專利名稱：：真菌過氧合酶和應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有過氧合酶活性的多肽和包含這類多肽的組合物，它們的編碼多核苷酸、表達(dá)載體和包含這樣的多核苷酸或載體的重組宿主細(xì)胞，產(chǎn)生所述多肽的方法，以及它們的應(yīng)用方法和用途，包括用于將通式(I)的N-雜環(huán)類化合物(N-heterocycles)酶促、區(qū)域選擇性地氧合成相應(yīng)的式(II)的N-氧化物的方法，其通過在一步反應(yīng)過程中在至少一種氧化劑存在下用過氧化物酶多肽轉(zhuǎn)化式(I)的N-雜環(huán)類化合物來進(jìn)行。
背景技術(shù)：
：發(fā)現(xiàn)來自傘菌擔(dān)子菌綱菌株柱狀田頭菇(菌株TM-A1)的表示為AaP的鹵過氧化物酶過氧合酶氧化芳基醇和醛。通過數(shù)步離子層析和SDS-PAGE從柱狀田頭菇TMAl純化了AaP過氧合酶，測定了分子量并在2維電泳之后測定了N-末端的14個(gè)氨基酸序列，但是沒有分離編碼基因(Ullrich等，2004，Appl.Env.Microbiol.70(8):4575_4581)。WO2006/034702Al公開了使用柱狀田頭菇TMAl的AaP過氧合酶，使非活化的烴(例如，萘、甲苯和環(huán)己烷)酶促羥基化的方法。這在Ullrich和Hofrichter，2005，F(xiàn)EBSLetters579:6247_6250中也有記載。DE10332065A1公開了通過使用柱狀田頭菇TMAl的AaP過氧合酶，經(jīng)由醛的中間形成而從醇酶促制備酸的方法。報(bào)導(dǎo)了一種用于快速和選擇性地以分光光度法直接檢測通過AaP過氧合酶進(jìn)行的芳族羥基化的方法(Kluge等，2007，ApplMicrobiolBiotechnol75:1473-1478)。從嗜糞真菌輻毛鬼傘(Coprinusradians)分離了另一種能夠進(jìn)行芳族過氧合作用(peroxygenation)的過氧合酶并進(jìn)行了表征，鑒定了N-末端的16個(gè)氨基酸，并與之前公布的柱狀田頭菇菌株AaP酶N-末端的14個(gè)氨基酸比對；但是沒有分離編碼基因(Anh等，2007，ApplEnvMicrobiol73(17):5477_5485)。眾所周知，向有機(jī)分子中直接區(qū)域選擇性引入氧官能(氧合作用)成為化學(xué)合成中的難題。尤其是難以催化吡啶型芳族雜環(huán)的選擇性N-氧合。所述產(chǎn)物，即雜環(huán)N-氧化物，是廣泛多樣的不同合成中的重要中間體，并且通常是生物學(xué)活性的。此外，它們作為保護(hù)基團(tuán)、氧化劑、金屬絡(luò)合物中的配體和特異性催化劑發(fā)揮功能。吡啶、吡啶衍生物和其它N-雜環(huán)類化合物的化學(xué)氧合相對復(fù)雜，其需要侵略性/毒性的化學(xué)劑/催化劑并且導(dǎo)致一系列不想要的副產(chǎn)物(例如，2-、3_和/或4-羥基吡啶衍生物)并且異構(gòu)體產(chǎn)率低。根據(jù)文獻(xiàn)，吡啶N-氧化物能夠使用以下起始化合物等從吡啶化學(xué)合成-過氧化氫(30%)，乙酸和吡啶(80°C，在吡啶/水中)_二氧化硅上的磷鎢酸和吡啶(80°C，在吡啶中)-鎢酸鹽，過氧化氫(30%)和吡啶(80°C，在吡啶中)-有機(jī)三氧化氫類物質(zhì)(organichydrotrioxides)和吡啶(-80至_60°C，在吡啶中)-過氧化氫，四(2，6-氯苯基)嚇啉錳(manganesetetrakis(2,6-chlorophenyl)porphyrin)(25°C，在二氯乙烷中)-二甲基環(huán)氧乙烷(dimethyloxirane)和吡啶(0°C，在二氯乙烷中)-全氟(順-2，3-二燒基啞嗪)(perfluoro(cis-2，3-dialkyloxaziridine))和吡啶(25°C，在吡啶中)。在雜環(huán)氮原子上的氧合反應(yīng)通?；谠陔娮庸w和分子氧(O2)或過氧化物/三氧化物(R-00H，R-000H)存在下、通過催化劑進(jìn)行的、直接攻擊氮的活性氧形態(tài)(reactiveoxygenspecies)的生成。這些高活性的氧形態(tài)僅有有限的區(qū)域選擇性。出于這個(gè)原因，化學(xué)性N-氧合的產(chǎn)率較低，并且它們導(dǎo)致產(chǎn)生不想要的副產(chǎn)物，還要求復(fù)雜的操作。已知一種胞內(nèi)酶，甲烷單加氧酶(MM0，EC14.13.25)，在非特異性副反應(yīng)中將吡啶轉(zhuǎn)化為吡啶N-氧化物。MMO酶由幾個(gè)蛋白質(zhì)組分組成并由甲基營養(yǎng)菌形成(例如，莢膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatus))；其需要復(fù)雜的電子供體如NADH或NADPH、輔助蛋白(黃素還原酶、調(diào)節(jié)蛋白)和分子氧(O2)。MMO的天然底物是甲烷，其被氧化成甲醇。作為特別不具特異性的生物催化劑，MMO像氧合/羥基化甲烷一樣，氧合/羥基化一系列其它底物如η-鏈烷烴和它們的衍生物、環(huán)烷烴、芳族化合物、一氧化碳和雜環(huán)類化合物。然而，特別是后者和吡啶僅以非常低的比例轉(zhuǎn)化，對于吡啶的比活性是0.029單位/mg蛋白質(zhì)(Colby等1977:Thesolublemethanemono-oxygenaseofMethylococcuscapsulatus.Biochem.J.165=395-402)。在生物技術(shù)中利用該酶目前還不可能，因?yàn)槠潆y以分離，像大多數(shù)胞內(nèi)酶一樣，其穩(wěn)定性低，并且需要的協(xié)同底物(cosubstrate)相對昂貴。吡啶降解細(xì)菌如紅球菌屬菌種(Rhodococcusspp.)或節(jié)桿菌屬菌種(Arthrobacterspp.)不具有任何生成吡啶N-氧化物的酶，而是利用在碳的位置羥基化吡啶環(huán)(罕見)或使環(huán)的特定鍵還原(常見)的酶，并由此起始降解(Fetzner，S.，1998:Bacterialdegradationof口比F,indole,quinoline,andtheirderivativesunderdifferentredoxconditions.App1.Microbiol.Biotechnol.49:237_250)。發(fā)明概述在第一方面，本發(fā)明涉及選自下組的具有過氧合酶活性的分離的多肽，其優(yōu)選是重組產(chǎn)生的(a)包含與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO10,SEQIDNO12,SEQIDN0:14或SEQIDNO:19的多肽具有至少60%同一性、優(yōu)選至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或98%同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在至少低、中、中-高或高嚴(yán)緊性條件下與下述雜交的多核苷酸編碼的多月太(i)SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列；(ii)SEQIDNOUSEQIDN0:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO=IUSEQIDN0:13、SEQIDN0:15或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列中所含cDNA序列或包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列；或(iii)(i)或()的全長互補(bǔ)鏈；(c)由包含與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列具有至少60%同一性、優(yōu)選至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或98%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼的多肽；(d)包含以下基序中的一種或多種的多肽，優(yōu)選包含以下基序中的兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或六種的多肽基序I:[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N(SEQIDNO40)基序II:G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH][LF]R(SEQIDNO41)基序III:RXXRI[QE][DEQ]S[IM]ATN(SEQIDNO42)基序IV:S[IM]ATN[PG][EQN][FM][SDN][FL](SEQIDNO43)基序V:P[PDK][DG]F[HFW]R[AP](SEQIDNO:44)基序VI:[TI]XXXLYPNP[TK][GV](SEQIDNO45)；禾口(e)包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDN0:6、SEQIDNO:8、SEQIDN0:10、SEQIDN0:12、SEQIDN0:14或SEQIDNO:19的成熟多肽的變體。在第二方面，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，其包含編碼第一方面的多肽的核苷酸序列。本發(fā)明的第三方面涉及核酸構(gòu)建體，其包含與一個(gè)或數(shù)個(gè)指導(dǎo)多肽在表達(dá)宿主中生成的調(diào)控序列可操作地連接的第二方面的多核苷酸。在第四方面，本發(fā)明涉及重組表達(dá)載體，其包含第三方面的核酸構(gòu)建體。本發(fā)明的第五方面涉及重組宿主細(xì)胞，其包含第三方面的核酸構(gòu)建體或第四方面的表達(dá)載體。本發(fā)明的第六方面涉及產(chǎn)生第一方面的多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明的第七方面涉及產(chǎn)生第一方面的多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含含有編碼所述多肽的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明的第八方面涉及產(chǎn)生親本細(xì)胞的突變體的方法，包括破壞或缺失編碼第一方面的多肽的核苷酸序列，其導(dǎo)致所述突變體產(chǎn)生的多肽少于親本細(xì)胞。本發(fā)明的第九方面涉及由第八方面的方法產(chǎn)生的突變細(xì)胞。在第十方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，包括(a)在有益于所述蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)第九方面的突變細(xì)胞；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。本發(fā)明的第十一方面涉及產(chǎn)生多核苷酸的方法，所述多核苷酸包含編碼具有過氧合酶活性的多肽的突變核苷酸序列，所述方法包括(a)向SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO=IUSEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列中引入至少一個(gè)突變，其中所述突變核苷酸序列編碼包含SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDN0:14或SEQIDNO:19的成熟多肽或由之組成的多肽；和(b)回收所述包含突變核苷酸序列的多核苷酸。本發(fā)明的第十二方面涉及由第十一方面的方法產(chǎn)生的突變多核苷酸。在第十三方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生多肽的方法，包括(a)在有益于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼所述多肽的第十二方面的突變多核苷酸；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明的第十四方面涉及產(chǎn)生第一方面的多肽的方法，包括(a)在有益于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞包含編碼所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明的第十五方面涉及核酸構(gòu)建體，其包含與編碼信號肽的第一核苷酸序列和/或編碼前肽的第二核苷酸序列可操作連接的編碼蛋白質(zhì)的基因，所述信號肽包含SEQIDNO2的氨基酸-43至-1或由之組成，所述前肽包含SEQIDNO2的氨基酸1至330或由之組成，其中所述基因?qū)τ谒龅谝缓偷诙塑账嵝蛄惺峭庠吹?。在第十六方面，本發(fā)明涉及重組表達(dá)載體，其包含前述方面的核酸構(gòu)建體。第十七方面涉及重組宿主細(xì)胞，其包含前述方面的核酸構(gòu)建體。第十八方面涉及產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，包括(a)在有益于所述蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)前述方面的重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。本發(fā)明的目的是實(shí)施一種用于從相應(yīng)的前體制備吡啶N-氧化物和其它N-雜環(huán)類化合物的方法，該方法具有非常低的工藝技術(shù)水平和設(shè)備復(fù)雜度水平，且同時(shí)使用廉價(jià)的協(xié)同底物。起始化合物的轉(zhuǎn)化應(yīng)該在非常短的溫育時(shí)間中，在室溫和常壓，于水介質(zhì)中，并且對于無菌或半無菌(semisterile)反應(yīng)條件沒有增加要求的條件下實(shí)現(xiàn)。所述反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)該以最低復(fù)雜度水平分離，并且對不同結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的復(fù)雜分離應(yīng)該被放棄(dispensedwith)ο本發(fā)明的第二十方面涉及將圖1中式(I)的N-雜環(huán)類化合物酶促、區(qū)域選擇性地氧合成相應(yīng)的圖1中式(II)的N-氧化物的方法，其通過在一步反應(yīng)過程中在至少一種氧化劑存在下使用第一方面中限定的過氧合酶多肽轉(zhuǎn)化圖1中式(I)的N-雜環(huán)類化合物來進(jìn)行。在另一方面，本發(fā)明涉及將式(I)的芳族N-雜環(huán)類化合物酶促、區(qū)域選擇性地氧合成相應(yīng)的式(II)的N-氧化物的方法，其通過在一步反應(yīng)過程中在至少一種氧化劑存在下使用真菌芳族鹵過氧化物酶過氧合酶轉(zhuǎn)化式(I)的N-雜環(huán)類化合物來進(jìn)行。本發(fā)明最后的方面涉及幾種類型的組合物，其包含第一方面中限定的多肽，例如，洗滌劑組合物、洗碗洗滌劑組合物、用于紙漿和紙?zhí)幚淼慕M合物、用于水處理的組合物和用于油處理的組合物。附1由過氧合酶催化的N-雜環(huán)類化合物轉(zhuǎn)化的通式示意圖。圖2依據(jù)實(shí)施例1的分子式示意圖。圖3通過AaP進(jìn)行的吡啶轉(zhuǎn)化的HPLC洗脫譜(256nm)，以及唯一產(chǎn)物吡啶N-氧化物的質(zhì)譜。圖4圖4A-4D顯示對分別示于SEQIDNO，s:2、4、6、8、10、12、14和19中的8個(gè)過氧合酶氨基酸序列的多重比對，以及共有序列指示和真菌過氧合酶特有的六個(gè)保守基序。定義過氧合酶活性術(shù)語“過氧合酶活性”(AaP:E.C.1.11.1.-)在本文定義為氧化廣泛多樣的化合物的能力，所述化合物包括酚、ABTS[2，2’-連氮基二(3-乙基苯并噻唑啉_6_磺酸)](2，2，-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonicacid)])、芳基醇、式I的N-雜環(huán)類化合物(參見圖1)和醛及無機(jī)溴化物。就本發(fā)明而言，過氧合酶活性是根據(jù)由Kluge等(2007，ApplMicrobiolBiotechnol751473-1478)描述的分光光度法測定的。本發(fā)明的多肽具有至少20%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，和甚至最優(yōu)選至少100%的SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14或19的成熟多肽的過氧合酶活性。分離的多肽術(shù)語“分離的多肽”用于本文中是指從來源分離的多肽。在優(yōu)選的方面中，如通過SDS-PAGE測定的，所述多肽為至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，且最優(yōu)選至少90%純?；旧霞兊亩嚯男g(shù)語“基本上純的多肽”在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物按重量計(jì)含有至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的(associated)的其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計(jì)至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%純，最優(yōu)選至少99.5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式，即，所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多肽材料。這能夠通過以下方法實(shí)現(xiàn)，例如，通過公知的重組方法或由經(jīng)典純化方法制備多肽。成熟多肽術(shù)語“成熟多肽”在本文定義為具有過氧合酶活性的多肽，所述多肽以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在，所述翻譯后修飾例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在優(yōu)選的方面中，所述成熟多肽基于N-末端肽測序數(shù)據(jù)(Ullrich等，2004，Appl.Env.Microbiol.70(8):4575_4581)具有SEQIDNO:2的位置1-330中所示的氨基酸序列，所述數(shù)據(jù)闡明了AaP過氧合酶酶的成熟蛋白的起點(diǎn)。成熟多肽編碼序列術(shù)語“成熟多肽編碼序列”在本文定義為編碼具有過氧合酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在優(yōu)選的方面中，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDN0:1的核苷酸152-1141。同一性參數(shù)“同一性”描述兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度使用EMBOSS軟件包(EMBOSSTheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,TrendsinGenetics16:276_277)的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48443-453)來測定，優(yōu)選版本3.0.0或更新的版本。使用的可選參數(shù)是缺口產(chǎn)生罰分(gapopenpenalty)10，缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)0.5和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記的“最長同一性”的輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為百分比同一性并且如下計(jì)算(同一的殘基X100)/(比對的長度-比對中的缺口總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度使用EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite，Rice等，2000，見上文)的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，見上文)來測定，優(yōu)選版本3.0.0或更新的版本。使用的可選參數(shù)是缺口產(chǎn)生罰分10，缺口延伸罰分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記的“最長同一性”的輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為百分比同一性并且如下計(jì)算(同一的脫氧核糖核酸X100)/(比對的長度-比對中的缺口總數(shù))同源序列術(shù)語“同源序列”在本文定義為在tfasty檢索(Pearson，W.R.，1999，inBioinformaticsMethodsandProtocols,S.Misener禾口S.A.Krawetz編，第185-219頁)中與SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14或19中所示多肽給出小于0.001的E值(或期望值)的預(yù)測的蛋白質(zhì)。多肽片段術(shù)語“多肽片段”在本文中定義為從SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14或19的成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個(gè)或多個(gè)(數(shù)個(gè))氨基酸的多肽，或其同源序列；其中所述片段具有過氧合酶活性。亞序列術(shù)語“亞序列(subsequence)”在本文中定義為從SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15或17的成熟多肽編碼序列的5’和/或3’端缺失一個(gè)或多個(gè)(數(shù)個(gè))核苷酸的核苷酸序列，或其同源序列，其中所述亞序列編碼具有過氧合酶活性的多肽片段。等位變體術(shù)語“等位變體(allelicvariant)”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸術(shù)語“分離的多核苷酸”用于本文中是指從來源分離的多核苷酸。在優(yōu)選的方面中，如通過瓊脂糖電泳測定的，所述多核苷酸為至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純?；旧霞兊亩嗪塑账嵝g(shù)語“基本上純的多核苷酸”用于本文指不含其它外來的或不期望的核苷酸的多核苷酸制備物，并且所述多核苷酸制備物處于適合于在遺傳工程的蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸按重量計(jì)含有至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，如啟動子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計(jì)至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99%，并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純的。所述多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式，即，所述多核苷酸制備物基本上不含與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。編碼序列當(dāng)用于本文時(shí)術(shù)語“編碼序列”是指直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可替換的起始密碼子例如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的核苷酸序列。cDNA:術(shù)語“cDNA”在本文中定義為能夠通過逆轉(zhuǎn)錄從得自真核細(xì)胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內(nèi)含子序列。因而源自mRNA的cDNA沒有任何內(nèi)含子序列。核酸構(gòu)建體術(shù)語“核酸構(gòu)建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或?qū)⑺龊怂岱肿右员緛聿淮嬖谟?nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的片段，或所述核酸分子是合成的。當(dāng)所述核酸構(gòu)建體含有表達(dá)本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時(shí)，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達(dá)盒”同義。調(diào)控序列術(shù)語“調(diào)控序列(controlsequence)”在本文定義為包括編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的表達(dá)所需的所有成分。各調(diào)控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子，以及轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點(diǎn)的接頭一起提供，所述特異性限制位點(diǎn)促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接?？刹僮鞯剡B接術(shù)語“可操作地連接”在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的適當(dāng)位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)多肽編碼序列的表達(dá)。