專利名稱：包含光學(xué)偵測(cè)裝置的生物檢測(cè)系統(tǒng)、及生物分子的偵測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物檢測(cè)系統(tǒng)，包括多個(gè)光學(xué)偵測(cè)器，以及該生物檢測(cè)系統(tǒng)用于 偵測(cè)及分析生物分子，例如核酸的用途。本發(fā)明還涉及一種生物檢測(cè)系統(tǒng)，包括至少10， 000 個(gè)光學(xué)偵測(cè)器，并行監(jiān)測(cè)大量的熒光團(tuán)(fluorophore)以偵測(cè)及分析該生物分子。
背景技術(shù)：
人類基因組計(jì)劃(HGP)剌激測(cè)序大量增加，導(dǎo)致測(cè)序成本相對(duì)降低。相較于人類 基因組計(jì)劃耗費(fèi)13年接近三十億美元的支出；最近完成的兩個(gè)個(gè)人基因組測(cè)序，每一基因 組(genome)的測(cè)序成本明顯減少(McGuire et al. ， Science 317:1687(2007))。未來(lái)在 個(gè)人化醫(yī)療的治療上，個(gè)人基因組測(cè)序代表一種新思維轉(zhuǎn)換。根據(jù)大量完成的基因信息，藥 物基因組學(xué)(pharmacogenomics)的發(fā)展，將使個(gè)人化的藥物設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)更有效率。并藉由管 理疾病的基因危險(xiǎn)因子，照顧者可更輕易實(shí)施預(yù)防醫(yī)學(xué)并提供個(gè)人專屬的治療。
為使個(gè)人專屬醫(yī)療普及化，美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(NIH)的國(guó)家人類基因組研究機(jī) 構(gòu)(NHGRI)，設(shè)定完成一個(gè)人類基因組測(cè)序成本降低的目標(biāo)，由目前約百萬(wàn)美元降至一千 美元。傳統(tǒng)高通量的毛細(xì)管電泳以及自動(dòng)化的基因組測(cè)序技術(shù)不能滿足的個(gè)體基因組測(cè) 序持續(xù)加增的需求。現(xiàn)行的測(cè)序方法使用的影像取得及分析步驟較為復(fù)雜且易發(fā)生錯(cuò)誤 (error-prone)。例如，許多現(xiàn)行技術(shù)需要移動(dòng)數(shù)組或偵測(cè)系統(tǒng)，以捕捉多重影像。得到的 影像必須再被堆砌、排列及分析。影像的獲得、加工及分析步驟皆可能產(chǎn)生錯(cuò)誤并需要昂貴 裝備且耗費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間。相反地，現(xiàn)行的系統(tǒng)不涉及可移動(dòng)的光學(xué)裝置，通常限制在中度的 偵測(cè)通量。而且，現(xiàn)行裝置不將被偵測(cè)分子放置于對(duì)應(yīng)的偵測(cè)單位的附近，實(shí)質(zhì)上限制訊號(hào) 偵測(cè)的靈敏度。 因此，為了達(dá)到"1000元美金基因組"測(cè)序的目標(biāo)，需要一種降低核酸測(cè)序成本的 裝置。該裝置可并行測(cè)序多個(gè)分子，并具有簡(jiǎn)化的設(shè)計(jì)及制作過(guò)程，以及避免現(xiàn)行裝置與方 法的復(fù)雜及錯(cuò)誤傾向的掃描與影像分析過(guò)程。而且，該裝置應(yīng)可測(cè)序單一分子，簡(jiǎn)化群集分 子測(cè)序方法中核酸序列復(fù)制擴(kuò)增的步驟，及避免群集分子測(cè)序時(shí)，不同分子反應(yīng)不同步導(dǎo) 致的長(zhǎng)序列讀序困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種生物檢測(cè)系統(tǒng)，包括多個(gè)光學(xué)偵測(cè)器，以及提供一種使用該生物 檢測(cè)系統(tǒng)偵測(cè)核酸的方法，例如核酸測(cè)序。本發(fā)明之生物檢測(cè)系統(tǒng)可進(jìn)行大量平行測(cè)序反
7應(yīng)，即同時(shí)對(duì)大量的不同核酸模板進(jìn)行測(cè)序。每一測(cè)序反應(yīng)使用單一分子作為模板(即單 一分子測(cè)序)。本發(fā)明提供的裝置還具有簡(jiǎn)化的設(shè)計(jì)，排除現(xiàn)行裝置所需的復(fù)雜、昂貴、及有 錯(cuò)誤傾向的掃描與偵測(cè)步驟。本發(fā)明系統(tǒng)的簡(jiǎn)化設(shè)計(jì)及功能一部分基于直接對(duì)應(yīng)被偵測(cè)核 酸連接于其上的偵測(cè)連接位置(linker site)(直接連接或如經(jīng)由聚合酶分子連接)，同時(shí) 可偵測(cè)一個(gè)或多個(gè)的偵測(cè)單位(如光偵測(cè)器)， 一部份基于連接位置與偵測(cè)單位間的短距 離。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，核酸與該偵測(cè)單位間的短距離，以偵測(cè)的大的接收訊號(hào)角度 (solid angle)方式表現(xiàn)。 本發(fā)明一方面提供一種生物檢測(cè)系統(tǒng)，在偵測(cè)單位上辨識(shí)單一生物分子。此生物 檢測(cè)系統(tǒng)包括多個(gè)光學(xué)偵測(cè)器，該光學(xué)偵測(cè)器各包括具有光偵測(cè)器的基材，以及于該光偵 測(cè)器上形成的連接位置，該連接位置經(jīng)處理后使該生物分子固定于該連接位置，其中該連 接位置鄰近于上述光偵測(cè)器上。本發(fā)明的實(shí)施方案中，上述連接位置與上述光偵測(cè)器的間 隔距離為小于或等于100 m，上述光偵測(cè)器收集上述生物分子在接收訊號(hào)角度為0. 8SI球 面度(steridian)或以上發(fā)射的光。上述光學(xué)偵測(cè)器可進(jìn)一步包括激發(fā)光源，其形成于上 述基材上，提供光源以激發(fā)附著于上述生物分子上的熒光團(tuán)(fluorophore)。
本發(fā)明另一發(fā)明方面提供一種核酸的偵測(cè)方法，藉由于本發(fā)明的光學(xué)偵測(cè)器的上 述連接位置上連接至少一個(gè)核酸(直接連接，或連接于核酸聚合酶，該核酸聚合酶連接于 上述連接位置)，偵測(cè)在對(duì)應(yīng)的光偵測(cè)器上的核酸。本發(fā)明的實(shí)施方案中，偵測(cè)上述核酸的 雜交作用，例如雜交至具有標(biāo)記的探針。本發(fā)明的實(shí)施方案中，上述核酸通過(guò)在上述光學(xué)偵 測(cè)器上進(jìn)行核酸測(cè)序而偵測(cè)。本發(fā)明的實(shí)施方案中，該核酸測(cè)序方法選自堿基延伸測(cè)序、末 端磷酸標(biāo)記的測(cè)序、及搖擺測(cè)序(wobble sequencing)。本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，上述測(cè) 序反應(yīng)為堿基延伸反應(yīng)。本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，上述堿基延伸測(cè)序反應(yīng)進(jìn)一步包括在 上述光學(xué)偵測(cè)器中加入具有阻斷基與標(biāo)記的核苷酸的步驟。本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，上 述核苷酸以熒光團(tuán)(fluorophore)標(biāo)記。 另一方面，本發(fā)明亦提供一種偵測(cè)樣本分子的方法。本發(fā)明的實(shí)施方案中，此方 法包括將標(biāo)記的樣本分子固定于本發(fā)明的光學(xué)偵測(cè)器上的連接位置，在對(duì)應(yīng)的光偵測(cè)器上 偵測(cè)該樣本分子。本發(fā)明的實(shí)施方案中，上述樣本分子以連結(jié)分子固定至連接位置。本發(fā) 明的實(shí)施方案中，上述連接分子包括(l)捕捉分子，適合連接上述樣本分子，及(2)核酸標(biāo) 簽。本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，將上述樣本分子涂鋪于本發(fā)明的光學(xué)偵測(cè)器，其中該光學(xué)偵 測(cè)器上的連接位置上已固定有連接分子。其它實(shí)施方案中，樣本分子可與連接分子結(jié)合，形 成結(jié)合復(fù)合物，然后將此結(jié)合復(fù)合物涂鋪于上述光學(xué)偵測(cè)器，使其固定在連接位置。本發(fā)明 的特定實(shí)施方案中，上述樣本分子為生物分子，例如多肽、核酸、脂質(zhì)、多糖、或代謝物。
本發(fā)明的具體實(shí)施詳細(xì)說(shuō)明如下，然而以下的實(shí)施方案僅用于進(jìn)一步公開(kāi)本發(fā)明
之技術(shù)內(nèi)容，不應(yīng)藉以限制本案的發(fā)明范疇。 附圖
簡(jiǎn)述 第1圖顯示本發(fā)明的生物檢測(cè)系統(tǒng)的上視圖，包括一光學(xué)偵測(cè)器陣列。 第2圖顯示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的光學(xué)偵測(cè)器，為第1圖的AA線下的剖面圖。 第3圖顯示本發(fā)明的光學(xué)偵測(cè)器的尺寸詳細(xì)說(shuō)明的剖面圖。 第4圖顯示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的光學(xué)偵測(cè)器，為第1圖的AA線下的剖面圖。 第5圖顯示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的濾光層構(gòu)成表。
第6圖顯示本發(fā)明的裝置的連接位置上連接核酸的情形。 第7圖顯示在以阻斷與標(biāo)記核苷酸進(jìn)行一個(gè)循環(huán)的堿基延伸后，該裝置的連接位 置上連接核酸的情形。 第8圖顯示如第7圖的堿基延伸測(cè)序反應(yīng)的另一實(shí)施方案。
第9圖顯示以堿基延伸測(cè)序并行測(cè)序數(shù)個(gè)核酸的一個(gè)循環(huán)。
發(fā)明詳述
1.生物檢測(cè)系統(tǒng) 本發(fā)明的生物檢測(cè)系統(tǒng)可用于并行監(jiān)測(cè)大數(shù)目(例如一些實(shí)施方案中IO，OOO 個(gè)以上)的單一生物分子。本發(fā)明的生物檢測(cè)系統(tǒng)可包括多個(gè)光學(xué)偵測(cè)器。每一個(gè)光學(xué) 偵測(cè)器，藉由偵測(cè)該熒光團(tuán)(fluorophore)發(fā)射的光子，可感測(cè)該單一分子上的熒光團(tuán) (fluorophore)存在。經(jīng)由并行操作上述光學(xué)偵測(cè)器，本發(fā)明的生物檢測(cè)系統(tǒng)可以高通量 (high throughput)辨識(shí)組織樣本中的基因組序列或表達(dá)基因的型態(tài)。
如第1圖顯示本發(fā)明的生物檢測(cè)系統(tǒng)1。生物檢測(cè)系統(tǒng)1包括生物檢測(cè)基材10及 多個(gè)光學(xué)偵測(cè)器20形成于基材10上。每一個(gè)光學(xué)偵測(cè)器20可獨(dú)立運(yùn)作，偵測(cè)及辨識(shí)其固 定的單一生物分子。例如單鏈DNA序列的辨識(shí)，可經(jīng)由逐步進(jìn)行堿基延伸及以光學(xué)偵測(cè)器 20偵測(cè)與該延伸的堿基偶聯(lián)的熒光團(tuán)(fluorophore)所發(fā)出的光。藉由在基材10上整合 大數(shù)量的光學(xué)偵測(cè)器20，可并行偵測(cè)及辨識(shí)大數(shù)量的單一生物分子。生物檢測(cè)系統(tǒng)1可根 據(jù)選擇的設(shè)計(jì)，可包括至少10， 000個(gè)、250， 000個(gè)、2， 000， 000個(gè)、10， 000， 000個(gè)或以上的光 學(xué)偵測(cè)器20形成于基材10上。 生物檢測(cè)系統(tǒng)1可進(jìn)一步包括偵測(cè)與記錄系統(tǒng)2，其與基材10連接，用以控制光學(xué) 偵測(cè)器20的運(yùn)作，及記錄光學(xué)偵測(cè)器20所得的數(shù)據(jù)。而且，生物檢測(cè)系統(tǒng)1可進(jìn)一步包括 激發(fā)光源(圖未顯示)。此激發(fā)光源可產(chǎn)生激發(fā)光，誘導(dǎo)熒光團(tuán)(fluorophore)發(fā)射出熒 光。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該激發(fā)光源可單獨(dú)設(shè)置，不在光學(xué)偵測(cè)器20或生物檢測(cè)基 材10上。在另一實(shí)施方案中，該激發(fā)光源可設(shè)置于光學(xué)偵測(cè)器20或生物檢測(cè)基材10上。
