據(jù)本發(fā)明的引物組的第二引物，足夠分析在第一引物的上游或下游的最多約5000個核苷酸。與第一引物一起可以形成用于根據(jù)本發(fā)明方法的合適引物組的合適第二引物的例子顯示如下門X、3個細菌物種X1、X2、X3XlacgttaacttcggccgggaaaggggggtttX2tacacggtgagecatcatcatgggtttX3acgteateactgttcccccccgggttt在這種情況下合適的引物的例子將因此是針對在序列XI、X2和X3中發(fā)現(xiàn)的保守位置L3M1的引物。如可以從上面的例子中所證實的，當(dāng)使用這樣的用于擴增位置Ll和L3之間的區(qū)域的引物時，獲得大小不同的區(qū)域。在現(xiàn)在的例子中區(qū)域是24、18和21個核苷酸的長度。如可以被本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，所述引物組可以合適地檢測相同分類群組的微生物，以及在這樣的分類群組中的不同的物種。為了將一個分類群組與另一個區(qū)分，但是在下一步需要確定一個針對保守區(qū)域的特定的引物組是否對第一個門是特異性的。如上述的，在任何情況下，當(dāng)其適合用于結(jié)合引物從而允許將來自一個分類群組的細菌與另一個分類群組的細菌區(qū)分開時，位置在本發(fā)明的上下文中是保守的，即當(dāng)其不結(jié)合或基本上不結(jié)合絕大部分另一個需要用根據(jù)本發(fā)明的方法分析的分類群組時(或不能獲得擴增產(chǎn)物時)，引物對于至少一個分類群組是特異性的。例如一個引物可以檢測門A和B，但不是門C。在這樣的情況下，引物對門A和B是特異的，并且因此針對于門A和B中的保守位置，而所述保守位置在門C中缺失。為了確立如上面設(shè)計的引物組是否可以合適用于將一個分類群組的微生物與另一個分類群組的微生物區(qū)分開，必須確定的是至少一個保守位置Ll或L3在大多數(shù)(如果不是全部)第二分類群組的已知序列中是缺失的，或保守區(qū)Ll和L3之間的區(qū)域具有不適合進行根據(jù)本發(fā)明方法的擴增反應(yīng)的長度(例如在10000個核苷酸以上)。例如當(dāng)確定細菌Xl、X2、X3和X4的第一個門的合適的弓丨物組時，可以鑒定下列候選(F-引物=正向引物，R-引物是反向引物)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>如可以見證的，因此在例子中的引物組可以適合用于分析屬于所述門的物種。在給定的例子中，可以獲得長度上不同的片段并且因此可以用于提供需要分析的微生物種群的部分指紋圖譜。同樣，當(dāng)確定合適的對于含有細菌Zl、Z2、Z3和Z4的第二個門的引物組(在本發(fā)明這個方面的上下文中的引物C和D)時，可以鑒定下列候選(F-引物=正向引物，R-引物是反向引物)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>可以基于引物因此容易地確立在現(xiàn)在的例子中，在兩個門中都可以發(fā)現(xiàn)反向引物BtaRataR0另外，來自第一個門的正向引物Acatcgac對所述第一個門特異，并且正向引物tgatcgatg對第二位置特異。換句話說，含有引物acatcgac和atagatag的一對引物組P1-P3和含有引物tgatcgatg和atagatag的一對引物組P2-P4，將在本實施例中是適合用于根據(jù)本發(fā)明方法的引物，因為通過使用這樣的引物，可以區(qū)別不同的門，而另外，可以獲得基于長度(大小)差異可以容易地區(qū)分的片段。應(yīng)該注意到，在現(xiàn)在的實施例中，引物組P3與引物組P4是相同的(即atagatag)，雖然在其它的實施例中P3和P4可以是不相同的。通過上面的公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解他如何可以設(shè)計適合用于本發(fā)明的引物，或確定特定的引物是否是用于根據(jù)本發(fā)明方法的引物組中合適的引物。