專利名稱：還原酶、其基因及其利用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型還原酶和編碼該還原酶的DNA、包含該DNA的重組載體、和用該重組載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體等。本發(fā)明還涉及使用了新型還原酶或該轉(zhuǎn)化體的作為光學(xué)活性 醇的光學(xué)活性的苯乙醇酸化合物等的制造方法。
背景技術(shù)：
光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物是在醫(yī)農(nóng)藥等的制造中有用的化合物，迄 今為止提出了使用不對(duì)稱還原試劑的制造方法等，在國(guó)際公開編號(hào)W00210101號(hào)記載的方 法中，為了提高光學(xué)純度在反應(yīng)后進(jìn)一步進(jìn)行重結(jié)晶等，在有機(jī)快報(bào)(Organic Letters), 2005，第7卷，24號(hào)，5425-5427頁(yè)中記載的反應(yīng)中，反應(yīng)的光學(xué)收率也未必可以稱為充分。 另外，迄今為止還不知道使用微生物等將鄰位上具有取代基的立體上處于復(fù)雜環(huán)境的苯乙 醛酸化合物的酮基還原，從而不對(duì)稱還原為光學(xué)活性的苯乙醇酸化合物的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供以良好的光學(xué)收率將鄰位上具有取代基的苯乙醛酸化合物還原為光 學(xué)活性的苯乙醇酸化合物的方法。更具體而言，本發(fā)明提供能夠?qū)⑧徫蝗〈谋揭胰┧峄衔锊粚?duì)稱還原并在工業(yè) 上有利地制造對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸的酰胺或酯化合物的蛋白質(zhì)、編碼該 蛋白質(zhì)的DNA(以下簡(jiǎn)稱為本發(fā)明DNA)、包含該DNA的轉(zhuǎn)化體、從該DNA制造該蛋白質(zhì)的方 法、以及使用該蛋白質(zhì)來(lái)將鄰位取代的苯乙醛酸化合物不對(duì)稱還原從而制造對(duì)應(yīng)的光學(xué)活 性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的方法。S卩，本發(fā)明提供1.由下述a) d)中的任何堿基序列構(gòu)成的DNA，a)編碼用序列編號(hào)1表示的氨基酸序列的堿基序列；b)i)相對(duì)于由編碼序列編號(hào)1所示的氨基酸序列的堿基序列構(gòu)成的DNA具有至少 90%序列同源性的DNA的堿基序列，并且ii)是對(duì)如下所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行編碼 的堿基序列，所述蛋白質(zhì)具有將鄰位取代的苯乙醛酸化合物不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué) 活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的能力；c)i)在嚴(yán)格條件下與由編碼序列編號(hào)1所示的氨基酸序列的堿基序列構(gòu)成的DNA 雜交的DNA的堿基序列，并且ii)是對(duì)如下所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行編碼的堿基序列， 所述蛋白質(zhì)具有將鄰位取代的苯乙醛酸化合物不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位 取代的苯乙醇酸化合物的能力；和d)用序列編號(hào)2表示的堿基序列。2. 一種DNA，其特征在于，以能夠發(fā)揮功能的形式將能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能 的啟動(dòng)子與權(quán)利要求1所述的DNA連接而形成。3. 一種重組載體，其特征在于，包含上述第1或2項(xiàng)所述的DNA。
4. 一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，通過(guò)將上述第2項(xiàng)所述的DNA或上述第3項(xiàng)所述的重 組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞而形成。5.根據(jù)上述第4項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，宿主細(xì)胞為微生物。6.根據(jù)上述第4項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，宿主細(xì)胞為大腸桿菌。7. 一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，包含上述第1項(xiàng)所述的DNA。8. 一種轉(zhuǎn)化體的制造方法，其特征在于，包括將上述第3項(xiàng)所述的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的步驟。9.由下述a) e)中的任何氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)，a)用序列編號(hào)1表示的氨基酸序列；b) i)相對(duì)于由序列編號(hào)2所示的堿基序列構(gòu)成的DNA具有至少90%序列同源性 的DNA的堿基序列所編碼的氨基酸序列，并且ii)是如下所述的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，所述 蛋白質(zhì)具有將鄰位取代的苯乙醛酸化合物不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代 的苯乙醇酸化合物的能力；c) i)在嚴(yán)格條件下與由序列編號(hào)2所示的堿基序列構(gòu)成的DNA雜交的DNA的堿基 序列所編碼的氨基酸序列，并且ii)是如下所述的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，所述蛋白質(zhì)具有 將鄰位取代的苯乙醛酸化合物不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸 化合物的能力；d) i)用序列編號(hào)1表示的氨基酸序列中缺失、置換或附加1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨 基酸序列，并且ii)是如下所述的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，所述蛋白質(zhì)具有將鄰位取代的苯 乙醛酸化合物不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的能力；和e) i)與序列編號(hào)1所示的氨基酸序列的序列同源性至少為90%的氨基酸序列，并 且ii)是如下所述的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，所述蛋白質(zhì)具有將鄰位取代的苯乙醛酸化合物 不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的能力。10. 一種重組載體，其特征在于，包含上述第1項(xiàng)所述的DNA和具有對(duì)如下所述蛋 白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行編碼的堿基序列的DNA，所述蛋白質(zhì)具有將氧化型β -煙酰胺腺嘌 呤二核苷酸或氧化型β“煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉(zhuǎn)換為還原型的能力。11.根據(jù)上述第10項(xiàng)所述的重組載體，其特征在于，具有將氧化型β -煙酰胺腺嘌 呤二核苷酸或氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉(zhuǎn)換為還原型的能力的蛋白質(zhì)，為葡 萄糖脫氫酶。12.根據(jù)上述第11項(xiàng)所述的重組載體，其特征在于，具有葡萄糖脫氫酶活性的蛋 白質(zhì)為巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)來(lái)源的葡萄糖脫氫酶。13. 一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，通過(guò)將上述第10 12項(xiàng)所述的重組載體導(dǎo)入宿主 細(xì)胞而得到。14.根據(jù)上述第13項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，宿主細(xì)胞為微生物。15.根據(jù)上述第13項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，宿主細(xì)胞為大腸桿菌。16. 一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，包含上述第1項(xiàng)所述的DNA和具有對(duì)如下所述蛋白 質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行編碼的堿基序列的DNA，所述蛋白質(zhì)具有將氧化型β -煙酰胺腺嘌呤 二核苷酸或氧化型β“煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉(zhuǎn)換為還原型的能力。17. 一種光學(xué)活性醇的制造方法，其特征在于，使上述第9項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)、或上述第4 7、13 16項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體、或其處理物，與前手性羰基化合物反應(yīng)。18.根據(jù)上述第17項(xiàng)所述的制造方法，其中，前手性羰基化合物為鄰位取代的苯 乙醛酸的酰胺或酯化合物，對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的醇化合物為光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸 的酰胺或酯化合物。19.根據(jù)上述第18項(xiàng)所述的制造方法，其中，鄰位取代的苯乙醛酸的酰胺或酯化 合物為式(1)所示的化合物，光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸的酰胺或酯化合物為式(2) 所示的光學(xué)活性化合物，
(1)式(1)中，R1表示可被取代的氨基或可被取代的烷氧基，R2表示可被取代的C1-8
燒基，
(2)式(2)中，R1和R2表示與上述相同的含義，帶*標(biāo)記的碳原子為手性碳原子。20.寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp.) SC-I (FERM BP-10785)。根據(jù)本發(fā)明，能夠以良好的光學(xué)純度制造作為醫(yī)農(nóng)藥或其制造中間體等有用的光 學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸的酰胺或酯化合物。
具體實(shí)施例方式首先，對(duì)本發(fā)明DNA進(jìn)行說(shuō)明。本發(fā)明DNA可以從具有將鄰位取代的苯乙醛酸化合物不對(duì)稱還原為對(duì)應(yīng)的 光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的能力的微生物中獲得，例如從寡養(yǎng)單胞菌 (Stenotrophomonas sp.) SC-1菌株(FERM BP-10785)等歸屬于寡養(yǎng)單胞菌屬的微生物中獲 得。本發(fā)明的DNA可以是所述天然的DNA，或者也可以是通過(guò)以下說(shuō)明的方法在所述天然的 DNA中導(dǎo)入變異(位點(diǎn)定向誘變法、突變處理等)而制成的DNA。寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp. ) SC-I菌株保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜 合研究所專利生物保藏中心，郵編305-8566，日本茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第 6，授予的保藏編號(hào)的為FERM BP-10785 (原保藏日2007年2月21日)。細(xì)菌學(xué)特性如下。1.菌落形態(tài)(30°C、24小時(shí))(1)細(xì)胞形態(tài)桿菌，0. 7 0. 8 X 1. 5 2. O μ m(2)革蘭氏染色陰性
(3)有無(wú)孢子無(wú)(4)有無(wú)運(yùn)動(dòng)性有2.營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的菌落形態(tài)菌落的顏色淡黃色菌落的形狀圓形 菌落的邊緣整個(gè)邊緣光滑菌落的隆起透鏡狀透明度不透明3.生理學(xué)性質(zhì)(1)過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性(2)氧化酶陰性(3) OF實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性/陰性4.編碼16S核糖體RNA的DNA的堿基序列利用PCR從寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp. ) SC-I菌株中擴(kuò)增16S核糖體DNA 的堿基序列約500bp，對(duì)堿基序列進(jìn)行分析。使用所得的16S核糖體DNA的堿基序列，通過(guò) BLAST進(jìn)行同源性性檢索，結(jié)果同源率為99. 6%，相對(duì)于Stenotrophomonas rhizophila 標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S核糖體DNA，顯示出最高的同源性。即便在使用了國(guó)際核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的 BLAST檢索中，也示出與寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)屬來(lái)源的16S核糖體DNA的高同 源性。根據(jù)以上的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)，本細(xì)菌鑒定為寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonassp.)。在本發(fā)明DNA中，“在嚴(yán)格條件下與由編碼序列編號(hào)1所示的氨基酸序列的堿基序 列構(gòu)成的DNA雜交的DNA”，是指下述DNA 例如在“克隆與序列”(cloning and sequence) (渡邊格主編，杉浦昌弘編輯，1989年，農(nóng)村文化公司發(fā)行)等中記載的Southern雜交法 中，(1)通過(guò)在高離子濃度下[例如可以舉出6xSSC(900mM的氯化鈉、90mM的檸檬酸鈉)]、 65°C下進(jìn)行雜交，與由編碼序列編號(hào)1所示的氨基酸序列的堿基序列構(gòu)成的DNA形成 DNA-DNA雜交體，(2)即使在低離子濃度下[例如可以舉出0. IxSSC(15mM的氯化鈉、1. 5mM 的檸檬酸鈉)]、65°C下保溫30分鐘后，該雜交體仍能維持。具體而言，例如可以舉出由編碼序列編號(hào)1所示的氨基酸序列的堿基序列構(gòu)成的 DNA、由編碼序列編號(hào)1所示的氨基酸序列的堿基序列中一部分堿基缺失、置換或附加的堿 基序列構(gòu)成的DNA、相對(duì)于由編碼序列編號(hào)1所示的氨基酸序列的堿基序列構(gòu)成的DNA具有 至少90%序列同源性、優(yōu)選至少95%序列同源性、更優(yōu)選至少99%序列同源性的DNA等。所述DNA可以是從自然界中存在的DNA中克隆的DNA，可以是在該克隆的DNA的堿 基序列中人工導(dǎo)入部分堿基的缺失、置換或附加而得到的DNA，也可以是人工合成的DNA。 序列同源性可以使用例如帶有UWGCG軟件包的BESTFIT程序(Devereux等(1984)，核酸 研究 12，387-395 頁(yè))、或者 PILEUP 或 BLAST 算法(Altschul S. F. (1993) J Mol Evol36 290-300 ；Altschul S. F. (1990) J Mol Biol 215:403-10)等序列分析用工具算出。本發(fā)明的DNA例如可以如下制備。從寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp.)等歸屬于寡養(yǎng)單胞菌屬的微生物等中，按 照通常的基因工程的方法(例如，“新細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)方法”(東京大學(xué)醫(yī)科學(xué)研究所制癌研究部編，秀潤(rùn)公司，1993年)中記載的方法)制備DNA文庫(kù)，以制備的DNA文庫(kù)作為模板，并 且使用適當(dāng)?shù)囊镞M(jìn)行PCR，由此能夠擴(kuò)增由編碼序列編號(hào)1所示的氨基酸序列的堿基序 列構(gòu)成的DNA、由編碼序列編號(hào)1所示的氨基酸序列中缺失、置換或附加1個(gè)或多個(gè)氨基酸 的氨基酸序列的堿基序列構(gòu)成的DNA和/或具有序列編號(hào)2所示的堿基序列的DNA等，從 而制備本發(fā)明的DNA。
