專(zhuān)利名稱(chēng)：：與控制可變剪接的核糖開(kāi)關(guān)有關(guān)的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本文公開(kāi)的發(fā)明主要涉及基因表達(dá)領(lǐng)域,具體涉及基因表達(dá)調(diào)節(jié)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：精確遺傳控制是活體系統(tǒng)的一個(gè)基本特征，因?yàn)榧?xì)胞必須通過(guò)改變基因表達(dá)模式來(lái)對(duì)多種生化信號(hào)和環(huán)境信號(hào)作出應(yīng)答。大多數(shù)已知的遺傳控制機(jī)制涉及到蛋白因子的使用，所述蛋白因子會(huì)感受到化學(xué)或物理剌激，然后通過(guò)與相關(guān)DNA或信使RNA序列選擇性相互作用來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。蛋白可采用復(fù)雜形狀并行使使活體系統(tǒng)可準(zhǔn)確地感受到它們的化學(xué)和物理環(huán)境的多種功能。對(duì)代謝物有應(yīng)答的蛋白因子通常通過(guò)結(jié)合DNA以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始(如Iac阻遏蛋白；Matthews,K.S.,andNichols,J.C.,1998，Prog.NucleicAcidsRes.Mol.Biol.58，127-164)或通過(guò)結(jié)合RNA以控制轉(zhuǎn)錄終止(如PyrR蛋白；Switzer,R.L.，etal.,1999,Prog.NucleicAcidsRes.Mol.Biol.62,329-367)或翻譯(如TRAP蛋白；Babitzke,P.,andGol!nick,P.，2001’j.Bacteriol.183，5795-5802)來(lái)發(fā)揮作用。蛋白因子通過(guò)多種機(jī)制如變構(gòu)調(diào)節(jié)或翻譯后修飾來(lái)應(yīng)答于環(huán)境剌激,并擅長(zhǎng)利用這些機(jī)制來(lái)作為高反應(yīng)性遺傳幵關(guān)(如參見(jiàn)Ptashne，M.，andGann,Α.(2002).GenesandSignals.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。除了蛋白質(zhì)因子廣泛參與基因控制之外，還已知RNA也可在基因調(diào)節(jié)中有活躍的作用。最近的研究逐漸揭示出小的非編碼RNA在選擇性靶向和破壞mRNA從而導(dǎo)致基因表達(dá)的下調(diào)方面的重要作用(參見(jiàn)例如Hannon,GJ.2002，Nature418，244-251和該文章的參考文獻(xiàn))。這種RNA干擾過(guò)程利用了短RNA通過(guò)Watsor^Crick堿基互補(bǔ)而選擇性識(shí)別目標(biāo)mRNA靶標(biāo)的能力，在該過(guò)程之后被結(jié)合的mRNA通過(guò)蛋白質(zhì)的作用而被破壞。在這一系統(tǒng)中RNA為分子識(shí)別的理想媒介物，因?yàn)橥ㄟ^(guò)進(jìn)化過(guò)程產(chǎn)生新的靶標(biāo)特異性RNA因子要比產(chǎn)生具有新的高特異性RNA結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)因子容易得多。雖然蛋白質(zhì)可以滿(mǎn)足生物學(xué)對(duì)于酶、受體和結(jié)構(gòu)功能的大部分需求，但是RNA也具有這些能力。例如,RNA具有足夠的結(jié)構(gòu)塑性，能形成多種具有很高的酶活力和精確的分子識(shí)別能力的核酶結(jié)構(gòu)域(Cech&Golden,BuildingacatalyticactivesiteusingonlyRNA.In:TheRNAWorldR.F.Gesteland,T.R.Cech,J.F.Atkins,eds.，pp.321-350(1998)；Breaker,InvitroselectionofCcitcilyticpolynucleotides.Chem.Rev.97,371-390(1997))和受體結(jié)構(gòu)域(Osborne&Ellington,Nucleicacidselectionandthechallengeofcombinatorialchemistry.Chem.Rev.97，349-370(1997)；Hermann&Patel,Adaptiverecognitionbynucleicacidadapters.Science287，820-825(2000))。此夕卜，上述能力還可以組合產(chǎn)生可被效應(yīng)物分子選擇性調(diào)節(jié)的變構(gòu)核酶(Smikup&Breaker，EngineeringprecisionRNAmolecularswitches.Proc.Natl.Acad.Sci.USA96，3584-3589(1999)；Seetharamanetal.，Immobilizedriboswitchesfortheanalysisofcomplexchemicalandbiologicalmixtures.NatureBiotechnol,19,336-341(2001))0可變剪接過(guò)程涉及raRNA前體上剪接位點(diǎn)的選擇性使用?？勺兗艚邮沟每蓮膯蝹€(gè)基因產(chǎn)生多種蛋白，從而使得產(chǎn)生具有不同功能的蛋白?？勺兗艚邮录赏ㄟ^(guò)多種方式出現(xiàn)，包括外顯子跳躍、相互排斥的外顯子的使用以及5‘和/或3‘剪接位點(diǎn)的差異選擇。對(duì)于許多基因來(lái)說(shuō)(例如同源基因、癌基因、神經(jīng)肽、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和肌肉收縮蛋白)，可變剪接以發(fā)育或組織特異的方式調(diào)控。因此，可變剪接在基因表達(dá)中起到關(guān)鍵的作用。最近的研究已揭示出可變剪接在復(fù)雜生物體的表達(dá)策略中的重要性。mRNA前體(mRNAprecursor)(mRNA前體(pre-mRNA))的可變剪接在調(diào)控哺乳動(dòng)物基因表達(dá)中起到重要作用?？勺兗艚拥恼{(diào)節(jié)出現(xiàn)在多種譜系的細(xì)胞中，并且是大量基因的表達(dá)程序的一部分。最近，已經(jīng)逐漸明確的是,可變剪接可控制蛋白同種形的產(chǎn)生,所述同種型有時(shí)具有完全不同的功能。在細(xì)胞轉(zhuǎn)化方面具有不同性質(zhì)且有時(shí)具有相對(duì)性質(zhì)的癌基因和原癌基因蛋白同種型經(jīng)由可變剪接產(chǎn)生。這類(lèi)基因的實(shí)例見(jiàn)Makela，T.P.etal.1992，Science256373；Yen,J.etal.1991,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.885077；Mumberg,D.etal.1991,GenesDev.51212；FouIkes,N.S.andSassone-Corsi,P.1992,Cell68411。同時(shí),可變剪接經(jīng)常用于控制在程序性細(xì)胞死亡中涉及的蛋白的產(chǎn)生,所述蛋白例如Fas、Bcl_2、Bax禾口Ced_4(Jiang,Ζ.H.andWuJ.Y.，1999,ProcSocExpBiolMed22064)。mRNA前體的可變剪接可產(chǎn)生一種阻遏蛋白，而在不同條件下可從相同mRNA前體產(chǎn)生一種激活子(BlackI).L.2000,Cell103367；Graveley,B.R.2001,TrendsGenet.17100)。本領(lǐng)域需要可以用于經(jīng)核糖開(kāi)關(guān)(riboswitch)調(diào)節(jié)可變剪接的方法和組合物。
發(fā)明內(nèi)容本文公開(kāi)了一種可調(diào)節(jié)的基因表達(dá)構(gòu)建體,所述構(gòu)建體包含一個(gè)編碼如下一種RNA的核酸分子,所述RNA包含可操作地連接于--個(gè)編碼區(qū)的核糖開(kāi)關(guān),其中所述核糖開(kāi)關(guān)調(diào)節(jié)所述RNA的剪接，其中所述核糖開(kāi)關(guān)和編碼區(qū)是異源的。所述核糖幵關(guān)可調(diào)節(jié)所述RNA的可變剪接。所述核糖開(kāi)關(guān)可包含適體(aptamer)結(jié)構(gòu)域和表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域，其中所述適體結(jié)構(gòu)域和所述表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域是異源的。所述RNA可進(jìn)一步包含一個(gè)內(nèi)含子,其中所述表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域在所述內(nèi)含子中包含--個(gè)可變剪接點(diǎn)。所述RNA可進(jìn)一步包含--個(gè)內(nèi)含子，其中所述表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域在所述內(nèi)含子的一端包含一個(gè)剪接點(diǎn)(即，5'剪接點(diǎn)或3'剪接點(diǎn))。所述RNA可進(jìn)一步包含一個(gè)內(nèi)含子，其中所述表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域在所述內(nèi)含子中包含分支位點(diǎn)。所述可變剪接點(diǎn)可在所述核糖開(kāi)關(guān)被激活時(shí)具有活性。所述可變剪接點(diǎn)可在所述核糖開(kāi)關(guān)未被激活時(shí)具有活性。所述核糖開(kāi)關(guān)可由觸發(fā)分子例如硫胺素焦磷酸(TPP)激活。所述核糖幵關(guān)可以是一種TPP-應(yīng)答性核糖幵關(guān)。所述核糖幵關(guān)可激活可變剪接。所述核糖開(kāi)關(guān)可抑制可變剪接。所述核糖開(kāi)關(guān)可改變RNA的剪接。所述RNA可具有分支結(jié)構(gòu)(branchedstructure)。所述RNA可以是mRNA前體。控制剪接的適體區(qū)域可位于例如P4莖和P5莖。控制剪接的適體區(qū)域還可出現(xiàn)于例如環(huán)5?？刂萍艚拥倪m體區(qū)域還可出現(xiàn)于例如莖P2。因此，表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域例如可與P4和P5序列、環(huán)5序列和/或P2序列相互作用。僅當(dāng)觸發(fā)分子未結(jié)合于上述適體結(jié)構(gòu)域時(shí)，所述適體序列通常才可用于與所述表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域相互作用。例如,所述剪接位點(diǎn)和/或分支位點(diǎn)可位于相對(duì)于所述適體5_'端-6至-24之間的位置。例如，所述剪接位點(diǎn)可接在序列GUA之后。還公開(kāi)了一種用于調(diào)節(jié)RNA剪接的方法，包括將包含核糖開(kāi)關(guān)的構(gòu)建體導(dǎo)入所述RNA,其中所述核糖開(kāi)關(guān)能夠調(diào)節(jié)RNA剪接。所述核糖開(kāi)關(guān)可包含一個(gè)適體結(jié)構(gòu)域和一個(gè)表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域，其中所述適體結(jié)構(gòu)域和所述表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域是異源的。所述核糖開(kāi)關(guān)可在所述RNA的內(nèi)含子內(nèi)。所述核糖幵關(guān)可由觸發(fā)分子例如TPP激活。所述核糖幵關(guān)可以是一種TPP應(yīng)答性核糖開(kāi)關(guān)。所述核糖開(kāi)關(guān)可激活可變剪接。所述核糖開(kāi)關(guān)可抑制可變剪接。所述核糖開(kāi)關(guān)可改變RNA的剪接。所述剪接可以非天然地發(fā)生?？刂瓶勺兗艚拥倪m體區(qū)域可出現(xiàn)于例如環(huán)5?？刂瓶勺兗艚拥倪m體區(qū)域可出現(xiàn)于例如莖P2。例如,所述剪接位點(diǎn)可位于相對(duì)于所述適體5'端-6至-24之間的位置。例如，所述剪接位點(diǎn)可在所述適體中的序列GUA之后。還公開(kāi)了一種抑制真菌生長(zhǎng)的方法，所述方法包括識(shí)別感染真菌的受試者；給與所述受試者有效量的抑制TPP-應(yīng)答性核糖開(kāi)關(guān)的化合物,從而抑制真菌生長(zhǎng)。抑制真菌生長(zhǎng)可包括真菌生物量減少10%或更多。所公開(kāi)的方法和組合物的其他優(yōu)點(diǎn)一部分將在下文的描述中闡明，一部分可以從說(shuō)明書(shū)中獲知，或者可通過(guò)實(shí)施公開(kāi)的方法和組合物而得知。所公開(kāi)的方法和組合物的優(yōu)點(diǎn)將通過(guò)所附權(quán)利要求書(shū)中具體指明的要素和組合實(shí)現(xiàn)和獲得。應(yīng)當(dāng)理解的是,上文的--般性描述和F文的具體描述都僅僅是示例性和解釋性的，并不是對(duì)本發(fā)明要求保護(hù)范圍的限制。附圖包含于本說(shuō)明書(shū)中并作為本說(shuō)明書(shū)的一部分，附圖闡述了所公幵方法和組合物的一些實(shí)施方案，它與文字描述一起作為對(duì)所公開(kāi)方法和組合物的原理的解釋。圖1所示為三個(gè)粗糙脈孢菌(N.crassa)基因在5'內(nèi)含子中攜帶TPP核糖開(kāi)關(guān)。a,前體5'UTR(I-I)和NMTlmRNA的可變剪接產(chǎn)物(1_2和1-3)。外顯子和內(nèi)含子分別為深灰色和無(wú)陰影/淺灰色矩形。示出了5'(GU)和3'(AG)剪接位點(diǎn)、推定的起始密碼子(*)以及來(lái)自u(píng)ORF和主NMTlORF的相應(yīng)翻譯產(chǎn)物。b和c,前體mRNAs的5‘UTR以及它們的ΤΙ4和NCUO1977.1的各剪接產(chǎn)物。d,對(duì)來(lái)自在不存在(-)或存在(+)30μM硫胺素條件下培養(yǎng)的粗糙脈孢菌mRNA5'區(qū)的RT-PCR檢測(cè)。THI4的帶II_3a和II_3b表示保留(3a)或去除(3b)....Ll游內(nèi)含子的剪接形式11-3。標(biāo)記DNA(M)以100個(gè)堿基對(duì)遞增。圖2所示為NMTlTPP核糖開(kāi)關(guān)對(duì)可變剪接和基因的控制。a,在培養(yǎng)于無(wú)硫胺素的培養(yǎng)基中的粗糙脈孢菌培養(yǎng)物中添加30μM:硫胺素(t=0)之后,NMTl轉(zhuǎn)錄物剪接(RT-PCR產(chǎn)物)的變化。b,融合于螢光素酶(LUC)ORF上游的野生型(WT)或多種突變型NMTl核糖開(kāi)關(guān)(Ml至M10)的報(bào)告物構(gòu)建體(SEQIDNO:1和2)。c,....丨二圖來(lái)自WT-LUC構(gòu)建體(標(biāo)準(zhǔn)化RLU=ι)的相對(duì)光單位(RLU)與在不存在(實(shí)心圓)或存在(空心圓)30μM硫胺素條件下培養(yǎng)的多種突變型NMTl-LUC構(gòu)建體之間的比較。值是3次獨(dú)立的重復(fù)測(cè)定的平均值，標(biāo)準(zhǔn)差誤差棒小于這些符號(hào)的直徑。下圖對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)化體，對(duì)來(lái)自L(fǎng)UC融合物(上部分)和天然NMTlRNA(下部分)的5'UTR進(jìn)行的RT-PCR分析。詳情在圖1中描述。圖3所示為在未剪接的和可變剪接的mRNA中的短uORF可引起NMTl抑制。a,野生型和突變型構(gòu)建體融合至LUC報(bào)告物以刺激未剪接的RNA(I-IR)和剪接的RNA(I_2R和I-3R)。b，(上圖)培養(yǎng)基中不存在(_，實(shí)心柱)或存在(+，空心柱)30μΜ硫胺素時(shí)的LUC活性。表達(dá)相對(duì)于未添加硫胺素的野生型HR構(gòu)建體的值標(biāo)準(zhǔn)化。值是3次獨(dú)立的重復(fù)測(cè)定的平均值，并顯示標(biāo)準(zhǔn)差誤差棒。(下圖)對(duì)于無(wú)(-)或有(+)硫胺素條件下培養(yǎng)的粗糙脈孢菌，對(duì)LUC融合物(上部分)和天然NMTl(下部分)轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行的RT-PCR分析。其他注釋如在圖2c的圖注中描述。圖4所示為粗糙脈孢菌中TPP核糖開(kāi)關(guān)介導(dǎo)的mRNA可變剪接的機(jī)制。a，在第二5'剪接位點(diǎn)附近TPP-誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)調(diào)整。5'32P-標(biāo)記的273NMT1RNA(-78至195位核苷酸)的自發(fā)切割產(chǎn)物通過(guò)PAGE分離并定量，以顯示結(jié)構(gòu)中ΙΟμΜTPP-介導(dǎo)的變化的定位。b，某些Ρ4-Ρ5核苷酸與TPP調(diào)節(jié)的第二5'剪接位點(diǎn)附近的核苷酸互補(bǔ)(SEQIDNO:3_4)。c,核糖開(kāi)關(guān)控制NMTl表達(dá)的機(jī)制,其中關(guān)鍵剪接決定子在適體不同的占位狀態(tài)時(shí)被激活或者被抑制。圖5所示為3種細(xì)菌的和23種真菌的TPP核糖開(kāi)關(guān)適體(SEQIDNO:5_30)的序列比對(duì)結(jié)果。突出顯示區(qū)對(duì)應(yīng)于配對(duì)莖，所述配對(duì)莖由頂部的箭頭圖指示。圖6所示為來(lái)自粗糙脈孢菌的3種TPP核糖開(kāi)關(guān)的前后序列。AUG代表主起始密碼子表示可變剪接起始密碼子(不在主ORF中)；■和表明5'剪接位點(diǎn)；且■表明3'剪接位點(diǎn)。對(duì)于每個(gè)基因，加陰影的核苷酸標(biāo)識(shí)內(nèi)含子，內(nèi)含子的加深陰影區(qū)域表示TPP適體(SEQIDNO:31-33)。M表示存在于數(shù)據(jù)庫(kù)中的NCUO1977.1的預(yù)測(cè)3'剪接位點(diǎn)，該位點(diǎn)基于測(cè)序剪接產(chǎn)物未被使用。_表示除非發(fā)生剪接否則將終止翻譯的NCU01977.1中的終止密碼子。圖7示出剪接中硫胺素依賴(lài)的變化需要TPP核糖開(kāi)關(guān)。對(duì)來(lái)自培養(yǎng)于不存在(_)或存在(+)30μM硫胺素的基本培養(yǎng)基中的脈孢菌a,FREQUENCY(FRQ)和b,NMTl轉(zhuǎn)錄物的可變剪接5‘區(qū)進(jìn)行的RT-PCR分析。對(duì)每種mRNA進(jìn)行2次重復(fù)描述。FRQ(a、b和c)的不同剪接形式——如以前報(bào)道——在硫胺素處理后相對(duì)于彼此之間無(wú)數(shù)目變化。使用引物5'-CATTGCAMAACGGCATTGGA(SEQIDNO:34)禾口5'-TGTGGGGACTTTTCATGATAC(SEQIDNO35)產(chǎn)生FRQ的RT-PCR產(chǎn)物。使用瓊脂糖凝膠(2%)電泳分離產(chǎn)物。“M”表示包含以100個(gè)堿基對(duì)遞增的DNA的分子大小標(biāo)記物。DNA通過(guò)溴化乙錠染色和UV光照顯示。圖8所示為T(mén)PP與NMTlmRNA的結(jié)合。a，MTl核糖幵關(guān)適體(SEQIDNO:36，代表115NMTl適體)的序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)和TPP誘導(dǎo)的調(diào)整。該模型改良自以前出現(xiàn)過(guò)的模型，以反映可用的原子分辨率的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。構(gòu)建體197NMTl包括天然的P3莖(圖9)，而該莖中第82位核苷酸在構(gòu)建體115NMTl中被刪除。位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)調(diào)整通過(guò)對(duì)b中描述的115NMTl的直讀探測(cè)(in-lineprobing)確立。SEQIDNO:36的核苷酸30、31、43、44、54、56、71和93呈現(xiàn)切割不變。SEQIDNO:36的核苷酸13-16、22、27、49-53、55、63、65、69、77-81、86和87出現(xiàn)切割減少。SEQIDNO36的核苷酸62,64和88出現(xiàn)切割增加。b,115MTl的直讀探測(cè)分析揭示TPP-誘導(dǎo)的RNA結(jié)構(gòu)調(diào)整,其中位點(diǎn)1和2被用于定量分析C中的配體親和力。泳道包括在無(wú)反應(yīng)后(NR)、在以RNA酶Tl部分消化后(Tl)或者在以堿部分消化后(OH)加樣的前體RNA。進(jìn)行U2G改變以有利于通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄進(jìn)行制備。c，該曲線(xiàn)描繪了標(biāo)準(zhǔn)化的RNA自發(fā)切割分?jǐn)?shù)相對(duì)于b中描述位點(diǎn)1和2的TTP濃度對(duì)數(shù)變化。圖9所示為構(gòu)建體197MTl的伸展P3莖的序列和直讀探測(cè)結(jié)果。陰影的核苷酸代表在不存在和存在最多至ImMTPP(SEQIDNO37)下RNA中都發(fā)生自發(fā)分裂的位置。圖10示出了261NMTlRNA構(gòu)建體的直讀探測(cè)分析顯示出在分支位點(diǎn)處的輕度結(jié)構(gòu)改變。a，來(lái)自使用5'32P-標(biāo)記261NMTlRNA(核苷酸1.1至270加另外的5'G以有利于體外轉(zhuǎn)錄)進(jìn)行的直讀探測(cè)測(cè)定法的自發(fā)RNA切割產(chǎn)物的PAGE分離。對(duì)帶強(qiáng)度定量,以顯示10μMTPP-介導(dǎo)的RNA結(jié)構(gòu)改變的定位。另外的詳情見(jiàn)圖4和圖8的圖例。圖11所示為，在不存在TPP的情況下，273NMTl野生型(WT)和Μ9麗TlRNA構(gòu)建體的直讀探測(cè)分析顯示出在第二5'剪接位點(diǎn)處的差異。a,來(lái)自使用如所示的5'32P-標(biāo)記的WT和M9273NMTlRNA(核苷酸-78至195)進(jìn)行的直讀探測(cè)測(cè)定的自發(fā)RNA切割產(chǎn)物的PAGE分離。b，測(cè)定帶的相對(duì)強(qiáng)度，以顯示M9中由導(dǎo)入突變?cè)斐傻南鄬?duì)于WT的結(jié)構(gòu)改變。另外的詳情見(jiàn)圖8和圖9的圖例。注意到，M9的核苷酸-14、-13和-12呈現(xiàn)大量的自發(fā)切割，并且相對(duì)于WT構(gòu)建體可以是非配對(duì)的，而WT構(gòu)建體在不存在TPP的情況下僅核苷酸-13被預(yù)計(jì)是非配對(duì)的。圖12所示為第二5'剪接位點(diǎn)的側(cè)翼區(qū)和來(lái)自多種真菌種的NMTl基因的TPP適體(SEQIDNO:38-43和96-101)之間的可變堿基配對(duì)。a，來(lái)自粗糙脈孢菌的NMTl基因的圖式表示。兩個(gè)可變5'剪接位點(diǎn)、分支位點(diǎn)和3'剪接位點(diǎn)以相對(duì)于TPP適體和主ORF的位置示出。橙色陰影的核苷酸標(biāo)識(shí)出在第二5’剪接位點(diǎn)側(cè)翼的序列和所述適體中的同源區(qū)域之間可能的堿基配對(duì)。b-f，對(duì)于來(lái)自不同真菌種的NMTl基因，鄰接適體和適體部分的推定5’剪接位點(diǎn)的周?chē)鷧^(qū)的互補(bǔ)序列。有可變堿基配對(duì)可能性的適體區(qū)域主要位于P4莖和P5莖的一側(cè),但在某些情形下還可擴(kuò)展至環(huán)5和莖P2。推定的可變5’剪接位點(diǎn)位于相對(duì)于所述適體5’端-6和-24之間的位置。所標(biāo)明的剪接位點(diǎn)的使用通過(guò)來(lái)自脈孢菌(見(jiàn)圖1)和米曲霉(Aspergillusoryzae)(b，AB226284)的NMTl基因的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)確認(rèn)。對(duì)于一些基因，在互補(bǔ)區(qū)中的共有序列“GUA”后出現(xiàn)了多個(gè)潛在5’剪接位點(diǎn)。圖13示出TPP核糖開(kāi)關(guān)在粗糙脈孢菌NCU01977.IraRNA中的基因激活。在粗糙脈孢菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，在不存在或存在30μΜ硫胺素的條件下下的LUC活性(a)以及天然NCU01977.1和NMTl轉(zhuǎn)錄物的核糖幵關(guān)區(qū)域的RT-PCR分析(b)。將粗糙脈孢菌以這樣的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化并在不存在硫胺素的條件下《過(guò)夜培養(yǎng)，即該構(gòu)建體包含與LUC報(bào)告基因按閱讀框融合的NCU01977.1包括起始密碼子的5'部分。然后將真菌組織轉(zhuǎn)移至無(wú)(Oh)或有30μΜ硫胺素的新鮮培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)24h。在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)從培養(yǎng)于不存在硫胺素(_)和添加硫胺素⑴后24h的培養(yǎng)物取樣。LUC活性相對(duì)于t=Oh下的測(cè)量值標(biāo)準(zhǔn)化。對(duì)天然轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行RT-PCR分析。M表示以IOObp遞增的大小標(biāo)記物,底部帶代表lOObp。在不加入硫胺素的情況下存在大量剪接產(chǎn)物II:I2可表明，細(xì)胞在這些條件下會(huì)產(chǎn)生足夠量的TPP,以最大程度地觸發(fā)核糖開(kāi)關(guān)_誘導(dǎo)的剪接。圖14示出了DNA引物的序列(SEQIDNO44-95)。具體實(shí)施例方式通過(guò)參考對(duì)下文中包括的實(shí)施例和具體實(shí)施方案的具體描述，以及參考附圖及其上下文的描述，可以更容易地理解所公開(kāi)的方法和組合物。信使RNA通常被認(rèn)為是遺傳信息的被動(dòng)載體,它可在翻譯過(guò)程中被蛋白調(diào)節(jié)因子或小RNA調(diào)節(jié)因子和核糖體作用。已發(fā)現(xiàn)某些mRNA帶有天然適體結(jié)構(gòu)域,并且特異性代謝物與這些RNA結(jié)構(gòu)域的結(jié)合可導(dǎo)致基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。天然核糖開(kāi)關(guān)具有天然RNA通常不具有的兩種特殊的功能。其一，mRNA元件可變?yōu)椴煌慕Y(jié)構(gòu)狀態(tài)，其中一種結(jié)構(gòu)可作為其靶標(biāo)代謝物的精確的結(jié)合袋。其二，由代謝物誘導(dǎo)的在結(jié)構(gòu)狀態(tài)之間的變構(gòu)互變可導(dǎo)致通過(guò)幾種不同機(jī)制之一的基因表達(dá)水平的改變。核糖開(kāi)關(guān)通?？杀粍澐譃閮蓚€(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域一個(gè)選擇性地結(jié)合靶標(biāo)(適體結(jié)構(gòu)域)，另一個(gè)影響基因控制(表達(dá)平臺(tái))。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的動(dòng)態(tài)相互作用導(dǎo)致對(duì)基因表達(dá)的依賴(lài)于代謝物的變構(gòu)控制。已識(shí)別了不同類(lèi)別的核糖開(kāi)關(guān)，這些不同類(lèi)別的核糖開(kāi)關(guān)表現(xiàn)出選擇性地識(shí)別激活化合物(在本文中被稱(chēng)為觸發(fā)分子)。例如,輔酶B12、甘氨酸、硫胺素焦磷酸(TPP)和黃素單核苷酸(FMN)激活存在于如下的基因中的核糖幵關(guān)，所述基因編碼這些化合物的代謝或轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中關(guān)鍵的酶。每一類(lèi)核糖開(kāi)關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域與高度保守的共有序列和結(jié)構(gòu)相一致。因此,可使用序列同源性檢索來(lái)識(shí)別相關(guān)的核糖開(kāi)關(guān)結(jié)構(gòu)域。已在細(xì)菌、古細(xì)菌和真核生物等多種生物中發(fā)現(xiàn)了核糖開(kāi)關(guān)結(jié)構(gòu)域。已報(bào)道了在真細(xì)菌中可感受10種不同的代謝物的11種結(jié)構(gòu)類(lèi)的核糖幵失(Mandal2004；Winkler2005；Bretiker2006；Fuchs2006；Roth.AeubacterialriboswitchselectiveforthequeuosineprecursorpreQlcontainsanunusuallysmallaptamerdomain.Nat.Struct.Mol.Biol.(2007)),并且大量的其他類(lèi)正在被表征。每種核糖幵關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域可通過(guò)其甚至在親緣關(guān)系遠(yuǎn)的生物之間仍保持高度保守的核苷酸序列(Rodionov2002；Vitreschak2002；Vitreschtik2003)和折疊結(jié)構(gòu)(Nahvi2004；Batey2004；Serganov2004；Montange2006；Thore2006；Serganov2006；Edwards2006)進(jìn)行區(qū)分。核糖開(kāi)關(guān)通常包括一個(gè)對(duì)適體的代謝物結(jié)合應(yīng)答時(shí)可調(diào)節(jié)基因表達(dá)的表達(dá)平臺(tái)，但表達(dá)平臺(tái)在序列、結(jié)構(gòu)和控制機(jī)制上可廣泛地不同。適體異常的保守水平使得可使用生物信息學(xué)在不同生物中識(shí)別相似的核糖開(kāi)關(guān)代表?，F(xiàn)今，已經(jīng)從所有3個(gè)生命域中識(shí)別了僅與TPP核糖開(kāi)關(guān)適體共有序列一致的序列(Sudarsan2003)。雖然從真菌(Sudarsan2003；Galagan2005)(圖5)和植物預(yù)測(cè)的一些真核TPP適體已顯示可結(jié)合TPP(Sudarsan2003Yamauchi)，但是代謝物結(jié)合通過(guò)何種機(jī)制控制基因表達(dá)是未知的。在真菌中，每個(gè)TPP適體均位于5'非翻譯區(qū)(UTR)內(nèi)含子或mRNA蛋白編碼區(qū)中，這暗示mRNA剪接受代謝物結(jié)合的控制(Sudarsan2003；Kubodera2003)。Α.核糖開(kāi)關(guān)RNA的一般性結(jié)構(gòu)細(xì)菌核糖開(kāi)關(guān)RNA是主要位于特定mRNA主編碼區(qū)域的5’非翻譯區(qū)(5’-UTR)的基因控制元件。結(jié)構(gòu)性探查研究(下文將詳述)發(fā)現(xiàn)核糖開(kāi)關(guān)元件通常包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)域作為配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的天然適體(T.Hermann,D.J.Patel,Science2000，287,820；L.Gold,etal.，AnnualReviewofBiochemistry1995，64，763)和與參與基因表達(dá)的RNA元件(例如Shine-Dalgarno(SD)元件；轉(zhuǎn)錄終止莖)相接的“表達(dá)平臺(tái)”。上述結(jié)論是基于下述觀察結(jié)果體外合成的適體結(jié)構(gòu)域在不存在表達(dá)平臺(tái)的條件下與合適的配體相結(jié)合(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布文本No.2005-0053951的實(shí)施例2、3和6)。此外，結(jié)構(gòu)性探查研究表明，在獨(dú)立檢測(cè)的時(shí)候大多數(shù)核糖開(kāi)關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域采用一種特定的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)折疊，這基本上與存在完整的5’前導(dǎo)RNA時(shí)檢測(cè)到的適體結(jié)構(gòu)相同。