表達(dá)術(shù)語“表達(dá)”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達(dá)載體術(shù)語“表達(dá)載體”在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達(dá)的額外核苷酸可操作地連接。宿主細(xì)胞如本文中所使用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括任何細(xì)胞類型，所述細(xì)胞類型對于用包含多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的(susceptible)。修飾術(shù)語“修飾”在本文的意思是，對由SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14或19的成熟多肽或其同源序列組成的多肽的任何化學(xué)修飾；以及對編碼這種多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個(gè)或多個(gè)(數(shù)個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個(gè)或多個(gè)(數(shù)個(gè))氨基酸側(cè)鏈的置換。人工變體當(dāng)用在本文時(shí)，術(shù)語“人工變體”是指具有過氧合酶活性的多肽，所述多肽由表達(dá)SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15或17之一的成熟多肽編碼序列的修飾的核苷酸序列或其同源序列的生物體產(chǎn)生。所述修飾的核苷酸序列經(jīng)人為干預(yù)(humanintervention)，通過修飾公開于SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15或17的多核苷酸序列或其同源序列來獲得。詳述多個(gè)真菌過氧合酶基因組DNA和cDNA以及編碼的氨基酸序列示于本申請的序列表中。-SEQIDNO:1顯示編碼來自柱狀田頭菇的AaPl酶的cDNA多核苷酸序列，其氨基酸序列示于SEQIDNO:2中。-SEQIDNO:3顯示編碼來自柱狀田頭菇的AaP2酶的cDNA多核苷酸序列，其氨基酸序列示于SEQIDNO:4中。.SEQIDNO5顯示編碼來自雙色蠟?zāi)?Laccariabicolor)的過氧合酶酶的基因組DNA多核苷酸序列，其氨基酸序列示于SEQIDNO:6中。SEQIDNO:7顯示編碼來自岡山灰擬鬼傘(Coprinopsiscinereaokayama)菌株7#130的過氧合酶1酶的cDNA多核苷酸序列(CC1G_08427)，其氨基酸序列示于SEQIDNO8中(推定的蛋白質(zhì)UNII3ROT:A8NAQ8)。-SEQIDNO9顯示編碼來自岡山灰擬鬼傘菌株7#130的過氧合酶2酶的cDNA多核苷酸序列(CC1G_10475)，其氨基酸序列示于SEQIDN0:10中(推定的蛋白質(zhì)UNIPR0TA8NL34)。-SEQIDNO:11顯示編碼來自岡山灰擬鬼傘菌株7#130的過氧合酶3酶的cDNA多核苷酸序列(CC1G_08981)，其氨基酸序列示于SEQIDNO12中(推定的蛋白質(zhì)UNIPR0TA8P4U7)。-SEQIDN0:13顯示編碼來自岡山灰擬鬼傘菌株7#130的過氧合酶4酶的cDNA多核苷酸序列(CC1G_08975)，其氨基酸序列示于SEQIDNO14中(推定的蛋白質(zhì)UNIPR0TA8P4T7)。·SEQIDNO15顯示編碼來自輻毛鬼傘DSM888(公眾可從德國DSMZ獲得)的過氧合酶酶的5’-端部分cDNA多核苷酸序列編碼部分，其部分氨基酸序列示于SEQIDNO16中。-SEQIDN0:17顯示編碼來自輻毛鬼傘DSM888的過氧合酶酶的3，-端部分cDNA多核苷酸序列編碼部分，其部分氨基酸序列示于SEQIDN0:18中。·SEQIDNO19顯示SEQIDNO，s16禾口18中來自輻毛鬼傘DSM888的過氧合酶酶的部分序列的合并氨基酸序列。在第一方面，本發(fā)明涉及選自下組的具有過氧合酶活性的分離的多肽，其優(yōu)選是重組產(chǎn)生的(a)包含與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO10,SEQIDNO12,SEQIDN0:14或SEQIDNO:19的多肽具有至少60%同一性、優(yōu)選至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或98%同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在至少低、中、中-高或高嚴(yán)緊性條件下與下述雜交的多核苷酸編碼的多月太(i)SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列；(ii)SEQIDNOUSEQIDN0:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO=IUSEQIDN0:13、SEQIDN0:15或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列中所含cDNA序列或包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列；或(iii)(i)或()的全長互補(bǔ)鏈；(c)由包含與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列具有至少60%同一性、優(yōu)選至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或98%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼的多肽；(d)包含以下基序中的一種或多種的多肽，優(yōu)選包含以下基序中的兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或六種的多肽基序I[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N(SEQIDNO40)基序II:G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH][LF]R(SEQIDNO41)基序III:RXXRI[QE][DEQ]S[IM]ATN(SEQIDNO42)基序IV:S[IM]ATN[PG][EQN][FM][SDN][FL](SEQIDNO43)基序V:P[PDK][DG]F[HFW]R[AP](SEQIDNO:44)基序VI:[TI]XXXLYPNP[TK][GV](SEQIDNO45)；和(e)包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDN0:6、SEQIDNO:8、SEQIDN0:10、SEQIDN0:12、SEQIDN0:14或SEQIDNO:19的成熟多肽的變體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一方面的多肽包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14或SEQIDNO:19的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成；或其具有過氧合酶活性的片段；優(yōu)選所述多肽包含SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14或SEQIDNO19的成熟多肽或由所述成熟多肽組成。優(yōu)選的實(shí)施方案涉及第一方面的多肽，其由在至少中嚴(yán)緊性條件下，優(yōu)選在至少中-高嚴(yán)緊性條件下，更優(yōu)選在至少高嚴(yán)緊性條件下，與以下序列雜交的多核苷酸編碼(i)SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDN0:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO13,SEQIDN0:15、orSEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列；(ii)SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列中所含cDNA序列或包含SEQIDNOUSEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDNO7,SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列；或(iii)(i)或()的全長互補(bǔ)鏈。另一優(yōu)選的實(shí)施方案涉及第一方面的多肽，其由包含與SEQIDNO=USEQIDN0:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO15或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列具有至少60%同一性，優(yōu)選至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或98%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼。還優(yōu)選第一方面的多肽由包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO:17的核苷酸序列或由所述核苷酸序列組成的多核苷酸編碼；或由所述多核苷酸的編碼具有過氧合酶活性的片段的亞序列編碼；優(yōu)選所述多肽由包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO5,SEQIDN0:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO=IUSEQIDNO:13、SEQIDN0:15或SEQIDNO:17的的成熟多肽編碼序列或由所述的成熟多肽編碼序列組成的多核苷酸編碼。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第一方面的多肽包含以下基序中的一種或多種，優(yōu)選包含以下基序中的兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或六種基序I[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N(SEQIDNO40)基序II:G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH][LF]R(SEQIDNO41)基序III:RXXRI[QE][DEQ]S[IM]ATN(SEQIDNO42)基序IV:S[IM]ATN[PG][EQN][FM][SDN][FL](SEQIDNO43)基序V:P[PDK][DG]F[HFW]R[AP](SEQIDNO:44)基序VI:[TI]XXXLYPNP[TK][GV](SEQIDNO45)優(yōu)選所述第一方面的多肽是包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO10,SEQIDNO:12、SEQIDNO:14或SEQIDNO19的成熟多肽的變體。優(yōu)選地，氨基酸改變對性質(zhì)是較不重要的(ofaminornature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為1至大約30個(gè)氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個(gè)殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進(jìn)純化的小延伸，如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合域(bindingdomain)。保守取代的實(shí)例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979，于TheProteins,AcademicPress,NewYork描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr>Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe>Ala/Pro>Lys/Arg>Asp/Asn>Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。除了20個(gè)基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2_氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)目的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基。“非天然氨基酸”在蛋白質(zhì)合成后已經(jīng)過修飾，并且/或者在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學(xué)方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上能夠獲得的，并且包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑烷酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸?？晒┻x擇的是，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)，使得多肽的物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變。例如，氨基酸改變可改進(jìn)多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適PH等。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(Curmiηgham和Wells,1989,Science244:1081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，向分子中的每個(gè)殘基引入單一丙氨酸突變，并且測試所得突變分子的生物活性(即，過氧合酶活性)以鑒定對于所述分子的活性而言關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699_4708。酶的活性部位或其它的生物學(xué)相互作用也可以通過對結(jié)構(gòu)的物理分析來測定，如通過以下這些技術(shù)如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記，結(jié)合對推定接觸位點(diǎn)氨基酸的突變來加以測定。參見例如deVos等，1992，Science255306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224:899_904；Wlodaver等，1992，F(xiàn)EBSLett.30959-64。也可以從分析同與本發(fā)明多肽相關(guān)的多肽的同一性來推斷必需氨基酸的身份?？梢允褂靡阎恼T變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后進(jìn)行有關(guān)的篩選方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science241:53_57；Bowie和Sauer，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA862152-2156；WO95/17413;或WO95/22625公開的那些方法來實(shí)現(xiàn)和測試單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.3010832-10837；美國專利第5，223，409號；WO92/06204)和區(qū)域定向誘變(Derbyshire等，1986，Gene46145；Ner等，1988，DNA7127)。誘變/改組方法可以與高通量、自動化篩選方法組合以檢測宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、經(jīng)誘變多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnology17:893-896)。使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法能夠從宿主細(xì)胞回收編碼活性多肽的經(jīng)誘變DNA分子并且快速測序。這些方法允許迅速測定感興趣的多肽中單獨(dú)氨基酸殘基的重要性，并且能夠應(yīng)用于結(jié)構(gòu)未知的多肽。SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO14或SEQIDNO19的成熟多肽中氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10，優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選至多6，更優(yōu)選至多5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選1。優(yōu)選所述第一方面的多肽由如下質(zhì)粒中所含多核苷酸編碼，所述質(zhì)粒包含在根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款在2008年3月14日以登錄號DSM21289保藏在DSMZ的大腸桿菌NN049991中；或所述多肽由如下質(zhì)粒中所含多核苷酸編碼，所述質(zhì)粒包含在根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款在2008年3月14日以登錄號DSM21290保藏在DSMZ的大腸桿菌NN049992中。另一優(yōu)選的實(shí)施方案涉及本發(fā)明的第一方面的多肽，其中所述成熟多肽是SEQIDNO:2的1-330。在本發(fā)明的第一方面中還優(yōu)選所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸152-1141。雜交SEQIDNO:1、SEQIDNO3；SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO17的核苷酸序列；或其亞序列；以及SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDN0:14或SEQIDN0:19的氨基酸序列；或其片段；可以用于設(shè)計(jì)核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬和種的菌株鑒定和克隆編碼具有過氧合酶活性的多肽的DNA。具體而言，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑒定和分離其中相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長度應(yīng)為至少14，優(yōu)選至少25，更優(yōu)選至少35，并且最優(yōu)選至少70個(gè)核苷酸。然而，優(yōu)選所述核酸探針的長度為至少100個(gè)核苷酸。例如，所述核酸探針的長度可以是至少200個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少300個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少400個(gè)核苷酸，或最優(yōu)選至少500個(gè)核苷酸。甚至可以使用更長的探針，例如，長度為優(yōu)選至少600個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少700個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選至少800個(gè)核苷酸，或最優(yōu)選至少900個(gè)核苷酸的核酸探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標(biāo)記以探測相應(yīng)的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標(biāo)記)。這些探針包含于本發(fā)明中。因而，可從由這些其它菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有過氧合酶活性的多肽。可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過其它分離技術(shù)分離來自這些其它菌株的基因組或其它DNA?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDNO:1或其亞序列同源的克隆或DNA，優(yōu)選將所述載體材料用在Sounthern印跡中。就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴(yán)緊性條件下與標(biāo)記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應(yīng)于SEQIDNO:USEQIDNO3；SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDN0:9、SEQIDN0:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列；SEQIDNO:1、SEQIDNO3；SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDN0:11、SEQIDN0:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列中所含cDNA序列或包含SEQIDN0:1、SEQIDNO3；SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列；其全長互補(bǔ)鏈；或它們的亞序列。在這些條件下核酸探針與之雜交的分子可以使用例如X射線片來檢測。對于長度為至少100個(gè)核苷酸的長探針，將非常低至非常高嚴(yán)緊性條件定義為，在42°C在5XSSPE、0.3%SDS、200yg/ml已剪切和變性的鮭精DNA，和對于非常低和低嚴(yán)緊性25%甲酰胺，對于中和中-高嚴(yán)緊性35%甲酰胺，或?qū)τ诟吆头浅８邍?yán)緊性50%甲酰胺中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法進(jìn)行預(yù)雜交和雜交，最佳進(jìn)行12-24小時(shí)。對于長度為至少100個(gè)核苷酸的長探針，將載體材料最終用2XSSC，0.2%SDS，優(yōu)選在45°C(非常低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選在50°C(低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在55°C(中嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選在60°C(中-高嚴(yán)緊性)，甚至更優(yōu)選在65°C(高嚴(yán)緊性)，并且最優(yōu)選在70°C(非常高嚴(yán)緊性)洗滌三次，每次15分鐘。對于長度為大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，將嚴(yán)緊性條件定義為在比用Bolton禾口McCarthy的計(jì)算法(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA48:1390)計(jì)算得出的Tm低5°C至10°C，在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA，0.5%NP-40，IX登哈特溶液(Denhardt'ssolution)，ImM焦磷酸鈉(sodiumpyrophosphate)，ImMIf舞酸二M幸內(nèi)(sodiummonobasicphosphate),0.ImMATP禾口每ml0.2mg的酵母RNA中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌(washingpost-hybridization)，最佳進(jìn)行12-24小時(shí)。對于長度為大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，將載體材料在6XSSC加0.SDS中洗滌一次15分鐘，并用6XSSC在低于計(jì)算的Tm5°C至10°C洗滌兩次，每次15分鐘。多肽的來源本發(fā)明的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定來源相關(guān)的術(shù)語“獲得自”的意思應(yīng)為所述由核苷酸序列編碼的多肽是由該來源產(chǎn)生的，或是由已經(jīng)插入了來自該來源的核苷酸序列的菌株產(chǎn)生的。在優(yōu)選的方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。本發(fā)明的具有過氧合酶活性的多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽性細(xì)菌多肽例如具有過氧合酶活性的芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、土芽孢桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)多肽；或革蘭氏陰性細(xì)菌多肽例如具有過氧合酶活性的大腸桿菌、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或尿枝原體屬(Ureaplasma)多肽。在優(yōu)選的方面，所述多肽是具有過氧合酶活性的嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、角軍淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculms)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)多肽。