另外，通過(guò)以所述DNA文庫(kù)作為模板，并且使用具有序列編號(hào)12所示的堿基序列 的寡核苷酸和具有序列編號(hào)13所示的堿基序列的寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR，能夠擴(kuò)增由 序列編號(hào)2所示的堿基序列構(gòu)成的DNA，從而制備本發(fā)明的DNA。作為該P(yáng)CR的條件，例如可以舉出下述條件將4種dNTP各20 μ M、2種寡核苷酸 引物各15pmol、Taq聚合酶1. 3U及作為模板的DNA文庫(kù)混合而成反應(yīng)液，94°C加熱該反應(yīng) 液2分鐘后，以94°C (10秒)-65°C (30秒)_72°C (90秒)為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，接著 以94°C (10秒)-650C (30秒)-72°C (1分鐘+5秒/循環(huán))為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，再 在72 °C保持7分鐘。需要說(shuō)明的是，該P(yáng)CR中使用的引物的5’末端側(cè)和/或3’末端側(cè)可以附加限制 性內(nèi)切酶識(shí)別序列等。另外，通過(guò)以所述DNA文庫(kù)作為模板，使用具有從編碼序列編號(hào)1所示的氨基酸序 列的堿基序列中選擇的部分堿基序列的寡核苷酸等(例如，由編碼序列編號(hào)1所示的氨基 酸序列的5’末端側(cè)的約14個(gè)堿基以上的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸)和由與DNA文庫(kù)構(gòu)建 中使用的載體的DNA插入位點(diǎn)附近的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的約14個(gè)堿基以上的 寡核苷酸作為引物進(jìn)行PCR，也能夠擴(kuò)增具有編碼序列編號(hào)1所示的氨基酸序列的堿基序 列的DNA、具有對(duì)序列編號(hào)1所示的氨基酸序列中缺失、置換或附加1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨 基酸序列進(jìn)行編碼的堿基序列的DNA等，從而制備本發(fā)明的DNA。將如上所述擴(kuò)增的DNA按照“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第二版”(1989)，冷泉 港實(shí)驗(yàn)室出版社，“最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編”(1987)，約翰·威利父子公司， ISBN0-471-50338-X等中記載的方法克隆到載體中，能夠得到本發(fā)明的載體。作為所 用的載體，具體例如可以舉出pUC119(寶酒造公司制)、pTV118N(寶酒造公司制)、 pBluescriptII(東洋紡公司制)、pCR2. 1-T0P0(英杰公司制)、pTrc99A(法瑪西亞公司 制)、pKK223-3 (法瑪西亞公司制)等。另外，本發(fā)明的DNA也可以通過(guò)下述方法獲得例如，以由具有從編碼序列編號(hào)1 所示的氨基酸序列的堿基序列中選擇的部分堿基序列的約15個(gè)堿基以上的堿基序列構(gòu)成 的DNA作為探針，使其在后述的條件下與微生物或噬菌體來(lái)源的載體中插入的DNA文庫(kù)雜 交，檢測(cè)該探針特異性結(jié)合的DNA，由此獲得。作為使探針與染色體DNA或DNA文庫(kù)雜交的方法，例如可以舉出菌落雜交或噬菌 斑雜交，可以根據(jù)文庫(kù)的制作中使用的載體的種類來(lái)選擇方法。在所用文庫(kù)是使用質(zhì)粒載體制作而成的情況下，可以利用菌落雜交。具體而言，通 過(guò)將文庫(kù)DNA導(dǎo)入宿主微生物，得到轉(zhuǎn)化體，對(duì)所得轉(zhuǎn)化體進(jìn)行稀釋后，將該稀釋物接種到 瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)到出現(xiàn)菌落為止。在所用文庫(kù)是使用噬菌體載體制作而成的情況下，可以利用噬菌斑雜交。具體而 言，將宿主微生物和文庫(kù)的噬菌體在能夠感染的條件下混合，進(jìn)一步與軟瓊脂培養(yǎng)基混合后，將該混合物接種到瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)到出現(xiàn)噬菌斑為止。
接著，無(wú)論在何種雜交的情況下，在進(jìn)行了所述培養(yǎng)的瓊脂培養(yǎng)基上鋪設(shè)膜，使轉(zhuǎn) 化體或噬菌體吸附、轉(zhuǎn)印到該膜上。對(duì)該膜進(jìn)行堿處理后，進(jìn)行中和處理，接著進(jìn)行將DNA 固定在該膜上的處理。更具體而言，例如，在噬菌斑雜交的情況下，在所述瓊脂培養(yǎng)基上鋪 設(shè)硝酸纖維素膜或尼龍膜(例如Hybond-N^安瑪西亞公司注冊(cè)商標(biāo)))，靜置約1分鐘，使 噬菌體粒子吸附、轉(zhuǎn)印到膜上。接著，將該膜在堿溶液(例如1.5M氯化鈉、0. 5M氫氧化鈉) 中浸漬約3分鐘，使噬菌體粒子溶解，由此將噬菌體DNA從膜上洗脫下來(lái)，然后在中和溶液 (例如1. 5M氯化鈉、0. 5MTris-鹽酸緩沖溶液pH7. 5)中浸漬約5分鐘。接著用洗滌液(例 如0. 3M氯化鈉、30mM檸檬酸、0. 2MTris-鹽酸緩沖液pH7. 5)洗滌該膜約5分鐘，然后通過(guò) 例如在約80°C下加熱約90分鐘使噬菌體DNA固定在膜上。使用如此制備的膜，以上述DNA作為探針進(jìn)行雜交。雜交例如可以按照 J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Manlatis著“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第二版(1989) ”冷泉港實(shí) 驗(yàn)室出版社等的記載來(lái)進(jìn)行。用作探針的DNA可以是用放射性同位素標(biāo)記的DNA，也可以是用熒光色素標(biāo)記的 DNA。作為用放射性同位素標(biāo)記用作探針的DNA的方法，例如可以舉出通過(guò)利用隨機(jī)引 物標(biāo)記試劑盒(寶酒造公司制)等將PCR反應(yīng)液中的dCTP替換為(a-32P)dCTP，以用作探 針的DNA為模板進(jìn)行PCR的方法。另外，在使用熒光色素標(biāo)記用作探針的DNA的情況下，例如可以使用安瑪西亞制 造的ECL核酸直接標(biāo)記和檢測(cè)系統(tǒng)等。雜交例如可以如下進(jìn)行。按照相對(duì)于Icm2如上制作的膜為50 200 μ 1的比例準(zhǔn)備預(yù)雜交液，所述預(yù)雜交 液含有450 900mM氯化鈉、45 90mM檸檬酸鈉、0. 1 1. 0重量％濃度的十二烷基硫酸 鈉(SDS)、0 200μ 1/ml濃度的變性非特異DNA，根據(jù)情況還可以含有白蛋白、Ficoll、聚 乙烯基吡咯烷酮等各0 0. 2重量％濃度，所述預(yù)雜交液優(yōu)選含有900mM氯化鈉、90mM檸 檬酸鈉、1. 0重量％ SDS及100 μ 1/ml變性小牛胸腺DNA，將所述膜浸漬在該預(yù)雜交液中，在 42 65°C保溫1 4小時(shí)。接著，將例如含有450 900mM氯化鈉、45 90mM檸檬酸鈉、0. 1 1.0重量％濃 度的SDS、0 200μ g/ml濃度的變性非特異DNA以及根據(jù)情況可以含有的白蛋白、Ficoll、 聚乙烯基吡咯烷酮等各0 0. 2重量％濃度的雜交溶液(優(yōu)選含有900mM氯化鈉、90mM檸 檬酸鈉、1. 0重量％ SDS及100 μ g/ml變性小牛胸腺DNA的雜交溶液)，與通過(guò)前述方法制 備而得的探針(相當(dāng)于Icm2膜為1. OX IO4 2. OX IO6Cpm的量)混合而得到溶液，按照相 對(duì)于Icm2膜為50 200 μ 1的比例準(zhǔn)備該溶液，將膜浸漬于該雜交溶液中，在42 65°C保 溫12 20小時(shí)。該雜交后，將膜取出，用含有15 300mM氯化鈉、1. 5 30mM檸檬酸鈉及0. 1 1. 0重量％的SDS等的42 65 °C的洗滌液(優(yōu)選含有15mM氯化鈉、1. 5mM檸檬酸鈉及1. 0 重量％的SDS的65 °C的洗滌液)等進(jìn)行洗滌。洗滌過(guò)的膜用2xSSC(300mM氯化鈉、30mM檸 檬酸鈉)輕輕沖洗后，進(jìn)行干燥。對(duì)該膜進(jìn)行例如放射自顯影等，檢測(cè)膜上的探針的位置， 由此在原來(lái)的瓊脂培養(yǎng)基上確定與所用探針雜交的DNA的膜上位置所對(duì)應(yīng)的克隆，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行挑菌，分離出具有該DNA的克隆。
對(duì)如此得到的克隆進(jìn)行培養(yǎng)，從得到的培養(yǎng)菌體能夠制備本發(fā)明的DNA。將如上所述制備的DNA按照“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第二版”(1989)，冷泉 港實(shí)驗(yàn)室出版社，“最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編”(1987)，約翰·威利父子公司， ISBN0-471-50338-X等中記載的方法克隆到載體中，能夠得到本發(fā)明的重組載體。作為使 用的載體，具體而言，例如可以舉出pUC119(寶酒造公司制)、pTV118N(寶酒造公司制)、 pBluescriptII(東洋紡公司制)、pCR2. 1-T0P0(英杰公司制)、pTrc99A(法瑪西亞公司 制)、pKK223-3 (法瑪西亞公司制)等。另外，所述DNA的堿基序列可以通過(guò)F. Sanger、S. Nicklen、A. R. Coulson著，美國(guó) 國(guó)家科學(xué)院院刊(1977)74 :5463-5467頁(yè)等中記載的雙脫氧終止法(dideoxy terminator method)等進(jìn)行分析。堿基序列分析用試樣的制備可以使用例如珀金埃爾默公司的ABI PRISM熒光標(biāo)記終止物循環(huán)測(cè)序反應(yīng)試劑盒等市售的試劑。如上操作得到的DNA編碼的是如下所述的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，所述的蛋白質(zhì)具 有將鄰位取代的苯乙醛酸化合物、典型而言是其酰胺或酯化物(例如2-(2-(2，5_ 二甲基 苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺)不對(duì)稱還原而產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位 取代的苯乙醇酸化合物、典型而言是其酰胺或酯化物(例如(R)-2-(2-(2，5-二甲基苯氧基 甲基)苯基)-N-甲基-2-羥基乙酰胺)的能力，這一結(jié)果的確認(rèn)例如可以如下進(jìn)行。首先，將如上操作得到的DNA如后所述按照與能在宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子 的下游連接的方式插入載體中，將該載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中而獲得轉(zhuǎn)化體。接著，使該轉(zhuǎn)化 體的培養(yǎng)物與鄰位取代的苯乙醛酸化合物(例如該化合物的酰胺或酯化合物，作為其具體 例，例如2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺)作用。對(duì)反應(yīng) 生成物中對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物(例如其酰胺或酯化合物，具體而 言，例如(R)-2-(2-(2，5-二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-羥基乙酰胺)的量進(jìn)行 分析，由此能夠確認(rèn)所得DNA編碼的是具有所述能力的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。為了使本發(fā)明DNA在宿主細(xì)胞中表達(dá)，例如將能在宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子 與本發(fā)明DNA以能發(fā)揮功能的形式連接而成的DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。此處，“以能發(fā)揮功能的形式”是指在通過(guò)將該DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞中來(lái)使宿主細(xì) 胞轉(zhuǎn)化時(shí)，本發(fā)明DNA處于與啟動(dòng)子結(jié)合以便在啟動(dòng)子的調(diào)控下進(jìn)行表達(dá)的狀態(tài)。作為啟 動(dòng)子，可以舉出大腸桿菌的乳糖操縱子的啟動(dòng)子、大腸桿菌的色氨酸操縱子的啟動(dòng)子、或者 tac啟動(dòng)子或trc啟動(dòng)子等能夠在大腸桿菌內(nèi)發(fā)揮功能的合成啟動(dòng)子等，也可以利用寡養(yǎng) 單胞菌中對(duì)本發(fā)明DNA的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的啟動(dòng)子。一般而言，將以能發(fā)揮功能的形式與能在宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子連接而成 的DNA插入到前述的載體中而得到重組載體，將所得的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。另外，作 為載體，使用含有篩選標(biāo)記基因(例如，卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因等賦予抗生素 抗性的基因等)的載體時(shí)，可以以該篩選標(biāo)記基因的表型等作為指標(biāo)對(duì)導(dǎo)入該載體的轉(zhuǎn)化 體進(jìn)行選擇。作為導(dǎo)入以能發(fā)揮功能的形式與能在宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子連接 而成的本發(fā)明DNA、或本發(fā)明重組載體等的宿主細(xì)胞，例如可以舉出歸屬于埃希氏菌 (Escherichia)屬、芽 包桿菌(Bacillus)屬、棒狀桿菌(Corynebacterium)屬、葡萄球菌(Staphylococcus)屬、鏈霉菌(Streptomyces)屬、酵母菌(Saccharomyces)屬、克魯 維酵母(Kluyveromyces)屬、畢赤酵母(Pichia)屬、紅球菌(Rhodococcus)屬及曲霉 (Aspergillus)屬的微生物等。