這表明在許多情況下，適體結(jié)構(gòu)域作為與獨(dú)立于表達(dá)平臺(tái)折疊的一個(gè)模塊單元(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布文本No.2005-0053951的實(shí)施例2、3和6)。適體結(jié)構(gòu)域的配體結(jié)合狀態(tài)或未結(jié)合狀態(tài)最終通過(guò)表達(dá)平臺(tái)來(lái)反映，表達(dá)平臺(tái)可以對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生影響。核糖開(kāi)關(guān)作為一個(gè)模塊元件的觀點(diǎn)被以下事實(shí)進(jìn)一步支持適體結(jié)構(gòu)域在多種生物之間是高度保守的(TPP核糖開(kāi)關(guān)甚至在不同生物界之間都是保守的)(N.Sudarsan,etal.,RNA2003，9，644)，而表達(dá)平臺(tái)在序列、結(jié)構(gòu)和控制附帶幵放閱讀框表達(dá)的機(jī)制方面都有所變化。例如，配體結(jié)合到枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的tenAmRNA的TPP核糖開(kāi)關(guān)上可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止(A.S.Mironov,eta:L，cell2002,111,747)。這種表達(dá)平臺(tái)與大腸桿菌(E.coli)thiMmRNA的TPP核糖開(kāi)關(guān)的表達(dá)平臺(tái)在序列和結(jié)構(gòu)上均不同，大腸桿菌thiMmRNA的TPP核糖幵關(guān)與TPP結(jié)合時(shí)會(huì)通過(guò)SD阻斷機(jī)制導(dǎo)致對(duì)翻譯的抑制(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布文本No.2005-0053951的實(shí)施例2)。這兩種轉(zhuǎn)錄單位的TPP適體結(jié)構(gòu)域很容易被識(shí)別，并且具有幾乎相同的功能特征,但是基因控制機(jī)制和實(shí)現(xiàn)該機(jī)制的表達(dá)平臺(tái)則相當(dāng)不同。核糖幵關(guān)RNA的適體結(jié)構(gòu)域通常長(zhǎng)度為70至170個(gè)核苷酸(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布文本No.2005-0053951的附圖11)。這一結(jié)果有些出人意料，因?yàn)轶w外進(jìn)化實(shí)驗(yàn)識(shí)別了多種結(jié)合小分子的適體,它們的長(zhǎng)度相當(dāng)短，并且結(jié)構(gòu)復(fù)雜(T.Hermann,I).J.Patel,Science2000，287，820；L.Gold,etal.,AnnualReviewofBiochemistry1995，64，763；Μ.Famulok,CurrentOpinioninStructuralBiology1999,9,324)。雖然天然適體序列相對(duì)于人工適體在復(fù)雜性和信息含量上的顯著增加的原因還需要進(jìn)一步的確證，但是相信這種復(fù)雜性是形成具有高親和力和高選擇性功能的RNA受體所需要的。配體-核糖開(kāi)關(guān)復(fù)合物的表觀Kd值從低納摩爾量至低微摩爾量不等。還值得注意的是,當(dāng)一些適體結(jié)構(gòu)域與附帶的表達(dá)平臺(tái)相分離時(shí)，表現(xiàn)出比完整核糖幵關(guān)更高的(10至100倍)對(duì)靶配體的親和力(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布文本No.2005-0053951的實(shí)施例2)?？梢酝茰y(cè)，對(duì)由完整的核糖開(kāi)關(guān)RNA所需的多種不同的RNA構(gòu)象進(jìn)行采樣中有消耗能量,這一點(diǎn)通過(guò)配體親和力的損失而反映出來(lái)。由于適體結(jié)構(gòu)域必須作為分子開(kāi)關(guān),這可能提高了天然適體的功能性要求，這一點(diǎn)可能也有助于解釋它們?yōu)槭裁从懈鼜?fù)雜的結(jié)構(gòu)。B.TPP核糖開(kāi)關(guān)輔酶硫胺素焦磷酸(TPP)是維生素Bl的活性形式,它是多種蛋白催化的反應(yīng)中必需的參與者。來(lái)自所有3個(gè)生命域的生物(包括細(xì)菌、植物和真菌)使用感受TPP的核糖幵關(guān)來(lái)控制負(fù)責(zé)輸入或合成硫胺素及其磷酸化衍生物的基因，這就使得該類(lèi)核糖幵關(guān)成為分布最廣的感受代謝物的RNA調(diào)節(jié)系統(tǒng)的成員。其結(jié)構(gòu)顯示一種折疊的RNA，其中一個(gè)亞結(jié)構(gòu)域形成TPP的4氨基羥甲基-2-甲基嘧啶部分的嵌入袋，而另一個(gè)亞結(jié)構(gòu)域形成這樣的--個(gè)更寬袋，即該袋使用二價(jià)金屬離子和水分子以使得橋式連接至所述配體的焦磷酸部分。這兩個(gè)袋所處的位置可使其作為識(shí)別擴(kuò)展構(gòu)象的TPP的分子測(cè)量設(shè)備發(fā)揮功能。中央噻唑部分不被RNA識(shí)別,這可解釋抗微生物化合物吡啶硫胺素焦磷酸為什么靶向該核糖開(kāi)關(guān)并下調(diào)硫胺素代謝基因的表達(dá)。天然配體及其藥物樣類(lèi)似物都可穩(wěn)定由所述核糖開(kāi)關(guān)控制的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)元件，以調(diào)節(jié)mRNA編碼蛋白的合成。此外，該結(jié)構(gòu)可提供這樣的認(rèn)識(shí)，即折疊的RNA如何能形成與蛋白遺傳因子形成的結(jié)合袋相當(dāng)?shù)木_結(jié)合袋。在絲狀真菌粗糙脈孢菌中檢查了3種TPP核糖開(kāi)關(guān),發(fā)現(xiàn)通過(guò)控制mRNA剪接,一種TPP核糖開(kāi)關(guān)激活基因表達(dá),且另兩種TPP核糖開(kāi)關(guān)抑制基因表達(dá)。對(duì)于編碼TTP代謝中涉及的蛋白的NMTlmRNA前體，闡明了一種涉及核糖幵關(guān)介導(dǎo)的堿基配對(duì)改變和可變剪接控制的詳細(xì)機(jī)制(實(shí)施例1)。這些結(jié)果證明，真核細(xì)胞利用代謝物結(jié)合的RNA來(lái)調(diào)節(jié)對(duì)關(guān)鍵生物化學(xué)過(guò)程的控制重要的RNA剪接事件。TPP核糖開(kāi)關(guān)還在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)文本No.US-2005-0053951中被詳述，No.US-2005-0053951的全部?jī)?nèi)容以援引的方式納入本文，還具體以援引的方式納入它對(duì)TTP核糖開(kāi)關(guān)結(jié)構(gòu)、功能和用途的描述。被明確考慮的是，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)文本No.US-2005-0053951的任何主題和描述,特別是美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)文本No.US-2005-0053951中對(duì)TTP核糖開(kāi)關(guān)結(jié)構(gòu)、功能和用途的任何描述均可以具體地被包括或者排除在本文公開(kāi)的其他主題之外。應(yīng)理解，如不另外說(shuō)明，公幵的方法和組合物不限于特定合成方法、特定分析技術(shù)或具體試劑，因此可有所改變。還應(yīng)理解本文所用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述具體實(shí)施方案，而不意欲作出限制。材料本文公幵了可用于所公幵的方法和組合物、可與之聯(lián)合使用、可用于其制備或作為其產(chǎn)品的材料、組合物和組分。本文公開(kāi)了這些和其他材料，應(yīng)理解當(dāng)公開(kāi)這些材料的組合、子集、相互作用、分組等時(shí),雖然可能沒(méi)有明確公開(kāi)具體的這些化合物的各個(gè)體的和總體的組合以及排列的每--種，但每種都在本文中明確地考慮和描述。例如，如果公開(kāi)和討論了核糖幵關(guān)或適體結(jié)構(gòu)域并且討論了對(duì)包括所述核糖幵關(guān)或適體結(jié)構(gòu)域的若千分子作出的若干修飾，那么除非特別作出相反的說(shuō)明，否則每種核糖開(kāi)關(guān)或適體結(jié)構(gòu)域的組合和排列以及可能的修飾都會(huì)被具體考慮。因此，如果公開(kāi)了一類(lèi)分子A、B和C以及一類(lèi)分子D、E和F,還公開(kāi)了--個(gè)組合分子的實(shí)例A-D,那么即使沒(méi)有單獨(dú)提到每種組合,每種組合也都被獨(dú)立和綜合地考慮了。因此，在此實(shí)例中，根據(jù)A、B和C;D、E和F；以及實(shí)例組合A-D的公開(kāi)內(nèi)容，A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、CE和C-F組合的每一個(gè)都被具體地考慮并應(yīng)認(rèn)為被公開(kāi)。類(lèi)似地，它們的任何子集或組合也被特別考慮和公開(kāi)。因此,例如,根據(jù)A、B和C；D、E和F；以及實(shí)例組合A-D的公開(kāi)內(nèi)容,子集A-E、B-F和C-E被具體地考慮并應(yīng)認(rèn)為被公開(kāi)。此概念適用于本申請(qǐng)所有方面，包括但不限于制備和使用所公開(kāi)組合物的方法的步驟。因此,如果有多個(gè)可實(shí)施的其他步驟，應(yīng)理解每個(gè)其他步驟都可與所公開(kāi)方法的任何具體實(shí)施方案或?qū)嵤┓桨附M合一起實(shí)施,并且每個(gè)這種組合都被具體地考慮且應(yīng)認(rèn)為被公開(kāi)。A.核糖開(kāi)關(guān)核糖開(kāi)關(guān)是作為待表達(dá)RNA分子的一部分并且與觸發(fā)分子結(jié)合時(shí)會(huì)改變狀態(tài)的表達(dá)控制元件。核糖開(kāi)關(guān)一般可被分為兩個(gè)獨(dú)立結(jié)構(gòu)域一個(gè)選擇性地與靶標(biāo)結(jié)合(適體結(jié)構(gòu)域)，而另一個(gè)影響基因控制(表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域)。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的動(dòng)態(tài)相互作用導(dǎo)致對(duì)基因表達(dá)的代謝物依賴(lài)的變構(gòu)調(diào)控。公開(kāi)了分離和重組的核糖開(kāi)關(guān)、含有這種核糖開(kāi)關(guān)的重組構(gòu)建體、與這種核糖幵關(guān)可操作地連接的異源序列以及包含這種核糖幵關(guān)、核糖開(kāi)關(guān)重組構(gòu)建體和與異源序列可操作地連接的核糖開(kāi)關(guān)的細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因生物體。例如，所述異源序列可為編碼包含報(bào)告蛋白或肽在內(nèi)的目的蛋白或肽的序列。優(yōu)選的核糖開(kāi)關(guān)是天然存在的核糖幵關(guān)或衍生自于天然存在的核糖幵關(guān)。例如，適體結(jié)構(gòu)域可以是天然存在的核糖開(kāi)關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域或衍生自于天然存在的核糖開(kāi)關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域。所述核糖開(kāi)關(guān)可以包括人工適體或者任選地排除人工適體。例如，人工適體包括經(jīng)體外演化和/或體外選擇設(shè)計(jì)或選擇的適體。所述核糖開(kāi)關(guān)可包含天然存在核糖開(kāi)關(guān)的共有序列。多種核糖開(kāi)關(guān)的共有序列記載于美國(guó)申請(qǐng)公幵文本No.2005-0053951中，例如在圖11中。本文公開(kāi)了一種可調(diào)節(jié)的基因表達(dá)構(gòu)建體,所述構(gòu)建體包含一個(gè)編碼如下一種RNA的核酸分子,所述RNA包含可操作地連接于一個(gè)編碼區(qū)的核糖開(kāi)關(guān)，其中所述核糖開(kāi)關(guān)調(diào)節(jié)所述RNA的剪接,其中所述核糖開(kāi)關(guān)和編碼區(qū)是異源的。所述核糖開(kāi)關(guān)可調(diào)節(jié)所述RNA的可變剪接。所述核糖幵關(guān)可包含一個(gè)適體結(jié)構(gòu)域和一個(gè)表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域，其中所述適體結(jié)構(gòu)域和所述表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域是異源的。所述RNA可進(jìn)一步包含一個(gè)內(nèi)含子，其中所述表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域在所述內(nèi)含子中或者在所述內(nèi)含子一端包含一個(gè)可變剪接點(diǎn)(即，5'剪接點(diǎn)或3'剪接點(diǎn))。所述RNA可進(jìn)--步包含--個(gè)內(nèi)含子,其中所述表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域在所述內(nèi)含子中包含分支位點(diǎn)。所述可變剪接點(diǎn)可在所述核糖幵關(guān)被激活或未被激活時(shí)具有活性。所述核糖開(kāi)關(guān)可由觸發(fā)分子例如硫胺素焦磷酸(TPP)激活。所述核糖開(kāi)關(guān)可以為T(mén)PP-應(yīng)答性核糖開(kāi)關(guān)。所述核糖開(kāi)關(guān)可改變RNA的剪接。例如,所述核糖開(kāi)關(guān)的活化可允許或啟動(dòng)可變剪接；阻止或降低剪接或主要剪接；阻止或降低可變剪接；或者允許或啟動(dòng)剪接或主要剪接。再例如,失活的核糖開(kāi)關(guān)或使所述核糖開(kāi)關(guān)失活可允許或啟動(dòng)可變剪接；阻止或降低剪接或主要剪接；阻止或降低可變剪接；或者允許或啟動(dòng)剪接或主要剪接。通常，剪接調(diào)節(jié)的形式可通過(guò)所述核糖開(kāi)關(guān)與剪接點(diǎn)的物理關(guān)系、可變剪接點(diǎn)和RNA分子的分支位點(diǎn)確定。例如，核糖幵關(guān)的活化/失活一般涉及RNA中可變二級(jí)結(jié)構(gòu)(例如堿基配對(duì)的莖)的形成和/或破壞，這種結(jié)構(gòu)變化可用于阻礙或暴露功能性RNA序列。核糖開(kāi)關(guān)的表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域一般包含這種功能性RNA序列。因此,例如,通過(guò)以以下方式在核糖開(kāi)關(guān)的表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域中包含一個(gè)剪接點(diǎn)(spicejunction)或--個(gè)分支位點(diǎn),可以調(diào)節(jié)或影響所述RNA的剪接,所述方式即所述剪接點(diǎn)或分支位點(diǎn)在所述核糖幵關(guān)被激活或失活時(shí)交替地被阻礙或被暴露，反之亦然。核糖開(kāi)關(guān)可激活或抑制剪接?！凹せ罴艚印钡囊馑际?核糖開(kāi)關(guān)可直接或間接地作用于RNA以使剪接發(fā)生。這可包括例如使任何剪接發(fā)生(例如相對(duì)于無(wú)剪接的單剪接)或者使可變剪接發(fā)生。與無(wú)核糖開(kāi)關(guān)時(shí)發(fā)生的剪接事件的數(shù)目相比，這可使剪接增加1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、1.9%,20%,21%,22%,23%,24%,25%,26%,27%,28%,29%,30%,31%,32%,33%、34%,35%,36%,37%,38%,39%,40%,41%,42%,43%,44%,45%,46%,47%,48%,49%,50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61%,62%,63%,64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%>94%,95%,96%,97%,98%,99%^；100%,或者更多?！耙种萍艚印钡囊馑际?，核糖幵關(guān)可直接或間接地作用于RNA以抑制剪接。這可包括例如阻止任何剪接發(fā)生或者減少剪接發(fā)生(例如無(wú)剪接和單剪接)，或者阻止或減少可變剪接的發(fā)生。與無(wú)核糖開(kāi)關(guān)時(shí)發(fā)生的可變剪接事件的數(shù)目相比,這可使可變剪接減少1%、2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%,12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%,35%,36%,37%,38%,39%,40%、41%、42%A3%、44%、45%,46%,47%、48%、49%,50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。核糖開(kāi)關(guān)可激活或抑制可變剪接?！凹せ羁勺兗艚印钡囊馑际?核糖開(kāi)關(guān)可直接或間接地作用于RNA以使可變剪接發(fā)生。與無(wú)核糖幵關(guān)時(shí)發(fā)生的可變剪接事件的數(shù)目相比，這可使可變剪接增加1%、2%、’3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、1’3%、14%,15%,16%J.7%,18%,19%,20%,21%,22%,23%,24%,25%,26%,27%,28%,29%,30%,31%,32%,33%,34%,35%,36%,37%,38%,39%,40%,41%,42%,43%,44%,45%,46%,47%,48%,49%,50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%,或者更多?！耙种瓶勺兗艚印钡囊馑际牵颂情_(kāi)關(guān)可直接或間接地作用于RNA以抑制可變剪接。與無(wú)核糖開(kāi)關(guān)時(shí)發(fā)生的可變剪接事件的數(shù)目相比，這可使可變剪接減少1%、2%、3%、4%、5%,6%,7%,8%,9%,10%、11%、12%、1.3%J.4%,15%,16%,17%J.8%,19%、20%、21%,22%,23%,24%,25%,26%,27%,28%,29%,30%,31%,32%,33%,34%,35%,36%,37%,38%,39%,40%,41%,42%,43%,44%,45%,46%,47%,48%,49%,50%,51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%、97%、98%、99%或100%。核糖開(kāi)關(guān)可影響RNA編碼的蛋白的表達(dá)。例如，對(duì)剪接或可變剪接的調(diào)節(jié)可影響待翻譯RNA的能力、改變編碼區(qū)或改變翻譯起始或終止。例如,可變剪接可導(dǎo)致不存在于正常加工的轉(zhuǎn)錄物中的起始密碼子或終止密碼子(或二者)出現(xiàn)于加工的轉(zhuǎn)錄物中。再例如，可變剪接可導(dǎo)致從加工的轉(zhuǎn)錄物去除正常的起始密碼子或終止密碼子。一種用于核糖開(kāi)關(guān)調(diào)節(jié)的剪接以調(diào)節(jié)RNA編碼蛋白的表達(dá)的有效模式為，在RNA的5‘非翻譯區(qū)的內(nèi)含子中導(dǎo)入一個(gè)核糖開(kāi)關(guān),并包括或利用所述內(nèi)含子中的起始密碼子,使得內(nèi)含子中的所述起始密碼子為所述可變剪接RNA中的第一起始密碼子。另一種用于核糖開(kāi)關(guān)調(diào)節(jié)的剪接以調(diào)節(jié)RNA編碼蛋白的表達(dá)的有效模式為，在RNA的5'非翻譯區(qū)的內(nèi)含子中導(dǎo)入一個(gè)核糖幵關(guān)，并包括或利用所述內(nèi)含子中的短開(kāi)放閱讀框，使得所述閱讀框首先出現(xiàn)在所述可變剪接RNA中。RNA分子可具有分支結(jié)構(gòu)。例如,在TPP核糖開(kāi)關(guān)(實(shí)施例1)中，當(dāng)TPP濃度低時(shí)，新轉(zhuǎn)錄的mRNA采用一種封閉第二5’剪接位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，而是分支位點(diǎn)處于可剪接狀態(tài)。從第一5’剪接位點(diǎn)剪接mRNA前體可的導(dǎo)致型mRNA的產(chǎn)生及NMTl蛋白的表達(dá)。當(dāng)TPP濃度高時(shí),配體與TPP適體的結(jié)合可造成RNA折疊的變構(gòu)改變，以增加所述第二5’剪接位點(diǎn)附近的結(jié)構(gòu)柔性并且封閉所述分支位點(diǎn)附近的核苷酸。控制剪接的適體區(qū)域可位于例如P4莖和P5莖?？刂瓶勺兗艚拥倪m體區(qū)域還可出現(xiàn)于例如環(huán)5中及莖P2中。剪接位點(diǎn)可位于例如相對(duì)于適體的5’端-6至-24之間的位置。因此,例如，表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域可以與P4和P5序列、環(huán)5序列和/或P2序列相互作用。當(dāng)觸發(fā)分子未結(jié)合適體結(jié)構(gòu)域的時(shí)候，這種適體序列通?？捎糜趦H與表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域相互作用。所述剪接位點(diǎn)可接在序列GUA之后。實(shí)施例1詳述了適體在核糖開(kāi)關(guān)上的具體定位。對(duì)于多種細(xì)菌核糖開(kāi)關(guān),代謝物結(jié)合可不涉及蛋白地改變位于適體下游的表達(dá)平臺(tái)的折疊(Winkleretal.(2002),Mironovet.al.(2002),Serganovetal.(2006))。為了在調(diào)節(jié)可變剪接的TPP核糖開(kāi)關(guān)中評(píng)估這一點(diǎn)，進(jìn)行試驗(yàn)以確定NMTlTPP核糖開(kāi)關(guān)的剪接調(diào)節(jié)是否是由于適體側(cè)翼的不依賴(lài)于蛋白的結(jié)構(gòu)調(diào)整。對(duì)NMTlUTR構(gòu)建體進(jìn)行直讀探測(cè)(SOUkUp&Breaker(1999))。有意思的是,添加TPP可造成分支位點(diǎn)的核苷酸的結(jié)構(gòu)變得更為有序(圖10)，并且在第二5’剪接位點(diǎn)產(chǎn)生更靈活的結(jié)構(gòu)(圖4a)。而且，已觀察到適體P4和P5元件的12個(gè)核苷酸與第二5’剪接位點(diǎn)處大多數(shù)在不存在配體時(shí)在結(jié)構(gòu)上退隱的核苷酸互補(bǔ)(圖4b)。P4和P5元件是TPP焦磷酸部分的識(shí)別必需的，因此TPP結(jié)合和5’剪接位點(diǎn)封閉是互相排斥的(實(shí)施例1)。所公幵的核糖開(kāi)關(guān)，包括其衍生形式和重組形式，通常可來(lái)自任何來(lái)源，包括天然存在的核糖開(kāi)關(guān)和從頭設(shè)計(jì)的核糖開(kāi)關(guān)。任何這種核糖開(kāi)關(guān)都可用于所公開(kāi)方法或與之一起使用，條件是它們已被確定可調(diào)節(jié)可變剪接。然而,可定義不同類(lèi)型的核糖開(kāi)關(guān),并且某些這類(lèi)子類(lèi)型可用于特殊方法或與之--起使用(一般如本文其他部分所述)。核糖開(kāi)關(guān)類(lèi)型包括例如天然存在的核糖開(kāi)關(guān)、天然存在的核糖幵關(guān)的衍生物和修飾形式、嵌合核糖開(kāi)關(guān)和重組核糖開(kāi)關(guān)。天然存在的核糖開(kāi)關(guān)是具有天然存在的核糖開(kāi)關(guān)序列的核糖開(kāi)關(guān)。這種天然存在的核糖開(kāi)關(guān)可以是天然存在的核糖開(kāi)關(guān)即自然界中出現(xiàn)的核糖開(kāi)關(guān)的分離或重組形式。即，所述核糖開(kāi)關(guān)具有相同的一級(jí)結(jié)構(gòu)但已被分離或在新的基因或核酸環(huán)境中被工程改造。嵌合核糖幵關(guān)例如可由任何類(lèi)別或類(lèi)型或者特定類(lèi)別或類(lèi)型的核糖幵關(guān)的一部分和相同類(lèi)別或類(lèi)型或者任何不同類(lèi)別或類(lèi)型的不同核糖開(kāi)關(guān)的一部分構(gòu)成；可由任何類(lèi)別或類(lèi)型或特定類(lèi)別或類(lèi)型的核糖開(kāi)關(guān)的一部分和任何非核糖開(kāi)關(guān)序列或組分構(gòu)成。重組核糖開(kāi)關(guān)是已被分離或在新的基因或核酸環(huán)境中被工程改造的核糖開(kāi)關(guān)。核糖開(kāi)關(guān)可包含單個(gè)或多個(gè)適體結(jié)構(gòu)域。包含多個(gè)適體結(jié)構(gòu)域的核糖幵關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域可表現(xiàn)出對(duì)觸發(fā)分子的協(xié)同結(jié)合，也可不表現(xiàn)出對(duì)觸發(fā)分子的協(xié)同結(jié)合(即所述適體不需表現(xiàn)協(xié)同結(jié)合)。對(duì)后一種情況,所述適體結(jié)構(gòu)域可被稱(chēng)作獨(dú)立結(jié)合物。含有多個(gè)適體的核糖開(kāi)關(guān)可含有一個(gè)或多個(gè)表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域。例如，含有兩個(gè)表現(xiàn)出對(duì)與其觸發(fā)分子協(xié)同結(jié)合的適體結(jié)構(gòu)域的核糖幵關(guān)可連接至被所述兩個(gè)適體結(jié)構(gòu)域調(diào)控的單個(gè)表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域。含有多個(gè)適體的核糖開(kāi)關(guān)可含有一個(gè)或多個(gè)通過(guò)接頭連接的適體。當(dāng)這種適體表現(xiàn)出與觸發(fā)分子協(xié)同結(jié)合時(shí),所述接頭可為協(xié)同接頭。如果適體結(jié)構(gòu)域具有介于χ和x-1之間的希爾(Hill)系數(shù)η——其中χ是用于分析協(xié)同結(jié)合的適體結(jié)構(gòu)域數(shù)目(或所述適體結(jié)構(gòu)域上結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目)，則它們可被認(rèn)為表現(xiàn)出協(xié)同結(jié)合。因此，例如，如含有兩個(gè)適體結(jié)構(gòu)域的核糖開(kāi)關(guān)(如甘氨酸應(yīng)答性核糖開(kāi)關(guān))的希爾系數(shù)在2和1之間，則所述核糖開(kāi)關(guān)可被認(rèn)為表現(xiàn)出協(xié)同結(jié)合。應(yīng)理解所用χ值取決于進(jìn)行協(xié)同結(jié)合分析的適體結(jié)構(gòu)域的數(shù)目，而不一定是核糖開(kāi)關(guān)中存在的適體結(jié)構(gòu)域數(shù)目。這是合理的，因?yàn)楹颂情_(kāi)關(guān)可含有多個(gè)適體結(jié)構(gòu)域,但只有某些表現(xiàn)協(xié)同結(jié)合。公開(kāi)了含有異源適體結(jié)構(gòu)域和表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域的嵌合核糖開(kāi)關(guān)。即，嵌合核糖開(kāi)關(guān)由--種來(lái)源的適體結(jié)構(gòu)域和另--種來(lái)源的表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。所述異源來(lái)源可來(lái)自例如不同的具體核糖幵關(guān)、不同類(lèi)型的核糖幵關(guān)或不同類(lèi)別的核糖幵關(guān)。所述異源適體也可來(lái)自非核糖開(kāi)關(guān)適體。所述異源表達(dá)平臺(tái)也可來(lái)自非核糖開(kāi)關(guān)來(lái)源。經(jīng)修飾的或衍生的核糖開(kāi)關(guān)可使用體外選擇和進(jìn)化技術(shù)生產(chǎn)。通常,用于核糖開(kāi)關(guān)的體外進(jìn)化技術(shù)包括產(chǎn)生一系列變種核糖開(kāi)關(guān),其中核糖開(kāi)關(guān)序列的一(幾)部分發(fā)生改變而該核糖開(kāi)關(guān)的其他部分保持不變。然后可對(duì)所述系列的變種核糖幵關(guān)的激活、失活或阻斷(或其他功能或結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn))進(jìn)行評(píng)估,符合目的標(biāo)準(zhǔn)的變種核糖開(kāi)關(guān)被選用或進(jìn)行進(jìn)一步演化。對(duì)生成變種有用的基礎(chǔ)核糖開(kāi)關(guān)是本文公開(kāi)的特定共有核糖開(kāi)關(guān)(consensusriboswitch)。共有核糖開(kāi)關(guān)可用于指出改變核糖開(kāi)關(guān)的哪一(些)部分來(lái)進(jìn)行體外選擇和演化。還公開(kāi)了調(diào)節(jié)發(fā)生改變的被修飾核糖開(kāi)關(guān)。核糖開(kāi)關(guān)的調(diào)節(jié)可通過(guò)將一個(gè)適體結(jié)構(gòu)域可操作地連接至所述核糖開(kāi)關(guān)(其是一個(gè)嵌合核糖開(kāi)關(guān))的表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域而被改變。然后所述適體結(jié)構(gòu)域可通過(guò)例如觸發(fā)分子對(duì)所述適體結(jié)構(gòu)域的作用來(lái)介導(dǎo)核糖開(kāi)關(guān)的調(diào)節(jié)。適體結(jié)構(gòu)域可以任何合適的方式與核糖幵關(guān)的表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域可操作地連接，包括例如通過(guò)用新的適體結(jié)構(gòu)域替換所述核糖開(kāi)關(guān)正?；蛱烊坏倪m體結(jié)構(gòu)域。通常,任何可激活、滅活或阻斷適體結(jié)構(gòu)域所來(lái)源的核糖開(kāi)關(guān)的化合物或條件都可用于激活、滅活或阻斷所述嵌合核糖開(kāi)關(guān)。還公開(kāi)了失活的核糖幵關(guān)。核糖幵關(guān)可通過(guò)共價(jià)方式(通過(guò)例如使部分核糖幵關(guān)交聯(lián)或?qū)⒒衔锱悸?lián)到該核糖開(kāi)關(guān))改變所述核糖開(kāi)關(guān)而被失活。通過(guò)這種方式的核糖開(kāi)關(guān)失活是由于例如防止核糖開(kāi)關(guān)與觸發(fā)分子結(jié)合的改變,防止核糖開(kāi)關(guān)與觸發(fā)分子結(jié)合時(shí)其狀態(tài)發(fā)生變化的改變,或防止核糖開(kāi)關(guān)在與觸發(fā)分子結(jié)合時(shí)其表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域影響表達(dá)的改變。還公開(kāi)了生物傳感器核糖開(kāi)關(guān)。生物傳感器核糖開(kāi)關(guān)是在其關(guān)聯(lián)觸發(fā)分子(cognatetrigger)存在的情況下產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的工程改造的核糖開(kāi)關(guān)。可用的生物傳感器核糖開(kāi)關(guān)可由閾水平或高于閾水平的觸發(fā)分子觸發(fā)。生物傳感器核糖開(kāi)關(guān)可被設(shè)計(jì)以在體內(nèi)或體外應(yīng)用。