在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，如第1圖所示，光學(xué)偵測(cè)器20由上向下觀看可為圓 形。光學(xué)偵測(cè)器20可具有其它幾何圖形，例如矩形、多角形、卵形、或其它類似形狀。而且， 第1圖顯示多個(gè)光學(xué)偵測(cè)器20排列成矩形晶格圖案。光學(xué)偵測(cè)器20亦可排列成其它圖案， 例如三角晶格圖案、蜂巢晶格圖案、或其它類似圖案。 由于生物檢測(cè)系統(tǒng)l的多個(gè)光學(xué)偵測(cè)器20獨(dú)立運(yùn)作，以下僅以一個(gè)光學(xué)偵測(cè)器20 說(shuō)明本發(fā)明的其它實(shí)施方案。雖然僅描述一個(gè)光學(xué)偵測(cè)器20，但可以了解生物檢測(cè)系統(tǒng)1 中的不同光學(xué)偵測(cè)器20不需相同?？筛鶕?jù)本發(fā)明不同實(shí)施方案的需要設(shè)計(jì)，建構(gòu)不同型態(tài) 的光學(xué)偵測(cè)器20。 第2圖顯示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，沿第1圖中AA線所示的光學(xué)偵測(cè)器20剖 面圖。如第2圖所示，光學(xué)偵測(cè)器20包括光偵測(cè)器210，其形成于基材10上，及連接位置 220，其形成于光偵測(cè)器210上。而且，光學(xué)偵測(cè)器20可進(jìn)一步包括控制回路215，其形成于 基材10上，用以控制光偵測(cè)器210的運(yùn)作。控制回路215可連接于偵測(cè)與記錄系統(tǒng)2，以接 收來(lái)自偵測(cè)與記錄系統(tǒng)2的控制指示，并傳送偵測(cè)訊號(hào)至偵測(cè)與記錄系統(tǒng)2。在本發(fā)明的 實(shí)施方案中，基材10可為玻璃基材、半導(dǎo)體基材(如硅)、或塑料基材。本發(fā)明的實(shí)施方案 中，每一光偵測(cè)器210可對(duì)應(yīng)一個(gè)或多個(gè)的控制回路215。
本發(fā)明的實(shí)施方案中，光偵測(cè)器210可包括單 一 光導(dǎo)光子偵測(cè)器 (photoconductive photon detector)或一組光導(dǎo)光子偵測(cè)器。在另外的實(shí)施方案中，光 偵測(cè)器210可包括單一光電光子偵測(cè)器(photovoltaic photon detector)或一組光電光 子偵測(cè)器。在另外的實(shí)施方案中，光偵測(cè)器210可包括單一光二極管(photodiodes)或一 組光二極管。在另外的實(shí)施方案中，光偵測(cè)器210可包括單一雪崩光二極管(avalanche photodiodes)或一組雪崩光二極管。在另外的實(shí)施方案中，光偵測(cè)器210可包括單一光敏 晶體管(phototransistor)或一組光敏晶體管。 本發(fā)明的實(shí)施方案中，光學(xué)偵測(cè)器20可進(jìn)一步包括遮光片230于光偵測(cè)器210 上。遮光片230可包括小孔235。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，小？L 235可為圓形，具有直徑D1 小于或等于l， 000、500、300、200、150、或100nm。小孔235可具有其它形狀，例如卵形、矩形、 或其它類似形狀。本發(fā)明的實(shí)施方案中，遮光片230可包括不透明材料，以阻擋不想要的光 到達(dá)光偵測(cè)器210。因此經(jīng)由小孔235使所希望的光到達(dá)光偵測(cè)器210。
連接位置220可形成于小孔235附近。在第2圖所示的實(shí)施方案中，連接位置220 形成于小孔235內(nèi)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，連接位置220形成于小孔235附近，與光偵測(cè) 器210的距離H1為小于或等于100iim的距離。在另外的實(shí)施方案中，距離H1可為小于或 等于75、50、25、15、10、5、3iim的距離。 光學(xué)偵測(cè)器20可進(jìn)一步包括濾光層240 (選擇性)及微透鏡250 (選擇性)，于光 偵測(cè)器210及遮光片230間。雖然第2圖顯示濾光層240形成于微透鏡250之上，但可了 解濾光層240也可形成于微透鏡250之下。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，濾光層240可包括單 一透明層，或多個(gè)具有不同反射系數(shù)的透明次層。當(dāng)濾光層240包括多個(gè)亞層時(shí)，可經(jīng)由逐 步在基材10上沉積該亞層，形成濾光層240。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，具有較高反射系數(shù)的 亞層可由兩個(gè)具有較低反射系數(shù)的亞層以三明治形式沉積。在另外的實(shí)施方案中，具有較 低反射系數(shù)的亞層可由兩個(gè)具有較高反射系數(shù)的亞層以三明治形式沉積。在本發(fā)明的實(shí)施 方案中，濾光層240可包括具有單一區(qū)域的層，或多個(gè)于不同波長(zhǎng)范圍具有不同透明度的 亞區(qū)域。 如第2圖所示，連接位置220可經(jīng)處理后使單一生物分子30固定于其上。在實(shí) 施方案中，生物分子30可包括單鏈DNA分子32及連接于DNA分子32的末端引物34。生 物分子30可經(jīng)由末端連接引物34固定于連接位置220。而且，DNA分子32可以熒光團(tuán) (fluorophore)36標(biāo)記。當(dāng)以第一波長(zhǎng)入1激發(fā)光被激發(fā)時(shí)，熒光團(tuán)36可發(fā)射出第二波長(zhǎng) 入2的熒光。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，第一波長(zhǎng)入l較第二波長(zhǎng)A2短。在另外的實(shí)施方案 中，第一波長(zhǎng)入l較第二波長(zhǎng)A2長(zhǎng)，例如在多光子激發(fā)中。然后光偵測(cè)器210偵測(cè)自熒光 團(tuán)36發(fā)出的熒光，辨識(shí)熒光團(tuán)36所附著的堿基，因而逐步辨識(shí)DNA分子32的序列。
第3圖顯示本發(fā)明實(shí)施方案的光學(xué)偵測(cè)器20的剖面圖。如第3圖所示，遮光片 230形成于光偵測(cè)器210之上，與光偵測(cè)器210的垂直間隔距離Hl。具有一厚度T的遮光 片230，包括半徑R1(直徑D1的一半)的小孔235。在此實(shí)施方案中，連接位置220可形成 于小孔235中，與生物分子連接(圖未顯示)。 當(dāng)在連接位置220上的第一位置36A發(fā)現(xiàn)熒光團(tuán)36且第一位置36A與連接位 置220距離H2時(shí)，半徑R2的光偵測(cè)器210可收集熒光團(tuán)36在第一接收訊號(hào)角度(solid angle) e 1發(fā)射的光。當(dāng)在第二位置36B發(fā)現(xiàn)熒光團(tuán)36且熒光團(tuán)36幾乎接觸到連接位置220 (即距離H2接近0或小于1 m)時(shí)，然后光偵測(cè)器210收集熒光團(tuán)36在第二接收訊號(hào)
角度e 2發(fā)射的光。第二接收訊號(hào)角度e 2大于第一接收訊號(hào)角度e i，提供實(shí)質(zhì)上較強(qiáng)的信號(hào)。 為了使光偵測(cè)器210暴露在由熒光團(tuán)36經(jīng)小孔235發(fā)出的熒光，光偵測(cè)器210的 半徑R2必須大于或等于第二接收信號(hào)角度9 2投射在光偵測(cè)器210的上表面的半徑。藉由 使遮光層230 (或連接位置220)更接近光偵測(cè)器210 (即減少距離HI)，然后光偵測(cè)器210 收集在接收信號(hào)角度內(nèi)較集中的光(即較強(qiáng)的光信號(hào))。在實(shí)施方案中，遮光片230(或連 接位置220)及光偵測(cè)器210具有一小距離Hl，因此第二接收信號(hào)角度9 2具有至少0. 8SI 球面度(steridian)。 第4圖顯示本發(fā)明的實(shí)施方案，沿第1圖中AA線所示的光學(xué)偵測(cè)器20剖面圖。此 實(shí)施方案中，激發(fā)光源40位于光學(xué)偵測(cè)器20上。如第4圖所示，激發(fā)光源40形成于光學(xué)偵 測(cè)器20的遮光片230上。本發(fā)明是實(shí)施方案中，激發(fā)光源40可包括p型及n型半導(dǎo)體層 (410及430)，發(fā)光層420位于層410與層430的接面區(qū)。層410與層430可與電源連接。 根據(jù)層410、420、及430使用的材料及/或材料的物理與原子結(jié)構(gòu)，激發(fā)光源40可為發(fā)光二 極管(LED)、發(fā)光激光二極管(LD)、有機(jī)發(fā)光二極管(OLED)、或聚合物發(fā)光二極管(PLED)。 無(wú)機(jī)材料，例如砷化鎵、磷化銦、銻化鎵、及氮化鎵；有機(jī)材料，例如與聚(對(duì)苯乙炔)骨架共 軛的聚合物，皆為可用于制造發(fā)光的接面二極管的半導(dǎo)體材料。 另外的實(shí)施方案中，激發(fā)光源40可形成遮光片230或形成于遮光片230內(nèi)。在本 發(fā)明的實(shí)施方案中，激發(fā)光源40位于光學(xué)偵測(cè)器20中，發(fā)出一波長(zhǎng)帶的光或多個(gè)波長(zhǎng)帶的 光。激發(fā)光源40可在一時(shí)間發(fā)出一波長(zhǎng)帶的光或數(shù)種波長(zhǎng)帶的光。 如第4圖所示，激發(fā)光源40可在其中心部位包括孔穴450，使小孔235暴露出來(lái)。 在此實(shí)施方案中，連接位置220不形成于小孔235內(nèi)。而且，連接位置220可形成于孔穴 450內(nèi)，并接近小孔235。此實(shí)施方案中，激發(fā)光源40形成遮光片230或形成于遮光片230 之內(nèi)時(shí)，孔穴450形成小孔235或形成于小孔235之內(nèi)。本發(fā)明的實(shí)施方案中，小孔235可 使用適當(dāng)方法，藉由例如蝕刻遮光片230及層410，形成于層410與遮光片230的中心部位。
而且，經(jīng)由金屬接點(diǎn)415形成于較低層410上以及金屬接點(diǎn)435形成于較上層430 上，激發(fā)光源40可與電源440連接。電源440可單獨(dú)存在，由偵測(cè)與記錄系統(tǒng)2控制，或整 合于偵測(cè)與記錄系統(tǒng)2中。 激發(fā)光源40的發(fā)光層420可發(fā)出激發(fā)光，如第4圖的發(fā)光層的箭頭方向，沿水平 方向發(fā)光至孔穴450。此實(shí)施方案中，激發(fā)光沿著實(shí)質(zhì)平行于遮光片230的上表面發(fā)出。因 此，激發(fā)光不會(huì)干擾熒光到達(dá)光偵測(cè)器210。本發(fā)明的光學(xué)偵測(cè)器20因此較傳統(tǒng)裝置更正 確地辨識(shí)生物分子。
2.核酸的偵測(cè) 本發(fā)明的生物檢測(cè)系統(tǒng)(包括例如單一或多個(gè)的光學(xué)偵測(cè)器)可作為分子偵測(cè)系 統(tǒng)的一部份或用于分子偵測(cè)的方法或步驟中，例如核酸測(cè)序。本發(fā)明的生物檢測(cè)系統(tǒng)及使 用的方法或步驟，有效作為分析及診斷應(yīng)用。這些應(yīng)用可為私人、公眾、商業(yè)、或產(chǎn)業(yè)用途。
本發(fā)明的實(shí)施方案中，本生物檢測(cè)系統(tǒng)適合于大規(guī)模并行的核酸測(cè)序。由于該生 物檢測(cè)系統(tǒng)的連接位置及光偵測(cè)器間的直接對(duì)應(yīng)關(guān)系，和/或連接位置與光偵測(cè)器非常接 近(實(shí)施方案中，顯示接收信號(hào)角度大)，本發(fā)明的生物檢測(cè)系統(tǒng)可用于測(cè)序核酸，而無(wú)需昂貴、復(fù)雜、及有錯(cuò)誤傾向的掃描與分析系統(tǒng)，例如可移動(dòng)的掃描透鏡或可移動(dòng)的裝置平臺(tái) 及之后的影像分析，因此可減少錯(cuò)誤與成本。本生物檢測(cè)系統(tǒng)可藉由大幅增強(qiáng)的信號(hào)強(qiáng)度 而偵測(cè)光信號(hào)，使單一分子得以被分析。 本發(fā)明的生物檢測(cè)系統(tǒng)可用于多樣的測(cè)序模式，且適合測(cè)序單一分子。而且，相較 于現(xiàn)行的生物芯片裝置，本發(fā)明的光學(xué)偵測(cè)器具有簡(jiǎn)化設(shè)計(jì)、組合、及生產(chǎn)。例如被測(cè)序的 核酸可隨機(jī)固定于陣列上的連接位置，避免使用費(fèi)時(shí)且昂貴的機(jī)械在預(yù)定位置上進(jìn)行放置 或合成核酸。 本發(fā)明的生物檢測(cè)系統(tǒng)可作為生物分子偵測(cè)方法及步驟中的系統(tǒng)的一部分，包括 核酸雜交或測(cè)序，例如對(duì)全基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄圖譜(transcriptionalprofiling)、比較轉(zhuǎn)錄 圖譜(comparative transcriptional prof iling)、或基因鑒定。生物分子的偵測(cè)也可包括 連接作用的偵測(cè)及/或測(cè)量，例如蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)、抗體/抗原、受體/配體、及核酸/蛋白 質(zhì)。這些應(yīng)用可作為分析或診斷的步驟及方法。 適合于本發(fā)明系統(tǒng)偵測(cè)的核酸，在實(shí)施方案中，可為連接分子(linkingmolecule) 的一部份，固定適合分析連接作用(binding interaction)的分子在本發(fā)明提供的裝置的 連接位置，該分析的連接作用的分子例如蛋白質(zhì)、其它核酸、碳?xì)浠衔锓肿硬糠荨⒒蛐》?子。本發(fā)明的實(shí)施方案中，上述的連接分子進(jìn)一步包括捕捉分子，與被分析連接作用的分子 連接。在連接分子中的核酸經(jīng)由例如直接測(cè)序或雜交，作為該連接分子中捕捉分子的鑒定 標(biāo)簽。 本發(fā)明的方法通常包括將欲偵測(cè)分子固定于本發(fā)明提供的裝置的地址陣列。本發(fā) 明的實(shí)施方案中，上述地址陣列包括具有多個(gè)小孔235的遮光片230，及連接位置220，形成 于小孔235中或周圍。如第1、2圖的實(shí)施方案所示。因此，本發(fā)明的生物檢測(cè)系統(tǒng)可同時(shí)
