專利名稱：在植物中通過調(diào)節(jié)玉米mads框轉(zhuǎn)錄因子silky1的產(chǎn)量增強(qiáng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
借助常規(guī)育種法的谷粒(grain)產(chǎn)量改善已經(jīng)在玉米中幾乎達(dá)到一個(gè)平臺(tái) 期。隨后自然要探索可能用來獲得進(jìn)一步產(chǎn)量提高的備選、非常規(guī)方法。由于玉米中的 收獲指數(shù)已經(jīng)在過去百年左右對(duì)谷粒產(chǎn)量選擇的期間基本上保持不變，產(chǎn)量改善已經(jīng)因 提高每單位土地面積的總生物量生產(chǎn)而實(shí)現(xiàn)(Sinclair等人(1998)Crop Science 38: 638-643 ；Duvick 等人(1999) CropScience 39 :1622_1630 ；禾口 Tollenaar 等人(1999) Crop Science39 1597-1604)。這種提高的總生物量已經(jīng)通過增加植物密度實(shí)現(xiàn)，這導(dǎo)致適應(yīng)性 表型變更，如葉片角減小和玉米穗狀花序大小降低，前者導(dǎo)致減少對(duì)下部葉子的遮蔽并且 后者可能提高收獲指數(shù)(Duvick 等人(1999) CropScience 39 1622-1630)。SILKY1屬于MADS轉(zhuǎn)錄因子家族，所述家族在植物的多種發(fā)育過程中具有關(guān)鍵作 用，所述過程包括花和種子發(fā)育(Miinster，等人，2002 ；Parenicova，等人，2003)。在MCM1、 AGAM0US、DEFICIENS和SRF(血清應(yīng)答因子)蛋白質(zhì)之后命名了高度保守的DNA結(jié)合MADS 結(jié)構(gòu)域(Schwarz-Sommer等人，1990)。MADS框基因是控制植物中花和種子發(fā)育的主要因 子。MADS框基因可以顯著修飾轉(zhuǎn)基因植物中植物花的形態(tài)和植物構(gòu)造，這是由于它們?cè)谥?物發(fā)育中的廣泛作用。SILKY1基因中的突變導(dǎo)致雄蕊和漿片向內(nèi)稃/外稃樣結(jié)構(gòu)的同源 異型轉(zhuǎn)化(Ambrose，等人，(2000)Molec Cell 5 :569_579)，這表明了 SILKY1 在玉米植物 區(qū)系發(fā)育中的作用。SILKY1可以在體外結(jié)合DNA作為專性異源二聚體，并且與適當(dāng)?shù)臄M南 芥屬B類伙伴蛋白相互作用用于這一結(jié)合活性(Whipple，等人，(2004)Development 131 6083-91)，這表明了其作為轉(zhuǎn)錄因子的功能。SILKY1主要在雄花穗(tassel)和穗(ear)中 表達(dá)，并且可以通過控制每個(gè)穗中小穗的數(shù)量來增強(qiáng)產(chǎn)量以及最終的種粒(kernel)數(shù)量 和種粒大小。在本領(lǐng)域中需要方法和組合物，可以使用此類序列以調(diào)節(jié)植物中的器官發(fā)育和產(chǎn)量。發(fā)明簡述提供了用于調(diào)節(jié)花器官發(fā)育、葉形成、向光性、頂端優(yōu)勢、果實(shí)發(fā)育、根發(fā)端和用于 提高植物中產(chǎn)量的組合物和方法。所述組合物包含SILKY1序列。本發(fā)明的組合物包含選 自SEQ ID N0 :1和2的氨基酸序列和核苷酸序列及其變體和片段。在用于目的植物中表達(dá)的DNA構(gòu)建體中提供了編碼SILKY1序列的核苷酸序列。還 提供了包含本發(fā)明序列的表達(dá)盒、植物、植物細(xì)胞、植物部分和種子。在具體的實(shí)施方案中， 多核苷酸與組成型啟動(dòng)子有效連接。提供了用于調(diào)節(jié)植物或植物部分中SILKY1序列的水平的方法。所述方法包括將包含SILKY1序列、MADS結(jié)構(gòu)域或本發(fā)明的SILKY1結(jié)構(gòu)域的異源多核苷酸導(dǎo)入植物或植物 部分。SILKY1多肽的水平可以被提高或降低。此方法可以用來提高植物中的產(chǎn)量；在一個(gè) 實(shí)施方案中，該方法用來提高谷類中的谷粒產(chǎn)量。附圖簡述

圖1 提供了一些來自玉米(Zea mays) (SEQ ID NO :2)、大豆屬(Glycine) (SEQ ID NOS :3和 4)、擬南芥屬(Arabidopsis thaliana) (SEQID NOS :13和 14)、稻(Oryza sativum) (SEQ ID NO :5、6 和 9)、大麥(Hordeum vulgare) (SEQ ID NO 8)、普通小麥(Triticum aestivum) (SEQID NO :7禾口 10)與石刁柏(Asparagus officianalis) (SEQ ID NO : 11 禾口 12) 的一些SILKY1樣序列的比對(duì)。在兩個(gè)字母屬-物種命名后的數(shù)字對(duì)應(yīng)了 NCBI Genbank進(jìn) 入號(hào)。兩個(gè) SPW1 稻序列(SEQ ID N0:5 禾P6)是指 SUPERW0MAN 1 (Nagasawa，等人，(2003) Development 130 :705_718)。SILKY1 MADS 結(jié)構(gòu)域是單下劃線的(ZmSILKYl MADS 結(jié)構(gòu)域是 SEQID NO 16，共有MADS結(jié)構(gòu)域是SEQ ID NO :18)，而K結(jié)構(gòu)域是雙下劃線的(ZmSILKYlK 結(jié)構(gòu)域是SEQ ID NO 17，共有K結(jié)構(gòu)域是SEQ IDN0:19)。