將以能發(fā)揮功能的形式與能在宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子連接而成的本發(fā)明 DNA或本發(fā)明重組載體等導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法，根據(jù)所用的宿主細(xì)胞采用通常使用的導(dǎo)入 方法即可，例如可以舉出“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第二版”(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，“最 新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編”(1987)，約翰·威利父子公司，ISBN0-471-50338-X等中記載 的氯化鈣法、或“電穿孔法基因脈沖/大腸桿菌脈沖系統(tǒng)”伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)室，(1993)等中記載 的電穿孔法等。要篩選導(dǎo)入有以能發(fā)揮功能的形式與能在宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子連接而 成的本發(fā)明DNA或本發(fā)明重組載體等的轉(zhuǎn)化體，例如以前述的載體中所含的篩選標(biāo)記基因 的表型作為指標(biāo)進(jìn)行篩選即可。該轉(zhuǎn)化體含有本發(fā)明DNA這一點(diǎn)，可以通過(guò)例如按照“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第二 版”(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社等中記載的通常的方法進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的確 認(rèn)、堿基序列的分析、Southern雜交、Western雜交等來(lái)確認(rèn)。下面對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)進(jìn)行說(shuō)明。作為“用序列編號(hào)1表示的氨基酸序列中缺失、置換或附加1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨 基酸序列”，優(yōu)選用序列編號(hào)1表示的氨基酸序列中缺失、置換或附加1個(gè)氨基酸的氨基酸 序列。本發(fā)明蛋白質(zhì)，例如可以通過(guò)對(duì)包含本發(fā)明DNA的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)制造。作為用于培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基，例如可以使用在微生物等宿主細(xì)胞的培養(yǎng)中通 常使用的適當(dāng)含有碳源、氮源、有機(jī)鹽、無(wú)機(jī)鹽等的各種培養(yǎng)基。作為碳源，例如可以舉出葡萄糖、糊精、蔗糖等糖類、甘油等糖醇、富馬酸、檸檬酸、 丙酮酸等有機(jī)酸、動(dòng)物油、植物油及糖蜜。關(guān)于這些碳源在培養(yǎng)基中的添加量，相對(duì)于培養(yǎng) 液通常為約0.1 30% (w/v) O作為氮源，例如可以舉出肉提取物、蛋白胨、酵母提取物、麥芽提取物、大豆粉、玉 米漿(Corn Steep Liquor)、棉籽粉、干燥酵母、酪蛋白氨基酸等天然有機(jī)氮源、氨基酸類、 硝酸鈉等無(wú)機(jī)酸的銨鹽、氯化銨、硫酸銨、磷酸銨等無(wú)機(jī)酸的銨鹽、富馬酸銨、檸檬酸銨等有 機(jī)酸的銨鹽及尿素。其中，有機(jī)酸的銨鹽、天然有機(jī)氮源、氨基酸類等在多數(shù)情況下也可以 作為碳源使用。關(guān)于這些氮源在培養(yǎng)基中的添加量，相對(duì)于培養(yǎng)液通常為約0. 1 30% (w/
ν) O作為有機(jī)鹽或無(wú)機(jī)鹽，例如可以舉出鉀、鈉、鎂、鐵、錳、鈷、鋅等的氯化物、硫酸鹽、 乙酸鹽、碳酸鹽及磷酸鹽。具體而言，例如可以舉出氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸 錳、氯化鈷、硫酸鋅、硫酸銅、乙酸鈉、碳酸鈣、磷酸二氫鉀及磷酸氫鉀。關(guān)于這些有機(jī)鹽和/ 或無(wú)機(jī)鹽在培養(yǎng)基中的添加量，相對(duì)于培養(yǎng)液通常為約0. 0001 5% (w/v)。進(jìn)而，在導(dǎo)入有tac啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子及Iac啟動(dòng)子等異乳糖誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子與 本發(fā)明DNA以能發(fā)揮功能的形式連接而成的基因而得的轉(zhuǎn)化體的情況下，作為用于誘導(dǎo)本 發(fā)明蛋白質(zhì)產(chǎn)生的誘導(dǎo)劑，例如也可以在培養(yǎng)基中少量添加異丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG)。
含有本發(fā)明DNA的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)，可以按照微生物等宿主細(xì)胞的培養(yǎng)中通常使用 的方法來(lái)進(jìn)行，例如可以舉出試管振蕩式培養(yǎng)、往返式振蕩培養(yǎng)、搖瓶(JarFermenter)培 養(yǎng)、酵罐培養(yǎng)等液體培養(yǎng)及固體培養(yǎng)。 培養(yǎng)溫度可以在該轉(zhuǎn)化體能夠生長(zhǎng)的范圍內(nèi)適當(dāng)改變，通常為約15 40°C。培養(yǎng) 基的PH優(yōu)選為約6 8的范圍。培養(yǎng)時(shí)間因培養(yǎng)條件而異，通常優(yōu)選為約1天 約5天。作為從含有本發(fā)明DNA的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中純化本發(fā)明蛋白質(zhì)的方法，可以應(yīng)用 在通常的蛋白質(zhì)純化中使用的方法，例如可以舉出如下方法。首先，通過(guò)離心分離等從轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中收集細(xì)胞后，通過(guò)超聲波處理、dino mill處理、弗氏壓碎處理等物理破碎法或者使用表面活性劑或溶菌酶等的化學(xué)破碎法等將 其破碎。通過(guò)離心分離、膜濾器過(guò)濾等從所得破碎液中除去雜質(zhì)，由此制備無(wú)細(xì)胞抽提液， 適當(dāng)使用陽(yáng)離子交換層析、陰離子交換層析、疏水層析、凝膠過(guò)濾層析、金屬螯合層析等分 離純化方法將其分為不同組分，由此能夠純化本發(fā)明蛋白質(zhì)。作為層析中使用的載體，例如可以舉出導(dǎo)入了羧甲(CM)基、二乙基氨基乙基 (DEAE)、苯基或丁基的纖維素、糊精或瓊脂糖等不溶性高分子載體。也可以使用市售的填 充完載體的層析柱，作為所述市售的填充完載體的層析柱，例如可以舉出Q-Si5Phar0se FF、 Phenyl-Sepharose HP(商品名，均為安發(fā)瑪西亞生物技術(shù)公司制)、TSK-gel G3000SW(商 品名，東曹公司制)等。另外，要篩選含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的組分，以將2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基甲基)苯 基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺)不對(duì)稱還原而優(yōu)先產(chǎn)生(R)-2-(2-(2，5-二甲基苯氧基甲 基)苯基)-N-甲基-2-羥基乙酰胺的能力作為指標(biāo)進(jìn)行篩選即可。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體及其處理物，可以用于將作為前手性羰基化合物的式(1)所示的 鄰位取代苯乙醛酸化合物(例如其酯或酰胺化合物)不對(duì)稱還原來(lái)制造作為光學(xué)活性醇化 合物的式(2)所示的光學(xué)活性的鄰位取代苯乙醇酸化合物(例如其酰胺或酯化合物)。對(duì)式(1)的鄰位取代苯乙醛酸化合物及式(2)的鄰位取代苯乙醇酸化合物中隊(duì)所 示的取代基進(jìn)行如下說(shuō)明。作為R1所示的可被取代的氨基，除了氨基之外，例如可以例示甲基氨基、乙基氨 基、丙基氨基、異丙基氨基、丁基氨基、異丁基氨基、叔丁基氨基、戊基氨基、己基氨基等C1-6 烷基氨基。另外，作為可被取代的烷氧基，例如可以舉出甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、 丁氧基、戊氧基、己氧基、庚氧基和辛氧基等C1-8烷氧基。下面，對(duì)R2所示的取代基進(jìn)行如下說(shuō)明。作為R2所示的可被取代的C1-8烷基中的C1-8烷基，例如可以例示甲基、乙基、丙
基、異丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基等。作為所述C1-8烷基的取代基，可以例示可被取代的烷氧基和可被取代的芳氧基。作為R2所示的可被取代的烷氧基烷基，例如可以例示甲氧基甲基、甲氧基乙基、甲
氧基丙基、甲氧基丁基、甲氧基戊基、甲氧基己基、甲氧基庚基、甲氧基辛基、乙氧基甲基、乙 氧基乙基、乙氧基丙基、乙氧基丁基、乙氧基戊基、乙氧基己基、乙氧基庚基、乙氧基辛基、丙 氧基甲基、丙氧基乙基、丙氧基丙基、丙氧基丁基、丙氧基戊基、丙氧基己基、丙氧基庚基、丙 氧基辛基、丁氧基甲基、丁氧基乙基、丁氧基丙基、丁氧基丁基、丁氧基戊基、丁氧基己基、丁 氧基庚基、丁氧基辛基等C1-4烷氧基取代的C1-8烷基。
作為可被取代的芳氧基，可以例示式(3)所示的芳氧基。 (式中、Α、Β和C相同或相互不同，表示氫原子、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、 烷氧基、商代烷基、羥基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、商原子、硝基、氰基、可 被烷氧基取代的芳烷基、可被選自鹵原子和烷氧基的取代基取代的芳基、烷基硫基、氨基、 烷基氨基)對(duì)式(3)中的Α、Β或C所示的取代基進(jìn)行如下說(shuō)明。作為烷基，例如可以例示甲基、乙基、丙基、丁基等C1-4烷基。作為烯基，例如可以例示乙烯基、烯丙基、丁烯基等C2-4烯基。作為炔基，例如可以例示乙炔基、丙炔基、丁炔基等C2-4炔基。作為環(huán)烷基，例如可以例示環(huán)丙基、環(huán)戊基、環(huán)己基等C3-6環(huán)烷基。作為環(huán)烯基，例如可以例示環(huán)戊烯基、環(huán)己烯基等C5-6環(huán)烯基。作為烷氧基，例如可以例示甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等C1-4烷氧基。作為鹵代烷基，例如可以例示三氟甲基、三氯甲基、二氟甲基、氯甲基、2-溴乙基、 1，2_ 二氯丙基等C1-3鹵代烷基。作為羥基烷基，例如可以例示羥基甲基、1-，2-羥基乙基等羥基取代的C1-2烷基。作為烷氧基烷基，例如可以例示甲氧基甲基、甲氧基乙基、乙氧基甲基、乙氧基乙 基等C1-2烷氧基取代的C1-2烷基。作為氨基烷基，例如可以例示氨基甲基、1-，2-氨基乙基等單氨基取代的C1-2烷 基、或二氨基取代的C1-2烷基。作為烷基氨基烷基，例如可以例示甲基氨基甲基、二甲基氨基甲基、二乙基氨基甲 基等單(C1-2)烷基氨基取代的C1-2烷基、或二(C1-2)烷基氨基取代的C1-2烷基。作為鹵原子，例如可以例示氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。作為可被烷氧基取代的芳烷基，例如可以例示芐基、苯乙基、4-甲氧基芐基等可被 C1-2烷氧基取代的C7-8芳烷基。作為可被選自鹵原子和烷氧基的基團(tuán)取代的芳基，例如可以例示2-，3-，4_氯苯 基、2-，3-，4_甲基苯基、2-，3-，4_甲氧基苯基、苯基、1-萘基、2-萘基等可被從鹵原子(氟 原子、氯原子、溴原子和碘原子)和C1-2烷氧基中選擇的基團(tuán)取代的C6-10芳基。作為烷基硫基，例如可以例示甲硫基、乙硫基、丙硫基等C1-3烷基硫基。作為烷基氨基，例如可以例示甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、異丙基氨基、丁基氨 基、異丁基氨基、叔丁基氨基、戊基氨基、己基氨基等C1-6烷基氨基等。從所述具有可被取代的芳氧基的用式(1’ )表示的鄰位取代苯乙醛酸化合物能 夠，得到式(2’ )所示的化合物。 (式(1’)中、禮表示可被取代的氨基或可被取代的烷氧基，A、B和C相同或相互 不同，表示氫原子、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、烷氧基、商代烷基、羥基烷基、烷氧基 燒基、氨基烷基、烷基氨基烷基、商原子、硝基、氰基、可被烷氧基取代的芳烷基、可被選自商 原子和烷氧基中的取代基取代的芳基、烷基硫基、氨基、烷基氨基) (式(2’)中、Ri、A、B和C表示與上述相同的含義，帶*標(biāo)記的碳原子為手性碳原 子)式(1)和(1’)的化合物中，作為札所示的可被取代的氨基，優(yōu)選甲基氨基，作為可 被取代的烷氧基，例如優(yōu)選甲氧基或乙氧基。另外，作為R2所示的可被取代的C1-8烷基，優(yōu) 選甲基；作為可被取代的烷氧基烷基，例如優(yōu)選甲氧基甲基，另外，作為可被取代的芳氧基 燒基，例如優(yōu)選二甲基苯氧基甲基，更具體而言，可以例示2- (2-甲基苯基)-N-甲基-2-氧 代乙酰胺、2_(2_甲基苯基)_2_氧代乙酸乙酯、2-(2_甲氧基甲基苯基)-N-甲基-2-氧代 乙酰胺、2-(2_甲氧基甲基苯基)_2_氧代乙酸乙酯、2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基甲基)苯 基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺或2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基甲基)苯基)_2_氧代乙酸甲酯。本發(fā)明的方法中，在以所述鄰位取代苯乙醛酸化合物為底物的情況下，能夠得到 式(2)或式(2’)的化合物，作為具體的化合物，可以分別得到2-(2_甲基苯基)-N-甲 基-2-羥基乙酰胺、2-(2_甲基苯基)_2_羥基乙酸乙酯、2-(2_甲氧基甲基苯基)-N-甲 基-2-羥基乙酰胺、2-(2_甲氧基甲基苯基)_2_羥基乙酸乙酯、2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基 甲基)苯基)-N-甲基-2-羥基乙酰胺或2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基甲基)苯基)-2_羥基 乙酸甲酯的光學(xué)活性體。上述方法通常在水及還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(以下記為NADPH)等 輔酶的存在下進(jìn)行。此時(shí)所用的水可以是緩沖水溶液。作為該緩沖水溶液中所用的緩沖劑， 例如可以舉出磷酸鈉、磷酸鉀等磷酸堿金屬鹽、乙酸鈉水溶液、乙酸鉀等乙酸堿金屬鹽及它 們的混合物。在上述方法中，除水以外也可以共存有有機(jī)溶劑。作為可共存的有機(jī)溶劑，例如可 以舉出叔丁基甲基醚、二異丙醚、四氫呋喃等醚類，甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁 酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯等酯類，甲苯、己烷、環(huán)己烷、庚烷、異辛烷等烴類，甲醇、乙醇、2-丙 醇、丁醇、叔丁醇等醇類，二甲亞砜等有機(jī)硫化合物，丙酮等酮類，乙腈等腈類及它們的混合 物。