雖然如上文解釋的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確立用于根據(jù)本發(fā)明方法的引物，或確定特定的引物或引物組是否可以成功地應(yīng)用于根據(jù)本發(fā)明的方法，特別地當(dāng)引物組Pl或P2含有基本上由具有選自SeqIDNo1_2序列的DNA組成的引物時，已經(jīng)獲得好的結(jié)果。具有SeqIdNo.1的第一正向引物對硬壁菌門和放線菌門是特異的并且可以例如用熒光標(biāo)記FAM標(biāo)記。所述引物的核苷酸序列是FirISf5'-CTGGATCACCTCCTTTCTAWG-3，(SEQIDNo1)具有SeqIdNo.2的第二引物對擬桿菌門是特異的并且可以例如用熒光標(biāo)記HEX標(biāo)記。所述引物的核苷酸序列是BacISf5'-CTGGAACACCTCCTTTCTGGA-3，(SEQIDNo2)如可以被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，還包括的是基本上具有所述序列的引物。換句話說，與提供的序列相比引物中例如1、2、3或4個核苷酸被改變了，或例如引物具有比上面提供的引物長度長或短1、2、3、4或5個核苷酸的長度。在另一個優(yōu)選的具體實施方式中方法的特征在于引物組P3或引物組P4含有基本上由具有選自SEQIDNo3，4或5(3-5)序列的DNA組成的引物。這些反向引物可以是非標(biāo)記的。DUISrl5'-AGGCATCCACCGTGCGCCCT-3，(SEQIDNo3)DUISr25'-AGGCATTCACCRTGCGCCCT-3，(SEQIDNo4)DUISr35'-AGGCATCCRCCATGCGCCCT-3，(SEQIDNo5)如將被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，還包括的是基本上具有所述序列的引物。換句話說，與提供的序列相比引物中例如1、2、3或4個核苷酸被改變了，或例如引物具有比上面提供的引物長度長或短1、2、3、4或5個核苷酸的長度。如將被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，特別地，可以有利地應(yīng)用多個包含在引物組P3或P4中的引物的組合，如上面詳細討論的。特別地，優(yōu)選的是當(dāng)引物組Pl含有基本上由具有SeqIDNo.1序列的DNA組成的引物并且和當(dāng)引物組P2含有基本上由具有SeqIDNo.2序列的DNA組成的引物時，引物組P3或引物組P4含有基本上由具有選自SEQIDNo.3、4或5序列的DNA組成的引物。通過這樣的組合，可以獲得對微生物種群(例如細菌種群)組成的好的分析，例如如在實施例中顯示的。作為進一步的例子，可以給出適于檢測屬于腸桿菌科的成員組成的引物(SeqIdNo6)。通過使用上述方法設(shè)計這個引物以用于發(fā)現(xiàn)適合用于根據(jù)本發(fā)明方法中的引物。具有SeqIdNo.6的正向引物可以用例如熒光標(biāo)記NED標(biāo)記。所述引物的核苷酸序列是正向(DUISr4):5，GGCATCCACCGTGTACGCT3，(SEQIDNo6)。在另一優(yōu)選的具體實施方式中，方法的特征在于對于上述的引物(SEQIDNo6)，引物組P3或引物組P4進一步含有基本上由具有SEQIDNo7序列的DNA組成的引物。反向(EntISf):5，TTGGATCACCTCCTTACCTWA3，(SEQIDNo7)如將被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，還包括的是基本上具有所述序列的引物。換句話說，與提供的序列相比引物中例如1、2、3或4個核苷酸被改變了，或例如引物具有比上面提供的引物長度長或短1、2、3、4或5個核苷酸的長度。在另一個優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明方法的具體實施方式中，保守位置Li、L2、L3或L4選自16SrDNA區(qū)、23SrDNA區(qū)、5SrDNA區(qū)、16S-23S中間區(qū)或5S-23S中間區(qū)內(nèi)的保守區(qū)。所述區(qū)域?