例如，可操作地連接至編碼用作信號(hào)或參與產(chǎn)生信號(hào)的蛋白的報(bào)告RNA的生物傳感器核糖開(kāi)關(guān)，可通過(guò)對(duì)細(xì)胞或生物體進(jìn)行工程改造使其包含編碼所述核糖開(kāi)關(guān)/報(bào)告RNA的核酸構(gòu)建體從而在體內(nèi)應(yīng)用。體外應(yīng)用生物傳感器核糖開(kāi)關(guān)的一個(gè)實(shí)例是包含構(gòu)象依賴(lài)標(biāo)簽的核糖開(kāi)關(guān)，所述標(biāo)簽的信號(hào)根據(jù)所述核糖開(kāi)關(guān)的激活狀態(tài)而變化。這種生物傳感器核糖開(kāi)關(guān)優(yōu)選地使用取自或衍生自天然存在的核糖開(kāi)關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域。生物傳感器核糖開(kāi)關(guān)可用于多種情況和平臺(tái)。例如，生物傳感器核糖開(kāi)關(guān)可與固體支持物如盤(pán)、片、帶和孔一起使用。還公開(kāi)了可識(shí)別新觸發(fā)分子的經(jīng)修飾的或衍生的核糖開(kāi)關(guān)。識(shí)別新觸發(fā)分子的新核糖開(kāi)關(guān)和/或新適體可通過(guò)篩選得到、設(shè)計(jì)得到或從已知核糖開(kāi)關(guān)衍生得到。這可通過(guò)例如以下的步驟實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生一系列核糖開(kāi)關(guān)的適體變種，在目的化合物存在下評(píng)估所述變種核糖開(kāi)關(guān)的激活情況，選擇被激活的變種核糖開(kāi)關(guān)(或者,例如被最大程度地或最具有選擇性地激活的核糖幵關(guān))和重復(fù)這些步驟直到產(chǎn)生具有所需活性、特異性、活性和特異性的組合或其他性質(zhì)的組合的變種核糖開(kāi)關(guān)。通常,通過(guò)設(shè)計(jì)或改變表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域中的被調(diào)控鏈?zhǔn)蛊渑c適體結(jié)構(gòu)域的控制鏈互補(bǔ),可使任何適體結(jié)構(gòu)域適合與任何表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域一起使用?；蛘?可改變所述適體的序列和適體結(jié)構(gòu)域的控制鏈，從而使所述控制鏈與表達(dá)平臺(tái)中的具有重要功能的序列互補(bǔ)。公開(kāi)了包含異源核糖開(kāi)關(guān)和編碼區(qū)的RNA分子。即，這種RNA分子由來(lái)自一個(gè)來(lái)源的核糖開(kāi)關(guān)和來(lái)自另一個(gè)來(lái)源的編碼區(qū)構(gòu)成。所述異源的源可來(lái)自例如,不同RNA分子、不同轉(zhuǎn)錄物、來(lái)自不同基因的RNA或轉(zhuǎn)錄物、來(lái)自不同細(xì)胞的RNA或轉(zhuǎn)錄物、來(lái)自不同生物體的RNA或轉(zhuǎn)錄物、來(lái)自不同物種的RNA或轉(zhuǎn)錄物、天然序列及人工或工程改造的序列、特定的核糖開(kāi)關(guān)、不同類(lèi)型的核糖開(kāi)關(guān)或者不同類(lèi)別的核糖開(kāi)關(guān)。本文公開(kāi)的術(shù)語(yǔ)“編碼區(qū)”是指編碼氨基酸的核酸的任何區(qū)域。這可以包括包含密碼子或密碼子模板的核酸鏈，以及這種核酸鏈在雙鏈的核酸分子情況下的互補(bǔ)序列。不是編碼區(qū)的核酸區(qū)域可被稱(chēng)作非編碼區(qū)。轉(zhuǎn)錄的信使RNA分子一般在5'端和3'端都包括非編碼區(qū)。真核raRNA分子還可以包括內(nèi)部非編碼區(qū),例如內(nèi)含子。一些類(lèi)型的:RNA分子可不包括功能性編碼區(qū)，例如tRNA和rRNA分子。1.適體結(jié)構(gòu)域適體是可與特定化合物和特定類(lèi)別的化合物選擇性結(jié)合的核酸區(qū)段和結(jié)構(gòu)。核糖開(kāi)關(guān)具有在與觸發(fā)分子結(jié)合時(shí)可導(dǎo)致該核糖開(kāi)關(guān)的狀態(tài)或結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的適體結(jié)構(gòu)域。在功能性核糖開(kāi)關(guān)中，當(dāng)觸發(fā)分子與適體結(jié)構(gòu)域結(jié)合時(shí),連接至所述適體結(jié)構(gòu)域的表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域的狀態(tài)或結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變。核糖開(kāi)關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域可從任何來(lái)源獲得，包括例如核糖開(kāi)關(guān)的天然適體結(jié)構(gòu)域，人工適體，經(jīng)工程改造、選擇、演化或衍生得到的適體或適體結(jié)構(gòu)域。核糖開(kāi)關(guān)中的適體的至少一部分通?？膳c相連的表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域的一部分例如通過(guò)形成莖結(jié)構(gòu)發(fā)生相互作用。與觸發(fā)分子結(jié)合時(shí)可形成或破壞這種莖結(jié)構(gòu)。多種天然核糖幵關(guān)的共有適體結(jié)構(gòu)域顯示于美國(guó)申請(qǐng)公幵文本No.2005-0053951的圖11和本文他處。這些適體結(jié)構(gòu)域(包括其中包含的所有直接變種)可用于核糖開(kāi)關(guān)。共有序列和結(jié)構(gòu)可明示序列和結(jié)構(gòu)中的變異情況。明示的變異范圍內(nèi)的適體結(jié)構(gòu)域在本文中稱(chēng)為直接變種。這些適體結(jié)構(gòu)域可被修改以產(chǎn)生被修改的適體結(jié)構(gòu)域或變種適體結(jié)構(gòu)域。保守性修改包括使得堿基對(duì)中的核苷酸仍保持互補(bǔ)的堿基配對(duì)的核苷酸的任何改變。中度修改包括莖或環(huán)(其長(zhǎng)度或長(zhǎng)度范圍被明示)的長(zhǎng)度改變小于或等于明示長(zhǎng)度范圍的20%。在共有結(jié)構(gòu)顯示出特定長(zhǎng)度的莖或環(huán),或列出或示出長(zhǎng)度范圍的情況下,環(huán)和莖被認(rèn)為是“明示的”。中度修改包括莖或環(huán)(其長(zhǎng)度或長(zhǎng)度范圍未被明示)的長(zhǎng)度改變小于或等于明示長(zhǎng)度范圍的40%。中度修改還包括適體結(jié)構(gòu)域未明示部分的功能性變種。公開(kāi)的核糖開(kāi)關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域也可作為適體用于任何其他目的和任何其他環(huán)境。例如,在結(jié)構(gòu)變化會(huì)影響RNA的功能的情況下,適體可被用于控制核酶、其他分子開(kāi)關(guān)和任何RNA分子。2.表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域是核糖開(kāi)關(guān)的一部分，其影響含有所述核糖開(kāi)關(guān)的RNA分子的表達(dá)。表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域通常有至少一部分可與相連的適體結(jié)構(gòu)域的--部分相互作用，如通過(guò)形成莖結(jié)構(gòu)。與觸發(fā)分子結(jié)合時(shí)可形成或破壞這種莖結(jié)構(gòu)。通常情況下，所述莖結(jié)構(gòu)要么就是表達(dá)調(diào)控結(jié)構(gòu)，要么防止形成表達(dá)調(diào)控結(jié)構(gòu)。表達(dá)調(diào)控結(jié)構(gòu)是可允許、阻止、加強(qiáng)或抑制含有該結(jié)構(gòu)的RNA分子的表達(dá)的結(jié)構(gòu)。實(shí)例包括SD(Shine-Dalgarno)序列、起始密碼子、轉(zhuǎn)錄終止子，以及穩(wěn)定信號(hào)和加工信號(hào),例如RNA剪接點(diǎn)和控制元件。對(duì)于剪接的調(diào)節(jié)，在表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域中將包括剪接點(diǎn)、可變剪接點(diǎn)和/或內(nèi)含子的分支位點(diǎn)包括在內(nèi)是有用的。這種平臺(tái)表達(dá)結(jié)構(gòu)域與核糖開(kāi)關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域中的序列的相互作用可由所述表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域和所述適體結(jié)構(gòu)域之間的互補(bǔ)序列介導(dǎo)。B.觸發(fā)分子觸發(fā)分子是可激活核糖幵關(guān)的分子和化合物。這包括核糖幵關(guān)的天然或正常的觸發(fā)分子和其他可激活核糖開(kāi)關(guān)的化合物。天然或正常觸發(fā)分子是給定的天然核糖開(kāi)關(guān)本來(lái)就有的觸發(fā)分子,或者對(duì)于某些非天然核糖開(kāi)關(guān)而言是這樣的觸發(fā)分子該核糖開(kāi)關(guān)針對(duì)該觸發(fā)分子被設(shè)計(jì)或該核糖開(kāi)關(guān)通過(guò)該觸發(fā)分子被選擇(正如在例如體外選擇或體外進(jìn)化技術(shù)中那樣)。C.化合物還公開(kāi)了可激活、滅活或阻斷核糖開(kāi)關(guān)的化合物和含有這些化合物的組合物。核糖開(kāi)關(guān)通過(guò)結(jié)合或去除觸發(fā)分子來(lái)起到控制基因表達(dá)的作用?；衔锟捎糜诩せ?、滅活或阻斷核糖幵關(guān)。核糖開(kāi)關(guān)的觸發(fā)分子(以及其他激活化合物)可用于激活核糖幵關(guān)。觸發(fā)分子以外的化合物通?？捎糜跍缁罨蜃钄嗪颂情_(kāi)關(guān)。核糖開(kāi)關(guān)也可通過(guò)例如從所述核糖開(kāi)關(guān)所在處除去觸發(fā)分子而失活。核糖開(kāi)關(guān)可通過(guò)例如與不激活該核糖開(kāi)關(guān)的觸發(fā)分子類(lèi)似物結(jié)合而被阻斷。還公開(kāi)了用于改變RNA分子或編碼RNA分子的基因的表達(dá)的化合物，其中所述RNA分子包含核糖開(kāi)關(guān)。這可通過(guò)使化合物與所述RNA分子接觸來(lái)實(shí)現(xiàn)。核糖開(kāi)關(guān)通過(guò)結(jié)合或去除觸發(fā)分子來(lái)起到控制基因表達(dá)的作用。因此,將包含核糖開(kāi)關(guān)的目的RNA分子置于激活、滅活或阻斷所述核糖開(kāi)關(guān)的條件下,可用于改變所述RNA的表達(dá)。表達(dá)可因例如轉(zhuǎn)錄被終止或核糖體與所述RNA的結(jié)合受到阻斷而改變。與觸發(fā)分子的結(jié)合可減少或阻止所述RNA分子的表達(dá)，或者可促進(jìn)或增加所述RNA分子的表達(dá)，這取決于核糖開(kāi)關(guān)的性質(zhì)。還公開(kāi)了用于調(diào)節(jié)RNA分子或編碼RNA分子的基因的表達(dá)的化合物。還公開(kāi)了通過(guò)激活、滅活或阻斷核糖開(kāi)關(guān)來(lái)調(diào)節(jié)含有所述核糖開(kāi)關(guān)的天然存在的基因或RNA的表達(dá)的化合物。如果所述基因?qū)兴募?xì)胞或生物體的存活是必需的，那么激活、滅活或阻斷所述核糖幵關(guān)可導(dǎo)致所述細(xì)胞或生物體的死亡、瘀滯或虛弱。還公開(kāi)了通過(guò)激活、失活或阻斷核糖開(kāi)關(guān)來(lái)調(diào)節(jié)經(jīng)分離、工程改造或重組得到的含有所述核糖開(kāi)關(guān)的基因或RNA的表達(dá)的化合物。由于本文公開(kāi)的核糖開(kāi)關(guān)可控制可變剪接，所以激活、滅活或阻斷所述核糖開(kāi)關(guān)可調(diào)節(jié)基因表達(dá)。核糖幵關(guān)作為對(duì)這種調(diào)節(jié)的一級(jí)控制的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是核糖開(kāi)關(guān)觸發(fā)分子可以是非抗原小分子。還公開(kāi)了識(shí)別可激活、滅活或阻斷核糖開(kāi)關(guān)的化合物的方法。例如，激活核糖開(kāi)關(guān)的化合物可通過(guò)使測(cè)試化合物與核糖開(kāi)關(guān)相接觸并評(píng)估所述核糖開(kāi)關(guān)的激活情況來(lái)識(shí)另ij。如果所述核糖幵關(guān)被激活，那么所述測(cè)試化合物就被識(shí)別為可激活所述核糖幵關(guān)的化合物。可用任何合適的方式評(píng)估核糖開(kāi)關(guān)的激活情況。例如，核糖開(kāi)關(guān)可被連接至一個(gè)報(bào)告RNA,然后在存在和不存在所述測(cè)試化合物的情況下測(cè)量所述報(bào)告RNA的表達(dá)、表達(dá)水平或表達(dá)水平的變化。作為另一個(gè)實(shí)例，所述核糖幵關(guān)可包括一個(gè)構(gòu)象依賴(lài)標(biāo)簽，其信號(hào)根據(jù)所述核糖開(kāi)關(guān)的激活狀態(tài)而改變。這種核糖開(kāi)關(guān)優(yōu)選地使用取自或衍生自天然存在的核糖開(kāi)關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域。可以看出，對(duì)核糖開(kāi)關(guān)的激活情況進(jìn)行評(píng)估使用或不使用對(duì)照測(cè)定或測(cè)量均可。識(shí)別滅活核糖開(kāi)關(guān)的化合物的方法可按類(lèi)似方式進(jìn)行。對(duì)阻斷核糖開(kāi)關(guān)的化合物的識(shí)別可通過(guò)任何合適的方法來(lái)完成。例如，可在已知可激活或滅活核糖開(kāi)關(guān)的化合物存在的情況下和在測(cè)試化合物存在的情況下進(jìn)行評(píng)估所述核糖開(kāi)關(guān)的激活或失活的測(cè)定。如果未觀察到在所述測(cè)試化合物不存在的情況下可觀察到的激活或失活,那么所述測(cè)試化合物被識(shí)別為阻斷所述核糖開(kāi)關(guān)被激活或滅活的化合物。還公幵了通過(guò)識(shí)別可激活、滅活或阻斷核糖幵關(guān)的化合物和并所識(shí)別出的化合物而制得的化合物。這可以通過(guò)例如將本文其他部分公開(kāi)的化合物識(shí)別方法與生產(chǎn)所識(shí)別出的化合物的方法結(jié)合使用而實(shí)現(xiàn)。例如,可通過(guò)下述方法制備化合物使待測(cè)化合物和核糖開(kāi)關(guān)相接觸,評(píng)估核糖開(kāi)關(guān)的激活，以及如果核糖開(kāi)關(guān)被待測(cè)化合物激活，則制備該激活核糖幵關(guān)的待測(cè)化合物作為所述化合物。還公開(kāi)了通過(guò)檢測(cè)某種化合物對(duì)核糖開(kāi)關(guān)的激活、滅活或阻斷作用并生產(chǎn)該經(jīng)檢測(cè)的化合物而制得的化合物。這可以通過(guò)例如將本文其他部分公開(kāi)的化合物激活、滅活或阻斷評(píng)估方法與生產(chǎn)經(jīng)檢測(cè)的化合物的方法結(jié)合使用而實(shí)現(xiàn)。例如,可通過(guò)下述方法制備化合物使待測(cè)化合物和核糖幵關(guān)相接觸，評(píng)估核糖幵關(guān)的激活，以及如果核糖開(kāi)關(guān)被待測(cè)化合物激活，則制備該激活核糖開(kāi)關(guān)待測(cè)化合物作為所述化合物。檢測(cè)化合物激活、滅活或阻斷核糖開(kāi)關(guān)的能力指的是對(duì)以前并不知道可否激活、滅活或阻斷核糖開(kāi)關(guān)的化合物的鑒定，以及對(duì)已知可激活、滅活或阻斷核糖開(kāi)關(guān)的化合物的激活、滅活或阻斷核糖開(kāi)關(guān)的能力的評(píng)估。還公開(kāi)了用于激活核糖開(kāi)關(guān)的具體化合物?？捎糜赥PP應(yīng)答性核糖開(kāi)關(guān)的化合物包括具有下式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>該化合物可結(jié)合TPP應(yīng)答性核糖開(kāi)關(guān)或其衍生物，其中R1帶正電，其中R2和R3每一個(gè)均獨(dú)立地為c、()或S，其中R4為CH3、:NH2、0H、SH、H:或不存在，其中R5為CH3、NH2、0H、SH或H，其中R6為C或N，并且其中每個(gè)“——”獨(dú)立地代表單鍵或雙鍵。還考慮了在按上述定義的化合物中其中R1為磷酸根、二磷酸根或三磷酸根的情況。在上述定義范圍內(nèi)的每一種化合物都意圖在并應(yīng)被認(rèn)為是在本文中具體地公開(kāi)。此外,在上述定義范圍內(nèi)可識(shí)別的每個(gè)亞群都意圖在并應(yīng)被認(rèn)為是在本文中具體地公開(kāi)。因此，特別考慮了任何化合物或化合物的亞群可具體包括在用途中或從用途中排除，或者包括在化合物列表中或從化合物列表中排除。例如,作為一種選擇，如果有某一組化合物，其中每種化合物都符合上述定義但并不是TPP、TP或硫胺素,那么該組也是被考慮到的。作為另--個(gè)實(shí)例,如果有某一組化合物,其中每種化合物都符合上述定義而且能激活TPP應(yīng)答性核糖幵關(guān)，那么該組也是被考慮到的。硫胺素焦磷酸(TPP)是TPP-應(yīng)答性核糖幵關(guān)的觸發(fā)分子，可激活TPP-應(yīng)答性核糖開(kāi)關(guān)。吡啶硫胺素焦磷酸可激活TPP-應(yīng)答性核糖開(kāi)關(guān)。吡啶硫胺素和吡啶硫胺素焦磷酸可獨(dú)立地及具體地包括在本文公開(kāi)的化合物、觸發(fā)分子和方法中，或者從本文公開(kāi)的化合物、觸發(fā)分子和方法排除。硫胺素和硫胺素焦磷酸可獨(dú)立地及具體地包括在本文公幵的化合物、觸發(fā)分子和方法中，或者從本文公幵的化合物、觸發(fā)分子和方法排除。D.構(gòu)建體、載體和表達(dá)系統(tǒng)所公開(kāi)的核糖開(kāi)關(guān)可在任何合適的表達(dá)系統(tǒng)中使用。重組表達(dá)可以使用例如質(zhì)粒等載體來(lái)有效實(shí)現(xiàn)。載體可包括與核糖幵關(guān)編碼序列可操作地連接的啟動(dòng)子和待表達(dá)的RNA(例如,編碼蛋白的RNA)。載體還可包括轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的其他元件。本文所述的載體指的是包含外源DNA的任何載體。因此，載體是可將外源核酸不降解地轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中的媒介，它包括啟動(dòng)子，可在它轉(zhuǎn)入的細(xì)胞中表達(dá)所述核酸。載體包括但不限于質(zhì)粒、病毒核酸、病毒、噬菌體核酸、噬菌體、粘粒和人工染色體?？梢陨a(chǎn)多種適于攜帶核糖幵關(guān)調(diào)節(jié)的構(gòu)建體的原核和真核的表達(dá)載體。這類(lèi)表達(dá)載體包括例如pET、pET3d、pCR2.l、pBAD、pUC和酵母載體。載體可在例如各種體內(nèi)和體外環(huán)境中使用。病毒載體包括腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、AIDS病毒、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)病毒(neuronaltrophicvirus)、辛德畢斯病毒(Sindbis)和其他RNA病毒，包括具有HIV骨架的那些病毒。還可使用與上述病毒具有共同的使其適于用作載體的性質(zhì)的任何病毒家族。由Verma(1985)描述的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括鼠類(lèi)馬羅尼白血病病毒MMLV和表現(xiàn)MMLV作為載體所需性質(zhì)的逆轉(zhuǎn)錄病毒。通常,病毒載體包括非結(jié)構(gòu)性早期基因、結(jié)構(gòu)性晚期基因、RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄物、復(fù)制和殼體化必需的反向末端重復(fù)序列以及控制病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的啟動(dòng)子。當(dāng)被基因工程改造用作載體時(shí),通常要移除病毒的一個(gè)或多個(gè)早期基因，并將一個(gè)基因或基因/啟動(dòng)子盒插入到病毒基因組中代替被移除的病毒DNA?！皢?dòng)子”通常為位于與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相對(duì)固定的位置發(fā)揮功能的一個(gè)或多個(gè)DNA序列。“啟動(dòng)子”包括與RNA聚合酶發(fā)生基本相互作用所需的核心元件和轉(zhuǎn)錄因子，還可包括上游元件和應(yīng)答元件?！霸鰪?qiáng)子”通常指的是為位于與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相對(duì)不固定的位置發(fā)揮功能的DNA序列，它可以在轉(zhuǎn)錄單位的5，(Laimins,1981)或3，(Luskyetal.，1983)。此外，增強(qiáng)子除了可以在編碼序列本身之中(Osborneetal.，1984)，也可以在內(nèi)含子中(Baiierjietal.，1983)。它們的長(zhǎng)度通常為IObp至300bp之間，并且以順式方式發(fā)揮作用。增強(qiáng)子的功能是增加鄰近的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子與啟動(dòng)子類(lèi)似,也經(jīng)常含有介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)的應(yīng)答元件。增強(qiáng)子經(jīng)常對(duì)表達(dá)的調(diào)節(jié)有決定性作用。用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲(chóng)、植物、動(dòng)物、人類(lèi)或有核細(xì)胞)中的表達(dá)載體還可包括可以影響raRNA表達(dá)的轉(zhuǎn)錄終止所必需的序列。這些區(qū)域在編碼組織因子蛋白的mRNA的非翻譯部分中以多腺苷酸化區(qū)段的形式被轉(zhuǎn)錄。3’非翻譯區(qū)還包括轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄單位也包括多腺苷酸化區(qū)域。這一區(qū)域的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它增加了被轉(zhuǎn)錄的單位像mRNA—樣被加工和轉(zhuǎn)運(yùn)的可能性。多腺苷酸化信號(hào)在表達(dá)構(gòu)建體中的鑒定和用途已經(jīng)廣為人知。優(yōu)選地,在轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中使用同源的多腺苷酸化信號(hào)。載體可包括編碼標(biāo)記物產(chǎn)物的核酸序列。使用這種標(biāo)記物產(chǎn)物來(lái)確定基因是否被送遞至細(xì)胞以及在送遞后是否被表達(dá)。優(yōu)選的標(biāo)記物基因?yàn)榫幋aβ-半乳糖苷酶的大腸桿菌IacZ基因和綠色熒光蛋白。在一些實(shí)施方案中,標(biāo)記物可為篩選標(biāo)記物。當(dāng)這類(lèi)篩選標(biāo)記物被成功地轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞中時(shí)，如果將宿主細(xì)胞置于篩選壓力F，則被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以存活。目前廣泛使用的有兩類(lèi)不同的篩選策略。第一類(lèi)是基于細(xì)胞代謝，使用離開(kāi)添加培養(yǎng)基就不能生長(zhǎng)的突變細(xì)胞系。第二類(lèi)為顯性篩選,它指的是在任何細(xì)胞類(lèi)型中都可使用而不必使用突變細(xì)胞系的篩選方案。這些方案通常使用抑制宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物。含有新基因的那些細(xì)胞可以表達(dá)使細(xì)胞具有藥物抗性的蛋白質(zhì)，從而可以在篩選中存活。這類(lèi)顯性篩選的實(shí)例中使用的藥物有新霉素(SouthernandBerg，1982)、霉酚酸(MulliganandBerg，1980)或潮霉素(Sugdenetal.，1985)可以使用遺傳物質(zhì)的直接轉(zhuǎn)移來(lái)獲得基因轉(zhuǎn)移,所述遺傳物質(zhì)包括在質(zhì)粒、病毒載體、病毒核酸、噬菌體核酸、噬菌體、粘粒和人工染色體中，但不限于此，或者通過(guò)細(xì)胞或載體例如陽(yáng)離子脂質(zhì)體中的遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移來(lái)獲得基因轉(zhuǎn)移。這類(lèi)方法為本領(lǐng)域所熟知，并且可以很容易的使之適用于本文所述的方法。轉(zhuǎn)移載體可為任何可將基因送遞至細(xì)胞內(nèi)的核苷酸構(gòu)建體(例如質(zhì)粒)，或者作為送遞基因的總體策略的一部分，例如作為重組逆轉(zhuǎn)錄病毒或重組腺病毒的一部分(Rametal.CancerRes.53:83_88，(1993))。用于轉(zhuǎn)染的合適手段包括病毒載體、化學(xué)轉(zhuǎn)染子或物理-機(jī)械方法例如電穿孔和DNA的直接擴(kuò)散，這些手段描述于例如，Wolff,J.Α.，etal.,Science,247,1465-1.468，(1990)；和Wolff,J.A.Nature,352,815-818,(1991)。1.病毒載體優(yōu)選的病毒載體為腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、AIDS病毒、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)病毒、辛德畢斯病毒和其他RNA病毒，包括具有HIV骨架的那些病毒。還優(yōu)選的是與上述病毒具有共同的使其適于用作載體的性質(zhì)的任何病毒家族。優(yōu)選的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括鼠類(lèi)馬羅尼白血病病毒MMLV和表現(xiàn)MMLV作為載體所需性質(zhì)的逆轉(zhuǎn)錄病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以比其他載體病毒攜帶更大的基因載量，即攜帶轉(zhuǎn)基因或標(biāo)記物基因，因此是常用的載體。但是它們不能用于非增殖細(xì)胞。腺病毒載體相對(duì)穩(wěn)定并易于操作、具有高滴度、可在氣溶膠制劑中送遞并可以轉(zhuǎn)染非分裂細(xì)胞。Pox病毒載體較大并具有多個(gè)可插入基因的位點(diǎn)，它們對(duì)熱穩(wěn)定，可在室溫下儲(chǔ)存。優(yōu)選的實(shí)施方案為經(jīng)過(guò)基因工程改造的病毒載體，這樣可以抑制宿主生物由病毒抗原引起的免疫反應(yīng)。優(yōu)選的這種類(lèi)型的載體應(yīng)攜帶白細(xì)胞介素8或1.0的編碼區(qū)域。病毒載體與大多數(shù)將基因?qū)爰?xì)胞的化學(xué)或物理方法相比，具有更高的處理能力(導(dǎo)入基因的能力)。通常，病毒載體包括非結(jié)構(gòu)性早期基因、結(jié)構(gòu)性晚期基因、RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄物、復(fù)制和殼體化必需的反向末端重復(fù)序列以及控制病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的啟動(dòng)子。當(dāng)被基因工程改造用作載體時(shí),通常要移除病毒的一個(gè)或多個(gè)早期基因，并將一個(gè)基因或基因/啟動(dòng)子盒插入到病毒基因組中代替被移除的病毒DNA。這種類(lèi)型的構(gòu)建體可以攜帶最多達(dá)約8kb的外源遺傳物質(zhì)。被移除的早期基因的必需功能通常由經(jīng)過(guò)基因工程改造而反式表達(dá)早期基因的基因產(chǎn)物的細(xì)胞系提供。i.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒為屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科的動(dòng)物病毒，包括任何類(lèi)型、亞科、屬或向性。Verma,I.M.,Retrovircilvectorsforgenetransfer.InMicrobiology—1985，AmericanSocietyforMicrobiology,pp.229-232,Washington,(1985)總體描述了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,上述文獻(xiàn)以援引的方式納入本文。將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用于基因療法的方法的實(shí)例描述于美國(guó)專(zhuān)利No.4，868，116和4，980，286；PCT申請(qǐng)W090/02806和WO89/07136；以及Mulligan,(Science260:926-932(1993))等文獻(xiàn)中，以上文獻(xiàn)中的教導(dǎo)以援引的方式納入本文。逆轉(zhuǎn)錄病毒本質(zhì)上是-一個(gè)包裝,它將核酸負(fù)載包裹在內(nèi)。核酸負(fù)載攜帶有包裝信號(hào)，這使得復(fù)制出的子代分子可以被有效地包裝在包衣中。除了包裝信號(hào)以外，還有許多復(fù)制和復(fù)制病毒的包裝所需要的順式作用分子。通常逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括參與蛋白質(zhì)衣殼形成的gag、pol和env基因。通常使用待轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞的外源DNA來(lái)替代gag、pol和env基因。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通常包括用于摻入至包衣的包裝信號(hào),起動(dòng)gag轉(zhuǎn)錄單位的信號(hào)序列，逆轉(zhuǎn)錄必需的元件(包括引物結(jié)合位點(diǎn)以結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄的tRNA引物)，在DNA合成過(guò)程中引導(dǎo)RNA鏈轉(zhuǎn)換的末端重復(fù)序列，作為DNA合成中第二鏈合成起始位點(diǎn)的富含嘌呤的序列5'至3’LTR,以及可使DNA狀態(tài)的逆轉(zhuǎn)錄病毒插入到宿主基因組中的LTR末端附近的特異性序列。gag、pol和env基因的移除可以使得約Skb的外源序列被插入到病毒基因組中、被反轉(zhuǎn)錄以及在復(fù)制后被包裝到新的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中。根據(jù)每種轉(zhuǎn)錄物的大小，—丨二述核酸量足夠送遞一至多個(gè)基因。優(yōu)選地，在插入物中與其他基因一起含有陽(yáng)性或陰性的篩選標(biāo)記物。由于在大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，復(fù)制機(jī)制和包裝蛋白(gag、pol和env)已經(jīng)被移除，通常通過(guò)將載體置于包裝細(xì)胞系中來(lái)生產(chǎn)載體。包裝細(xì)胞系為已被含有復(fù)制和包裝機(jī)制但不含任何包裝信號(hào)的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。當(dāng)攜帶所選DNA的載體被轉(zhuǎn)染到這些細(xì)胞系中時(shí)，包含目的基因的載體通過(guò)輔助細(xì)胞提供的順式機(jī)制而被復(fù)制并包裝到新的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中。而具有該機(jī)制的基因組因?yàn)闆](méi)有必需的信號(hào)而不被包裝。ii.腺病毒載體對(duì)于復(fù)制缺陷型腺病毒的構(gòu)建，前人已有所描述(Berkneretal.,J.Virology61:1213-1220(1987)；Massieetal.，mo1·Ce1:[.Biο1·62872-2883(1986)；Haj-Ahmadetal.