上述方法中的反應(yīng)，例如可以在含有本發(fā)明蛋白質(zhì)或產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體 或其處理物并且含有水、鄰位取代的苯乙醛酸的酰胺或酯化合物(例如2-(2-(2，5_二甲基 苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺)及NADPH，以及根據(jù)需要進(jìn)一步含有有機(jī)溶 劑等的狀態(tài)下，通過(guò)攪拌、振蕩等進(jìn)行混合來(lái)進(jìn)行。上述方法中反應(yīng)時(shí)的pH可以適當(dāng)選擇，但通常為pH3 10的范圍。另外，反應(yīng) 溫度可以適當(dāng)選擇，但從原料及產(chǎn)物的穩(wěn)定性、反應(yīng)速度的觀點(diǎn)考慮，通常為0 60°C的范 圍。反應(yīng)的終點(diǎn)例如可以通過(guò)利用液相色譜等追蹤反應(yīng)液中鄰位取代的苯乙醛酸的 酰胺或酯化合物(例如2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺) 的量來(lái)確定。反應(yīng)時(shí)間可以適當(dāng)選擇，但通常為0. 5小時(shí) 10天的范圍。從反應(yīng)液中回收鄰位取代的光學(xué)活性的苯乙醇酸的酰胺或酯化合物(例如 (R) -2- (2- (2，5- 二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-羥基乙酰胺)，通過(guò)通常已知的任 意方法進(jìn)行即可。例如可以舉出通過(guò)將反應(yīng)液的有機(jī)溶劑萃取操作、濃縮操作等后處理根據(jù)需要與 柱層析、蒸餾等組合進(jìn)行來(lái)純化的方法。本發(fā)明蛋白質(zhì)、產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體、或其處理物，可以以各種形態(tài)在上述方法 中使用。關(guān)于具體的形態(tài)，例如作為包含本發(fā)明DNA的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物、所述轉(zhuǎn)化體的處 理物，可以舉出無(wú)細(xì)胞抽提液、粗純化蛋白質(zhì)、純化蛋白質(zhì)等及它們的固定化物。此處，作 為轉(zhuǎn)化體的處理物，例如可以舉出凍干轉(zhuǎn)化體、有機(jī)溶劑處理轉(zhuǎn)化體、干燥轉(zhuǎn)化體、轉(zhuǎn)化體 磨碎物、轉(zhuǎn)化體的自消化物、轉(zhuǎn)化體的超聲波處理物、轉(zhuǎn)化體抽提物、轉(zhuǎn)化體的堿處理物。另 外，作為獲得固定化物的方法，例如可以舉出運(yùn)載體結(jié)合法(使本發(fā)明蛋白質(zhì)等吸附在硅 膠或陶瓷等無(wú)機(jī)運(yùn)載體、纖維素、離子交換樹脂等上的方法)及包囊法(將本發(fā)明蛋白質(zhì)等 限制在聚丙烯酰胺、含硫多糖凝膠(例如卡拉膠)、精氨酸凝膠、瓊脂凝膠等高分子的網(wǎng)狀 結(jié)構(gòu)中的方法)。另外，如果考慮使用包含本發(fā)明DNA的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)，則與使用活轉(zhuǎn)化體 相比，使用將該轉(zhuǎn)化體滅活的處理物的方法從制造設(shè)備的限制少的觀點(diǎn)考慮優(yōu)選。作為該 用于使細(xì)菌死亡的處理方法，例如可以舉出物理殺菌法(加熱、干燥、冷凍、光線、超聲波、 過(guò)濾、通電)或使用化學(xué)藥品的殺菌法(堿、酸、鹵素、氧化劑、硫、硼、砷、金屬、醇、酚、胺、硫 化物、醚、醛、酮、氰及抗生素)。一般而言，優(yōu)選選擇這些殺菌法中盡量不使本發(fā)明蛋白質(zhì)的 酶活性失活且在反應(yīng)體系中殘留、污染等影響小的處理方法。另外，本發(fā)明的光學(xué)活性的鄰位取代苯乙醇酸酰胺或酯化合物的制造方法，在 NADPH等輔酶的存在下進(jìn)行，就該鄰位取代苯乙醛酸酰胺或酯化合物(例如2-(2-(2，5_ 二 甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺)而言，隨著不對(duì)稱還原反應(yīng)的進(jìn)行，該 NADPH轉(zhuǎn)換為氧化型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(以下記為NADP+)。轉(zhuǎn)換生成的 NADP+可以通過(guò)具有將NADP+轉(zhuǎn)換為還原型(NADPH)的能力的蛋白質(zhì)恢復(fù)為原來(lái)的NADPH， 因此，上述方法的反應(yīng)體系內(nèi)也可以共存有具有將NADP+轉(zhuǎn)換為NADPH的能力的蛋白質(zhì)。作為具有將氧化型0 -尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下記為NAD+)或NADP+轉(zhuǎn)換
15為還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下記為NADH)或NADPH的能力的蛋白質(zhì)，例如 可以舉出葡萄糖脫氫酶、醇脫氫酶、醛脫氫酶、氨基酸脫氫酶及有機(jī)脫氫酶(蘋果酸脫氫酶
寸J寸°另外，在具有將NAD+或NADP+轉(zhuǎn)換為NADH或NADPH的能力的蛋白質(zhì)為葡萄糖脫氫 酶的情況下，通過(guò)使反應(yīng)體系內(nèi)共存有葡萄糖等而有時(shí)可增強(qiáng)該蛋白質(zhì)的活性，例如，可以 在反應(yīng)液中添加這些物質(zhì)。另外，該蛋白質(zhì)可以是酶本身，或者也可以以具有該酶的微生物或該微生物的處 理物的形態(tài)共存于反應(yīng)體系內(nèi)。進(jìn)而，也可以是包含具有對(duì)如下所述的蛋白質(zhì)的氨基酸序 列進(jìn)行編碼的堿基序列的基因的轉(zhuǎn)化體或其處理物，所述蛋白質(zhì)具有將NAD+或NADP+轉(zhuǎn)換 為NADH或NADPH的能力。此處，處理物是指與前述的“轉(zhuǎn)化體的處理物”等同的處理物。另外，在本發(fā)明的鄰位取代的光學(xué)活性苯乙醇酸酰胺或酯化合物的制造方法中， 也可以使用同時(shí)包含具有對(duì)如下所述的蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行編碼的堿基序列的DNA 的轉(zhuǎn)化體來(lái)進(jìn)行，所述的蛋白質(zhì)是葡萄糖脫氫酶、醇脫氫酶、醛脫氫酶、氨基酸脫氫酶及有 機(jī)脫氫酶(蘋果酸脫氫酶等)等具有將NAD+或NADP+轉(zhuǎn)換為NADH或NADPH的能力的蛋白 質(zhì)。在該轉(zhuǎn)化體中，作為將兩種DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法，例如可以舉出將包含兩種 DNA的單一載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法和利用將兩種DNA分別導(dǎo)入復(fù)制起源不同的多種載體 而得到的重組載體對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法等。另外，也可以將一種DNA或兩種DNA導(dǎo) 入到宿主細(xì)胞的染色體中。另外，作為將包含兩種DNA的單一載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的方法，例如，可以將啟動(dòng) 子、終止子等參與表達(dá)調(diào)控的區(qū)域分別與兩種DNA連接來(lái)構(gòu)建重組載體，或者構(gòu)建以像乳 糖操縱子那樣含有多個(gè)順?lè)醋拥牟倏v子的形式進(jìn)行表達(dá)的重組載體。實(shí)施例以下，通過(guò)實(shí)施例等更具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的任何限制。參考例1 (染色體DNA的制備)在兩個(gè)500ml燒瓶中分別裝入培養(yǎng)基(在水100ml中溶解葡萄糖2g、聚蛋白 胨0. 5g、酵母提取物0. 3g、肉提取物0. 3g、硫酸銨0. 2g、磷酸二氫鉀0. lg、七水合硫酸鎂 0.05g，用2N的HC1調(diào)節(jié)pH至6)各100ml，在121°C滅菌15分鐘。向其中分別加入在相同 組成的培養(yǎng)基中培養(yǎng)(30°C、48小時(shí)、振蕩培養(yǎng))的寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp.) SC-1菌株(FERMBP-10785)的培養(yǎng)液各0. 3ml，在30°C振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。然后，將得到的 培養(yǎng)液離心(8000rpm、4°C、10分鐘)，收集產(chǎn)生的沉淀。將該沉淀用0. 85%食鹽水50ml洗 滌，得到3. 5g的濕菌體。使用QIApr印Genomic-tip System(Qiagen公司制)從上述菌體中得到染色體 DNA (以下記為染色體DNA (A))。實(shí)施例1 (本發(fā)明DNA的獲得及其分析)(1)(本發(fā)明蛋白質(zhì)的制備)將在與參考例同樣的條件下制備的寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonassp. ) SC-1菌 株(FERM BP-10785)的濕菌體約7. 5g，懸浮于添加有ImMPMSF (苯甲基磺酰氟)的20mM磷 酸鉀緩沖液(pH7. 0) 10ml中，用Multi-Beads Shocker (安井器械公司制，玻璃珠0. ImmO,
162500rpm，20分鐘)破碎。在所得破碎液中添加硫酸魚精蛋白38mg后，離心分離(8000rpm、 4°C、10分鐘)，再將上清用過(guò)濾器(0.45i!m)過(guò)濾，得到離心上清液約8ml。重復(fù)進(jìn)行同樣 的操作，得到離心上清液約40ml。使得到的離心上清液約10ml在親和層析柱[HiTrap BlueHP (安發(fā)瑪西亞生物技 術(shù)公司制)][用20mM磷酸鉀緩沖液(pH7. 0)平衡]上展開，以溶解有氯化鈉的磷酸鉀緩沖 液(氯化鈉濃度0 — 1. 0M的濃度梯度)作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，作為具有還原酶活性的組分， 得到氯化鈉濃度0. 5 0. 8M的組分2ml。重復(fù)進(jìn)行同樣的操作，得到活性組分約10ml。使用Amicon Ultra-4 (MILLIP0RE 公司制)濃縮該洗脫組分，并用 20mM Tris-HCl 緩沖液(PH7.5)進(jìn)行緩沖交換。將該濃縮液在離子交換層析柱[HiTrap DEAE Sepharose FF(安發(fā)瑪西亞生物技術(shù)公司制)][用Tris-HCl緩沖液(20mM、pH7. 5)平衡]上展開，以 溶解有氯化鈉的Tris-HCl緩沖液(氯化鈉濃度0 — 0. 5M的濃度梯度)作為流動(dòng)相進(jìn)行洗 脫，作為具有還原酶活性的組分，得到氯化鈉濃度0. 1 0. 2M的活性組分2ml。重復(fù)進(jìn)行同 樣的操作，得到活性組分約6ml。使用Amicon Ultra-4 (MILLIP0RE公司制)濃縮該洗脫組分，并用含有0. 15M氯化 鈉的50mM磷酸鈉緩沖液(pH7. 0)進(jìn)行緩沖交換。使該濃縮液通過(guò)凝膠過(guò)濾柱[Superdex200 10/300GL(安發(fā)瑪西亞生物技術(shù)公司制)][流動(dòng)相含有0. 15M氯化鈉的50mM磷酸鈉緩沖 液(PH7. 0)]，作為具有還原酶活性的組分，得到分子量約35000道爾頓的洗脫組分1ml (以 下記為活性組分(A))。對(duì)于在層析等中得到的組分，通過(guò)以下操作來(lái)測(cè)定還原酶活性。將2- (2- (2，5- 二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基_2_氧代乙酰胺3mg、通過(guò)層 析等得到的洗脫組分0. 2ml、NADPH 9mg、乙酸丁酯0. 15ml、100mM磷酸緩沖液(pH7. 0) 1. 5ml 混合，在30°C攪拌18小時(shí)。然后，在反應(yīng)液中添加乙酸乙酯2ml后，離心分離，得到有機(jī)層。 在下述條件下通過(guò)液相色譜對(duì)該有機(jī)層進(jìn)行含量分析測(cè)定。由2-(2-(2，5-二甲基苯氧基 甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺的殘留量和(R)-2-(2-(2，5-二甲基苯氧基甲基)苯 基)-N-甲基-2-羥基乙酰胺的生成量，求出還原酶活性。(含量分析條件)柱SUMICHIRAL0DS A-212流動(dòng)相A液0. 三氟乙酸水溶液，B液含有0. 三氟乙酸的乙腈溶液時(shí)間(分鐘) A液(％ ) B液(％ )080 202010 90301 9930. 180 20流量0.5ml/分鐘柱溫40°C檢測(cè)290nm(2)來(lái)自本發(fā)明蛋白質(zhì)的部分肽所具有的氨基酸序列的分析將通過(guò)上述操作得到的活性組分(A)按照Laemmli，U. K.，自然雜志，(1970)227，