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員是已知的并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其是在特別適合的位置上，所述位置用于確定適合用作例如引物組P1、引物組P2或引物組P3和引物組P4中的引物的引物。在例如SeqIdNo.1_5中描述的引物是這樣合適的引物的例子。如上面解釋的，可以使用幾個本領(lǐng)域中已知的方法(測序、質(zhì)譜等等)分析用根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的片段。優(yōu)選地，獲得的片段含有大小不同的片段，并且可以檢測這樣的不同。換句話說，如此選擇用于根據(jù)本發(fā)明的不同引物組的引物屬于特定分類群組的不同種類的微生物獲得的片段有大小的差異。因此，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的方法是一種其中獲得的片段至少含有大小差異的方法。在本發(fā)明的另一個方面，提供了適合用于根據(jù)本發(fā)明的方法的引物或引物組。如上面解釋的，知道本文公開的本領(lǐng)域技術(shù)人員沒有任何能夠確定特定的引物、引物群組或引物組或與另一個引物組的組合是否適合用于根據(jù)本發(fā)明方法的發(fā)明技能。例如，在SeqIDNo1_7中所描述的引物可以適合用于根據(jù)本發(fā)明的方法。因此，在另一個優(yōu)選的具體實施方式中，至少一個引物用于基本上由具有選自SEQIDNo1-7序列的DNA組成的本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供適合用作根據(jù)本發(fā)明方法中的成對引物組P1-P3或P2-P4的引物組的組合。如將被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，并且如本文所述的，根據(jù)本發(fā)明的方法基于擴增兩個保守位置Ll和L3和/或L2和L4之間的至少一個區(qū)域。換句話說，一定要提供適合用作成對的引物組P1-P3或P2-P4(并且其中P4可以與P3相同)的引物組的組合。特別地，提供了如上述的引物組的組合，其特征在于至少一個基本上由具有選自SEQIDNo1-7序列的DNA組成的引物。在另一個方面，提供了含有適合用于根據(jù)本發(fā)明方法的至少一對引物組P1-P3和/或一對引物組P2-P4的試劑盒。這樣的試劑盒進一步包括其它適合用于根據(jù)本發(fā)明方法的成分，如標(biāo)記的引物、緩沖液、核苷酸、聚合酶、孵育管等等，或如何操作根據(jù)本發(fā)明方法的說明書。在另一個方面，提供了根據(jù)本發(fā)明方法的用途，適合用于根據(jù)本發(fā)明方法的引物或引物組的用途，用于研究外部因素對環(huán)境中微生物種群(例如細菌種群)組成的影響，其中外部因素選自飲食、食物、藥物、抗生素、溫度、益生菌、污染物、殺蟲劑或醫(yī)學(xué)治療。如本文解釋的，根據(jù)本發(fā)明的方法可以適合用于(以可靠的方式)研究微生物種群(例如細菌種群)的組成。因此獲得的微生物種群(例如細菌種群)的指紋圖譜還可以通過例如與來自其它的、但是可比較的環(huán)境的指紋圖譜相比較(例如來自健康個體和患有特定狀況的個體的微生物種群(例如細菌種群)之間的比較)，或通過比較獲自相同的環(huán)境但是不同時間點的微生物種群(例如細菌種群)的組成(例如，這允許容易地研究在例如抗生素治療后，或在土壤用殺蟲劑等處理后微生物種群組成的發(fā)展)。用這種方式，可以有利地用根據(jù)本發(fā)明的方法分析可以影響微生物種群(例如細菌種群)組成的外部因素的效應(yīng)。特別地，可以容易地關(guān)于微生物種群(例如細菌種群)組成的發(fā)展或改變監(jiān)測選自飲食、食物、藥物、抗生素、溫度、益生菌、污染物、殺蟲劑或醫(yī)學(xué)治療的外部因素。如在提供的實施例中可見的，當(dāng)進行根據(jù)本發(fā)明方法的特定具體實施方式時，提供了關(guān)于例如不只是擴增片段大小差異的信息，還有所述片段屬于的特定分類群組例如門的信息。通過該方法，可以獲得微生物種群(例如細菌種群)的總的概況，無需確定所述獲得的片段屬于哪個特定的微生物。