，J.Virology51:261_21A(1986)；Davidsonetal.，J.Virology611226-1239(1987)；Zhang“Generationandidentificationofrecombinantadenovirusbyliposome-mediatedtransfectionandPCRanalysis"BioTechniques15:868-872(1993))。使用這些病毒作為載體的優(yōu)點(diǎn)是它們散播至其他細(xì)胞類(lèi)型的程度是有限的，因?yàn)樗鼈兛梢栽诔跏几腥镜募?xì)胞中復(fù)制,但是它們不能形成新的感染性病毒顆粒。重組腺病毒在直接體內(nèi)送遞至下列組織時(shí)已表現(xiàn)出可獲得很高的基因轉(zhuǎn)移效率氣道上皮、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮、CNS實(shí)質(zhì)以及多種其他組織位點(diǎn)(Morsy,J.Clin.Invest.921580-1586(1993)；Kirshenbaum,J.Clin.Invest.92:381-387(1993)；Roessler,J.Clin.Invest.921085-1092(1993)；Moullier,NatureGenetics4154-159(1993)；LaSalle,Science259:988-990(1993)；Gomez-Foix，J.Biol.Chem.267:25129_25134(1992)；Rich,HumanGeneTherapy4:461-476(1993)；Ztibner,NatureGenetics6:75-83(1994);Guzman,CirculationResearch731201-1207(1993)；Bout,HumanGeneTherapy53-10(1994)；Zabner,Cell75207-216(1993)；Caillaud,Eur.J.Neuroscience51287-1291(1993)；和Ragot，J.Gen.Virology74:501-507(1993))。重組腺病毒與野生型或復(fù)制缺陷型腺病毒一樣,通過(guò)結(jié)合特異性細(xì)胞表面受體而完成基因轉(zhuǎn)導(dǎo),然后病毒通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞作用而內(nèi)化(Chardonnet.andDales,Virology40:462-477(1970)；BrownandBurlingham,J.Virologyl2:386_396(1973)；SvenssonandPersson,J.Virology55442-449(1985)；Seth,etal.，J.Virol.51:650-655(1984)；Seth,etal.，mol.Cell.Biol.41528-1533(1984)；Vargaetal.,J.Virology65:6061-6070(1991)；Wickhametal.，Cell73:309_319(1993))。一種優(yōu)選的病毒載體為基于移除了El基因的腺病毒的載體，這些病毒在例如人類(lèi)293細(xì)胞的細(xì)胞系中產(chǎn)生。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，El和E3基因都被從腺病毒基因組中移除。另一類(lèi)病毒載體是基于腺伴隨病毒(AAV)。這種缺陷型細(xì)小病毒是一種優(yōu)選的載體，因?yàn)樗梢愿腥驹S多種細(xì)胞類(lèi)型，并且對(duì)人類(lèi)沒(méi)有致病性。AAV型載體可以轉(zhuǎn)運(yùn)4至5kb的基因，并且已知野生型AAV可以穩(wěn)定地插入到第19號(hào)染色體上。具有這種位點(diǎn)特異性整合性質(zhì)的載體為優(yōu)選的。這種載體的一種特別優(yōu)選的實(shí)施方案是由Avigen,SanFrancisco,CA生產(chǎn)的P4.IC載體,它可包含單純皰疹病毒胸苷激酶基因、HSV_tk和/或標(biāo)記物基因，例如編碼綠色熒光蛋白GFP的基因。在病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒中插入的基因經(jīng)常含有啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子以輔助對(duì)所需基因產(chǎn)物的表達(dá)的控制。啟動(dòng)子通常為位于與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相對(duì)固定的位置時(shí)可以發(fā)揮功能的--個(gè)或多個(gè)DNA序列?！皢?dòng)子”包含與RNA聚合酶發(fā)生基本相互作用所需的核心元件和轉(zhuǎn)錄因子，還可包含上游元件和應(yīng)答元件。2.病毒啟動(dòng)子和增強(qiáng)子控制哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的載體轉(zhuǎn)錄的優(yōu)選啟動(dòng)子可由各種來(lái)源獲得,例如,諸如下列病毒的基因組多瘤病毒、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒，最優(yōu)選巨細(xì)胞病毒；或者來(lái)源于異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子例如β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子可以方便地以同樣包括SV40病毒復(fù)制起始位點(diǎn)的SV40限制性片段的形式獲得(Fiersetal.,Nature,273113(1978))0人類(lèi)巨細(xì)胞病毒的即時(shí)早期啟動(dòng)子可以方便地以HindIIIE限制性片段的形式獲得(Greenway,PJ.etal.，Gene18355-360(1982))當(dāng)然，來(lái)自宿主細(xì)胞或相關(guān)物種的啟動(dòng)子也在此有用?！霸鰪?qiáng)子”通常指的是為位于與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相對(duì)不固定的位置發(fā)揮功能的DNA序列，它可以在轉(zhuǎn)錄單位的5，(Laimins,L.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.78993(1981))或3，(Lusky,M.L.，etal.，Mol.Cellbio.31108(1983))。此外,增強(qiáng)子除了可以在編碼序列本身之中(Osborne,Τ.F.,etal.,mol.Cellbio.4:1293(1984))，也可以在內(nèi)含子中(Banerji，J.L.etal.,Cell33:729(1983))。它們的長(zhǎng)度通常為IObp至300bp之間，并且以順式方式發(fā)揮作用。增強(qiáng)子的功能是增加鄰近的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子還經(jīng)常含有介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)的應(yīng)答元件。增強(qiáng)子還經(jīng)常含有介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)的應(yīng)答元件。增強(qiáng)子經(jīng)常對(duì)表達(dá)的調(diào)節(jié)有決定性作用。雖然許多來(lái)自哺乳動(dòng)物基因的增強(qiáng)子的序列是已知的(珠蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰島素)，但是通常還是使用來(lái)自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。優(yōu)選的實(shí)例為在復(fù)制起點(diǎn)下游(lateside)的SV40增強(qiáng)子(bpl00_270)、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、在復(fù)制起點(diǎn)F游的多瘤病毒增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子。啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子可以被能觸發(fā)它們功能的光或特異性化學(xué)事件特異性地激活?？梢杂美缢沫h(huán)素和地塞米松等試劑來(lái)調(diào)節(jié)系統(tǒng)。也有一些方法通過(guò)暴露于例如Y輻照的輻照方法或烷基化化療藥物來(lái)增強(qiáng)病毒載體的基因表達(dá)。優(yōu)選地，啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子區(qū)域在所有真核細(xì)胞類(lèi)型中都是有活性的。這種類(lèi)型的一種優(yōu)選的啟動(dòng)子為CMV啟動(dòng)子(650個(gè)堿基)。其他優(yōu)選的啟動(dòng)子為SV40啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(全長(zhǎng)啟動(dòng)子)和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LTF。已顯示所有的特異性調(diào)節(jié)元件都可被克隆和用于構(gòu)建在特定細(xì)胞類(lèi)型例如黑素瘤細(xì)胞中選擇性表達(dá)的表達(dá)載體。神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)啟動(dòng)子已被用于在神經(jīng)膠質(zhì)來(lái)源的細(xì)胞中選擇性表達(dá)基因。用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲(chóng)、植物、動(dòng)物、人類(lèi)或有核細(xì)胞)中的表達(dá)載體還可包含可以影響mRNA表達(dá)的轉(zhuǎn)錄終止所必需的序列。這些區(qū)域在編碼組織因子蛋白的mRNA的非翻譯部分中以多腺苷酸化區(qū)段的形式被轉(zhuǎn)錄。3’非翻譯區(qū)還包括轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄單位也包括多腺苷酸化區(qū)域。這一區(qū)域的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它增加了被轉(zhuǎn)錄的單位像raRNA—樣被加工和轉(zhuǎn)運(yùn)的可能性。多腺苷酸化信號(hào)在表達(dá)構(gòu)建體中的鑒定和用途已經(jīng)廣為人知。優(yōu)選地,在轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中使用同源的多腺苷酸化信號(hào)。在轉(zhuǎn)錄單位的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，多腺苷酸化區(qū)域來(lái)自SV40早期多腺苷酸化信號(hào)，由大約400個(gè)堿基組成。還優(yōu)選地,轉(zhuǎn)錄單位單獨(dú)包括其他標(biāo)準(zhǔn)序列或包括其他標(biāo)準(zhǔn)序列和上述序列，改進(jìn)構(gòu)建體的表達(dá)或穩(wěn)定性。3.標(biāo)記物載體可包括編碼標(biāo)記物產(chǎn)物的核酸序列。使用這種標(biāo)記物產(chǎn)物來(lái)確定基因是否被送遞至細(xì)胞以及在送遞后是否被表達(dá)。優(yōu)選的標(biāo)記物基因?yàn)榫幋aβ半乳糖苷酶的大腸桿菌:IacZ基因和綠色熒光蛋白。在--些實(shí)施方案中,標(biāo)記物可為篩選標(biāo)記物。用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的篩選標(biāo)記物的實(shí)例為二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素類(lèi)似物G418、潮霉素和嘌呤霉素。當(dāng)這類(lèi)篩選標(biāo)記物被成功地轉(zhuǎn)移至哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中時(shí),如果將宿主細(xì)胞置于篩選壓力下，則被轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞可以存活。目前廣泛使用的有兩類(lèi)不同的篩選策略。第一類(lèi)是基于細(xì)胞代謝,使用離開(kāi)添加培養(yǎng)基就不能生長(zhǎng)的突變細(xì)胞系。兩個(gè)實(shí)例為=CHODHFR-細(xì)胞和小鼠LTK-細(xì)胞。這些細(xì)胞在不添加如胸苷或次黃嘌呤營(yíng)養(yǎng)物的情況下就不能生長(zhǎng)。由于這些細(xì)胞缺乏完整的核苷酸合成途徑中必需的某些基因，因此除非在添加培養(yǎng)基中提供那種沒(méi)有的核苷酸，否則細(xì)胞就不能存活。另一種補(bǔ)充培養(yǎng)基的方式是將完整的DHFR或TK基因?qū)肴狈ο鄳?yīng)基因的細(xì)胞中，由此改變它們的生長(zhǎng)需求。未被DiFR或TK基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞將不能在非添加培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。第二類(lèi)為顯性篩選，它指的是在任何細(xì)胞類(lèi)型中都可使用而不必使用突變細(xì)胞系的篩選方案。這些方案通常使用抑制宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物。那些細(xì)胞可以表達(dá)使細(xì)胞具有藥物抗性的蛋白質(zhì),從而可以在篩選中存活。這類(lèi)顯性篩選的實(shí)例中使用的藥物有新霉素(SouthernP.andBerg,P.，J.Molec.App1.Genet.1:327(1982))、霉酚酸(Mulligan,R.C.andBerg,P.Science209:1422(1980))或潮霉素(Sugden,B.etal.,mol.Cell.Biol.5:410-413(1985))。這三個(gè)實(shí)例使用了真核控制下的細(xì)菌基因來(lái)分別賦予細(xì)胞對(duì)于合適的藥物G418或新霉素(遺傳霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。其他的還有新霉素類(lèi)似物G418和嘌呤霉素。E.生物傳感器核糖開(kāi)關(guān)還公開(kāi)了生物傳感器核糖開(kāi)關(guān)。生物傳感器核糖開(kāi)關(guān)是經(jīng)過(guò)基因工程改造的核糖開(kāi)關(guān)，它們?cè)诖嬖谒鼈兊耐N觸發(fā)分子時(shí)產(chǎn)生可檢出的信號(hào)。可用的生物傳感器核糖幵關(guān)可以在觸發(fā)分子達(dá)到或超過(guò)閾值水平時(shí)被觸發(fā)。生物傳感器核糖開(kāi)關(guān)可被設(shè)計(jì)為體內(nèi)應(yīng)用或體外應(yīng)用。例如，與編碼作為信號(hào)的蛋白質(zhì)或參與產(chǎn)生信號(hào)的蛋白質(zhì)的報(bào)告RNA可操作地連接的控制可變剪接的核糖開(kāi)關(guān)可通過(guò)基因工程改造細(xì)胞或生物,使其含有編碼該核糖幵關(guān)的核酸構(gòu)建體從而在體內(nèi)應(yīng)用。用于體外的生物傳感器核糖幵關(guān)的一個(gè)實(shí)例是包括構(gòu)象依賴(lài)性標(biāo)簽的核糖開(kāi)關(guān)，由該標(biāo)簽產(chǎn)生的信號(hào)隨核糖開(kāi)關(guān)的激活狀態(tài)而變化。優(yōu)選地，這種生物傳感器核糖開(kāi)關(guān)使用天然存在的核糖開(kāi)關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域或由天然存在的核糖開(kāi)關(guān)衍生的適體結(jié)構(gòu)域。F.報(bào)告蛋白和報(bào)告肽為評(píng)估核糖開(kāi)關(guān)或生物傳感器核糖開(kāi)關(guān)的激活，可以使用報(bào)告蛋白或報(bào)告肽。報(bào)告蛋白或報(bào)告肽可以由通過(guò)核糖開(kāi)關(guān)調(diào)節(jié)其表達(dá)的RNA編碼。實(shí)施例中描述了一些特異性報(bào)告蛋白的使用。報(bào)告蛋白和報(bào)告肽的使用已為人所熟知，并可以容易地適于與核糖開(kāi)關(guān)一起使用。報(bào)告蛋白可為任意可檢出的或產(chǎn)生可檢出信號(hào)的蛋白質(zhì)或肽。優(yōu)選地，該蛋白質(zhì)或肽的存在可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如放射免疫測(cè)定、放射性標(biāo)記、免疫測(cè)定、酶活性測(cè)定、吸附、熒光、發(fā)光和蛋白質(zhì)印跡)檢測(cè)。更優(yōu)選地，即使在報(bào)告蛋白的水平比較低的情況下，仍然可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)其水平定量?？捎玫膱?bào)告蛋白包括螢光素酶、綠色熒光蛋白以及它們的衍生物，例如北美螢火蟲(chóng)(Photinuspyralis)的螢火蟲(chóng)螢光素酶(FL)和海參(Renillareniformis)的海參螢光素酶(RL)。G.構(gòu)象依賴(lài)性標(biāo)簽構(gòu)象依賴(lài)性標(biāo)簽指的是具有下述性質(zhì)的所有標(biāo)簽在標(biāo)簽所連接的分子或化合物(例如核糖幵關(guān))的形式或構(gòu)象發(fā)生改變的基礎(chǔ)上，該標(biāo)簽可以產(chǎn)生熒光強(qiáng)度或波長(zhǎng)的變化。在使用探針和引物的情況下，使用的構(gòu)象依賴(lài)性標(biāo)簽的實(shí)例包括分子信標(biāo)(raolecularbeacon),Amplifluors,FRET探針、可切割的FRET探針、TaqMan探針、蝎形引物(scorpionprimer)、焚光三聚體寡聚物(fluorescenttriplexoligos)包括但不限于:Ξ:聚體分子信標(biāo)或三聚體FRET探針、熒光水溶性綴合聚合物、PNA探針和QPNA探針。這類(lèi)標(biāo)簽——具體而言它們的功能原理——可適于與核糖開(kāi)關(guān)一起使用。一些類(lèi)型的構(gòu)象依賴(lài)性標(biāo)簽綜述于SchweitzerandKingsmore,Curr.Opin.Biotech.12:21-27(2001)中。莖淬滅標(biāo)簽是構(gòu)象依賴(lài)性標(biāo)簽的一種形式,它是位于核酸上的熒光標(biāo)簽,這樣當(dāng)莖結(jié)構(gòu)形成時(shí)淬滅部分會(huì)接近熒光標(biāo)簽以使得標(biāo)簽發(fā)出的熒光被淬滅。當(dāng)莖結(jié)構(gòu)被破壞時(shí)(例如當(dāng)含有標(biāo)簽的核糖開(kāi)關(guān)被激活時(shí))，淬滅部分就不再接近熒光標(biāo)簽，熒光就會(huì)增強(qiáng)。這種效應(yīng)的實(shí)例可見(jiàn)于分子信標(biāo)、熒光三聚體寡聚物、三聚體分子信標(biāo)、三聚體FRET探針和QPNA探針中，它們的操作原理也可適于與核糖開(kāi)關(guān)一起使用。莖激活標(biāo)簽是構(gòu)象依賴(lài)性標(biāo)簽的一種形式，它是通過(guò)莖結(jié)構(gòu)的形成可以增強(qiáng)或改變熒光的標(biāo)簽或標(biāo)簽對(duì)。莖激活標(biāo)簽可包括受體熒光標(biāo)簽和供體部分，當(dāng)受體和供體相互接近時(shí)(當(dāng)包括標(biāo)簽的核酸鏈形成莖結(jié)構(gòu)時(shí))，熒光共振能量由供體向受體的轉(zhuǎn)移會(huì)使受體發(fā)熒光。莖激活標(biāo)簽通常為位于核酸分子(例如核糖幵關(guān))上的標(biāo)簽對(duì)，這樣當(dāng)核酸分子中形成莖結(jié)構(gòu)時(shí)受體和供體就會(huì)相互接近。如果莖激活標(biāo)簽的供體部分本身就是熒光標(biāo)簽,那么當(dāng)它不與受體接近時(shí)(也就是未形成莖結(jié)構(gòu)時(shí))它就會(huì)以熒光的形式釋放能量(通常這種熒光的波長(zhǎng)與受體熒光的波長(zhǎng)不同)。當(dāng)莖結(jié)構(gòu)形成時(shí),總體的效果是供體熒光減少和受體熒光增加。FRET探針為使用莖激活標(biāo)簽的一個(gè)實(shí)例，它的操作原理也可適于與核糖開(kāi)關(guān)一起使用。H.檢測(cè)標(biāo)簽為幫助對(duì)核糖開(kāi)關(guān)的激活、失活或阻斷進(jìn)行檢測(cè)和量化,或?qū)颂情_(kāi)關(guān)的激活、失活或阻斷后產(chǎn)生的核酸或蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)和量化，可以在檢測(cè)探針或者檢測(cè)分子中導(dǎo)入檢測(cè)標(biāo)簽，或者在表達(dá)的核酸或蛋白質(zhì)中直接導(dǎo)入檢測(cè)標(biāo)簽。本文中所述的檢測(cè)標(biāo)簽為可以與核酸或蛋白質(zhì)直接或間接地相連接、并由此直接或間接地產(chǎn)生可以測(cè)量的可檢測(cè)信號(hào)的任何分子。許多這種標(biāo)簽均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知?？捎糜谒_(kāi)方法的合適的檢測(cè)標(biāo)簽的實(shí)例為放射性同位素、熒光分子、磷光分子、酶、抗體和配體。合適的熒光標(biāo)簽的實(shí)例包括異硫氰酸熒光素(FITC)、5，6-羧甲基熒光素、德克薩斯紅(Texasred)、硝基苯-2-氧雜-1,3-二唑-4-基(NBD)、香豆素、丹酰氯、羅丹明、氨基甲基香豆素(AMCA)、曙紅、藻紅、BODIPY、CascadeBlue、OregonGreen、芘、麗絲胺a—issaraine)、加氧雜蒽(xanthenes)、吖啶、噁嗪、藻紅蛋白、鑭系金屬離子的大環(huán)螯合物例如量子染料、熒光能量轉(zhuǎn)移染料例如噻唑橙乙啡啶異源二聚體、以及花青染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。其他特異性熒光標(biāo)簽的實(shí)例包括3_羥基芘5，8，10-三磺酸、5羥色胺(5HT)、酸性品紅、茜素絡(luò)合酮、茜素紅、別藻藍(lán)蛋白、氨基香豆素、蒽基硬脂酸、阿斯屈拉崇(Astrazon)亮紅4G、阿斯屈拉崇橙R、阿斯屈拉崇紅6B、阿斯屈拉崇黃7GLL、阿的平(Atabrine)、金胺(Auramine)、Aurophosphine、AurophosphineG、BAO9(雙氨基苯基噁二唑)、BCECF、硫酸小檗堿、雙苯酰胺、布蘭科福爾(B1ancophor)FFG溶液、BlancophorSV,BodipyF1、亮磺基黃素FF(BrilliantSulphoflavinFF)、鈣黃綠素藍(lán)(CalcienBlue)、鈣綠(CalciumGreen)、卡爾科弗盧爾(Calcofluor)RW溶液、卡爾科弗盧爾白(CalcofluorWhite)、爾科弗盧爾白ABT溶液、爾科弗盧爾白標(biāo)準(zhǔn)溶液、Carbostyryl,CascadeYellow、兒茶酚胺、奎納克林(Chinacrine)、科里膦O、香豆素-鬼筆環(huán)肽、CY3.18、CY5.18、CY7、Dans(1-二甲基氨基-萘-5-磺酸)、Dansa(二氨基萘磺酸)、丹酰NH-CH3，二氨基苯基噁二唑(DAO)、二甲基氨基-5-磺酸、二吡咯亞甲基二氟化硼、聯(lián)苯亮黃素7GFF、多巴胺、藻紅ITC、吖啶橙(Euchrysin)、FIF(甲醛誘導(dǎo)熒光)、FlazoOrange^Fluo3、焚光胺、Fura-2、Genacryl亮紅EKGenacryl亮黃IOGF^Genacryl粉紅3G、Genacryl黃5GF、GloxalicAcicU粒狀藍(lán)(GranularBlue)、血fl卜啉(Iiaematoporphyrin)、Indo-UIntrawhiteCf液體、雷可福(Leucophor)PAF、雷可福SF、雷可福WS、麗絲胺羅丹明B200(RD200)、螢黃CH(LuciferYellowCH)、螢黃VS、蘇丹紅(MagdalaRed)、MarinaBlue、麥西隆(Maxilon)亮黃素10GFF、麥西隆亮黃素8GFF、MPS(MethylGreenPyronineStilbene,甲基綠焦寧均二苯乙烯)、光神霉素、NBD胺、硝基苯并噁二唑(Nitrobenzoxadidole)、去甲腎上腺素、核堅(jiān)牢紅(NuclearFastRed)、核黃(NuclearYel:[ow)、尼龍山(Kylosan)亮黃素E8G、噁二唑、Pacific藍(lán)、堿性副品紅(Feulgen)、PhorwiteAR溶液、PhorwiteBKL,PhorwiteRev,PhorwiteRPA、膦3R、酞菁(Phthalocyanine)、藻紅蛋白R(shí)、PolyazaindacenePontochromeBlueBlack、口卜啉、Primuline、普施安黃(ProcionYellow)、焦寧(Pyronine)、焦寧B、Pyrozal亮黃素7GF、芥奎吖因(QuinacrineMustard)、羅丹明123、羅丹明5GLD、羅丹明6G、羅丹明B、羅丹明B200、羅丹明BExtra、羅丹明RB、羅丹明BG、羅丹明WT、5_羥色胺、塞夫隆(Sevron)亮紅2B、塞夫隆亮紅4G、塞夫隆亮紅B、塞夫隆橙、塞夫隆黃L、SITS(Primuline)、SITS(均二苯乙烯異硫磺酸，StilbeneIsothiosulphonicacid)、均二苯乙烯、Snarf1、磺基羅丹明BCanC、磺基羅丹明GExtra、四環(huán)素、噻嗪紅R、硫黃素S、硫黃素TCN、硫黃素5、Thiolyte、ThiozolOrange、TinopolCBS、純藍(lán)(TrueBlue)>Ultralite^熒光素鈉(Uranine)B、優(yōu)微添(Uvitex)SFC、二甲苯橙(XyleneOrange)和XRITC。可用的熒光標(biāo)簽為熒光素(5-羧基熒光素-N-羥基琥珀酰亞胺酯)、羅丹明(5，6_四甲基羅丹明)和花青染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。這些熒光染料的最大吸收和發(fā)射波長(zhǎng)分別為:FITC(490nm；520nm)、Cy3(554nm；568nm)、Cy3.5(58Inm；588nm)、Cv5(652nm；672nm)、Cv5.5(682nm；703nm)、Cy7(755nm；778nm),這使得它們可以同時(shí)被檢測(cè)。熒光素染料的其他實(shí)例包括6_羧基熒光素(6-FAM)、2’，4’，l，4，-四氯熒光素(TET)、2，，4，，5，，7，，1，4-六氯熒光素(HEX)、2，，7，-二甲氧基-4，，5，-二氯-6-羧基羅丹明(JOE)、2’-氯-5’-氟-7’，8’-稠苯-1,4-二氯-6-羧基熒光素(NED)和2’-氯-7’-苯基-1,4-二氯-6-羧基熒光素(VIC)。熒光標(biāo)簽可由各種來(lái)源商購(gòu)獲得，包括AmershamPharmaciaBiotech，PiscatawayNJ；MolecularProbes，Eugene,OR；禾RResearchOrganics，Cleveland,Ohio0所關(guān)注的其他標(biāo)簽包括那些僅當(dāng)它們所連接的探針與靶分子特異性結(jié)合時(shí)產(chǎn)生信號(hào)的標(biāo)簽，其中這類(lèi)標(biāo)簽包括Tyagi&Kramer,NatureBiotechnology(1996)14:303和EPO070685Bl中所述的“分子信標(biāo)”。所關(guān)注的其他標(biāo)簽包括美國(guó)專(zhuān)利No.5，563，037、國(guó)際申請(qǐng)WO97/17471和WO97/17076中所述的那些標(biāo)簽。被標(biāo)記的核苷酸是檢測(cè)標(biāo)簽的一種可用形式，可以在合成過(guò)程中直接導(dǎo)入被表達(dá)的核酸中?？梢灾苯訉?dǎo)入核酸中的檢測(cè)標(biāo)簽的實(shí)例包括核苷酸類(lèi)似物例如BrdUrd(5-溴脫fiMf1，HoyandSchimke,MutationResearch290:217_230(1993))、M_胃—ftM苷(Henegariuetal:，NatureBiotechnology18:345-348(2000))、5-甲基胞嘧啶(Sanoetal.，Biochim.Biophys.Acta951:157-165(1988))、溴尿核苷(Wansicketa!,J.CellBiology122:283-293(1993))和經(jīng)生物素修飾的核苷酸(Langeretal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:6633(1981))或經(jīng)過(guò)例如地高辛抗原(digoxygenin)的合適的半抗原修飾的核苷酸(Kerkhof，Anal.Biochem.205:359-364(1992))。合適的熒光標(biāo)記的核苷酸有異硫氰酸熒光素-dUTP、花青-3-dUTP和花青-5-dUTP(Yuetal,NucleicAcidsRes.,22:3226-3232(1994))。對(duì)于DNA而言?xún)?yōu)選的核苷酸類(lèi)似物檢測(cè)標(biāo)簽為BrdUrd(溴脫氧尿苷、BrdUrd、BrdU、BUdR，Sigma-AldrichCo)。其他用于將檢測(cè)標(biāo)簽導(dǎo)入DNA的可用的核苷酸類(lèi)似物為AA-dUTP(氨基烯丙基脫氧尿苷三磷酸，Sigma-AldrichCo.)和5-甲基dCTP(RocheMolecularBiochemicals)0一種用于將檢測(cè)標(biāo)簽導(dǎo)入RNA的可用的核苷酸類(lèi)似物為生物素-16-UTP(生物素-16-尿苷-5，-三磷酸,RocheMolecularBiochemicals)?？蓪晒馑谻y3和Cy5連接至dUTP上用于直接標(biāo)記。Cy3.5和Cy7可以以抗生物素蛋白或抗地高辛抗原綴合物的形式用于帶有生物素或地高辛抗原標(biāo)簽的探針的二級(jí)檢測(cè)。被導(dǎo)入核酸的例如生物素的檢測(cè)標(biāo)簽,隨后可以使用本領(lǐng)域公知的靈敏方法進(jìn)行檢測(cè)。例如，使用鏈親和素-堿性磷酸酶綴合物(Tropix,Inc.)可以檢測(cè)生物素，這種綴合物可以與生物素結(jié)合并隨后通過(guò)適當(dāng)?shù)孜锏幕瘜W(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)(例如，化學(xué)發(fā)光底物CSPD:3-(4-甲氧基螺-[1，2,-二環(huán)氧丙烷-3-2，-(5，-氯)三環(huán)[3.8.1.I3'7]癸烷]-4-基)苯基舞酸二(disodium,3-(4-methoxyspiro-[l,2,-dioxetane-3-2'_(5，-chloro)tricvclo[3.3.1.I3.7]decane]_4_yl)phenylphosphate)；Tropix,Inc.)。標(biāo)簽也可以是可.檢測(cè)的酶，例如堿性磷酸酶、大豆過(guò)氧化物酶、辣根過(guò)氧化物酶和聚合酶，檢測(cè)例如使用化學(xué)信號(hào)放大法或使用能發(fā)光的酶的底物(例如化學(xué)發(fā)光的1,2二環(huán)氧丙烷底物)或能產(chǎn)生熒光信號(hào)的酶的底物。結(jié)合了兩個(gè)或多個(gè)上述檢測(cè)標(biāo)簽的分子也可被認(rèn)為是檢測(cè)標(biāo)簽。任何已知的檢測(cè)標(biāo)簽都可與本發(fā)明公開(kāi)的探針、標(biāo)簽、分子和方法一起使用，以便標(biāo)記和檢測(cè)本發(fā)明公開(kāi)方法所產(chǎn)生的激活的或失活的核糖開(kāi)關(guān)或核酸或蛋白質(zhì)。用于檢測(cè)和測(cè)量檢測(cè)標(biāo)簽產(chǎn)生的信號(hào)的方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，可以通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)或直接顯示法來(lái)檢測(cè)放射性同位素；可用熒光分光光度計(jì)來(lái)檢測(cè)熒光分子；可用分光光度計(jì)或直接照相顯示的方法檢測(cè)磷光分子；可通過(guò)檢測(cè)或可視化酶促反應(yīng)的產(chǎn)物來(lái)檢測(cè)酶?？赏ㄟ^(guò)檢測(cè)與抗體偶聯(lián)的二級(jí)檢測(cè)標(biāo)簽來(lái)檢測(cè)抗體。本文所述的檢測(cè)分子為偶聯(lián)了一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)標(biāo)簽的與待測(cè)化合物或組合物相互作用的分子。