17(伯樂(lè)公司制)染色，切出染色后的一部分凝膠。將該凝膠洗滌后，進(jìn)行胰蛋白酶處理，從 凝膠中抽提肽。抽提出的肽通過(guò)HPLC (柱TSK gel 0DS_80Ts，2. OmmX 250mm(東曹株式會(huì) 社)，移動(dòng)相A液(0. 三氟乙酸水)、B液(含有0. 09%三氟乙酸的90%乙腈水溶液)、 A/B = 100/0 — 0/100的濃度梯度)分段回收。利用蛋白質(zhì)測(cè)序儀(Procise494HT型蛋白 測(cè)序系統(tǒng))確定分段回收的各組分中每2個(gè)組分的氨基酸序列。已確定的氨基酸序列如序 列編號(hào)3或序列編號(hào)4所示。(3)來(lái)自本發(fā)明DNA的部分堿基序列的分析(之一))根據(jù)序列編號(hào)3所示的氨基酸序列，合成具有序列編號(hào)5所示的堿基序列的寡核 苷酸引物。另外，根據(jù)序列編號(hào)4所示的氨基酸序列，合成具有序列編號(hào)6所示的堿基序列 的寡核苷酸引物。 使用具有序列編號(hào)5及序列編號(hào)6所示的堿基序列的寡核苷酸引物，以所述染色 體DNA (A)為模板，在下述反應(yīng)液組成和反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR (使用羅氏診斷產(chǎn)品公司制造 的高保真 PCR 擴(kuò)增系統(tǒng)(Expand HighFidelity PLUS PCR System))。[反應(yīng)液組成]
染色體DNA(A)溶液2u 1
dNTP (各2. 5mM混合物)1 u 1
引物(50pmol/u 1)各 0. 4ii 1
5x緩沖液(含MgCl)10 u 1
expandHiFi 酶(5U/u 1)0. 5u 1
超純水35. 7u 1
[反應(yīng)條件]
將裝有上述組成的反應(yīng)液的容器設(shè)置于珀金埃爾默基因擴(kuò)增PCR系統(tǒng)9700中，在
94°C加熱2分鐘后，以94°C (10秒)-65°C (30秒)_72°C (90秒)為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行10個(gè)循 環(huán)，接著以94°C (10秒)-65°C (30秒)_72°C (1分鐘+5秒/循環(huán))為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行20個(gè) 循環(huán)，再在72 °C保持7分鐘。然后，取出一部分PCR反應(yīng)液，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果檢測(cè)到約600bp的DNA 片段的條帶。將上述約600bp的DNA片段連接到pCR2. 1-T0P0載體中已有的“PCR產(chǎn)物插入位 點(diǎn)”(使用英杰公司制TOPO TA克隆試劑盒)中，用得到的連接液對(duì)大腸桿菌T0P10F’進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在含有50y g/ml氨芐青霉素的LB(1 %細(xì)菌用胰蛋白胨、0. 5%細(xì)菌用酵母提取 物、氯化鈉)瓊脂培養(yǎng)基上，涂布5-溴-4-氯-3-吲哚基-3-D-半乳糖苷(以下記為 父飛￡11)4%水溶液30111及0.說(shuō)的0^6 30 iil，將其上得到的轉(zhuǎn)化體接種進(jìn)行培養(yǎng)。在 形成的菌落中挑取1個(gè)白色菌落，將該菌落接種到含有50y g/ml氨芐青霉素的無(wú)菌LB培 養(yǎng)基(2ml)中，在試管中振蕩培養(yǎng)(30°C、24小時(shí))。使用QIApr印Spin Minipr印試劑盒 (Qiagen公司制)從培養(yǎng)菌體中取出質(zhì)粒。對(duì)所得質(zhì)粒中插入的DNA片段的堿基序列進(jìn)行分析，確定了序列編號(hào)7所示的堿 基序列。需要說(shuō)明的是，質(zhì)粒中插入的DNA片段的堿基序列的分析，通過(guò)使用熒光標(biāo)記終止物循環(huán)測(cè)序反應(yīng)試齊ll盒(Dye Terminator Cycle sequencingFS ready Reaction Kit) (珀金埃爾默制)，以各質(zhì)粒為模板進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，利用DNA測(cè)序儀373A(珀金埃爾默制) 分析得到的DNA的堿基序列來(lái)進(jìn)行。(4)來(lái)自本發(fā)明DNA的部分堿基序列的分析(之二))根據(jù)序列編號(hào)7所示的堿基序列，合成了具有序列編號(hào)8所示的堿基序列的寡核 苷酸引物及具有序列編號(hào)9所示的堿基序列的寡核苷酸引物。另外，根據(jù)序列編號(hào)7所示 的堿基序列，合成了具有序列編號(hào)10所示的堿基序列的寡核苷酸引物及具有序列編號(hào)11 所示的堿基序列的寡核苷酸引物。使用具有序列編號(hào)8及序列編號(hào)9所示的堿基序列的寡核苷酸引物，以所述染色 體DNA(A)經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI處理后通過(guò)T4DNA連接酶進(jìn)行自連接而成的DNA為模板， 在下述反應(yīng)液組成和反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR。另外，使用具有序列編號(hào)10及序列編號(hào)11所 示的堿基序列的寡核苷酸引物，以所述染色體DNA(A)經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRV處理后通過(guò) T4DNA連接酶進(jìn)行自連接而成的DNA為模板，在下述反應(yīng)液組成和反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR(使
用羅氏診斷產(chǎn)品公司制造的高保真PCR擴(kuò)增系統(tǒng))。
[反應(yīng)液組成]
染色體DNA(A)溶液2u 1
dNTP (各2. 5mM混合物)1 u 1
引物(50pmol/u 1)各 0. 4ii 1
5x緩沖液(含MgCl)10 u 1
expandHiFi 酶(5U/u 1)0. 5u 1
超純水35. 7u 1
[反應(yīng)條件]
將裝有上述組成的反應(yīng)液的容器設(shè)置于珀金埃爾默基因擴(kuò)增PCR系統(tǒng)9700中，在
94°C加熱2分鐘后，以94°C (10秒)-65°C (30秒)_72°C (90秒)為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行10個(gè)循 環(huán)，接著以94°C (10秒)-65°C (30秒)_72°C (1分鐘+5秒/循環(huán))為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行20個(gè) 循環(huán)，再在72°C保持7分鐘。然后，取出一部分PCR反應(yīng)液，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果，在使用具有序列編號(hào)8 及序列編號(hào)9所示的堿基序列的寡核苷酸引物進(jìn)行PCR后，檢測(cè)到約600bp的DNA片段的 條帶。另外，在使用具有序列編號(hào)10及序列編號(hào)11所示的堿基序列的寡核苷酸引物進(jìn)行 PCR后，檢測(cè)到約1300bp的DNA片段的條帶。將上述約600bp、或約1300bp的DNA片段連接到pCR2. 1-T0P0載體中已有的“PCR 產(chǎn)物插入位點(diǎn)”(使用英杰公司制T0P0TM TA克隆試劑盒)中，用該連接液對(duì)大腸桿菌 TOP 1 OF，進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在含有50 u g/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上涂布X_gal 4 %水溶液30 yl及 0. 1M的IPTG 30 yl，將其上得到的轉(zhuǎn)化體接種進(jìn)行培養(yǎng)。在形成的菌落中挑取1個(gè)白色菌 落，將該菌落接種到含有50 y g/ml氨芐青霉素的無(wú)菌LB培養(yǎng)基(2ml)中，在試管中振蕩培 養(yǎng)(30°C、24小時(shí))。使用QIApr印Spin Miniprep試劑盒(Qiagen公司制)，從各培養(yǎng)菌 體中取出質(zhì)粒。對(duì)所得質(zhì)粒中插入的DNA片段的堿基序列進(jìn)行分析。根據(jù)所得堿基序列，確定對(duì)
19如下所述的蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行編碼的堿基序列(序列編號(hào)2)，所述蛋白質(zhì)為寡養(yǎng)單 胞菌(Stenotrophomonas sp.)SC_l 菌株(FERMBP-10785)所有，且其具有將 2-(2-(2，5-二 甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺)不對(duì)稱還原而優(yōu)先產(chǎn)生(R)-2-(2-(2， 5-二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-羥基乙酰胺的能力。進(jìn)而根據(jù)該序列編號(hào)2確 定了該蛋白質(zhì)的氨基酸序列(序列編號(hào)1)。需要說(shuō)明的是，將序列編號(hào)1與序列編號(hào)3或序列編號(hào)4進(jìn)行比較，結(jié)果可知，序 列編號(hào)3或序列編號(hào)4所示的氨基酸序列與序列編號(hào)1所示的氨基酸序列的一部分一致。
需要說(shuō)明的是，質(zhì)粒中插入的DNA片段的堿基序列的分析，通過(guò)使用熒光標(biāo)記終 止物循環(huán)測(cè)序反應(yīng)試劑盒(珀金埃爾默制)，以各質(zhì)粒為模板進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，利用DNA測(cè)序 儀373A(珀金埃爾默制)分析得到的DNA的堿基序列來(lái)進(jìn)行。實(shí)施例2 (本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的制造及還原反應(yīng)例(之一))(1)本發(fā)明載體的制備根據(jù)序列編號(hào)2所示的堿基序列，合成了具有序列編號(hào)12所示的堿基序列的寡核 苷酸引物和具有序列編號(hào)13所示的堿基序列的寡核苷酸引物。以具有序列編號(hào)12所示的堿基序列的寡核苷酸引物和序列編號(hào)13所示的寡核苷 酸引物為引物，以所述染色體DNA(A)為模板，在下述反應(yīng)液組成和反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR(使 用羅氏診斷產(chǎn)品公司制造的高保真PCR擴(kuò)增系統(tǒng))。[反應(yīng)液組成]染色體DNA (A)溶液2 μ 1dNTP (各 2. 5mM 混合物)1 μ 1引物(50ρπιο1/μ 1)各 0·4μ1
5χ 緩沖液(含 MgCl) 10 μ 1expandHiFi 酶(5U/ μ 1)0. 5 μ 1超純水35. 7 μ 1將裝有上述組成的反應(yīng)液的容器設(shè)置于珀金埃爾默基因擴(kuò)增PCR系統(tǒng)9700中，在 94°C加熱2分鐘后，以94°C (10秒)_65°C (30秒)_72°C (90秒)為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行10個(gè)循 環(huán)，接著以94°C (10秒)-65°C (30秒)_72°C (1分鐘+5秒/循環(huán))為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行20個(gè) 循環(huán)，再在72°C保持7分鐘。然后，取出一部分PCR反應(yīng)液，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果檢測(cè)到約IOOObp的DNA 片段的條帶。在剩余的PCR反應(yīng)液中加入2種限制性內(nèi)切酶(NcoI及XbaI)，對(duì)約IOOObp的DNA 片段進(jìn)行雙酶切，接著對(duì)酶消化后的DNA片段進(jìn)行純化。另一方面，將質(zhì)粒載體pTrc99A(法瑪西亞制)用2種限制性內(nèi)切酶(NcoI及XbaI) 進(jìn)行雙酶切，對(duì)酶消化后的DNA片段進(jìn)行純化。將這些酶消化后的DNA片段混合，用T4DNA連接酶連接，用得到的連接液對(duì)大腸桿 菌DH5ci進(jìn)行轉(zhuǎn)化。得到的轉(zhuǎn)化體用含有50μ g/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，從長(zhǎng)出的菌落 中隨機(jī)挑選8個(gè)菌落。將該選出的菌落分別接種到含有50 μ g/ml氨芐青霉素的無(wú)菌LB培 養(yǎng)基(2ml)中，在試管中振蕩培養(yǎng)(37°C、17小時(shí))。使用QIApr印Spin Minipr印試劑盒(Qiagen公司制)，從各培養(yǎng)菌體中取出質(zhì)粒。從已取出的質(zhì)粒各取一部分，經(jīng)NcoI和XbaI 2種限制性內(nèi)切酶雙酶切后，進(jìn)行電泳，確認(rèn)取出的6個(gè)質(zhì)粒中插入有所述約IOOObp的DNA 片段(以下將該質(zhì)粒記為質(zhì)粒PTrcRs)。(2)本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的制備及還原反應(yīng)例