發(fā)明詳述現(xiàn)在將參考附圖在下文中更充分地描述本發(fā)明，其中顯示了一些但非全部的本發(fā) 明實(shí)施方案。實(shí)際上，這些發(fā)明可以以多種不同形式體現(xiàn)并且不得解釋為限于本文中所述 的實(shí)施方案；相反，提供了這些實(shí)施方案，從而本公開內(nèi)容將滿足適用的法律要求。這里所述的本發(fā)明的眾多修改和其他實(shí)施方案將是得益于在前面描述和相關(guān)附 圖中所展示教導(dǎo)的這些發(fā)明所涉及領(lǐng)域的技術(shù)人員可想起的。因此，應(yīng)當(dāng)理解所述發(fā)明不 意圖限于所公開的具體實(shí)施方案并且修改和其他實(shí)施方案將意圖被包含于所附權(quán)利要求 書的范圍中。盡管本文中使用了具體術(shù)語，不過它們僅在一般性和描述性意義上使用并且 其目的不在于限制。I.概述提供了在植物中促進(jìn)花器官發(fā)育、根發(fā)端及產(chǎn)量和用于調(diào)節(jié)葉形成、向光性、頂 端優(yōu)勢、果實(shí)發(fā)育等的方法和組合物。本發(fā)明的組合物和方法通過調(diào)節(jié)植物中至少一種 SILKY1多肽或具有本發(fā)明SILKY1多肽的生物學(xué)活性變體或片段的多肽的水平產(chǎn)生改善的 植物或作物產(chǎn)量。II.組合物本發(fā)明的組合物包含了參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的SILKY1多核苷酸和多肽及其變體和片 段。SILKY1編碼具有MADS結(jié)構(gòu)域和K-結(jié)構(gòu)域的植物蛋白質(zhì)。SILKY1中的MADS結(jié)構(gòu)域 (SEQ ID NO 16)是從對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 1的核酸位置的氨基酸殘基1至60 (對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :2的核酸位置147-326)。SILKY1中的K-結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 17)是從對(duì)應(yīng)于SEQ IDN0 1中的核酸位置357至650的氨基酸殘基71至168 (SEQ ID NO :2)?！皩?duì)應(yīng)于”意指 對(duì)于每個(gè)結(jié)構(gòu)域的所提到的氨基酸位置涉及所提到SEQ IDN0的氨基酸位置并且意指包含 這些結(jié)構(gòu)域的多肽可以通過使用標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)方法比對(duì)所述多肽與所提到SEQ ID NO:而找到。本發(fā)明的SYLKY1序列作用為轉(zhuǎn)錄因子，其特異性結(jié)合靶基因以激活(或)阻抑靶 基因轉(zhuǎn)錄。SILKY1主要在小穗形成期間在幼穗中表達(dá)。如本文中所用，“SILKY1”序列包含編 碼MADS結(jié)構(gòu)域和/或K結(jié)構(gòu)域的或者所述MADS或K結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性變體或片段的多核苷酸或具有MADS結(jié)構(gòu)域和/或K結(jié)構(gòu)域的或所述MADS或K結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性變體或 片段的多肽。見，例如，Jurata 和 Gill (1997)Mol. Cell. Biol. 17 :5688_98 ；和 Franks 等人 (2002)Development 129:253-63。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含如SEQ ID NO 2中所示氨基酸序列的分離 的SILKY1多肽及其片段和變體。還提供了包含SEQ ID NO :1中所述核苷酸序列的多核苷 酸和包含編碼MADS結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 16)的多核苷酸的序列。本發(fā)明包括分離的或基本上純化的多核苷酸或蛋白質(zhì)組合物?！胺蛛x的”或“純 化的”多核苷酸或蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性部分基本上或?qū)嵸|(zhì)上不含這樣的組分，其中所述 組分通常伴隨或與該多核苷酸或蛋白質(zhì)相互作用，如在該組分天然存在環(huán)境中所發(fā)現(xiàn)的那 樣。因此，分離的或純化的多核苷酸或蛋白質(zhì)通過重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)基本上不含其他細(xì)胞材 料或培養(yǎng)基，或當(dāng)化學(xué)合成時(shí)基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)品。最佳地，“分離的”多核 苷酸不含在衍生該多核苷酸的生物的基因組DNA中天然分布于該多核苷酸側(cè)翼(即位于該 多核苷酸的5’或3’端)的序列(最佳地是蛋白質(zhì)編碼序列)。