讀取百萬(wàn)個(gè)核酸片段。假設(shè)每一片段為iooo個(gè)堿基長(zhǎng)度，裝置可獲得十億個(gè)片段信息，使
例如全基因組測(cè)序及再測(cè)序成為可能。
2. l偵測(cè)的分子 適合本發(fā)明方法偵測(cè)的核酸可包括任何核酸，包括例如DNA、 RNA、 PNA(肽核苷 酸)，且可包括任何已知及未知的序列，包括天然發(fā)生的序列或人造序列。該核酸可為天然 衍生的、重組產(chǎn)生的、或化學(xué)合成的。該核酸可包括天然發(fā)生的核苷酸、自然界不存在的核 苷酸類似物、或修飾核苷酸。偵測(cè)的核苷酸長(zhǎng)度根據(jù)實(shí)際的應(yīng)用而異。在本發(fā)明的實(shí)施方 案中，核酸包括至少10、20、50、100、200、500、1， 000、2， 000、5， 000、10， 000、20， 000個(gè)堿基 或以上。本發(fā)明的實(shí)施方案中，核酸可為10-20、10-50、10-100、50-100、50-500、50-1000、 50-5000、500-2， 000、500_5， 000、或1， 000-5， 000個(gè)堿基。 偵測(cè)的核酸可為單鏈。單鏈核酸模板可由已知方法衍生自雙鏈分子，例如加熱、堿
處理或其它化學(xué)處理。單鏈核酸模板也可由如化學(xué)合成或試管內(nèi)合成而制造。 本發(fā)明的實(shí)施方案中，偵測(cè)的核酸以其5'端或3'端連接至連接位置。本發(fā)明實(shí)
施方案中，該核酸進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)的末端連接引物，偶聯(lián)至該核酸的5'端、3'端、或
5'端及3'端。在特定實(shí)施方案中，該末端連接引物固定于該核酸的3'端。末端連接引物
可用于固定欲偵測(cè)的核酸至裝置上的連接位置，提供一個(gè)或多個(gè)偵測(cè)引物的互補(bǔ)序列，該
偵測(cè)引物例如測(cè)序引物。 2. 1. l末端連接引物
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末端連接引物為短核酸分子，通常由少于100個(gè)核苷酸所組成。本發(fā)明的實(shí)施方 案中，該末端連接引物為至少5、10、15、20、25、30、50、75、90個(gè)核苷酸或以上的長(zhǎng)度。在特 定的實(shí)施方案中，末端連接引物為8-25、10-20、10-30、或10-50個(gè)核苷酸長(zhǎng)。在本發(fā)明的 實(shí)施方案中，該末端連接引物不具有分支，然而在其它實(shí)施方案中，該末端連接引物具有分 支。 該末端連接引物可用于使欲偵測(cè)核酸附著至地址陣列上的連接位置。本發(fā)明的實(shí) 施方案中，該末端連接引物可將該核酸直接連接至陣列表面，例如藉由共價(jià)連接(如酯或 硫鍵)或非共價(jià)連接，例如抗原/抗體或生物素(biotin)/抗生物素蛋白(avidin)連接， 如第6、7圖所述。本發(fā)明的實(shí)施方案中，該末端連接引物將核酸間接連接至陣列表面，例 如藉由連接一中間分子，如聚合酶，如第8圖所示。因此，該末端連接引物可包括修飾核苷 酸或其它修飾以加速連接至連接位置，以本領(lǐng)域已知的方法，例如二硫、硫酯、酰胺、磷酸二 酯、或酯鍵；或藉由抗原/抗體或生物素(biotin)/抗生物素蛋白(avidin)連接，例如該末 端連接引物包含核苷酸，該核苷酸包括抗原部份或生物素化核苷酸。在特定的實(shí)施方案中， 修飾核苷酸位于末端連接引物的3'端。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，末端連接引物的5'端包 括修飾核苷酸。 該末端連接引物也可作為用于偵測(cè)該核酸的一個(gè)或多個(gè)的引物的補(bǔ)體，例如測(cè)序 引物。本發(fā)明的實(shí)施方案中，該引物用于以雜交偵測(cè)該核酸，例如該引物包含可偵測(cè)標(biāo)記， 例如熒光或放射性同位素標(biāo)記。本發(fā)明的實(shí)施方案中，該末端連接引物的5'端包括互補(bǔ)于 測(cè)序引物的序列。本發(fā)明的實(shí)施方案中，將互補(bǔ)于該測(cè)序引物的末端連接引物序列定位，因 此該測(cè)序引物的3'端立即相鄰于被測(cè)序的核酸中第一個(gè)核苷酸。 如第6圖顯示一實(shí)施方案中被測(cè)序的核酸固定于本發(fā)明的光學(xué)偵測(cè)器20的表示 圖。單鏈核酸32、末端連接引物34、及黏合的測(cè)序引物346，被固定于經(jīng)處理具有反應(yīng)官能 基的連接位置220，使修飾的核苷酸344連接于末端連接引物34。本發(fā)明的實(shí)施方案中，核 酸32藉由其5'端連接至連接位置220，末端連接引物34連接于核酸32的3'端，作為測(cè)序 引物346的補(bǔ)體。 本發(fā)明的實(shí)施方案中，以連接酶(ligase)使末端連接引物添加于欲偵測(cè)的核酸 上，該連接酶例如DNA連接酶。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，在連接(ligation)前，末端連接 引物及欲偵測(cè)的核酸皆為單鏈。在另外的實(shí)施方案中，兩者皆為單鏈。在其它的實(shí)施方案 中，一為單鏈、另一為雙鏈。連接(ligation)為本領(lǐng)域中已知的方法。例如，在聚合酶群落 測(cè)序方法(polony sequencingmethod)中，薛杜爾等人使用新英格蘭生物試驗(yàn)(NEB)快速 連接試劑盒，使T30末端連接引物(32pb)連接至樣本DNA片段(Shendure et al. ，2005， Science, 309 :1728-1732)。此述的連接反應(yīng)溶液包括在IX快速連接緩沖液中含有DNA 0. 26pMole、T30末端連接引物0. 8pMole、T4DNA連接酶4. 0 yl ?；旌虾螅瑢⒋朔磻?yīng)液在室溫 下培養(yǎng)約10分鐘，然后放在冰上。此連接反應(yīng)以加熱樣本至65°C、10分鐘終止。
在其它實(shí)施方案中，末端連接引物合成于欲偵測(cè)的核酸上。例如，該末端連接引 物可為均聚物，通過(guò)例如末端轉(zhuǎn)移酶加入。例如哈利斯等人將多聚A尾(poly A tail)加 到DNA模板上，作為病毒基因組的單一分子測(cè)序中多T測(cè)序引物的補(bǔ)體(Harris et al.， 2008，Science 320:106-109)。
2. 1.2測(cè)序引物
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測(cè)序引物為單鏈寡核苷酸，互補(bǔ)于偵測(cè)的核酸片段或其相關(guān)的末端連接引物。本 發(fā)明的實(shí)施方案中，測(cè)序引物為至少8、10、15、20、25、30、35、40、45、50個(gè)核苷酸，或以上的 長(zhǎng)度。在特定實(shí)施方案中，測(cè)序引物可為8-25、10-20、10-30、或10-50個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。測(cè)序 引物可由任何型態(tài)核苷酸組成，包括天然發(fā)生的核苷酸、自然界不存在的核苷酸類似物、或 修飾核苷酸。在特定實(shí)施方案中，在以偵測(cè)的核酸雜交測(cè)序引物后，可修飾測(cè)序引物的5' 端，以加速連接至地址陣列上的連接位置，包括一個(gè)或多個(gè)的末端連接分子。
本發(fā)明的實(shí)施方案中，測(cè)序引物包含修飾的核苷酸，例如鎖住的核酸(LNAs、修飾 的核糖核苷酸、或在多核酸中提供提高的堿基堆疊交互作用者)。例如使用LNA的說(shuō)明，拉 芬等人顯示含有LNA的引物，相較于未鎖住的引物，具有改良的特異性及呈現(xiàn)較強(qiáng)的連接 (Levin et al. ， 2006， NucleicAcid Research 34(20) :142)。包含3個(gè)LNA核苷酸(在cap 處)于不同位置的MCP1引物(5'-cttaaattttcttgaat-3')的三種變異體為MCPl-LNA-3' (5'-cttaaattttCtTgaAt-3') ;MCPl-LNA-5' (5'-CtTaAattttcttgaat-3');及MCPl-LNA-e ven (5 ， -ctTaaatTttctTgaat-3 ，)。所有LNA-取代的弓|物具有升高的Tm，然而，MCP1-LNA-5 ， 引物展現(xiàn)獨(dú)特的提高的測(cè)序正確性(Phred Q30counts)。因此，在特定的實(shí)施方案中，測(cè)序 引物可包括在5'區(qū)域中至少一種鎖住核苷酸，即在測(cè)序引物的5'的一半、三分之一、或四 分之一。 測(cè)序引物及單鏈樣本核酸(即欲偵測(cè)的核酸包括至少一個(gè)末端連接引物)在應(yīng)用 于本發(fā)明的光學(xué)偵測(cè)器前可被雜交。經(jīng)由混合樣本核酸與過(guò)量摩爾的測(cè)序引物在含鹽溶液 中，例如5X SSC(或5X SSPE) 、0. 1% Tween 20 (或0. 1 % SDS)、及0. 1 % BSA緩沖液，使摩 爾測(cè)序引物與樣本核酸雜交。此混合物可加熱至65t:至少5分鐘，緩慢冷卻至室溫，使引物 /模板黏合。殘余的引物可由適當(dāng)方法去除，例如分子篩。 包括末端連接引物及測(cè)序引物，引物可以適當(dāng)方法設(shè)計(jì)，包括序列的可視調(diào)查或 計(jì)算機(jī)輔助的弓I物設(shè)計(jì)。多種軟件包皆可用于輔助弓I物設(shè)計(jì)，包括DNAStarTM(DNAStar， Inc. ，Madison， WI) 、0IG0 4. 0 (NationalBiosciences， Inc.) 、Vector NTI (Invitrogen)、 Primer Premier 5 (Premierbiosoft)、及Primer 3 (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA)。設(shè)計(jì)引物應(yīng)考慮如測(cè)序的分子、特異性、長(zhǎng)度、所需要的解鏈溫 度、二級(jí)結(jié)構(gòu)、引物二元體、GC含量、緩沖液的pH及離子強(qiáng)度、及使用的酶(即聚合酶或連 接酶)(Joseph Sambrook and David Russell，Molecular Cloning :A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press ;3rd ed. (2001))。
2. 1. 3連接至陣列表面 在黏合測(cè)序引物及欲偵測(cè)的核酸(包括一個(gè)或多個(gè)的末端連接引物)之后，將此 復(fù)合物存于適當(dāng)緩沖液中，涂鋪于地址陣列的表面，使其連接。本發(fā)明的實(shí)施方案中，樣本 核酸(欲偵測(cè)的核酸及一個(gè)或多個(gè)的末端連接引物)固定于連接位置，之后涂鋪測(cè)序或偵 測(cè)的引物。另外的實(shí)施方案中，在涂鋪于該裝置之前使該復(fù)合物雜交。已知只有一個(gè)樣本 核酸連接的連接位置為有效的地址。在特定的實(shí)施方案中，將該復(fù)合物涂鋪到上述的光學(xué) 偵測(cè)器，且該樣本核酸固定至該地址陣列上的任意的連接位置。另外的實(shí)施方案中，可以適 當(dāng)方法將樣本核酸涂鋪至該地址陣列上的預(yù)定的連接位置，適當(dāng)?shù)姆椒ɡ缃?jīng)由機(jī)械或液 體處理裝置。 使核酸固定至固體支持物上的適當(dāng)方法已知。本發(fā)明的實(shí)施方案中，樣本核酸直接以共價(jià)連接固定在連接位置，例如以二硫鍵、硫酯鍵、酰胺鍵、磷酸二酯鍵、或酯鍵；或以非共價(jià)連接固定，例如抗體/抗原或生物素/抗生物素蛋白連接。本發(fā)明的實(shí)施方案中，以插入分子(intervening molecule)使樣本核酸固定至連接位置。本發(fā)明的實(shí)施方案中，該插入分子可為聚合酶，例如DNA聚合酶。 關(guān)于核酸的直接共價(jià)連接，阿迪西等人改良引物的5'端，包括SH官能基(Adeesiet al. ，2000， Nucleic Acid Research, 28 :87)。根據(jù)阿迪西等人的方法，核酸以50 ii M磷酸緩沖鹽溶液(PBS) (NaPi :0. 1M NaH2P04、 p朋.5、0. l麗aCl)制備。然后將約1-5 引物溶液涂鋪于硅烷化(silanised)玻璃玻片表面，在室溫下濕度控制箱中培養(yǎng)約5小時(shí)，使該引物連接至芯片表面。在連接反應(yīng)完成后，將該P(yáng)BS溶液在室溫下震動(dòng)清洗兩次，每次5分鐘，移除未連接的DNA。清洗后，將lOmMP -巰基乙醇加入該P(yáng)BS溶液中，在室溫下潤(rùn)濕該地址陣列表面，使未連接的DNA的巰基去活化。其次，清洗該陣列表面，例如一次以5X SSC0. 1^Tween及一次以5X SSC緩沖液清洗。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案中，使用阿迪西等人的方法，使樣本核酸固定至連接位置，例如，經(jīng)由測(cè)序引物或樣本核酸的5'端。