使用質(zhì)粒pTrcRs對(duì)大腸桿菌HBlOl進(jìn)行轉(zhuǎn)化。得到的轉(zhuǎn)化體接種于含有0. 2mM的 IPTG和50 μ g/ml氨芐青霉素的無(wú)菌LB培養(yǎng)基(9ml)中，振蕩培養(yǎng)(37°C、15小時(shí))。離心分 離所得培養(yǎng)液，得到濕菌體約0. 12g。在得到的濕菌體中混合2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基甲 基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺1. 5mg、NADPH 6. 9mg、IOOmM磷酸緩沖液(ρΗ7· 0) 1. 5ml、 葡萄糖2. 7mg、乙酸丁酯0. 075ml，在30°C攪拌23小時(shí)。然后，在反應(yīng)液中添加乙酸乙酯2ml 后進(jìn)行離心分離，得到有機(jī)層。在下述條件下通過(guò)液相色譜對(duì)該有機(jī)層進(jìn)行含量分析，結(jié)果 可知，生成了 2- (2- (2，5- 二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-羥基乙酰胺，其生成量相 對(duì)于反應(yīng)中使用的2- (2- (2，5- 二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺的量為 97.9%。另外，在下述條件下測(cè)定有機(jī)層中2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基甲基)苯基)-N_甲 基-2-羥基乙酰胺的光學(xué)純度，結(jié)果(R)體為100% e. e.。(含量分析條件)柱SUMICHIRALODS A-212流動(dòng)相A液0. 三氟乙酸水溶液，B液含有0. 三氟乙酸的乙腈溶液時(shí)間(分鐘) A液(％ ) B液(％ )080 202010 90301 9930. 180 20流量0.5ml/ 分鐘柱溫40°C檢測(cè)290nm(光學(xué)純度測(cè)定條件)柱CHIRALCELOD-H流動(dòng)相己烷2-丙醇=9 1分析時(shí)間50分鐘流量0.5ml/ 分鐘柱溫40°C檢測(cè)230nm實(shí)施例3 (本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的制造及還原反應(yīng)例(之二))(1)為制備具有編碼具有將氧化型β -尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸轉(zhuǎn)換為還原型的 能力的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的堿基序列的基因進(jìn)行的準(zhǔn)備將巨大芽孢桿菌IF012108菌株在無(wú)菌的LB培養(yǎng)基IOOml中培養(yǎng)，得到菌體0. 4g。 使用Qiagen Genomic Tip (Qiagen公司制)，按照其附帶的手冊(cè)中記載的方法從該菌體中純 化染色體DNA (以下記為染色體DNA (B))。(2)具有編碼具有將氧化型β -尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉(zhuǎn)換為還原型的能力的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的堿基序列的基因的制備 根據(jù)生物化學(xué)雜志第264卷，第11期，6381-6385頁(yè)(1989)中記載的巨大芽孢桿 菌IWG3來(lái)源的葡萄糖脫氫酶的序列，合成了具有序列編號(hào)14所示的堿基序列的寡核苷酸 引物和具有序列編號(hào)15所示的堿基序列的寡核苷酸引物。使用具有序列編號(hào)14所示的堿基序列的寡核苷酸引物和具有序列編號(hào)15所示的 堿基序列的寡核苷酸引物作為引物，以所述染色體DNA(B)為模板，在下述反應(yīng)液組成、反 應(yīng)條件下進(jìn)行PCR(使用羅氏診斷產(chǎn)品公司制造的高保真PCR擴(kuò)增系統(tǒng))。[反應(yīng)液組成]染色體DNA (B)原液Ιμ dNTP (各 2. 5mM 混合物) 0. 4 μ 1引物(20ρπιο1/μ 1)各 0·75μ1IOx 緩沖液(含 MgCl)5 μ 1
expandHiFi 酶(3. 5 X 103U/ml) 0. 375 μ 1超純水41. 725 μ 1[PCR反應(yīng)條件]將裝有上述組成的反應(yīng)液的容器設(shè)置于珀金埃爾默基因擴(kuò)增PCR系統(tǒng)2400中，在 97°C加熱2分鐘后，以97V (15秒)_55°C (30秒)_72°C (1. 5分鐘)為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行10個(gè) 循環(huán)，接著以97°C (15秒)-55°C (30秒)_72°C (1分鐘+5秒/循環(huán))為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行20 個(gè)循環(huán)，再在72 °C保持7分鐘。然后，取出一部分PCR反應(yīng)液，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果檢測(cè)到約950bp的DNA 片段的條帶。使用所得PCR反應(yīng)液和英杰公司制造的TOPO TA克隆試劑盒Ver. E，將通過(guò)PCR而 得到的約950bp的DNA片段連接到pCR2. 1-T0P0載體中已有的“PCR產(chǎn)物插入位點(diǎn)”中，用 該連接液對(duì)大腸桿菌DH5 α進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在含有50 μ g/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，涂布X_gal 4 %水溶液3. 0 μ 1 及0. IM的IPTG 30μ 1，將其上得到的轉(zhuǎn)化體接種進(jìn)行培養(yǎng)。在形成的菌落中挑取1個(gè)白色 菌落，將該菌落接種到含有50 μ g/ml氨芐青霉素的無(wú)菌LB培養(yǎng)基(2ml)中，在試管中振蕩 培養(yǎng)(300C >24小時(shí))。接著使用QIAprep Spin Miniprep試劑盒(Qiagen公司制)從培養(yǎng) 菌體中取出質(zhì)粒。將取出的質(zhì)粒的一部分用限制性內(nèi)切酶(EcoRI)消化，并進(jìn)行電泳，由此 確認(rèn)該質(zhì)粒中插入有約950bp的DNA片段(以下將該質(zhì)粒記為質(zhì)粒pSD⑶H12)。對(duì)質(zhì)粒pSDGDH12中插入的DNA片段的堿基序列進(jìn)行分析。其結(jié)果如序列編號(hào)16 所示。需要說(shuō)明的是，質(zhì)粒中插入的DNA片段的堿基序列的分析，通過(guò)使用熒光標(biāo)記終 止物循環(huán)測(cè)序反應(yīng)試劑盒(珀金埃爾默制)以質(zhì)粒PSDGDH12為模板進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，利用 DNA測(cè)序儀373A(珀金埃爾默制)分析得到的DNA的堿基序列來(lái)進(jìn)行。接著，根據(jù)序列編號(hào)16所示的堿基序列，合成了具有序列編號(hào)17和序列編號(hào)18 所示的堿基序列的寡核苷酸引物。使用具有序列編號(hào)17和序列編號(hào)18所示的堿基序列的寡核苷酸引物，以所述染 色體DNA (B)為模板，在下述反應(yīng)液組成和反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR (使用羅氏診斷產(chǎn)品公司制造的高保真PCR擴(kuò)增系統(tǒng))。[反應(yīng)液組成]染色體DNA (B)原液Ιμ dNTP (各 2. 5mM 混合物)0.4 μ 1引物(20ρπιο1/μ 1)各 0·75μ1IOx 緩沖液(含 MgCl)5 μ 1expandHiFi 酶(3. 5 X 103U/ml) 0. 375 μ 1超純水41. 725 μ 1[PCR反應(yīng)條件]將裝有上述組成的反應(yīng)液的容器設(shè)置于珀金埃爾默基因擴(kuò)增PCR系統(tǒng)2400中，在 97°C加熱2分鐘后，以97V (15秒)_55°C (30秒)_72°C (1. 5分鐘)為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行10個(gè) 循環(huán)，接著以97°C (15秒)-55°C (30秒)_72°C (1分鐘+5秒/循環(huán))為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行20 個(gè)循環(huán)，再在72 °C保持7分鐘。然后，取出一部分PCR反應(yīng)液，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果檢測(cè)到約SOObp的DNA 片段的條帶。在剩余的PCR反應(yīng)液中2種限制性內(nèi)切酶(NcoI及BamHI)，對(duì)約800bp的DNA片 段進(jìn)行雙酶切，接著對(duì)酶消化后的DNA片段進(jìn)行純化。另一方面，將質(zhì)粒載體pTrc99A(法瑪西亞制)用2種限制性內(nèi)切酶(NcoI及 BamHI)進(jìn)行雙酶切，對(duì)酶消化后的DNA片段進(jìn)行純化。將這些酶消化后的DNA片段混合，用T4DNA連接酶連接，用得到的連接液對(duì)大腸桿 菌DH5ci進(jìn)行轉(zhuǎn)化。得到的轉(zhuǎn)化體用含有50μ g/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，從長(zhǎng)出的菌落 中隨機(jī)挑選10個(gè)菌落。將該選出的菌落分別接種到含有50 μ g/ml氨芐青霉素的無(wú)菌LB 培養(yǎng)基(2ml)中，在試管中振蕩培養(yǎng)(37°C、17小時(shí))。使用QIApr印Spin Minipr印試 劑盒(Qiagen公司制)從各培養(yǎng)菌體中取出質(zhì)粒。對(duì)取出的質(zhì)粒各取一部分，經(jīng)NcoI和 BamHI 2種限制性內(nèi)切酶雙酶切后進(jìn)行電泳，確認(rèn)已取出的質(zhì)粒中有4個(gè)質(zhì)粒中插入有所 述約800bp的DNA片段(以下將該質(zhì)粒記為質(zhì)粒pTrc⑶H)。(3)本發(fā)明載體的制備以具有序列編號(hào)19所示的堿基序列的寡核苷酸引物和序列編號(hào)12所示的寡核苷 酸引物作為引物，以質(zhì)粒PTrcRs為模板，在下述反應(yīng)液組成和反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR(使用羅 氏診斷產(chǎn)品公司制造的高保真PCR擴(kuò)增系統(tǒng))。[反應(yīng)液組成]質(zhì)粒 pTrcRs2 μ 1dNTP (各 2. 5mM 混合物)1 μ 1引物(50ρπιο1/μ 1)各 0·4μ15χ 緩沖液(含 MgCl)10 μ 1高保真擴(kuò)增Taq PLUS聚合酶 0. 5 μ 1 (2. 5U)超純水35. 7 μ 1[反應(yīng)條件]
將裝有上述組成的反應(yīng)液的容器設(shè)置于珀金埃爾默基因擴(kuò)增PCR系統(tǒng)9700中，在 94°C加熱2分鐘后，以94°C (10秒)_65°C (30秒)_72°C (90秒)為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行10個(gè)循 環(huán)，接著以94°C (10秒)-65°C (30秒)_72°C (1分鐘+5秒/循環(huán))為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行20個(gè) 循環(huán)，再在72°C保持7分鐘。然后，取出一部分PCR反應(yīng)液，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果檢測(cè)到約IOOObp的DNA 片段的條帶。在剩余的PCR反應(yīng)液中加入2種限制性內(nèi)切酶(BamHI和XbaI)，對(duì)約IOOObp的 DNA片段進(jìn)行雙酶切，接著對(duì)酶消化后的DNA片段進(jìn)行純化。另一方面，將質(zhì)粒pTrc⑶H用2種限制性內(nèi)切酶(BamHI和XbaI)進(jìn)行雙酶切，對(duì)酶消化后的DNA片段進(jìn)行純化。將分別經(jīng)酶消化的DNA片段用T4DNA連接酶連接，用該連接液對(duì)大腸桿菌DH5 α 進(jìn)行轉(zhuǎn)化。得到的轉(zhuǎn)化體用含有50 μ g/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，從長(zhǎng)出的菌落 中隨機(jī)挑選6個(gè)菌落。將該選出的菌落分別接種到含有50 μ g/ml氨芐青霉素的無(wú)菌LB培 養(yǎng)基(2ml)中，在試管中振蕩培養(yǎng)(30°C、17小時(shí))。使用QIApr印Spin Minipr印試劑盒 (Qiagen公司制)從各培養(yǎng)菌體中取出質(zhì)粒。從已取出的質(zhì)粒各取一部分，經(jīng)BamHI和XbaI 2種限制性內(nèi)切酶雙酶切后，進(jìn)行電泳，由此確認(rèn)已取出的質(zhì)粒中全部插入有約IOOObp的 目標(biāo)DNA片段(以下將該質(zhì)粒記為質(zhì)粒pTrcGSRs)。(4)本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的制備及還原反應(yīng)例使用質(zhì)粒pTrcGSRs對(duì)大腸桿菌HBlOl進(jìn)行轉(zhuǎn)化。得到的轉(zhuǎn)化體接種于含有0. 2mM 的IPTG和50 μ g/ml氨芐青霉素的無(wú)菌LB培養(yǎng)基(5ml)中，振蕩培養(yǎng)(30°C、24小時(shí))。離 心分離所得培養(yǎng)液，得到濕菌體約0. Igo在得到的濕菌體中混合2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基 甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺3mg、NADP+L 8mg、IOOmM磷酸緩沖液(ρΗ7· 0) 1. 5ml、 葡萄糖2.8mg、四氫呋喃0. 15ml，在30°C攪拌24小時(shí)。然后，在反應(yīng)液中添加乙酸乙酯2ml 后進(jìn)行離心分離，得到有機(jī)層。在下述條件下通過(guò)液相色譜對(duì)該有機(jī)層進(jìn)行含量分析，結(jié)果 可知，生成了相對(duì)于反應(yīng)中使用的2-(2-(2，5_二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代 乙酰胺的量為96. 8%的2-(2-(2，5- 二甲基苯氧基甲基)苯基)_N_甲基-2-羥基乙酰胺。 另外，在下述條件下測(cè)定有機(jī)層中2-(2-(2，5- 二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-羥 基乙酰胺的光學(xué)純度，結(jié)果(R)體為100% e. e.。(含量分析條件)柱SUMICHIRALODS A-212流動(dòng)相A液0. 三氟乙酸水溶液，B液含有0. 三氟乙酸的乙腈溶液時(shí)間(分鐘) A液(％ ) B液(％ )080 202010 90301 9930. 180 20流量0.5ml/分鐘柱溫40°C檢測(cè)290nm
(光學(xué)純度測(cè)定條件)柱CHIRALCELOD-H流動(dòng)相己烷2-丙醇=9 1分析時(shí)間50分鐘流量0.5ml/ 分鐘