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽是具有過氧合酶活性的似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、酉良月農(nóng)鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸癌亞禾中(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)多月太。在另一的優(yōu)選方面，所述多肽是具有過氧合酶活性的不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)多月太。本發(fā)明的具有過氧合酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選酵母多肽例如具有過氧合酶活性的念珠菌屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢^(qū)##M(Pichia)>##M(Saccharomyces)>HM##M(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)多肽；或更優(yōu)選絲狀真菌多肽例如具有過氧合酶活性的枝頂孢霉屬(Acremonium)、蘑菇屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、失豆■#M(Aureobasidium)、罾胃帛月空胃M(Botryospaeria)、^菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、麥角屬(Clavic^ps)、旋孢腔菌屬(Cochliobolus)、擬鬼傘屬(Coprinopsis)、白蟻屬(Coptotermes)、Corynascus>Cryphonectria>疼急球菌屬(Cryptococcus)、色三f包屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、Filibasidium、鍵抱屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質(zhì)霄屬(Humicola)、奉巴菌屬(Irpex)、Lentinula、Leptospaeria、包胃屬(Magnaporthe)>Melanocarpus、Meripilus>^MM(Mucor)、胃絲霄屬(Myceliophthora)、新考瑪月旨霄屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)>擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、Phanerochaete、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia>H|ifM(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha>f艮毛霉屬(Rhizomucor)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、長毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、小包腳菇屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽。在優(yōu)選的方面，所述多肽是具有過氧合酶活性的卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多月太。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽是具有過氧合酶活性的解纖維素枝頂孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、曰本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、漂曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、嗜角質(zhì)金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、租金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、桿抱狀德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、庫威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(Fusariumculmorum)、禾本禾斗德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝鐮孢(Fusariumreticulatum)、粉紅鐮孢(Fusariumroseum)、接骨木鐮孢(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圓德抱(Fusariumtorulosum)、擬絲孢鐮孢(Fusariumtrichothecioides)、鑲片鐮孢(Fusariumvenenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicolalanuginosa)、米赫毛霉(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脈？包菌(Neurosporacrassa)、繩狀青霉(PeniciIliumfuniculosum)、產(chǎn)紫青霉(Penici11iumpurpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、Thielaviaachromatica、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、Thielaviaaustraleinsis、Thielaviafimeti、微抱梭抱殼(Thielaviamicrospora)、Thielaviaovispora^Thielaviaperuviana^罾fe冑(Thielaviaspededonium)、^i冑(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila、zht—胃(Thielaviaterrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)、綠色木霉(Trichodermaviride)多月太。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽來自擔(dān)子菌綱(Basidiomycete)的糞傘科(Bolbitiaceae)(例如田頭菇屬菌種(Agrocybespp.))或鬼傘科(Coprinaceae)(例如鬼傘屬菌種(Coprinusspp.))科。可理解的是對于前述的種，本發(fā)明包含完全和不完全兩種階段(bothperfectmdimperfectstates)，和其它分類學(xué)的等同物(equivalent)，例如無性型(mamorph)，無論它們已知的種名。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將輕易地識別適合的等同物的同一性。這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對于公眾能夠輕易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物禾口細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammiungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得這些多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。隨后可通過相似地篩選這種微生物的基因組或cDNA文庫來獲得所述多核苷酸。一旦用所述探針檢測到編碼多肽的多核苷酸序列，就能夠使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)將所述多核苷酸分離或克隆(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另一多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼另一多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)來產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們符合閱讀框，并且使融合多肽的表達(dá)在相同啟動子和終止子的控制下。融合多肽可進(jìn)一步包含切割位點(diǎn)。在融合蛋白分泌時(shí)，所述位點(diǎn)被切割，具有過氧合酶活性的多肽從融合多肽釋放。切割位點(diǎn)的實(shí)例包括但不限于編碼二肽Lys-Arg白勺Kex2itL^(Martin^,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3568-76；Svetina，2000，J.Biotechnol.76245-251；Rasmussen-ffilson等，1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488_3493；Ward等，1995，Biotechnology13:498_503；禾口Contreras等，1991，Biotechnology9:378-381)；由因子Xa蛋白酶在精氨酸殘基之后切割的Ile-(Glu或Asp)-Gly-Arg位點(diǎn)(Eaton等，1986，Biochem.25:505_512)；由腸激酶在賴氨酸之后切割的Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位點(diǎn)(Collins-Racie等，1995，Biotechnology13982-987)；由GenenaseI切割的His-Tyr-Glu位點(diǎn)或His-Tyr-Asp位點(diǎn)(Carteretal.，1989,ProteinsStructure,Function,andGenetics6240-248)；由IH_在Arg之后切割的Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位點(diǎn)(Stevens,2003,DrugDiscoveryWorld435-48)；由TEV蛋白酶在Gin之后切割的Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位點(diǎn)(Stevens，2003，見上)；和由人鼻病毒3C蛋白酶的遺傳工程形式在Gin之后切割的Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位點(diǎn)(Stevens，2003，見上)。多核苷酸本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包含編碼具有本發(fā)明的過氧合酶活性的多肽的核苷酸序列或由該核苷酸序列組成。在優(yōu)選的方面中，所述核苷酸序列包含SEQIDN0:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDN0:7、SEQIDNO:9、SEQIDN0:11、SEQIDN0:13、SEQIDN0:15或SEQIDNO:17，或由SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:1USEQIDN0:13、SEQIDN0:15或SEQIDNO:17組成。在另一更優(yōu)選的方面中，所述核苷酸序列包含如下序列或由如下序列組成，所述序列包含在根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款在2008年3月14日以登錄號DSM21289保藏在DSMZ的大腸桿菌NN049991中所含的質(zhì)粒中；或所述核苷酸序列由如下多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含在根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款在2008年3月14日以登錄號DSM21290保藏在DSMZ的大腸桿菌NN049992中所含的質(zhì)粒中。在另一優(yōu)選的方面中，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:USEQIDN0:3、SEQIDN05,SEQIDN0:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDN0:13、SEQIDN0:15或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列或由所述成熟多肽編碼序列組成。在另一優(yōu)選的方面中，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:1的核苷酸152-1141或由之組成。在另一更優(yōu)選的方面中，所述核苷酸序列包含如下成熟多肽編碼序列或由如下成熟多肽編碼序列組成，所述成熟多肽編碼序列包含在根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款在2008年3月14日以登錄號DSM21289保藏在DSMZ的大腸桿菌NN049991中所含的質(zhì)粒中；或所述成熟多肽編碼序列由如下多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含在根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款在2008年3月14日以登錄號DSM21290保藏在DSMZ的大腸桿菌NN049992中所含的質(zhì)粒中。本發(fā)明還包括編碼如下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8、SEQIDNO:10、SEQIDN0:12、SEQIDNO:14或SEQIDNO19的氨基酸序列或其成熟多肽，或由所述氨基酸序列或其成熟多肽組成；所述核苷酸序列因遺傳密碼的簡并性而不同于SEQIDNO:USEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO:17，或其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明還涉及SEQIDNO=USEQIDNO3,SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO=IUSEQIDNO13,SEQIDN0:15或SEQIDNO:17的亞序列，所述亞序列編碼SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8、SEQIDNO10,SEQIDNO:12、SEQIDNO:14或SEQIDNO19的具有過氧合酶活性的片段。本發(fā)明還涉及突變多核苷酸，所述突變多核苷酸包含在SEQIDNO=USEQIDN0:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO15或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列中的至少一個(gè)突變或由之組成，其中所述突變核苷酸序列編碼SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO10,SEQIDNO:12、SEQIDNO:14或SEQIDNO:19的成熟多肽。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合。可通過例如使用熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或表達(dá)文庫的抗體篩選來檢測具有共有結(jié)構(gòu)特性的克隆DNA片段，從而實(shí)現(xiàn)從這種基因組DNA克隆本發(fā)明的多核苷酸。參見，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork?？梢允褂闷渌怂釘U(kuò)增方法，例如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基于核苷酸序列的擴(kuò)增(NASBA)?？梢詮膿?dān)子菌綱的菌株，或從另外的或相關(guān)的生物克隆多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。本發(fā)明還涉及包含下述核苷酸序列或由下述核苷酸序列組成的多核苷酸，所述核苷酸序列與SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDNO5,SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO=IUSEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%同一性的同一性程度，所述多核苷酸編碼活性多肽。修飾編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列對于合成與所述多肽基本上相似的多肽可能是必需的。術(shù)語與所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于從其天然來源分離的多肽，例如，比活性、熱穩(wěn)定性、最適PH等方面不同的人工變體?？梢栽谧鳛镾EQIDNO1,SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列存在的核苷酸序列，例如其亞序列的基礎(chǔ)上，和/或通過引入如下核苷酸取代來構(gòu)建變體序列所述核苷酸取代不產(chǎn)生由核苷酸序列編碼的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲產(chǎn)生酶的宿主生物的密碼子選擇；或者所述核苷酸取代可產(chǎn)生不同的氨基酸序列。關(guān)于核苷酸取代的概述，參見，例如，F(xiàn)ord等，1991，ProteinExpressionandPurification2:95_107。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，這些取代能夠在對于分子功能關(guān)鍵的區(qū)域之外進(jìn)行，并且仍然產(chǎn)生活性多肽。對于由本發(fā)明的分離的多核苷酸編碼的多肽活性關(guān)鍵的并且因此優(yōu)選不進(jìn)行取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變(參見，例如，Cunningham和Wells，1989，見上文)來鑒定。在后一技術(shù)中，將突變引入到分子中的每個(gè)正電殘基處，并且測試所得突變分子的過氧合酶活性，以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點(diǎn)也能夠通過分析三維結(jié)構(gòu)測定，通過如核磁共振分析、晶體學(xué)或光親和標(biāo)記這樣的技術(shù)來測定(參見，例如，deVos等，1992，見上文；Smith等，1992，見上文；Wlodaver等，1992，見上文)。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸在非常低嚴(yán)緊性條件下，優(yōu)選低嚴(yán)緊性條件，更優(yōu)選中嚴(yán)緊性條件，更優(yōu)選中_高嚴(yán)緊性條件，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)緊性條件，并且最優(yōu)選非常高嚴(yán)緊性條件下，與以下序列雜交(i)SEQIDNO1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO13、SEQIDNO15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:1、SEQIDNO3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列中所含的cDNA序列或包含SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；或它們的等位變體和亞序列(Sambrook等，1989，見上文)，如本文所定義的。在優(yōu)選的方面，所述互補(bǔ)鏈?zhǔn)荢EQIDNO=USEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列的全長互補(bǔ)鏈。本發(fā)明還涉及通過如下方法獲得的分離的多核苷酸(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高嚴(yán)緊性條件下，將DNA的群體與以下序列雜交(i)SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDN0:15或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDN0:5、SEQIDNO:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列中所含的cDNA序列或包含SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有過氧合酶活性的多肽。在優(yōu)選的方面，互補(bǔ)鏈?zhǔn)荢EQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列的全長互補(bǔ)鏈。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述分離的多核苷酸與一個(gè)或多個(gè)(數(shù)個(gè))調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細(xì)胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)?？梢杂迷S多方式操作編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸以提供多肽的表達(dá)。依賴于表達(dá)載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對其進(jìn)行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。調(diào)控序列可以是合適的啟動子序列，其是由用于表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞識別的核苷酸序列。啟動子序列含有介導(dǎo)多肽的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所選的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，特別是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實(shí)例是從下述獲得的啟動子大腸桿菌lac操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌(Str印tomycescoelicolor)瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因和原核β-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727_3731)，以及tac啟動子(DeBoer等，1983，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21-25)。另外的啟動子在〃Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"inScientificAmerican,1980,242:74_94中；禾口在Sambrook等，1989，見上文中有所描述。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實(shí)例是從下列酶的基因獲得的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、鑲片鐮孢Daria(WC)00/56900)、鑲片鐮孢Quirm(W000/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。其它對于酵母宿主細(xì)胞有用的啟動子由Romanos等，1992,Yeast8:423_488描述。調(diào)控序列可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，其是由宿主細(xì)胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地連接?？梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對于酵母宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對于酵母宿主細(xì)胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見上文描述。調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，其是對于宿主細(xì)胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5’末端?？梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。對于酵母宿主細(xì)胞合適的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α-因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核苷酸序列的3，末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時(shí)，宿主細(xì)胞將其識別為將聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號?？梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本發(fā)明中使用。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。對于酵母宿主細(xì)胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，MolecularCellularBiology15:5983_5990描述。調(diào)控序列還可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的氨基末端相聯(lián)的氨基酸序列，并且指導(dǎo)編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列中的5’端可固有地包含信號肽編碼序列，其與編碼分泌多肽的編碼序列片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中?？晒┻x擇的是，編碼序列5’端可含有對于所述編碼序列外源的信號肽編碼序列。外源信號肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號肽編碼序列時(shí)可能是必需的?；蛘?，外源信號肽編碼序列可以簡單地取代天然信號肽編碼序列以增強(qiáng)多肽的分泌。然而，指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選宿主細(xì)胞的分泌途徑(即，分泌至培養(yǎng)基中)的任何信號肽編碼序列可在本發(fā)明中使用。對于細(xì)菌宿主細(xì)胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprH)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號肽由Simonen和Palva,1993，MicrobiologicalReviews57:109_137描述。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V和疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶。對于酵母宿主細(xì)胞有用的信號肽從釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼序列由Romanos等，1992，見上文，描述。在優(yōu)選的方面，所述信號肽包含SEQIDNO2的氨基酸-43至_1或由SEQIDΝ0:2的氨基酸-43至-1組成。在另一優(yōu)選的方面，所述信號肽編碼序列包含SEQIDNO:1的核苷酸23-151或由SEQIDNO1的核苷酸23-151組成。調(diào)控序列還可以是合適前肽編碼序列，其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolyp印tide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前肽通常是無活性的并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)變成成熟活性多肽。可以從枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α-因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)的基因獲得前肽編碼序列。當(dāng)信號肽和前肽區(qū)二者均出現(xiàn)在多肽的氨基末端時(shí)，將前肽序列置于緊接著(nextto)多肽氨基末端，并且將信號肽序列置于緊接著前肽序列的氨基末端。同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對于宿主細(xì)胞的生長來調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是引起基因表達(dá)響應(yīng)化學(xué)或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac、xyl和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKAa-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實(shí)例是那些允許基因擴(kuò)增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)節(jié)序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表汰載體本發(fā)明還涉及重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。本文所述的多種核酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體可以包括一個(gè)或多個(gè)(數(shù)個(gè))方便的限制位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)插入或取代編碼多肽的核苷酸序列。可供選擇的是，可以通過在合適的用于表達(dá)的載體中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸構(gòu)建體來表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸序列。在構(gòu)建表達(dá)載體的過程中，將編碼序列置于載體中，使得該編碼序列與合適的表達(dá)調(diào)控序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其能夠方便地進(jìn)行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生核苷酸序列的表達(dá)。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實(shí)體(entity)存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段(means)。或者，載體可以是一種當(dāng)被引入宿主細(xì)胞中時(shí)，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可以使用單獨(dú)的載體或質(zhì)粒，或兩個(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細(xì)胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有一個(gè)或多個(gè)(數(shù)個(gè))選擇性標(biāo)記，其允許簡單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實(shí)例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標(biāo)記，所述抗生素抗性例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。對于酵母宿主細(xì)胞合適的標(biāo)記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷-5，-磷酸脫羧酶(orotidine-5，-phosphatedecarboxylase))、sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因禾口吸水鏈霄菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細(xì)胞基因組或載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組的自主復(fù)制。為了整合入宿主細(xì)胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件?；蛘?，載體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導(dǎo)通過同源重組整合入宿主細(xì)胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)該優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核酸，如100至10，000堿基對，優(yōu)選400至10，000堿基對，并且最優(yōu)選800至10，000堿基對，其與相應(yīng)的目標(biāo)序列具有高度同一性以增強(qiáng)同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細(xì)胞基因組中。為了自主復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包含復(fù)制起點(diǎn)，其使載體能夠在所述的宿主細(xì)胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)可以是介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子(r印licator)，其在細(xì)胞中發(fā)揮功能。術(shù)語“復(fù)制起點(diǎn)”或“質(zhì)粒復(fù)制子”在本文定義為使質(zhì)?；蜉d體能夠體內(nèi)復(fù)制的核苷酸序列。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點(diǎn)，和允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和ρΑΜβ1的復(fù)制起點(diǎn)。用于酵母宿主細(xì)胞中的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2微米復(fù)制起點(diǎn)，ARSl,ARS4，ARSl和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細(xì)胞中有用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene9861-67；Cullen等·，1987，NucleicAcidsResearch15:9163_9175；WO00/24883)。分離AMAl基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)?；蜉d體能夠根據(jù)公開于WO00/24883中的方法完成?？梢詫⒍嘤谝粋€(gè)拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細(xì)胞以增加基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可以通過如下方式獲得將所述序列的至少一個(gè)額外拷貝整合入宿主細(xì)胞基因組，或包括與多核苷酸一起的可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記基因，其中能夠通過在適當(dāng)?shù)倪x擇劑存在下培養(yǎng)細(xì)胞來選擇含有選擇性標(biāo)記基因的擴(kuò)增拷貝，并因而含有所述多核苷酸的額外拷貝的細(xì)胞。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，所述重組宿主細(xì)胞包含本發(fā)明的分離的多核苷酸，將其有利地用于多肽的重組產(chǎn)生中。將包含本發(fā)明多核苷酸的載體引入宿主細(xì)胞中，從而將該載體保留作為染色體整合體(chromosomalintegrant)或作為前述的自復(fù)制的染色體外載體。術(shù)語“宿主細(xì)胞”包含親本細(xì)胞的任何子代，其由于復(fù)制過程中發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不相同。宿主細(xì)胞的選擇將很大程度依賴于編碼多肽的基因和它的來源。宿主細(xì)胞可以是任何細(xì)胞，其可用于本發(fā)明的多肽的重組產(chǎn)生，例如原核生物或真核生物。原核宿主細(xì)胞可為任何革蘭氏陽性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽性細(xì)菌包括，但不限于，芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、土芽孢桿菌屬或海洋芽孢桿菌屬。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬或尿枝原體屬。細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌屬細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)踐中有用的芽孢桿菌屬細(xì)胞包括但不限于嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。在優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞。在另一更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是克勞氏芽孢桿菌細(xì)胞。在另一更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是地衣芽孢桿菌細(xì)胞。在另一更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何鏈球菌屬細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)踐中有用的鏈球菌屬細(xì)胞包括但不限于似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。在優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是似馬鏈球菌細(xì)胞。在另一優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是釀膿鏈球菌細(xì)胞。在另一優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是乳房鏈球菌細(xì)胞。在另一優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何鏈霉菌屬細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)踐中有用的鏈霉菌屬細(xì)胞包括但不限于不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌細(xì)胞。在優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是不產(chǎn)色鏈霉菌細(xì)胞。在另一優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是除蟲鏈霉菌細(xì)胞。在另一優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是天藍(lán)色鏈霉菌細(xì)胞。在另一優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是灰色鏈霉菌細(xì)胞。在另外的優(yōu)選方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是淺青紫鏈霉菌細(xì)胞?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到芽孢桿菌屬細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang和Cohen，1979，MolecularGeneralGenetics168:111_115)，使用感受態(tài)細(xì)胞(參見，例如，Young和Spizizen，1961，JournalofBacteriology81:823_829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，JournalofMolecularBiology56:209_221)，電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques6:742_751)，或接合(參見，例如，Koehler禾口Thorne，1987，JournalofBacteriologyl69:5771_5278)?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到大腸桿菌細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Hanahan,1983，J.Mol.Biol.166557-580)或電穿孔(參見，例如，Dower等，1988，NucleicAcidsRes.166127-6145)。可通過如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈霉菌屬細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(參見，例如，Gong等，2004，F(xiàn)oliaMicrobiol(Praha)49:399_405)，接合(參見，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171:3583_3585)，或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98=6289-6294)?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到假單胞菌屬細(xì)胞例如電穿孔(參見，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(參見，例如，Pinedo和Smets，2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51_57)。可通過如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈球菌屬細(xì)胞例如天然感受態(tài)(naturalcompetence)(參見，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.321295-1297)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Catt和Jollick,1991，Microbios.68189-2070)，電穿孔(參見，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.653800-3804)或接合(參見，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45409-436)。然而，本領(lǐng)域已知的任何方法可以用于將DNA引入宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞還可以是真核生物，例如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細(xì)胞。在優(yōu)選的方面，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞?！罢婢庇迷诒疚陌ㄒ韵麻T子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)禾口接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi,8thedition,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995，見上)。在更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞?！敖湍浮庇迷诒疚陌óa(chǎn)子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)抱霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變，就本發(fā)明而言，將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.禾口Davenport,R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。在更加優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是念珠菌屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細(xì)胞。在最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母細(xì)胞。在另一最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)細(xì)胞。在另一最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowialipolytica)細(xì)胞。在另一更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等，1995，見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進(jìn)行營養(yǎng)生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母進(jìn)行的營養(yǎng)生長通過單細(xì)胞菌體的出芽生殖(budding)進(jìn)行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。在甚至更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬蠟菌屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、Filibasidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)或木霉屬細(xì)胞。在最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細(xì)胞。在另一最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細(xì)胞。在另一最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta)>zFifaIif(Ceriporiopsisaneirina)>zFMifflIif>Ceriporiopsiscaregiea、淺黃擬M菌(Ceriporiopsisgilvescens)>Ceriporiopsispannocinta、環(huán)帶Miffllii(Ceriporiopsisrivulosa)、微紅擬賭菌(Ceriporiopsissubrufa)、蟲擬賭菌(Ceriporiopsissubvermispora)、嗜角質(zhì)金抱子菌、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、粗金抱子菌、Chrysosporiumqueenslandicum>Chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌、輻射射脈菌(Phlebiaradiata)、刺芹側(cè)耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢霉、絨毛栓菌(Trametesvillosa)、雜色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細(xì)胞?？梢詫⒄婢?xì)胞通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁重建的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的合適方法在EP238023和Yelton^,1984,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA811470-1474中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文獻(xiàn)描述的方法轉(zhuǎn)化酵母=Becker和Guarente，于Abelson,J.N.禾口Simon,Μ.I.,編，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194,pp182—187,AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等，1983,JournalofBacteriology153:163；禾口Hinnen等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920o產(chǎn)牛方法本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式能夠產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)如本文所述的宿主細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含突變核苷酸序列，其在SEQIDNO=USEQIDN0:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO=IUSEQIDNO13,SEQIDN0:15或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列中具有至少一個(gè)突變，其中所述突變核苷酸序列編碼如下多肽，所述多肽包含SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO14或SEQIDNO19的成熟多肽或由所述成熟多肽組成，和(b)回收所述多肽。