例如，在多個(gè)實(shí)施方案中， 這種分離的多核苷酸可以含有在衍生該多核苷酸的細(xì)胞的基因組DNA中天然分布于該多 核苷酸側(cè)翼的小于約5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0. 5kb或0. lkb的核苷酸序列?；旧喜缓?xì) 胞材料的蛋白質(zhì)包括具有小于約30%、20%、10%、5%或(干重)雜質(zhì)蛋白的蛋白質(zhì)制 品。當(dāng)重組地產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)或生物學(xué)活性部分時(shí)，培養(yǎng)基最佳地出現(xiàn)小于約30%、 20%、10%、5%或(干重)的化學(xué)前體或非目的蛋白質(zhì)化學(xué)品。SILKY1結(jié)構(gòu)域或SILKY1多核苷酸及其所編碼蛋白質(zhì)的片段和變體也被本發(fā)明的 方法和組合物包括?！捌巍币庵付嗪塑账岬囊徊糠只虬被嵝蛄械囊徊糠?。多核苷酸的 片段可以編碼仍保留天然蛋白生物學(xué)活性并且因而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)片段。例如，多肽片 段將包含MADS結(jié)構(gòu)域(SEQ IDN0 16)或K結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 17)。在一些實(shí)施方案中， 該多肽片段包含MADS結(jié)構(gòu)域和K結(jié)構(gòu)域這兩者。備選地，用于抑制或沉默(即降低表達(dá)水 平)SILKY1序列的片段不需要編碼蛋白質(zhì)片段，但仍將保留抑制此靶序列表達(dá)的能力。另 外，用作雜交探針的片段通常不編碼保留生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)片段。因此，核苷酸序列的片 段可以具有至少約18個(gè)核苷酸、約20個(gè)核苷酸、約50個(gè)核苷酸、約100個(gè)核苷酸并多達(dá)編 碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的全長多核苷酸。編碼MADS結(jié)構(gòu)域或SILKY1多肽的多核苷酸的片段編碼至少15、25、30、50、100、 150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、675、700、725、750、775、800、825 個(gè)連續(xù) 氨基酸或多達(dá)全長MADS結(jié)構(gòu)域或SILKY1蛋白(即SEQ ID NO 2)中存在的氨基酸總數(shù)。 用作雜交探針、PCR引物或用作抑制構(gòu)建體的K或MADS結(jié)構(gòu)域的片段或SILKY1多核苷酸 片段一般不需要編碼SILKY1蛋白或SILKY1結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性部分?？梢酝ㄟ^如下方式制備包含K和MADS結(jié)構(gòu)域的多肽或SILKY1蛋白的生物學(xué)活性 部分，即通過分離SILKY1多核苷酸的一部分，表達(dá)SILKY1蛋白的所編碼部分(例如通過體 外重組表達(dá))并評(píng)估SILKY1蛋白的所編碼部分的活性。作為SILKY1核苷酸序列的片段的 多核苷酸或包含K和MADS結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列包含了至少16、20、50、75、100、150、200、 250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1，000,1, 100 個(gè)連續(xù)核苷酸或多達(dá) 全長K和MADS結(jié)構(gòu)域中或SILKY1多核苷酸(即SEQ ID NO :1，1176個(gè)核苷酸)中存在的 核苷酸數(shù)目。
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“變體”意指基本上相似的序列。對(duì)于多核苷酸而言，變體包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸 在天然多核苷酸內(nèi)部一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部位點(diǎn)處的缺失和/或添加和/或一個(gè)或多個(gè)核苷酸在 天然多核苷酸中一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的置換。如本文中所用，“天然”多核苷酸或多肽分別包 含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。對(duì)于多核苷酸而言，保守性變體包括這些序列，其 中所述序列因遺傳密碼的簡并性而編碼SILKY1多肽或K和MADS結(jié)構(gòu)域之一的氨基酸序 列。可以使用熟知的分子生物學(xué)技術(shù)鑒定天然存在的等位基因變體，例如用下文說明的聚 合酶鏈反應(yīng)(PCR)和雜交技術(shù)。變體多核苷酸也包括合成方式衍生的多核苷酸，例如通過 位點(diǎn)定向誘變產(chǎn)生、不過仍編碼包含K或MADS結(jié)構(gòu)域(或這兩者)的多肽或能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄 或能夠降低(即抑制或沉默)SILKY1多核苷酸之表達(dá)水平的SILKY1多肽的那些多核苷酸。 