I.序列相似性應(yīng)當(dāng)理解的是，本文所使用的術(shù)語(yǔ)同源性和同一性的含義是相同的，都是指相似性。因此,例如，如果在兩個(gè)序列(例如非天然序列)之間使用同源性這一詞語(yǔ),應(yīng)當(dāng)理解這并不一定是指著兩個(gè)序列之間的進(jìn)化關(guān)系,而是著眼于它們的核酸序列之間的相似性或關(guān)聯(lián)性。為了測(cè)量序列的相似性，確定兩個(gè)進(jìn)化上相關(guān)的分子之間相似性的很多方法都可以常規(guī)地應(yīng)用于兩個(gè)或多個(gè)核酸或蛋白質(zhì)，而無(wú)需考慮它們?cè)谶M(jìn)化上是否相關(guān)?？傮w而言,應(yīng)當(dāng)理解的是,為了定義本文所公開(kāi)的核糖開(kāi)關(guān)、適體、表達(dá)平臺(tái)、基因和蛋白質(zhì)的已知變體和衍生物或可能出現(xiàn)的種類(lèi)，一種方法是通過(guò)定義變體和衍生物與特定已知序列的同源性。本文公幵的具體序列的這種同一性在本文其他部分也有所討論?？傮w而言，本文所公開(kāi)的核糖開(kāi)關(guān)、適體、表達(dá)平臺(tái)、基因和蛋白質(zhì)的變體與指定序列或天然序列通常有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%、98%或99%的同源性。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易明白如何測(cè)定兩種蛋白質(zhì)或核酸(例如基因)之間的同源性。例如，可以在序列比對(duì)并使同源性達(dá)到最高水平后計(jì)算同源性。計(jì)算同源性的另一種方法可以通過(guò)公開(kāi)的算法進(jìn)行?？墒褂孟铝兴惴ㄟM(jìn)行用于比較的序列優(yōu)化比對(duì)SmithandWatermanAdv.App1.Math.2=482(1981)中所述的局部同源性算法；NeedlemanandWunsch,J.MoLBiol.48:443(1970)中所述的同源性比對(duì)算法；PearsonandLipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.852444(1988)中所述的相似性檢索方法；或者這些算法的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)形式(WisconsinGenetics軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI)；或者通過(guò)審查的方式進(jìn)行。通過(guò)例如Zuker,M.Science244:48-52,1989Jaegeretal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA867706-7710,1989Jaegeret.al.MethodsEnzymo1.183:281_306,1989中公開(kāi)的算法，可以獲得核酸的相同類(lèi)型的同源性，上述文獻(xiàn)中至少與核酸比對(duì)有關(guān)的素材以援引的方式納入本文。應(yīng)當(dāng)理解的是，通?？梢允褂萌魏畏椒?，而在某些情況下這些不同的方法所得到的結(jié)果可能不同,但是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解,如果使用上述方法中的至少一種發(fā)現(xiàn)了同一性，則該序列可被稱(chēng)為具有指定的同一性。例如，如本文所使用的，所述的具有與另一序列相比的特定百分比同源性的序列，是指具有由上述任意一種或多種計(jì)算方法所計(jì)算出的所述同源性的序列。例如，如果使用Zuker計(jì)算方法,第一序列被計(jì)算為與第二序列具有80%的同源性，即使按照其他任何計(jì)算方法都計(jì)算出該第--序列與第二序列不具有80%的同源性,那么，如本文所定義的,第一序列與第二序列仍具有80%的同源性。另一個(gè)實(shí)例，如果使用Zuker計(jì)算方法和Pearson和Lipman計(jì)算方法，第一序列被計(jì)算為與第二序列具有80%的同源性，即使通過(guò)Smith和Waterman計(jì)算方法、Needleman和Wimsch計(jì)算方法、Jaeger計(jì)算方法或任意其他計(jì)算方法計(jì)算，第一序列與第二序列不具有80%的同源性,那么，如本文所定義的,第一序列與第二序列仍具有80%的同源性。再一個(gè)實(shí)例，如果使用每一種計(jì)算方法，第一序列都被計(jì)算為與第二序列具有80%的同源性(盡管實(shí)際上不同的計(jì)算方法常得到不同的計(jì)算的同源性百分比)，那么如本文所定義的，第一序列與第二序列具有80%的同源性。J.雜交和選擇性雜交術(shù)語(yǔ)雜交通常意為至少兩種核酸分子例如引物或探針與核糖幵關(guān)或基因間的序列驅(qū)動(dòng)的相互作用。序列驅(qū)動(dòng)的相互作用意為以核苷酸特異性的方式發(fā)生于兩個(gè)核苷酸或核苷酸類(lèi)似物或核苷酸衍生物間的相互作用。例如G與C相互作用或者A與T相互作用即為序列驅(qū)動(dòng)的相互作用。通常序列驅(qū)動(dòng)的相互作用發(fā)生于核苷酸的沃森_克里克面或Hoogsteen面。兩種核酸的雜交受到本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的許多條件和參數(shù)的影響。例如鹽濃度、PH和反應(yīng)溫度均會(huì)影響兩種核酸分子是否會(huì)雜交。兩種核酸分子間的選擇性雜交的參數(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。例如,在一些實(shí)施方案中選擇性雜交條件可被定義為嚴(yán)格雜交的條件。例如,雜交的嚴(yán)格性是通過(guò)雜交和/或洗滌步驟的溫度和鹽濃度共同控制的。例如實(shí)現(xiàn)選擇性雜交的雜交條件可包括在比Tm(解鏈溫度，在該溫度下一半的分子與其雜交配對(duì)的另一部分解離)低大約12-25的溫度下,在高離子強(qiáng)度溶液(6XSSC或6XSSPE)中雜交,然后在所選的溫度和鹽濃度的組合的條件下洗滌，此時(shí)洗滌溫度為比Tm低大約5°C至20°C。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)容易地確定溫度和鹽濃度條件，在該實(shí)驗(yàn)中使固定在濾膜上的參照DNA的樣品與帶標(biāo)記的目的核酸雜交，然后在不同嚴(yán)格度的條件下洗滌。對(duì)于DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交而言雜交溫度通常較高一些?？墒褂萌缟纤龅幕虮绢I(lǐng)域已知的(Sambrooketal.,MolecularCloningALaboratoryManual，2ndEd.，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1989；Kunkeletal.MethodsEnzymol.1987:154:367，1987，上述文獻(xiàn)中至少與核酸雜交相關(guān)的素材通過(guò)援引的方式納入本文)條件以達(dá)到嚴(yán)格度。優(yōu)選的DNA:DNA雜交的嚴(yán)格條件可以是在約68°C(水溶液中)，在6XSSC或6XSSPE中雜交，之后在68°C洗滌。如果需要，當(dāng)所需的互補(bǔ)程度降低時(shí),雜交和洗滌的嚴(yán)格性可作相應(yīng)減小,并且還根據(jù)尋找可變性的任何區(qū)域中的G-C或A-T的豐富程度而定。同樣，如果需要，當(dāng)所需的同源性增大時(shí)，雜交和洗滌的嚴(yán)格性可作相應(yīng)增加，并且還根據(jù)需要高同源性的任何區(qū)域中的G-C或A-T的豐富程度而定，所有這些均為本領(lǐng)域已知。另一種定義選擇性雜交的方法是通過(guò)著眼于一種核酸與另一核酸結(jié)合的量(百分比)。例如，在一些實(shí)施方案中選擇性雜交的條件可以為至少約60%、65%、70%、71%、72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%>87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的限量核酸與非限量核酸結(jié)合時(shí)的條件。通常非限量核酸要過(guò)量例如10或100或1000倍。這類(lèi)測(cè)定可在限量核酸和非限量核酸均比它們的kd低例如10倍或100倍或1000倍時(shí)的條件下進(jìn)行，或者只是一種核酸分子為比它的kd低例如10倍或100倍或1000倍時(shí)的條件下進(jìn)行，或兩種核酸分子之一或兩者均在kd之上時(shí)的條件下進(jìn)行。另一種定義選擇性雜交的方法是通過(guò)著眼于這樣一種核酸的百分比，所述核酸是在需要雜交以促進(jìn)所需的酶操作的條件下得到酶操作的核酸。例如，在一些實(shí)施方案中選擇性雜交條件可以是至少約60%,65%,70%,71%,72%,73%、74%、75%、76%、77%、78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,100%的核酸在促進(jìn)酶操作的條件下進(jìn)行酶操作時(shí)的條件,例如，如果酶操作是DNA延伸，那么選擇性雜交條件可以是至少約60%、65%、70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,100%的核酸分子被延伸時(shí)的條件。優(yōu)選的條件還包括廠商所建議的或本領(lǐng)域所指出的適于酶進(jìn)行操作的條件。正如同源性一樣,應(yīng)當(dāng)理解本文公開(kāi)的用于確定兩種核酸分子間的雜交水平的方法有許多種。應(yīng)當(dāng)理解這些方法和條件可提供兩種核酸分子間的不同雜交百分比，但是除非另外指明，否則滿(mǎn)足任何方法的參數(shù)都是足夠的。例如，如果需要80%雜交并且只要在這些方法的任意一種中所要求的參數(shù)內(nèi)發(fā)生雜交，就認(rèn)為它在本文得到了公開(kāi)。應(yīng)當(dāng)理解,本領(lǐng)域技術(shù)人員知道,如果組合物或方法滿(mǎn)足用于單獨(dú)或聯(lián)合確定雜交的這些標(biāo)準(zhǔn)的任意--條,那么它就是本文所公開(kāi)的組合物或方法。K.核酸本文公開(kāi)了基于核酸的多種分子,包括例如核糖開(kāi)關(guān)、適體以及編碼核糖開(kāi)關(guān)和適體的核酸。所公開(kāi)的核酸由例如核苷酸、核苷酸類(lèi)似物或核苷酸替代物構(gòu)成。本文討論了這些分子及其他分子的非窮盡性實(shí)例。應(yīng)當(dāng)理解,例如當(dāng)載體在細(xì)胞中表達(dá)時(shí),表達(dá)的mRNA通常由A、C、G和U組成。同樣，應(yīng)當(dāng)理解，如果核酸分子通過(guò)例如外源性送遞被導(dǎo)入細(xì)胞或細(xì)胞環(huán)境中，那么核酸分子由核苷酸類(lèi)似物構(gòu)成是有利的，這樣可減少核酸分子在細(xì)胞環(huán)境中的降解。只要保留了它們相關(guān)的功能,核糖開(kāi)關(guān)、適體、表達(dá)平臺(tái)以及任何其他寡核苷酸和核酸都可以由經(jīng)修飾的核苷酸(核苷酸類(lèi)似物)構(gòu)成或含有經(jīng)修飾的核苷酸(核苷酸類(lèi)似物)。很多經(jīng)修飾的核苷酸是已知的，并可被用于寡核苷酸和核酸之中。核苷酸類(lèi)似物是含有對(duì)堿基、糖或磷酸部分的一些類(lèi)型的修飾的核苷酸。對(duì)堿基部分的修飾可以包括對(duì)A、C、G和T/U的天然性或合成性修飾，以及使用不同的嘌呤或嘧啶堿,例如尿嘧啶-5-基、次黃嘌呤-9-基(I)和2-氨基腺嘌呤-9-基。經(jīng)修飾的堿基包括但不限于5_甲基胞嘧啶(5-me-C)；5羥甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的6甲基或其他烷基衍生物；腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的2-丙基或其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶；2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶；5-鹵素尿嘧啶和5-鹵素胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；6偶氮基尿嘧啶、6偶氮基胞嘧啶和6偶氮基胸腺嘧啶；5尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的8鹵素、8氨基、8硫代、8硫代烷基、8羥基以及其他8-取代物；尿嘧啶和胞嘧啶的5-鹵素特別是5-溴、5-三氟甲基和其他的5-取代物-J-甲基鳥(niǎo)嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤和8-氮雜腺嘌呤；7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤(7-deazaguanine)和飛-脫氮腺嘌呤和3脫氮鳥(niǎo)嘌呤和3脫氮腺嘌呤。其他的堿基修飾物可見(jiàn)于例如美國(guó)專(zhuān)利No.3，687，808、Englischetal.,AngewandteChemie,InternationalEdition,1991,30,613、Sanghvi,Y.S.Chapter15AntisenseResearchandApplications,第289-302頁(yè)、Crooke,S.Τ.andLebleu,B.ed.，CRCPress,1993。某些核苷酸類(lèi)似物例如5_取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和N2、N6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5丙炔基胞嘧啶。5甲基胞嘧啶可以增加雙鏈體形成的穩(wěn)定性。其他經(jīng)修飾的堿基是那些有通用堿基功能的堿基。通用堿基包括3-硝基吡咯和5-硝基吲哚。通用堿基可取代正常的堿基，但在堿基配對(duì)....Ll沒(méi)有偏好性。也就是說(shuō)通用堿基可以與其他任何堿基進(jìn)行堿基配對(duì)。堿基修飾經(jīng)?？膳c例如糖修飾結(jié)合使用，例如2’甲氧基乙基，以獲得獨(dú)特的屬性例如提高的雙鏈體穩(wěn)定性。有多個(gè)美國(guó)專(zhuān)利具體描述了很多堿基修飾，例如4，845，205,5,130，302,5,134，066,5,175，273,5,367，066,5,432，272,5,457,187、5，459，255,5，484，908,5，502，177,5，525，711,5，552，540,5，587，469,5，594，121,5，596，091,5,614，617和5，681，941。以上各專(zhuān)利文獻(xiàn)的每一篇的全部?jī)?nèi)容都以援引的方式納入本文，并且特別是這些文獻(xiàn)中關(guān)于堿基修飾及其合成、使用和將其導(dǎo)入寡核苷酸和核酸的描述也以援引的方式納入本文。核苷酸類(lèi)似物還可包括糖部分的修飾。對(duì)糖部分的修飾可包括核糖和脫氧核糖的天然性修飾及合成性修飾。糖修飾包括但不限于在2’位置的下列修飾0H；F；0-烷基、S烷基或N烷基；0烯基、S-烯基或N烯基；0炔基、S炔基或N炔基；或0-烷基-ο-烷基,其中所述烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的Cl至ClO烷基或C2至ClO烯基和炔基。2，糖修飾還包括但不限于-0[(CH2)n0]mCH3、-0(CH2)n0CH3、_0(CH2)nNH2、-0(CH2)nCII3、—0(CH2)n—ONII2禾口-O(CII2)n0N[(CII2)nCII3)]2，其中η和m在1至大約10之間。在2’位置的其他修飾包括但不限于C1至ClO低級(jí)烷基、取代的低級(jí)烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或0-芳烷基、SH、SCH3、0CN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3,SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2,N3,NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基團(tuán)、報(bào)告基團(tuán)、插入劑、可提高寡核苷酸藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)或可提高寡核苷酸藥效學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)和其他具有類(lèi)似性質(zhì)的基團(tuán)。還可以在糖的其他位置進(jìn)行類(lèi)似的修飾,特別是在3’端核苷酸上或2’-5’連接的寡核苷酸中的糖的3’位置,和在5’端核苷酸的5’位置。經(jīng)修飾的糖可含有那些在環(huán)氧橋位置用例如CH2和S進(jìn)行的修飾。核苷酸糖類(lèi)似物還可具有糖模擬物,例如用環(huán)丁基部分代替五碳呋喃糖。有許多美國(guó)專(zhuān)利都教導(dǎo)了這類(lèi)經(jīng)修飾的糖結(jié)構(gòu)的制備，例如4，981，957,5,118，800,5,319，080,5,359，044,5,393，878,5,446，137、5，466,786,5,514，785,5,519，134、5，567，811,5,576，427,5,591，722,5，597，909、5，610，300、5，627，053、5，639，873、5，646，265、5，658，873、5，670，633和5，700，920，以上各專(zhuān)利文獻(xiàn)的每一篇的全部?jī)?nèi)容都以援引的方式納入本文,并且特別是這些文獻(xiàn)中關(guān)于經(jīng)修飾的糖結(jié)構(gòu)及其合成、使用和將其導(dǎo)入核苷酸、寡核苷酸和核酸的描述也以援引的方式納入本文。核苷酸類(lèi)似物可以在磷酸部分加以修飾。經(jīng)修飾的磷酸部分包括但不限于可經(jīng)過(guò)修飾而使得在兩個(gè)核苷酸之間的連接部分含有下列結(jié)構(gòu)的磷酸部分，所述結(jié)構(gòu)包括硫代磷酸酯；手性硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；磷酸三酯；氨烷基磷酸三酯；磷酸甲酯和其他磷酸烷基酯，包括磷酸3’-烯基酯和手性磷酸酯；次膦酸酯(phosphinate)；氨基磷酸酯，包括3’-氨基氨基磷酸酯(3’-aminophosphoramidate)和氨烷基氨基磷酸酯(aminoalkylphosphoramidate)、硫代氨基憐酉麵旨(thionophosphoramidates)、硫代燒基憐酸酉旨(thionoalkylphosphonates)、t代；^基石粦酸Ξ酉旨(thionoalkylphosphotriesters)和硼烷磷酸酯(boranophosphates)。應(yīng)當(dāng)理解的是，在兩個(gè)核苷酸之間的這些磷酸連接或經(jīng)修飾的磷酸連接可以通過(guò)3’-5’連接或2’-5’連接，連接可以包括極性的倒轉(zhuǎn)，例如3’-5’至5’-3’或者2’-5’至5’-2’。還包括各種鹽形式、混合鹽形式和游離酸形式。許多美國(guó)專(zhuān)利教導(dǎo)了如何制備和使用含有經(jīng)修飾磷酸的核苷酸,包括但不限于=3,687,808、4，469，863,4，476，301,5，023，243,5，177，196,5，188，897,5，264，423,5，276，019,5，278,302,5,286，717,5,321，131、5，399，676,5,405,939,5,453，496,5,455，233、5，466，677、5，476，925、5，519，126、5，536，821、5，541，306、5，550，111、5，563，253、5，571,799,5,587，361和5，625，050，以上各專(zhuān)利文獻(xiàn)的每一篇的全部?jī)?nèi)容都以援引的方式納入本文，并且特別是這些文獻(xiàn)中關(guān)于經(jīng)修飾的磷酸及其合成、使用和將其導(dǎo)入核苷酸、寡核苷酸和核酸的描述也以援引的方式納入本文。應(yīng)當(dāng)理解的是，核苷酸類(lèi)似物僅需要包括一種修飾，但是也可以在一個(gè)部分或幾個(gè)不同部分中包括多種修飾。核苷酸替代物為與核苷酸具有類(lèi)似功能特性但不含有磷酸部分的分子，例如肽核酸(PNA)。核苷酸替代物分子可以以Watson-Crick方式或Hoogsteen方式識(shí)別互補(bǔ)性核酸并與互補(bǔ)性核酸雜交(堿基配對(duì))，但是它們通過(guò)非磷酸的部分連接起來(lái)。核苷酸替代物在與合適的靶核酸相互作用時(shí)能夠形成雙螺旋型結(jié)構(gòu)。核苷酸替代物為磷酸部分和/或糖部分被替換的核苷酸或核苷酸類(lèi)似物。核苷酸替代物不包括標(biāo)準(zhǔn)的磷原子。磷酸的替代物可為例如短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間連接物、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間連接物、或一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間連接物。這些連接物可包括具有下列結(jié)構(gòu)的連接物嗎啉代連接物(形成核苷的糖部分的一部分)；硅氧烷骨架；硫化物、亞砜和砜骨架；甲?；?formacetyl)和硫甲?；?thioformacetyl)骨架；亞甲基甲?；土蚣柞；羌?；含烯烴骨架；氨基磺酸鹽骨架；亞甲基亞胺基和亞甲基胼基骨架；磺酸和磺胺骨架；酰胺骨架；以及其他帶有混合的N、()、S和CH2組成部分的連接物。許多美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)了如何制備和使用這些種類(lèi)的磷酸替換物,包括但不限于5，034，506,5,166，315,5,185，444,5,214,134,5,216，141,5,235，033,5,264，562、5，264，564、5，405，938,5，434,257,5,466，677,5,470，967,5，489,677,5，541,307、5，561，225,5,596，086,5，602，240,5,610，289,5,602，240,5,608，046,5，610，289、5,618,704,5,623，070,5,663,312,5,633，360,5,677,437和5，677，439，以上各專(zhuān)利文獻(xiàn)的每一篇的全部?jī)?nèi)容都以援引的方式納入本文，并且特別是這些文獻(xiàn)中關(guān)于磷酸替換物及其合成、使用和將其導(dǎo)入核苷酸、寡核苷酸和核酸的描述也以援引的方式納入本文。應(yīng)當(dāng)理解的是,在核苷酸替代物中核苷酸的糖部分和磷酸部分都可以被例如酰胺型連接物(氨基乙基甘氨酸)(PNA)所替換。美國(guó)專(zhuān)利5，539，082、5，714，331和5，719，262教導(dǎo)了如何制備和使用PNA分子，上述文獻(xiàn)的每一篇都以援引的方式納入本文。(還可參見(jiàn)Nielseneta!.,Science254:1497-1500(1991))。寡核苷酸和核酸可以由核苷酸構(gòu)成，并可以由不同類(lèi)型或相同類(lèi)型的核苷酸構(gòu)成。例如，在寡核苷酸中，一個(gè)或多個(gè)核苷酸可以是核糖核苷酸、2’-0-甲基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2’-0-甲基核糖核苷酸的混合物；大約10%至約50%的核苷酸可以是核糖核苷酸、2’-0甲基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2’-0甲基核糖核苷酸的混合物’大約50%或50%以上的核苷酸可以是核糖核苷酸、2’-0-甲基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2’-0-甲基核糖核苷酸的混合物；或者全部核苷酸可以是核糖核苷酸、2’-0-甲基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2’0甲基核糖核苷酸的混合物。這類(lèi)寡核苷酸和核酸可被稱(chēng)為嵌合寡核苷酸和嵌合核酸。L.固體支持物固體支持物為可連接分子(例如觸發(fā)分子)和核糖幵關(guān)(或其他由所公幵的方法產(chǎn)生的或在所公開(kāi)的方法中使用的組件)的固態(tài)基質(zhì)或支持物，可以與支持物相連接。核糖開(kāi)關(guān)和其他分子可以直接或間接地與固體支持物相連接。例如，分析物(例如觸發(fā)分子，待測(cè)化合物)可以結(jié)合到固體支持物表面或與固定在固體支持物上的捕獲試劑(例如結(jié)合分析物的化合物或分子)相連接。作為另一個(gè)實(shí)例，核糖幵關(guān)可以結(jié)合到固體支持物表面或與固定在固體支持物上的探針相連接。多個(gè)核糖開(kāi)關(guān)、探針或其他分子以陣列、網(wǎng)格或其他組織形式連接到固體支持物上構(gòu)成陣列。可用于固體支持物的固態(tài)基質(zhì)可以包括可以與組件直接或間接連接的任何固體材料。這包括下述材料，例如丙烯酰胺、瓊脂糖、纖維素、硝酸纖維素、玻璃、金、聚苯乙烯、聚乙烯乙酸乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚氧乙烯、聚硅酸鹽、聚碳酸酯、特氟隆(聚四氟乙烯樹(shù)脂)，碳氟化合物、尼龍、硅橡膠、聚酐、聚乙醇酸、聚乳酸、聚原酸酯、官能化硅烷、聚丙基延胡索酸鹽(polypropylfumerate)、膠原、糖胺聚糖和聚氨基酸。固態(tài)基質(zhì)可為任何可用的形式，包括薄膜、膜、瓶、盤(pán)、纖維、編織纖維、成型聚合物、顆粒、珠粒、微顆?；蛩鼈兊慕M合。固態(tài)基質(zhì)和固體支持物可為有孔的和無(wú)孔的。芯片是一小片長(zhǎng)方形或正方形的材料。優(yōu)選的固態(tài)基質(zhì)的形式為薄膜、珠?；蛐酒?。一種可用于固態(tài)基質(zhì)的形式是微量滴定板。在--些實(shí)施方案中,可以使用多孔載玻片。陣列可包括多個(gè)固定于固體支持物的確定位置或預(yù)定位置的核糖幵關(guān)、觸發(fā)分子、其他分子、化合物或探針。固體支持物上的每個(gè)預(yù)定位置通常具有一種類(lèi)型的組件(即在該位置的所有組件都是相同的)?；蛘?在固體支持物上的同一預(yù)定位置可以固定化多種類(lèi)型的組件。每一位置可以具有給定組件的多個(gè)拷貝。在固體支持物上的不同組件的空間隔離使得可以進(jìn)行分別的檢測(cè)和識(shí)別。固體支持物為一個(gè)單獨(dú)的單位或結(jié)構(gòu)雖然是有用的，但不是必需的。一系列的核糖開(kāi)關(guān)、觸發(fā)分子、其他分子、化合物和/或探針可以分布于任意數(shù)目的固體支持物上。例如，--種極端的情況是每一個(gè)組件可被固定于分離的反應(yīng)管或容器中，或在分離的珠?；蛭㈩w粒上。將寡核苷酸固定化于固態(tài)基質(zhì)的方法已很成熟?？墒褂靡阎呐悸?lián)方法將包括定位探針(addressprobe)和檢測(cè)探針的寡核苷酸偶聯(lián)至基質(zhì)上。例如,合適的附著方法描述于Peaseet.al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91(11):5022_5026(1994)禾口Khrapkoet.al.，MolBiol(Mosk)(USSR)25:718-730(1991)。一種將3，-胺寡核苷酸固定于酪蛋白包被的載玻片上的方法描述于Stimpsonetal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:6379-6383(1995)。一種將寡核苷酸附著于固態(tài)基質(zhì)上的可用的方法描述于Guoetal,NucleicAcidsRes.225456-5465(1994)。固定于固體支持物上的每一組件(例如，核糖開(kāi)關(guān)、觸發(fā)分子或其他分子)可以位于固體支持物的不同預(yù)定區(qū)域。不同的位置可以是不同的反應(yīng)室。每一不同的預(yù)定區(qū)域可以與其他不同的預(yù)定區(qū)域在物理上彼此分離。固體支持物上的不同預(yù)定區(qū)域之間的距離可以是固定的，也可以是可變的。例如，在陣列中每一組件可以彼此之間以固定距離排列，而與珠粒相連接的組件就不會(huì)有固定的空間關(guān)系。特別地，多個(gè)固體支持物單位(例如多個(gè)珠粒)的使用方式會(huì)導(dǎo)致不同的距離。組件可以以任何密度連接于或固定于固體支持物上。組件固定于固體支持物上的密度可以超過(guò)每立方厘米400個(gè)不同組件。組件的陣列可以有任何數(shù)目的組件。例如，陣列可以具有至少1，000個(gè)固定于固體支持物的不同組件、至少10，000個(gè)固定于固體支持物的不同組件、至少100，000個(gè)固定于固體支持物的不同組件或至少1，000，000個(gè)固定于固體支持物的不同組件.M.試劑盒上文所述的材料和其他材料可以以任意合適的組合被包裝在一起，作為用于進(jìn)行或輔助進(jìn)行所公開(kāi)方法的試劑盒。如果給定試劑盒中的試劑盒組件被設(shè)計(jì)和調(diào)整為在所公開(kāi)的方法中--起使用則是有用的。例如公開(kāi)了用于檢測(cè)化合物的試劑盒,該試劑盒包括--種或多種生物傳感器核糖幵關(guān)。該試劑盒還可包括檢測(cè)核糖開(kāi)關(guān)的激活的試劑和標(biāo)簽。N.混合物公開(kāi)了通過(guò)實(shí)施或準(zhǔn)備實(shí)施所公開(kāi)方法而形成的混合物。例如，公開(kāi)了包括核糖開(kāi)關(guān)和觸發(fā)分子的混合物。不論何時(shí)，只要方法包括使組合物或組件或試劑混合或相接觸，實(shí)行該方法就會(huì)產(chǎn)生多種不同的混合物。例如，如果方法包括3個(gè)混合步驟,如果各步驟分別進(jìn)行，則在上述步驟的每一步之后都會(huì)形成一種特有的混合物。此外,不論各步驟如何進(jìn)行，在所有步驟完成之后也會(huì)形成--種混合物。本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容考慮了由實(shí)施所公開(kāi)方法所獲得的這些混合物，以及含有例如本文所公幵的試劑、組合物或組件的混合物。0.系統(tǒng)公開(kāi)了用于實(shí)施或輔助實(shí)施所公開(kāi)方法的系統(tǒng)。系統(tǒng)通常包括制造的物品的組合例如結(jié)構(gòu)、機(jī)械、裝置等，以及組合物、化合物、材料等。這些組合為已公開(kāi)的或從公開(kāi)的內(nèi)容可以顯而易見(jiàn)，這些組合均被考慮。例如，公開(kāi)了和考慮了包括生物傳感器核糖開(kāi)關(guān)、固體支持物和信號(hào)讀取裝置的系統(tǒng)。P.數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)和計(jì)算機(jī)控制公開(kāi)了所公開(kāi)方法中使用的、由所公開(kāi)方法產(chǎn)生的或從所公開(kāi)方法中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)。數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)通常為在組合物或介質(zhì)中采集、編組、儲(chǔ)存和/或體現(xiàn)的任何形式的數(shù)據(jù)、信息和/或?qū)ο?。以例如MM或存儲(chǔ)磁盤(pán)的電子形式儲(chǔ)存的核糖開(kāi)關(guān)的結(jié)構(gòu)和激活測(cè)量結(jié)果就是--種類(lèi)型的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)。所公幵的方法或其任意部分或由該方法制備的制品，都可以通過(guò)計(jì)算機(jī)控制來(lái)進(jìn)行控制、管理或輔助。這類(lèi)計(jì)算機(jī)控制可以通過(guò)計(jì)算機(jī)控制過(guò)程或方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，可以使用和/或產(chǎn)生數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，并可以使用計(jì)算機(jī)程序。這類(lèi)計(jì)算機(jī)控制、計(jì)算機(jī)控制的過(guò)程、數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)和計(jì)算機(jī)程序都被考慮到并應(yīng)理解為在本文中被公開(kāi)。方法本文公開(kāi)了用于調(diào)節(jié)RNA剪接的方法,包括將包含一種核糖開(kāi)關(guān)的構(gòu)建體導(dǎo)入所述RNA,其中所述核糖開(kāi)關(guān)能夠調(diào)節(jié)RNA的剪接。例如，所述核糖開(kāi)關(guān)能夠調(diào)節(jié)可變剪接。