但是還將被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的是通過將獲得的結(jié)果與通過將根據(jù)本發(fā)明的方法應(yīng)用于獲自一個特定微生物(例如細菌)的DNA而獲得的結(jié)果比較，可以進行微生物種群(例如細菌種群)的進一步詳細的分析。另外，將被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的是通過比較例如獲自不同個體，例如自健康個體和自患有特定狀況的個體的樣品之間獲得的結(jié)果，現(xiàn)在可以容易地分析特定狀況是否伴隨特征性的微生物種群(例如細菌種群；指紋圖譜)(的組成)。例如可以檢測的是在狀況X下，存在屬于不同分類群組(例如門)的細菌之間例如比例的改變，而另外可以發(fā)現(xiàn)，與存在于健康個體中的種群比，屬于一個特定門的特定(未知)細菌在種群中大量地增加，而與在健康個體中存在的種群相比其它細菌是缺少的。換句話說，種群的指紋圖譜改變了。同樣，根據(jù)本發(fā)明的方法可以有利地用于分析外部因素如飲食、食物、藥物、殺蟲劑等對微生物種群(例如細菌種群)組成的效應(yīng)。同樣，當(dāng)把關(guān)于微生物種群(例如細菌種群)的組成獲得的信息與那些涉及或已經(jīng)涉及特定狀況(如健康狀況、飲食或環(huán)境中殺蟲劑的存在等)的組成相比時，現(xiàn)在可以第一次預(yù)測這樣的特定狀況是否還可以存在于/發(fā)生于被分析的微生物種群(例如細菌種群)中。例如，當(dāng)特定的纖維如半乳寡聚糖或果糖寡聚糖的消耗影響含有更多屬于例如擬桿菌門細菌的胃腸道的特定部分中的微生物種群(例如細菌種群)的組成時，這樣的微生物種群(例如細菌種群)組成的特定指紋圖譜可以與獲自個體的指紋圖譜相比，以便確定這個人是否將例如消耗同樣影響所述胃腸道部分中微生物種群(例如細菌種群)組成的食物因素。因此使用根據(jù)本發(fā)明的方法，現(xiàn)在可以更好地理解微生物種群(例如細菌種群)(的組成)之間的關(guān)系和其中外部因素的影響。因此該方法可以有利地用于研究、分析、預(yù)測外部因素和/或狀況對微生物種群(例如細菌種群)的作用，反之，無需知道特定的微生物存在于樣品中。通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的微生物種群(例如細菌種群)的指紋圖譜可以有利地用于所述目的。本發(fā)明現(xiàn)在將進一步用下面非限制性實施例舉例說明。雖然將被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的是下面的實施例不限制本發(fā)明，還要理解的是提及的方法、材料、條件如溫度和濃度、引物和使用的標(biāo)記，可以獨立于實施例中的上下文，和在本發(fā)明中被認為是在本發(fā)明的上下文中保持優(yōu)選的具體實施方式。例如當(dāng)提到反應(yīng)可以在37-40°C在2-50mM的濃度進行時，37-40°C和2-50mM是彼此獨立的，被認為是有利條件和在本發(fā)明的上下文中的具體實施方式。實施例實施例1.樣品人類胃腸道來自人類腸的活組織檢查樣品在結(jié)腸鏡檢查中獲得(樣品同樣可以通過腸的其它部分的活組織檢查，包括小腸而獲得)。獲得的樣品重量在25mg以下并且我們立即用0.9%NaCl洗滌，凍在液氮中并且儲存于-80°C直到使用。實施例2.DNA分離為了從獲得的樣品中分離DNA，首先裂解獲得的樣品。為此使用QIAGENQIAampDNAMini試劑盒，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解其它裂解方案是可用的。在解凍實施例1中獲得的樣品后，將樣品轉(zhuǎn)移至含有360μ1ATL緩沖液的管中。加入約40μ1蛋白酶K。將獲得的混合物在56°C孵育直到樣品中的組織裂解(約1-2小時)。在HOOOrpm離心5秒后，加入400μ1AL緩沖液。將混合物充分震蕩15秒并且在搖動下在70°C孵育10分鐘。接著，使用easyMAGBiomerieux)繼續(xù)DNA的分離。為此，使用有內(nèi)部裂解步驟的內(nèi)部標(biāo)準規(guī)程，使用約800μ1混合物。在進行如在easyMAG中有的規(guī)程，總共獲得在緩沖液中的約110μ1DNA。實施例3.