專利名稱：編碼瘧疾抗原的腺病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠引發(fā)抗瘧原蟲生活周期中紅細(xì)胞前期的免疫應(yīng)答的重組腺病毒 載體。具體地，本發(fā)明提供了一種編碼包含血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白(TRAP)之抗原的 重組猿腺病毒載體，并且還提供了包含所述載體的免疫原性組合物(例如疫苗)以及使用 這些組合物的方法。
背景技術(shù)：
瘧疾一直是世界上的一個(gè)重大健康問題。據(jù)估計(jì)至少有30億人(幾乎是世界人口 的一半)生活在瘧疾流行地區(qū)，每年報(bào)告有3億到5億的臨床病例，約150萬死亡病例[1]。 對(duì)有效疫苗的開發(fā)將是有助于減少此疾病問題的重要成果。紅細(xì)胞前期疫苗接種法已在臨 床試驗(yàn)中顯示出一些效力，其具有針對(duì)此階段瘧疾生命周期中子孢子和隨后的肝內(nèi)裂殖體 的免疫性[2]。細(xì)胞免疫應(yīng)答先前已顯示出在紅細(xì)胞前期免疫中的重要性，其中CD8+T細(xì)胞 和IFN γ的產(chǎn)生在抗肝臟階段瘧疾的保護(hù)中起著重要作用[3]。血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白(TRAP)是在子孢子上表達(dá)的抗原，其先前已顯示 出誘導(dǎo)保護(hù)性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答[4]。TRAP已在疫苗臨床試驗(yàn)中以融合蛋白質(zhì)的形式進(jìn)行了 廣泛地試驗(yàn)，所述融合蛋白質(zhì)是與含有來自數(shù)種瘧疾抗原的其它B細(xì)胞、CD8+和CD4+T細(xì) 胞表位的多表位串融合的蛋白質(zhì)，稱為ME. TRAP[5,6]。在本領(lǐng)域中，已對(duì)基于質(zhì)粒DNA或經(jīng)修飾安卡拉痘苗病毒(modified vaccinia virus Ankara, MVA)的編碼ME. TRAP抗原的疫苗載體進(jìn)行了試驗(yàn)(Moorthy等(2004) PLoS， Med 1(2) :e33)，顯示出在引發(fā)-加強(qiáng)方案中使用時(shí)誘導(dǎo)高頻率的效應(yīng)T細(xì)胞。盡管如此，仍需要能夠在人對(duì)象中預(yù)防惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)自 然感染并能夠誘導(dǎo)更強(qiáng)的T細(xì)胞應(yīng)答(尤其是CD8+類型)的改進(jìn)的抗瘧疾疫苗。在ME. TRAP 作為在DNA和痘病毒載體(例如MVA和雞痘病毒)中插入物的臨床試驗(yàn)中，應(yīng)答主要是CD4+ 類型，其相比于CD8+T細(xì)胞應(yīng)答很可能保護(hù)性較小。人血清型5的腺病毒載體先前已被用于約氏瘧原蟲(P. yoelii)小鼠瘧疾模型，并 且已顯示出突出的免疫原性和僅僅單次給藥后的有效保護(hù)[7]。但是，妨礙此血清型用于 人體的一個(gè)主要限制是普遍存在AdH5，頻繁的兒童期感染導(dǎo)致血清轉(zhuǎn)化。為了避免預(yù)先存 在對(duì)AdH5的免疫性的問題，對(duì)利用不在人群中循環(huán)的猿來源的腺病毒血清型的興趣正在 增加，許多研究證明了這些載體在SARS[8]和HIV[9，10]的小鼠和非人靈長(zhǎng)類模型中引發(fā) ⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答的能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明現(xiàn)已表明，編碼ME. TRAP抗原的猿腺病毒載體(特別是那些來源于黑猩猩 腺病毒分離株AdCh63的)可在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)引發(fā)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答以及抗TRAP的高效價(jià)抗體應(yīng) 答。另外，可通過隨后施用編碼相同轉(zhuǎn)基因的MVA載體來加強(qiáng)免疫原性，在恒河猴(一個(gè)用 作良好預(yù)測(cè)可能人免疫原性的物種)中觀察到強(qiáng)免疫原性。還已經(jīng)在人I期臨床研究中證明了免疫原性。在小鼠攻擊(challenge)模型中使用編碼ME. TRAP的AdCh63載體進(jìn)行研 究的保護(hù)效力出人意料地大于其它腺病毒載體。此小鼠模型中的效力在本領(lǐng)域中廣泛地用 作對(duì)人中效力的有用的預(yù)測(cè)性指標(biāo)。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種重組復(fù)制缺陷型猿腺病毒載體，其編碼包含血 小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白(TRAP)或其至少一個(gè)T細(xì)胞表位的抗原。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述猿腺病毒載體包含猿腺病毒基因組，其中穩(wěn)定整合了編 碼至少一個(gè)與調(diào)節(jié)序列有效連接之抗原的轉(zhuǎn)基因，所述調(diào)節(jié)序列指導(dǎo)所述轉(zhuǎn)基因在哺乳動(dòng) 物細(xì)胞中表達(dá)，其中所述抗原包含血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白(TRAP)或其至少一個(gè)T細(xì) 胞表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述猿腺病毒基因組是黑猩猩腺病毒載體的基因組。在一個(gè)具體的非限定性實(shí)施方案中，所述猿腺病毒基因組可以是黑猩猩腺病毒分 離株63(AdCh63)的基因組。還可使用載體AdC68(也稱為AdC9)或AdCh3載體，或者AdC6 或AdC7載體，但優(yōu)選AdCh63載體。因此，本發(fā)明尤其涉及編碼包含血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘 附蛋白(TRAP)或其至少一個(gè)T細(xì)胞表位之抗原的重組復(fù)制缺陷型AdCh63載體。在本發(fā)明的所有實(shí)施方案中，由所述猿腺病毒載體編碼的抗原可包含ME. TRAP或 由其組成。在一個(gè)具體的非限定性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種編碼ME. TRAP的重組復(fù)制 缺陷型猿腺病毒載體(尤其是AdCH63載體)，其中ME. TRAP的表達(dá)由調(diào)節(jié)序列驅(qū)動(dòng)，所述調(diào) 節(jié)序列包含人CMV IEl基因的啟動(dòng)子以及包括內(nèi)含子A在內(nèi)的人CMV IEl基因的5'非翻 譯區(qū)域的片段(在本文中也稱為“長(zhǎng)”HCMV啟動(dòng)子)。在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種免疫原性組合物，其包含與一種或多種可藥用 賦形劑、載體、稀釋劑或佐劑相混合的根據(jù)本發(fā)明第一方面的猿腺病毒載體。在一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，其包含與一種或多種可藥用賦 形劑、載體、稀釋劑或佐劑相混合的根據(jù)本發(fā)明第一方面的猿腺病毒載體。在一些具體的非限定性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含編碼ME. TRAP的重 組復(fù)制缺陷型猿腺病毒載體(尤其是AdCH63載體)的免疫原性組合物或疫苗組合物，其 中ME. TRAP的表達(dá)由所述“長(zhǎng)”HCMV啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)。在一個(gè)具體的非限定性實(shí)施方案中， 所述免疫原性或疫苗組合物包含所述腺病毒載體，其配制于IOmM組氨酸、7. 5%蔗糖、35mM NaClUmM MgCl2^O. 1% PS80.0. ImM EDTA、0. 5% 乙醇，pH6. 6 中，其適于皮內(nèi)施用給人對(duì)象。在第三方面，本發(fā)明提供了一種在人對(duì)象中引發(fā)針對(duì)血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋 白(TRAP)的免疫應(yīng)答的方法，其包括向所述對(duì)象施用包含編碼TRAP之重組猿腺病毒載體 (根據(jù)本發(fā)明第一方面)的免疫原性組合物或疫苗組合物，其數(shù)量足以引發(fā)所述對(duì)象中抗 TRAP免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，以單劑免疫接種的方式施用所述免疫原性或疫苗組合物。在第四方面，本發(fā)明提供了一種在人對(duì)象中引發(fā)針對(duì)血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋 白(TRAP)的免疫應(yīng)答的方法，其包括i)給所述對(duì)象施用引發(fā)劑量的免疫原性組合物或疫苗組合物，其包含編碼TRAP 的重組猿腺病毒載體(根據(jù)本發(fā)明的第一方面)；和ii)給同一對(duì)象施用加強(qiáng)劑量的包含非腺病毒載體的免疫原性或疫苗組合物，所述非腺病毒載體編碼包含血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白(TRAP)之抗原，其中所述加強(qiáng)劑 量在所述弓I發(fā)劑量后至少兩周施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述加強(qiáng)劑量可以在所述加強(qiáng)劑量后八周施用。如果需要，可以將一個(gè)或多個(gè)另外的加強(qiáng)劑量施用給同一對(duì)象，以優(yōu)化在該對(duì)象 中引發(fā)的免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟ii)中施用的所述非腺病毒載體是重組痘病毒載體，例 如經(jīng)修飾安卡拉痘苗(MVA)。在第五方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)品組合或藥盒，其包含
