專利名稱：：金黃色藻類及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及富含類胡蘿卜素的藻類和藻類生物質(zhì)的制備。
背景技術(shù)：
：藻類是簡(jiǎn)單的類似植物的活生物體。它們是單細(xì)胞或多細(xì)胞的活生物體。藻類是從自然界發(fā)現(xiàn)的，并被分為了不同的類別，其被發(fā)現(xiàn)具有多種顏色和形態(tài)。由于藻類具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，加上食品來(lái)源的減少，人口不斷增加以及農(nóng)業(yè)用地的減少，藻類被認(rèn)為是未來(lái)潛在的食品。除了包含營(yíng)養(yǎng)成分之外，藻類，特別是微藻類還被視為具有治療、化學(xué)預(yù)防性質(zhì)和工業(yè)用途的有用添加劑、其他化合物和色素的主要來(lái)源。類胡蘿卜素是具有下述一系列用途的這樣一類色素，包括用于保健食品、化妝品、禽、畜、魚(yú)和甲殼類的飼料添加劑、藥學(xué)上的治療及化學(xué)預(yù)防補(bǔ)充劑，其也在不同行業(yè)中被用作著色劑。營(yíng)養(yǎng)食品的興起也已加大了對(duì)混合性類胡蘿卜素的需求，這主要是由于其具有業(yè)已得到證明的抗氧化和治療特性。近期發(fā)現(xiàn)的這樣或那樣的健康益處進(jìn)一步加深了類胡蘿卜素的市場(chǎng)潛力。不遠(yuǎn)的將來(lái)，類胡蘿卜素在世界范圍內(nèi)市場(chǎng)價(jià)值的增長(zhǎng)預(yù)計(jì)會(huì)超過(guò)1000百萬(wàn)美元。消費(fèi)者對(duì)天然產(chǎn)品的需求促進(jìn)了從生物資源中獲得類胡蘿卜素，而不是通過(guò)容易導(dǎo)致毒性問(wèn)題的合成途徑獲得。許多研究表明，天然混合的類胡蘿卜素比單一的類胡蘿卜素具有更好的協(xié)同效果，并能提供更好的抗氧化保護(hù)。這就使得人們更有興趣獲得天然混合的類胡蘿卜素，而不是單一的類胡蘿卜素部分。天然混合的類胡蘿卜素可以從包括植物原料或微藻類的生物資源中獲得。但是，植物中類胡蘿卜素合成的生產(chǎn)率和百分比都相對(duì)較低，因此由植物來(lái)生產(chǎn)類胡蘿卜素更加昂貴。一些微藻，包括藍(lán)綠藻，被發(fā)現(xiàn)含有類胡蘿卜素，且人們?cè)絹?lái)越有興趣去開(kāi)發(fā)它們來(lái)生產(chǎn)天然混合的類胡蘿卜素。螺旋藻(Spirulina)是屬于分裂藍(lán)藻菌(門)的一種基本形態(tài)的原核藍(lán)綠微藻。螺旋藻屬是光合的，呈絲狀、棒狀或螺旋形。其中最重要的屬是極大螺旋藻(Spirulinamaxima)、梭狀螺旋藻(Spirulinafusiformis)、太平洋螺旋藻(Spirulinapacifica)、鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)等。螺旋藻是具有多種生物活性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的天然生物活性和營(yíng)養(yǎng)成分的重要來(lái)源。最近的研究還表明，螺旋藻的抗氧化和免疫刺激活性歸因于其混合性類胡蘿卜素和多糖部分。螺旋藻的化學(xué)組成包括每IOOgm中有55000-72000mg蛋白質(zhì)，每IOOgm中有15000-25000mg碳水化合物，每IOOgm中有6000_8000mg脂肪(脂質(zhì))，以及每IOOgm中有350-650mg維生素，每IOOgm中有5000_7000mg礦物質(zhì)，每IOOgm中有370mg類似天然混合的類胡蘿卜素的色素，每IOOgm中有IOOOmg葉綠素a和每IOOgm中有14000mg藻青蛋白。據(jù)報(bào)道螺旋藻的天然混合性類胡蘿卜素部分由胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)(zeaxanthene)、海膽酮、β-隱黃質(zhì)(beta-cryptoxanthene)、羥基海膽酮、以及其他類胡蘿卜素組成。