引物如在步驟2中獲得的約10-100微升DNA用于根據(jù)本發(fā)明的分析。為此，進行PCR反應(yīng)，雖然本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可以使用其它擴增DNA的方法。在根據(jù)本發(fā)明的本實施例中用于擴增的引物(0.1-1μM或更多)的特征在于正向引物是這樣的其僅僅對有限數(shù)量的門，例如對于僅僅一個或僅僅兩個不同的門是特異的。另外，引物用不同的熒光標(biāo)記而標(biāo)記。DNA引物的比例可以在11和150之間變化。本實施例中的第一正向引物對硬壁菌門和放線菌門特異并且用熒光標(biāo)記FAM標(biāo)記。所述引物的核苷酸序列是FirISf5'-CTGGATCACCTCCTTTCTAWG-3’對擬桿菌門特異的第二引物用熒光標(biāo)記HEX標(biāo)記。所述引物的核苷酸序列是BacISf5，-CTGGAACACCTCCTTTCTGGA-3，另外，將3個非標(biāo)記的反向引物加入混合物中。它們是DUISrl:5，-AGGCATCCACCGTGCGCCCT-3，DUISr2:5，-AGGCATTCACCRTGCGCCCT-3，DUISr3:5，-AGGCATCCRCCATGCGCCCT-3，在AppliedBiosystems的GeneAmpPCR系統(tǒng)9700中進行PCR反應(yīng)。為每個獨立的PCR反應(yīng)制備下列混合物儲存液每個反應(yīng)(μ1)PCRGold緩沖液IOx2.5DNTP2mM2.5MgCl225mM1.5BSA1,25%0.8AmpliTAQGold5U/ul0.2Bidest100%4FirISf10μM0.7BacISf10μM0.7DUISrl10μM0.7DUISr210μM0.7DUISr3IOuM0.7PCR循環(huán)如下94"C7分鐘94。C30秒〕560C45秒卜5x72°C1分鐘J72°C5分鐘實施例4.片段分析在PCR后，用AppliedBiosystems的ABIPrism3130x1遺傳分析儀，Genescan分析軟件(AppliedBiosystems)和軟件包BioNumerics4.61(AppliedMaths)分析獲得的片段。實施例5.根據(jù)本發(fā)明的方法典型操作的結(jié)果下面圖1中的結(jié)果從獲自如上述的人類腸的5個活組織檢查活樣品中獲得。在圖1中，從左至右，片段的長度從0個堿基對跑至1000個堿基對。以一個“S”指示的小峰是大小標(biāo)記的例子，其允許關(guān)聯(lián)獲得的不同片段的大小。以一個“B”指示的峰代表來自擬桿菌門細菌的HEX標(biāo)記的片段。以一個“F”指示的峰是來自硬壁菌門和放線菌門細菌的FAM-標(biāo)記產(chǎn)物的例子。通過將X-軸上的位置與大小標(biāo)記關(guān)聯(lián)，確定片段的確切長度。這樣的數(shù)據(jù)可以例如涉及就一個或更多特異細菌種屬而已經(jīng)獲得的特異信息。相信峰的高度代表存在于種群中的特定細菌的量。從結(jié)果中明確的是不同的個體顯示不同的指紋圖譜，并且在一些個體的指紋圖譜中峰是存在的而在其它個體中其是缺失的，而同時可以觀察到在不同個體之間的相似性。實施例6.在圖2中，將如上述的根據(jù)本發(fā)明的方法應(yīng)用于所謂的混合的糞腸球菌(屬于硬壁菌門)和脆弱擬桿菌(屬于擬桿菌門)的培養(yǎng)物。如從圖中可見的，該方法可以區(qū)分兩個不同的細菌，但是更重要的現(xiàn)在可以通過比較獲得的“指紋圖譜”與微生物種群(例如細菌種群)的指紋圖譜，容易地使用所述數(shù)據(jù)，無需這樣細菌的特異性引物，允許容易地和直接地鑒定存在于微生物種群(例如細菌種群)中的這樣的微生物(例如細菌)。實施例7.進行實驗而研究“指紋圖譜”，即取樣于結(jié)腸中不同位置的細菌種群的復(fù)雜組成。另外用根據(jù)本發(fā)明的方法分析排泄物。為此通過本領(lǐng)域已知的方法在20個健康個體上進行結(jié)腸鏡檢查?；谀c疾病的遺傳傾向進行該過程。對于所有在這一分析中使用的個體，在結(jié)腸活組織檢查上進行的結(jié)腸鏡檢查和組織學(xué)未顯示異常。對于每個患者，從整個結(jié)腸和直腸中取5個活組織檢查?