i)包含編碼含有TRAP或其至少一個(gè)T細(xì)胞表位之抗原的猿腺病毒載體的引發(fā)組 合物，和ii)含有非腺病毒載體的加強(qiáng)組合物，其中所述非腺病毒載體也編碼血小板反應(yīng) 蛋白相關(guān)粘附蛋白(TRAP)或其至少一個(gè)T細(xì)胞表位。所述引發(fā)組合物優(yōu)選包含猿腺病毒載體，其包含其中穩(wěn)定整合了編碼至少一個(gè)與 調(diào)節(jié)序列有效連接之抗原的轉(zhuǎn)基因的猿腺病毒基因組，所述調(diào)節(jié)序列指導(dǎo)所述轉(zhuǎn)基因在哺 乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，其中所述抗原包含血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白(TRAP)或其至少一 個(gè)T細(xì)胞表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述引發(fā)組合物和所述加強(qiáng)組合物可以都編碼包含血小板反 應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白(TRAP)或其至少一個(gè)T細(xì)胞表位的相同抗原。在一個(gè)具體的非限定性實(shí)施方案中，所述引發(fā)組合物和所述加強(qiáng)組合物可以都編 碼 ME. TRAP。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用作疫苗的編碼包含TRAP之抗原的重組復(fù)制 缺陷型猿腺病毒載體，特別是提供了一種包含其中穩(wěn)定整合了轉(zhuǎn)基因的猿腺病毒基因組 的猿腺病毒載體，所述轉(zhuǎn)基因編碼至少一個(gè)與調(diào)節(jié)序列有效連接的抗原，所述調(diào)節(jié)序列指 導(dǎo)所述轉(zhuǎn)基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，其中所述抗原包含血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白 (TRAP)或其至少一個(gè)T細(xì)胞表位。本發(fā)明還提供了編碼包含TRAP之抗原的重組復(fù)制缺陷型猿腺病毒載體、尤其是 包含其中穩(wěn)定整合了編碼至少一個(gè)與調(diào)節(jié)序列有效連接之抗原的轉(zhuǎn)基因的猿腺病毒基因 組的猿腺病毒載體在制備用于在人對(duì)象中引發(fā)對(duì)血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白(TRAP)的 免疫應(yīng)答之藥物中的用途，所述調(diào)節(jié)序列指導(dǎo)所述轉(zhuǎn)基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，其中所 述抗原包含血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白(TRAP)或其至少一個(gè)T細(xì)胞表位。本發(fā)明還提供了編碼包含TRAP之抗原的重組復(fù)制缺陷型猿腺病毒載體、尤其是 包含其中穩(wěn)定整合了編碼至少一個(gè)與調(diào)節(jié)序列有效連接之抗原的轉(zhuǎn)基因的猿腺病毒基因 組的猿腺病毒載體在制備用作抗瘧疾疫苗的藥物中的用途，所述調(diào)節(jié)序列指導(dǎo)所述轉(zhuǎn)基因 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，其中所述抗原包含血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白(TRAP)或其至 少一個(gè)T細(xì)胞表位。


圖1顯示了基于編碼抗原ME. TRAP之黑猩猩腺病毒載體AdCh63的本發(fā)明示例性 腺病毒載體的構(gòu)造。圖Ia顯示質(zhì)粒pSG2ME-TRAP。圖Ib顯示通過利用AfeI和Sail消化從pSG2ME-TRAP上切下的4. 7kb片段。此片段含有HCMV啟動(dòng)子、內(nèi)含子A、METRAP和BGH polyA序列。圖Ic顯示帶有在HCMV和BGHpA控制下的丙型肝炎病毒的非結(jié)構(gòu)區(qū)域(NS)的 preChAd63NSmut接受載體。圖Id顯示含有ME-TRAP抗原的前質(zhì)粒pChAd63。圖2顯示了單次引發(fā)后AdCh63ME. TRAP的免疫原性。用1Χ101(ινρ的編碼ME. TRAP 的猿腺病毒載體AdCh63和AdC9免疫接種了 6-8周齡的BALB/c小鼠。在免疫接種后第7、 12和60天，通過ELISpot分析血中的免疫原性。圖3顯示編碼ME. TRAP的猿腺病毒載體AdCh63和AdC9對(duì)寄生蟲攻擊的無菌保護(hù) 和效力。用腺病毒(IXIOicVP)載體免疫接種了 BALB/c小鼠，然后在14天(η = 6)和60天 后(η = 6)通過靜脈內(nèi)施用1000個(gè)伯氏瘧原蟲(Plasmodium berghei)子孢子進(jìn)行攻擊。
圖4顯示腺病毒-MVA引發(fā)-加強(qiáng)方案的免疫原性。用(5 X IO9Vp)編碼ME. TRAP的 猿腺病毒載體AdCh63和AdC9免疫接種了 BALB/c小鼠。8周后，用MVA ME. TRAP (1 X 107pfu) 再次免疫所有小鼠，14天后通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估(a)，在加強(qiáng)后63和182天通過ELISpot 評(píng)估T細(xì)胞應(yīng)答(b)。在用MVA加強(qiáng)后28天還通過ELISA對(duì)IgG抗體的誘導(dǎo)進(jìn)行了定量
(C)。圖5顯示腺病毒-MVA引發(fā)-加強(qiáng)方案對(duì)寄生蟲攻擊的無菌保護(hù)和效力。最 初用腺病毒(5X109vp)載體免疫接種BALB/c小鼠，隨后在8周后用編碼ME. TRAP的 MVA(IXlO7Pfu)加強(qiáng)。在14(a),63(b)和182(c)天后，通過靜脈內(nèi)施用1000個(gè)伯氏瘧原 蟲子孢子攻擊小鼠。圖6顯示在恒河猴中AdCh63ME. TRAP引發(fā)、MVA ME. TRAP加強(qiáng)方案的免疫 原性。用AdCh63ME. TRAP (5 X 1010vp)肌內(nèi)和皮內(nèi)免疫接種恒河猴，在8周后用MVA ME. TRAP (2X 108pfu)加強(qiáng)。免疫后在血液中進(jìn)行離體IFN γ ELISPOT (a)，經(jīng)Ad-引發(fā)及 MVA-加強(qiáng)的免疫應(yīng)答動(dòng)力學(xué)顯示血液中整體ME. TRAP應(yīng)答(b)，在引發(fā)后第四周和加強(qiáng)后 第一周對(duì)跨越ME. TRAP整個(gè)序列的肽庫的IFNy應(yīng)答(c)。圖7顯示了在恒河猴中測(cè)試的兩種不同的AdCh63ME. TRAP引發(fā)、MVA ME. TRAP力口 強(qiáng)方案。時(shí)間(T)以周計(jì)。在每一種情況下，引發(fā)疫苗均是AdCh63ME.TRAP(肌內(nèi)或皮內(nèi)施 用 5X IOicVp),8 周后用 MVA ME. TRAP(皮內(nèi)施用 2X 108pfu)加強(qiáng)。圖8也顯示了在恒河猴中AdCh63ME. TRAP引發(fā)、MVA ME. TRAP加強(qiáng)方案的免疫原 性，其比較了 TRAP T細(xì)胞應(yīng)答和抗體效價(jià)。圖(a)顯示在所附實(shí)施例中利用IFNYELIspot 測(cè)定的對(duì)TRAP肽庫在所述接種疫苗研究時(shí)間過程的TRAPT細(xì)胞應(yīng)答(T =以周計(jì)的時(shí)間)。 組1的對(duì)象接受8周和24周時(shí)MVA ME. TRAP的加強(qiáng)給藥，而組2則接受8、16和24周時(shí) MVA ME. TRAP的加強(qiáng)給藥。使用AdCh63ME. TRAP進(jìn)行單次免疫接種產(chǎn)生了約1000SFU/百萬 PBMC的強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答。圖(b)顯示針對(duì)TRAP蛋白而測(cè)量的7個(gè)個(gè)體的抗體效價(jià)時(shí)程，證明 了用AdCh63ME. TRAP疫苗接種并用MVA ME. TRAP加強(qiáng)誘導(dǎo)了強(qiáng)的抗體效價(jià)。圖9顯示在人對(duì)象中AdCh63ME. TRAP的I期臨床試驗(yàn)中T細(xì)胞免疫原性的時(shí)程，通 過對(duì)與疫苗插入物重疊的15聚體肽庫(T9/96TRAP15聚體)進(jìn)行的IFN γ ELIspot以及對(duì)與 20聚體肽(T9/96TRAP 20聚體)重疊的相同序列進(jìn)行的IFN γ ELIspot進(jìn)行評(píng)估。還顯示了 對(duì)代表異源惡性瘧原蟲(P. falciparum)株的20聚體肽(3D7TRAP 20聚體)的應(yīng)答以及對(duì) ME多表位串中短的主要九聚物瘧疾肽表位串的應(yīng)答(Gilbert等，Nature Biotech. 1997， Nov 15，1280-84)(ME)。