所述核糖開(kāi)關(guān)可包含一個(gè)適體結(jié)構(gòu)域和一個(gè)表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域，其中所述適體結(jié)構(gòu)域和所述表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域是異源的。所述核糖幵關(guān)可在所述RNA的內(nèi)含子內(nèi)。所述核糖幵關(guān)可由觸發(fā)分子例如TPP激活。所述核糖開(kāi)關(guān)可以是一種TPP-應(yīng)答性核糖開(kāi)關(guān)。所述核糖開(kāi)關(guān)可激活可變剪接。所述核糖開(kāi)關(guān)可抑制可變剪接。所述剪接可以非天然地發(fā)生。控制可變剪接的適體區(qū)域可出現(xiàn)于例如環(huán)5?？刂瓶勺兗艚拥倪m體區(qū)域可出現(xiàn)于例如莖P2。所述剪接位點(diǎn)例如可位于相對(duì)于所述適體5'端_6至-24之間的位置。所述剪接位點(diǎn)例如可接在所述適體的序列GUA之后?！罢{(diào)節(jié)RNA剪接”是指核糖開(kāi)關(guān)可控制RNA剪接，從而造成不同mRNA分子的形成，以及可能的(但不總是)不同蛋白的形成。例如，所述核糖開(kāi)關(guān)可以調(diào)節(jié)可變剪接。進(jìn)一步公幵了用于激活、滅活或阻斷調(diào)節(jié)RNA剪接的核糖開(kāi)關(guān)的方法。這類(lèi)方法可包括例如使核糖開(kāi)關(guān)和可激活、滅活或阻斷該核糖開(kāi)關(guān)的化合物或觸發(fā)分子相接觸。核糖開(kāi)關(guān)通過(guò)觸發(fā)分子的結(jié)合或移除來(lái)發(fā)揮控制基因表達(dá)的功能?；衔锟捎糜诩せ?、滅活或阻斷核糖開(kāi)關(guān)。核糖開(kāi)關(guān)的觸發(fā)分子(以及其他的激活化合物)可被用于激活核糖開(kāi)關(guān)。通?？墒褂贸|發(fā)分子以外的化合物來(lái)滅活或阻斷核糖開(kāi)關(guān)(例如TPP)。還可以通過(guò)例如從核糖開(kāi)關(guān)所在處移除觸發(fā)分子來(lái)滅活核糖開(kāi)關(guān)。因此，所公開(kāi)的滅活核糖開(kāi)關(guān)的方法可以包括例如移除核糖開(kāi)關(guān)所在處的或與核糖開(kāi)關(guān)接觸的觸發(fā)分子(或其他激活化合物)?？梢岳缤ㄟ^(guò)不激活核糖開(kāi)關(guān)的觸發(fā)分子類(lèi)似物的結(jié)合來(lái)阻斷核糖開(kāi)關(guān)。還公幵了通過(guò)使一化合物與RNA分子相接觸來(lái)改變?cè)揜NA分子或編碼該RNA分子的基因的表達(dá)的方法，其中所述RNA分子包括調(diào)節(jié)剪接的核糖開(kāi)關(guān)。例如，所述核糖開(kāi)關(guān)可調(diào)節(jié)所述RNA分子的可變剪接。核糖開(kāi)關(guān)通過(guò)結(jié)合或者去除觸發(fā)因子來(lái)發(fā)揮控制基因表達(dá)的功能。因此,將包含核糖開(kāi)關(guān)的目的RNA分子置于激活、滅活或者阻斷該核糖開(kāi)關(guān)的條件下，可用于改變所述RNA的表達(dá)。表達(dá)可因例如轉(zhuǎn)錄被終止或核糖體與所述RNA的結(jié)合受到阻斷而改變。與觸發(fā)分子的結(jié)合可減少或防止所述RNA分子的表達(dá),或者促進(jìn)或者增加所述RNA分子的表達(dá),這取決于核糖開(kāi)關(guān)的性質(zhì)及發(fā)生的可變剪接的類(lèi)型。還公開(kāi)了通過(guò)激活、滅活或者阻斷可調(diào)控剪接的核糖開(kāi)關(guān)來(lái)調(diào)控含有所述核糖開(kāi)關(guān)的天然存在的基因或RNA的表達(dá)的方法。例如，所述核糖幵關(guān)可調(diào)節(jié)所述RNA的可變剪接。如果所述基因?qū)τ诤兴募?xì)胞或者生物體的生存是必需的,那么激活、滅活或阻斷所述核糖開(kāi)關(guān)會(huì)造成所述細(xì)胞或者生物體的死亡、瘀滯或虛弱。例如,激活微生物存活所必需的天然存在的基因中的天然存在的核糖開(kāi)關(guān)會(huì)導(dǎo)致該微生物的死亡(如果所述核糖開(kāi)關(guān)的激活控制可變剪接，可變剪接轉(zhuǎn)而—t調(diào)或下調(diào)關(guān)鍵蛋白)。這是使用所公幵化合物和方法達(dá)到抗微生物或抗真菌效果的一個(gè)基礎(chǔ)。具有這些抗微生物效果的化合物被認(rèn)為具有抑菌、殺菌或殺真菌能力。還公開(kāi)了選擇和識(shí)別可激活、滅活或阻斷調(diào)節(jié)剪接的核糖幵關(guān)的化合物的方法。例如，所述核糖開(kāi)關(guān)可調(diào)節(jié)可變剪接。核糖開(kāi)關(guān)的激活是指核糖開(kāi)關(guān)結(jié)合觸發(fā)分子時(shí)其狀態(tài)的變化。核糖開(kāi)關(guān)可由除觸發(fā)分子以外的化合物并以不同于與觸發(fā)分子結(jié)合的方式被激活。術(shù)語(yǔ)觸發(fā)分子在本文中用來(lái)指可激活核糖開(kāi)關(guān)的分子和化合物。這包括核糖開(kāi)關(guān)的天然或正常的觸發(fā)分子以及其他可以激活核糖幵關(guān)的化合物。天然或正常的觸發(fā)分子是給定的天然核糖開(kāi)關(guān)本來(lái)就有的觸發(fā)分子，或者對(duì)于某些非天然核糖開(kāi)關(guān)而言是這樣的觸發(fā)分子該核糖開(kāi)關(guān)針對(duì)該觸發(fā)分子被設(shè)計(jì)或該核糖開(kāi)關(guān)通過(guò)該觸發(fā)分子被選擇(正如在例如體外選擇或體外進(jìn)化技術(shù)中那樣)。不是天然的觸發(fā)分子可被稱(chēng)為非天然觸發(fā)分子。還公幵了一種抑制真菌生長(zhǎng)的方法，所述方法包括識(shí)別感染真菌的受試者；給與所述受試者有效量的抑制TPP-應(yīng)答性核糖開(kāi)關(guān)的化合物,從而抑制真菌生長(zhǎng)。抑制真菌生長(zhǎng)可包括真菌生物量減少10%,20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。還公開(kāi)了識(shí)別激活、失活或阻斷調(diào)節(jié)剪接的核糖開(kāi)關(guān)的化合物的方法。例如,激活核糖幵關(guān)的化合物可通過(guò)以下途徑識(shí)別將測(cè)試化合物和核糖幵關(guān)相接觸，并且通過(guò)測(cè)量基因產(chǎn)物的可變剪接或測(cè)量作為剪接事件結(jié)果表達(dá)的蛋白差異水平評(píng)估所述核糖開(kāi)關(guān)的激活情況。如果所述核糖開(kāi)關(guān)被激活,則該測(cè)試化合物被識(shí)別為可激活核糖開(kāi)關(guān)的化合物。核糖開(kāi)關(guān)的激活可以任何合適的方式被評(píng)估。例如,核糖開(kāi)關(guān)可被連接到一報(bào)告RNA上,并在存在或不存在所述測(cè)試化合物的情況下可測(cè)量所述報(bào)告RNA的表達(dá)、表達(dá)水平或表達(dá)水平的變化。再如，核糖開(kāi)關(guān)可包含一個(gè)構(gòu)象依賴(lài)標(biāo)簽，來(lái)自該構(gòu)象依賴(lài)標(biāo)簽的信號(hào)隨所述核糖開(kāi)關(guān)的激活狀態(tài)而改變。這種核糖開(kāi)關(guān)優(yōu)選使用來(lái)自或者衍生自天然存在的核糖開(kāi)關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域。可以看出，對(duì)核糖開(kāi)關(guān)的激活情況進(jìn)行評(píng)估使用或不使用對(duì)照測(cè)定或測(cè)量均可。識(shí)別滅活核糖開(kāi)關(guān)的化合物的方法可用類(lèi)似方式進(jìn)行。除了本文其他部分公開(kāi)的方法，對(duì)阻斷可調(diào)節(jié)剪接的核糖開(kāi)關(guān)的化合物的識(shí)別可以任何合適的方式完成,例如，在已知可激活或者滅活核糖開(kāi)關(guān)的化合物存在時(shí)或者在測(cè)試化合物存在時(shí)可進(jìn)行評(píng)估核糖開(kāi)關(guān)的激活或失活的分析。如果未觀察到在所述測(cè)試化合物不存在時(shí)可觀察到的激活或失活，那么所述測(cè)試化合物被確定為阻斷所述核糖幵關(guān)激活或者失活的化合物。還公開(kāi)了使用調(diào)節(jié)可變剪接的生物傳感器核糖開(kāi)關(guān)檢測(cè)化合物的方法。該方法可包括使一測(cè)試樣本和生物傳感器核糖開(kāi)關(guān)接觸以及評(píng)估所述生物傳感器核糖開(kāi)關(guān)的激活情況。生物傳感器核糖幵關(guān)的激活表示在測(cè)試樣品中存在生物傳感器核糖幵關(guān)的觸發(fā)分子。生物傳感器核糖開(kāi)關(guān)是在其關(guān)聯(lián)觸發(fā)分子存在的情況下可產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的工程化改造的核糖開(kāi)關(guān)。有用的生物傳感器核糖開(kāi)關(guān)可由閾水平或高于閾水平的觸發(fā)分子觸發(fā)。生物傳感器核糖開(kāi)關(guān)可被設(shè)計(jì)成體內(nèi)或體外使用。例如,調(diào)節(jié)可變結(jié)合的生物傳感器核糖開(kāi)關(guān)可以被可操作地連接到編碼用作信號(hào)或者參與產(chǎn)生信號(hào)的蛋白的報(bào)告RNA，可通過(guò)對(duì)細(xì)胞或者生物體進(jìn)行工程改造使其包含編碼所述核糖開(kāi)關(guān)/報(bào)告RNA的核酸構(gòu)建體從而在體內(nèi)使用。生物傳感器核糖開(kāi)關(guān)體外應(yīng)用的一個(gè)實(shí)例是包含構(gòu)象依賴(lài)標(biāo)簽的核糖開(kāi)關(guān),來(lái)自該核糖開(kāi)關(guān)的信號(hào)的變化取決于核糖開(kāi)關(guān)的激活狀態(tài)。這種生物傳感器核糖開(kāi)關(guān)優(yōu)選使用來(lái)自或者衍生自天然存在的TPP核糖開(kāi)關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域。還公開(kāi)了通過(guò)識(shí)別激活、滅活或阻斷核糖開(kāi)關(guān)的化合物以及制造所識(shí)別出的化合物制成的化合物。這可通過(guò)例如將如文中其他部分所公開(kāi)的化合物的識(shí)別方法與制造所識(shí)別出的化合物的方法相結(jié)合來(lái)完成。例如，化合物可通過(guò)如下步驟制備使一測(cè)試化合物和一核糖開(kāi)關(guān)相接觸,評(píng)估所述核糖開(kāi)關(guān)的激活情況，并且如果所述核糖開(kāi)關(guān)被所述測(cè)試化合物激活,則制造所述激活核糖開(kāi)關(guān)的測(cè)試化合物作為所述化合物。還公開(kāi)了通過(guò)以下方式制備的化合物檢測(cè)--化合物對(duì)一核糖開(kāi)關(guān)的激活、滅活或阻斷并制造所述被檢測(cè)的化合物。這可以通過(guò)例如將本文其他部分所公幵的化合物激活、失活或阻斷的評(píng)估方法與制造被檢測(cè)的化合物的方法相結(jié)合來(lái)完成。例如，可通過(guò)如下步驟制備化合物使一測(cè)試化合物和一核糖開(kāi)關(guān)相接觸,評(píng)估所述核糖開(kāi)關(guān)的激活情況,并且如果所述核糖開(kāi)關(guān)被所述測(cè)試化合物激活,則制造所述激活核糖開(kāi)關(guān)的測(cè)試化合物作為所述化合物。檢測(cè)化合物激活、滅活或阻斷核糖幵關(guān)的能力既指識(shí)別之前未知可激活、滅活或阻斷核糖開(kāi)關(guān)的化合物，也指在已知某種化合物可激活、滅活或阻斷核糖開(kāi)關(guān)時(shí)，評(píng)估所述化合物激活、滅活或者阻斷核糖開(kāi)關(guān)的能力。A.抗真菌的化合物的識(shí)別如果存在某一化合物時(shí)的核糖開(kāi)關(guān)測(cè)定與不存在該化合物時(shí)同樣的核糖開(kāi)關(guān)測(cè)定相比(即與對(duì)照測(cè)定相比)，信號(hào)增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、50%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%或500%，則該化合物可識(shí)別為可激活核糖開(kāi)關(guān)或確定具有核糖開(kāi)關(guān)激活活性。所述核糖開(kāi)關(guān)測(cè)定可使用任何合適的核糖開(kāi)關(guān)構(gòu)建體進(jìn)行。對(duì)于核糖幵關(guān)激活測(cè)定特別有用的核糖開(kāi)關(guān)構(gòu)建體在本文其他地方描述。可激活核糖開(kāi)關(guān)或具有核糖開(kāi)關(guān)激活活性的化合物的識(shí)別可依據(jù)一個(gè)或多個(gè)具體核糖開(kāi)關(guān)、核糖開(kāi)關(guān)構(gòu)建體或者核糖開(kāi)關(guān)類(lèi)別進(jìn)行。為方便起見(jiàn)，被識(shí)別為可激活控制可變剪接的核糖開(kāi)關(guān)的化合物可依此識(shí)別為針對(duì)具體核糖開(kāi)關(guān)的化合物。B.使用抗真菌化合物的方法本文公開(kāi)了體內(nèi)和體外抗真菌方法。“抗真菌”意味著抑制或阻止真菌生長(zhǎng)，殺滅真菌或者減少真菌數(shù)。因此,公開(kāi)了抑制或阻止真菌生長(zhǎng)的方法,包括用有效量的本文公開(kāi)的--種或多種化合物接觸真菌。被公開(kāi)的化合物的其他結(jié)構(gòu)在本文給出。本文公開(kāi)了一種抑制真菌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，該方法包括使細(xì)胞和可結(jié)合TPP-應(yīng)答性核糖開(kāi)關(guān)的化合物接觸，其中所述細(xì)胞包含編碼包含TPP-應(yīng)答性核糖開(kāi)關(guān)的RNA的基因，其中所述化合物通過(guò)結(jié)合于所述TPP-應(yīng)答性核糖開(kāi)關(guān)限制TPP產(chǎn)生而抑制細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)，。該方法可使細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)與未接觸所述化合物的細(xì)胞相比至少降低10%。所述化合物和所述細(xì)胞可通過(guò)將所述化合物給予受試者而接觸。所述細(xì)胞可以為受試者中的真菌細(xì)胞，其中所述化合物殺死或抑制所述真菌細(xì)胞生長(zhǎng)。所述受試者可感染有真菌。所述化合物可與另一種真菌化合物聯(lián)合給藥。真菌可選自例如，藍(lán)色梨頭霉(Absidiacoerulea)、灰綠犁頭霉(Absidiaglauca)、傘枝犁頭霉(Absidiacorymbifera)、枝頂抱霉菌(Acremoniumstrictrm)、交鏈格抱菌(Alternaricialternata)、Apophysomyceselegans^Saksenavasiformis、黃曲霉(Aspergillusflavus)、米曲霉、煙曲霉(Aspergi1lusfumigatus)、Keosartorytafischeri、黑曲霉(Aspergillusniger)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、Aspergillusphoenicus、特曲霉(Aspergillusnomius)、赫曲霉(Aspergillusochraceus)、孑L曲霉(Aspergillusostianus)、Aspergillusauricomus、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)、醬油曲霉(Aspergillusojae)、局限曲霉(Aspergillusrestrictus)、Aspergilluscaesillus、圓維曲霉(Aspergillusconicus)、聚多曲霉(Aspergillussydowii)、溜曲霉(Aspergillustamarii)、土曲霉(Aspergillusterreus)、焦曲霉(Aspergillusustus)、雜色曲霉(Aspergillusversicolor)、焦曲霉(Aspergillusustus)、雜色曲霉(Aspergillusversicolor)、球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)、芽枝狀枝抱(Cladosporiumcladosporioides)、多主枝抱(Cladosporiumherbarum)、球抱枝抱(Cladosporiumsphaerospermum)、冠狀耳霉(Conidioboluscoronatus)、異抱耳霉(Conidiobolusincongruus)、雅致小克銀漢霉(Cunninghamellaelegans)、構(gòu)巢裸胞殼(Emericellanidulans)、褶自皮裸胞殼(Emericellarugulosa)、對(duì)四脊裸胞殼(Emericillaquadrilineata)、Apicoccumnigrum、阿姆斯特丹散囊菌(Eurotiumamstelodami)、謝尻散囊菌(Eurotiumchevalieri)、錯(cuò)葉散囊菌(Eurotiumherbariorum)、赤散囊菌(Eurotiumrubrura)、匍甸散囊菌(Eurotiumrepens)、白地霉(Geotrichumcandidum)、克氏地霉(Geotrichumklebahnii)、刺黑烏霉(Memnoniellaechinata)、多頭被孢霉(Mortierellapolycephala)、沃爾夫被抱霉(Mortierellawolfii)、高大毛霉(Mucormucedo)、Mucoramphibiorum、卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)、凍土毛霉(Mucorheimalis)、印度毛霉菌(Mucorindicus)、總狀毛霉(Mucorracemosus)、多枝毛霉(Mucorramosissimus)、中華根霉(Rhizopusazygosporous)、Rhizopushomothalicus、小抱根霉(Rhizopusmicrosporus)、少抱根霉(Rhizopusoligosporus)、米根霉(Rhizopusoryzae)、疣孢漆斑菌(Myrotheciumverrucaria)、露濕漆斑菌(Myrotheciumroridum)、淡紫擬青毒(PaeciIomyces1i!acinus)、宛氏擬青毒(Paecilomycesvariotii)、弗瑞青毒(Penicilliumfreii)、撫狀青霉(Penicilliumverrucosum)、多毛青霉(Penicilliumhirsutum)、Penicilliumalberechii、IfiWβ(Penicillumaurantiοgriseum)、波蘭青霉(Penicilliumpolonicum)、魚(yú)羊MW9(Penicilliumviridicatum)>^毛青霉(Penicilliumhirsutum)、短密青霉(Penici1liumbrevicompactum)、產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)、灰黃青霉(Penicilliumgriseofulvum)、櫟實(shí)青霉(Penicilliumglandicola)、Penicilliumcoprophilum、皮殼正青霉(Eupenicilliumcrustaceum)^ΜMIEW9(Eupenicilliumegyptiacum)、&胃冑M(fèi)(Penici11iumcrustosura)、橘青霉(Penici11iumcitrinum)、Penici1Iiumsartoryi、Penicilliumwestlingi^頂青霉(PenicilliumcorylophiIum)、斜臣卜青霉(Penicilliumdecumbens)、棘刺青霉(Penicilliumechinulatum)、離生青霉(PenicilliumsoIiturn)、Π才白(Penicilliumcamembertii)、^fflW^(Penicilliumcommune)、棘朿丨JWβ(Penici11iumechinulatum)、Penici11iumsclerotigenura>意大禾丨J青霉(Penici1Iiumitalicum)、擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)>瘦青霉(Penicilliumfellutanum)>查理青霉(Penicilliumcharlesii)、微紫青霉(Penicilliumjanthinellum)、Penicilliumraperi、Penicilliummadriti、M胃W9(Penicilliumgladioli)>草酸青霉(Penicilliuraoxalicum)、婁地青霉(Penici1Iiumroquefortii)、簡(jiǎn)青霉(Penicilliumsimplicissimum)、赫綠青霉(Penicilliumochrochloron)、小朿丨J青霉(Penicilliumspinulosum)、光抱青霉(Penicilliumglabrum)、托姆青霉(Penicillumthomii)(Penici11iumpupurescens)、^qH青β(EupenicilliumIapidosum)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)、多變根毛霉(Rhizomucorvariabilis)、匍蓮根毛霉(Rhizopusstolonifer)、Scopulariopsisasperula、feM(Scopulariopsisbrevicaulis)、H^fe^^(Scopulariopsisfusca)、布朗氏帚霉(Scopulariopsisbrumptii)、紙帯霉(Scopulariopsischartarmn)、Scopulariopsissphaerospora、棘孢木霉(Trichodermaasperellum)、鉤狀木霉(Trichodermahamatum)、綠色木霉(Trichodermaviride)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、長(zhǎng)枝木毒(Trichodermalongibrachiatum)、Trichodermacitroviride、深綠木霉(Trichodermaatroviricle)、康氏木霉(Trichodermakoningii)、黑細(xì)基格孢(Ulocladiumatrum)、紙狀細(xì)基格孢(Ulocladiumchartarum)、葡串細(xì)基格孢(Ulocladiumbotrytis)^ffallemiasebi禾口紙狀葡萄穗霉(Stachybotryschartarum)0真菌存在的任何環(huán)境中的真菌生長(zhǎng)也可被抑制。例如流體、生物被膜中和表面上的真菌生長(zhǎng)可被抑制。本文公開(kāi)的化合物可與任何其他化合物或者組合物聯(lián)合給予或使用。例如,本公開(kāi)的化合物可與另--種抗真菌化合物聯(lián)合給予或使用?！耙种普婢L(zhǎng)”被定義為減少單個(gè)真菌分裂成子細(xì)胞的能力，或減少真菌群形成子細(xì)胞的能力。真菌繁殖的能力可減少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或100%或更高。還提供了一種抑制真菌或真菌群生長(zhǎng)和/或殺滅真菌或真菌群的方法,包括將所述真菌與本文所公幵和描述的一種或多種化合物接觸?！皻缯婢北欢x為使單個(gè)真菌死亡或減少多個(gè)真菌如集落中的真菌的數(shù)量。當(dāng)以復(fù)數(shù)形式提及真菌時(shí),“殺滅真菌”被定義為既定真菌群的細(xì)胞死亡率為群的10%、群的20%、群的30%、群的40%、群的50%、群的60%、群的70%、群的80%、群的90%或低于或等于群的100%。本文公開(kāi)的化合物和組合物具有體內(nèi)或體外抗真菌活性，且可與同樣為殺真菌劑的其他化合物和組合物結(jié)合使用。術(shù)語(yǔ)“治療有效量”的本文所提供的化合物是指無(wú)毒的、足以將一種或多種癥狀根據(jù)需要減輕的量。如將在F文指出的，所需化合物的確切量因受試者而異，這取決于受試者的物種、年齡和總體狀況、所治療疾病的嚴(yán)重程度，使用的具體化合物,其給藥模式等等。因此，不可能指定一個(gè)確切的“有效量”。但是,適當(dāng)?shù)挠行Я坑杀绢I(lǐng)域的普通技術(shù)人員只使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)即可確定。本文公幵的化合物和組合物可通過(guò)藥學(xué)可接受載體體內(nèi)給藥?！八帉W(xué)可接受的”是指物質(zhì)不會(huì)在生物學(xué)方面或者其他方面不合乎需要，即該物質(zhì)可在不引起任何不良生物反應(yīng)的情況下或在不會(huì)以有害方式與藥物組合物所含有的任何其他組分相互作用的情況下被給予受試者。使活性成分的任何降解最小并使在受試者中的有害副作用最小的載體自然會(huì)被選擇，這正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的那樣。本文公開(kāi)的組合物或者化合物可以口服給藥、胃腸外給藥(如靜脈內(nèi)給藥)、肌內(nèi)注射給藥、腹膜內(nèi)注射給藥、經(jīng)皮給藥、體外給藥、局部給藥等等,包括局部鼻內(nèi)給藥或者通過(guò)吸入器給藥。本文所用“局部鼻內(nèi)給藥”表示通過(guò)--個(gè)或者兩個(gè)鼻孔將組合物送遞到鼻和鼻道(nasalpassage)，并可包括通過(guò)噴霧裝置或者滴化裝置送遞，或通過(guò)霧化核酸或載體送遞。組合物通過(guò)吸入器給藥可通過(guò)鼻或嘴經(jīng)由噴霧或滴化裝置送遞。也可通過(guò)插管直接送遞到呼吸系統(tǒng)的任何區(qū)域(如肺部)。所需要的組合物的確切量因受試者而異,這取決于受試者的物種、年齡、體重和總體狀況、所治療變態(tài)反應(yīng)性疾病的嚴(yán)重程度，使用的具體核酸或者載體，其給藥模式等等。因此，不可能為每一種組合物指定一個(gè)確切量。但是，適當(dāng)?shù)牧坑杀绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員在本文的教導(dǎo)下只使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)即可確定。如果使用胃腸外途徑給予組合物或者化合物,其特點(diǎn)一般為注射給藥。注射劑被制備為常規(guī)形式，或者為液體溶液或者懸浮液、注射之前適合溶于或懸浮于液體中的固體形式，或者為乳劑。最近改進(jìn)的胃腸外給藥方法包括使用一個(gè)緩慢釋放或持續(xù)釋放系統(tǒng)，從而使得恒定劑量得以維持。見(jiàn)如美國(guó)專(zhuān)利No.3，610，795,其以援引的方式被納入本文中。本文公開(kāi)的組合物和化合物可與藥學(xué)可接受的載體聯(lián)合用于治療中。合適的載體及其制劑描述于Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(19thed.)ed.A.R.Gennaro,MackPublishingCompany，Easton，PA1995。通常'清況下，合適量的藥學(xué)可接受的鹽用于制劑中使該制劑等滲。藥學(xué)可接受的載體的實(shí)例包括但不限于生理鹽水、林格氏液和葡萄糖溶液。溶液的PH值優(yōu)選為約5到約8’且更優(yōu)選為約7至約7.5。其他載體包括緩釋制劑如含有抗體的固體疏水性聚合物的半透基質(zhì)，該基質(zhì)是特型制品形式，例如薄膜、脂質(zhì)體或微粒。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的是，可更優(yōu)選某些載體，這取決于例如給藥化合物的給藥途徑和濃度。藥學(xué)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些藥學(xué)載體最通常是用于將藥物給予人的標(biāo)準(zhǔn)載體，包括溶液如無(wú)菌水、鹽水以及具有生理PH的緩沖液。組合物可通過(guò)肌內(nèi)或皮下方式給藥。其他化合物根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員使用的標(biāo)準(zhǔn)程序給藥。除了所選分子外，藥物組合物還可包含載體、增稠劑、稀釋劑、緩沖劑、防腐劑、表面活性劑等等。藥物組合物可還包括一種或多種活性成分,如抗微生物劑、抗炎劑、麻醉藥寸寸。藥物組合物可以多種方式給藥，這取決于是需要局部治療還是全身治療，以及治療區(qū)域。給藥可通過(guò)局部(包括眼、陰道、直腸、鼻內(nèi))、口服、吸入或胃腸外途徑例如通過(guò)靜脈滴注、皮下注射、腹膜內(nèi)注射或肌內(nèi)注射進(jìn)行。本公開(kāi)的抗體可靜脈內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、肌內(nèi)給藥、皮下給藥、腔內(nèi)給藥或經(jīng)皮給藥。胃腸外給藥制劑包括無(wú)菌水或非水溶液、懸浮液和乳劑。非水溶劑的實(shí)例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，以及可注射有機(jī)酯類(lèi)如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液,包括鹽水和緩沖介質(zhì)。胃腸外載體包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏或不揮發(fā)油。靜脈內(nèi)載體包括液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(如那些基于林格氏右旋葡萄糖的電解質(zhì)補(bǔ)充劑)等。防腐劑和其他添加劑也可存在，如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑以及惰性氣體等。局部給藥制劑包括膏劑、洗劑、霜?jiǎng)?、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉劑。常規(guī)藥學(xué)載體(以水、粉末或油為基礎(chǔ))、增稠劑等是必要的或可取的?？诜o藥的組合物包括粉末或顆粒、水或非水介質(zhì)中的懸浮液或溶液、膠囊、囊劑或片劑。增稠劑、調(diào)味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑是可取的。有些組合物可能作為藥學(xué)可接受的酸或堿加成的鹽形式給藥,所述酸加成鹽是與無(wú)機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸，和有機(jī)酸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來(lái)酸和富馬酸反應(yīng)所形成,所述堿加成鹽是與無(wú)機(jī)堿如氫氧化鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀,和有機(jī)堿如單烷基胺、雙烷基胺、三烷基胺和芳胺和取代乙醇胺反應(yīng)所形成。本文所公開(kāi)的治療性組合物也可通過(guò)使用單克隆抗體作為與各化合物分子偶聯(lián)的各獨(dú)立載體給藥。本公開(kāi)的治療性組合物還可與作為可靶向性藥物載體的水溶性聚合物偶聯(lián)。這類(lèi)聚合物可包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羥丙基甲基丙烯酸-酰胺苯酚、聚羥乙基天冬酰胺苯酚或由棕櫚酰殘基取代的聚乙烯_環(huán)氧乙烷聚賴(lài)氨酸。此外，本公開(kāi)的治療性組合物可與一類(lèi)用于實(shí)現(xiàn)控制藥物釋放的可生物降解的聚合物例如聚乳酸、聚ε己內(nèi)酯、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚縮醛、聚二氫-吡喃、聚氰基丙烯酸酯和交聯(lián)或兩親的水凝膠嵌段共聚物偶聯(lián)。優(yōu)選由于化合物的給藥至少約3%，更優(yōu)選約10%、更優(yōu)選約20%、更優(yōu)選約30%、更優(yōu)選約50%、更優(yōu)選約75%甚至更優(yōu)選約100%的真菌感染被降低。感染降低是由諸如白細(xì)胞計(jì)數(shù)減少、退熱、炎癥減輕、真菌數(shù)減少或其他真菌感染指標(biāo)下降的參數(shù)決定。為了增加真菌感染降低的百分比，可將劑量增加到對(duì)受試者保持無(wú)毒的最有效水平。如在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中所用的，“受試者”是指某一個(gè)體。優(yōu)選地，該受試者是哺乳動(dòng)物如除人外的哺乳動(dòng)物或靈長(zhǎng)類(lèi)，且更優(yōu)選為人?！