柱溫40°C檢測(cè):230nm實(shí)施例4 (本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的還原反應(yīng)例(之三))使用質(zhì)粒pTrcRs對(duì)大腸桿菌HBlOl進(jìn)行轉(zhuǎn)化。得到的轉(zhuǎn)化體接種于含有0. ImM 的IPTG和50 μ g/ml氨芐青霉素的無(wú)菌LB培養(yǎng)基(5ml)中，振蕩培養(yǎng)(371、15小時(shí))。離 心分離所得培養(yǎng)液，得到濕菌體約0. Igo在得到的濕菌體中混合2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基 甲基)苯基)-2-氧代乙酸甲酯3mg、NADPH 13. 5mg、IOOmM磷酸緩沖液(ρΗ7· 0) 1. 5ml、乙酸 丁酯0. 15ml，在30°C攪拌24小時(shí)。然后，在反應(yīng)液中添加乙酸乙酯2ml后進(jìn)行離心分離， 得到有機(jī)層。在下述條件下通過(guò)液相色譜對(duì)該有機(jī)層進(jìn)行含量分析，結(jié)果可知，生成了相對(duì) 于反應(yīng)中使用的2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基甲基)苯基)-2_氧代乙酸甲酯的量為28.8% 的2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基甲基)苯基)-2_羥基乙酸甲酯。另外，在下述條件下測(cè)定有 機(jī)層中2-(2-(2，5_ 二甲基苯氧基甲基)苯基)-2_羥基乙酸甲酯的光學(xué)純度，結(jié)果(R)體 為 100% e. e.。(含量分析條件)柱SUMICHIRALODS A-212流動(dòng)相A液0. 三氟乙酸水溶液，B液含有0. 三氟乙酸的乙腈溶液時(shí)間(分鐘) A液(％ ) B液(％ )080 202010 90301 9930. 180 20流量0.5ml/分鐘柱溫40°C檢測(cè)290nm(光學(xué)純度測(cè)定條件)柱CHIRALCELOD-H流動(dòng)相己烷2-丙醇=9 1分析時(shí)間50分鐘流量0.5ml/ 分鐘柱溫40°C檢測(cè):230nm實(shí)施例5 (本發(fā)明蛋白質(zhì)的各種性質(zhì))(1)本發(fā)明蛋白質(zhì)的制備使用質(zhì)粒pTrcRs對(duì)大腸桿菌HBlOl進(jìn)行轉(zhuǎn)化。得到的轉(zhuǎn)化體接種于含有0. ImM的IPTG和SOyg/ml氨芐青霉素的無(wú)菌LB培養(yǎng)基(100mlX8)中，振蕩培養(yǎng)(37 °C、 13.5小時(shí))。離心分離所得培養(yǎng)液，得到濕菌體約5. 4g。將濕菌體約5.4g懸浮于20mM 磷酸鉀緩沖液(PH7. 0) 20ml中，用Multi-Beads Shocker (安井器械公司制，玻璃珠 0. Imm0,2500rpm,20分鐘)破碎。離心分離(8000rpm、4°C、10分鐘)所得破碎液，再將 上清用過(guò)濾器(0.45μπι)過(guò)濾，得到離心上清液約18ml。所得離心上清液使用Amicon Ultra-4(MILLIP0RE公司制)濃縮，得到約4ml的離心上清濃縮液。使得到的離心上清濃縮液約4ml在親和層析柱[HiTrap BlueHP (安發(fā)瑪西亞生物 技術(shù)公司制)][用20mM磷酸鉀緩沖液(pH7. 0)平衡]上展開，以溶解有氯化鈉的磷酸鉀緩 沖液(氯化鈉濃度0 — 1. 2M的濃度梯度)作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，作為具有還原酶活性的組 分，得到氯化鈉濃度0. 01 0. 34M的組分約6ml。使用Amicon Ultra-4 (MILLIP0RE 公司制)濃縮該洗脫組分，并用20mM Tris-HCl 緩沖液(PH7. 5)進(jìn)行緩沖交換。將該濃縮液在離子交換層析柱[HiTrap DEAE Sepharose FF(安發(fā)瑪西亞生物技術(shù)公司制)][用Tris-HCl緩沖液(20mM、pH7. 5)平衡]上展開，以 溶解有氯化鈉的Tris-HCl緩沖液(氯化鈉濃度O — 0. 5M的濃度梯度)作為流動(dòng)相進(jìn)行洗 脫，作為具有還原酶活性的組分，得到氯化鈉濃度0. 1 0. 2M的活性組分2ml。使用Amicon Ultra-4(MILLIP0RE公司制)濃縮該洗脫組分，并用含有0. 15M 氯化鈉的50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)進(jìn)行緩沖交換。使該濃縮液通過(guò)凝膠過(guò)濾柱 [SuperdeX20010/300GL(安發(fā)瑪西亞生物技術(shù)公司制)][流動(dòng)相含有0. 15M氯化鈉的 50mM磷酸鈉緩沖液(ρΗ7. 0)]，作為具有還原酶活性的組分，得到分子量約32200道爾頓的 洗脫組分Iml (以下記為活性組分(C))。另外，關(guān)于在層析等中得到的組分，通過(guò)以下操作來(lái)測(cè)定還原酶活性。將2-(2-(2，5- 二甲基苯氧基甲基)苯基)_N_甲基_2_氧代乙酰胺3mg、通過(guò)層 析等得到的洗脫組分0. 2ml,NADPH 9mg、乙酸丁酯0. 15ml、IOOmM磷酸緩沖液(ρΗ7. 0) 1. 5ml 混合，在30°C攪拌18小時(shí)。然后，在反應(yīng)液中添加乙酸乙酯2ml后，離心分離，得到有機(jī)層。 在下述條件下通過(guò)液相色譜對(duì)該有機(jī)層進(jìn)行含量分析測(cè)定。由2-(2-(2，5-二甲基苯氧基 甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺的殘留量和(R)-2-(2-(2，5-二甲基苯氧基甲基)苯 基)-N-甲基-2-羥基乙酰胺的生成量，求出還原酶活性。(含量分析條件)柱SUMICHIRALODS A-212流動(dòng)相A液0. 三氟乙酸水溶液，B液含有0. 三氟乙酸的乙腈溶液時(shí)間(分鐘)A液(％ ) B液(％ )080 202010 90301 9930. 180 2流量0.5ml/ 分鐘柱溫40°C檢測(cè)290nm(2)本發(fā)明蛋白質(zhì)的酶化學(xué)性質(zhì)
使用活性組分(C)考察本發(fā)明蛋白質(zhì)的酶化學(xué)性質(zhì)。(1)作用以NADPH為輔酶，作用于2-(2-(2，5-二甲基苯氧基甲基)苯基)_N_甲基_2_氧 代乙酰胺，將其還原成光學(xué)純度為100% e.e.的(R)-2-(2-(2，5-二甲基苯氧基甲基)苯 基)-N-甲基-2-羥基乙酰胺。(2)最適 pH為考察作用最適pH，測(cè)定了 pH5.5 pHIO下的苯甲酰甲酸乙酯還原活性。作為 緩沖液，使用IOOmM磷酸緩沖液(pH5. 5 8)、100mM Tris-HCl緩沖液(pH7 9)和IOOmM Tris-甘氨酸緩沖液(pH9 10)。關(guān)于相對(duì)于苯甲酰甲酸乙酯的還原活性，在各種緩沖液 中溶解底物苯甲酰甲酸乙酯和輔酶NADPH，并使其終濃度分別為IOmM和0. 5mM，再添加已純 化的本發(fā)明蛋白質(zhì)(活性組分(C))，在30°C進(jìn)行反應(yīng)1分鐘，從此時(shí)該反應(yīng)液在波長(zhǎng)340nm 下吸光度的減小速度算出對(duì)苯甲酰甲酸乙酯的還原活性。在本反應(yīng)條件中，將1分鐘內(nèi)使 1 μ mol的NADPH氧化為NADP的活性定義為1個(gè)單位。結(jié)果，最適pH為7. 0。(3)底物特異性在IOOmM磷酸緩沖液(pH7)中溶解作為底物的羰基化合物和輔酶NADPH，并使其終 濃度分別為ImM和0.5mM。在其中添加已純化的本發(fā)明蛋白質(zhì)(活性組分(C))適當(dāng)量，在 30°C進(jìn)行反應(yīng)5分鐘。從該反應(yīng)液在波長(zhǎng)340nm下吸光度的減小速度算出對(duì)各羰基化合物 的還原活性，以對(duì)苯甲酰甲酸乙酯的活性為100%，將各還原活性的相對(duì)值示于表1。表 1 實(shí)施例6 (本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的還原反應(yīng)例(之四))(1)2-(2-甲基苯基)-2_氧代乙酸乙酯的合成在四氫呋喃50g和鎂7. 3g的混合液中添加2_溴甲苯4. 4g，使鎂活化。升溫到 40°C，滴加2-溴甲苯45g的四氫呋喃(130g)溶液，一直滴加到確認(rèn)2-溴甲苯消失。然后，冷卻到室溫，制備Grignard試劑。將草酸二乙酯83g的甲苯(170g)溶液冷卻到_40°C以下。在_40°C以下滴加上述 制備的Grignard試劑后，進(jìn)一步在_40°C下保溫2小時(shí)。在反應(yīng)混合物中添加10%硫酸 234g后，回收有機(jī)層。將得到的有機(jī)層用水134g洗滌后，用硫酸鎂干燥。用蒸發(fā)器濃縮后，進(jìn)一步在高真空下蒸餾，并進(jìn)行硅膠柱純化，得到33. Ig的2-(2-甲基苯基)-2-氧代乙酸乙酯。1H-NMR (300MHz, CDCl3) δ ppm 1. 41 (t、J = 7. 2Hz、3H)、2. 61 (s、3H)、
4.39-4. 47 (m、2H)、7. 26-7. 70 (m、4H)(2) 2-(2-甲基苯基)-N-甲基_2_氧代乙酰胺的合成將(1)中得到的2-(2_甲基苯基)-2_氧代乙酸乙酯18.化與甲苯728、甲醇368 混合，保溫于25°C的同時(shí)添加40%甲胺水溶液23. 2g，在25°C下保溫1小時(shí)。然后，添加水 36. 2g后，回收有機(jī)層。分別用5%鹽酸143g、飽和碳酸氫鈉水溶液36g、水36g洗滌后，用硫 酸鎂干燥。用蒸發(fā)器濃縮后，進(jìn)一步進(jìn)行硅膠柱純化，得到11. 4g的2-(2_甲基苯基)-N-甲 基-2-氧代乙酰胺。1H-NMR (300MHz、CDCl3) δ ppm 2. 48 (s、3H)、2. 96 (d、J = 5· 13Ηζ、3Η)、7· 1 (6s、 1H)、7. 25-7. 93(m、4H)(3)使用本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的2-(2-甲基苯基)-N-甲基_2_氧代乙酰胺的不對(duì)稱還原使用質(zhì)粒pTrcGSRs對(duì)大腸桿菌HBlOl進(jìn)行轉(zhuǎn)化。得到的轉(zhuǎn)化體接種于含有0. ImM 的IPTG和50 μ g/ml氨芐青霉素的無(wú)菌LB培養(yǎng)基(IOOml)中，振蕩培養(yǎng)(37°C、15小時(shí))。離 心分離所得培養(yǎng)液，得到濕菌體約0. 5g。在反應(yīng)管中添加2-(2-甲基苯基)-N-甲基-2-氧 代乙酰胺30mg、所述濕菌體約0. 5g、NADP+30mg、葡萄糖45mg、IOOmM磷酸緩沖液(pH7) 5ml, 以IOOOrpm的攪拌速度在30°C下反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)液中添加乙酸乙酯 5ml，然后離心分離(1000Xg、5分鐘)，由此回收有機(jī)層。蒸餾除去該有機(jī)層，得到油狀的 2- (2-甲基苯基)-N-甲基-2-羥基乙酰胺22. 5mg。得到的2- (2-甲基苯基)-N-甲基-2-羥 基乙酰胺的1H-NMR分析結(jié)果如下所示。1H-NMR(300MHz、CDCl3) σ 2. 37 (S、3H)、2. 79 (d、J = 4. 96Hz、3H)、3· 87 (IH)、
5.15 (SUH) ,6. 21(S、1H)、7. 15-7. 26(m、4H)在得到的2-(2_甲基苯基)-N-甲基-2-羥基乙酰胺中添加含有2_丙醇10%的 己烷，在下述條件下通過(guò)液相色譜進(jìn)行光學(xué)純度分析，結(jié)果光學(xué)純度為100% e. e.(洗脫時(shí) 間22· 5分鐘)。需要說(shuō)明的是，外消旋體的2-(2_甲基苯基)-N-甲基-2-羥基乙酰胺，通過(guò)將 2-(2-甲基苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺在甲醇中用NaBH4還原而合成。(光學(xué)異構(gòu)體分析條件)柱CHIRALPAKOD-H(Daieel 化學(xué)工業(yè)公司制)流動(dòng)相己烷/2-丙醇=90/10流量0.5ml/ 分鐘柱溫40°C檢測(cè)230nm洗脫時(shí)間
2-(2-甲基苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺16. 0分鐘2-(2-甲基苯基)-N-甲基-2-羥基乙酰胺18. 5分鐘、22. 4分鐘實(shí)施例7 (本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的還原反應(yīng)例(之五)) 除使用2-(2_甲基苯基)-2_氧代乙酸乙酯作為底物以外，通過(guò)與實(shí)施例6(3)中 記載的方法相同的方法進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果，得到油狀的2-(2_甲基苯基)-2_羥基乙酸乙酯 26. 5mg。得到的2-(2-甲基苯基)-2-羥基乙酸乙酯的1H-NMR分析結(jié)果如下所示。1H-Wr(SoomHzJDCI3) σ 1. 21 (t、J = 7. 2Ηζ、3Η)、2· 43 (S、3H)、3· 56 (d、J = 7. 7Hz、 1Η)、4. 13-4. 29(m、2H)、5. 35 (SUH)、7. 15-7. 30(m、4H)在得到的2- (2-甲基苯基)-2-羥基乙酸乙酯中，添加含有2-丙醇10 %的己烷，在 下述條件下通過(guò)液相色譜進(jìn)行光學(xué)純度分析，結(jié)果光學(xué)純度為99% e. e.(洗脫時(shí)間13.3 分鐘)。需要說(shuō)明的是，外消旋體的2-(2_甲基苯基)-2_羥基乙酸乙酯，通過(guò)將2-(2_甲 基苯基)-2-氧代乙酸乙酯在甲醇中用NaBH4還原而合成。(光學(xué)異構(gòu)體分析條件)柱CHIRALPAKOD-H(Daieel 化學(xué)工業(yè)公司制)流動(dòng)相己烷/2-丙醇=90/10流量0.5ml/分鐘柱溫40°C檢測(cè)230nm洗脫時(shí)間2-(2-甲基苯基)-2-氧代乙酸乙酯8.9分鐘2-(2-甲基苯基)-2-羥基乙酸乙酯11.6分鐘、13. 3分鐘實(shí)施例8 (本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的還原反應(yīng)例(之六))(1)2-(2-甲氧基甲基苯基)-2_氧代乙酸乙酯的合成將28 %甲醇鈉的甲醇溶液59. 8g升溫至60 V，滴加鄰溴芐基溴70. 4g和甲醇 70. 4g的混合液，在60°C保溫2小時(shí)。冷卻到室溫后，添加甲苯211g和水211g并攪拌，分 液后回收有機(jī)層。水層用甲苯211g萃取3次，加入回收的有機(jī)層和水211g，洗滌后濃縮，得 到55. 3g的1-甲氧基甲基-2-溴苯。在四氫呋喃46. 4g和鎂5. 4g的混合液中添加1_甲氧基甲基_2_溴苯4. 6g，使鎂 活化。升溫至40°C，滴加1-甲氧基甲基-2-溴苯41. 7g的四氫呋喃(139g)溶液，一直滴加 到確認(rèn)1-甲氧基甲基-2-溴苯消失。然后，冷卻到室溫，制備Grignard試劑。將草酸二乙酯64. 4g的甲苯(177g)溶液冷卻到_40°C以下。在_40°C以下滴加上 述制備的Grignard試劑后，進(jìn)一步在_40°C保溫4小時(shí)。在反應(yīng)混合物中添加10%硫酸 211g后，回收有機(jī)層。得到的有機(jī)層用水133g洗滌后，用硫酸鎂干燥。用蒸發(fā)器濃縮后，進(jìn) 行硅膠柱純化，進(jìn)一步在高真空下蒸餾，得到38. 5g的2-(2-甲氧基甲基苯基)-2-氧代乙 酸乙酯。1H-NMR(300MHz, CDCl3) δ ppm 1. 41 (t, J = 7. 08Hz、3H)、3. 44 (s、3H)、4. 41 (q、 2H)、4. 75 (s、2H)、7. 55-7. 69 (m、4H)(2) 2-(2-甲氧基甲基苯基)-N-甲基_2_氧代乙酰胺的合成