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，使用本領(lǐng)域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達(dá)和/或分離所述多肽的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，和實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公布的成分制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌到培養(yǎng)基中，其能夠從細(xì)胞裂解物(Iysate)回收?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的對于所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，酶試驗(yàn)(enzymeassay)可用于測定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收多肽，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。本發(fā)明的多肽可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(pr印arative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS_PAGE或提取(參見，例如，ProteinPurification，J.-C.Janson禾口LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)。轉(zhuǎn)基因棺物本發(fā)明還涉及植物，例如，轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其包含編碼具有過氧合酶活性的本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸，從而以可回收的量表達(dá)并產(chǎn)生所述多肽。所述多肽可從植物或植物部分回收?；蛘?，可以將含有該重組多肽的植物或植物部分用于改進(jìn)食品或飼料的質(zhì)量，例如，改進(jìn)營養(yǎng)價(jià)值、適口性(palatability)和流變性質(zhì)(rheologicalproperties),或用于破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子。轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實(shí)例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadowgrass)(藍(lán)草(bluegrass)，早熟禾屬(Poa))；飼用牧草(foragegrass)如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)；寒地型牧草(temperategrass)，如剪股穎屬(Agrostis)；和谷類，例如，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物的實(shí)例是煙草(tobacco)，豆類(legumes)，如羽扇豆(lupins)，馬鈴薯，糖甜菜(sugarbeet),豌豆,豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(familyBrassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rapeseed)和緊密相關(guān)的模型生物擬南芥(Arabidopsisthaliana)。植物部分的實(shí)例是莖(stem)、愈傷組織(calIus)、葉(leaf)、根(root)、果實(shí)(fruit)、種子(seed)和塊莖(tuber)，以及包含這些部分的獨(dú)立組織，例如，表皮(epidermis)、葉肉(mesophyll)、薄壁組織(parenchyma)、維管組織(vasculartissue)、分生組織(meristem)。具體的植物細(xì)胞區(qū)室(compartments)，如葉綠體(chloroplast)、質(zhì)外體(apoplast)、線粒體(mitochondria)、液泡(vacuole)、過氧化物酶體(peroxisome)禾口細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)也被認(rèn)為是植物部分。此外，任何植物細(xì)胞，無論什么組織來源，都被認(rèn)為是植物部分。同樣地，植物部分，如分離以促進(jìn)本發(fā)明的應(yīng)用的特定組織和細(xì)胞也被認(rèn)為是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和種皮(seedcoat)。同樣包含于本發(fā)明范圍內(nèi)的還有這些植物、植物部分和植物細(xì)胞的子代。表達(dá)本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞可以依照本領(lǐng)域已知方法構(gòu)建。簡而言之，通過如下方法構(gòu)建所述植物或植物細(xì)胞將編碼本發(fā)明多肽的一個(gè)或多個(gè)(數(shù)個(gè))表達(dá)構(gòu)建體并入植物宿主基因組或葉綠體基因組，并將所得的修飾植物或植物細(xì)胞繁殖成轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。表達(dá)構(gòu)建體便利地是包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述多核苷酸與在選擇的植物或植物部分中表達(dá)該多核苷酸序列所需的適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列可操作地連接。此外，表達(dá)構(gòu)建體可以包含對于鑒定宿主細(xì)胞有用的選擇性標(biāo)記，在所述宿主細(xì)胞中整合了表達(dá)構(gòu)建體和將該構(gòu)建體引入到所述植物中所需的DNA序列(后者依賴于使用的DNA引入方法)。調(diào)節(jié)序列的選擇，例如啟動子和終止子序列和任選地信號或轉(zhuǎn)運(yùn)序列的選擇，舉例來說，基于期望何時(shí)、何處以及如何表達(dá)多肽而確定。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因的表達(dá)可以是組成型的或誘導(dǎo)型的，或可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產(chǎn)物可以靶向特定的組織或植物部分例如種子或葉。調(diào)節(jié)序列由例如Tague等，1988，PlantPhysiology86:506所述。對于組成性表達(dá)，可以使用35S_CaMV、玉米泛素1和稻肌動蛋白1啟動子(Franck等，1980,Cell21:285_294，Christensen等，1992,PlantMo.Biol.18:675_689；Zhang等，1991,PlantCell3:1155_1165)。器官特異性啟動子可以是例如來自貯藏庫組織(storagesinktissue)例如種子、馬鈴薯塊蓮和果實(shí)的啟動子(Edwards&Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24:275_303)，或來自代謝庫組織(metabolicsinktissue)例如分生組織的啟動子(Ito等，1994，PlantMol.Biol.24:863_878)，種子特異性啟動子諸如來自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)啟動子(Wu等，1998，PlantandCellPhysiology39:885_889)，來自豆球蛋白(Iegumin)B4和蠶豆(Viciafaba)的未知的種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad等，1998，JournalofPlantPhysiology152:708_711)、來自種子油體蛋白(oilbodyprotein)的啟動子(Chen等，1998，PlantandCellPhysiology39:935_941)，來自歐洲油菜(Brassicanapus)的貯藏蛋白napA啟動子，或本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的任何其他種子特異性的啟動子，例如，在WO91/14772中所描述的。此外，啟動子可為葉特異性的啟動子，如來自稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozuka等，1993，PlantPhysiologyl02:991_1000)，小球藻病毒(chlorellavirus)腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(adeninemethyltransferase)基因啟動子(Mitra和Higgins，1994，PlantMolecularBiology26:85_93)，或來自稻的aldP基因啟動子(Kagaya等，1995，MolecularandGeneralGenetics248:668_674)，或傷口誘導(dǎo)的啟動子，如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993，PlantMolecularBiology22:573-588)。同樣地，所述啟動子可通過非生物的處理誘導(dǎo)，所述非生物的處理諸如溫度、干旱或鹽度變化，或通過外源應(yīng)用的激活所述啟動子的物質(zhì)誘導(dǎo)，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脫落酸(abscisicacid)、赤霉酸(gibberellicacid)和/或重金屬。啟動子增強(qiáng)子元件也可以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明多肽在植物中的較高表達(dá)。例如，啟動子增強(qiáng)子元件可以是內(nèi)含子，將其置于啟動子和編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間。例如Xu等，1993，見上，公開了使用稻肌動蛋白1基因的第一內(nèi)含子以增強(qiáng)表達(dá)。選擇性標(biāo)記基因和表達(dá)構(gòu)建體的任何其它部分可以選自本領(lǐng)域內(nèi)可用的那些。將核酸構(gòu)建體根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)并入植物基因組，所述常規(guī)技術(shù)包括土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射(microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化和電穿孔(Gasser等，1990，Science2441293；Potrykus,1990,Bio/Technology8535；Shimamoto等，1989，Nature338274)。目前，根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)，是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的優(yōu)選方法(為了參考，見Hooykas和Schilperoort,1992,PlantMolecularBiology19:15_38)，而且它也可以用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，雖然對于這些植物其它的轉(zhuǎn)化方法是常用的。目前，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的優(yōu)選的方法，是用粒子(用轉(zhuǎn)化DNA包覆的微觀的金或鎢粒子)轟擊胚愈傷組織(embryoniccalli)或發(fā)育中的胚(developingembryos)(Christou,1992,PlantJournal2:275-281;Shimamoto,1994,CurrentOpinionBiotechnology5158-162；Vasil等，1992,Bio/Technology10:667_674)。轉(zhuǎn)化單子葉植物的可供選擇的方法，是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如由Omirulleh等，1993，PlantMolecularBiology21:415_428所述的。轉(zhuǎn)化之后，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法選擇具有并入的表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體并且再生成為完整植物。通常設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)化方法用于通過如下方法在再生期間或在后續(xù)世代中選擇性消除選擇基因例如，使用帶有兩種獨(dú)立的T-DNA構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化或通過特異性重組酶位點(diǎn)特異性地切除選擇基因。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，其包含編碼本發(fā)明具有過氧合酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。去除或減少過氧合酶活件本發(fā)明還涉及產(chǎn)生親本細(xì)胞突變體的方法，其包括破壞或缺失編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸序列或其部分，所述方法導(dǎo)致在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，與親本細(xì)胞相比突變的細(xì)胞產(chǎn)生較少的所述多肽?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的方法，例如插入、破壞、取代或缺失，通過減少或消除編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的表達(dá)來構(gòu)建突變細(xì)胞。在優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列是失活的。待修飾或失活的核苷酸序列可以是，例如，編碼區(qū)或其對活性關(guān)鍵的部分，或表達(dá)編碼區(qū)所必需的調(diào)節(jié)元件。這種調(diào)節(jié)或調(diào)控序列的實(shí)例可以是啟動子序列或其功能部分，即，足以影響核苷酸序列表達(dá)的部分。用于可能的修飾的其它調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽序列、轉(zhuǎn)錄終止子和轉(zhuǎn)錄激活子?？梢酝ㄟ^向親本細(xì)胞施以誘變，并且選擇其中已將所述核苷酸序列的表達(dá)減少或消除的突變細(xì)胞來進(jìn)行核苷酸序列的修飾或失活。誘變可能是特異性的或隨機(jī)的，可以通過例如使用合適的物理或化學(xué)誘變劑進(jìn)行，通過使用合適的寡核苷酸進(jìn)行，或通過將所述DNA序列進(jìn)行PCR產(chǎn)生的誘變。此外，可以通過使用這些誘變劑的任何組合來進(jìn)行誘變。適合于本發(fā)明目的的物理或化學(xué)誘變劑的實(shí)例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、0_甲基羥胺、亞硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethylmethanesulphonate)(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。當(dāng)使用這些試劑時(shí)，通常通過如下方法來進(jìn)行所述誘變在合適條件下存在優(yōu)選的誘變劑時(shí)溫育待誘變的親本細(xì)胞，并篩選和/或選擇顯示基因表達(dá)減少的或無基因表達(dá)的突變細(xì)胞。通過引入、取代或去除基因中的一個(gè)或多個(gè)(數(shù)個(gè))核苷酸或其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)節(jié)元件，可以實(shí)現(xiàn)所述核苷酸序列的修飾或失活。例如，可以插入或去除核苷酸從而導(dǎo)致引入終止密碼子，去除起始密碼子，或改變開讀框。按照本領(lǐng)域已知的方法通過定位誘變或PCR產(chǎn)生的誘變可以實(shí)現(xiàn)這種修飾或失活。盡管在理論上所述修飾可以在體內(nèi)進(jìn)行，即，直接在表達(dá)待修飾核苷酸序列的細(xì)胞上進(jìn)行，但優(yōu)選如下文所示例的那樣在體外進(jìn)行所述修飾。消除或減少核苷酸序列通過細(xì)胞表達(dá)的便利方法的實(shí)例是基于基因取代、基因缺失或基因破壞的技術(shù)。例如，在基因破壞方法中，將相應(yīng)于內(nèi)源核苷酸序列的核酸序列在體外進(jìn)行誘變以產(chǎn)生缺陷性的核酸序列，隨后將其轉(zhuǎn)化入親本細(xì)胞中以產(chǎn)生缺陷基因。通過同源重組，所述缺陷性核酸序列替代了內(nèi)源性核苷酸序列。理想的是所述缺陷性核苷酸序列還編碼標(biāo)記，其可用于選擇其中核苷酸序列被修飾或破壞的轉(zhuǎn)化體。在特別優(yōu)選的方面，用選擇性標(biāo)記如本文所述的那些來破壞所述核苷酸序列?；蛘?，可以使用與所述核苷酸序列互補(bǔ)的序列通過確定的反義或RNAi技術(shù)來進(jìn)行所述核苷酸序列的修飾或失活。更具體地，通過導(dǎo)入與所述基因的核苷酸序列互補(bǔ)的序列可以減少或消除所述核苷酸序列通過細(xì)胞的表達(dá)，所述序列可以在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄并且能夠與細(xì)胞中產(chǎn)生的mRNA雜交。在允許所述互補(bǔ)反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下，由此減少或消除翻譯的蛋白質(zhì)的量。本發(fā)明進(jìn)一步涉及親本細(xì)胞的突變細(xì)胞，其包含編碼多肽的核苷酸序列或其調(diào)控序列的破壞或缺失，這導(dǎo)致與親本細(xì)胞相比突變細(xì)胞產(chǎn)生更少的多肽或不產(chǎn)生多肽。這樣生成的多肽缺陷性突變細(xì)胞作為表達(dá)天然和/或異源多肽的宿主細(xì)胞特別有用。所以，本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生天然或異源多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)突變細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。術(shù)語“異源多肽”在本文中定義為對宿主細(xì)胞不是天然的多肽，進(jìn)行了修飾而將天然序列改變的天然蛋白，或作為通過重組DNA技術(shù)操作宿主細(xì)胞的結(jié)果將表達(dá)在量上改變的天然蛋白。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及通過發(fā)酵產(chǎn)生本發(fā)明的多肽以及感興趣的蛋白產(chǎn)物的細(xì)胞，來產(chǎn)生基本上無過氧合酶活性的蛋白產(chǎn)物的方法在發(fā)酵完成之前、之中，或之后向發(fā)酵液(fermentationbroth)中添加有效量的能夠抑制過氧合酶活性的物質(zhì)(agent)，從發(fā)酵液中回收感興趣的產(chǎn)物，和任選地將回收的產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步純化。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及如下生產(chǎn)基本上無過氧合酶活性的蛋白產(chǎn)物的方法在允許所述產(chǎn)物表達(dá)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行組合的PH和溫度處理以基本上減少過氧合酶活性，和從培養(yǎng)液中回收產(chǎn)物?；蛘?，可以將從培養(yǎng)液回收的酶制備物進(jìn)行組合的PH和溫度處理。所述組合的pH和溫度處理可任選地與過氧合酶抑制劑處理組合使用。依照本發(fā)明的這個(gè)方面，可能去除至少60%，優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少85%，還更優(yōu)選至少95%，并且最優(yōu)選至少99%的過氧合酶活性?？墒褂么朔椒ǐ@得過氧合酶活性的完全去除。組合的pH和溫度處理優(yōu)選在2-4或9-10的pH和至少60_70°C的溫度進(jìn)行一段足夠的時(shí)間以達(dá)到期望的效果，通常30至60分鐘是足夠的。用于培養(yǎng)和純化感興趣的產(chǎn)物的方法可通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。用于產(chǎn)生基本上無過氧合酶產(chǎn)物的本發(fā)明的方法在真核多肽，特別是真菌蛋白質(zhì)例如酶的產(chǎn)生中是特別令人感興趣的。所述酶可以選自，例如，淀粉分解酶(amylolyticenzyme)、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纖維素分解酶(cellulolyticenzyme)、氧化還原酶或植物細(xì)胞壁降解酶。這些酶的實(shí)例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶(chitinase)、角質(zhì)酶(cutinase)、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、半乳糖苷酶、β“半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、商素過氧化酶、半纖維素酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。過氧合酶缺陷性細(xì)胞也可以用于表達(dá)在制藥上感興趣的異源蛋白質(zhì)例如激素、生長因子、受體等。可理解的是術(shù)語“真核多肽”不僅包括天然多肽，也包括多肽例如酶，其通過氨基酸取代、缺失或添加修飾，或通過其它這樣的修飾以增強(qiáng)活性、熱穩(wěn)定性、PH耐受性等。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及基本上無過氧合酶活性的蛋白產(chǎn)物，其通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生。組合物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多肽的組合物。優(yōu)選地，所述組合物富含這種多肽。術(shù)語“富含”表示所述組合物的過氧合酶活性，以例如至少1.1的富集因數(shù)(enrichmentfactor)±曾力口。所述組合物可以包含本發(fā)明的多肽作為主要酶成分，例如，單成分組合物?；蛘?，所述組合物可以包含多種酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵過氧化酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。額外的酶可以通過例如屬于以下屬或種的微生物產(chǎn)生曲霉屬，優(yōu)選棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；鐮孢屬，優(yōu)選桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢；腐質(zhì)霉屬，優(yōu)選特異腐質(zhì)霉或疏棉狀腐質(zhì)霉；或木霉屬，優(yōu)選哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域內(nèi)已知的方法制備多肽組合物，并且可以是液體或干組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式?？梢詫ㄓ谒鼋M合物中的多肽依照本領(lǐng)域內(nèi)已知方法穩(wěn)定。以下提供的實(shí)施例是本發(fā)明多肽組合物的優(yōu)選用途。本發(fā)明的多肽組合物的劑量和使用該組合物的其它條件可以基于本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法決定。本發(fā)明還涉及使用所述具有過氧合酶活性的多肽或其組合物的方法。芳族Ν-^m^mim^mmmN-m^m優(yōu)選將式(I)的起始化合物與具有特別高的過氧合酶活性的真菌柱狀田頭菇的芳族鹵過氧化物酶過氧合酶(柱狀田頭菇過氧合酶-柱狀田頭菇過氧化物酶=AaPl)和至少一種氧化劑反應(yīng)，而發(fā)生雜環(huán)氮的區(qū)域選擇性氧合。依據(jù)本發(fā)明使用的氧化劑優(yōu)選是H2O2、有機(jī)過氧化物或氫過氧化物，例如，叔丁基氫過氧化物、空氣或氧(02)。在本方法中有可能省去昂貴的電子供體，例如NADH或NADPH(氧化劑的濃度0.01-10mmol/l，優(yōu)選0.l_2mmol/l的H2O2)。為了進(jìn)一步加速使用酶AaPl的式(I)化合物的轉(zhuǎn)化，額外可以向反應(yīng)混合物加入生成H2O2的酶，尤其是氧化酶，例如葡糖氧化酶或芳基醇氧化酶和它們的底物(葡萄糖或苯甲醇)。依據(jù)本發(fā)明的酶促、無細(xì)胞方法的基礎(chǔ)是新型胞外鹵過氧化物酶過氧合酶(芳族過氧合酶)，其具有P450-催化性質(zhì)，并且在合適的氧化劑(例如過氧化物)存在下，特別是緩沖的水溶液中，將芳族N-雜環(huán)類化合物(例如吡啶)氧化成相應(yīng)的N-氧化物，并由此實(shí)現(xiàn)高選擇性(>95%N-氧化物)。