盡管由于其能最終應(yīng)用于食品和飼料補(bǔ)充劑，營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品和化妝品，因而在世界范圍內(nèi)對(duì)培育的螺旋藻的需求正不斷增長(zhǎng)，但是，其強(qiáng)烈的藍(lán)_綠色和其他感官特性，如味道和風(fēng)味都還不能令人滿意，這限制了它的主要商業(yè)應(yīng)用。已經(jīng)存在一些培養(yǎng)方案，提出的這些方案是為了生產(chǎn)傳統(tǒng)可得的螺旋藻。CN121883涉及藍(lán)綠藻的生長(zhǎng)和繁殖。其公開(kāi)了一種在螺旋藻培養(yǎng)中調(diào)節(jié)并控制碳源和PH值的方法。將NaHCO3或二氧化碳加入到培養(yǎng)基中以精確控制pH，從而促進(jìn)藍(lán)綠藻的生長(zhǎng)和繁殖。CN1254012涉及在含有NaHCO3的無(wú)機(jī)化合物中培養(yǎng)新鮮的可食用螺旋藻，無(wú)機(jī)化合物的PH達(dá)到8-11，且水溫達(dá)到25-40°C。R0117388公開(kāi)了一種鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)的變種，其通過(guò)連續(xù)流體培養(yǎng)生成，培養(yǎng)基含有NaHC03、NaNO3和其他無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物。JP1037281公開(kāi)了一種海洋藍(lán)綠藻(marineblue-greenalgae)的培養(yǎng)方法，其步驟包括以特定劑量向培養(yǎng)液中添加縮聚磷酸鹽，離解出足夠多的鐵離子，和保持溶解狀態(tài)以促進(jìn)其生長(zhǎng)。如上所述，加入Na2CO3,NaHCO3,NaH2PO4和其他無(wú)機(jī)鹽作為營(yíng)養(yǎng)物。加入pH調(diào)節(jié)劑或緩沖液以獲得期望的適于藻類生長(zhǎng)的PH值。AU2004322412公開(kāi)了螺旋藻在pH為6.5和8.0下產(chǎn)生生物質(zhì)的方法，其以海水基培養(yǎng)基計(jì)，有1.2至3.0%w/v范圍內(nèi)的碳酸氫鈉，0.1至0.3%w/v范圍內(nèi)的含氮量，0.1至0.3%w/v范圍內(nèi)的磷和0.1至0.3%w/v范圍內(nèi)的鉀。上述的專利文獻(xiàn)僅僅披露了引入的營(yíng)養(yǎng)物以及獲得高生物質(zhì)的螺旋藻的步驟。還有人嘗試提出了一些方案來(lái)選擇性增加一些營(yíng)養(yǎng)成分，如鐵，硒，鍺(germanium)或其它。CNl144844涉及用含鐵甲硫氨酸制造富鐵螺旋藻。CN1092104公開(kāi)了在二氧化鍺和亞硒酸鈉中培養(yǎng)螺旋藻來(lái)生產(chǎn)含有鍺和硒的螺旋藻。然而，迄今為止仍然沒(méi)有任何成功的嘗試能培養(yǎng)出其中天然混合類胡蘿卜素的含量被提高到非常高的螺旋藻或其他包括藍(lán)綠藻的微藻。此外，人們也沒(méi)有有花大力氣專注于生產(chǎn)具有令人滿意的可視外觀和改善的感官品質(zhì)的螺旋藻。因此，仍存在迫切的需求來(lái)培養(yǎng)具有更高天然混合類胡蘿卜素含量、具有令人滿意的可視外觀和感官特性的微藻，包括螺旋藻和其他藍(lán)綠藻。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種培養(yǎng)富含類胡蘿卜素和生物質(zhì)的藻類的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供富含類胡蘿卜素和碳水化合物的藻類生物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明中的一個(gè)實(shí)施方案，其提供了一種培養(yǎng)富含類胡蘿卜素的金黃色藻類的方法，包括如下步驟在含有低碳濃度和中氮濃度培養(yǎng)基中初始培養(yǎng)藻5至7天。隨后提高碳濃度并降低氮濃度，再培養(yǎng)藻5至7天。