將(1)中得到的2-(2_甲氧基甲基苯基)-2_氧代乙酸乙酯28.3g與甲苯109g、 甲醇54. 4g混合，保溫于25°C的同時(shí)添加40%甲胺水溶液28. 6g，在25°C保溫2小時(shí)。然 后，添加水54. 4g后，補(bǔ)充添加甲苯80g，靜置后回收有機(jī)層。分別用5%鹽酸178g、飽和碳 酸氫鈉水溶液54. 4g、水54. 4g洗滌后，用蒸發(fā)器濃縮，得到12. Og的2_(2_甲氧基甲基苯 基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺。 1H-NMR(300MHz、CDCl3) δ ppm 2. 95 (d、J = 5. 14Ηζ、3Η)、3· 28(s、3H)、4· 66 (s、 2H)、7. 04 (s、1H)、7. 36-7. 72 (m、4H)(3)使用本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的2-(2-甲氧基甲基苯基)-N-甲基_2_氧代乙酰胺的不對(duì) 稱還原除使用2-(2_甲氧基甲基苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺作為底物以外，通過(guò)與 實(shí)施例6(3)中記載的方法相同的方法進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果，得到油狀的2-(2_甲氧基甲基苯 基)-N-甲基-2-羥基乙酰胺19. 5mg。得到的2- (2-甲氧基甲基苯基)-N-甲基-2-羥基乙 酰胺的1H-NMR分析結(jié)果如下所示。1H-NMR (300MHz、CDCl3) σ 2. 77 (d、J = 4· 85Ηζ、3Η)、3· 47 (S、3H)、4· 38 (d、 J = 10. 6Ηζ、1Η)、4· 73(d、J = 10. 6Hz、1Η)、4· 81 (S、1Η)、5· 23 (S、1Η)、7· 16 (S、1Η)、 7. 26-7. 43(m、4H)在得到的2-(2-甲氧基甲基苯基)-N-甲基-2-羥基乙酰胺中，添加含有2-丙 醇10 %的己烷，在下述條件下通過(guò)液相色譜進(jìn)行光學(xué)純度分析，結(jié)果光學(xué)純度為100 % e. e.(洗脫時(shí)間20. 3分鐘)。需要說(shuō)明的是，外消旋體的2-(2_甲氧基甲基苯基)-N-甲基-2-羥基乙酰胺，通 過(guò)將2-(2_甲氧基甲基苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺在甲醇中用NaBH4還原而合成。(光學(xué)異構(gòu)體分析條件)柱CHIRALPAKOD-H(Daieel 化學(xué)工業(yè)公司制)流動(dòng)相己烷/2-丙醇=90/10流量0·5ml/ 分鐘柱溫40°C檢測(cè):230nm洗脫時(shí)間2-(2-甲氧基甲基苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺18. 5分鐘2_(2_甲氧基甲基苯 基)-N-甲基-2-羥基乙酰胺20. 4分鐘、21. 0分鐘實(shí)施例9 (本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的還原反應(yīng)例(之七))除使用2-(2_甲氧基甲基苯基)-2_氧代乙酸乙酯作為底物以外，通過(guò)與實(shí)施例 6(3)中記載的方法相同的方法進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果，得到油狀的2-(2_甲氧基甲基苯基)-2_羥 基乙酸乙酯27. 6mg。得到的2-(2_甲氧基甲基苯基)_2_羥基乙酸乙酯的1H-NMR分析結(jié)果 如下所示。1H-NMR(300MHz, CDCl3) σ 1. 21 (t, J = 7· 09Ηζ、3Η)、3· 39 (S、3H)、4· 16-4. 26 (m、 2H)、4. 59 (d、J = 6. 36Hz、2H)、5. 39 (SUH)、7. 31-7. 37(m、4H)在得到的2-(2-甲氧基甲基苯基)-2_羥基乙酸乙酯中添加含有2-丙醇10%的 己烷，在下述條件下通過(guò)液相色譜進(jìn)行光學(xué)純度分析，結(jié)果光學(xué)純度為100% e. e.(洗脫時(shí)間13. 6分鐘)。需要說(shuō)明的是，外消旋體的2-(2_甲氧基甲基苯基)-2_羥基乙酸乙酯，通過(guò)將 2-(2-甲氧基甲基苯基)-2_氧代乙酸乙酯在甲醇中用NaBH4還原而合成。
(光學(xué)異構(gòu)體分析條件)柱CHIRALPAKOD-H(Daieel 化學(xué)工業(yè)公司制)流動(dòng)相己烷/2-丙醇=90/10流量0·5ml/ 分鐘柱溫40°C檢測(cè):230nm洗脫時(shí)間2-(2-甲氧基甲基苯基)-2-氧代乙酸乙酯9. 3分鐘2-(2-甲氧基甲基苯基)-2_羥基乙酸乙酯12. 8分鐘、13. 6分鐘工業(yè)上的可利用性根據(jù)本發(fā)明，能夠容易地得到光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物。序列表純文本序列編號(hào)5為PCR設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物序列編號(hào)6為PCR設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物序列編號(hào)8為PCR設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物序列編號(hào)9為PCR設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物序列編號(hào)10為PCR設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物序列編號(hào)11為PCR設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物序列編號(hào)12為PCR設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物序列編號(hào)I3為PCR設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物序列編號(hào)14為PCR設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物序列編號(hào)I5為PCR設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物序列編號(hào)I7為PCR設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物序列編號(hào)I8為PCR設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物
序列編號(hào)I9 為PCR設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物
權(quán)利要求
一種由下述a)～d)中的任何堿基序列構(gòu)成的DNA，a)編碼用序列編號(hào)1表示的氨基酸序列的堿基序列；b)i)相對(duì)于由編碼序列編號(hào)1所示的氨基酸序列的堿基序列構(gòu)成的DNA具有至少90％序列同源性的DNA的堿基序列，并且ii)是對(duì)如下所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行編碼的堿基序列，所述蛋白質(zhì)具有將鄰位取代的苯乙醛酸化合物不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸的酰胺或酯化合物的能力；c)i)在嚴(yán)格條件下與由編碼序列編號(hào)1所示的氨基酸序列的堿基序列構(gòu)成的DNA雜交的DNA的堿基序列，并且ii)是對(duì)如下所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行編碼的堿基序列，所述蛋白質(zhì)具有將鄰位取代的苯乙醛酸的酰胺或酯化合物不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸的酰胺或酯化合物的能力；和d)用序列編號(hào)2表示的堿基序列。
2.—種DNA，其特征在于，以能夠發(fā)揮功能的形式將能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能的啟 動(dòng)子與權(quán)利要求1所述的DNA連接而形成。
3.一種重組載體，其特征在于，包含權(quán)利要求1或2所述的DNA。
4.一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，通過(guò)將權(quán)利要求2所述的DNA或權(quán)利要求3所述的重組載 體導(dǎo)入宿主細(xì)胞而形成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，宿主細(xì)胞為微生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
7.一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的DNA。
8.一種轉(zhuǎn)化體的制造方法，其特征在于，包括將權(quán)利要求3所述的重組載體導(dǎo)入宿主 細(xì)胞的步驟。
9.一種由下述a) e)中的任何氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)，a)用序列編號(hào)1表示的氨基酸序列；b)i)相對(duì)于由序列編號(hào)2所示的堿基序列構(gòu)成的DNA具有至少90%序列同源性的DNA 的堿基序列所編碼的氨基酸序列，并且ii)是如下所述的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，所述蛋白 質(zhì)具有將鄰位取代的苯乙醛酸化合物不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯 乙醇酸化合物的能力；c)i)在嚴(yán)格條件下與由序列編號(hào)2所示的堿基序列構(gòu)成的DNA雜交的DNA的堿基序列 所編碼的氨基酸序列，并且ii)是如下所述的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，所述蛋白質(zhì)具有將鄰 位取代的苯乙醛酸化合物不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合 物的能力；d)i)用序列編號(hào)1表示的氨基酸序列中缺失、置換或附加1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸 序列，并且ii)是如下所述的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，所述蛋白質(zhì)具有將鄰位取代的苯乙醛 酸化合物不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的能力；和e)i)與序列編號(hào)1所示的氨基酸序列的序列同源性至少為90%的氨基酸序列，并且 ii)是如下所述的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，所述蛋白質(zhì)具有將鄰位取代的苯乙醛酸化合物不 對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的能力。
10.一種重組載體，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的DNA和具有對(duì)如下所述蛋白質(zhì) 的氨基酸序列進(jìn)行編碼的堿基序列的DNA，所述蛋白質(zhì)具有將氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉(zhuǎn)換為還原型的能力。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組載體，其特征在于，所述具有將氧化型β-煙酰胺腺嘌 呤二核苷酸或氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉(zhuǎn)換為還原型的能力的蛋白質(zhì)為葡 萄糖脫氫酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的重組載體，其中，所述具有葡萄糖脫氫酶活性的蛋白質(zhì)為 巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)來(lái)源的葡萄糖脫氫酶。
13.一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，通過(guò)將權(quán)利要求10 12所述的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞 而得到。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，宿主細(xì)胞為微生物。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
16.一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的DNA和具有對(duì)如下所述蛋白質(zhì)的 氨基酸序列進(jìn)行編碼的堿基序列的DNA，所述蛋白質(zhì)具有將氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核 苷酸或氧化型β“煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉(zhuǎn)換為還原型的能力。
17.一種光學(xué)活性醇的制造方法，其特征在于，使權(quán)利要求9所述的蛋白質(zhì)、或權(quán)利要 求4 7、13 16中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體、或其處理物，與前手性羰基化合物反應(yīng)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的制造方法，其中，前手性羰基化合物為鄰位取代的苯乙醛 酸的酰胺或酯化合物，對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的醇化合物為光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸的酰 胺或酯化合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的制造方法，其中，鄰位取代的苯乙醛酸的酰胺或酯化合物 為式(1)所示的化合物，光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸的酰胺或酯化合物為式(2)所示 的光學(xué)活性化合物， 式(1)中，R1表示可被取代的氨基或可被取代的烷氧基，R2表示可被取代的C1-8烷基， 式(2)中，禮和1 2表示與上述相同的含義，帶*標(biāo)記的碳原子為手性碳原子。
20.寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonassp.) SC-I (FERM BP-10785)。
全文摘要
本發(fā)明提供能夠?qū)⑧徫蝗〈谋揭胰┧峄衔锊粚?duì)稱還原而在工業(yè)上有利地制造對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸的酰胺或酯化合物的蛋白質(zhì)、編碼該蛋白質(zhì)的DNA、從該DNA制造該蛋白質(zhì)的方法以及使用該蛋白質(zhì)將鄰位取代的苯乙醛酸化合物不對(duì)稱還原從而制造對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的方法等。
文檔編號(hào)C12N1/19GK101849000SQ200880016678
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2008年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月22日
發(fā)明者朝子弘之 申請(qǐng)人:住友化學(xué)株式會(huì)社