笆茉囌摺笨砂茵B(yǎng)動(dòng)物(如貓、狗等)、牲畜(如牛、馬、豬、綿羊、山羊等)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(如小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和魚(yú)類(lèi)?！罢婢腥尽北欢x為受試者或者樣品內(nèi)存在真菌。這種真菌可以是天然存在的真菌在受試者或者樣品內(nèi)或上的生長(zhǎng)產(chǎn)生，或由于外來(lái)生物體入侵產(chǎn)生。實(shí)施例實(shí)施例1真核核糖開(kāi)關(guān)對(duì)可變RNA剪接和基因表達(dá)的控制以前對(duì)攜帶TPP適體的真菌米曲霉thiAmRNA的研究(Kuboderaetal.(2003))揭示，生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加硫胺素(維生素Bi)會(huì)造成基因表達(dá)降低，以及刪除核糖幵關(guān)適體會(huì)破壞硫胺素應(yīng)答性。這些結(jié)果表明，在真菌中硫胺素進(jìn)入細(xì)胞、被磷酸化以生成TPP，并且所產(chǎn)生的輔酶作為配體，用于核糖開(kāi)關(guān)介導(dǎo)的RNA剪接的控制(Sudarsanetal.(2003))。在該研究中，檢查了出現(xiàn)在粗糙脈孢菌中的3個(gè)基因中的TPP適體的功能(圖5)。已知這些基因的兩個(gè)——NMTl(圖la)和CyPBP37(圖Ib；下文稱(chēng)作THI4同源物)是硫胺素代謝基因(McColletal.(2003)，F(xiàn)aou&Tropschug(2003)，F(xiàn)aouTropschug(2004))。第三個(gè)基因NCUO1977.1(圖Ic)編碼未知功能的蛋白。檢查主要集中于NMTl基因，已知該基因在粗糙脈孢菌中(McColletal.(2003))和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)中(Maundrell(1989))受過(guò)量硫胺素抑制。所有3種前體mRNA都在位于5'端附近的內(nèi)含子中攜帶核糖開(kāi)關(guān)(圖1和圖6)。逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法被用于建立相對(duì)量，并且當(dāng)在不存在或存在硫胺素的情況下培養(yǎng)粗糙脈孢菌時(shí)產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物5’端的核苷酸序列(圖Id)。RNA產(chǎn)物的克隆和測(cè)序顯示出與基因組DNA的序列匹配的前體轉(zhuǎn)錄物的存在以及，與圖1中描述的RNA剪接產(chǎn)物一致的其他序列的存在。這些結(jié)果可證實(shí),硫胺素可造成NMTl和THI4前體mRNA的可變剪接，以及造成NCU01977.1前體mRNA的剪接增加。硫胺素不影響不攜帶TPP核糖開(kāi)關(guān)的RNA的剪接(圖7)。通過(guò)直讀探測(cè)(in-lineprobing)確認(rèn)了NMTlRNA構(gòu)建體的TPP結(jié)合(Soukup&Breaker(1999))(圖8和9)。已知呈現(xiàn)主結(jié)構(gòu)調(diào)整的核苷酸參與TPP結(jié)合(Thoreetal.(2006),Serganovetal.(2006),Edwards&Ferre-D'Amar6(2006)),測(cè)得的這兩種構(gòu)建體的300ρΜ的表觀離解常數(shù)(KD)類(lèi)似于細(xì)菌TPP核糖幵關(guān)呈現(xiàn)的表觀離解常數(shù)(Winkleretal.(2OO2)，Welz&Breaker(2OO7))。通過(guò)使用RT-PCR進(jìn)一步研究了NMTlRNA可變剪接的硫胺素控制，以確立從在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)的粗糙脈孢菌及在補(bǔ)充硫胺素后不同時(shí)間取樣的粗糙脈孢菌分離的轉(zhuǎn)錄物的類(lèi)型和量(圖2a)。在不存在添加的硫胺素(t=Omin)的情況下，轉(zhuǎn)錄物被加工以產(chǎn)生剪接產(chǎn)物1-3。在補(bǔ)充硫胺素后的第1小時(shí)內(nèi)，出現(xiàn)剪接產(chǎn)物和未剪接的NMTl前體RNAI1。在4小時(shí)內(nèi)，幾乎被I2和完全代替。這些結(jié)果表明，:卜3在添加硫胺素后的急劇降低是NMTl表達(dá)降低的原因。攜帶具有按閱讀框與螢光素酶(LUC)報(bào)告基因融合的主ORF起始密碼子的NMTl5'UTR或其變體的構(gòu)建體(圖2b)被用于評(píng)估TPP適體對(duì)于基因控制的重要性。對(duì)野生型(WT)LUC報(bào)告物構(gòu)建體的實(shí)質(zhì)性遏制出現(xiàn)于在補(bǔ)充30μM硫胺素的培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)的粗糙脈孢菌中(圖2c,上圖)。而且,源自報(bào)告物構(gòu)建體和天然NMTlmRNA的RT-PCR產(chǎn)物是相當(dāng)?shù)?圖2c,下圖)。當(dāng)細(xì)胞在無(wú)硫胺素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的時(shí)候,大多數(shù)的突變構(gòu)建體呈現(xiàn)比WT增大2倍至4倍的報(bào)告物活性。在生長(zhǎng)于基本培養(yǎng)基中的細(xì)胞中，弱化TPP結(jié)合親和性的突變還可能消除由TPP合成造成的適度水平的基因遏制。在莖Pl至P5中破壞并隨后恢復(fù)適體內(nèi)的堿基配對(duì)的突變(構(gòu)建體Ml至M9,圖2b)大多數(shù)產(chǎn)生與RNA的TPP結(jié)合能力相關(guān)的基因調(diào)節(jié)特征。雖然在M5中P3的伸展部分被破壞，但是該變化出現(xiàn)于適體的TPP結(jié)合核心之外，對(duì)基因控制幾乎無(wú)影響。另外，大多數(shù)的伸展P3莖可以被刪除(M10,類(lèi)似于圖8中的115MTlRNA)，而不失去全部功能。Ml中的突變可造成LUC活性的顯著降低，并且檢測(cè)不到通常的raRNA產(chǎn)物(圖2c)，這表明除了起到結(jié)合TPP的作用之外,適體中的某些核苷酸和結(jié)構(gòu)可影響mRNA轉(zhuǎn)錄或加工。使用M9時(shí)出現(xiàn)了大多數(shù)出現(xiàn)的結(jié)果，它攜帶針對(duì)M8的P5莖中破壞性突變的補(bǔ)償性突變。M9僅呈現(xiàn)對(duì)硫胺素依賴(lài)的基因控制的部分恢復(fù)，而處于遠(yuǎn)低于WT或其他補(bǔ)償性突變的表達(dá)水平(圖2c)。M9的這些異常特征與這樣一種機(jī)制是一致,即P5中的核苷酸可通過(guò)該機(jī)制參與可變剪接的控制(見(jiàn)下文)。上述大多數(shù)突變對(duì)硫胺素調(diào)節(jié)作用的影響使本發(fā)明人推測(cè)由于存在主ORF上游的起始密碼子(圖la)，未剪接的或可變剪接的RNA是失活的。對(duì)該假設(shè)的檢驗(yàn)是通過(guò)檢查與WT或突變形式的所述三種類(lèi)型NMTl5‘UTR的下游融合的其他LUC報(bào)告物構(gòu)建體來(lái)進(jìn)行(圖3a)。所形成的構(gòu)建體I-3R缺乏上游啟動(dòng)密碼子并可模擬在不存在所添加的硫胺素時(shí)主要的短(或全長(zhǎng))剪接mRMA，該構(gòu)建體I-3R可產(chǎn)生強(qiáng)的報(bào)告物活性(圖3b)。相反，類(lèi)似物I-2R構(gòu)建體幾乎沒(méi)有表現(xiàn)出報(bào)告物活性，這與硫胺素存在時(shí)以及基因表達(dá)減少時(shí)該剪接變體的天然產(chǎn)生是一致的(圖2c)。如預(yù)計(jì)的,具有構(gòu)建體I-2R和I-3R的LUC表達(dá)水平未因添加硫胺素而被改變，這是因?yàn)椴淮嬖赥PP核糖開(kāi)關(guān)。在主NMTlORF上游的可變剪接的1-2構(gòu)建體(圖3a)中對(duì)第一(Ml1)、第二(M12)或前述二者(M13)起始密碼子的破壞可形成產(chǎn)生不斷增多的轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的構(gòu)建體。已經(jīng)觀察到，真菌基因5‘UTR的短上游ORF(uORF)可減少主ORF的表達(dá)(Vilela&McCarthy(2003))。因此,在同時(shí)破壞1_2中兩個(gè)uORF起始密碼子時(shí)LUC表達(dá)的恢復(fù)與這樣的假設(shè)是一致的，即uORF翻譯是主NMTlORF表達(dá)減少的原因。在第一5’剪接位點(diǎn)(M14)、剪接分支位點(diǎn)(M15)或3’剪接位點(diǎn)(M16)攜帶突變的轉(zhuǎn)錄物(圖3a)可形成均--的低報(bào)告物表達(dá)(圖3b,上圖)。RT-PCR分析顯示,M14可產(chǎn)生I-2RRNA剪接產(chǎn)物，而M15和M16不進(jìn)行剪接(圖3b，下圖)。這些結(jié)果可證明，需要合適的剪接來(lái)去除uORF并使主ORF表達(dá)。對(duì)于許多細(xì)菌核糖開(kāi)關(guān),代謝物結(jié)合可以不涉及蛋白的方式改變位于適體下游的表達(dá)平臺(tái)的折疊(Winkleretal.(2002),Mironovetal.(2002),Serganovetal.(2006))。為了評(píng)估NMTlTPP核糖幵關(guān)進(jìn)行的剪接調(diào)節(jié)是否是由于適體側(cè)翼的不依賴(lài)于蛋白的結(jié)構(gòu)調(diào)整引起的，對(duì)NMTlUTR構(gòu)建體進(jìn)行直讀探測(cè)(S0ukup&Breaker(1999))。有意思的是，添加TPP會(huì)導(dǎo)致在分支位點(diǎn)處的核苷酸的結(jié)構(gòu)變得更為有序(圖10)，并且會(huì)在第二5’剪接位點(diǎn)處產(chǎn)生更加靈活的結(jié)構(gòu)(圖4a)。再者，已經(jīng)觀察到,適體P4和P5元件的12個(gè)核苷酸與位于第二5’剪接位點(diǎn)的大多數(shù)在不存在配體時(shí)結(jié)構(gòu)....t退隱的核苷酸互補(bǔ)(圖4b)。P4和P5元件是TPP的磷酸部分的識(shí)別所必需的，從而TPP結(jié)合和5’剪接位點(diǎn)封閉是互相排斥的。在體內(nèi)報(bào)告物測(cè)定中，構(gòu)建體M9的異常特征與該核糖開(kāi)關(guān)功能的模型是一致的。直讀探測(cè)可確認(rèn)，M9突變可破壞適體和第二5’剪接位點(diǎn)之間的堿基配對(duì)(圖11)，并且該結(jié)構(gòu)缺陷被預(yù)計(jì)有助于所出現(xiàn)的長(zhǎng)剪接mRNA的產(chǎn)生和報(bào)告物表達(dá)的喪失(圖2c)。而且，與其他真菌物種NMTl基因相關(guān)的所有TPP核糖開(kāi)關(guān)中均存在相似的可變堿基配對(duì)可能(圖12),這說(shuō)明這種保守的可變二級(jí)結(jié)構(gòu)是TPP核糖開(kāi)關(guān)表達(dá)平臺(tái)的一個(gè)重要特征。已經(jīng)被證明的是，當(dāng)存在兩個(gè)5’剪接位點(diǎn)時(shí)，來(lái)自真菌粟酒裂殖酵母的剪接體極偏好使用靠近3’剪接位點(diǎn)的位點(diǎn)(Romfoetal.(2000))?？紤]到上述5，剪接位點(diǎn)的偏向性，那么簡(jiǎn)單地通過(guò)調(diào)節(jié)P4-P5適體區(qū)和第二5’剪接位點(diǎn)之間的堿基配對(duì)，_T1raRNA中的TPP核糖開(kāi)關(guān)即可保持對(duì)可變剪接產(chǎn)物分布的完全控制。其他真菌基因中的TPP核糖開(kāi)關(guān)似乎使用不同機(jī)制進(jìn)行基因控制(圖13)。這些數(shù)據(jù)與TPP核糖開(kāi)關(guān)介導(dǎo)的剪接調(diào)節(jié)機(jī)制是一致的，在TPP核糖開(kāi)關(guān)介導(dǎo)的剪接調(diào)節(jié)機(jī)制中代謝物結(jié)合可改變內(nèi)含子可變剪接位點(diǎn)和分支位點(diǎn)組分的可用性(圖4c)。當(dāng)TPP濃度較低時(shí),新轉(zhuǎn)錄的mRNA采用一種封閉第二5’剪接位點(diǎn)的結(jié)構(gòu),而使得所述分支位點(diǎn)可進(jìn)行剪接。來(lái)自第一5’剪接位點(diǎn)的mRNA前體剪接可導(dǎo)致1-3形式的mRNA的產(chǎn)生及NMTl蛋白的表達(dá)。當(dāng)TPP濃度較高時(shí)，配體結(jié)合于TPP適體可造成RNA折疊的變構(gòu)變化，以增加第二5’剪接位點(diǎn)附近的結(jié)構(gòu)靈活性，以及封閉所述分支位點(diǎn)附近的核苷酸。這些變化的組合效應(yīng)是I-ImRNA的剪接效率的降低，以及那些確實(shí)被加工的mRNA的再定向以生成可變剪接的1-2mRNA。I-I和1_2都攜帶與主ORF翻譯競(jìng)爭(zhēng)并抑制NMTl表達(dá)的uORF?？勺兗艚釉谡婧嘶蚩刂浦械膮⑴c正逐漸變得清晰(Matlinetal.(2005)，Blencowe(2006)),這些結(jié)果表明了核糖開(kāi)關(guān)可以如何調(diào)節(jié)剪接效率以及剪接位點(diǎn)的選擇，而不需要蛋白因子?？紤]到RNA折疊可能性的巨大多樣性，成結(jié)構(gòu)的RNA結(jié)構(gòu)域可能通過(guò)以下方式被廣泛地用于控制剪接(Buratti&Baralle(2004))直接讀取的物理變化例如溫度(Colotetal.(2005))或者代謝物濃度的變化(Sudarsanetal.(2003),Kuboderaetal.(2003),Borsuketal.(2007))。再者一種配體介導(dǎo)的剪接控制的實(shí)例最近已被報(bào)告，所述控制使用工程改造的適體(Kimetal.(2005))，這證明了配體-mRNA直接相互作用可束縛基因控制的應(yīng)用。使用真菌TPP核糖開(kāi)關(guān)的觀察結(jié)果進(jìn)一步顯示了來(lái)自生命的各結(jié)構(gòu)域的核糖開(kāi)關(guān)的多變性，并且暗示未發(fā)現(xiàn)的核糖開(kāi)關(guān)類(lèi)有可能參與其他基因控制過(guò)程。方法概要寡核苷酸和化學(xué)品.合成RNA、購(gòu)買(mǎi)合成的DNA(圖14)和試劑并按詳述的方法所示制備DAN構(gòu)建體。RNA分析.使用來(lái)自接種于100mlVogel基本培養(yǎng)基(補(bǔ)充有0.5mgHir1L-組氨酸)中的未轉(zhuǎn)化粗糙脈孢菌的RNA進(jìn)行RT-PCR分析。在不存在或存在添加的30μM硫胺素的情況下，在300C下將培養(yǎng)物以150rpm振搖培養(yǎng)24h。使用補(bǔ)充信息(Supp1eraentaryIηformation)中所述引物和方法，將cDNA作為模板用于所述3個(gè)基因5‘區(qū)的PCR擴(kuò)增。所有剪接產(chǎn)物通過(guò)克隆及測(cè)序確認(rèn)。報(bào)告基因測(cè)定.使用新鮮懸浮的大分生孢子的電穿孔進(jìn)行粗糙脈孢菌的轉(zhuǎn)化，并通過(guò)使用來(lái)自基因組DNA的插入物特異性引物的PCR來(lái)驗(yàn)證靶基因的插入。螢光素酶報(bào)告物構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄受插入至NMT1.5'UTR上游的粗糙脈孢菌β-微管蛋白(BTUB)啟動(dòng)子組成性地驅(qū)動(dòng)。在不存在或存在30μM硫胺素的情況下,在30°C下將粗糙脈孢菌于2%的葡萄糖基本培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。如下述分離樣品并測(cè)定螢光素酶活性。方法生物信息學(xué)搜索和真菌TPP核糖開(kāi)關(guān).本發(fā)明人通過(guò)由已知的代表性TPP核糖開(kāi)關(guān)修改的手工審校的種子序列比對(duì)，使用協(xié)方差模型搜索檢查了RefSeq數(shù)據(jù)庫(kù)(第13版)的“真菌”分支。協(xié)方差模型(Eddyetal.(1994))使用infernal軟件包(Eddy，S.R,DepartmentofGenetics,WashingtonUniversitySchoolofMedicine.St.Louis,Missouri)(第0.55版)生成。另外的詳情還見(jiàn)補(bǔ)充信息。DNA寡核苷酸和化學(xué)品.合成的DNA購(gòu)自耶魯大學(xué)(YaleUniversity)HHMIKeck基金生物技術(shù)資源中心。TPP、硫胺素、碘乙酸鈉(IAA)和L-組氨酸購(gòu)自Sigma-Aldrich0[γ-32P]ATP購(gòu)自AmershamPharmacia。體外轉(zhuǎn)錄.DNA模板通過(guò)PCR擴(kuò)增從粗糙脈孢菌基因組DNA產(chǎn)生,使用的是設(shè)計(jì)用于將T7啟動(dòng)子導(dǎo)入構(gòu)建體的引物。將序列CC添加至模板鏈轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)以促進(jìn)體外轉(zhuǎn)錄效率，從而產(chǎn)生5'端攜帶GG的RNA。RNA使用RiboMaxTranscriptionKit(Promega)依照廠商說(shuō)明書(shū)制備。如以前的描述(Seethaxamanetal.(2001))通過(guò)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)純化RNA，并進(jìn)行5‘32P-標(biāo)記。RNA構(gòu)建體的直讀探測(cè).在存在或不存在如定義的TPP的情況下下,將5'32P-標(biāo)記的RNA于50mMTris-HCl(pH8.3，25°C)、20mMMgCl2和IOOmMKCl中在23°(下孵育40分鐘。切割產(chǎn)物通過(guò)變性10%PAGE分離、通過(guò)PhosphorImager(GEHealthcare)顯像并使用IraageQuant軟件定量。KD值是通過(guò)將標(biāo)準(zhǔn)化的切割RNA部分相對(duì)于所使用配體的對(duì)數(shù)濃度作圖來(lái)進(jìn)行確定。菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基.粗糙脈孢菌87-74(bd；frq+a和his_3)(Froehlichetal.(2003))被用作轉(zhuǎn)化用的宿主株。攜帶螢火蟲(chóng)螢光素酶(LUC)報(bào)告基因的質(zhì)粒PLL07(由J.C.Dunlap的實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng))(Mehraeta!.(2002))被用于報(bào)告基因構(gòu)建。通過(guò)QuikChange(Stratagene)位點(diǎn)定向誘變移除pLL07中LUC報(bào)告基因的起始密碼子以獲得質(zhì)粒pLL09。粗糙脈孢菌中從1至355位的β-微管蛋白基因啟動(dòng)子(登錄號(hào)Μ13630)(Orbachetal.(1986))是使用引物DNA3和DNA4通過(guò)PCR從基因組DNA擴(kuò)增。以MfeI和EcoRI消化所擴(kuò)增的DNA片段，并插入至pLL09的EcoRI位點(diǎn)，以得到pLUC。pLUC的序列通過(guò)測(cè)序(耶魯大學(xué)HHMIKeck基金生物技術(shù)資源中心)確認(rèn)。在質(zhì)粒操作過(guò)程中將大腸桿菌Top10細(xì)胞(Invitrogen)用作宿主。對(duì)NMTl基因(登錄號(hào)AY007661)5'UTR的克隆是以DNA5和DNA6為引物通過(guò)PCR從粗糙脈孢菌基因組DNA擴(kuò)增378bp片段(幵始于注釋的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))實(shí)現(xiàn)。首先使用TOPOTA克隆試劑盒(Invitrogen)克隆所產(chǎn)生的野生型(WT)PCRDNA0通過(guò)EcoRI和XbaI限制酶消化從所述載體釋放NMTl片段,并將其克隆至pLUC的合適位點(diǎn)中。為了生成適體突變體Ml至M9和剪接位點(diǎn)突變體M14至M16,在包含TOTO載體的WTNMTl上進(jìn)行PCR誘變(見(jiàn)引物列表)。在通過(guò)DNA測(cè)序確認(rèn)誘變后，將每個(gè)突變體NMTl片段克隆至pLUC的EcoRI/Xbal位點(diǎn)中。對(duì)于M缺失構(gòu)建體(MlO)的克隆，將NMTl以引物DNA5/DNA25和DNA26/DNA6擴(kuò)增為兩個(gè)片段,其中重疊區(qū)刪除了大部分的天然P3a莖。這兩個(gè)片段在以DNA5和DNA6作為外引物的后續(xù)PCR中被用作模板。所形成的片段經(jīng)EcoRI和XbaI消化，并被克隆至pLUC中。NMTl的I-2R和I-3R構(gòu)建體以及變體的制備是以DNA5和DNA6為引物通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增這兩個(gè)可變剪接產(chǎn)物而實(shí)現(xiàn)。如上述將所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物克隆并突變。為T(mén)生成NCU01977.15‘區(qū)-LUC報(bào)告物融合物(圖13),如上所述，以DNA41和DNA42為引物從粗糙脈孢菌基因組DNA擴(kuò)增預(yù)測(cè)起始密碼子上游94個(gè)核苷酸起始的478個(gè)核苷酸的片段，并且克隆至PLUC的EcoRI/Xbal位點(diǎn)中。所有構(gòu)建體的完整性通過(guò)測(cè)序(耶魯大學(xué)HHMIKeck基金會(huì)生物技術(shù)資源中心)確認(rèn)。在所有構(gòu)建體中，主ORF(ΝΜ或NCU01977.1)的原始起始密碼子都與LUC報(bào)告物序列按閱讀框融合。用于培養(yǎng)粗糙脈孢菌的標(biāo)準(zhǔn)液體培養(yǎng)基包含2%葡萄糖、0.5%L-精氨酸、IXVogel基本培養(yǎng)基和50ng/ml生物素。用于粗糙脈孢菌生長(zhǎng)的固體培養(yǎng)基(斜面)包含IXVogel基本培養(yǎng)基、2%蔗糖和1.5%瓊脂。用于選擇粗糙脈孢菌轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基包含IXVogel基本培養(yǎng)基、2%瓊脂、2%L-山梨糖、0.05%果糖和0.05%葡萄糖。對(duì)于同核體分離,使用含IAA的0.IXWestergaard培養(yǎng)基。粗糙脈孢菌轉(zhuǎn)化和報(bào)告物測(cè)定.如以前的描述(Davis(2000)，Loros.&I)unlap(1.991),Vann(1995)),粗糙脈孢菌的轉(zhuǎn)化是使用新鮮懸浮的大分生孢子的電穿孔進(jìn)行。靶基因的插入是通過(guò)PCR使用插入物特異的引物從基因組DNA確認(rèn)。如以前的描述(Ebbole&Sachs(1990))分離同型核的株。螢光素酶報(bào)告基因測(cè)定.通過(guò)過(guò)濾分離來(lái)自以L(fǎng)UC報(bào)告物構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的粗糙脈孢菌的菌絲體,并將大約IOOrag組織碾成細(xì)粉。在添加1.00μ1IXpassive裂解緩沖液(Promega)后,將樣品劇烈混合并在冰上孵育30min,然后以13，OOOg離心15分鐘。使用螢光素酶測(cè)定系統(tǒng)(Promega)和板讀數(shù)(plate-reading)發(fā)光計(jì)(Wallac)測(cè)定所得上清液的螢光素酶活性。將螢光素酶活性按Bradford蛋白質(zhì)測(cè)定法(BioRad)測(cè)定的提取物總蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)化，并最終以相對(duì)于參考構(gòu)建體的值表示。相對(duì)于未添加硫胺素培養(yǎng)的細(xì)胞中的野生型NMTl構(gòu)建體,螢光素酶背景活性(未轉(zhuǎn)化的粗糙脈孢菌)為0.05%。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析.使用TRIzolLS試劑(Invitrogen)依照廠商說(shuō)明書(shū)從菌絲體分離總RNA。在37°C下將5μg總RNA以無(wú)RNA酶的DNA酶I(Promega)處理30min。cDNA是通過(guò)在42°C下使用SuperScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)依照廠商說(shuō)明書(shū)以polyT為引物逆轉(zhuǎn)錄lhr生成。為了排除來(lái)源于基因組DNA污染的擴(kuò)增產(chǎn)物的可能性,在RT之前進(jìn)行了使用RNA制劑的對(duì)照反應(yīng)，并且對(duì)于NMT1，使用了一種跨越編碼區(qū)外顯子-外顯子邊界的反向引物。生物信息學(xué)搜索和真菌TPP核糖開(kāi)關(guān).通過(guò)從已知的TPP核糖開(kāi)關(guān)代表物修改的手工審校的種子序列比對(duì)，使用協(xié)方差模型搜索檢查了RefSeq數(shù)據(jù)庫(kù)(第13版)的“真菌”分支，。協(xié)方差模型(Eddyl994)是使用INFERNAL軟件包(第0.55版)生成。為了確認(rèn)已知核糖開(kāi)關(guān)序列被恢復(fù),將最終結(jié)果與通過(guò)對(duì)硫胺素代謝基因的徹底比較基因組分析而編匯的TPP核糖開(kāi)關(guān)列表比較。該方法成功地識(shí)別出以前在微生物物種中發(fā)現(xiàn)的每一核糖幵關(guān)。另外，與來(lái)自11個(gè)絲狀真菌種的23個(gè)基因相關(guān)的TPP核糖幵關(guān)被鑒定(圖5)。已知在真菌中通過(guò)本方法鑒定的多個(gè)核糖開(kāi)關(guān)相關(guān)的基因參與硫胺素代謝?；谒鼈兏髯?RF的氨基酸序列,還發(fā)現(xiàn)該列表中大多數(shù)以前表征的基因?yàn)榱虬匪卮x蛋白的同源物。在真菌中發(fā)現(xiàn)的TPP適體與它們的真核生物同源物大部分相同，這與功能保守性是一致的。然而，真菌TPP適體代表物具有2個(gè)明顯差異。第一點(diǎn)是一致地缺乏P3a莖，P3a莖有時(shí)存在于真核代表物中但對(duì)適體的TPP結(jié)合來(lái)說(shuō)是非必需的。第二點(diǎn)是在絲狀真菌的P3莖長(zhǎng)度很不均--,在4-83個(gè)堿基對(duì)的區(qū)間變化。三種TPP核糖開(kāi)關(guān)在粗糙脈孢菌中的定位在圖6中示出。DNA寡核苷酸和化學(xué)品.合成的DNA購(gòu)自耶魯大學(xué)(YaleUniversity)HIMIKeck基金生物技術(shù)資源中心。TPP、硫胺素、碘乙酸鈉(IAA)和L-組氨酸購(gòu)自Sigma-Aldrich。[y-32P]ATP購(gòu)自AmershamPharmacia。體外轉(zhuǎn)錄.DNA模板是通過(guò)PCR擴(kuò)增從粗糙脈孢菌基因組DNA產(chǎn)生，使用的是設(shè)計(jì)用于將T7啟動(dòng)子導(dǎo)入構(gòu)建體的引物。將序列CC添加至模板鏈轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)以促進(jìn)體外轉(zhuǎn)錄的效率,從而產(chǎn)生5‘端攜帶GG的RNA。RNA是使用RiboMax轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)依照廠商說(shuō)明書(shū)制備。如以前的描述(Seetharamanetal.(2001))通過(guò)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)純化RNA并進(jìn)行5‘32P-標(biāo)記。RNA構(gòu)建體的直讀探測(cè).在存在或不存在所定義的TPP的情況下，將5‘32P標(biāo)記的RNA于50mMTris-HC:[(pH8.3,25°C)、20raMMgCl2和lOOmMKC1中在23°C下孵育40分鐘。切割產(chǎn)物通過(guò)變性10%PAGE分離、通過(guò)PhosphorImager(GEHealthcare)顯像并使用ImageQuant軟件定量。通過(guò)將標(biāo)準(zhǔn)化的切割RNA部分相對(duì)于所使用配體的對(duì)數(shù)濃度作圖確定Kd值。197麗T1和115NMT1的直讀探測(cè)的結(jié)果在圖8和圖9中描述，261NMT1的結(jié)果在圖10中描述，273NMT1的結(jié)果在圖11種描述。與278MT1構(gòu)建體中正被檢查的可變堿基配對(duì)類(lèi)似的可變堿基配對(duì)出現(xiàn)于位于NMT1mRNA中的其他真菌TPP核糖開(kāi)關(guān)中(圖菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基.粗糙脈孢菌87-74(bd；frq'a和his-3)被用作轉(zhuǎn)化的宿主株。攜帶螢火蟲(chóng)螢光素酶(LUC)報(bào)告基因的質(zhì)粒pLL()7(Froehlich2004)被用于報(bào)告基因構(gòu)建。通過(guò)QuikChange(Stratagene)位點(diǎn)定向誘變移除pLL07中LUC報(bào)告基因的起始密碼子以獲得質(zhì)粒PLL09。粗糙脈孢菌中從1至355位的f3-微管蛋白基因啟動(dòng)子(登錄號(hào)M13630)是通過(guò)PCR使用引物DNA3和DNA4從基因組DNA擴(kuò)增。以Mfel和EcoRI消化所擴(kuò)增的DNA片段,并將其插入至PLL09的EcoRI位點(diǎn)，以得到pLUC。pLUC的序列通過(guò)測(cè)序(耶魯大學(xué)HHMIKeck基金生物技術(shù)資源中心)確認(rèn)。在質(zhì)粒操作過(guò)程中將大腸桿菌Top10細(xì)胞(Invitrogen)用作宿主。用于培養(yǎng)粗糙脈孢菌的標(biāo)準(zhǔn)液體培養(yǎng)基包含2%葡萄糖、0.5%L-精氨酸、IXVogel基本培養(yǎng)基和50ng/ml生物素。用于粗糙脈孢菌生長(zhǎng)的固體培養(yǎng)基(斜面)包含IXVogel基本培養(yǎng)基、2%蔗糖和1.5%瓊脂。用于選擇粗糙脈孢菌轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基包含IXVogel基本培養(yǎng)基、2%瓊脂、2%L-山梨糖、0.05%果糖和0.05%葡萄糖。對(duì)于同核體分離，使用含IAA的0.IXffestergaard培養(yǎng)基(Westergaard1947)。粗糙脈孢菌轉(zhuǎn)化和報(bào)告物測(cè)定.如以前的描述(Davis2000，Loros1991,Vann1995)，粗糙脈孢菌的轉(zhuǎn)化是使用新鮮懸浮的大分生孢子的電穿孔進(jìn)行。靶基因的插入是通過(guò)PCR使用插入物特異的引物從基因組DNA證實(shí)。如以前的描述(Ebbole1990)分離同型核的株。5‘UTR-報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建.對(duì)NMT1基因(登錄號(hào)AY007661)5‘UTR的克隆是以DNA5和DNA6為引物通過(guò)PCR從粗糙脈孢菌基因組DNA擴(kuò)增378bp片段(開(kāi)始于所注明的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))實(shí)現(xiàn)。所產(chǎn)生的野生型(WT)PCRDNA首先使用T0P0TA克隆試劑盒(Invitrogen)克隆。通過(guò)EcoRI和Xbal限制酶消化從所述載體釋放NMT1片段,并將其克隆至pLUC的合適位點(diǎn)中。為了生成適體突變體Ml至M9和剪接位點(diǎn)突變體M14至M16，在包含T0P0載體的WTNMT1上進(jìn)行PCR誘變(見(jiàn)引物列表)。在通過(guò)DMA測(cè)序確認(rèn)誘變后,將每個(gè)突變體NMT1片段克隆至pLUC的EcoRI/Xbal位點(diǎn)中。對(duì)于P3缺失構(gòu)建體(M10)的克隆,將NMT1以DNA5/DNA25和DNA26/DNA6為引物擴(kuò)增為兩個(gè)片段，其中重疊區(qū)刪除了大部分的天然P3a莖。這兩個(gè)片段在以DNA5和DNA6作為外引物的后續(xù)PCR中被用作模板。通過(guò)EcoRI和Xbal消化所形成的片段,并將其克隆至pLUC中。NMT1的I-2R和I-3R構(gòu)建體以及變體的制備是以DNA5和DNA6為引物通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增這兩個(gè)可變剪接產(chǎn)物而實(shí)現(xiàn)。如上述將所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物克隆并突變。