通常，本發(fā)明的特定多核苷酸的變體將與該特定核苷酸具有如通過本文其他地方描述的序 列比對(duì)程序和參數(shù)所確定的至少約40 %,45 %,50 %,55 %,60 %,65 %,70 %,75 %,80 %, 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的序列同一性。本發(fā)明的特定多核苷酸(即參照多核苷酸)的變體也可以通過比較在變體多核苷 酸所編碼的多肽與這種參照多核苷酸所編碼的多肽之間的序列同一性百分?jǐn)?shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。因 此，例如公開了一種分離的多核苷酸，其編碼與SEQ ID N0:1或SEQ ID NO :2的多肽具有 給定序列同一性百分?jǐn)?shù)的多肽?？梢允褂迷诒疚钠渌胤矫枋龅男蛄斜葘?duì)程序和參數(shù)計(jì)算 任意兩個(gè)多肽之間的序列同一性百分?jǐn)?shù)。在本發(fā)明任意給定的多核苷酸配對(duì)通過比較由所 述多核苷酸編碼的兩個(gè)多肽所共有的序列同一性百分?jǐn)?shù)而進(jìn)行評(píng)價(jià)的情況下，這兩個(gè)編碼 的多肽之間的序列同一性百分?jǐn)?shù)是至少約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的序列同一 性?！白凅w”蛋白質(zhì)意指從天然蛋白中通過在該天然蛋白中一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部位點(diǎn)處缺 失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或在該天然蛋白中一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處置換一個(gè)或多個(gè)氨 基酸而衍生的蛋白質(zhì)。由本發(fā)明包括的變體蛋白質(zhì)是有生物學(xué)活性的，即它們繼續(xù)具有該 天然蛋白的想要的生物學(xué)活性，即如本文中所述調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。此類變體可以例如因遺傳多態(tài) 性或因人類操作產(chǎn)生。本發(fā)明的SILKY1蛋白的生物學(xué)活性變體或者K或MADS結(jié)構(gòu)域的生 物學(xué)活性變體將與SILKY1蛋白的氨基酸序列或共有的K和MADS結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列具有 如通過本文其他地方描述的序列比對(duì)程序和參數(shù)所確定的至少約40 %、45 %、50 %、55 %、 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%, 99%或更大的序列同一性。本發(fā)明的SILKY1蛋白的或者K或MADS結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性變 體可以與該蛋白質(zhì)具有少至1-15個(gè)氨基酸殘基，少至1-10個(gè)，如6-10個(gè)，少至5個(gè)，少至 4、3、2個(gè)或甚至1個(gè)氨基酸殘基的不同。本發(fā)明的多核苷酸可以按照多種方式進(jìn)行改變，所述的方式包括氨基酸置換、 缺失、截短和插入。用于此類操作的方法通常是本領(lǐng)域已知的。例如，可以通過在DNA 中突變來制備SILKY1蛋白或K和MADS結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列變體和片段。用于誘變和 多核苷酸變更的方法是本領(lǐng)域熟知的。見，例如，Kunkel，(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 488-492 ；Kunkel 等人(1987)Methods in Enzymol. 154 :367_382 ；美國專利號(hào) 4，873，192 ;Walker和Gaastra編著(1983)，Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company，紐約)以及其中引用的參考文獻(xiàn)。關(guān)于不影響目的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的適宜氨基酸置換的指導(dǎo)可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found.，Washington, D. C.)的模型中找到，所述文獻(xiàn)在本文 中引用作為參考。保守性置換，如將一個(gè)氨基酸交換為具有相似特性的另一個(gè)氨基酸，可以 是最佳的。因此，本發(fā)明的基因和多核苷酸包括天然存在的序列以及突變形式。同樣，本發(fā)明 的蛋白質(zhì)包括天然存在的蛋白質(zhì)以及其改變和修飾的形式。此類變體將繼續(xù)具有想要的活 性(即，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或降低靶SILKY1序列的表達(dá)水平的能力)。在具體的實(shí)施方案中，將于編 碼該變體的DNA中產(chǎn)生的突變未使該序列不符合可讀框并且不產(chǎn)生可能產(chǎn)生二級(jí)mRNA結(jié) 構(gòu)的互補(bǔ)性區(qū)域。見，EP專利申請(qǐng)
發(fā)明者W·B·布魯斯 申請(qǐng)人:克羅普迪塞恩股份有限公司