發(fā)明詳述在下述段落中，更詳細(xì)地描述本發(fā)明的多個(gè)方面。除非另有說明，與本發(fā)明的一個(gè)方面有關(guān)的被描述為優(yōu)選的任何特征對(duì)于本發(fā)明的其它方面來說也是優(yōu)選的。本發(fā)明人已經(jīng)構(gòu)建了表達(dá)異源抗原的猿腺病毒載體，所述異源抗原包含紅細(xì)胞前 期瘧疾(子孢子)抗原血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白(TRAP)，本發(fā)明人已觀察到這些載體 在兩個(gè)不同動(dòng)物模型中能夠引發(fā)強(qiáng)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。使用表達(dá)TRAP抗原的猿腺病毒載體所 引發(fā)的T細(xì)胞應(yīng)答水平出乎意料地高，特別是當(dāng)在靈長(zhǎng)類模型中進(jìn)行測(cè)試時(shí)，這表明猿腺 病毒載體和TRAP抗原的組合在引發(fā)抗此紅細(xì)胞前期瘧疾抗原的免疫力上是特別有效的。因此，本發(fā)明的一個(gè)主要方面是提供一種重組復(fù)制缺陷型猿腺病毒載體，其編碼 包含TRAP或其至少一個(gè)表位的抗原(優(yōu)選TRAP的至少一個(gè)T細(xì)胞表位)。所述重組復(fù)制 缺陷型猿腺病毒載體通常包含其中穩(wěn)定整合了編碼至少一個(gè)與調(diào)節(jié)序列有效連接之抗原 的轉(zhuǎn)基因的猿腺病毒基因組，所述調(diào)節(jié)序列指導(dǎo)所述轉(zhuǎn)基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，其中 所述抗原包含血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白(TRAP)或其至少一個(gè)T細(xì)胞表位。腺病毒載體(尤其是猿腺病毒載體)是本領(lǐng)域中普遍已知的。多種復(fù)制缺陷型重 組猿腺病毒描述于WO 2005/071093中，其內(nèi)容通過引用全文并入本文。本發(fā)明的猿腺病毒載體通常包含通過穩(wěn)定插入轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒而修飾的猿腺病毒 基因組，所述表達(dá)盒包含編碼TRAP抗原的核酸序列，所述TRAP抗原與能夠指導(dǎo)所述TRAP 抗原在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列有效連接。本發(fā)明的重組猿腺病毒載體通常是“復(fù)制缺陷型”，這意味著由于編碼病毒復(fù)制所 必需的基因產(chǎn)物之基因的功能性缺失或完全移除，已使得它們無法復(fù)制。舉例來說，可通過 移除El基因以及任選地E3區(qū)域和/或E4區(qū)域的全部或部分使得本發(fā)明的載體成為復(fù)制 缺陷型。所述猿腺病毒的天然E4區(qū)域可被人腺病毒的該區(qū)域如Ad5E4orf6所替換?！皬?fù)制 缺陷型”猿腺病毒載體的一般特征是本領(lǐng)域中已知的，例如來自W02005/071093，其內(nèi)容通 過引用并入本文。在一個(gè)特定的但非限定性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組腺病毒載體可以基于黑猩 猩腺病毒分離株AdCh63。該特定病毒血清型是本領(lǐng)域已知的(例如來自WO 2005/071093), 但是之前從未被描述作為瘧原蟲屬的紅細(xì)胞前期TRAP抗原的疫苗載體。本發(fā)明人已觀察 到表達(dá)TRAP抗原的AdCh63載體骨架的組合誘導(dǎo)出驚人的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，并且具有引發(fā) 強(qiáng)TRAP-特異性抗體(IgG)應(yīng)答的額外優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的載體可表達(dá)全長(zhǎng)TRAP抗原或者其包含至少一個(gè)T細(xì)胞表位的片段。通 常，所述包含至少一個(gè)τ細(xì)胞表位的片段至少是9個(gè)氨基酸長(zhǎng)，其可以是任意長(zhǎng)度直至全長(zhǎng) 的TRAP或ME. TRAP。例如，所述片段可以是9至200，或者9至100，或者9至50個(gè)氨基酸 長(zhǎng)。T細(xì)胞表位在TRAP序列內(nèi)的位置之前已在文獻(xiàn)中進(jìn)行過描述，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員 眾所周知的。TRAP的示例性T細(xì)胞表位描述于下述出版物中Aidoo M, Lalvani A,Allsopp CE,Plebanski Μ,Meisner SJ,KrausaP,Browning Μ,Morris-Jones S,Gotch F,Fidock DA 等.Lancet. 1995 ；345 1003-7 ；Flanagan KL,Plebanski Μ,Akinwunmi P,Lee EA,ReeceffH, Robson KJ, Hill AV, Pinder Μ. Eur J Immunol. 1999 Jun ；29 1943-54 ；禾口 Flanagan KL, Plebanski Μ, Odhiambo K, Sheu Ε, MwangiT, Gelder C, Hart K, Kortok Μ, Lowe B, Robson KJ, Marsh K, Hill AV. Am J Trop Med Hyg. 2006Mar ；74 (3) :367_75，這些文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用全文并入本文，用于描述TRAP的已知T細(xì)胞表位。所述TRAP抗原可來源于任何瘧原蟲，但通常是來自于惡性瘧原蟲株的TRAP抗原。 所述TRAP抗原序列可來自于任何惡性瘧原蟲株，但是在一個(gè)特定的(非限定性的)實(shí)施方 案中，所述TRAP抗原來自于惡性瘧原蟲T9/96株。不同株的惡性瘧原蟲的TRAP抗原顯示 高度的氨基酸序列同一性(通常在全長(zhǎng)TRAP序列上大于90%)。因此，設(shè)想使用具有與惡 性瘧原蟲T9/96株的TRAP抗原的氨基酸序列同一性大于90%、大于95%或大于99%的任 何TRAP氨基酸序列。 TRAP抗原(或其T細(xì)胞表位片段)可單獨(dú)表達(dá)或者與附加多肽序列共同表達(dá)，例 如作為融合蛋白。這些附加多肽序列可包含B細(xì)胞、⑶8+T細(xì)胞或⑶4+T細(xì)胞表位，尤其是 來自于除TRAP之外的惡性瘧原蟲抗原的B-細(xì)胞或T-細(xì)胞表位。一種特別有利的組合是 稱為ME. TRAP的構(gòu)建物，其包含與來自于其它紅細(xì)胞前期惡性瘧原蟲抗原的B細(xì)胞、⑶8+T 細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞表位的多表位串相融合的全長(zhǎng)TRAP抗原(5、6)。文獻(xiàn)中描述的(和SEQ ID NO :2所示的)ME. TRAP抗原含有來自惡性瘧原蟲T9/96株的全長(zhǎng)TRAP序列。但是，應(yīng) 理解此ME. TRAP構(gòu)建物的TRAP部分可以被來自其它株惡性瘧原蟲的TRAP序列所替換。本 領(lǐng)域技術(shù)人員還會(huì)理解所述TRAP序列(和/或ME序列)可以被一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、 插入或缺失所修飾，而基本上不改變T細(xì)胞(或B細(xì)胞)免疫原性。在一個(gè)具體的非限定性實(shí)施方案中，所述ME. TRAP抗原可包含SEQ ID NO :2所示 的氨基酸系列或者由其組成。其它合適的TRAP抗原序列由Robson KJ等，Nature. 1988 ； 335 :79-82所描述，其通過引用并入本文。所述ME表位串由Gilbert SC等，Nat Biotechnol. 1997 ；15(12) :1280_4所描述，其通過引用并入本文。所述指導(dǎo)TRAP抗原表達(dá)的調(diào)節(jié)序列可包含轉(zhuǎn)錄起始序列、啟動(dòng)子序列或增強(qiáng)子 序列以及其組合。所述啟動(dòng)子序列通常是異源啟動(dòng)子(相對(duì)于腺病毒和所表達(dá)抗原均如 此)，并且可以是被真核RNA聚合酶(例如RNA polll)識(shí)別的任何啟動(dòng)子。優(yōu)選的啟動(dòng)子是人巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期(IEl)啟動(dòng)子，其由Chapman等 NAR, 19 :3979-3986所描述，其通過引用全文并入本文。此啟動(dòng)子可以以包含包括內(nèi)含子A 序列在內(nèi)的IEl基因的5'非翻譯區(qū)片段的“長(zhǎng)”形式使用，或者可以以不含內(nèi)含子A序列 的“短”形式使用。通常，“長(zhǎng)” CMV啟動(dòng)子是優(yōu)選的，并且通常排除外顯子B。但是，應(yīng)理解 本發(fā)明并不限于使用所述“長(zhǎng)"HCMV啟動(dòng)子來指導(dǎo)TRAP抗原的表達(dá)。可使用指導(dǎo)所述抗原 合適表達(dá)水平的其它異源啟動(dòng)子，包括表達(dá)水平基本上相當(dāng)于使用所述HCMV “長(zhǎng)”啟動(dòng)子 的啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子包括例如小鼠CMV啟動(dòng)子、勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma virus, RSV)啟動(dòng)子、SV40早期/晚期啟動(dòng)子以及β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒(編碼包含TRAP的抗原)通常還包含異源轉(zhuǎn)錄終止子序列。 可使用任何合適的RNAp0III終止子序列，例如BGH polyA序列。HCMV “長(zhǎng)”啟動(dòng)子與BGH PolyA序列的組合是特別有利的，并且優(yōu)選與AdCh63載體骨架一起使用。所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒(編碼包含TRAP的抗原)通常被插入到猿腺病毒基因組的El 缺失區(qū)域中。但是，應(yīng)理解所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒在所述載體中的插入位點(diǎn)的精確位置和方向 并不重要，只要1)所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒是功能性的，即在插入到腺病毒基因組后它能夠指導(dǎo) 包含TRAP的抗原的表達(dá)，以及2)所述轉(zhuǎn)基因的插入不妨礙腺病毒載體在合適宿主細(xì)胞系 中的復(fù)制和/或包裝在感染性病毒顆粒中。