本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，該樣本核酸可包含例如生物素化核酸，連接至在該連接位置表面的抗生物素蛋白。另一實(shí)施方案中，該樣本核酸可包括抗原部份，例如BrdU或洋地黃毒苷(digoxigenin)，以抗體(或抗體片段)連接于該連接位置。"抗體"已知包括免疫球蛋白分子片段，包括例如一個(gè)或多個(gè)的CDR區(qū)域；或可變重鏈或可變輕鏈。抗體可以是天然地發(fā)生、重組或合成的?？贵w也可包括例如多株抗體及單株抗體的變異體。本發(fā)明的實(shí)施方案中，抗體連接其抗原的結(jié)合常數(shù)為至少106、107、108、10、或以上?？贵w的結(jié)構(gòu)、功會(huì)g及制造為已知技術(shù)(Gary Howard and Matthew Kasser，Making and Using Antibodies :A Practical Handbook CRC Press ;lst ed. (2006))。 另外的實(shí)施方案中，樣本核酸可由聚合酶固定至連接位置，例如DNA聚合酶。熟知此技術(shù)的人了解應(yīng)考慮保留酶功能的可獲取信息，例如酶的初級(jí)、次級(jí)、及三級(jí)結(jié)構(gòu)。例如已知的Taq及Phi29聚合酶的結(jié)構(gòu)(Kim et al. ， Nature, 376 :612-616(1995)和Kamtekaret al. ， Mol. Cell, 16 :609-618(2004))。聚合酶固定于表面的方法，如美國(guó)專利申請(qǐng)案2008/0199932及Korlach等人(PNAS 105:1176-1181(2008))所記載的保留活性。第8圖顯示本發(fā)明的實(shí)施方案的表示圖，該樣本核酸(即欲測(cè)序的核酸32、末端連接引物34、及測(cè)序引物346)經(jīng)由以工具384已經(jīng)連接于連接位置220的聚合酶38，連接至連接位置220，該工具384例如直接非共價(jià)吸收、抗體、生物素、或化學(xué)連接，如酰胺鍵。
本發(fā)明的實(shí)施方案中，連接位置的醛修飾表面以含醛的硅烷試劑處理。醛容易與蛋白質(zhì)表面的一級(jí)胺形成希夫(Schiff)堿連接。由于許多蛋白質(zhì)表面呈現(xiàn)賴氨酸，而且通常在NH2_端反應(yīng)性較強(qiáng)的a -胺，這些蛋白質(zhì)可以各種定位連接至玻片，使該蛋白質(zhì)的不同面與溶液中的其它蛋白或小分子作用。另一實(shí)施方案中，以UV光活化作用使photoNHS(N-羥基琥珀酰亞胺羧酸分子連接至具有碳鏈連接物的疊氮硝基苯(azidonitrobenzene)分子)連接至該裝置上的胺修飾表面。這些實(shí)施方案中，UV光激發(fā)疊氮硝基苯(azidonitrobenzene)的部份，去除氮后，產(chǎn)生高反應(yīng)性的氮烯(nitrene)。氮烯(nitrene)容易與上述裝置表面的NH2作用，形成聯(lián)胺(hydrazine)鍵。此連接物的其它端為NHS羧酸酯，與聚合酶表面的賴氨酸，形成酰胺共價(jià)鍵。另一實(shí)施方案中，該NHS羧酸酯與上述裝置表面的伯胺在緩沖環(huán)境中反應(yīng)。UV光用于活化疊氮硝基苯(azidonitrobenzene)的部份，形成高反應(yīng)性氮烯(nitrene)作為電子缺少組，容易與聚合酶上的賴氨酸殘基的伯胺反應(yīng)。此方法將詳細(xì)描述于以下的實(shí)施例4。
2. 2測(cè)序形式 本發(fā)明的生物檢測(cè)系統(tǒng)可以已知方法用于偵測(cè)及測(cè)序核酸(如美國(guó)專利案6， 946， 249及Shendure et al. ， Nat. Rev. Genet. 5 :335-44(2004))。本發(fā)明的實(shí)施方案中，測(cè)序方法根據(jù)DNA聚合酶或DNA連接酶的特異性決定，包括例如堿基延伸測(cè)序(單一堿基依序延伸)、合成的多堿基測(cè)序(包括如端標(biāo)記的核苷酸的測(cè)序)、及搖擺(wobble)測(cè)序，基于連接作用而決定。這些方法通常需要單鏈樣本核酸，包括至少一個(gè)末端連接引物(直接或間接)固定于連接位置上。然后以測(cè)序引物(基于連接酶的測(cè)序通常為錨引物(anchorprimer)，與測(cè)序引物為相似目的)開(kāi)始測(cè)序。 關(guān)于所有測(cè)序形式，本發(fā)明提供可再測(cè)序單一分子的優(yōu)點(diǎn)。例如，在完成測(cè)序讀取后，測(cè)序引物及延伸的核苷酸可自樣本核酸去除，清洗上述裝置，重復(fù)測(cè)序。在多個(gè)實(shí)施方案中，再測(cè)序可以相同或不同方法進(jìn)行。關(guān)于再測(cè)序相同分子，預(yù)期測(cè)序錯(cuò)誤降低為測(cè)序讀取數(shù)量的平方。例如當(dāng)單一讀取的每一堿基錯(cuò)誤率為10—3，則兩次讀取后，會(huì)降低至(10—3)2，即10—6。這對(duì)單一分子測(cè)序有特別的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)闇y(cè)序用的修飾核苷酸可失去其標(biāo)記或保護(hù)基(blocking group)而導(dǎo)致如偽缺失。
2. 2. 1堿基延伸測(cè)序逐步延伸 在實(shí)施方案中，本發(fā)明的光偵測(cè)裝置可用于進(jìn)行堿基延伸測(cè)序(美國(guó)專利案5， 302， 509)。本發(fā)明的實(shí)施方案中，堿基延伸測(cè)序開(kāi)始于使包括欲測(cè)序的單鏈核酸32、連接于欲測(cè)序的單鏈核酸32的3'端的末端連接引物34、及被黏合的測(cè)序引物346的部份雙鏈樣本核酸，連接至連接位置220，如第6圖所示。在實(shí)施方案中，然后將聚合酶38與修飾的核苷酸在適當(dāng)緩沖液中涂鋪于上述的光偵測(cè)裝置上。在實(shí)施方案中，上述樣本核酸復(fù)合物通過(guò)連接位置上的聚合酶被固定于連接位置。在實(shí)施方案中，上述核苷酸包括共價(jià)連接的可偵測(cè)標(biāo)記，例如熒光標(biāo)記，及保護(hù)基以避免任何次級(jí)延伸。因此，在測(cè)序引物346的3'端加上單核苷酸后停止測(cè)序。 第7圖顯示一實(shí)施方案中堿基延伸測(cè)序反應(yīng)的第一步驟。將帶有熒光保護(hù)基364的核苷酸362以DNA聚合酶38加入至測(cè)序引物346的3'端。在一些實(shí)施方案中，熒光標(biāo)記作用如保護(hù)基。在另外的實(shí)施方案中，熒光標(biāo)記為分離部份。單核苷酸附于測(cè)序引物346的3'端，根據(jù)對(duì)應(yīng)的光偵測(cè)器210辨識(shí)其標(biāo)記。然后移除該熒光標(biāo)記及保護(hù)基，例如使用化學(xué)或酶胞溶，允許額外增加的堿基延伸循環(huán)。在特定實(shí)施方案中，該標(biāo)簽與保護(hù)基可同時(shí)、之后、或以任何順序移除。經(jīng)由編輯加入的堿基順序，樣本核酸的序列以3'向5'的方向追溯，一次一個(gè)堿基。第9圖顯示各樣本核酸并行進(jìn)行延伸、偵測(cè)、及去保護(hù)/去標(biāo)記的一個(gè)循環(huán)。 通常，有兩種方法辨認(rèn)在逐步延伸時(shí)加入的核苷酸。 一種情形為，四種核苷酸皆有相同可偵測(cè)標(biāo)記，但是以預(yù)定的順序，一次加入一種。根據(jù)延伸反應(yīng)中核苷酸加入的順序，辨識(shí)延伸的核苷酸。另一種情形為在延伸時(shí)辨認(rèn)加入的堿基，將四種核苷酸同時(shí)加入，每一種連接不同、可區(qū)分的標(biāo)記。在不同的實(shí)施方案中，標(biāo)記的激發(fā)或發(fā)光的光譜及/或強(qiáng)度可能不同。加入延伸反應(yīng)中的核苷酸由偵測(cè)標(biāo)記的強(qiáng)度及/或波長(zhǎng)(即激發(fā)或發(fā)光光譜)辨識(shí)。這兩種方法的實(shí)施方案于以下實(shí)施方案5中說(shuō)明。
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2. 2. 2以合成方法測(cè)序多步驟延伸 在一些實(shí)施方案中，合成方法測(cè)序以多步驟無(wú)中斷的延伸反應(yīng)進(jìn)行，例如不使用保護(hù)基。這些實(shí)施方案中，以偵測(cè)核苷酸三磷酸水解后的磷酸釋放，例如P及Y磷酸復(fù)合物的釋放，監(jiān)測(cè)聚合反應(yīng)。這些復(fù)合物可直接被偵測(cè)，例如藉由該復(fù)合物上的熒光部份，或間接被偵測(cè)，例如使焦磷酸連接至化學(xué)或生物熒光偵測(cè)系統(tǒng)。 —些實(shí)施方案中，上述樣本核酸必須連續(xù)以末端_磷酸標(biāo)記的核苷酸測(cè)序。末端磷酸標(biāo)記的核苷酸及其使用方法的例子，例如美國(guó)專利案7， 361， 466及美國(guó)專利公開(kāi)案2007/0141598。簡(jiǎn)單地說(shuō)，使用于本發(fā)明裝置的核苷酸，當(dāng)在聚合反應(yīng)時(shí)水解，則標(biāo)記的焦磷酸可被對(duì)應(yīng)的光偵測(cè)器偵測(cè)。 一些實(shí)施方案中，四種核苷酸皆包括一種標(biāo)記，且可同時(shí)加入。 一些實(shí)施方案中，核苷酸包括不能辨別，例如相同的標(biāo)記，并以預(yù)定順序依序加入。帶有無(wú)法辨別的標(biāo)記的核苷酸，依序、循環(huán)的添加，仍然可進(jìn)行多步驟、無(wú)中斷的聚合步驟，例如以均聚物的順序。
2. 2. 3基于連接酶的測(cè)序 其它實(shí)施方案中，樣本核酸以本發(fā)明的光學(xué)偵測(cè)器經(jīng)基于連接酶的測(cè)序方法測(cè)序?；谶B接酶的測(cè)序方法例如如美國(guó)專利案5，750，341及薛杜爾等人(Shendure et al.，2005， Science, 309 :1728-1732)所公開(kāi)。在薛杜爾等人的方法中，兩個(gè)末端連接引物位于未知的單鏈DNA樣本的兩側(cè)，并固定于固體支持物上。未知序列上的特定位置(例如接近特定的末端連接引物的第n個(gè)堿基)，以所謂錨引物(類似測(cè)序引物)黏合于末端連接引物之一來(lái)檢查，然后在此混合物中加入4個(gè)簡(jiǎn)并的九元體(degenerate nonamer)。此四個(gè)九元體皆具有獨(dú)特的熒光標(biāo)記，并在所有位置皆會(huì)簡(jiǎn)并，除了有疑問(wèn)的位置，每個(gè)九元體檢視
不同的堿基-A、C、G、或T。清洗樣本、熒光掃描，辨識(shí)有疑問(wèn)的堿基。然后去除樣本核酸中的錨引物及連接的九元體，清洗該裝置，并重復(fù)步驟、尋找其它有疑問(wèn)的位置。此方法的優(yōu)點(diǎn)在于無(wú)累進(jìn)性，即堿基不需依順序?qū)ふ?。因此，錯(cuò)誤不會(huì)累積。而且，此方法可尋找從5'或3'方向有疑問(wèn)的位置，即不需如傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)以5'向3'方向的DNA合成?？偣布s13個(gè)堿
基的樣本核酸通?？捎么朔椒y(cè)序。
2. 3應(yīng)用 本發(fā)明的生物檢測(cè)系統(tǒng)可同時(shí)偵測(cè)百萬(wàn)個(gè)核酸片段。如果每一片段例如為1000個(gè)堿基長(zhǎng)度，一裝置可依此進(jìn)行十億個(gè)以上的堿基序列。以下討論為上述裝置的額外應(yīng)用及其方法。 2. 3. 1整段基因組測(cè)序 本發(fā)明的生物檢測(cè)系統(tǒng)可用于進(jìn)行例如細(xì)菌、真菌、真核生物、或脊椎動(dòng)物，例如哺乳類，例如人類的整段或部份基因組測(cè)序?；蚪MDNA可切成至少20、50、100、200、300、500、800、1200、1500個(gè)核苷酸長(zhǎng)度或以上的片段，進(jìn)行測(cè)序。 一些實(shí)施方案中，切斷的基因組DNA可為20-50、20-100、20-500、20-1000、500-1200或500-1500個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。在一些實(shí)施方案中，預(yù)測(cè)序的核酸沿著相關(guān)末端連接引物制成單鏈，黏合至測(cè)序引物，并涂鋪于本發(fā)明的裝置，進(jìn)行如上述的測(cè)序。
2. 3. 2基因表達(dá)型態(tài) 在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明之生物檢測(cè)系統(tǒng)可用于測(cè)序cDNA以了解基因表達(dá)型態(tài)。例如，mRNA的量可由測(cè)量裝置上偵測(cè)的特定序列的相對(duì)頻率而定量。數(shù)百萬(wàn)個(gè)cDNA分