；罱M織檢查的位置是盲腸(CC)、肝曲(HC)、脾曲(LC)、乙狀結(jié)腸(SC)和直腸(RC)。在結(jié)腸鏡檢查后的一些天(例如3天)，收集排泄物。使用在本申請中所述的引物和引物組，按照上述進行DNA分離和從所有樣品中產(chǎn)生圖譜。結(jié)果的簇分析(使用Pearson相關(guān)和UPGMA)顯示對于每個個體，微生物圖譜(如通過根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的)在結(jié)腸和直腸中幾乎是相同的。然而圖譜的個體間變化非常大每個患者有自己的獨特的圖譜。從排泄物中獲得的圖譜顯示來自活組織檢查的顯著不同，但是排泄物圖譜仍是患者特異性的不與其他排泄物樣品成簇，圖譜還是與相同患者的活組織檢查圖譜成簇(圖3；圖3顯示結(jié)腸活組織檢查和5個個體的排泄物的簇分析。雖然顯著不同，排泄物圖譜還是與相同個體的結(jié)腸圖譜成簇。)這個例子明確顯示無論活組織檢查的解剖位置，根據(jù)本發(fā)明的方法對于分析結(jié)腸活組織檢查樣本是極好的。另外，排泄物圖譜與相同個體的活組織檢查圖譜相關(guān)并且還極適合作為根據(jù)本發(fā)明的方法的輸入(IS-Pro)。這個數(shù)據(jù)還證實了根據(jù)本發(fā)明的方法的可重復(fù)性。實施例8.進行了進一步評估根據(jù)本發(fā)明的方法對研究和確定指紋圖譜即存在于樣品例如存在于排泄物中的微生物組成(無需詳細和之前確實知道微生物)的適合性。實驗的目的是確定是否可以檢測微生物(例如由外部因素如飲食、藥物、酒精誘導(dǎo)的)組成的變化。為此，在2周內(nèi)獲得來自健康個體的7個排泄物樣品。通過使用BioNumerics軟件包進行用根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的圖譜的分析。這個分析顯示存在于排泄物中的擬桿菌隨時間穩(wěn)定，而硬壁菌在這期間顯示變化。這個變化可能與個體在取樣前一天攝入酒精有關(guān)。這個數(shù)據(jù)強調(diào)和證實根據(jù)本發(fā)明的方法是敏感的方法，非常適于檢測微生物(由外部因素如酒精、飲食或藥物誘導(dǎo)的)組成的變化。實施例9.腸道微生物發(fā)展和抗生素干預(yù)的效果在一組5個新生兒中，在出生后7、14和30天收集排泄物。其中一個嬰兒(兒童5)在研究期間的大部分接受抗生素。使用根據(jù)本發(fā)明的方法，從所有樣品中產(chǎn)生圖譜(指紋圖譜)。按照以上所述分析圖譜和進行簇分析。結(jié)果顯示兒童1-4的圖譜顯示在時間內(nèi)彼此相關(guān)，兒童1和2和兒童3和4顯示出強的成對相似性。在第30天圖譜開始不同。來自兒童5(接受了抗生素的兒童)的圖譜與從其他兒童獲得的圖譜不相關(guān)或在整個研究期間彼此不相關(guān)(圖4；圖4用UPGMA產(chǎn)生的樹狀圖顯示在整個時間內(nèi)對除了兒童5的所有兒童的強相關(guān)性，兒童5接受了抗生素)。實驗顯示抗生素干預(yù)可以對腸微生物組成有大的影響并且可以通過根據(jù)本發(fā)明的方法容易地評估這樣的變化。實施例10.皮膚微生物為了評估根據(jù)本發(fā)明的方法對于分析皮膚微生物的可應(yīng)用性，從5個個體中取耳后皮膚拭樣。五個個體中的一個具有感染的皮膚損傷。從這個損傷也取了拭樣。如上所述從這些皮膚拭樣分離DNA并且用根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生圖譜。圖譜的分析顯示皮膚微生物在個體間非常相似。從感染性皮膚損傷中獲得的圖譜與該個體的耳后拭樣和來自所有其他個體的圖譜顯著不同。從這里我們得出結(jié)論，根據(jù)本發(fā)明的方法適合于分析在皮膚上發(fā)現(xiàn)的復(fù)雜微生物，并且使用該方法檢測例如在皮膚損傷中發(fā)現(xiàn)的這個圖譜的變化是非常直接的。實施例11.口腔微生物為了評估根據(jù)本發(fā)明的方法對于分析口腔微生物的可應(yīng)用性，從5個健康個體中取口腔拭樣。五個個體中的一個有口腔粘膜的aphtoid潰瘍。也從這個損傷取了拭樣。按照上面所述從這些口腔拭樣分離DNA并且產(chǎn)生圖譜。圖譜的分析顯示口腔微生物在個體間比皮膚微生物更可變，但比腸微生物有遠小的可變性。