本發(fā)明的猿腺病毒載體通常以感染性病毒顆粒的形式提供和使用，所述顆粒包含 編碼所述TRAP抗原的重組腺病毒基因組?？梢允褂眉?xì)胞系在組織培養(yǎng)物中培養(yǎng)復(fù)制缺陷 型腺病毒，以產(chǎn)生高滴度的感染性病毒顆粒，所述細(xì)胞系反式提供了所缺少的對(duì)于病毒復(fù) 制和包裝而言所必需的基因產(chǎn)物?？梢詫⑾俨《竟羌?基因組)序列克隆進(jìn)細(xì)菌質(zhì)粒載體 中，以便于使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)進(jìn)行克隆和操作。這些質(zhì)粒代表相應(yīng)腺病毒載體的“分子 克隆”，其含有完整的重組腺病毒基因組。在對(duì)所述質(zhì)粒載體進(jìn)行限制性酶消化以移除細(xì)菌 序列并暴露出反向末端重復(fù)之后，所得核酸可用于轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞系，所述宿主細(xì)胞 系提供了病毒基因組序列所缺失的必需功能基因(例如El基因產(chǎn)物)，從而產(chǎn)生純的重組 病毒顆粒。一個(gè)合適的例子是HEK 293細(xì)胞系，其支持El缺失腺病毒的生長(zhǎng)。另一個(gè)合適 的細(xì)胞系是稱為PerC6的細(xì)胞系。 盡管本發(fā)明主要涉及可以在免疫原性組合物(例如疫苗)中施用的重組猿腺病毒 顆粒，但是，應(yīng)理解，包含在質(zhì)粒載體形式中的帶有穩(wěn)定整合的TRAP(或ME. TRAP)表達(dá)盒的 猿腺病毒骨架的相應(yīng)質(zhì)粒載體也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。這些質(zhì)粒載體可用于生產(chǎn)高滴度的 包含編碼TRAP (或ME. TRAP)抗原之重組腺病毒基因組的腺病毒顆粒。免疫原件組合物本發(fā)明還提供了包含根據(jù)本發(fā)明第一方面的猿腺病毒載體的免疫原性組合物。這 些組合物通常包含感染性腺病毒顆粒形式的猿腺病毒載體，其與一種或多種可藥用賦形 齊U、稀釋劑、載體或佐劑相混合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物可以是疫苗組合物，其適于人施用并且可用于引 發(fā)至少抗所述TRAP抗原的保護(hù)性免疫應(yīng)答(例如通過⑶8+，經(jīng)常是細(xì)胞毒性T細(xì)胞)。所述的有關(guān)本發(fā)明第一方面的猿腺病毒載體的優(yōu)選特征也適用于本發(fā)明的組合 物。本發(fā)明的組合物通常被配制成液體劑型，其包含在合適液體載體中的腺病毒顆 粒，所述載體例如水性載體如IOmM組氨酸、7. 5%蔗糖、35mM NaClUmM MgCl2、0. 1% PS80、 0. ImM EDTA、0. 5%乙醇，pH6. 6，不含內(nèi)毒素的PBS或者任意其它合適的載體。優(yōu)選劑型被 配制成用于肌內(nèi)或皮內(nèi)施用，但是不排除其它給藥途徑，例如經(jīng)口、靜脈內(nèi)、粘膜、透皮等。 用于人施用的免疫原性組合物或疫苗組合物通常含有滴度在1-3X IO11vPAiI的病毒顆粒。引發(fā)免疫應(yīng)答的方法可將包含本發(fā)明猿腺病毒載體的組合物施用給人對(duì)象，以引發(fā)針對(duì)所編碼TRAP 抗原的免疫應(yīng)答。本發(fā)明人已表明，本發(fā)明的載體(特別是編碼ME.TRAP抗原的AdCh93 或AdC9載體)可在動(dòng)物模型中引發(fā)強(qiáng)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。尤其是在小鼠攻擊模型中使用編 碼ME. TRAP的AdCh63載體所顯示出的保護(hù)效力出人意料地大于其它腺病毒載體。在此模 型中的效力在本領(lǐng)域中被廣泛人為是可用作對(duì)人效力的有用的預(yù)測(cè)性指標(biāo)，因此包含編碼 ME. TRAP之AdCh63的疫苗可用于保護(hù)人對(duì)抗瘧疾。事實(shí)上，本發(fā)明人已經(jīng)證明了包含編碼 ME. TRAP之AdCh63的示例性疫苗在人中具有免疫原性。因此，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的組合物(尤其是包含編碼ME. TRAP抗原之 AdCh63載體的組合物)以單次免疫接種的形式或更廣泛給藥方案(例如引發(fā)-加強(qiáng)方案) 之一部分的形式向人對(duì)象的施用。接受本發(fā)明猿腺病毒載體免疫接種的人對(duì)象可以是希望對(duì)瘧疾免疫的任何人對(duì)象。對(duì)于單次免疫接種方案，對(duì)象通常將接受1 X IO8至5X IOki病毒顆粒的劑量。此 劑量一般是皮內(nèi)施用，但也不排除涉及其它劑量和給藥途徑的其它治療方案。引發(fā)-加強(qiáng)方案通常包括在第一時(shí)間點(diǎn)施用引發(fā)劑量的表達(dá)包含TRAP(尤其是 ME. TRAP)之抗原的重組猿腺病毒，然后在第二時(shí)間點(diǎn)施用加強(qiáng)劑量的編碼包含TRAP(或 ME. TRAP)之抗原的非腺病毒載體。所述第一和第二時(shí)間點(diǎn)間隔至少兩周，通常間隔約8周。
用于施用加強(qiáng)劑量的非腺病毒載體可以是編碼包含TRAP (或ME. TRAP)之抗原的 任何非腺病毒載體。合適的實(shí)例包括病毒載體，特別是重組痘病毒載體(例如MVA)以及質(zhì) 粒DNA載體。優(yōu)選的(但非限定性的)組合利用編碼ME. TRAP抗原的重組AdCh63進(jìn)行引發(fā)給 藥，利用編碼ME. TRAP的MVA進(jìn)行加強(qiáng)給藥(例如劑量范圍為1 X IO7至1 X 108pfu)。在一 個(gè)優(yōu)選的(但非限定性的)方案中，兩次給藥都是皮內(nèi)施用，并且引發(fā)給藥和加強(qiáng)給藥的間 隔為8周。通過本文所述的疫苗和接種方案誘導(dǎo)的T細(xì)胞可用于預(yù)防或治療瘧疾。但是它們 還有其它用途。它們可用于產(chǎn)生用于瘧疾診斷的試劑，例如使用T細(xì)胞來診斷瘧疾感染?；?者，所用的T細(xì)胞可能在用于瘧疾免疫療法的T細(xì)胞轉(zhuǎn)移方案中是有價(jià)值的。另外，可將免 疫接種后個(gè)體產(chǎn)生足夠免疫應(yīng)答的能力用作免疫能力的度量，以排除特定的免疫或遺傳缺 陷。參考下列非限定性實(shí)驗(yàn)實(shí)施例會(huì)進(jìn)一步理解本發(fā)明。實(shí)施例1AdCh63ME. TRAP 載體的產(chǎn)生AdCh63ME. TRAP是表達(dá)ME-TRAP的復(fù)制缺陷型腺病毒載體，其用于疫苗接種以預(yù)
防瘧疾。AdCh63ME-TRAP由下列組成猿腺病毒，含有表達(dá)一系列已知細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL) 的基因序列的黑猩猩腺病毒血清型63，與完全紅細(xì)胞前期抗原即血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附 蛋白(TRAP)融合的來自惡性瘧原蟲紅細(xì)胞前期抗原的表位。構(gòu)成ME-TRAP的‘多表位’部分的各個(gè)CTL表位代表多種潛在的保護(hù)性靶抗原，其 被包括在內(nèi)以確保所接種人群中的大多數(shù)對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答。TRAP是高豐度的紅細(xì)胞前期 抗原。接種了經(jīng)照射的子孢子且被保護(hù)免受瘧疾的人志愿者產(chǎn)生抗TRAP的T細(xì)胞應(yīng)答，使 其成為用于包括在瘧疾疫苗之中的有力候選者。疫苗插入片段的核酸序列顯示為SEQ ID NO :1。使用質(zhì)粒pChAd63ME-TRAP作為產(chǎn)生AdCh63ME_TRAP的起始材料。為了產(chǎn) 生此質(zhì)粒，通過同源重組將ME-TRAP表達(dá)盒克隆進(jìn)線性化的前腺病毒接受載體(pre adeno-acceptor vector)中。此質(zhì)粒的構(gòu)建示于圖1中。用AfeI和SalI切割質(zhì)粒pSG2ME_TRAP (圖la)，切下4. 7kb的含有HCMV啟動(dòng)子、 METRAP和BGHpolyA序列的片段。將也含有HCMV啟動(dòng)子、內(nèi)含子A和BGH polyA序列的所得ME-TRAP 4. 7kb片段 (圖lb)重組進(jìn)preChAd63NSmut接受載體中，所述載體帶有在HCMV和BGHpA控制下的丙型肝炎的非結(jié)構(gòu)區(qū)域(NS)(圖lc)。PChAd63載體來源于克隆在質(zhì)粒載體中的野生型黑猩猩 腺病毒63基因組，其在pChAd63病毒骨架的不同區(qū)域帶有下述修飾1)病毒基因組的El區(qū)域(455bp至3421bp)缺失
2) 27207bp 至 31788bp 的 E3 區(qū)域缺失3) 33834bp 至 36216bp 的 E4 區(qū)域缺失4) 33319bp 至 34200bp 的 Ad5E4orf6 插入通過HpaI和SnabI的切割使得接受載體ChAd63 (c) NSmut線性化。通過在大腸桿 菌(E.coli)中的同源重組將ME-TRAP表達(dá)盒克隆進(jìn)前腺病毒載體中。用約30ng線性化的 接受載體(AHpaI, ASnabI)和約 IOOng 消化的 pSG2ME_TRAP ( Δ AfeI、Δ Sail)共轉(zhuǎn)染 BJ 5183細(xì)胞。在4. 7kb片段和前腺病毒ChAd63NSmut接受載體之間發(fā)生的重組導(dǎo)致4. 7kb片 段(含有HCMV啟動(dòng)子、ME-TRAP基因和BGH polyA序列)插入到腺病毒載體中，其利用了 HCMV啟動(dòng)子和BGH polyA序列之間存在的同源性。通過使用HindIII和EcoRI的限制性消 化分析鑒定了陽性克隆。圖Id是含有ME-TRAP抗原的新型ChAd63載體的圖。顯示出了 HindIII和EcoRI 位點(diǎn)。通過限制性酶分析和測(cè)序進(jìn)行了對(duì)質(zhì)粒DNA的鑒定。對(duì)于含ME-TRAP的片段，在瓊 脂糖凝膠電泳上觀察到了預(yù)期的Hindlll-EcoRI限制性酶切特征。利用不同寡聚物進(jìn)行了 測(cè)序分析，證實(shí)ME-TRAP插入片段的序列是正確的。原代病毒儲(chǔ)液(PVS)的制備HEK 293細(xì)胞的制備I質(zhì)粒DNA線性化丨轉(zhuǎn)染引發(fā)腺病毒感染I收獲腺病毒人胚腎293 (HEK 293)細(xì)胞系是經(jīng)剪切的人5型腺病毒DNA轉(zhuǎn)化的原代人胚胎腎 細(xì)胞的永生化細(xì)胞系。該細(xì)胞特別易感于人腺病毒，并且支持ElA缺失的復(fù)制缺陷型腺病 毒的生長(zhǎng)。