17子可在本發(fā)明的裝置上并行測(cè)序。假如一細(xì)胞包含平均350，000個(gè)mRNA分子，在每個(gè)細(xì)胞中即使以一個(gè)拷貝呈現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄物，預(yù)期在一百萬(wàn)測(cè)序反應(yīng)中也可測(cè)序約3次。因此，本發(fā)明的裝置適合具有單一復(fù)制數(shù)量靈敏度的單一分子測(cè)序。 cDNA合成為已知，通常包括具有選擇性富有mRNA的完整RNA。由mRNA形成cDNA的步驟包括，例如在第一鏈合成時(shí)的反轉(zhuǎn)錄作用；RNA酶處理移除剩余的RNA ;隨機(jī)六元體(random hexamer)引發(fā)該第一鏈，及DNA聚合酶合成第二鏈。所得的cDNA適合在本發(fā)明的裝置上測(cè)序。分離及制備DNA及RNA的方法為已知(Jos印h Sambrook and David Russell，Molecular Cloning :A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press ;3rded. (2001))。 —些實(shí)施方案中，cDNA的測(cè)序如美國(guó)專利案6， 812， 005及7， 361， 488所公開(kāi)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，cDNA以適應(yīng)物多核酸連接，該適應(yīng)物經(jīng)特殊化限制酶加工，最后該加工過(guò)的核酸連接至固定于本發(fā)明裝置的連接位置的互補(bǔ)的寡核苷酸。特定的實(shí)施方案中，該適應(yīng)物分子為末端連接引物。 本發(fā)明的實(shí)施方案中，mRNA的聚A尾可作為適當(dāng)?shù)哪┒诉B接引物，其互補(bǔ)于聚A測(cè)序引物。 2. 3. 3偵測(cè)及/或測(cè)量連接作用 其它實(shí)施方案中，上述生物檢測(cè)系統(tǒng)可用于偵測(cè)多種連接作用，包括例如DNA/DNA、RNA/RNA、或DNA/RNA堿基配對(duì)、核酸/蛋白質(zhì)作用、抗原/抗體、受體/配位體連接、及酶/底物連接。樣本分子通常固定于包含一辨識(shí)核酸標(biāo)簽(ID)的連接分子。 一些實(shí)施方案中，該連接分子進(jìn)一步包括連接樣本分子的捕捉分子。連接分子也包括連接至連接位置的方法，例如加速共價(jià)化學(xué)連接的部份，例如二硫鍵、硫酯、酰胺、磷酸二酯、或酯連接；或非共價(jià)連接，例如抗體/抗原或生物素/抗生物素蛋白連接。在一些實(shí)施方案中，連接分子以ID巻標(biāo)固定于上述陣列中。 樣本分子涂鋪于本發(fā)明的裝置上，并藉由其連接分子固定至隨機(jī)連接位置，例如藉由連接位于該連接分子上的捕捉分子。 一些實(shí)施方案中，混合樣本分子及連接分子，使其連接，然后涂鋪至本發(fā)明的裝置。 一些實(shí)施方案中，該連接分子首先涂鋪至該裝置，使其固定于連接位置，然后再涂鋪該樣本分子。然后，以本發(fā)明方法(如藉由雜交或測(cè)序)偵測(cè)ID，辨識(shí)相關(guān)的樣本分子。多個(gè)樣本分子種類可固定于相同陣列，由其巻標(biāo)區(qū)分，而使用其連接的捕捉分子的獨(dú)特ID作為其連接作用的特征。因此，一些實(shí)施方案中，偵測(cè)巻標(biāo)樣本分子的方法，包括使用包括核酸標(biāo)簽(ID)的連接分子，使樣本分子連接至本發(fā)明的裝置的連接位置，進(jìn)行該ID的核酸測(cè)序，并偵測(cè)標(biāo)記的樣本分子。特定的實(shí)施方案中，該核酸測(cè)序?yàn)閴A基延伸測(cè)序，或末端磷酸標(biāo)記的核苷酸測(cè)序。 使用核苷酸"小段(bits)"，可在本發(fā)明的生物檢測(cè)系統(tǒng)上固定及辨識(shí)最多至4n可區(qū)別的捕捉分子，其中n為代表ID測(cè)序的長(zhǎng)度的整數(shù)。例如，5個(gè)核苷酸可提供千個(gè)以上獨(dú)特的ID，而12個(gè)核苷酸提供1千6百萬(wàn)以上的組合。例如，連接分子固定于本發(fā)明的裝置，以偵測(cè)其對(duì)應(yīng)ID巻標(biāo)確定其位置。該連接分子然后可作為探針，例如調(diào)查與一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的樣本分子的連接作用。即固定一個(gè)或多個(gè)連接分子的裝置可作為探針陣列。
特定的實(shí)施方案中，標(biāo)記的樣本分子為熒光標(biāo)記。當(dāng)連接于連接分子的捕捉分子時(shí)，標(biāo)記的樣本分子由對(duì)應(yīng)該連接位置的光偵測(cè)器偵測(cè)，該連接分子固定于該連接位置。因此， 一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括將標(biāo)記樣本分子涂鋪于本發(fā)明的裝置上，并 偵測(cè)該標(biāo)記的樣本分子。特定實(shí)施方案中，該裝置具有包括核酸巻標(biāo)(ID)的連接分子，固 定于其連接位置上。多種標(biāo)記的樣本分子可同時(shí)涂鋪于探針陣列，并藉由例如其熒光標(biāo)記 的強(qiáng)度及/或波長(zhǎng)，由其標(biāo)記分化。樣本分子與標(biāo)記的詢問(wèn)分子間的連接作用的分離數(shù)，根 據(jù)在標(biāo)記的詢問(wèn)分子的固定濃度下，動(dòng)力學(xué)(如進(jìn)入/移出比例)及統(tǒng)計(jì)學(xué)(如任何固定 時(shí)間內(nèi)樣本分子在連接或未連接狀態(tài)的分配)，受到干擾。 一些實(shí)施方案中，連接分子的ID至少為5、10、15、20、25、30、40、50、75、90、100、 150、200個(gè)或以上的核苷酸長(zhǎng)度。在一些實(shí)施方案中，該ID為5-10、20、40、80、或160 ;或 為10-20或50 ;或?yàn)?0-35個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。該ID包括獨(dú)特的核酸序列，即欲偵測(cè)的核酸。 特定的實(shí)施方案中，該獨(dú)特的核酸序列可為至少1、2、4、6、8、10、12、14、16、20、24、30個(gè)或 以上的核苷酸長(zhǎng)度。 一些實(shí)施方案中，該獨(dú)特的核酸序列為4-10、12、15、或20個(gè)核苷酸長(zhǎng) 度；或10-20個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。該ID包括至少一個(gè)末端連接引物，即該ID包括互補(bǔ)于測(cè)序引 物的序列， 一些實(shí)施方案中，該ID經(jīng)修飾連接于連接位置，如藉由包括生物素化的核苷酸。 在一些實(shí)施方案中，該ID的末端連接引物部份為3'端至該獨(dú)特核酸序列。 一些實(shí)施方案 中，該ID的末端連接引物部份為5'端至該獨(dú)特核酸序列。其它的實(shí)施方案中，末端連接引 物表達(dá)在該獨(dú)特核酸序列的3'端及5'端。 在特定實(shí)施方案中，樣本分子與捕捉分子包括一部份選自碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白 質(zhì)、肽、抗原、核酸、激素、小有機(jī)分子(如醫(yī)藥)、或維生素部份；或其組合。這些部份可為天 然發(fā)生(如生化上純化的)或合成的(如化學(xué)合成或重組產(chǎn)生的)。而且，這些基質(zhì)可不包 含非原始組成物、包含一些非原始組成物、或包含的皆非原始組成物(如非天然的氨基酸、 保護(hù)基(blockinggroup)或保護(hù)基(protecting group)等)。在特定的實(shí)施方案中，樣本 分子或捕捉分子為蛋白質(zhì)，例如生長(zhǎng)因子、肽抗原、抗體、或受體。 使核酸連接至連接分子或連接位置的多種方法為已知(美國(guó)專利公開(kāi)案 2004/0038331)。美國(guó)專利公開(kāi)案2004/0038331公開(kāi)形成連接于固相支持物上的蛋白寡核 苷酸的方法。美國(guó)專利案第4，748，111提供一例，使蛋白質(zhì)連接至核酸的3'端。其中，首 先使用端轉(zhuǎn)移酶在該分子的3'部份加上核糖殘基。然后進(jìn)行過(guò)碘酸氧化反應(yīng)，在該核酸上 產(chǎn)生3'醛基，然后與蛋白質(zhì)的酰胺基形成共價(jià)鍵。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)連接至該ID的3'端時(shí)，該ID 的5'端連接至連接位置。 —些實(shí)施方案中，捕捉分子例如蛋白質(zhì)，連接至該ID的5'端。這些實(shí)施方案中，該 ID的3'端或測(cè)序引物的5'端用于將捕捉分子固定至連接位置。例如美國(guó)專利案6， 013434 公開(kāi)寡核苷酸聚酰胺的連接，該連接是經(jīng)由該寡核苷酸的5'端。美國(guó)專利案6， 197， 513公 開(kāi)PNA與DNA皆藉由該核酸的5'端，連接于帶有羧酸部份的分子，例如蛋白質(zhì)。該P(yáng)NA與 DNA分子包括芳基胺或胺基氧基乙?；糠荨Ｃ绹?guó)專利案6， 153， 737公開(kāi)包括至少一個(gè)2' 官能化核苷酸的寡核苷酸，適合連接各種分子。
2. 3.4額外的偵測(cè)方法
2. 3. 4. 1FRET —些實(shí)施方案中，本發(fā)明的光學(xué)偵測(cè)器以福斯特共振能量轉(zhuǎn)移(F6ster resonance energy transfer ;FRET)偵領(lǐng)lj分子，亦禾爾為熒光共振會(huì)g量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer)。如本技術(shù)領(lǐng)域中所周知，F(xiàn)RET出現(xiàn)在當(dāng)激發(fā)的提供者分子
19非放射性轉(zhuǎn)移能量至接受者分子時(shí)，此轉(zhuǎn)移會(huì)發(fā)出能量，通常是光的形式。FRET可協(xié)助減 輕背景信號(hào)，藉由例如在對(duì)欲偵測(cè)分子進(jìn)行有效激發(fā)與發(fā)出波長(zhǎng)間，提供較大的光譜分離。 FRET通常用于偵測(cè)相近的分子作用，因?yàn)槠溆行У厮〕蔀槲挥谔峁┱吲c接受者分子距離 間的第六力。例如曾等人以FRET偵測(cè)的核酸雜交(Zhang et al. ， NatureMaterials 4: 826-31(2005))。其中，將生物素化的核酸目標(biāo)連接至抗生物素蛋白包覆的量子點(diǎn)提供者， 然后，激發(fā)Cy5-連接的DNA探針。本發(fā)明的實(shí)施方案中，標(biāo)記的捕捉分子與標(biāo)記的樣本分 子可形成提供者/接受者(反之亦然)對(duì)以FRET偵測(cè)。 本發(fā)明的核酸測(cè)序的實(shí)施方案中，熒光標(biāo)記的核苷酸作用如接受者熒光團(tuán) (chromophore)，對(duì)連接于聚合酶或連接酶的提供者熒光團(tuán)(chromophore)。因此，在這些 實(shí)施方案中，位于聚合酶或連接酶的提供者熒光團(tuán)，激發(fā)該樣本分子上聚合的或連接的核 苷酸上的接受者熒光團(tuán)。不接近于聚合酶的核苷酸不被激發(fā)，因?yàn)镕RET效能快速下降的 原因。本發(fā)明的實(shí)施方案中，提供者分子為例如另一熒光團(tuán)(fluorophore)，例如量子點(diǎn)。 量子點(diǎn)，例如半導(dǎo)體量子點(diǎn)為此技術(shù)領(lǐng)域中所已知(W003/00015)。偶合量子點(diǎn)的工具， 例如已知的生物分子在例如(Mednitz et al. ， Nature Materials4 :235-46 (2005) ;USP 2006/0068506、2008/0087843)中進(jìn)行了綜述。在一些實(shí)施方案中，量子點(diǎn)連接至DNA聚合 酶分子，進(jìn)一步描述于以下的實(shí)施方案3。如上述已討論的使酶連接至連接位置，熟知此項(xiàng) 技術(shù)者無(wú)疑地可了解當(dāng)連接熒光團(tuán)至例如DNA聚合酶或連接酶時(shí)，須注意保留酶功能，藉 由減輕熒光團(tuán)連接于初級(jí)、次級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)酶的任何影響。
2. 3. 4. 2多光子激發(fā) 本發(fā)明的實(shí)施方案中，熒光團(tuán)被兩種或以上的光子激發(fā)。例如，在本發(fā)明的實(shí)施方 案中，F(xiàn)RET的提供者或接受者熒光團(tuán)的激發(fā)，是經(jīng)過(guò)兩種或以上的光子。兩光子及多光子 的激發(fā)進(jìn)一步討論于美國(guó)專利案6， 344， 653及5， 034， 613。
2. 3. 4. 3時(shí)間分辨的偵測(cè)(Time Resolved Detection) 本發(fā)明的實(shí)施方案中，本發(fā)明的裝置中的光源與光偵測(cè)器，可調(diào)整具有獨(dú)特的相 移動(dòng)(phase shift)。例如公開(kāi)于美國(guó)專利公開(kāi)案2008/0037008的已知方法，由本發(fā)明的 裝置上偵測(cè)到的分子發(fā)出的光，可由對(duì)應(yīng)的光偵測(cè)器測(cè)量，而無(wú)來(lái)自激發(fā)光源的干擾。
3.使用本生物檢測(cè)系統(tǒng)的生物分子分析服務(wù) 本發(fā)明亦提供一種生物分子分析服務(wù)，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案使用該生物檢測(cè)系 統(tǒng)。本發(fā)明的實(shí)施方案中，此方法包括從服務(wù)需求者提供包括欲分析的生物分子的樣本，給 服務(wù)提供者，及服務(wù)需求者從服務(wù)提供者收到分析結(jié)果，其中，該結(jié)果來(lái)自本發(fā)明的裝置。 本發(fā)明的實(shí)施方案中，此方法可考慮報(bào)酬，例如無(wú)服務(wù)費(fèi)或契約服務(wù)同意。而且，該樣本可 直接由服務(wù)需求者運(yùn)送至服務(wù)提供者，或者中間經(jīng)由一賣家。在一些實(shí)施方案中，服務(wù)提供 者或賣家可位于美國(guó)領(lǐng)土以外的地區(qū)，例如其它國(guó)家。 關(guān)于此所引述的所有專利案、專利申請(qǐng)案、或其它參考文獻(xiàn)，應(yīng)可了解其診體作為 本發(fā)明內(nèi)容參考的目的及引用的陳述。任何介于參考文獻(xiàn)與本發(fā)明內(nèi)容的沖突，以本發(fā)明 內(nèi)容為主。 由本說(shuō)明書內(nèi)引述的參考資料的教示，可最充分了解本說(shuō)明書。本說(shuō)明書中的實(shí) 施方案提供本發(fā)明的具體實(shí)施的說(shuō)明，不應(yīng)作為構(gòu)成本發(fā)明范圍的限制。熟知此技術(shù)領(lǐng)域 之人可容易了解本發(fā)明包含多種其它的實(shí)施方式。此所引用的所有公開(kāi)物及專利案全文作為參考。關(guān)于參考文獻(xiàn)所使用的材料或與本說(shuō)明書中不一致之處，本發(fā)明可置換任何該等 材料。此引述的任何參考文獻(xiàn)并不意指為本案的先前技術(shù)。 除非有特別說(shuō)明，所有整數(shù)、反應(yīng)條件等使用于本說(shuō)明書(包括申請(qǐng)專利范圍)中 的代表量化的數(shù)字，皆可被修飾為"約"。因此，除非有特別說(shuō)明為相反者，數(shù)字參數(shù)為大約 數(shù)值，且可根據(jù)本發(fā)明欲獲得的所需性質(zhì)而改變。為了不限制本案申請(qǐng)專利范圍的均等范 圍，每一數(shù)字參數(shù)應(yīng)由明顯數(shù)字及已知方法所使用的數(shù)字所構(gòu)成。 除非有特別說(shuō)明，"至少"一詞在多個(gè)組件前，可了解其依序意指每一組件。熟知此 技術(shù)的人士可辨認(rèn)或確認(rèn)慣例試驗(yàn)中所使用者為本發(fā)明之特定實(shí)施方案中的均等物。以下 的申請(qǐng)專利范圍亦包含該述之均等物。