從aphtoid損傷獲得的圖譜與取自該個體的非潰瘍粘膜的口腔拭樣顯著不同。從這里我們得出結(jié)論，根據(jù)本發(fā)明的方法適合于分析口腔微生物，并且使用該方法檢測例如在aphtoid損傷中發(fā)現(xiàn)的這個圖譜的變化是非常直接的。權(quán)利要求一種分析在懷疑含有細菌的環(huán)境中的不同分類群組的微生物種群，如細菌種群的方法，該方法包括下列步驟a)提供獲自所述環(huán)境的DNA并且提供至少i)第一引物組P1，其含有至少一個引物p1，p1針對于對選自門、綱、目或科的第一分類群組特異的至少一個保守位置L1；ii)第二引物組P2，其含有至少一個引物p2，p2針對于對選自門、綱、目或科的第二分類群組特異的至少一個保守位置L2；iii)第三引物組P3，其含有至少一個引物p3，p3針對于至少對屬于第一分類群組的微生物特異的至少一個保守位置L3；iv)第四引物組P4，其含有至少一個引物p4，p4針對于至少對于屬于第二分類群組的微生物特異的至少一個保守位置L4，并且其中引物組P1和P3適于擴增所述保守區(qū)域L1和L3之間的區(qū)域，并且其中引物組P2和P4適于擴增所述保守區(qū)域L2和L4之間的區(qū)域；b)使用所述引物組進行擴增反應(yīng)，因此產(chǎn)生具有可檢測大小、數(shù)量和/或核苷酸序列的差異的片段；c)檢測所述差異。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中微生物種群含有細菌。3.根據(jù)權(quán)利要求1-2的方法，其中第一和/或第二分類群組是門。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的方法，其中所述引物組P3和所述引物組P4相同。5.用于檢測存在于環(huán)境中的微生物種群變化的方法，包括下列步驟a)在第一時間點tO在獲自所述環(huán)境的DNA上操作根據(jù)前述權(quán)利要求任意所述的方法；b)在第二時間點tl在獲自所述環(huán)境的DNA上操作根據(jù)前述權(quán)利要求任意所述的方法；禾口c)比較在步驟a和b獲得的結(jié)果。6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于比較在門、綱、目、科、屬或種的水平，優(yōu)選在門的水平進行。7.根據(jù)前述權(quán)利要求任意所述的方法，其特征在于引物組Pl由一個引物組成和/或引物組P2由一個引物組成。8.根據(jù)前述權(quán)利要求任意所述的方法，其特征在于引物組P3和/或P4由至少兩個，優(yōu)選至少三個不同的引物組成。9.根據(jù)前述權(quán)利要求任意所述的方法，其特征在于DNA來自選自存在于人類、植物、動物、水、食物或土壤的微生物環(huán)境的環(huán)境，更優(yōu)選來自胃腸道、皮膚、肺、唾液、結(jié)腸、口、腹水、排泄物、潰瘍、膿、牙窩、傷口液體、創(chuàng)傷、血或心血管系統(tǒng)的微生物環(huán)境。10.根據(jù)前述權(quán)利要求任意所述的方法，其中所述第一和第二引物組Pl和P2被標(biāo)記并且含有選自熒光標(biāo)記，優(yōu)選FAM、ΤΕΤ、HEX、Cy5、Cy5.5,Cy3、Cy3.5,Cy7、四甲基羅丹明、ROX、J0E、FITC、TRITC、放射性標(biāo)記，優(yōu)選3H、14C、32P或33P、35S的標(biāo)記。11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中引物組Pl的標(biāo)記與引物組P2的標(biāo)記不同。12.