使用的酶是具有過氧化物酶或過氧合酶功能的特異性胞外血紅素-硫醇鹽(heme-thiolate)蛋白。其通過糞傘科(例如田頭菇屬菌種)和鬼傘科(Coprinaceae)(例如鬼傘屬菌種)的擔(dān)子菌形成，其特征在于使其明顯有別于目前為止描述過的過氧化物酶和細(xì)胞色素P450酶的特異性催化性質(zhì)。酶的產(chǎn)生優(yōu)選在液體培養(yǎng)物中、在生物反應(yīng)器和富含氮的培養(yǎng)基中進(jìn)行(Ullrich,R.，2005，Thesis,IHIZittau；Kluge,M.2006，Diplomathesis,IHIZittau)。與化學(xué)合成相反，由稱為AaPl的酶催化的反應(yīng)不需要高度濃縮的、侵略性的和對環(huán)境有害的試劑，并且在回收產(chǎn)物時(shí)，可以省去為了分離異構(gòu)體混合物而進(jìn)行的化學(xué)密集型且耗時(shí)的純化步驟。通常，使用的酶的濃度為0.02U/ml至10U/ml的AaPl，特別是0.09-8U/ml的AaPl。這使得所述反應(yīng)過程對環(huán)境特別友好。相對于純化學(xué)合成的另一個(gè)優(yōu)勢在于操作，原因是發(fā)明的過氧合酶催化的反應(yīng)在室溫和標(biāo)準(zhǔn)氣壓下進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法在水緩沖溶液中進(jìn)行。為了穩(wěn)定水介質(zhì)中的反應(yīng)，可以向反應(yīng)混合物加入緩沖液，所述緩沖液基于有機(jī)酸，優(yōu)選檸檬酸，和磷酸鹽，優(yōu)選磷酸氫二鉀(potassiumhydrogenphosphate)(緩沖液濃度為5mmol/l至500mmol/l，優(yōu)選20-100mmol/l)。另外，可以在無緩沖液并連續(xù)按計(jì)量加入酸或堿的pH狀態(tài)中進(jìn)行反應(yīng)。為了改善溶解度，可以向反應(yīng)混合物加入有機(jī)溶劑，并且可以在兩相體系中工作?？梢罁?jù)本發(fā)明使用的溶劑是質(zhì)子溶劑，如甲醇或乙醇，或疏質(zhì)子極性溶劑，如醚(例如二異丙醚)、丙酮、乙腈、DMSO(二甲亞砜)和DMF(N，N-二甲基甲酰胺)。使用的式(I)的起始化合物具體為來自下組的化合物吡啶，取代的吡啶(R=-X、-NO2,-烷基、-苯基、-NH2、-0H)，喹啉，異喹啉及其衍生物，具有數(shù)個(gè)雜原子的芳族化合物和多環(huán)N-雜環(huán)類化合物。反應(yīng)在5°C至40°C的范圍內(nèi)進(jìn)行，優(yōu)選在20-30°C。反應(yīng)時(shí)間通常在0.5-120分鐘的范圍內(nèi)，特別是在5-30分鐘的范圍內(nèi)。獲得的N-氧化物的產(chǎn)率在10%-99%的范圍內(nèi)，優(yōu)選為20-99%。過氧合酶催化的N-雜環(huán)類化合物的反應(yīng)優(yōu)于使用唯一一種另外的能夠?qū)⑦拎ぱ趸蛇拎-氧化物的酶(甲烷單加氧酶，ΜΜ0)的催化作用的優(yōu)勢由以下幾點(diǎn)組成·i)在于更高的比活性·ii)在于使用廉價(jià)的過氧化物代替昂貴的電子供體[NAD(P)H]，·iii)在于使羥基化酶獨(dú)立于黃素還原酶和調(diào)節(jié)蛋白，·iv)在于不破壞細(xì)胞的簡單的酶回收，和·ν)在于胞外AaPl和類似的過氧合酶與不穩(wěn)定的胞內(nèi)且部分膜結(jié)合的MMO相比的高穩(wěn)定性。使用AaPl催化的反應(yīng)，有可能第一次將未活化的N-雜環(huán)類化合物如吡啶在僅需要過氧化物作為協(xié)同底物的單一胞外生物催化劑的輔助下，在一步過程中區(qū)域選擇性地轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的N-氧化物(例如吡啶N-氧化物)。所述過程可以用在廣泛多樣的合成化學(xué)的不同部分中，包括但不限于用于活性成分、藥物中間體、特異性催化劑和氧化劑的制備，和用于將保護(hù)基引入不穩(wěn)定的分子。本發(fā)明將在下文參考附圖中所示實(shí)例進(jìn)行更詳細(xì)的說明，其中本發(fā)明不限于所述實(shí)例。過氧合酶在紙漿和紙工業(yè)(pulp&paperindustry)中的應(yīng)用在優(yōu)選的實(shí)施方案中過氧合酶可以用于紙漿和紙工業(yè)中的不同的應(yīng)用。所述酶可以用于增加牛皮紙漿(Kraftpulps)、機(jī)械紙漿和化學(xué)機(jī)械紙漿的漂白過程中的去木質(zhì)作用。漂白過程的目的是將褐色的木質(zhì)素分子從纖維素纖維中去除；這在傳統(tǒng)上通常在漂白工序(bleachingsequence)中進(jìn)行，所述漂白工序使用氧化性化學(xué)品如二氧化氯、氧、臭氧或過氧化氫，也包括氧化步驟之間的堿性提取。通過氧合木質(zhì)素分子中的芳族結(jié)構(gòu)，木質(zhì)素將變得更親水，并且將在進(jìn)一步通過傳統(tǒng)氧化性化學(xué)品進(jìn)行降解時(shí)更易于從紙漿提取，這樣獲得相同亮度水平的紙漿需要的傳統(tǒng)漂白化學(xué)品更少。復(fù)雜的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)中存在的潛在的芳族結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈羥基化、烷基-芳基醚的切割以及醇和醛結(jié)構(gòu)的氧化也將改善漂白過程并節(jié)省傳統(tǒng)的化學(xué)品。在另一也涉及去木質(zhì)作用(例如牛皮紙漿的去木質(zhì)作用)的實(shí)施方案中，可以將過氧合酶用于原位生成在漆酶/中介體(mediator)或過氧化物酶/中介體去木質(zhì)作用中使用的中介體，所述方法由例如Call等，JournalofBiotechnology53(1997)第163-202頁描述。所謂的N-OH型中介體種類像例如羥基苯并三唑是在這種方法中顯示出高去木質(zhì)效果的化合物。在所述方法中羥基苯并三唑能夠通過使用過氧合酶羥基化廉價(jià)得多的化合物苯并三唑而原位生成。其它N-OH型的雜環(huán)化合物能夠以類似方法生成。在另一實(shí)施方案中，過氧合酶酶可以用于改善化學(xué)紙漿、機(jī)械紙漿和化學(xué)-機(jī)械紙漿的樹脂去除(Pitchremoval)/脫樹脂作用。樹脂(pitchandresin)是用于木材中天然存在的疏水化合物的常用術(shù)語。在傳統(tǒng)化學(xué)制漿方法中將樹脂去除/降解到一定程度，但是所述化合物中的一些由于這些化合物的疏水性而難以去除到理想的程度，芳族結(jié)構(gòu)的羥基化或芳基醇或酚結(jié)構(gòu)的氧化能夠改善脫樹脂作用，并由此改善紙漿/紙的性質(zhì)，節(jié)省進(jìn)行清潔的停工期(downtimeforcleaning)，并潛在地節(jié)省為了保持所述疏水化合物均勻地懸浮在紙漿中而另外加入的化學(xué)品。水處理工業(yè)中的過氧合酶過氧合酶可以應(yīng)用于水處理工業(yè)中的多種目的。實(shí)際上所有預(yù)期的應(yīng)用都對應(yīng)于過氧合酶催化的對難降解物(recalcitrant)、持久性毒物(toxicpersistent)和/或生物活性物質(zhì)的改性。這些物質(zhì)的改性(即氧化)將促進(jìn)通過常規(guī)水處理操作來減輕它們，所述操作包括但不限于活化污泥(activatedsludges)、生物反應(yīng)器(例如移動床、上流式污泥床(upflowsludgeblanket)、膜等)、需氧和厭氧消化器、凈化器和氧化池(lagoon)?？梢詫⒅鲝埖倪^氧合酶在水處理操作中特異性和催化活性的益處按照主要能夠提供白勺改t生(theprimarydeliverableofthemodification)來分組。在第一種情況(scenario)中，過氧合酶介導(dǎo)的物質(zhì)改性直接降低所述物質(zhì)的有害性質(zhì)(hazardousnature)和/或通過增加有害物質(zhì)用于后續(xù)通過常規(guī)水處理操作進(jìn)行去除的生物利用度而降低所述物質(zhì)的有害性質(zhì)。實(shí)例包括持久性物質(zhì)例如除草劑/殺真菌齊U(例如苯脲、苯氧)、莠去津(atrazine)、苯烴&PAH(phenylhydrocarbons&PAH)、殺蟲齊[J、DDT、PCB、PCDD、PCDF和表面活性劑以及新興微量污染物(emergingmicropollutant)(EMP)例如內(nèi)分泌破壞物(endocrinedisrupters)、藥物(例如抗生素/抗菌劑、雌激素)、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品等。在很大程度上，所述物質(zhì)傾向于以低濃度水平存在，這使得過氧合酶的選擇性和特異性相對于趨向于無選擇性、非催化性和非再生性的更昂貴的處理成為優(yōu)選。在第二種情況中，物質(zhì)的過氧合酶改性改善水處理操作的效力/性能。通過過氧合酶進(jìn)行的難降解有機(jī)物(即，“未處理的”和“不能處理的/惰性的/難以處理的COD”)的氧化使CODBOD比降低，這可以增加常規(guī)水處理操作的整體去除率而不用大量資金投入。以類似的方式，過氧合酶介導(dǎo)的對潛在毒性物質(zhì)的氧化可以改善生物營養(yǎng)物去除(BNR)系統(tǒng)(例如反應(yīng)器、消化器、氧化池、污泥、床、過濾器和凈化器)的健康和效力。除了改進(jìn)的有機(jī)物去除率，過氧合酶還可以通過解毒流入物和降低CODBOD比來增加甲烷生成。在第三種情況中，過氧合酶活性可以用于還原工業(yè)流出物中存在的殘余過氧化物，并伴隨本地的物質(zhì)的氧化。在第四種情況中，過氧合酶活性可以用于改善初級和二級/生物污泥的絮凝性質(zhì)(flocculatingbehaviour)。通過催化膠體和膠體之間以及膠體和較大絮凝物之間共價(jià)橋鍵的形成，可以降低用于在常規(guī)脫水(例如增稠器(thickener)、壓榨機(jī)(press)、床、離心機(jī)(centrifuge)、板框(plateandframe)等)之前調(diào)節(jié)污泥的化學(xué)品的量和/或可以改善在加入或不加入化學(xué)品時(shí)污泥的脫水性質(zhì)。酶促油處理中的過氧合酶應(yīng)用石油產(chǎn)品是能量和原料最重要的來源；然而，隨著世界油儲量逐漸稀缺，重質(zhì)原油和浙青沉積物(bituminousdeposit)將不得不伴隨可再生能源方面的多種開發(fā)而被利用。重質(zhì)原油高度粘稠并且難以提取此外重質(zhì)原油含有大量硫、氮、芳族化合物和重金屬；必需在利用之前減少的化合物。在石油精煉中利用生物技術(shù)，特別是基于氧化還原酶的技術(shù)的不同的潛在應(yīng)用由Ayala，M.等(BiocatalysisandBiotransformation,2007,252,114-129)描述。不同的實(shí)施方案在下文進(jìn)一步描述浙青烯被定義為石油中不溶于N-鏈烷烴但是溶于甲苯的部分。認(rèn)為浙青烯級分是造成不想要的油性質(zhì)的主要原因，所述不想要的油性質(zhì)如高粘度和形成乳劑、聚合物和焦炭(coke)的傾向。氮、氧和硫雜原子作為非雜環(huán)或雜環(huán)基團(tuán)存在。此外，可以發(fā)現(xiàn)大量卟啉(石油卟啉)含有鎳和釩。使用過氧合酶使浙青烯改性將具有一系列有益效果增加的水溶性、增加的沸點(diǎn)、更低的分子間相互作用、更低的粘度和改善的生物反應(yīng)性。因此，過氧合酶可以在提高等級(upgrading)之前應(yīng)用，致使粘度降低并減少對溶劑的需要和焦炭的形成。與氧化還原酶，特別是漆酶、酚氧化酶、鹵過氧化物酶和過氧化物酶，或微生物，特別是紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)或類似的細(xì)菌細(xì)胞組合的或連續(xù)的(subsequent)反應(yīng)將進(jìn)一步增強(qiáng)改性或降解。所述處理可以在脫鹽之前進(jìn)行，與脫鹽組合進(jìn)行，或在后續(xù)加工過程中或之后進(jìn)行，所述后續(xù)加工如真空蒸餾、加氫處理器(hydrotreater)、氫化裂解器或流體催化裂解器?？梢匀芜x地應(yīng)用在水中的兩相體系或水混溶性溶劑。精煉燃料中芳族化合物的存在導(dǎo)致不完全燃燒和伴隨的顆粒物的形成。多環(huán)芳烴被認(rèn)為有潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)，原因是它們的致癌活性和誘變活性。用過氧合酶處理多環(huán)芳烴產(chǎn)生與親本化合物相比可溶性更好并且誘變性顯著更低的產(chǎn)物。重金屬離子如釩和鎳天然存在于300ppm或更大的數(shù)量級的加拿大油砂浙青中。已知這些離子通過與浙青中稱為石油卟啉的生物標(biāo)志物螯合而緊密結(jié)合(holdtightly)。金屬離子對于浙青的等級提高有害，因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生損害(poison)在裂解和加氫處理過程中使用的下游催化劑的作用。石油中的重金屬引起兩個(gè)其它的主要問題。一是高濃度的金屬氧化物形成灰，造成廢物處置的問題。二是催化性裂解過程中對催化劑的損害使選擇性和活性減少。目前，沒有緩解這些問題的補(bǔ)救方法；目前的實(shí)踐是利用大體積的催化劑。已經(jīng)研究過在精煉工業(yè)中使用生物技術(shù)，盡管尚不知曉有商業(yè)應(yīng)用。在二十世紀(jì)九十年代早期據(jù)Fedorak等顯示，一種來自C.fumago的稱為氯過氧化物酶(CPO)的血紅素過氧化物酶(heme-peroxidase)能夠通過使石油卟啉的氧化開環(huán)來破壞金屬離子的螯合。然后將釋放的金屬離子從有機(jī)層提取至水層中，與浙青分開。在二十世紀(jì)九十年代后期，Torres和Vazquez-Duhalt證明了使用細(xì)胞色素C(一種具有過氧化物酶-樣活性的小血紅素蛋白)的類似的反應(yīng)性。盡管這些酶顯示了令人感興趣的針對石油卟啉的活性，但是它們具有數(shù)個(gè)將使它們不可能用于大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用的缺點(diǎn)。首先，在它們的底物(例如過氧化氫)的存在下，所述酶本身開始被氧化并喪失活性。已知血紅素活性位點(diǎn)被H2O2氧化；這些酶在ImMH2O2中的半衰期以分鐘計(jì)。其次，酶表達(dá)水平非常低。用過氧合酶處理油、浙青、浙青烯或石油卟啉顯著降低重金屬的含量，特別是鎳和釩的含量。所述處理可優(yōu)選在催化裂解器之前的任何階段進(jìn)行。關(guān)于液態(tài)烴燃料的規(guī)定一直要求較低的硫含量。傳統(tǒng)的脫硫在氫化處理過程中進(jìn)行，其中還減少或去除氮、氧和砷化合物。過氧合酶處理能夠顯著降低硫含量，特別是如果后面為蒸餾步驟。所述處理可以在脫鹽之前進(jìn)行，與脫鹽組合進(jìn)行，或在后續(xù)加工過程中或之后進(jìn)行，所述后續(xù)加工如真空蒸餾、加氫處理器、氫化裂解器或流體催化裂解器。真菌過氧合酶在藥物/化學(xué)合成中的應(yīng)用類似于細(xì)胞色素P450酶，過氧合酶可以用于多種化學(xué)品的化學(xué)合成，所述化學(xué)品包括活性藥物成分和中間體，并且具體而言過氧合酶可以有利地用于光學(xué)純的手性化合物的合成。這類可能由過氧合酶催化的反應(yīng)的實(shí)例是·賴希斯坦(Reichstein)S經(jīng)11β-羥基化變?yōu)闅浠傻乃?美國專利No.4353985)·孕酮轉(zhuǎn)化為可的松(類固醇改性/產(chǎn)生)?！拿婪ニ?compactin)生成Pravastin(—種抗膽固醇藥物)(Biotechnol.Lett.2003,25，1827)?！-2-苯氧基丙酸在4-位羥基化?！ぷ詸幟?Iimone)使用P450酶生成抗癌藥紫蘇醇(perillylalcohol)(App1.Environ.Microbiol.2005，71，1737)。特別適合的是含有吡啶、吡咯、吡咯烷(pyrro11idine)、哌啶、咪唑、噻唑、嗎啉或嘧啶的N-氧化形式的化合物(來源參考(SourceRefs):J.B.vanBeilen，等，TrendsBiotechnol.，2003，21，170.和V.B.UrlacherandS.Eiben,TrendsBiotechnol.，2006，24，324)。過氧合酶在洗滌劑組合物中的應(yīng)用本發(fā)明的過氧合酶酶可以加入洗滌劑組合物并由此稱為洗滌劑組合物的組分?？梢詫⒈景l(fā)明的洗滌劑組合物例如配制為手洗或機(jī)洗的洗衣洗滌劑組合物，包括適于預(yù)處理沾污織物的洗衣添加劑組合物和添加了漂洗劑的織物柔軟劑組合物，或?qū)⑵渑渲茷橛糜谕ǔ＜彝ビ脖砻媲謇聿僮鞯南礈靹┙M合物，或配制用于手洗或機(jī)洗的洗碗(dishwashing)操作。在具體的方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的酶的洗滌劑添加劑。所述洗滌劑添加劑以及洗滌劑組合物可以包含一種或多種其它的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶(arabinase)、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶，和/或過氧化物酶。通常所選酶的性質(zhì)應(yīng)該與選擇的洗滌劑相容(即，最適pH，與其它酶和非酶成分的兼容性等)，并且所述酶應(yīng)該以有效量存在。蛋_:合適的蛋白酶包括動物、植物或微生物來源的那些。微生物來源是優(yōu)選的。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程的突變體。所述蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實(shí)例是枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)，特別是源自芽孢桿菌屬的那些，例如，枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(在WO89/06279中描述)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實(shí)例是胰蛋白酶(例如，豬或牛來源)和鐮孢屬蛋白酶，在WO89/06270和WO94/25583中描述。有用的蛋白酶的實(shí)例是在WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116和WO98/34946中描述的變體，特別是在一個(gè)或多個(gè)以下位置具有取代的變體27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274-參考具體序列和位置。優(yōu)選的商業(yè)上能夠獲得的蛋白酶包括Alcalase、Savinase,Primase,Duralase、Esperase禾口Kannase(NovozymesA/S)、Maxatase、Maxacal、Maxapem、Properase,Purafect,PurafectOxP、FN2和FN3(GenencorInternationalInc.)。MM:合適的脂肪酶包括細(xì)菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程的突變體。有用的脂肪酶的實(shí)例包括來自如下的脂肪酶腐質(zhì)霉屬(同物異名嗜熱霉屬(Thermomyces))，例如，來自疏棉狀腐質(zhì)霉(細(xì)毛嗜熱霉(T.Ianuginosus))如EP258068和EP305216中所述，或來自特異腐質(zhì)霉如W096/13580中所述，假單胞菌屬脂肪酶，例如，來自產(chǎn)堿假單胞菌(P.alcaligenes)或類產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218272)、洋蔥假單胞菌(P.cepacia)(EP331376)、施氏假單胞菌(P.stutzeri)(GB1，372，034)、熒光假單胞菌(P.fluorescens)、假單胞菌屬菌種菌株SD705(W095/06720和W096/27002)、P.wisconsinensis(W096/12012)，芽孢桿菌屬脂肪酶，例如,來自枯草芽孢桿菌(Dartois等，1993，BiochemicaetBiophysicaActa,1131:253_360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64/744992)或短小芽孢桿菌(W091/16422)的脂肪酶。其它實(shí)例是例如在WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中描述的那些脂肪酶變體。優(yōu)選的商業(yè)上能夠獲得的脂肪酶包括Lipolase和LipolaseUltra(NovozymesA/S)。淀粉酶合適的淀粉酶(α和/或β)包括細(xì)菌和真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的變體。淀粉酶包括例如從芽孢桿菌屬獲得的α-淀粉酶，例如，地衣芽孢桿菌的特殊菌株，在GB1，296，839中有更詳細(xì)的描述。有用的淀粉酶的實(shí)例是在WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO97/43424中描述的變體，特別在一個(gè)或多個(gè)以下位置具有取代的變體15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444——參考具體序列和位置。商業(yè)上能夠獲得的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、Fungamyl和BAN(NovozymesA/S)、Rapidase禾口Purastar(GenencorInternationalInc.)。纖維素酶合適的纖維素酶包括細(xì)菌或真菌來源的那㈣。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程的突變體。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢屬、梭孢殼屬、枝頂孢霉屬菌屬的纖維素酶，例如，產(chǎn)生自特異腐質(zhì)霉、嗜熱毀絲霉和尖鐮孢的真菌纖維素酶，其公開于US4，435，307、US5，648，263、US5，691，178、US5，776，757和WO89/09259。特別合適的纖維素酶是堿性或中性纖維素酶，其具有保護(hù)顏色的益處(colourcarebenefits)。這種纖維素酶的實(shí)例是在EPO495257、EPO531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中描述的纖維素酶。其它實(shí)例是纖維素酶變體，例如在WO94/07998、EP0531315、US5，457，046、US5,686，593、US5，763，254、WO95/24471、WO98/12307和WO1999/001544中描述的那些。商業(yè)上能夠獲得的纖維素酶包括Celluzyme和CarezymeTM(NovozymesA/S)、Clazinase和PuradaxHA(GenencorInternationalInc.),和KAC-500(B)(KaoCorporation)。過氧化物酶/氧化酶合適的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細(xì)菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程的突變體。有用的過氧化物酶的實(shí)例包括來自鬼傘屬的過氧化物酶，例如，來自灰蓋鬼傘(C.cinereus)的過氧化物酶，及其變體，如在WO93/24618、WO95/10602和WO98/15257中描述的那些。商業(yè)上能夠獲得的過氧化物酶包括Guardzyme(NovozymesA/S)。通過添加含有一種或多種酶的單獨(dú)的添加劑，或通過添加包含所有這些酶的組合添加劑可將洗滌劑酶包括在洗滌劑組合物中。可將本發(fā)明的洗滌劑添加劑(即單獨(dú)的添加劑或組合的添加劑)配制成例如，顆粒(granulate)、液體、漿等。優(yōu)選的洗滌劑添加劑劑型是顆粒，具體為無粉塵(non-dusting)顆粒，液體，具體為穩(wěn)定的液體，或漿。例如，可以如US4，106，991和4，661，452中所公開的產(chǎn)生無粉塵顆粒，并且可以任選地通過本領(lǐng)域已知的方法包覆。蠟制包覆材料(waxycoatingmaterial)的實(shí)例是具有1000至20000的平均摩爾質(zhì)量的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)品(聚乙二醇，PEG)；具有從16至50個(gè)的環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有從12至20個(gè)碳原子，并且其中具有15至80個(gè)環(huán)氧乙烷單元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的單-和二-和三甘油酯。適合于流化床技術(shù)應(yīng)用的成膜涂覆材料的實(shí)例提供于GB1483591。例如，可根據(jù)已經(jīng)建立的方法通過添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸來穩(wěn)定液體酶制備物?？梢愿鶕?jù)公開于EP238，216中的方法來制備保護(hù)酶。本發(fā)明的洗滌劑組合物可以是任何方便的形式，例如，條(bar)、片劑、粉末、顆粒、糊劑或液體。液體洗滌劑可以是含水的，通常含有多至70%的水和0-30%的有機(jī)溶劑，或非水的(non-aqueous)。所述洗滌劑組合物包含一種或多種表面活性劑，其可以是非離子的，包括半極性的和/或陰離子的和/或陽離子的和/或兩性離子的。所述表面活性劑通常以按重量計(jì)0.至60%的水平存在。當(dāng)包括于此時(shí)，所述洗滌劑將通常含有約1%至約40%的陰離子表面活性劑，如線性烷基苯磺酸鹽(alkylbenzenesulfonate)、α-烯烴磺酸酯(alpha-olefinsulfonate)、烷基硫酸鹽(alkylsulfate)(脂肪醇硫酸酯(fattyalcoholsulfate))、醇乙氧基硫酸鹽(alcoholethoxysulfate)、仲鏈燒磺酸鹽(secondaryalkanesulfonate)>α-磺基月旨肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸，或肥皂(soap)。