實(shí)施例 實(shí)施例1高通量生物檢測(cè)系統(tǒng)的制造 生物檢測(cè)系統(tǒng)1的制造方法將于以下并第1-4圖詳細(xì)說(shuō)明。首先，在該硅基材10 上表面具有多個(gè)光偵測(cè)器210，以商業(yè)可購(gòu)得的0. 25 ii m半導(dǎo)體制程，形成一般具邏輯的光 學(xué)裝置。光偵測(cè)器210為光二極管光子偵測(cè)器，每一光偵測(cè)器具有直徑24 ii m，曝光區(qū)域 452 ii m2。每一光偵測(cè)器彼此相鄰排列，因此光偵測(cè)器210的512欄與512列陣列形成于基 材10上。 多個(gè)控制線圈215形成于沒(méi)有光偵測(cè)器210的基材10的上表面。此實(shí)施方案中， 控制線圈215對(duì)應(yīng)至光偵測(cè)器210，并控制對(duì)應(yīng)的光偵測(cè)器210及控制光偵測(cè)器210及偵測(cè) 與記錄系統(tǒng)2間的聯(lián)系。 此實(shí)施方案中，濾光層240形成于光偵測(cè)器210與控制線圈215的上表面。在形 成濾光層240前，對(duì)光偵測(cè)器210及控制線圈215的上表面進(jìn)行全面平坦化制程。濾光層 240包括多個(gè)亞層。此實(shí)施方案中，濾光層240的形成，首先由具有較高反射系數(shù)的亞層沉 積于上述光偵測(cè)器210及控制線圈215的平坦化的上表面。然后，具有較低反射系數(shù)的亞 層沉積于已形成的具有較高反射系數(shù)的亞層上。藉由連續(xù)沉積較高反射系數(shù)及較低反射系 數(shù)的亞層，直到大量如上述的亞層沉積后，形成濾光層240。此實(shí)施方案中，濾光層240包括 101個(gè)亞層。 第5圖為總結(jié)濾光層240建構(gòu)的實(shí)施方案的表。第5圖中，較小編號(hào)的亞層表示 較接近濾光層240底面的亞層，較大編號(hào)的亞層表示較接近濾光層240上表面的亞層。如 第5圖所示，在此特定的實(shí)施方案中，濾光層240的奇數(shù)號(hào)的亞層由例如氧化鈮(Nb205)構(gòu) 成，具有較高的反射系數(shù)。偶數(shù)號(hào)的亞層由例如氧化硅(Si02)構(gòu)成，具有較低的反射系數(shù)。 這些亞層可使用濺鍍系統(tǒng)形成，例如使用自由基輔助濺鍍系列RAS1100型(Shincron Co.， Ltd ;Shinagawa-ku， Tokyo, JAPAN)。此實(shí)施方案的每一亞層厚度亦顯示于第5圖。所獲得 的濾光層240，對(duì)于熒光團(tuán)Cy5的熒光，濾光層240具有高透光性，對(duì)于自氦_氖激光以約 633nm波長(zhǎng)發(fā)出的光，濾光層240具有低透光性，該氦_氖激光可作為一外在光源激發(fā)熒光 團(tuán)Cy5。 關(guān)于第2及4圖，具有小孔235的遮光片230形成于濾光層240上。于濾光層240
或基材10上形成具有小孔235的遮光片230的制造方法，將詳述于下。 首先，藉由例如在濾光層240上旋轉(zhuǎn)涂布光阻材料，當(dāng)濾光層240選擇性形成于光偵測(cè)器210及控制線路215的上表面時(shí)，在該濾光層240上形成光阻層，或者當(dāng)該濾光層未 形成時(shí)，在光偵測(cè)器210及控制線路215的平坦化上表面上形成光阻層。之后，使該光阻層 顯影，在小孔區(qū)域形成光阻圖案。該光阻圖案系使用光罩覆蓋該小孔區(qū)域而形成，并曝光該 光阻層，因此只有光罩覆蓋的區(qū)域保留在濾光層240或光偵測(cè)器210及控制線路215的平 坦化上表面。 然后，將金屬層沉積于濾光層240上形成光阻圖案處。此實(shí)施方案中，該金屬層包 含鉻(Cr)，藉由磁控濺鍍步驟，沉積于濾光層240或光偵測(cè)器210及控制線路215的平坦化 上表面。 之后，移除在該小孔區(qū)域的部分金屬層及光阻圖案，形成具有小孔235的遮光片 230。 另一實(shí)施方案中，遮光片230的形成由首先沉積金屬層(如Cr)于濾光層240上， 然后在該金屬層上形成罩幕，使該金屬層的部分上表面曝光。然后蝕刻該曝光的金屬層部 分，直到露出濾光層240，在該金屬層上形成小孔。然后，自該金屬層移除罩幕，在濾光層 240上形成具有小孔235的遮光片230。 如第2及4圖所示，此實(shí)施方案中，連接位置220的形成系藉由將支持材料填充至 小孔235或孔穴450。該支持材料可為聚合物或無(wú)機(jī)材料，對(duì)于熒光團(tuán)36發(fā)出的熒光具有 透光性。 雖然第1圖僅顯示12個(gè)光學(xué)偵測(cè)器20，但是可了解至少10， 000個(gè)光學(xué)偵測(cè)器20 可形成于基材10上。此實(shí)施方案中，例如每個(gè)光學(xué)偵測(cè)器20為具有半徑約5 ii m或以下的 圓形，面積約100 iim2。對(duì)于面積1平方英寸(即2. 54x2. 54cm2)的基材IO，可建構(gòu)六百萬(wàn) 個(gè)以上的光學(xué)偵測(cè)器20于基材10上。由于同時(shí)操作六百萬(wàn)個(gè)光學(xué)偵測(cè)器20，可高通量地 偵測(cè)生物分子。 實(shí)施例2高通量生物檢測(cè)系統(tǒng)中生物分子的附著及偵測(cè) 使用熒光染色Cy5標(biāo)記的核酸，測(cè)試上述偵測(cè)系統(tǒng)。Cy5及生物素分別固定于60 元體(60-mer)寡核苷酸的3'及5'端。該標(biāo)記與生物素化的DNA溶于TrisMg(10mM Tris， 10mM NaCl，100mM MgCl2，pH8. 0)緩沖液，沉積于該地址陣列上，于潮濕環(huán)境(wet chamber) 中培養(yǎng)。約30分鐘后，以Tris緩沖液洗去未連接的DNA。 激發(fā)光形成于遮光片上，由635nm發(fā)光二極管提供。為了讀取每一像素的信號(hào)，激 發(fā)光存在約l-5秒，記錄每一像素的信號(hào)，重復(fù)此循環(huán)100回。然后計(jì)算每一像素的代表平 均信號(hào)及標(biāo)準(zhǔn)差。比較DNA樣本沉積前后的信號(hào)，具有平均信號(hào)差大于3倍標(biāo)準(zhǔn)差的總合 的像素，視為正像素，即(沉積后的平均值-沉積前的平均值)〉3x(沉積后的標(biāo)準(zhǔn)差+沉 積前的標(biāo)準(zhǔn)差)。 實(shí)施例3聚合酶的連接量子點(diǎn) 以下為官能化量子點(diǎn)連接至聚合酶分子上的伯胺的兩種方法。第一種方法使用胺
活化點(diǎn)，第二種方法使用羧基活化點(diǎn)。 3. 1胺EVITAG 對(duì)DNA聚合酶的共軛 胺EVITAGTM(如Evident Technologies, cat能2-Cll-AM2-0620 ;EVITAG 合適的 QD產(chǎn)物亦以商標(biāo)eFluorTM由eBioscience， Inc. ， San Diego， CA販賣)官能化的量子點(diǎn) (QD)，由BS3 (雙-(磺基琥珀酰亞胺基)辛二酸)、同質(zhì)雙官能化的水溶性交聯(lián)劑活化，胺
22EVITAGTm官能化的量子點(diǎn)(QD)在8碳的間隔臂(spacer arm)的每一端包括一胺反應(yīng)性 N-羥基磺基琥珀酰亞胺(NHS)酯。NHS酯與QD表面的伯胺在pH7-9反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺 鍵，并釋放出N-羥基磺基琥珀酰亞胺離去基。T叫DNA聚合酶或Phi29DNA聚合酶具有數(shù)個(gè) 伯胺(例如賴氨酸(K)殘基與每一多肽的N端)為NHS酯交聯(lián)的目標(biāo)。
3. 1. 1.量子點(diǎn)的表面活性 以25iiL 10mM BS3 (雙-(磺基琥珀酰亞胺基)辛二酸；Pierce， Part#21580)及 25 ii L 10xPBS (磷酸緩沖鹽溶液，pH7. 4)，添加去離子水使終體積為250 y L，活化2. 0,1 的EVITAGTm。培養(yǎng)30分鐘后，使用PD-10柱(AmershamBiosciences，產(chǎn)品編號(hào)17-0851-01) 使此溶液脫鹽，以lxPBS洗提。染色部分包含活化的QD。
3. 1.2.DNA聚合酶的偶聯(lián) 于上述混合物中加入于0. 1M碳酸鈉緩沖液的100 ii g的DNA聚合酶，pH9. 2，使聚 合酶偶聯(lián)。充分混合后，該樣本培養(yǎng)于4t:傾斜旋轉(zhuǎn)2小時(shí)。
3. 1. 3. QD-共軛的聚合酶的純化 將此連接物以30K微旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器(Pall Corporation, Part#OD 100C33)6000rpm 離心5-10分鐘，濃縮至總體積 200 iU。在30K微旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器上以去離子水清洗該連接物 兩次。 接著，以Superdex 30/75樹(shù)月旨(GE Healthcare,part#17-0905_10或17-1044-10 對(duì)小蛋白及肽)體積排除，純化上述連接物。該柱先以去離子水進(jìn)行預(yù)先平衡，再添加濃縮 的上述連接混合物，使其進(jìn)入柱床。該樣本在黑光激發(fā)下以去離子水洗提，收集熒光部分。 集合該熒光部分，并以100K微旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器以6， OOOrpm離心5_10分鐘，濃縮至總體積為 100 ill 。此純化及濃縮的連接物儲(chǔ)存于4°C 。
3. 2羧基EVITAG 對(duì)DNA聚合酶的共軛羧基EVITAG (如Evident Technologies, cat能2-Cll-CB2-0620)官能化的量子 點(diǎn)(QD)，經(jīng)由EDC-媒介的磺基-NHS酯連接反應(yīng)活化。該胺反應(yīng)的磺基_NHS酯與例如Taq DNA聚合酶或Phi29DNA聚合酶上的伯胺的側(cè)鏈賴氨酸(K)殘基反應(yīng)。
3. 2. 1.量子點(diǎn)的表面活性 將2. Onmol的EVITAG 稀釋于25mM MES pH5. 0緩沖液中。使用前，將EDC(l-乙 基_3-[3- 二甲基氨基丙基]碳化二亞胺鹽酸鹽；Pierce， part#22980)溶于冷的25mM MES pH5. O，使?jié)舛葹?0mg/ml。另外，同樣準(zhǔn)備于25mMMES pH5. 0中的磺基-NHS酯(Pierce, part#24525)溶液50mg/ml。接著，再將50 ill的EDC溶液及50 y 1的磺基-NHS溶液加入該EVITAGTM溶液中。 將此混合物均勻混合，以慢傾斜旋轉(zhuǎn)室溫下培養(yǎng)30分鐘。然后使用PD-10柱(Amersham Biosciences,產(chǎn)品編號(hào)17_0851_01)去除該混合物的鹽，以pH9. 2的0. IM碳酸鈉緩沖液洗 提。收集含有活化QD的顏色部分。
3. 2. 2. DNA聚合酶偶聯(lián)將pH9. 2的0. 1M碳酸鈉緩沖液中的100 y g的DNA聚合酶加入上述混合物中。充 分混合后，將此樣本以傾斜旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)于4°C 2小時(shí)。
3. 2. 3. QD-結(jié)合的聚合酶之純化 以30K微旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器(Pall Corporation, part#0D100C33) 6， OOOrpm離心5-10分
23鐘濃縮此連接物至 200iU的總體積。在30K微旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器上以去離子水清洗兩次。接 著，使用Superdex 30/75樹(shù)脂體積排除，純化此連接物。 此柱以去離子水預(yù)先平衡。然后將濃縮的偶聯(lián)混合物加入該柱中，使其進(jìn)入柱床。 此柱在黑光激發(fā)下以去離子水洗提，收集熒光部分。集合熒光部分，以IOOK微旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器 6， OOOrpm離心5_10分鐘濃縮至 100 y 1的總體積。此純化及濃縮的結(jié)合物儲(chǔ)存于4°C 。