HEK 293 細(xì)胞獲得自 BioReliance，Todd Campus, West of Scotland Science Park, Glasgow G200XA。HEK 293細(xì)胞系作為貼壁細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞在添加有谷氨酰胺和10%合格胎牛血清 (FBS)的DMEM中于無菌情況下培養(yǎng)，不添加抗生素。為產(chǎn)生PVS，利用化學(xué)成分確定的陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipof ectamine 2000 (來自Invitrogen)將5 μ g PmeI線性化質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)對(duì)數(shù)期的HEK 293細(xì)胞(接 種后18小時(shí))。限制性酶PmeI和特定緩沖劑購自New England Biolabs (NEB)。該緩沖劑中的 BSA確定為US來源。4個(gè)單位的PmeI (10000U/mL)用于線性化IygW DNA。使用無菌水來 稀釋。將不含胎牛血清(FBS)的Dulbecco' s改良Eagles培養(yǎng)基(DMEM)用于轉(zhuǎn)染階段 (FBS的存在降低轉(zhuǎn)染效率)。在第10天收獲轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，此時(shí)觀察到了最大細(xì)胞致病作用 (CPE)。通過三次凍融從細(xì)胞收獲病毒，并與細(xì)胞上清液合并在10%無菌甘油中，最終體積 為4. lmL。將PVS小管速凍并保存在-80°C。將6個(gè)月的再次試驗(yàn)日期分配給此儲(chǔ)備液。
前工作載體儲(chǔ)備液A的制備將一管HEK 293細(xì)胞解凍，并在添加了谷氨酰胺的含10% FBS的DMEM中擴(kuò)增，在 5次傳代后產(chǎn)生2個(gè)Cellbind轉(zhuǎn)瓶的均勻分散的貼壁細(xì)胞。在感染當(dāng)天，使用重組胰蛋白 酶將1個(gè)轉(zhuǎn)瓶中的細(xì)胞重懸，并計(jì)數(shù)。細(xì)胞密度為1.06X 105細(xì)胞/cm2。在113毫升接種體 中，用原始病毒儲(chǔ)備液感染第二個(gè)轉(zhuǎn)瓶中的細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.64pfu/細(xì)胞。將所 需量的儲(chǔ)備液病毒(1.25mL)在濕冰上解凍，并用細(xì)胞培養(yǎng)基(01^11加谷氨酰胺和2% 8幻 稀釋至115mL。 將轉(zhuǎn)瓶手動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)一次，然后置于設(shè)定在37°C的孵箱中以0. Irpm旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)瓶組上， 孵育48小時(shí)。每天檢查轉(zhuǎn)瓶CPE的存在。典型CPE伴隨細(xì)胞的轉(zhuǎn)動(dòng)。檢查對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng) 物沒有CPE。在一輪病毒復(fù)制并出現(xiàn)總CPE后(48小時(shí))，收獲病毒感染的轉(zhuǎn)瓶。將病毒感染 的細(xì)胞輕輕重懸于培養(yǎng)基中，形成細(xì)胞懸液，然后以2000rpm在20°C離心15分鐘使細(xì)胞沉 淀。除去上清，將細(xì)胞沉淀重懸于8. Oml的細(xì)胞裂解緩沖液(在CBF純化水中制備的IOmM Tris, 135mMNaCl, ImM MgCl，pH7. 9)中。然后將細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移到50mL聚丙烯管中。將細(xì)胞 沉淀凍融三次(在IPA/干CO2浴中冷凍，然后在37°C水浴中解凍)。以3000rpm在4°C下 再次離心30分鐘澄清細(xì)胞裂解物。以小的等分試樣在-80攝氏度下速凍上清(細(xì)胞裂解 物)。從細(xì)胞裂解物中取樣進(jìn)行感染滴定(3. 34 X 108pfU/mL)。分析感染和未感染細(xì)胞上 清(均為100毫升)樣品的生物負(fù)載(均為陰性)。工作載體儲(chǔ)備液(WVS) 1和2的制備使用前工作載體儲(chǔ)備液(前WVS)制備了工作載體儲(chǔ)備液1 (WVSl)，并使用WVSl制 備了 WVS2。兩者都包括在Cellbind轉(zhuǎn)瓶中均勻貼壁的HEK293細(xì)胞中的一輪病毒復(fù)制。計(jì) 算WVS2的量使得每批生產(chǎn)使用彡10%的總WVS2。對(duì)于WVS1，使用14個(gè)轉(zhuǎn)瓶的細(xì)胞密度為 1. 29 X 105/cm2的HEK 293細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增；對(duì)于WVS2，使用29個(gè)轉(zhuǎn)瓶的1. 54X 105/cm2 的細(xì)胞密度。對(duì)于WVSl和WVS2來說，制備規(guī)格都是相同的。用添加谷氨酰胺和2% FBS的 DMEM將病毒接種物(分別為前WVS或WVS1)稀釋至113mL/轉(zhuǎn)瓶(對(duì)于WVS1)以及稀釋至 20mL/轉(zhuǎn)瓶保持2小時(shí)然后稀釋至113mL/轉(zhuǎn)瓶(對(duì)于WVS2)。最終MOI分別是1. 01 (對(duì) 于WVS1)和8.6pfu/細(xì)胞(對(duì)于WVS2)。將轉(zhuǎn)瓶手動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)一次，然后置于設(shè)定在37°C的以 0. Irpm旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)瓶組上，分別孵育48小時(shí)和71小時(shí)。每天檢查轉(zhuǎn)瓶CPE的存在。兩者的 方法中都包括了含未感染HEK 293細(xì)胞的陰性對(duì)照轉(zhuǎn)瓶以用于對(duì)比和細(xì)胞計(jì)數(shù)。WVSl在感染后48小時(shí)收獲，而WVS2在感染后71小時(shí)收獲。將病毒感染的細(xì)胞輕 輕重懸于細(xì)胞上清中，形成細(xì)胞懸液，然后將其傾倒進(jìn)離心管中，以2000rpm在20°C下離心 15分鐘使細(xì)胞沉淀。除去細(xì)胞上清，將每個(gè)轉(zhuǎn)瓶的各細(xì)胞沉淀重懸于8. Oml細(xì)胞裂解緩沖 液(10mMTris，135mM NaCl, ImM MgCl，pH7. 9)中。然后，將細(xì)胞沉淀懸液匯集到聚丙烯管中。 將管凍融三次(在IPA/干冰浴中冷凍，然后在37°C水浴中解凍)。通過在4°C以3000rpm 再次離心30分鐘澄清所得細(xì)胞裂解物。合并含有病毒(WSV1或WSV2)的上清(細(xì)胞裂解 物)，取樣，分為等分試樣并在-80°C速凍。對(duì)于每種儲(chǔ)備液制備112mL和236mL的終體積。制備AdCh63ME-TRAP的大量收獲臨床批次使用WVS2制備三批大量收獲批次的AdCh63ME-TRAP。每個(gè)批次由來自WVS2的一 輪病毒復(fù)制組成。該過程類似于如上所述制備WVS2，初始接種20mL/轉(zhuǎn)瓶，保持2小時(shí)，然后加滿到113mL/轉(zhuǎn)瓶的終體積，但是在細(xì)胞裂解過程中在第一次冷凍/融解循環(huán)后添加 Benzonase酶。如上所述用含2% FBS和谷氨酰胺的DMEM稀釋病毒接種物(WVS2)，將其以 20毫升2-3pfu/細(xì)胞的MOI的量加入到HEK293轉(zhuǎn)瓶中。將瓶手動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)一次然后置于設(shè)定 在37°C的孵箱中的以0. Irpm旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)瓶組上孵育共71小時(shí)。每日檢查轉(zhuǎn)瓶CPE的存在 情況，在總CPE出現(xiàn)后收獲病毒感染的轉(zhuǎn)瓶。將病毒感染的細(xì)胞輕輕重懸于培養(yǎng)基中以形 成細(xì)胞懸液。從每個(gè)轉(zhuǎn)瓶中取出2. 5mL細(xì)胞懸液和上清的樣品，并合并。將其標(biāo)記為大量 收獲前合并物批次1、2或3。取這些“大量收獲”樣品用于最終的合并，以產(chǎn)生用于工藝中 的腺病毒外部試驗(yàn)和用于逆轉(zhuǎn)錄酶的大量收獲樣品。然后在20°C下以2000rpm離心30分 鐘將所剩懸液沉淀。除去細(xì)胞上清，將每個(gè)轉(zhuǎn)瓶的細(xì)胞沉淀重懸于8. Oml的細(xì)胞裂解緩沖 液(IOmM Tris,135mM NaCl, ImM MgCl, pH7. 9)中。然后，將細(xì)胞沉淀懸液合并并分配到聚 丙烯管中。所述管經(jīng)歷一輪凍融(在IPA/干冰浴中冷凍，然后在37°C水浴中解凍)。最小 冷凍時(shí)間為30分鐘。然后，在純化前加入Benzonase酶以降解殘余的宿主細(xì)胞DNA (每8mL 細(xì)胞裂解物1500個(gè)單位)。將細(xì)胞裂解物與Benzonase酶在20士2°C下在設(shè)置為全速的旋 轉(zhuǎn)搖床上孵育25-35分鐘，之后進(jìn)行如上所述的另外兩輪凍融。通過在4°C下以3000rpm再 次離心30分鐘澄清細(xì)胞裂解物。使用無菌吸管取出細(xì)胞裂解物上清以測(cè)定合并的體積，分 為等分試樣并在-80°C下速凍。進(jìn)行下游處理以制備純化的收獲批次解凍 BHL(54_128mL)I CsCl分步梯度(1或2次運(yùn)行/批次)ICsCl平衡梯度(1次運(yùn)行/批次)I配制(緩沖液交換)I 稀釋和聚集體過濾(0. 45 μ )I作為單個(gè)純化批次速凍腺病毒顆粒在氯化銫(CsCl)中具有獨(dú)特的密度，這使得其可以通過在Beckman Optima超速離心機(jī)中進(jìn)行的密度梯度超速離心而從大多數(shù)污染物病毒以及宿主細(xì)胞蛋白 和DNA中純化出來。缺少被包裝DNA的病毒顆粒(空衣殼)可以與完整病毒粒子分離開來， 因?yàn)樗鼈兠芏容^小。通常，分步梯度超速離心之后，可見較低的“感染性”病毒顆粒條帶，其 上面的條帶含有空衣殼。通過平衡CsCl密度梯度超速離心20小時(shí)進(jìn)一步純化來自第一分 步梯度的收獲物。純化的批次量受到離心管和轉(zhuǎn)子(Bechman SW40)可容納的大量收獲物 體積的限制。選擇大量收獲物批次等分試樣的量使得該量適于轉(zhuǎn)移到該處理，在每個(gè)純化 批次開始時(shí)解凍合適量的大量收獲物。將來自1和2初始分步梯度離心運(yùn)行之間的病毒收 獲物用作第二平衡離心步驟的起始材料。從而在一系列重復(fù)的純化處理過程中進(jìn)行大量收 獲物批次的純化。總共由3個(gè)大量收獲物批次制得了初始的小批次(用于毒性和穩(wěn)定性研 究)和10個(gè)純化批次。