當(dāng)包括于此時(shí)，洗滌劑將通常含有約0.2%至約40%的非離子表面活性劑，如月旨肪醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基聚糖苷(alkylpolyglycoside)、烷基二甲基氧化胺(alkyldimethylamineoxide)、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺(ethoxylatedfattyacidmonoethanolamide)、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺(glucamide)”)。所述洗滌劑可以含有0-65%的洗滌劑增清劑或絡(luò)合劑例如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸酯(phosphonate)、碳酸鹽(carbonate)、檸檬酸鹽、氮川三乙酸(nitrilotriaceticacid)、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶硅酸鹽或分層硅酸鹽(例如來自Hoechst的SKS-6)。所述洗滌劑可包含一種或多種聚合物。實(shí)例是羧甲基纖維素、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸酯(polycarboxylates)如聚丙烯酸酯(polyacrylates)、馬來酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。所述洗滌劑可以含有漂白體系，其可以包含H2O2源如過硼酸鹽或過碳酸鹽，其可以與形成過酸的漂白激活劑如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯磺酸(nonanoyloxybenzenesulfonate)組合?；蛘撸左w系可以包含過氧酸，例如，酰胺、酰亞胺(imide)或砜類型的過氧酸。本發(fā)明的洗滌劑組合物的酶可以使用常規(guī)穩(wěn)定劑穩(wěn)定，例如，多元醇如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如，芳香硼酸酯，或苯基硼酸(Phenylboronicacid)衍生物如4-甲酰苯基硼酸(4-formylphenylboronicacid)，并可例如WO92/19709和WO92/19708中所述配制所述組合物。所述洗滌劑還可以含有其它常規(guī)洗滌劑成分，例如，織物整理劑(fabricconditioner)包括粘土、泡沫促進(jìn)劑、抑泡劑、防腐蝕劑、懸污劑、防污物再沉積劑、染料、殺菌劑、光學(xué)增亮劑(opticalbrightener)、水溶助劑(hydrotrope)、晦暗抑制劑(tarnishinhibitors)或香料。目前預(yù)期在洗滌劑組合物中的任何酶，特別是本發(fā)明的酶，可以按相當(dāng)于每升洗滌液0.Ol-IOOmg酶蛋白，優(yōu)選每升洗滌液0.05-5mg酶蛋白，特別是每升洗滌液0.I-Img酶蛋白的量添加。本發(fā)明的酶可以額外地并入公開于WO97/07202的洗滌劑配制物，W097/07202在本文中作為參考文獻(xiàn)并入。本申請所描述并要求保護(hù)的發(fā)明不應(yīng)受限于本申請公開的具體方面的范圍，因?yàn)檫@些實(shí)施方案意在說明本發(fā)明的某些方面。本發(fā)明的范圍意圖包括任何等同的方面。事實(shí)上，除了本申請明示和描述的那些之外，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)前文的描述顯然能想到本發(fā)明的各種修改形式。隨附權(quán)利要求書的范圍也意圖包括這樣的修改形式。如有沖突，當(dāng)以包括定義在內(nèi)的本申請公開內(nèi)容為準(zhǔn)。實(shí)施例實(shí)施例1.從柱狀田頭菇和輻毛鬼傘克隆過氧合酶基因之前描述過關(guān)于柱狀田頭菇過氧化物酶(Ullrich等，2004，Appl.Env.Microbiol.70(8):4575_4581)和輻毛鬼傘過氧化物酶(Anh等，2007，ApplEnvMicrobiol73(17)=5477-5485)的培養(yǎng)條件、活性測量和酶的純化。核酸的分離和cDNA合成通過從振蕩培養(yǎng)物進(jìn)行過濾獲得了輻毛鬼傘(菌株DSMZ888，培養(yǎng)12天)和柱狀田頭菇(菌株TM-A1-K，培養(yǎng)16天)的菌絲體(具體培養(yǎng)條件見上文描述)。在后續(xù)凍干之后(Alpha2-4凍干器，Christ，Osterode，Germany)，使用先前描述的規(guī)程(Nikolcheva和Barlocher,2002)分離了基因組DNA。使用Trizol試劑(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)分離總RNA，將總RNA儲存在_80°C。為了cDNA合成，將總RNA(1.0微克)使用聚T-錨定引物(輻毛鬼傘為聚T-錨定2-引物)引發(fā)(prime)。之后，通過使用“RevertAidHMinusM-MuLV”逆轉(zhuǎn)錄酶(Fermentas,St.Leon-Rot,Germany)將總mRNA逆轉(zhuǎn)錄成帶有添加至3'端的錨定序列的cDNA；再通過向反應(yīng)混合物加入1微升TS-短引物(10微摩爾)，向cDNA的5，端添加錨定序列，其中使用依據(jù)Matz等(1999)的規(guī)程。PCR條件對于PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增應(yīng)用“MasterCyclerEPGradientS”梯度循環(huán)儀(Eppendorf,Hamburg,Germany)。全部弓I物獲得自MWGBiotech(Ebersberg,Germany)。用于cDNA合成、3，RACE(rapidamplificationofcDNAends(cDNA末端的快速擴(kuò)增))和5’RACE實(shí)驗(yàn)的引物列于表1。簡并引物列于表2。用于AaP基因的特異性引物列于表3。用1100稀釋的PCR產(chǎn)物進(jìn)行嵌套式PCR。表1用于cDNA合成、3'和5'RACE的引物。弓丨物序列按照IUPAC核苷酸編碼書寫，字母“rg”代表核糖核苷酸鳥苷。<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>表2簡并引物按照IUPAC核苷酸編碼書寫，字母‘i’代表肌苷擺動堿基。<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>表3用于AaP基因的特異性引物。引物名稱加下劃線以區(qū)別簡并的和特異性的AaP引物<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>PCR反應(yīng)(25微升)含有10微升PCRMasterMix(HotMasterMix,2.5_倍濃縮的；5Prime，Hamburg,Germany)，1微升的各引物，在特異性引物的情況下引物來自10微摩爾母液，而對于簡并引物來自100微摩爾母液，1微升的cDNA和PCR等級的水。PCR以95°C3分鐘的初始變性開始，然后是35個(gè)循環(huán)的95°C變性45秒、在52.7。C(若為簡并引物)或依據(jù)“4+2規(guī)則”的溫度(Rychlik和Rhoads(1989)，若為特異性引物)退火45秒和72°C延伸1分30秒。最終延伸在72°C持續(xù)10分鐘。將所得PCR產(chǎn)物純化(SureClean,Bioline,Luckenwalde,Germany)并克隆?？私怠y序和序列分析通過菌落PCR驗(yàn)證了源自使用pSTBlue-1AccepTor載體試劑盒46(Merck(Novagen),Darmstadt,Germany)進(jìn)行的PCR片段的dU/A_克隆的質(zhì)粒，并將數(shù)個(gè)獨(dú)立的克隆用于測序。測序在ALFexpressII設(shè)備上聯(lián)合AutoReadSequencing試劑盒(bothGEHealthcare,Munich,Germany)進(jìn)行。使用軟件BioEdit7.0進(jìn)行序列分析和多重比對(Hall,1999,NucleicAcidsSympSer41,95-98)。輻毛鬼傘基于對N-末端的肽序列和一個(gè)內(nèi)部肽片段的知識，對cDNA使用了簡并引物以部分?jǐn)U增輻毛鬼傘(菌株DMSZ888)中鹵過氧化物酶基因的片段。將源自應(yīng)用簡并引物Copl-For和Cop6-Rev的初始PCR產(chǎn)物(大小約700bp)純化、克隆，對一個(gè)克隆進(jìn)行測序(SEQIDNO:15)，并且通過基礎(chǔ)局部比對查找工具(BLAST)檢索鑒定為與CP0序列同源。為了獲得所述cDNA的3'端，進(jìn)行cDNA末端的快速擴(kuò)增(3'RACE)。將AP2-引物與簡并引物Cop5-For組合使用從cDNA擴(kuò)增片段(約500bp)，將所述片段克隆并在之后進(jìn)行完整測序(SEQIDNO17)(三個(gè)獨(dú)立克隆)。柱狀田頭菇基于對N-末端的肽序列和5個(gè)內(nèi)部肽片段的知識，對cDNA使用了簡并引物以擴(kuò)增柱狀田頭菇(菌株TM-A1-K)中鹵過氧化物酶基因的片段。一個(gè)初始PCR產(chǎn)物源自簡并引物Aapl-For和Aap6_Rev的應(yīng)用(大小約880bp)。分別通過使用以AaPl-For和AP引物進(jìn)行的PCR(約1200bp)和通過使用以AaP4-For和AP引物進(jìn)行的PCR(嵌套式PCR，約650bp)生成了兩種3，RACE-PCR產(chǎn)物。從瓊脂糖凝膠純化全部三種片段，進(jìn)行純化和克隆。對數(shù)個(gè)獨(dú)立克隆進(jìn)行完整測序；將全部序列組裝成合成序列。通過基礎(chǔ)局部比對查找工具(BLAST)檢索將所述合成序列鑒定為與CP0序列同源的。使用特異性引物混合物SO-Mix(含有90%踵-特異性引物和10%踵-載體引物，10微摩爾)和簡并引物AaP4-ReV進(jìn)行5，RACE。然后在使用S0_Mix和簡并引物AaP2-ReV的嵌套式PCR中使用稀釋的PCR產(chǎn)物。將所得的約350bp的條帶從凝膠切下、純化并克隆。對數(shù)個(gè)獨(dú)立克隆進(jìn)行完整測序。發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)不同但是同源的序列。一個(gè)序列與已知的合成序列重疊并且補(bǔ)全了AaPl基因的cDNA序列。基于此數(shù)據(jù)，為AaPl基因和AaP2基因二者設(shè)計(jì)了特異性引物。在cDNA水平用引物組合lAaP-Forl和lAaP~Rev4進(jìn)行PCR產(chǎn)生了AaPl基因的完整全長cDNA序列片段?？寺〈似尾σ粋€(gè)克隆進(jìn)行完整測序(SEQIDN0:1)。將這個(gè)克隆作為大腸桿菌NN049991在2008年3月14日以登錄號DSM21289保藏在DSMZ。為了在cDNA水平完成AaP2基因，進(jìn)行了3，RACE使用引物組合2AaP_Forl和AP引物的PCR產(chǎn)生了約1300bp的長片段。也對這個(gè)片段進(jìn)行克隆，對兩個(gè)克隆進(jìn)行完整測序并揭示了AaP2的全部cDNA序列(SEQIDN02)。將這個(gè)克隆作為大腸桿菌NN049992在2008年3月14日以登錄號DSM21290保藏在DSMZ。在完成cDNA序列之后，在PCR中使用特異性引物擴(kuò)增AaP基因的基因組片段。使用引物組合!AaP-For2和!AaP-Rev4從基因組DNA擴(kuò)增AaPl的基因區(qū)(約1400bp)，其編碼不含信號肽的成熟蛋白并且也包含完整3’UTR。使用引物組合2AaP-Forl和2AaP-Rev2從基因組DNA擴(kuò)增AaP2基因的完整⑶S和3，UTR(約1500bp)。將兩種PCR產(chǎn)物純化、克隆并且對至少兩個(gè)獨(dú)立克隆進(jìn)行完整測序。實(shí)施例2.真菌過氧合酶的氨基酸基序特征我們分析了AaPl和AaP2的全長過氧合酶氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)它們是獨(dú)特的，因?yàn)槌墒祀男蛄锌梢钥醋靼瑑蓚€(gè)結(jié)構(gòu)域。AaPl氨基酸序列(SEQIDNO2)的前一半與氯過氧化物酶CP0令人信服地良好比對(alignconvincelywell)。AaPl肽后面的C末端一半不與數(shù)據(jù)庫中的任何氨基酸享有同源性，除了經(jīng)由基因組測序鑒定的蠟?zāi)?Laccaria)和灰蓋鬼傘推定的開放閱讀框序列之外。非常有可能兩個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)是這類過氧合酶的明顯特征，其中N末端一半與已知的氯過氧化物酶共享相似性，而C末端部分則沒有。在圖4A-D中我們已經(jīng)將本文推導(dǎo)的氨基酸序列與多個(gè)相似的序列進(jìn)行了比對，并且鑒定了一些辨識性保守基序。用于基序搜索的圖式是基于PR0SITE數(shù)據(jù)庫中使用的圖式的形式，區(qū)別在于字母之間的終止點(diǎn)'和連字符'是任選的。來自PR0SITE文件的PR0SITE形式定義遵循使用用于氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)IUPAC單字母編碼。對于接受任何氨基酸的位置使用符號、‘。通過在方括號、[]‘之間列出對于給定位置可接受的氨基酸來表明模糊性(ambiguity)。例如[ALT]代表Ala或Leu或Thr。模糊性也通過在一對大括號、{}’之間列出在給定位置不接受的氨基酸來表明。例如{AM}表示除了Ala和Met的任何氨基酸。圖式中的每個(gè)元素通過與其相鄰的元素分開。(在patmatdb和fuzzpro中是任選的)。圖式中元素的重復(fù)可以通過按照元素加上圓括號內(nèi)的數(shù)值或數(shù)值范圍的方式來表明。例如x(3)相當(dāng)于x-x-x，x(2，4)相當(dāng)于x-x或x-x-x或x—m。當(dāng)圖式限于序列的N_末端或C_末端時(shí)，該圖式以、‘符號起始或各自以彳'符號結(jié)束。以句號結(jié)束圖式。(在patmatdb和fuzzpro中是任選的)。為了排除經(jīng)典的氯過氧化物酶，我們將我們的搜索限制在所比對的過氧合酶蛋白C-末端一半的保守基序。我們鑒定出以下保守基序?qū)τ诓檎疫^氧合酶非常有用基序I[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N(SEQIDNO40)基序II:G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH][LF]R(SEQIDNO41)基序III:RXXRI[QE][DEQ]S[IM]ATN(SEQIDNO42)基序IV:S[IM]ATN[PG][EQN][FM][SDN][FL](SEQIDNO43)基序V:P[PDK][DG]F[HFW]R[AP](SEQIDNO:44)基序VI:[TI]XXXLYPNP[TK][GV](SEQIDNO45)可以將這些基序或序型(profile)輸入搜索程序(例如Fuzzpro)中，用于鑒定新的真菌過氧合酶(Fuzzpro由AlanBleasby,EuropeanBioinformaticsInstitute,WellcomeTrustGenomeCampus,Hinxton,CambridgeCB101SD,UK編寫)。Fuzzpro是EMBOSS軟件包的一部分(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite(2000),Rice,P.Longden,I.禾口Bleasby,A.TrendsinGenetics16,(6)pp276—277)。表4中所示的百分比同一性矩陣是基于對序列表中所列的過氧合酶氨基酸序列進(jìn)行“全部對全部”比對來計(jì)算的。矩陣中第i行第j列的條目是作為序列i和序列j之間的比對中精確匹配數(shù)除以比對的總長度減去比對中缺口的總長度的差來計(jì)算的。每個(gè)比對使用來自EMBOSS軟件包(http//www,emboss,org)版本2.8.0的Needle程序進(jìn)行。程序Needle執(zhí)行Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(J.Mol.Biol.,1970,48:443_453)；和Kruskal,J.B.(1983)Anoverviewofsequencecomparison于D.Sankoff禾口J.B.Kruskal,(編輯)，Timewarps,stringeditsandmacromolecules:thetheoryandpracticeofsequencecomparison，第1-44頁AddisonWesley中描述的全局比對算法。所述比對使用以下參數(shù)缺口產(chǎn)生罰分10.00缺口延伸罰分0.50取代矩陣BL0SUM62表4.序列表中所列過氧合酶氨基酸序列的對稱％同一性矩陣<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>100實(shí)施例3.構(gòu)建曲霉屬重組表達(dá)宿主編碼AaPl和AaP2的完整開放閱讀框的cDNA序列分別列于SEQIDN0，s:1和3中。設(shè)計(jì)PCR引物來擴(kuò)增從ATG起始密碼子直到終止密碼子的完整開發(fā)閱讀框。合成的引物具有與Hindlll-BamHI切割的pDaul09曲霉屬表達(dá)載體克隆位點(diǎn)邊界同源的15個(gè)堿基對的5，序列。pDaul09在W02005042735中記載，將其通過提述并入本文。因此所述引物由兩個(gè)區(qū)組成，一個(gè)區(qū)是過氧合酶特異性的并且具有大約50度或更高的退火溫度，以及在限制酶邊界處與表達(dá)質(zhì)粒同源的15個(gè)堿基對。質(zhì)粒pDaul09是經(jīng)BamHI和Hindlll雙重消化的，而所述載體是通過瓊脂糖凝膠電泳并使用IIlustraDNA和凝膠條帶純化試劑盒(GEHealthcare)自填充片段(stufferfragment)純化的。引物如下所示引物AaPlF5acacaactRRRRatccaccatRaaatacttcaRcctRttc(SEQIDNO46)引物AaPIR5agatctcgagaagcttaatctcgcccgtacgggaat(SEQIDNO47)引物AaP2F:5’acacaactggggatccaccatgaaatattttcccctgttcc(SEQIDNO48)引物AaP2R5agatctcgagaagcttaatctcgcccgtatgggaag(SEQIDNO49)引物中帶下劃線的部分被設(shè)計(jì)成與載體中的克隆位點(diǎn)重疊，并且為稍后的InFusion克隆所需。用于生成表達(dá)盒的PCR反應(yīng)如下進(jìn)行使用PhusionHotStart高保真DNA聚合酶(F-540,NewEnglandBiolabs)系統(tǒng)從cDNA質(zhì)粒擴(kuò)增表達(dá)盒。使用用于富含GC的模板的緩沖液代替標(biāo)準(zhǔn)緩沖液。使用MJResearchPTC-200DNA引擎進(jìn)行所述PCR反應(yīng)。使用以下條件GC5X緩沖液10微升20mMdNTP1微升引物F1微升引物R1微升DNA模板10ng1微升dH2035.5微升PhusionHot(2u/ul)0.5微升PCR稈序95°C30秒25個(gè)循環(huán)的98°C10秒50°C20秒72°C30秒最終在72°C延伸10分鐘在PCR程序結(jié)束之后將所述反應(yīng)冷卻至10°C。將各種PCR產(chǎn)物25微升在1%瓊脂糖TBE凝膠上運(yùn)行，并且使用IllustraDNA和凝膠條帶純化試劑盒(GEHealthcare)純化PCR單條帶。于是經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物準(zhǔn)備好進(jìn)行克隆。使用克隆用的InFusion系統(tǒng)來將所述片段克隆入制備的載體(BDBiosciences)中?？寺∫?guī)程完全遵循InFusion用戶說明中所述。按照規(guī)程將經(jīng)處理的質(zhì)粒和插入物轉(zhuǎn)化入InFusionBlue大腸桿菌細(xì)胞并且涂布在含有50mg/升氨芐青霉素的LB上。在37°C溫育過夜之后，在LB氨芐青霉素平板上觀察到在選擇下生長的菌落。將10個(gè)AaPl構(gòu)建體的菌落和10個(gè)AaP2構(gòu)建體的菌落在含有50mg/ml氨芐青霉素的液體LB中培養(yǎng)，并且依據(jù)JETQUICKPlasmidPurificationSpin試劑盒流程(Genomed)分離質(zhì)粒。將分離的質(zhì)粒用載體引物測序以確定沒有PCR錯誤的代表性質(zhì)粒表達(dá)克隆。選擇了一個(gè)無錯的AaPl克隆和一個(gè)無錯的AaP2克隆用于進(jìn)一步的工作NP003506:Aapl過氧合酶NP003507:Aap2過氧合酶然后使用JETSTAR2.0PlasmidMini/Midi/Maxi-Protocol(Genomed)分離質(zhì)粒DNA。由此依據(jù)W02005/042735第34-35頁(通過提述并入本文)的方法將純化的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化入標(biāo)準(zhǔn)真菌表達(dá)宿主，例如米曲霉。然后在小(200ml)或非常大(超過15m3的罐)中發(fā)酵如通過SDSPAGE分析判斷能夠產(chǎn)生重組AaP蛋白的曲霉屬轉(zhuǎn)化體，以產(chǎn)生足夠的培養(yǎng)液用于后續(xù)過濾、濃縮和/或純化重組產(chǎn)生的酶。實(shí)施例4.克隆雙色蠟?zāi)⑦^氧合酶使用設(shè)計(jì)的引物，例如設(shè)計(jì)用于InFusion克隆的引物，如先前部分中所述，自基因組雙色蠟?zāi)NA(SEQIDN0:5)或來自它的cDNA獲得合適的表達(dá)盒。擴(kuò)增完整開放閱讀框且適合于在pDaul09中表達(dá)的合適引物組如下iH向引物5'acacaactggggatccaccatggctcgccttactttcct(SEQIDNO50)反向引物5，agatctcgagaagcttactttccataagggaagatctg(SEQIDNO51)帶下劃線的序列代表上文詳細(xì)描述的InFusion克隆流程所需的載體序列。所得1167bp片段將與BamHI-Hindlll切割的pDaul09載體具有15bp重疊。在例如米曲霉中的重組表達(dá)如上文中對AaPl和AaP2酶所描述的進(jìn)行。實(shí)施例5.灰蓋鬼傘過氧合酶的克隆使用設(shè)計(jì)的引物，例如設(shè)計(jì)用于InFusion克隆的引物，如先前部分中所述，自基因組灰蓋鬼傘DNA或來自它的cDNA(SEQIDNO，s:7、9、11、13或15)獲得合適的表達(dá)盒。擴(kuò)增過氧合酶之一(SEQIDN0:8)的完整開放閱讀框且適合于在pDaul09中表達(dá)的合適引物組如下正向引物5，acacaactRRRRatccaccatgatctcgacctcgaagca(SEQIDNO52)反向引物5，agatctcgagaagcttaatcactcttgccccaggg(SEQIDNO53)帶下劃線的序列代表上文詳細(xì)描述的InFusion克隆流程所需的載體序列。所得片段將與BamHI-Hindlll切割的pDaul09載體具有15bp重疊。擴(kuò)增過氧合酶之一(SEQIDNO10)的完整開放閱讀框且適合于在pDaul09中表達(dá)的合適引物組如下正向引物5'acacaactRRRRatccaccatRRtttcRtRcaaRctcc(SEQIDNO54)反向引物5，aRatctcRaRaaRcttacagtRtaccatacRRtttca(SEQIDNO55)帶下劃線的序列代表上文詳細(xì)描述的InFusion克隆流程所需的載體序列。所得片段將與BamHI-Hindlll切割的pDaul09載體具有15bp重疊。擴(kuò)增過氧合酶之一(SEQIDNO12)的完整開放閱讀框且適合于在pDaul09中表達(dá)的合適引物組如下正向引物5，acacaactggggatccaccatRaacRRtctRttcRcca(SEQIDNO56)反向引物5，aRatctcRaRaaRcttaRttacRtccRtaRRRRaac(SEQIDNO57)帶下劃線的序列代表上文詳細(xì)描述的InFusion克隆流程所需的載體序列。所得片段將與BamHI-Hindlll切割的pDaul09載體具有15bp重疊。擴(kuò)增過氧合酶之一(SEQIDNO14)的完整開放閱讀框且適合于在pDaul09中表達(dá)的合適引物組如下正向引物5，acacaactggggatccaccatRctcaaaccRCRtRttc(SEQIDNO58)反向引物5'aRatctcRaRaaRcttaatcRtRtccRtaaRRRaaaa(SEQIDNO:59)帶下劃線的序列代表上文詳細(xì)描述的InFusion克隆流程所需的載體序列。所得片段將與BamHI-Hindlll切割的pDaul09載體具有15bp重疊。上文所列各種鬼傘屬過氧合酶在例如米曲霉中的重組表達(dá)如先前部分中對AaPl和AaP2酶所描述的進(jìn)行。實(shí)施例6.通過AaPl酶進(jìn)行的吡啶到吡啶N-氧化物的轉(zhuǎn)化將2mM吡啶溶解在磷酸鉀緩沖水溶液(20mM，pH=7.0)中，并且在24°C與2mMH202(20X100微摩爾)和2U柱狀田頭菇AaPl過氧化物酶(基于藜蘆醇成為藜蘆醛的氧化的單位；Ullrich等，2004，Appl.Environ.Microbiol:70，4575-81)—起以lml的總體積在密閉的玻璃容器中攪拌。反應(yīng)時(shí)間是總共120分鐘(用25mMNaOH結(jié)束反應(yīng))。參考可信的標(biāo)準(zhǔn)品(Fluka)通過保留時(shí)間和UV和質(zhì)譜從這個(gè)反應(yīng)檢測到的產(chǎn)物(收率25%)只有吡啶N-氧化物。層析分離和產(chǎn)物鑒定使用特異性柱(Phenomex協(xié)同4微米融合一RP80A(Phenomexsynergi4micronsFusion-RP80A),150X2mm)禾口AgilentLC-MS-DAD系統(tǒng)進(jìn)行。