實(shí)施例4 :連接聚合酶至該裝置 以下說(shuō)明使用photoNHS(N-羥基琥珀酰亞胺羧酸酯分子連接至帶有碳鏈連接物 的疊氮硝基苯(azidonitrobenzene)分子)附加于酶(例如聚合酶)以連接至裝置的兩種 方法。 4. 1UV表面活化 使用photoNHS附加于聚合酶以連接于該裝置的胺修飾表面，經(jīng)UV光活化。UV 光激發(fā)該疊氮硝基苯(azidonitrobenzene)部分，藉由去除氮分子，形成高反應(yīng)性的氮烯 (nitrene)基。氮烯(nitrene)與該裝置的表面NH2作用，形成聯(lián)胺鍵。該連接物的另一端 為NHS羧酸酯，與該聚合酶上的賴氨酸殘基形成酰胺共價(jià)鍵。
4. 1. 1.表面制造將lmM的photoNHS(Sigma， Art No. A3407，分子量390. 35)溶液準(zhǔn)備于95%乙醇 中。胺修飾表面先以碳酸緩沖液(pH9.3)、然后95X乙醇清洗。接著，將此photoNHS溶液 涂鋪于該胺修飾表面。以254-365nm UV光照射該表面3分鐘，再以95%乙醇潤(rùn)濕三次。
4. 1. 2.胺的終止加蓋(end-c即)準(zhǔn)備10mM N-乙酰氧基琥珀酰亞胺溶液于碳酸緩沖液(pH9. 3)，并涂鋪于該表面， 使任何未反應(yīng)的胺終止加蓋(end-c即)。將此裝置以溫和搖晃培養(yǎng)于室溫2小時(shí)。接著以 碳酸緩沖液及蒸餾去離子水清洗該表面3次。
4. 1.3.DNA聚合酶的偶聯(lián) 接著，將碳酸緩沖液(pH9. 3)中的lmM DNA聚合酶溶液涂鋪于上述表面，在持續(xù)溫 和搖晃下室溫培養(yǎng)2小時(shí)。然后以碳酸緩沖液及pH7. 4的PBS(磷酸緩沖鹽溶液)清洗上 述表面3次。此聚合酶鍵連的表面儲(chǔ)存于4t:。 4. 2緩沖表面的活化 在另外的實(shí)施方案中，photoNHS可在緩沖環(huán)境下活化并結(jié)合至上述表面。然后在
聚合酶存在下，使用UV光活化疊氮硝基苯(azidonitrobenzene)部分。同樣，在UV光下形
成高反應(yīng)性氮烯(nitrene)為電子缺少基，容易與聚合酶表面的伯胺作用，形成共價(jià)鍵連
接于上述表面。 4. 2. 1.表面的準(zhǔn)備 lmM的photoNHS(Sigma， Art No. A3407,分子量390. 35)溶液準(zhǔn)備于碳酸緩沖液 (pH9.3)中。以碳酸緩沖液(pH9.3)潤(rùn)濕胺修飾表面。將此photoNHS溶液涂于該胺修飾表 面，在持續(xù)溫和搖晃下培養(yǎng)2小時(shí)。然后以碳酸緩沖液潤(rùn)濕該表面3次。
4. 2. 2.胺的終止加蓋(end-c即) 準(zhǔn)備10mM N-乙酰氧基琥珀酰亞胺溶液于碳酸緩沖液(pH9. 3)，并涂鋪于該表面， 使任何未反應(yīng)的胺基終止加蓋(end-c即)。將此裝置以溫和搖晃培養(yǎng)于室溫2小時(shí)。接著 以PBS緩沖液(pH7. 4)潤(rùn)濕3次。
4. 2. 3. DNA聚合酶的偶聯(lián) 接著，將PBS緩沖液(pH7.4)中的ImM DNA聚合酶溶液涂鋪于上述終止加蓋 (end-cap)表面。以254_365nm UV光照射該表面3分鐘，然后以PBS (pH7. 4)清洗上述表面
3次。此聚合酶鍵連的表面儲(chǔ)存于4t:。 實(shí)施例5 :堿基延伸測(cè)序模式 如上說(shuō)明，有兩種通用方法辨識(shí)在逐步延伸中加入的核苷酸逐次加入四種相同 標(biāo)記的核苷酸；或者同時(shí)加入四種不同標(biāo)記的核苷酸。每一種模式皆說(shuō)明如下。
5. 1逐次加入四種具有相同標(biāo)記的核苷酸
5. 1. 1腺嘌呤(A)分子的延伸 將保護(hù)與標(biāo)記的腺苷與適當(dāng)?shù)木酆厦讣尤霚y(cè)序的反應(yīng)緩沖液溶液中(例如40mM Tris-HCl pH9、lmM MgCl2)。只有當(dāng)欲偵測(cè)的核酸中相鄰于末端連接引物5'端的核苷酸為 胸腺嘧啶(T)時(shí)，腺嘌呤加在測(cè)序引物的3'端上。如果最接近引物3'端的核苷酸為鳥(niǎo)嘌 呤(G)、胞嘧啶(C)、或腺嘌呤(A)時(shí)，則將不會(huì)再進(jìn)行延伸。
5. 1. 2.延伸反應(yīng)清除步驟 在延伸反應(yīng)完成后，以5X SSC及O. 1% SDS清洗陣列芯片一次，5X SSC清洗一次，
移除腺嘌呤及未反應(yīng)溶液。 5. 1.3.熒光偵測(cè)及記錄 讀取連接位置的熒光信號(hào)，確認(rèn)腺嘌呤是否進(jìn)行延伸，腺嘌呤延伸表示偵測(cè)的核
酸中有對(duì)應(yīng)的胸腺嘧啶。 5. 1. 4.移除保護(hù)基及熒光基 偵測(cè)后，通過(guò)化學(xué)或酶切斷，移除保護(hù)基及熒光基。
5. 1. 5.清除步驟 以5X SSC及0. 1 % SDS清洗陣列芯片一次，5X SSC清洗一次，移除切斷的保護(hù)基 及標(biāo)記基。 5. 1. 6.校讀及記錄 確定該保護(hù)及熒光基自先前的延伸步驟中成功清除。如果有殘留的保護(hù)及熒光
基，該偵測(cè)及記錄系統(tǒng)2中的偵測(cè)及分析軟件將記錄其位置。該測(cè)序反應(yīng)的記錄只有在之
后的清除步驟中辨識(shí)保護(hù)及熒光基已移除后進(jìn)行。 5. 1. 7.重復(fù)5. 1. 1-5. 1. 6，但是使用鳥(niǎo)嘌呤進(jìn)行延伸反應(yīng)。 5. 1. 8.重復(fù)5. 1. 1-5. 1. 6，但是使用胞嘧啶進(jìn)行延伸反應(yīng)。 5. 1. 9.重復(fù)5. 1. 1-5. 1. 6，但是使用胸腺嘧啶進(jìn)行延伸反應(yīng)。 5.1.10.使用A、G、C、T為一循環(huán)進(jìn)行一回四次的延伸反應(yīng)。藉由重復(fù)此反應(yīng)，逐 次辨識(shí)核酸的序列。 5. 2同時(shí)加入四種不同標(biāo)記的核苷酸
5. 2. 1.堿基延伸反應(yīng) 將四種阻斷的且可區(qū)別的標(biāo)記DNA核苷酸(A、 G、 C、 T)及核酸聚合酶加到陣列的 測(cè)序緩沖液中。此延伸反應(yīng)可只在測(cè)序引物的3'端進(jìn)行。與測(cè)序的核酸的核苷酸互補(bǔ)的 核苷酸最接近連接引物5'端，被加到測(cè)序引物的3'端，如第6圖所示。
5. 2. 2.延伸反應(yīng)清除步驟
在延伸反應(yīng)完成后，以5X SSC及O. 1% SDS清洗陣列芯片一次，5X SSC清洗一次， 移除反應(yīng)溶液中殘余的材料。
5.2.3.熒光偵測(cè)及記錄 偵測(cè)每一連接位置上的每一可區(qū)分的熒光團(tuán)，辨識(shí)加入的核酸。 5. 2. 4.移除保護(hù)基及熒光基 偵測(cè)后，通過(guò)化學(xué)或酶切斷，移除保護(hù)及熒光基。 5. 2. 5.清除步驟 以5X SSC及0. 1 % SDS清洗陣列芯片一次，5X SSC清洗一次，移除切斷的保護(hù)及 熒光基。 5. 2. 6.校讀及記錄 確認(rèn)該保護(hù)基及熒光基自先前的延伸步驟中成功清除。如果有殘留的保護(hù)基及熒
光基，該偵測(cè)及記錄系統(tǒng)2中的偵測(cè)及分析軟件將記錄其位置。該測(cè)序反應(yīng)的記錄只有在
之后的清除步驟中確認(rèn)保護(hù)及熒光基已移除后進(jìn)行。 5. 2. 7.重復(fù)5. 2. 1_5. 2. 6。重復(fù)反應(yīng)循環(huán)，確認(rèn)核酸的序列。 實(shí)施例6 :已知核酸的測(cè)序 將化學(xué)合成的60元體(60-mer)寡核苷酸，具有已知序列生物素-5' -tcagtcag tcag tcag tcag tcag tcag tcag tcag tcag tcag tc ACACGGAGGTTCTA-3'，作為測(cè)序模板。 將該測(cè)序模板連接于14元體(14mer)寡核苷酸測(cè)序引物(5'-TAGAACCTCCGTGT-3')。該模 板的5'端經(jīng)修飾包含生物素分子。該模板分子固定于含有抗生物素蛋白(str印tavidin) 的反應(yīng)物表面。此測(cè)序反應(yīng)使用DNA聚合物在lX測(cè)序緩沖液及15mM DTT中，進(jìn)行堿基延 伸反應(yīng)。每一延伸反應(yīng)步驟只加入一種具有次級(jí)延伸保護(hù)(阻斷)及熒光標(biāo)記(例如Cy5) 的核苷酸。如果相鄰于測(cè)序引物3'端的DNA模板核苷酸，互補(bǔ)于該加上去的核苷酸，之后 再加上熒光標(biāo)記的堿基。洗去未反應(yīng)的堿基材料后，偵測(cè)該熒光信號(hào)。如果加入的堿基沒(méi) 有互補(bǔ)，則不會(huì)偵測(cè)到熒光信號(hào)。偵測(cè)后，化學(xué)移除保護(hù)的熒光基，使用含鹽溶液(例如5X SSC;O. 1%SDS)再次清洗該陣列，再偵測(cè)一次以確認(rèn)熒光標(biāo)記已移除。移除及清洗步驟之 后，沒(méi)有偵測(cè)到熒光信號(hào)的位置被認(rèn)為是熒光巻標(biāo)已移除。在之后的反應(yīng)循環(huán)中所得到的 熒光信號(hào)，認(rèn)為是之后延伸測(cè)序的信號(hào)。移除清洗后，仍偵測(cè)到熒光信號(hào)的位置，該位置以 軟件記錄為具有未完全清除的反應(yīng)。該位置產(chǎn)生的信號(hào)可持續(xù)被記錄，直到在下一循環(huán)中 確認(rèn)該移除步驟。此方法為逐次加入四種反應(yīng)堿基材料，并循環(huán)地進(jìn)行反應(yīng)。因此，可辨識(shí) 該模板的序列。 雖然本發(fā)明已以優(yōu)選實(shí)施方案公開(kāi)如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此 項(xiàng)技藝者，在不脫離本發(fā)明之精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可做些許更動(dòng)與潤(rùn)飾，因此本發(fā)明之保護(hù)范 圍當(dāng)視后附之申請(qǐng)專利范圍所界定者為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
一種辨識(shí)單一生物分子的裝置，包括具有光偵測(cè)器的基材；及連接位置，其形成于上述光偵測(cè)器上，該連接位置經(jīng)處理后使上述生物分子固定于該連接位置；其中該連接位置位于上述光偵測(cè)器附近，且與上述光偵測(cè)器隔開(kāi)，該連接位置與該光偵測(cè)器的距離為小于或等于100μm。
2.如權(quán)利要求l所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置，進(jìn)一步包括遮光片，其形成于上述基材上，該遮光片包括具有直徑的小孔，其中上述連接位置形成于該小孔附近。
3.如權(quán)利要求2所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置，其中上述小孔的直徑為小于或等于1.ooonm。
4.如權(quán)利要求2所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置，其中上述小孔的直徑為小于或等于200nm。
5.如權(quán)利要求2所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置，進(jìn)一步包括濾光層，其形成于上述基材及上述遮光片之間。
6.如權(quán)利要求2所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置，進(jìn)一步包括微透鏡，其形成于上述基材及上述遮光片之間。
7.如權(quán)利要求l所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置，其中該距離為小于或等于25 u m。
8.如權(quán)利要求l所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置，其中該距離為小于或等于6 u m。
9.如權(quán)利要求l所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置，其中該光偵測(cè)器收集接收訊號(hào)角度(S?！癲 angle)內(nèi)該生物分子發(fā)出的光，該接收訊號(hào)角度為大于或等于o.8S工球面度(Steridian)。
10.一種辨識(shí)單一生物分子的裝置，包括具有光偵測(cè)器的基材；及連接位置，其形成于上述光偵測(cè)器上，該連接位置經(jīng)處理后使上述生物分子固定于該連接位置；以及激發(fā)光源，其形成于上述基材上；其中該連接位置位于上述光偵測(cè)器附近，且與上述光偵測(cè)器隔開(kāi)，該連接位置與該光偵測(cè)器的距離為小于或等于lOO u m。
11.如權(quán)利要求lo所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置，其中上述激發(fā)光源包括發(fā)光層，該發(fā)光層沿著平行于上述光偵測(cè)器表面的水平方向，向上述連接位置發(fā)出激發(fā)光。
12.如權(quán)利要求11所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置，進(jìn)一步包括濾光層，其形成于上述基材與上述發(fā)光層之間。
13.如權(quán)利要求lo所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置，其中上述激發(fā)光源選自發(fā)光二極管(LED)、有機(jī)發(fā)光二極管(。LED)、聚合物發(fā)光二極管(PLED)、及激光二極管(LD)。
14.如權(quán)利要求lo所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置，其中上述激發(fā)光源提供第一波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光，上述生物分子發(fā)出第二波長(zhǎng)范圍的光，該第一波長(zhǎng)范圍與該第二波長(zhǎng)范圍不重疊。