不連續(xù)CsCl超速離心在14mL超凈離心管(Beckman)中使用3個(gè)不同的CsCl密度手工制備分步梯度。 在CBF純水中IOmM Tris pH7. 9中制備氯化銫溶液。起初將2ml 1. 25g/L CsCl溶液添加 到每個(gè)管中，并用2ml 1. 35g/L CsCl形成底層。最后用最大密度的CsSl溶液(0. 5ml的 1. 50CsCl)形成底層。在1個(gè)小時(shí)使用時(shí)間內(nèi)使用冷卻的溶液制備分步梯度。將大量收獲物批次細(xì)胞裂解物的各樣品在冷水(4-10°C )中解凍。將約8. 5mL細(xì) 胞裂解物手動(dòng)置于CsCl梯度的頂層。將管迅速(< 1小時(shí))以ISOOOOg離心3小時(shí)。在 離心過程中，上方的細(xì)胞碎片區(qū)域、空衣殼材料的擴(kuò)散帶以及下方的感染性病毒的窄細(xì)條 帶相分離。通過用與Iml注射器相連的16G水平針刺穿每個(gè)管的側(cè)壁來收獲下方的條帶。 每個(gè)管平均收集0.6ml病毒，將其合并并且如果需要保存在4-10°C。最大保持時(shí)間是4小 時(shí)。平衡CsCl超速離心使用相同的離心管進(jìn)行平衡超速離心。最初用6mL密度為1. 35的CsCl填充這些 管，并用1.0-1. 5mL收獲自第一超速離心步驟的病毒合并物鋪在其上層。將在注射用水中 制備的磷酸鹽緩沖鹽水加滿作為緩沖液。以150000g在10°C下將病毒離心20小時(shí)。這得到 了擴(kuò)散的模糊上方條帶以及下方的完整病毒顆粒的窄細(xì)條帶。還可觀察到在該窄細(xì)條帶兩 側(cè)各有一條模糊的條帶。如上所述使用16G水平針和注射器收獲感染性病毒顆粒的主要窄 細(xì)條帶。每個(gè)管收獲0. 5至1. OmL的病毒，在最后通過緩沖液交換配制之前將其在4-10°C 的冷盒中保存最多2小時(shí)。配制成最終緩沖液使用一次性聚丙烯預(yù)裝PD-10柱，通過在S印hadex G25上色譜脫鹽將CsCl純化 的病毒合并物進(jìn)行緩沖液交換至最終的配制緩沖液(A438)，所述PD-10柱含有8. 3mL在 水中的Sephadex G25，其中含有0. 15% Kathon作為抗微生物劑(GE Healthcare的A聚 體shamBiosciences部門)。在消毒前建立6倍柱體積的水洗條件，從柱洗脫液中除去> 99. 5%的 Kathon。水洗之后，用0. 5M氫氧化鈉對(duì)柱消毒最少20分鐘，使用5倍柱體積的磷酸鹽緩沖 鹽水中和氫氧化鈉。最后，以配制緩沖液(3倍柱體積)配制緩沖液(A438) :10mM組氨酸、 35mM NaClUmM MgCl清洗柱。使用注射用水制備0. ImM EDTA.0. 5% (ν/ν)乙醇、7. 5%蔗 糖、0. 1% PS80pH6. 6。針對(duì)病毒樣品(< 1. 5mL)和收集體積(< 2. 25mL)建立條件，使得 在終產(chǎn)品最大患者劑量中的最終CsCl濃度比相當(dāng)于皮下注射氯化銫的大鼠LD50的經(jīng)調(diào)節(jié) 重量還要低>61og。使用一系列柱5)進(jìn)行每個(gè)純化批次的緩沖液交換，從而可應(yīng)用和 收集特定的體積。從每個(gè)柱收集作為單個(gè)級(jí)分的病毒峰，將這些級(jí)分合并以產(chǎn)生濃縮的純 化批次。在質(zhì)量控制(QC)病毒顆粒測(cè)定中，將該批次用冰冷的A438稀釋至2-3X10"^/ mL，并用0. 45微米過濾器(Millipore Millex HV直徑33mm PVDF盤式過濾器)過濾以除 去大的病毒聚集體。將每個(gè)純化批次在異丙醇/干冰中速凍并保存在-80°C。最大保持時(shí) 間是配制后1小時(shí)。最終劑型置于0. 6mL玻璃瓶中。每瓶AdCh63ME_TRAP含有1. 3 X lO^vp/mL，其配 制于 IOmM 組氨酸、7. 5%蔗糖、35mM NaCl、ImMMgCl2、0. 1 % PS80、0. ImM EDTA、0. 5% 乙醇， pH6.6(此滴度由260nm下的吸收度測(cè)定)。AdCh63ME_TRAP的使用劑量通常是皮內(nèi)施用IX IO8VP至5X IOltVp。相應(yīng)于任何更新的濃度，所施用的體積可以不同。實(shí)施例2-測(cè)試AdCh63ME. TRAP載體
材料與方法免疫接種小鼠6至8周齡的雌性BALB/c小鼠購自牛津大學(xué)John Radcliffe醫(yī)院的生物醫(yī)學(xué) 服務(wù)單位，全部動(dòng)物均符合英國(guó)內(nèi)政部動(dòng)物保護(hù)法案計(jì)劃許可(Animals Act Project License)的條款。進(jìn)行皮內(nèi)免疫接種，其之前已顯示出比其它途徑(例如皮下、肌內(nèi))更好 地引發(fā)免疫原性[11]。以IX IOltl病毒顆粒(v. p.)的劑量施用腺病毒進(jìn)行包括單次引發(fā) 的實(shí)驗(yàn)，以及以5X IO9Vp的較低劑量施用腺病毒進(jìn)行引發(fā)-加強(qiáng)方案。以IXlO7Pfu的劑 量使用MVA加強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答。所有載體在免疫接種前均重懸于不含內(nèi)毒素的PBS中。恒河猴中T細(xì)胞應(yīng)答的免疫接種和分析通過三角肌中肌內(nèi)注射(恒河猴id號(hào)0033、1029、2013和4073)以及皮內(nèi)(id 號(hào)0043、2009和6015)兩個(gè)不同途徑施用5X IOicVp劑量的AdCh63ME. TRAP免疫接種恒河 猴。在8周后通過皮內(nèi)免疫接種2X IO8Pfu劑量的MVA ME. TRAP對(duì)所有恒河猴進(jìn)行加強(qiáng)免疫。通過用跨越整個(gè)ME. TRAP區(qū)域的4肽庫刺激T細(xì)胞來進(jìn)行離體IFN y ELISpot。通 過將各合并物的應(yīng)答相加并減去僅含有DMSO的未刺激樣品的背景值而計(jì)算得到總TRAP應(yīng)答。病毒載體實(shí)驗(yàn)中所用的所有病毒載體AdCh63、AdC9和MVA表達(dá)如上所述的轉(zhuǎn)基因 ME. TRAP [5、12]。如本文其它部分所述，插入片段ME. TRAP是2398bp的編碼789個(gè)氨基酸的 蛋白質(zhì)的雜合轉(zhuǎn)基因。ME串含有位于許多其它B細(xì)胞和T細(xì)胞表位之間的BALB/c H_2Kd 表位Pb9[13]。如上所述構(gòu)建并擴(kuò)增猿腺病毒載體AdC9 (SAdV) [14]。如實(shí)施例1中所述進(jìn)行AdCh63ME. TRAP的制備和載體生產(chǎn)。已經(jīng)使用此方案成功 產(chǎn)生良好滴度的AdCh63，可基于替代的猿腺病毒載體骨架使用類似方案來產(chǎn)生ME. TRAP載 體。離體IFN γ ELISP0T在IPVH膜平板(Millipore)上培養(yǎng)ACK-處理的脾細(xì)胞或PBMC18-20小時(shí)，所述 平板具有終濃度為ι μ g/ml的優(yōu)勢(shì)免疫表位H-2Kd限制性表位Pb9(SYIPSAEKI)。如上所述 進(jìn)行 ELISPOT [15]。ELISA如上所述通過ELISA分析了抗TRAP區(qū)域的IgG抗體[16]。對(duì)于該實(shí)驗(yàn)，在利用腺 病毒-MVA引發(fā)-加強(qiáng)方案免疫接種4周后，從至少3只BALB/c小鼠的組獲得了血清。寄生蟲攻擊自雌性瘧蚊(Anopheles stephensi)的唾液腺中分離出伯氏瘧原蟲(Plasmodium berghei) (ANKA株系克隆234)子孢子(spz)。將寄生蟲重懸于RPMI-1640培養(yǎng)基中，每個(gè) 小鼠通過靜脈內(nèi)途徑接受總共lOOOspz。從第5至第20天，每天取血液樣品；用吉姆薩對(duì) 涂片染色，并篩選紅細(xì)胞內(nèi)裂殖體的存在。存活定義為血液中完全沒有寄生蟲。統(tǒng)計(jì)分析
使用單向或雙向ANOVA和Bonferroni驗(yàn)后檢驗(yàn)分析流式細(xì)胞術(shù)樣品的統(tǒng)計(jì)學(xué) 顯著性° 使用 windows 下的 GraphPad Prism 4. 03 版(GraphPad Software, San Diego California, USA, www. graphpad. com)進(jìn)行所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。MM
小鼠中AdCh63ME. TRAP單次引發(fā)后的免疫原性單次免疫接種后，腺病毒載體能夠誘導(dǎo)強(qiáng)的長(zhǎng)期CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。圖2顯示了均 編碼ME. TRAP轉(zhuǎn)基因的AdCh63和AdC9之間的比較。轉(zhuǎn)基因的ME串中優(yōu)勢(shì)免疫性H_2Kd 限制性表位Pb9(SYIPSAEKI)的存在使得我們能夠評(píng)估所述病毒載體引發(fā)的免疫應(yīng)答的效 力。我們實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果表明AdC9是免疫原性最強(qiáng)的載體之一，其能夠誘導(dǎo)強(qiáng)于人血清型 AdH5的⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答。圖2顯示AdCh63ME. TRAP在60天的時(shí)期內(nèi)誘導(dǎo)類似于AdC9的應(yīng) 答。在免疫接種7天后的早期，AdCh63⑶8應(yīng)答明顯高于AdC9，后來則沒有觀察到顯著的差 異。任何病毒載體疫苗的重要目的是誘導(dǎo)強(qiáng)記憶性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的可能性，在這一點(diǎn)上 AdC9和AdCh63ME. TRAP兩種載體均顯示出類似的免疫原性，甚至是在60天的長(zhǎng)時(shí)間后。