根據(jù)前述權(quán)利要求任意所述的方法，其特征在于當(dāng)?shù)谝换虻诙诸惾航M是門時，該門選自硬壁菌門firmicutes、梭桿菌門fusobacterium、脫鐵桿菌門deferribacteres、螺$定體門spirochaetes、藍細菌門cyanobacteria、乳桿菌門acidobacteria、硝酸剌菌門nitrospina、消化螺旋菌門nitrospirae、曖發(fā)菌門caldithrix、鹵素厭氧細菌門haloanaerobiales,撫微菌門verrucomicrobia、衣原體chlamydiae、浮霉菌門planctomycetes、芽單胞菌門gemmimonas、纖維桿菌門fibrobacteres、綠菌門chlorobi、擬桿菌門bacteroidetes、變性菌門proteobacteria、熱孢菌門thermotogae、嗜熱糞桿菌門corprothermobacter、聯(lián)合菌門synergites、熱脫硫桿菌門thermodesulfobacteria、脫硫桿菌門desulfurobacterium、產(chǎn)水菌門aquificae、異常球菌-棲熱菌門deinococcus-thermus、綠彎菌門chlorofIexi或放線菌門actinobacteria。13.根據(jù)前述權(quán)利要求任意所述的方法，其特征在于通過提供下列物質(zhì)設(shè)計成對的引物組P1-P3和/或成對的引物組P2-P4a)含有至少一個引物A和引物B的第一對引物組P1-P3，其中i)所述引物A是含有至少3-50個，優(yōu)選10-30個核苷酸的引物，并且其中所述引物針對于對第一分類群組特異的保守位置；)所述引物B是含有至少3-50個，優(yōu)選10-30個核苷酸的引物，并且其中引物A和引物B之間的區(qū)域是屬于第一分類群組的微生物中的10-5000個核苷酸；b)含有至少引物C和引物D的第二對引物組P2-P4，其中i)所述引物C是含有至少3-50個，優(yōu)選10-30個核苷酸的引物，并且其中所述引物針對于對第二分類群組特異的保守位置；)所述引物D是含有至少3-50個，優(yōu)選10-30個核苷酸的引物，并且其中引物C和引物D之間的區(qū)域是屬于第二分類群組的微生物中的10-5000個核苷酸。14.根據(jù)前述權(quán)利要求任意所述的方法，其中引物組Pl或P2含有基本上由具有選自SeqIDNo1-2序列的DNA組成的引物。15.根據(jù)前述權(quán)利要求任意所述的方法，其中引物組P3或引物組P4含有基本上由具有選自SEQIDNo3-5序列的DNA組成的引物。16.根據(jù)前述權(quán)利要求任意所述的方法，其中引物組Pl或P2含有基本上由具有SeqIDNo6序列的DNA組成的引物。17.根據(jù)前述權(quán)利要求任意所述的方法，其中引物組P3或引物組P4含有基本上由具有SeqIDNo7序列的DNA組成的引物。18.根據(jù)前述權(quán)利要求任意所述的方法，其中保守位置Li、L2、L3或L4選自16SrDNA區(qū)、23SrDNA區(qū)、5SrDNA區(qū)、16S-23S中間區(qū)或5S-23S中間區(qū)中的保守區(qū)。19.根據(jù)前述權(quán)利要求任意所述的方法，其中獲得的片段至少含有大小的差別。20.適合用于根據(jù)權(quán)利要求1-19任意所述的方法的引物或引物組。21.基本上由具有選自SEQIDNo1_7序列的DNA組成的引物。22.適合用作在根據(jù)前述權(quán)利要求1-19任意所述的方法的一對引物組P1-P3或P2-P4的引物組的組合。23.根據(jù)權(quán)利要求20的引物組的組合，其特征在于至少一個引物基本上由具有選自SEQIDNo1-7序列的DNA組成。24.含有適用于根據(jù)本發(fā)明的方法的至少一對引物組P1-P3和/或一對引物組P2-P4的試劑盒。25.權(quán)利要求1-19任意所述的方法，權(quán)利要求20-24的引物或引物組，在研究外部因素對環(huán)境中微生物種群，優(yōu)選細菌種群組成的效應(yīng)中的用途，其中外部因素選自飲食、食物、藥物、抗生素、溫度、益生菌、污染物、殺蟲劑或醫(yī)學(xué)治療。全文摘要本發(fā)明涉及用于分析在懷疑含有細菌、引物、引物組和適合用于該方法的成對引物組的環(huán)境中不同分類群組的微生物種群(例如細菌種群)的方法，和該方法在測定外部因素如藥物、營養(yǎng)素和殺蟲劑對不同分類群組的細菌種群的效應(yīng)中的用途。文檔編號C12Q1/68GK101815791SQ200880016594公開日2010年8月25日申請日期2008年4月17日優(yōu)先權(quán)日2007年4月17日發(fā)明者A·E·巴丁,P·H·M·薩韋爾庫爾申請人:高等教育科學(xué)研究及疾病護理協(xié)會