權(quán)利要求具有過氧合酶活性的分離的多肽，其選自下組(a)包含與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14或SEQIDNO19的多肽具有至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在至少低、中、中-高或高嚴(yán)緊性條件下與下述雜交的多核苷酸編碼的多肽(i)SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15或SEQIDNO17的多肽編碼序列；(ii)SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列中所含cDNA序列或包含SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列；或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；(c)由包含與SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列具有至少60％同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼的多肽；(d)包含以下基序中的一種或多種的多肽基序I[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N(SEQIDNO40)基序IIG[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH][LF]R(SEQIDNO41)基序IIIRXXRI[QE][DEQ]S[IM]ATN(SEQIDNO42)基序IVS[IM]ATN[PG][EQN][FM][SDN][FL](SEQIDNO43)基序VP[PDK][DG]F[HFW]R[AP](SEQIDNO44)基序VI[TI]XXXLYPNP[TK][GV](SEQIDNO45)；和(e)包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14或SEQIDNO19的成熟多肽的變體。2.權(quán)利要求1的多肽，其包含與SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8,SEQIDNO10,SEQIDNO:12、SEQIDNO:14或SEQIDNO:19的成熟多肽具有至少60%同一性的氨基酸序列。3.權(quán)利要求2的多肽，其包含與SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8,SEQIDNO10,SEQIDNO12,SEQIDNO:14或SEQIDNO:19的成熟多肽具有至少65%同一性的氨基酸序列。4.權(quán)利要求3的多肽，其包含與SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8,SEQIDNO10,SEQIDNO12,SEQIDNO:14或SEQIDNO:19的成熟多肽具有至少70%同一性的氨基酸序列。5.權(quán)利要求4的多肽，其包含與SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8,SEQIDNO10,SEQIDNO:12、SEQIDNO:14或SEQIDNO:19的成熟多肽具有至少75%同一性的氨基酸序列。6.權(quán)利要求5的多肽，其包含與SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:(8,SEQIDNO10,SEQIDNO:12、SEQIDNO:14或SEQIDNO:19的成熟多肽具有至少80%同一性的氨基酸序列。7.權(quán)利要求6的多肽，其包含與SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8,SEQIDNO10,SEQIDNO12,SEQIDNO:14或SEQIDNO:19的成熟多肽具有至少85%同一性的氨基酸序列。8.權(quán)利要求7的多肽，其包含與SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8,SEQIDNO10,SEQIDNO12,SEQIDNO:14或SEQIDNO:19的成熟多肽具有至少90%同一性的氨基酸序列。9.權(quán)利要求8的多肽，其包含與SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8,SEQIDNO10,SEQIDNO:12、SEQIDNO:14或SEQIDNO:19的成熟多肽具有至少95%同一性的氨基酸序列。10.權(quán)利要求1的多肽，其包含或其組成為SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO14或SEQIDNO19的氨基酸序列；或其具有過氧合酶活性的片段。11.權(quán)利要求10的多肽，其包含或其組成為SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO14或SEQIDNO19的氨基酸序列。12.權(quán)利要求10的多肽，其包含或其組成為SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO14或SEQIDNO19的成熟多肽。13.權(quán)利要求1的多肽，其由在至少中嚴(yán)緊性條件下與下述雜交的多核苷酸編碼(i)SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO=IUSEQIDNO13,SEQIDN0:15或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列；(ii)SEQIDNO=USEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO=IUSEQIDNO13,SEQIDNO15或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列中所含cDNA序列或包含SEQIDNO=USEQIDN0:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO15或SEQIDN017的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列；或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈。14.權(quán)利要求13的多肽，其由在至少中-高嚴(yán)緊性條件下與下述雜交的多核苷酸編碼(i)SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO11、SEQIDNO:13、SEQIDNO15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列；(ii)SEQIDNOUSEQIDN0:3、SEQIDNO:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIIN0:15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列中所含cDNA序列或包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列；或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈。15.權(quán)利要求14的多肽，其由在至少高嚴(yán)緊性條件下與下述雜交的多核苷酸編碼(i)SEQIDN0:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO=IUSEQIDN0:13、SEQIDN0:15或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列；(ii)SEQIDNO=USEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO=IUSEQIDNO:13、SEQIDNO15或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列中所含cDNA序列或包含SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列；或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈。16.權(quán)利要求1的多肽,其由包含與SEQIDNO=USEQIDNO3,SEQIDN0:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列具有至少60%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼。17.權(quán)利要求16的多肽，其由包含與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列具有至少65%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼。18.權(quán)利要求17的多肽，其由包含與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO=IUSEQIDNO13,SEQIDN0:15或SEQIDN0:17的成熟多肽編碼序列具有至少70%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼。19.權(quán)利要求18的多肽，其由包含與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列具有至少75%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼。20.權(quán)利要求19的多肽，其由包含與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列具有至少80%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼。21.權(quán)利要求20的多肽，其由包含與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列具有至少85%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼。22.權(quán)利要求21的多肽，其由包含與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列具有至少90%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼。23.權(quán)利要求22的多肽，其由包含與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO=IUSEQIDNO13,SEQIDN0:15或SEQIDN0:17的成熟多肽編碼序列具有至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼。24.權(quán)利要求1的多肽，其由如下多核苷酸或其編碼具有過氧合酶活性的片段的亞序列編碼，所述多核苷酸包含或其組成為SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO:17的核苷酸序列。25.權(quán)利要求24的多肽，其由如下多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或其組成為SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO13,SEQIDN0:15或SEQIDNO17的核苷酸序列。26.權(quán)利要求24的多肽，其由如下多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或其組成為SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO13、SEQIDNO15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列。27.權(quán)利要求1的多肽，其包含以下基序中的一種或多種基序I:[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N(SEQIDNO40)基序II:G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH][LF]R(SEQIDNO41)基序IIIRXXRI[QE][DEQ]S[IM]ATN(SEQIDNO42)基序IV:S[IM]ATN[PG][EQN][FM][SDN][FL](SEQIDNO43)基序V:P[PDK][DG]F[HFff]R[AP](SEQIDNO44)基序VI[TI]XXXLYPNP[TK][GV](SEQIDNO45)。28.權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽是包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO10,SEQIDN0:12、SEQIDNO:14或SEQIDNO19的成熟多肽的變體。29.權(quán)利要求1的多肽，其由如下質(zhì)粒中所含多核苷酸編碼，所述質(zhì)粒包含在根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款在2008年3月14日以登錄號DSM21289保藏在DSMZ的大腸桿菌NN049991中；或所述多肽由如下質(zhì)粒中所含多核苷酸編碼，所述質(zhì)粒包含在根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款在2008年3月14日以登錄號DSM21290保藏在DSMZ的大腸桿菌NN049992中。30.權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)的多肽，其中所述成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸1-330。31.權(quán)利要求1-30中任一項(xiàng)的多肽，其中所述成熟多肽編碼序列是SEQIDN0:1的核苷酸152-1141。32.分離的多核苷酸，其包含編碼權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列。33.權(quán)利要求32的分離的多核苷酸，其在SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDN0:7、SEQIDNO:9、SEQIDN0:11、SEQIDN0:13、SEQIDN0:15或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列中包含至少一個(gè)突變，其中所述突變核苷酸序列編碼SEQIDNO:2、SEQIDN0:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14或SEQIDNO19的成熟多肽。34.核酸構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求32或33的多核苷酸，所述多核苷酸與一個(gè)或數(shù)個(gè)指導(dǎo)多肽在表達(dá)宿主中生成的調(diào)控序列可操作地連接。35.重組表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求34的核酸構(gòu)建體。36.重組宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求34的核酸構(gòu)建體。37.產(chǎn)生權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。38.產(chǎn)生權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含含有編碼所述多肽的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體；和(b)回收所述多肽。39.產(chǎn)生親本細(xì)胞的突變體的方法，其包括破壞或缺失編碼權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列，導(dǎo)致所述突變體產(chǎn)生的多肽少于親本細(xì)胞。40.通過權(quán)利要求39的方法產(chǎn)生的突變細(xì)胞。41.權(quán)利要求40的突變細(xì)胞，還包含編碼天然或異源蛋白的基因。42.產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包括(a)在有益于所述蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求41的突變細(xì)胞；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。43.權(quán)利要求32或33的分離的多核苷酸，其通過(a)在至少中嚴(yán)緊性條件下將DNA群體與如下雜交(i)SEQIDN0:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列；(ii)SEQIDN0:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDN0:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列中所含cDNA序列或包含SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列；或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；并(b)分離編碼具有過氧合酶活性的多肽的雜交的多核苷酸來獲得。44.權(quán)利要求43的分離的多核苷酸，其通過(a)在至少中-高嚴(yán)緊性條件下將DNA群體與如下雜交(i)SEQIDN0:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列；(ii)SEQIDN0:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDN0:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列中所含cDNA序列或包含SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列；或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；并(b)分離編碼具有過氧合酶活性的多肽的雜交的多核苷酸來獲得。45.權(quán)利要求44的分離的多核苷酸，其通過(a)在至少高嚴(yán)緊性條件下將DNA群體與如下雜交(i)SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列；(ii)SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列中所含cDNA序列或包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列；或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；并(b)分離編碼具有過氧合酶活性的多肽的雜交的多核苷酸來獲得。46.權(quán)利要求43-45中任一項(xiàng)的分離的多核苷酸，其中所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO1的核苷酸152-1141。47.產(chǎn)生多核苷酸的方法，所述多核苷酸包含編碼具有過氧合酶活性的多肽的突變核苷酸序列，所述方法包括(a)向SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDN0:5、SEQIDNO:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO=IUSEQIDNO:13、SEQIDN0:15或SEQIDN0:17的成熟多肽編碼序列中引入至少一個(gè)突變，其中所述突變核苷酸序列編碼包含SEQIDN0:2、SEQIDNO:4,SEQIDN0:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO10,SEQIDNO12,SEQIDNO:14或SEQIDNO:19的成熟多肽或由所述成熟多肽組成的多肽；和(b)回收所述包含突變核苷酸序列的多核苷酸。48.通過權(quán)利要求47的方法產(chǎn)生的突變多核苷酸。49.產(chǎn)生多肽的方法，其包括(a)在有益于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼所述多肽的權(quán)利要求48的突變多核苷酸；和(b)回收所述多肽。50.產(chǎn)生權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)的多肽的方法，其包括(a)在有益于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞包含編碼所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。51.核酸構(gòu)建體，其包含與編碼信號肽的第一核苷酸序列和/或編碼前肽的第二核苷酸序列可操作連接的編碼蛋白質(zhì)的基因，所述信號肽包含或其組成為SEQIDNO:2的氨基酸-43至-1，所述前肽包含或其組成為SEQIDNO:2的氨基酸1至330，其中所述基因?qū)τ谒龅谝缓偷诙塑账嵝蛄惺峭庠吹摹?2.重組表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求51的核酸構(gòu)建體。53.重組宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求51的核酸構(gòu)建體。54.產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包括(a)在有益于所述蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求53的重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。55.將圖1中式(I)的N-雜環(huán)類化合物酶促、區(qū)域選擇性地氧合成相應(yīng)的圖1中式(II)的N-氧化物的方法，其通過在一步反應(yīng)過程中在至少一種氧化劑存在下使用權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)限定的過氧合酶多肽轉(zhuǎn)化圖1中式(I)的N-雜環(huán)類化合物來進(jìn)行。56.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其特征在于使用的N-雜環(huán)類化合物是吡啶。57.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其特征在于使用的N-雜環(huán)類化合物是取代的吡啶或多環(huán)雜環(huán)類化合物(例如喹啉)。58.根據(jù)權(quán)利要求55-57中任一項(xiàng)的方法，其中所述過氧合酶源自糞傘科、鬼傘科或口蘑科(Tricholomataceae)中的代表。59.根據(jù)權(quán)利要求58的方法，其中所述過氧合酶源自柱狀田頭菇、茶薪菇(Agrocybechaxingu)、$昌毛鬼傘或Coprinusverticulatus。60.根據(jù)權(quán)利要求55-59中任一項(xiàng)的方法，其中所述氧化劑是過氧化氫、有機(jī)的過氧化物或氫過氧化物、空氣或氧。61.根據(jù)權(quán)利要求55-60中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述氧化劑以催化量使用，優(yōu)選以基于圖1中式(I)的化合物濃度的<0.01%的量使用。62.根據(jù)權(quán)利要求55-61中任一項(xiàng)的方法，其中進(jìn)一步向反應(yīng)混合物中加入H2O2生成酶以進(jìn)一步加速式(I)的化合物與過氧合酶多肽的反應(yīng)。63.根據(jù)權(quán)利要求55-62中任一項(xiàng)的方法，其中向所述反應(yīng)加入基于有機(jī)酸和/或磷酸鹽的緩沖液以穩(wěn)定反應(yīng)。64.根據(jù)權(quán)利要求55-63中任一項(xiàng)的方法，其中所述反應(yīng)在10°C至40°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。65.根據(jù)權(quán)利要求55-64中任一項(xiàng)的方法，其中通過加入有機(jī)溶劑來改善底物可溶性。66.洗滌劑組合物，其包含如權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)所限定的多肽。67.洗碗機(jī)用洗滌劑組合物，其包含如權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)所限定的多肽。68.用于紙漿和紙?zhí)幚淼慕M合物，其包含如權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)所限定的多肽。69.用于水處理的組合物，其包含如權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)所限定的多肽。70.用于油處理的組合物，其包含如權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)所限定的多肽。全文摘要本發(fā)明涉及具有過氧合酶活性的多肽和包含這類多肽的組合物，它們的編碼多核苷酸、表達(dá)載體和包含這樣的多核苷酸或載體的重組宿主細(xì)胞，產(chǎn)生所述多肽的方法，以及它們的應(yīng)用方法和用途，包括用于將通式(I)的N-雜環(huán)類化合物(N-heterocycles)酶促、區(qū)域選擇性氧合成相應(yīng)的式(II)的N-氧化物的方法，其中通過在一步反應(yīng)過程中在至少一種氧化劑存在下用過氧化物酶多肽轉(zhuǎn)化式(I)的N-雜環(huán)類化合物來進(jìn)行。文檔編號C12N9/08GK101802180SQ200880017970公開日2010年8月11日申請日期2008年3月31日優(yōu)先權(quán)日2007年3月30日發(fā)明者勒內(nèi)·烏爾里克,卡林·沙伊布納,柯克·M·施諾爾,馬丁·G·克盧格,馬丁·霍夫里奇特,馬雷克·J·佩西納申請人:諾維信公司