小鼠中對(duì)伯氏瘧原蟲攻擊的保護(hù)該研究結(jié)果首次表明，用腺病毒載體單次免疫接種可在伯氏瘧原蟲子孢子攻擊后 引發(fā)高水平的對(duì)瘧疾的無菌保護(hù)。最初實(shí)驗(yàn)表明例如AdH5、AdC7和AdC9的載體在僅一次 免疫接種(以IXlOiciv. p.的劑量)后就能夠保護(hù)高百分?jǐn)?shù)的小鼠。圖3顯示免疫后不久 在第14天(a)和免疫施用和攻擊之間60天的長(zhǎng)時(shí)期后(b)AdCh63ME. TRAP與AdC9保護(hù)水 平的比較。盡管兩種載體隨時(shí)間表現(xiàn)出類似的免疫原性(圖2)，但AdCh63ME.TRAP引發(fā)的 保護(hù)水平在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)都超出AdC9。特別重要的是，我們發(fā)現(xiàn)在免疫接種后第14天的攻 擊后，AdCh63保護(hù)所有小鼠免受感染達(dá)15天，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)6只小鼠中僅有1只小鼠被感 染。AdC9顯示了較低水平的短期(圖3a)和長(zhǎng)期(圖3b)保護(hù)。引發(fā)-加強(qiáng)方案已有報(bào)道稱，與單次施用載體或用其它載體(例如DNA或FP9，然后用MVA)的引 發(fā)-加強(qiáng)方案相比，用AdH5引發(fā)并隨后用編碼相同轉(zhuǎn)基因的MVA加強(qiáng)(A-M方案)增加了 免疫原性[11]。因此，我們測(cè)試了使用將猿腺病毒載體與8周后痘病毒載體MVA相組合的 引發(fā)-加強(qiáng)方案的方法。圖4顯示由AdCh63-MVA和AdC9_MVA方案引發(fā)的⑶8+T細(xì)胞應(yīng) 答(圖4a、b)和抗體應(yīng)答(圖4c)之間的比較。免疫接種后不久(圖4a)，AdCh63顯示了 高水平的CD8應(yīng)答，盡管AdC9的應(yīng)答更有效，但是沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)長(zhǎng)期應(yīng)答的分 析顯示了引發(fā)-加強(qiáng)方案相對(duì)于單次引發(fā)的巨大優(yōu)勢(shì)。如圖4b所示，CD8應(yīng)答甚至在加 強(qiáng)后第60天仍保持很高(> 25000SFC/百萬PBMC)，這與單次疫苗接種后同一時(shí)間點(diǎn)的水 平(< 10000SFC/百萬PBMC，圖2)形成了對(duì)比。MVA加強(qiáng)后6個(gè)月，免疫原性水平仍高于 10000斑點(diǎn)/百萬PBMC，在兩種所測(cè)試的猿腺病毒載體之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。盡管保護(hù)效力依賴于該體系中的細(xì)胞免疫應(yīng)答，但腺病毒載體還提供了誘導(dǎo)強(qiáng)轉(zhuǎn) 基因特異性抗體應(yīng)答的額外優(yōu)點(diǎn)[17]。由于抗體提供了除細(xì)胞免疫應(yīng)答之外的額外保護(hù)， 此特征在該腺病毒用于人體中疫苗用途時(shí)可能非常重要。通過對(duì)A-M引發(fā)-加強(qiáng)方案引發(fā) 的IgG進(jìn)行定量來評(píng)估了體液應(yīng)答。如圖4c所示，所測(cè)試兩種方案的抗體應(yīng)答很高，使用 AdCh63-MVA組合導(dǎo)致了比AdC9明顯要高的IgG水平。因?yàn)橐l(fā)-加強(qiáng)方案改善了免疫原性水平，所以利用依次疫苗接種的相同策略分析了無菌保護(hù)的水平(圖5)。在兩種方案中加強(qiáng)之后短時(shí)間間隔和長(zhǎng)時(shí)間間隔時(shí)均發(fā)現(xiàn)了 顯著的水平。但是，AdCh63-MVA方案在所測(cè)試的所有時(shí)間點(diǎn)均超出了 AdC9-MVA。有意思的 是，AdCh63-MVA方案在100%的動(dòng)物中引發(fā)了短期的無菌保護(hù)。盡管該保護(hù)作用隨時(shí)間而 降低，但是其仍保持高水平，甚至在加強(qiáng)免疫接種6個(gè)月后兩種方案均驚人地誘導(dǎo)高水平 的保護(hù)(圖5c)。恒河猴中的免疫原性 在許多現(xiàn)有技術(shù)的例子中，觀察到在非人靈長(zhǎng)類或人中測(cè)試時(shí)載體疫苗的效力與 小鼠中的應(yīng)答相比出現(xiàn)降低。因此，在恒河猴中測(cè)試了類似于如上所述的在小鼠中的引 發(fā)-加強(qiáng)方案。用根據(jù)實(shí)施例1制備的5 X IOicVp劑量的AdCh63ME. TRAP疫苗免疫接種了 7只恒 河猴。皮內(nèi)或肌內(nèi)施用疫苗，但是在這些途徑之間沒有觀察到免疫原性差異，如數(shù)據(jù)所示。 在使用AdCh63ME-TRAP免疫接種后的不同時(shí)間，進(jìn)行使用異源病毒載體即編碼ME-TRAP的 MVA的加強(qiáng)免疫接種(參見圖7)。數(shù)據(jù)表明(圖8)AdCh63ME-TRAP在恒河猴中具有很高的 免疫原性，恒河猴是一種被普遍認(rèn)為可用于預(yù)測(cè)人體中疫苗免疫原性的物種。單次免疫接 種后，在ELISP0T測(cè)定中觀察到平均T細(xì)胞應(yīng)答為約1000SFU/百萬PBMC，其為之前與此疫 苗插入物在人體中保護(hù)相關(guān)的水平(Webster等，PNAS 2005102 =4836-41) 0另外，免疫接種 誘導(dǎo)得到強(qiáng)的抗體效價(jià)。使用MVA的異源加強(qiáng)免疫接種可以將T細(xì)胞和抗體應(yīng)答都提高到 甚至更高的水平。來自選定時(shí)間點(diǎn)的T細(xì)胞表型的有限分析表明CD8和CD4T細(xì)胞均被該 免疫接種方案所誘導(dǎo)，這些可能是表達(dá)Y干擾素、TNF和IL2的多功能細(xì)胞。如圖6a所示，用AdCh63ME. TRAP引發(fā)產(chǎn)生強(qiáng)的T細(xì)胞應(yīng)答，其在疫苗接種后第4 周達(dá)到峰值。令人感興趣的是，除了一只(4073)之外的所有恒河猴都是幼年的，其體重為 3_4kg，而較年老且較重的動(dòng)物No. 4073 (大于IOkg)則在引發(fā)后顯示出特別好的免疫應(yīng)答。 重要的是，可通過使用MVA ME. TRAP的隨后免疫接種來加強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答，在比較引發(fā)的峰 值和加強(qiáng)后的峰值時(shí)，在一些例子中發(fā)現(xiàn)多達(dá)五倍的差異。在比較對(duì)跨越整個(gè)ME. TRAP區(qū) 域的肽庫的免疫應(yīng)答后，進(jìn)行另外的觀察。T細(xì)胞應(yīng)答主要集中于AdCh63引發(fā)后的合并物 T2(圖6b)。但是，MVA加強(qiáng)提供了在對(duì)ME. TRAP的免疫應(yīng)答中寬度增加的額外優(yōu)點(diǎn)，這時(shí) 并不主要集中在T2，而是針對(duì)整個(gè)ME. TRAP序列(圖6c)。重要地，恒河猴中誘導(dǎo)的這些 強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答很可能是針對(duì)瘧疾抗原所曾經(jīng)誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答中最強(qiáng)的，其比目前為止進(jìn) 行的任何臨床試驗(yàn)中對(duì)ME. TRAP所誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答都高得多。因?yàn)獒槍?duì)TRAP誘導(dǎo)的T細(xì) 胞應(yīng)答的量級(jí)與人臨床試驗(yàn)中所測(cè)得的保護(hù)的量相關(guān)(Webster等PNAS ;DimaChie et al Infection and Immunity)，所以我們預(yù)測(cè)此疫苗方案應(yīng)該會(huì)比目前為止在人體中測(cè)試的 任何ME. TRAP疫苗更加有效。AdCh63ME. TRAP 在人中的用途已經(jīng)在I期人臨床試驗(yàn)中評(píng)價(jià)了猿腺病毒載體AdCh63ME. TRAP,以檢驗(yàn)AdCh63ME. TRAP單次免疫以及包括上述腺病毒并隨后8周后MVA加強(qiáng)的引發(fā)-加強(qiáng)方案在人中的安全 性和免疫原性。所招募的所有志愿者都是健康成年男性。因?yàn)檫@是首次在人中評(píng)價(jià)黑猩猩腺病毒 載體，第一組接種者接受IO8Vp的非常低劑量的疫苗。這可能與施用給恒河猴的5X IOltVp 的劑量形成對(duì)比，在先前人腺病毒載體疫苗試驗(yàn)中使用1-10X IOicVp的典型劑量。在此IO8Vp的低劑量時(shí)，最初的8個(gè)志愿者中局部和全身安全性都是優(yōu)秀的。這些個(gè)體中有四 個(gè)接受了 2X IO8Pfu劑量的編碼ME-TRAP的MVA的加強(qiáng)免疫接種。在圖9中顯示了作為平 均應(yīng)答的這四個(gè)志愿者中T細(xì)胞免疫原性的時(shí)程。通過離體Y-干擾素ELISPOT測(cè)定了對(duì) 與疫苗插入物重疊的15聚體肽庫即T9/96TRAP 15聚體以及對(duì)具有20聚體肽重疊的相同 序列即T9/96TRAP 20聚體的免疫原性。還顯示了對(duì)代表異源惡性瘧原蟲的20聚體肽即 3D7TRAP 20聚體的應(yīng)答。最后，ME顯示了對(duì)ME多表位串中主要九聚物瘧疾肽表位的短串 的應(yīng)答(Gilbert 等，Nature Biotechnol. 1997Nov ；15 1280-4)。這些結(jié)果顯示，即使在所用的非常低的劑量下，在人體中用AdCh63ME-TRAP單次 免疫接種4周后也觀察到可檢出的對(duì)TRAP的T細(xì)胞應(yīng)答。另外，這些應(yīng)答可通過MVA疫苗 強(qiáng)烈地加強(qiáng)，表明通過腺病毒載體在人體中引發(fā)記憶T細(xì)胞。本文引用的所有專利、專利申請(qǐng)和出版的參考文獻(xiàn)均 通過引用全文并入本文。盡 管已參考一些優(yōu)選實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了特別的展示和描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理 解，在不脫離權(quán)利要求所涵蓋的本發(fā)明范圍的情況下，可進(jìn)行形式和細(xì)節(jié)上的多種改變。參考文獻(xiàn)1 Snow, R. 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權(quán)利要求