為了生成NCU01977.15'區(qū)-LUC報(bào)告物融合物(圖12),如上所述，以DNA41和DKA42為引物從粗糙脈孢菌基因組DNA擴(kuò)增預(yù)測(cè)起始密碼子上游94個(gè)核苷酸起始的478個(gè)核苷酸的片段,并且克隆至PLUC的EcoRI/Xbal位點(diǎn)中。所有構(gòu)建體的完整性通過(guò)測(cè)序(耶魯大學(xué)HHMIKeck基金生物技術(shù)資源中心)確認(rèn)。在所有構(gòu)建體中，主0RF(NMT1或NCU01977.1)的原始起始密碼子都與LUC報(bào)告物序列按閱讀框融合。螢光素酶報(bào)告基因測(cè)定.通過(guò)過(guò)濾分離來(lái)自以L(fǎng)UC報(bào)告物構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的粗糙脈孢菌的菌絲體，并將大約100mg組織碾成細(xì)粉。在添加100ulIXPassive緩沖裂解液(Promega)后，將樣品劇烈混合并在冰....丨二孵育30min，然后以13，000g離心15分鐘。使用螢光素酶測(cè)定系統(tǒng)(Promega)和板讀數(shù)發(fā)光計(jì)(Wallac)確定所得上清液的螢光素酶活性。將螢光素酶活性按Bradford蛋白質(zhì)測(cè)定法(BioRad)測(cè)定的提取物總蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)化,并最終以相對(duì)于參考構(gòu)建體的值表示。相對(duì)于未添加硫胺素培養(yǎng)的細(xì)胞中的野生型NMT1構(gòu)建體，螢光素酶背景活性(未轉(zhuǎn)化的粗糙脈孢菌)為0.05%。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析.使用TRIzolLS試劑(Invitrogen)46依照廠商說(shuō)明書(shū)從菌絲體分離總RNA。在37°C下將5ug總RNA以無(wú)RNA酶的DNA酶I(Promega)處理30min。cDNA是通過(guò)在42°C下使用SuperScriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)依照廠商說(shuō)明書(shū)以polyT引物逆轉(zhuǎn)錄Ihr生成。為了排除來(lái)源于基因組DNA污染的擴(kuò)增產(chǎn)物的可能性，在RT之前進(jìn)行了使用RNA制劑的對(duì)照反應(yīng),并且對(duì)于NMT1，使用了一種跨越編碼區(qū)外顯子-外顯子邊界的反向引物。RT-PCR分析從以polyT為引物通過(guò)RT生成的cDNA進(jìn)行，但使用序列特異性的RT引物得到了相同的結(jié)果。同時(shí)，使用結(jié)合于NMT1編碼區(qū)下游外顯子的RT-PCR反向引物未造成任何差異(數(shù)據(jù)未顯示)。這表明，所有轉(zhuǎn)錄物形式都是多腺苷酸化的，并且對(duì)包含核糖開(kāi)關(guān)的內(nèi)含子的下游內(nèi)含子的剪接是不受影響的。為了識(shí)別序列,將所有擴(kuò)增產(chǎn)物克隆并且通過(guò)對(duì)多個(gè)獨(dú)立克隆的測(cè)序進(jìn)行確認(rèn)。此外，向生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加硫胺素未出現(xiàn)對(duì)剪接控制的一般效應(yīng)(圖7)。另外，RT-PCR被用于確定從NMT1下游內(nèi)含子剪接的范圍，發(fā)現(xiàn)了在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中不存在及存在添加的硫胺素的情況下都進(jìn)行組成型剪接。對(duì)每個(gè)基因使用特異的引物組合,一個(gè)引物結(jié)合于所注明的轉(zhuǎn)錄物5’端，另一引物結(jié)合于包含核糖開(kāi)關(guān)的內(nèi)含子緊鄰的下游。對(duì)于NMT1基因，使用的PCR引物是DNA37和DNA38(圖14)，分別對(duì)應(yīng)于所注明的NMT1mRNA的5’端和包含TPP核糖開(kāi)關(guān)的內(nèi)含子下游大約50個(gè)核苷酸的區(qū)域。對(duì)于THI4(CyPBP37)基因，使用的PCR引物是DKA89和DNA40,分別對(duì)應(yīng)于mRNA的5’端和包含TPP核糖開(kāi)關(guān)的內(nèi)含子下游大約125個(gè)核苷酸的區(qū)域。用分別結(jié)合預(yù)測(cè)起始密碼子前94個(gè)核苷酸和含核糖幵關(guān)的內(nèi)含子的預(yù)測(cè)3'端下游的22個(gè)核苷酸的引物DNA41和DNA42，擴(kuò)增NCU01977.1的5'區(qū)。PCR產(chǎn)物是通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，并通過(guò)溴化乙錠染色顯示。將不同的擴(kuò)增產(chǎn)物使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)純化,并依照廠商的說(shuō)明書(shū)克隆至T0P0-TA克隆載體(Invitrogen)中。每個(gè)產(chǎn)物的多克隆序列均通過(guò)測(cè)序分析(耶魯大學(xué)HHMIKeck基金生物技術(shù)資源中心)。為了在粗糙脈孢菌轉(zhuǎn)化體中檢測(cè)NMT1-LUC融合轉(zhuǎn)錄物,使用引物DNA37和DNA43，它們對(duì)應(yīng)于NMT1轉(zhuǎn)錄物的5'端和LUC開(kāi)放閱讀框起始點(diǎn)下游大約130個(gè)核苷酸的區(qū)域。天然NMT1轉(zhuǎn)錄物以及所示的某些突變構(gòu)建體攜帶伸展的P3莖(圖10)。其他真菌TPP核糖幵關(guān)的機(jī)制.通過(guò)一種核糖幵關(guān)作用、可變剪接和uORF翻譯的類(lèi)似相互作用，粗糙脈孢菌THI4基因可能被TPP抑制。相反，NCU01977.1前體轉(zhuǎn)錄物在內(nèi)含子中攜帶TPP核糖開(kāi)關(guān)適體,所述內(nèi)含子隔斷主0RF。未剪接的轉(zhuǎn)錄物的翻譯被存在于內(nèi)含子中的早期終止密碼子中斷。NCU01977.ImRNA的RT-PCR分析(圖lb)表明，剪接的mRNA相對(duì)于未剪接的mRNA的比例在存在硫胺素時(shí)會(huì)增大，這表明其TPP核糖幵關(guān)作為“幵啟的”基因開(kāi)關(guān)的功能，所述開(kāi)啟的基因開(kāi)關(guān)會(huì)增加結(jié)合TPP后的剪接和基因表達(dá)。該結(jié)論還得到了對(duì)在粗糙脈孢菌中表達(dá)的NOJ01977.1報(bào)告融合構(gòu)建體的分析結(jié)果的支持，粗糙脈孢菌對(duì)補(bǔ)充硫胺素的反應(yīng)是產(chǎn)生升高的LUC表達(dá)(圖13)。應(yīng)理解，所公幵的方法和組合物不限于所述的具體方法、方案和試劑，因而它們可有所變化。還應(yīng)理解，本文所用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述具體實(shí)施方案而不意欲限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只被所附的權(quán)利要求所限制。必須注意的是,除非上下文中另外明確指出，在本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)中使用的單數(shù)形式的“一”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指代對(duì)象。因此，例如，提及“一種核糖幵關(guān)”包括多個(gè)這樣的核糖開(kāi)關(guān)，提及“該核糖開(kāi)關(guān)”是指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一個(gè)或多個(gè)核糖S述的事件、情況或材料可能發(fā)生或存在，也可能情況或材料發(fā)生或存在以及不發(fā)生或不存在的開(kāi)關(guān)及其等價(jià)物，等等?！叭芜x的”或“任選地”是指后|不發(fā)生或不存在，且該描述包括所述事情形。范圍在本文中可被表示為從“大約”--個(gè)具體值，和/或到“大約”另一個(gè)具體值。當(dāng)表示為這樣一個(gè)范圍時(shí)，除非____丨二下文另外特別指出，否則也具體地考慮和認(rèn)為公幵了從前述的一個(gè)具體值和/或到前述的另一個(gè)具體值的范圍。類(lèi)似地，當(dāng)通過(guò)在前面使用“大約”將數(shù)值表示為近似值時(shí)，除非上下文另外特別指出，否則應(yīng)理解成該具體數(shù)值可形成另一個(gè)應(yīng)認(rèn)為被公開(kāi)的具體考慮的實(shí)施方案。還應(yīng)理解,除非上下文另外特別指出，每個(gè)范圍的端點(diǎn)在與另一個(gè)端點(diǎn)相關(guān)或獨(dú)立于另一個(gè)端點(diǎn)時(shí)都是有意義的。最后，應(yīng)該理解的是，除非文中另外特別說(shuō)明，否則在明確公開(kāi)的范圍中所包括的所有單個(gè)的數(shù)值和子范圍也被特別考慮和認(rèn)為被公開(kāi)。不論在具體的情況下這些實(shí)施方案的全部或部分是否被明確地公開(kāi),上述的原則都適用除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與所公開(kāi)方法和組合物所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同含義。盡管與本文所述方法和材料類(lèi)似或相當(dāng)?shù)娜魏畏椒ê筒牧隙伎捎糜诒景l(fā)明方法和組合物的實(shí)施或檢測(cè),但是本文仍然描述了特別有用的方法、設(shè)備和材料。本文引用的出版物和因其而被引用的內(nèi)容在此特別地以援引的方式納入本文。本文不應(yīng)被解釋為承認(rèn)本發(fā)明不能先于在先發(fā)明的這些公開(kāi)內(nèi)容。且并非承認(rèn)任何參考文獻(xiàn)都構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。參考文獻(xiàn)的討論說(shuō)明了它們的作者的論斷,但是本申請(qǐng)人保留懷疑所引用文獻(xiàn)的正確性和相關(guān)性的權(quán)利?？梢郧宄乩斫?，雖然本文中提及了許多出版物,但是這些參考文獻(xiàn)并不表示承認(rèn)任何這些文件都構(gòu)成本領(lǐng)域的公知常識(shí)的一部和在通篇本申請(qǐng)的說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中，詞語(yǔ)“包含”和該詞的變化形式如“含有”意指“包括但不限于”,而不意欲排除例如其他添加劑、組分、整數(shù)或步驟。本領(lǐng)域的技術(shù)人員僅使用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)即可認(rèn)識(shí)到或能句合物的具體實(shí)施方案的許多等價(jià)方案。這種等價(jià)方案意欲被隨附的權(quán)利要求所涵蓋。參考文獻(xiàn)Blencowe,B.J.Alternativesplicing:newinsightsfromglobalanalyses.Cell126，37-47(2006).Borsuk,P.，etal.L—ArginineinfluencesthestructureandfunctionofarginasemRNAinAspergillusnidulcins.Biol.Chem.388,135-144(2007).Buratti,E.&Baralle,F.E.InfluenceofRNAsecondarystructureonthepre-mRNAsplicingprocess.Mol.CellBiol.24,10505-10514(2004).Colot,H.V.，Loros,J.J.&Dunlap,J.C.Temperature-modulatedalternativesplicingandpromoteruseinthecircadianclockgenefrequency.Mol.Biol.Cell16,5563-5571(2005).DavisR.H.NeurosporaContributionsofamodelorganism.OxfordUniversityPress,NewYork,NY(2000).Ebbole,D.&Sachs,M.S.ArapidandsimplemethodforisolationofNeurosporacrassahomokaryonsusingmicroconidia.FungalGenet.Newsl.37，17-18(1990).Eddy,S.R.&Durbin，R.RNAsequenceanalysisusingcovariancemodels.NucleicAcidsRes.22，2079-2088(1994).EcldyS.R.INFERNAL.Version0.55.Distributedbytheauthor.DepartmentofGenetics,WashingtonUniversitySchoolofMedicine.St.Louis,Missouri.Edwards,T.E.&Ferre-D>Amare,A.R.CrystalstructuresoftheThi-boxriboswitchbouncltothiaminepyrophosphateanalogsrevealadaptiveRNA—smallmoleculerecognition.Structure14，1459-1468(2006).Faou,P.&Tropschug,M.NeurosporacrassaCyPBP37:acytosolicstressproteinthatisabletoreplaceyeastThi4pfunctioninthesynthesisofvitaminBLJ.Mol.Biol.344，1147-1157(2004).Faou,P.&TropschugM.AnovelbindingproteinforamemberofCyP40-typeCyclophi1ins:N.crassaCyPBP37,agrowthandthiamineregulatedproteinhomologtoyeastThi4p,J.Mol.Biol.333，831-844(2003).Froehlich，A.C.，Loros，J.J.&DunlapJ.C.RhythmicbindingofaWHITECOLLAR-containingcomplextothefrequencypromoterisinhibitedbyFREQUENCY.Proc.Natl.Acad.Sci.USA100，5914-5919(2003)Galagan,J.E.，etal.SequencingofAspergillusnidulansandcomparativeanalysiswithA.fumigatusandA.oryzae.Nature438，1105-1115(2005).Kim,D._S.，Gusti,V.，Pillai,S.G.&Gaur,R.K.Anartificialriboswitchforcontrollingpre-mRNAsplicing.RNA11,1667-1677(2005)Kubodera，T.，etal.，Thiamine-regulatedgeneexpressionofAspergillusoryzaethiArequiressplicingoftheintroncontainingariboswitch—likedomaininthe5'-UTR.FEBSLett.555，516-520(2003)_Loros,J.J.&Dunlap,J.C.Neurosporacrassaclock-controlledgenesareregulatedattheleveloftranscription.Mol.Cell,Biol,11,558-563(1991).McCol1D.Valencia,C.A.&VierulaP.J.CharacterizationandexpressionoftheNeurosporacrassanmt-1gene.Curr.Genet.44216-223(2003).Mandal,M.&BreakerR.R.Generegulationbyriboswitches.NatureRev.Mol.CellBiol.5,451-463(2004).Mat!in,A.J.，Clark，F(xiàn).&Smith，C.W.Understandingalternativesplicingtowardsacellularcode.Nat.Rev.Mol.CellBiol.6，386-398(2005).Maundrell,K.nmtloffissionyeast:ahighlyexpressedgenecompletelyrepressedbythiamine.J.Biol.Chem.265，10857-10864(1989).Mehra，A.，Morgan，L，Bel1-Pedersen，I).，Loros，J.&DunlapJ.C.WatchingtheNeurosporaClockTick.Abstractin:Soc.Res.Biol.Rhythms，AmeliaIsland，F(xiàn)L，SocietyforResearchonBiologicalRhythms27(2002)Mironov，A.S,，etal.SensingsmallmoleculesbynascentRNA:amechanismtocontroltranscriptioninbacteria.Cell111，747-756(2002)·Nahvi,A.，Sudarsan，N.，Ebert，Μ.S.，Zou，X.，Brown，K.L.&Breaker,R.R.GeneticcontrolbyametabolitebindingmRNA,Chem.Biol.9,1043-1049(2002),Orbach，M.J.，Porro，E.B.&Yanofsky，C.Cloningandcharacterizationofthegeneforbeta-tubulinfromabenomyl-resistantmutantofNeurosporacrassaanditsuseasadominantselectablemarker.Mol.Cell.Biol.6,2452-2461(1986)·Romfo,C.M.，Alvarez,C.J.，vanHeeckeren，W.J.，Webb，C.J.&Wise，j.A.EvidenceforsplicesitepairingviaiηtrοηdefinitioninSchizosaccharomvcespombe.Mol.Cell.Biol.20，7955-7970(2000)·Seetharaman,S.，Zivarts,Μ·，Sudarsan,N.&BreakerR.R.ImmobilizedRNAswitchesfortheanalysisofcomplexchemicalandbiologicalmixtures.NatureBiotechnoL19，336-341(2001).Serganov,A.，Polonskaia,Α.，Phan，A.T.，Breaker,R.R.&Patel，D.J.Structuralbasisforgeneregulationbyathiaminepyrophosphate-sensingriboswitch.Nature441，1167-1171(2006).Soukup，G.A.&Breaker，R.R.RelationshipbetweeninternucleoticlelinkagegeometryandthestabilityofRNA.RNA5，1308-1325(1999).SudarsanN..，BarrickJ.E.&BreakerR.R.Metabolite-bindingRNAdomainsarepresentinthegenesofeukaryotes.RNA9,644-647(2003).ThoreS.，LeibundgutM.&Ban，N.Structureoftheeukaryoticthiaminepyrophosphateriboswitchwithitsregulatory1igand.Science312，1208-1211(2006).Vann，D.C,Electroporation—basedtransformationoffreshlyharvestedconidiaofNeurosporacrassa.FungalGenet.Newsl.42A53(1995).Vilela,C.McCarthyJ.E.RegulationoffungalgeneexpressionviashortopenreadingframesinthemRNA5'untranslatedregion.Mol.Microbiol.49，859-867(2003).Welz，R.&BreakerR.R.LigandbindingandgenecontrolcharacteristicsoftanclemriboswitchesinBacillusanthracis.RNA13，(AdvanceOnlineArticle)(2007).WestergaardiM.Mitchell,H.K.NeurosporaV.Asyntheticmediumfavoringsexualreprocluction.Amer.J.Bot.34，573-577(1947).Winkler，W.C.&Breaker，R.R.Regulationofbacterialgeneexpressionbyriboswitches.Annu.Rev.Microbiol.59，487-517(2005)·ffinkler,W,C.,Nahvi，A.&Breaker，R.R.ThiaminederivativesbindmessengerRNAsdirectlytoregulatebacterialgeneexpression.Nature419，952-956(2002)_MandalM.&BreakerR.R.Generegulationbyriboswitches.NatureRev.Mol.CellBioL5，451-463(2004).Puchs,R.T.，Grundy,F.J.MIenkin,Τ.M.TheS(MK)boxisanewSAM^bindingRNAfortranslationalregulationofSAMsynthetase.Nat.Struct.Mol.Biol.13，226-233(2006).Roth,A.etal.AeubacterialriboswitchselectiveforthequeuosineprecursorpreQlcontainsanunusualIysmallaptamerdomain.Nat.Struct.MoLBioL(inpress)(2007).Rodionov，D.Α.，Vitreschak,A.G.，Mirοηον,Α·Α.&Ge1fand，Μ.S.Comparativegenomicsofthiaminebiosynthesisinprokaryotes.J.BioLChera.277，48949-48959(2002).Vitreschak,A.G.，Rodionov,D.A.，Mironov,A.A.&Gelfand,M.S.RegulationofriboflavinbiosynthesisandtransportgenesinbacteriabytranscriptionalandtransIation&ilattenu&ition.NucleicAcidsRes.30，3141-3151(2002).Vitreschak，A.G.，Rodionov，D.A.，Mironov，A.A.&GelfanclM.S.RegulationofthevitaminB12metabolismandtransportinbacteriabyaconservedRNAstructuralelement.RNA9，1084-1097(2003).Nahvi，A.，Barrick，J.E.&Breaker，R.R.CoenzymeB12riboswitchesarewidespreaclgeneticcontrolelementsinprokaryotes.NucleicAcidsRes.32，143-150(2004).Batey,R.T.，Gilbert,S.D.&MontangeR.K.Structureofanaturalguanine—responsiνeriboswitchcomplexedwiththemetabolitehypoxanthine.Nature432，411-415(2004)·Serganov，A.etal.Structuralbasisfordiscriminativeregulationofgeneexpressionbyadenine-andguanine-sensingmRNAs.Chem.Biol.11,1-13(2004).Montange,R.K.&Batey，R.T.StructureoftheS-&idenosy!methionineriboswitchregu1atorymRNAelement.Nature441，1172-1175(2006).ThoreS.，Leibundgut，M.&Ban，N.Structureoftheeukaryoticthiaminepyrophosphateriboswitchwithitsregulatory1igand.Science312，1208-1211(2006),Serganov，A.，Polonskaia，A.，PhanA.T.，Breaker，R.R.&Patel，I).J.Structuralbasisforgeneregulationbyathiaminepyrophosphate-sensingriboswitch.Nature441，1167-1171(2006).Edwards,Τ.E.&Feire—D’Amare,A.R.CrystalstructuresoftheThi-boxriboswitchbouncltothiaminepyrophosphateanalogsrevealadaptiveRNA—smallmoleculerecognition.Structure14，1459-1468(2006).SudarsanN..，BarrickJ.E.&BreakerR.R.Metabolite-bindingRNAdomainsarepresentinthegenesofeukaryotes.RNA9,644-647(2003).權(quán)利要求一種可調(diào)節(jié)的基因表達(dá)構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含一個(gè)編碼如下一種RNA的核酸分子，所述RNA包含可操作地連接于一個(gè)編碼區(qū)的核糖開(kāi)關(guān)，其中所述核糖開(kāi)關(guān)調(diào)節(jié)所述RNA的剪接，其中所述核糖開(kāi)關(guān)和編碼區(qū)是異源的。2.權(quán)利要求1的構(gòu)建體,其中所述核糖開(kāi)關(guān)調(diào)節(jié)可變剪接。3.權(quán)利要求1或2的構(gòu)建體，其中所述核糖開(kāi)關(guān)包含一個(gè)適體結(jié)構(gòu)域和一個(gè)表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域，其中所述適體結(jié)構(gòu)域和所述表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域是異源的。4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的構(gòu)建體，其中所述RNA進(jìn)一步包含一個(gè)內(nèi)含子，其中所述表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域在所述內(nèi)含子中包含一個(gè)可變剪接點(diǎn)。5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的構(gòu)建體,其中所述RNA進(jìn)一步包含一個(gè)內(nèi)含子,其中所述表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域在所述內(nèi)含子的--端包含--個(gè)剪接點(diǎn)。6.權(quán)利要求4或5的構(gòu)建體，其中所述可變剪接點(diǎn)在所述核糖開(kāi)關(guān)被激活時(shí)具有活性。7.權(quán)利要求4或5的構(gòu)建體，其中所述可變剪接點(diǎn)在所述核糖開(kāi)關(guān)未被激活時(shí)具有活性。8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的構(gòu)建體,其中所述核糖開(kāi)關(guān)被一種觸發(fā)分子激活。9.權(quán)利要求8的構(gòu)建體，其中所述觸發(fā)分子為T(mén)PP。10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的構(gòu)建體，其中所述核糖開(kāi)關(guān)是一種TPP應(yīng)答性核糖開(kāi)關(guān)。11.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的構(gòu)建體,其中所述核糖開(kāi)關(guān)激活可變剪接。12.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的構(gòu)建體,其中所述核糖開(kāi)關(guān)抑制可變剪接。13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的構(gòu)建體，其中RNA具有一個(gè)分支結(jié)構(gòu)。14.權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的構(gòu)建體，其中所述RNA是mRNA前體。15.權(quán)利要求3-13任一項(xiàng)的構(gòu)建體,其中所述適體結(jié)構(gòu)域控制剪接的區(qū)域位于P4莖和P5莖。16.權(quán)利要求15的構(gòu)建體，其中所述適體結(jié)構(gòu)域控制剪接的區(qū)域還位于環(huán)5。17.權(quán)利要求15或16的構(gòu)建體，其中所述適體結(jié)構(gòu)域控制剪接的區(qū)域還位于莖P2。18.權(quán)利要求3-17任一項(xiàng)的構(gòu)建體,其中所述剪接位點(diǎn)位于相對(duì)于所述適體結(jié)構(gòu)域5'端的_6至-24之間的位置。19.權(quán)利要求3-17任一項(xiàng)的構(gòu)建體，其中所述剪接位點(diǎn)在序列GUA之后。20.一種用于調(diào)節(jié)RNA剪接的方法，包括將包含一個(gè)核糖開(kāi)關(guān)的構(gòu)建體導(dǎo)入所述RNA，其中所述核糖開(kāi)關(guān)能夠調(diào)節(jié)RNA剪接。21.權(quán)利要求20的方法,其中所述核糖開(kāi)關(guān)包含一個(gè)適體結(jié)構(gòu)域和一個(gè)表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域，其中所述適體結(jié)構(gòu)域和所述表達(dá)平臺(tái)結(jié)構(gòu)域是異源的。22.權(quán)利要求20或21的方法，其中所述核糖開(kāi)關(guān)在RNA的一個(gè)內(nèi)含子中。23.權(quán)利要求20-22任一項(xiàng)的方法，其中所述核糖開(kāi)關(guān)被一種觸發(fā)分子激活。24.權(quán)利要求23的方法,其中所述觸發(fā)分子為T(mén)PP。25.權(quán)利要求20-24任一項(xiàng)的方法，其中所述核糖幵關(guān)是一種TPP-應(yīng)答性核糖開(kāi)關(guān)。26.權(quán)利要求20-25任一項(xiàng)的方法，其中所述核糖開(kāi)關(guān)激活可變剪接。27.權(quán)利要求20-25任一項(xiàng)的方法,其中所述核糖開(kāi)關(guān)抑制可變剪接。28.權(quán)利要求20-27任一項(xiàng)的方法,其中所述剪接不是天然發(fā)生的。29.權(quán)利要求21-28任一項(xiàng)的方法，其中所述適體結(jié)構(gòu)域控制剪接的區(qū)域位于環(huán)5。30.權(quán)利要求21-28任一項(xiàng)的方法,其中所述適體結(jié)構(gòu)域控制剪接的區(qū)域位于莖P2。31.權(quán)利要求21-30任一項(xiàng)的方法，其中所述剪接位點(diǎn)位于相對(duì)于所述適體結(jié)構(gòu)域5‘端的-6至-24之間的位置。32.權(quán)利要求21-30任一項(xiàng)的方法，其中所述剪接位點(diǎn)在所述適體結(jié)構(gòu)域中序列GUA之后。33.一種抑制真菌生長(zhǎng)的方法，所述方法包括(a)識(shí)別感染真菌的受試者；(B)給與所述受試者有效量的抑制TPP-應(yīng)答性核糖開(kāi)關(guān)的化合物,從而抑制真菌生長(zhǎng)。34.權(quán)利要求33的方法，其中抑制真菌生長(zhǎng)包括真菌生物量減少10%或更多。全文摘要公開(kāi)了與控制可變剪接的核糖開(kāi)關(guān)有關(guān)的方法和組合物。文檔編號(hào)C12N15/11GK101801185SQ200880016909公開(kāi)日2010年8月11日申請(qǐng)日期2008年3月22日優(yōu)先權(quán)日2007年3月22日發(fā)明者A·瓦赫特,M·T·謝,N·蘇達(dá)珊,R·R·布雷克申請(qǐng)人:耶魯大學(xué)