15.如權(quán)利要求lo所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置，其中該距離為小于或等于25 u m。
16.如權(quán)利要求lo所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置，其中該距離為小于或等于6 u m。
17. 如權(quán)利要求10所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置，其中該光偵測(cè)器收集接受訊號(hào) 角度(solid angle)內(nèi)該生物分子發(fā)出的光，該接受訊號(hào)角度為大于或等于0. 8SI球面度 (steridian)。
18. —種辨識(shí)單一生物分子的裝置，包括 具有光偵測(cè)器的基材；及連接位置，其形成于上述光偵測(cè)器上，該連接位置經(jīng)處理后使上述生物分子固定于該 連接位置；其中該光偵測(cè)器收集接受訊號(hào)角度(solid angle)內(nèi)該生物分子發(fā)出的光，該接受訊 號(hào)角度為大于或等于0. 8SI球面度(steridian)。
19. 如權(quán)利要求18所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置，進(jìn)一步包括遮光片，形成于上述 基材上，該遮光片包括具有直徑的小孔，其中上述連接位置形成于該小孔附近。
20. 如權(quán)利要求18所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置，其中上述小孔的直徑為小于或等 于1， OOOnm。
21. 如權(quán)利要求18所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置，其中上述小孔的直徑為小于或等 于200nm。
22. 如權(quán)利要求19所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置，進(jìn)一步包括濾光層，其形成于上 述基材及上述遮光片之間。
23. 如權(quán)利要求19所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置，進(jìn)一步包括微透鏡，其形成于上 述基材及上述遮光片之間。
24. —種辨識(shí)單一生物分子的裝置，包括 具有光偵測(cè)器的基材；及連接位置，其形成于上述光偵測(cè)器上，該連接位置經(jīng)處理后使上述生物分子固定于該 連接位置；以及激發(fā)光源，其形成于上述基材上；其中該光偵測(cè)器收集接受訊號(hào)角度(solid angle)內(nèi)該生物分子發(fā)出的光，該接受訊 號(hào)角度為大于或等于0. 8SI球面度(steridian)。
25. 如權(quán)利要求24所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置，其中上述激發(fā)光源包括發(fā)光層， 其形成于上述基材上，該發(fā)光層沿著平行于上述光偵測(cè)器表面的水平方向，向上述連接位 置發(fā)出激發(fā)光。
26. 如權(quán)利要求25所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置，進(jìn)一步包括濾光層，其形成于上 述基材與上述發(fā)光層之間。
27. 如權(quán)利要求24所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置，其中上述激發(fā)光源系選自發(fā)光二 極管(LED)、有機(jī)發(fā)光二極管(0LED)、聚合物發(fā)光二極管(PLED)、及激光二極管(LD)。
28. —種光學(xué)偵測(cè)系統(tǒng)，包括至少10， 000個(gè)如權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)所述的辨識(shí)單 一生物分子的裝置。
29. —種光學(xué)偵測(cè)系統(tǒng)，包括至少250， 000個(gè)如權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)所述的辨識(shí) 單一生物分子的裝置。
30. —種光學(xué)偵測(cè)系統(tǒng)，包括至少2， 000， 000個(gè)如權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)所述的辨 識(shí)單一生物分子的裝置。
31. —種光學(xué)偵測(cè)系統(tǒng)，包括至少10， 000， 000個(gè)如權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)所述的辨 識(shí)單一生物分子的裝置。
32. —種核酸的測(cè)序方法，包括將核酸分子固定于如權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)所述的裝置的連接位置上；以及 對(duì)上述裝置上的核酸分子進(jìn)行核酸測(cè)序。
33. 如權(quán)利要求32所述的核酸的測(cè)序方法，其中上述核酸藉由連接于固定于上述連接 位置的聚合酶，固定于上述連接位置。
34. 如權(quán)利要求32所述的核酸的測(cè)序方法，其中上述核酸測(cè)序包括于上述裝置中加入 標(biāo)記的核苷酸。
35. 如權(quán)利要求34所述的核酸的測(cè)序方法，其中上述核苷酸為熒光標(biāo)記的。
36. 如權(quán)利要求35所述的核酸的測(cè)序方法，其中上述核苷酸的熒光標(biāo)記在其末端磷酸上。
37. 如權(quán)利要求32所述的核酸的測(cè)序方法，其中上述核酸測(cè)序?yàn)閴A基延伸測(cè)序，包括 于上述裝置中加入具有保護(hù)基及標(biāo)記的核苷酸的步驟。
38. 如權(quán)利要求37所述的核酸的測(cè)序方法，其中上述核苷酸為熒光標(biāo)記的。
39. 如權(quán)利要求38所述的核酸的測(cè)序方法，其中上述核苷酸具有相同的熒光標(biāo)記，且 逐次加入。
40. 如權(quán)利要求38所述的核酸的測(cè)序方法，其中上述核苷酸具有各自不同熒光標(biāo)記， 且同時(shí)加入。
41. 如權(quán)利要求32所述的核酸的測(cè)序方法，其中上述核酸測(cè)序?yàn)榛谶B接酶的測(cè)序。
42. 如權(quán)利要求32所述的核酸的測(cè)序方法，其中上述核酸在核酸測(cè)序前于連接位置上 被擴(kuò)增。
43. 如權(quán)利要求32所述的核酸的測(cè)序方法，其中上述核酸序列是未知的。
44. 一種多個(gè)核酸分子的測(cè)序方法，包括使多個(gè)核酸分子固定于如權(quán)利要求28-31中任一項(xiàng)所述的光學(xué)偵測(cè)系統(tǒng)的連接位置 上；以及在上述光學(xué)偵測(cè)系統(tǒng)上并行進(jìn)行上述核酸分子的核酸測(cè)序。
45. —種生物分子的偵測(cè)方法，包括使一個(gè)或多個(gè)的生物分子固定于如權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)所述的光學(xué)偵測(cè)器的連接 位置上；以及在上述裝置上偵測(cè)該生物分子。
46. 如權(quán)利要求45所述的生物分子的偵測(cè)方法，其中該生物分子包括標(biāo)記。
47. 如權(quán)利要求46所述的生物分子的偵測(cè)方法，其中該標(biāo)記為熒光。
48. 如權(quán)利要求47所述的生物分子的偵測(cè)方法，其中該生物分子包括選自多肽、抗體、 脂質(zhì)、維生素、低分子量有機(jī)分子、及多糖的部分。
49. 如權(quán)利要求48所述的生物分子的偵測(cè)方法，其中該生物分子藉由連接分子固定于 上述裝置的連接位置。
50. 如權(quán)利要求49所述的生物分子的偵測(cè)方法，其中該連接分子包括捕捉分子。
51. 如權(quán)利要求50所述的生物分子的偵測(cè)方法，其中該捕捉分子為蛋白質(zhì)。
52. 如權(quán)利要求50所述的生物分子的偵測(cè)方法，其中該捕捉分子為抗體。
53. 如權(quán)利要求50所述的生物分子的偵測(cè)方法，其中該連接分子包括核酸標(biāo)簽。
54. 如權(quán)利要求53所述的生物分子的偵測(cè)方法，進(jìn)一步包括偵測(cè)在上述裝置上的連接 分子的上述核酸標(biāo)簽的步驟。
55. 如權(quán)利要求54所述的生物分子的偵測(cè)方法，其中上述核酸標(biāo)簽通過(guò)核酸測(cè)序偵
56. 如權(quán)利要求54所述的生物分子的偵測(cè)方法，其中上述核酸標(biāo)簽通過(guò)雜交于核酸探 針偵測(cè)。
57. 如權(quán)利要求56所述的生物分子的偵測(cè)方法，其中上述核酸探針為熒光標(biāo)記。
58. 如權(quán)利要求32-45或55中任一項(xiàng)所述的生物分子的偵測(cè)方法，其中上述核酸是以 福斯特共振能量轉(zhuǎn)移(F6ster resonance energy transfer ;FRET)激發(fā)的標(biāo)記偵測(cè)的。
59. 如權(quán)利要求32-45或55中任一項(xiàng)所述的生物分子的偵測(cè)方法，其中上述核酸是以 時(shí)間分辨熒光技術(shù)(time-resolved fluorescence technology)的標(biāo)記偵測(cè)的。
60. —種多個(gè)生物分子的偵測(cè)方法，包括將多個(gè)生物分子固定于如權(quán)利要求28-31中任一項(xiàng)所述的光學(xué)偵測(cè)系統(tǒng)的連接位置；以及并行偵測(cè)在上述光學(xué)偵測(cè)系統(tǒng)上的生物分子。
61. —種辨識(shí)單一生物分子的裝置的制造方法，包括 于基材上形成光偵測(cè)器及控制線路； 于上述基材上形成具有小孔的遮光片；以及 于上述光偵測(cè)器上形成連接位置，且該連接位置接近上述小孔， 上述連接位置經(jīng)處理后使上述生物分子固定于上述連接位置，其中上述連接位置接近上述光偵測(cè)器，且與上述光偵測(cè)器隔開(kāi)，且上述連接位置與上 述光偵測(cè)器的間隔距離為小于或等于100 m。
62. 如權(quán)利要求61所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置的制造方法，進(jìn)一步包括于上述基 材與上述遮光片之間形成濾光層。
63. 如權(quán)利要求62所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置的制造方法，其中形成上述遮光片 包括于上述濾光層上形成不透明層； 于上述不透明層上形成光阻層； 圖案化上述光阻層，使部分上述不透明層露出；使用上述圖案化光阻層作為罩幕，蝕刻上述不透明層，直到上述濾光層露出；以及 移除上述光阻層。
64. 如權(quán)利要求63所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置的制造方法，其中上述不透明層包 括金屬。
65. —種提供生物分子分析服務(wù)的方法，包括 向服務(wù)提供者提供樣本，該樣本包含來(lái)自服務(wù)需求者的生物分子； 上述服務(wù)需求者獲得來(lái)自上述服務(wù)提供者的分析結(jié)果，其中，上述結(jié)果得自如權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)所述的辨識(shí)單一生物分子的裝置。
66. 如權(quán)利要求65所述的提供生物分子分析服務(wù)的方法，其中上述方法的進(jìn)行有報(bào)酬考量。
67. 如權(quán)利要求66所述的提供生物分子分析服務(wù)的方法，其中上述服務(wù)需求者與上述 服務(wù)提供者由賣主媒合。
68. 如權(quán)利要求65所述的提供生物分子分析服務(wù)的方法，其中上述分析結(jié)果在其它國(guó)家產(chǎn)生。
69. 如權(quán)利要求65所述的提供生物分子分析服務(wù)的方法，其中上述分析結(jié)果在美國(guó)以 外的其它國(guó)家產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種生物檢測(cè)系統(tǒng)，包括多個(gè)光學(xué)偵測(cè)器，該光學(xué)偵測(cè)器各包括具有光偵測(cè)器的基材，以及于該光偵測(cè)器上形成連接位置，該連接位置經(jīng)處理后使上述生物分子固定于上述連接位置。上述連接位置位于上述光偵測(cè)器附近，與上述光偵測(cè)器的間隔為小于或等于100μm。上述光偵測(cè)器收集上述生物分子在接收訊號(hào)角度為0.8SI球面度(steridian)或以上發(fā)射的光。上述光學(xué)偵測(cè)器可進(jìn)一步包括激發(fā)光源，其形成于上述基材上，提供光源用于激發(fā)附著于上述生物分子的熒光分子。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101743321SQ200880018426
公開(kāi)日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2008年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月25日
發(fā)明者姚斌誠(chéng), 張上嘉, 朱正煒, 潘詔智, 邱創(chuàng)汎, 黎育騰 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人工業(yè)技術(shù)研究院