一種重組復(fù)制缺陷型猿腺病毒載體，其編碼包含血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白(TRAP)或其至少一個(gè)T細(xì)胞表位的抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的猿腺病毒載體，其包含其中穩(wěn)定整合了編碼至少一個(gè)與調(diào)節(jié)序列 有效連接之抗原的轉(zhuǎn)基因的猿腺病毒基因組，所述調(diào)節(jié)序列指導(dǎo)所述轉(zhuǎn)基因在哺乳動(dòng)物細(xì) 胞中表達(dá)，其中所述抗原包含血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白(TRAP)或其至少一個(gè)T細(xì)胞表 位。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的猿腺病毒載體，其中所述猿腺病毒基因組是黑猩猩腺病毒載體的 基因組。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的猿腺病毒載體，其中所述猿腺病毒基因組是黑猩猩腺病毒分離株 63 (AdCh63)、AdCh68 (AdC9)、AdC3、AdC6 或 AdC7 的基因組。
5.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的猿腺病毒載體，其中所述抗原包含ME.TRAP或由其組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求2至5中任一項(xiàng)的猿腺病毒載體，其中指導(dǎo)所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)序 列包含CMV啟動(dòng)子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的猿腺病毒載體，其中所述調(diào)節(jié)序列包含HCMVIEl基因的啟動(dòng)子和 包括內(nèi)含子A在內(nèi)的HCMV IEl基因的5'非翻譯區(qū)的片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的猿腺病毒載體，其包含包裝在感染性病毒顆粒中的 猿腺病毒基因組。
9.一種免疫原性組合物，其包含與一種或多種可藥用賦形劑、載體、稀釋劑或佐劑相混 合的根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的猿腺病毒載體。
10.一種疫苗組合物，其包含與一種或多種可藥用賦形劑、載體、稀釋劑或佐劑相混合 的根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的猿腺病毒載體。
11.一種在人對(duì)象中引發(fā)抗血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白(TRAP)的免疫應(yīng)答的方法， 其包括給所述對(duì)象施用足以在所述對(duì)象中引發(fā)抗TRAP之免疫應(yīng)答的量的權(quán)利要求9的免 疫原性組合物或權(quán)利要求10的疫苗組合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述免疫原性組合物或疫苗組合物以足以引發(fā)抗 TRAP的T細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答的量施用。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的方法，其中所述免疫原性組合物或疫苗組合物作為單劑免 疫接種施用。
14.一種在人對(duì)象中引發(fā)抗血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白(TRAP)的免疫應(yīng)答的方法， 其包括i)給所述對(duì)象施用引發(fā)劑量的權(quán)利要求9的免疫原性組合物或權(quán)利要求10的疫苗組 合物；和 )給同一對(duì)象施用加強(qiáng)劑量的包含非腺病毒載體的免疫原性或疫苗組合物，所述非 腺病毒載體編碼含有血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白(TRAP)的抗原，其中所述加強(qiáng)劑量在 所述弓I發(fā)劑量至少兩周后施用，由此在所述對(duì)象中引發(fā)抗TRAP的免疫應(yīng)答。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述加強(qiáng)劑量在所述加強(qiáng)劑量8周后施用。
16.根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟ii)中施用的非腺病毒載體是重組痘病毒載體或質(zhì)粒DNA載體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述重組痘病毒載體是經(jīng)修飾安卡拉痘苗病毒 (MVA) ο
18.一種產(chǎn)品組合或藥盒，其包含i)含有重組復(fù)制缺陷型猿腺病毒載體的引發(fā)組合物，所述腺病毒載體編碼包含血小板 反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白(TRAP)或其至少一個(gè)T細(xì)胞表位的抗原；和 )含有非腺病毒載體的加強(qiáng)組合物，其中所述非腺病毒載體也編碼包含血小板反應(yīng) 蛋白相關(guān)粘附蛋白(TRAP)或其至少一個(gè)T細(xì)胞表位的抗原。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的產(chǎn)品組合或藥盒，其中所述猿腺病毒載體包含其中穩(wěn)定整合 了編碼至少一個(gè)與調(diào)節(jié)序列有效連接之抗原的轉(zhuǎn)基因的猿腺病毒基因組，所述調(diào)節(jié)序列指 導(dǎo)所述轉(zhuǎn)基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，其中所述抗原包含血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白 (TRAP)或其至少一個(gè)T細(xì)胞表位。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的產(chǎn)品組合或藥盒，其中所述引發(fā)組合物和所述加強(qiáng)組合物 都編碼包含血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白(TRAP)或其至少一個(gè)T細(xì)胞表位的相同抗原。
21.根據(jù)權(quán)利要求18-20中任一項(xiàng)的產(chǎn)品組合或藥盒，其中所述引發(fā)組合物和所述加 強(qiáng)組合物都編碼ME. TRAP。
22.—種用作疫苗的重組復(fù)制缺陷型猿腺病毒載體，其編碼包含血小板反應(yīng)蛋白相關(guān) 粘附蛋白(TRAP)或其至少一個(gè)T細(xì)胞表位的抗原.
23.根據(jù)權(quán)利要求22的用作疫苗的猿腺病毒載體，其中所述載體包含其中穩(wěn)定整合 了編碼至少一個(gè)與調(diào)節(jié)序列有效連接之抗原的轉(zhuǎn)基因的猿腺病毒基因組，所述調(diào)節(jié)序列指 導(dǎo)所述轉(zhuǎn)基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，其中所述抗原包含血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白 (TRAP)或其至少一個(gè)T細(xì)胞表位。
24.編碼包含血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白(TRAP)或其至少一個(gè)T細(xì)胞表位之抗原的 重組復(fù)制缺陷型猿腺病毒載體在制備用于引發(fā)人對(duì)象中針對(duì)血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋 白(TRAP)的免疫應(yīng)答的藥物中的用途。
25.編碼包含血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白(TRAP)或其至少一個(gè)T細(xì)胞表位之抗原的 重組復(fù)制缺陷型猿腺病毒載體在制備用作抗瘧疾疫苗的藥物中的用途。
26.根據(jù)權(quán)利要求24或25的用途，其中所述猿腺病毒載體包含其中穩(wěn)定整合了編碼至 少一個(gè)與調(diào)節(jié)序列有效連接之抗原的轉(zhuǎn)基因的猿腺病毒基因組，所述調(diào)節(jié)序列指導(dǎo)所述轉(zhuǎn) 基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，其中所述抗原包含血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白(TRAP)或 其至少一個(gè)T細(xì)胞表位。
全文摘要
本發(fā)明提供了能夠引發(fā)抗瘧原蟲生活周期中紅細(xì)胞前期的免疫應(yīng)答的重組腺病毒載體。特別地，本發(fā)明提供了一種編碼包含血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)粘附蛋白(TRAP)之抗原的重組復(fù)制缺陷型猿腺病毒載體，并且還提供了包含所述載體的免疫原性組合物(例如疫苗)以及使用這種組合物的方法。
文檔編號(hào)C12N15/861GK101848729SQ200880019586
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2008年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月10日
發(fā)明者斯特凡諾·科洛卡, 杰拉爾丁·奧哈拉, 里卡爾多·科爾泰塞, 阿圖羅·雷耶斯, 阿德里安·伊爾 申請(qǐng)人:Isis創(chuàng)新有限公司;歐卡羅斯有限公司