在提高了碳源濃度之后，定時(shí)用高碳有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物補(bǔ)充培養(yǎng)基。之后收獲培養(yǎng)物獲得呈金黃色的富含類胡蘿卜素的藻。培養(yǎng)使用的藻選自藍(lán)綠藻中的任意種類。在培養(yǎng)過(guò)程中改變培養(yǎng)基中碳氮含量的比例，并定時(shí)用檸檬酸鹽和醋酸鹽化合物補(bǔ)充培養(yǎng)基，以提高類胡蘿卜素產(chǎn)量并使藍(lán)綠藻的顏色變?yōu)榻瘘S色。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了一種富含類胡蘿卜素的金黃色藻類，其是通過(guò)下述步驟培養(yǎng)出的在含有低碳高氮的培養(yǎng)基中初始培養(yǎng)所述藻5至7天。隨后提高碳濃度并降低氮濃度，再培養(yǎng)藻5至7天。在提高了碳源濃度之后，定時(shí)用高碳有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物補(bǔ)充培養(yǎng)基。然后收獲培養(yǎng)物，獲得富含類胡蘿卜素的金黃色藻類，其中所述藻類的類胡蘿卜含量為每IOOgm的干細(xì)胞物質(zhì)中含有至少600mg。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，獲得的藻在每IOOgm的干細(xì)胞物質(zhì)中含有600mg至1200mg。本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案提供了一種生產(chǎn)富含類胡蘿卜素的藻類生物質(zhì)的方法，包括的步驟有在含有低碳濃度和中氮濃度的培養(yǎng)基中初始培養(yǎng)藻5至7天。隨后提高碳濃度并降低氮濃度，再培養(yǎng)藻5至7天。在提高碳源濃度之后，定時(shí)用高碳有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物補(bǔ)充培養(yǎng)基。然后收獲培養(yǎng)物，獲得富含類胡蘿卜素的藻類生物質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案提供了一種富含類胡蘿卜素的藻類生物質(zhì)，其是通過(guò)下述方法制得的在含有低碳濃度和中氮濃度的培養(yǎng)基中初始培養(yǎng)藻5至7天。隨后提高碳濃度并降低氮濃度，再培養(yǎng)藻5至7天。在提高碳源濃度之后，定時(shí)用高碳有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物補(bǔ)充培養(yǎng)基。然后收獲培養(yǎng)物，獲得富含類胡蘿卜素的藻類生物質(zhì)，其中所述生物質(zhì)中的類胡蘿卜素含量為每IOOgm的干細(xì)胞物質(zhì)中含有至少600mg。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，獲得的藻類生物質(zhì)在每IOOgm的干細(xì)胞物質(zhì)中含有600mg至1200mg。在本發(fā)明中，其中使用的術(shù)語(yǔ)“低碳中氮培養(yǎng)基”是指液態(tài)或半固態(tài)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，其包括濃度為0.1至0.15g/L的碳源；以及濃度為0.06至0.35g/L的氮源和其他營(yíng)養(yǎng)成分。圖1表示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中的方法生產(chǎn)的金黃色藻類。具體實(shí)施例方式盡管在本文中已經(jīng)描述了本發(fā)明的各種示例性的具體實(shí)施方案，但是不脫離本發(fā)明主旨和范圍的各種實(shí)施方案的改良、改進(jìn)及其組合以及修改和變形對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案提供了一種培養(yǎng)富含類胡蘿卜素的金黃色藻類的方法，其包括的步驟有在含有0.1至0.15g/L的碳源和0.06至0.35g/L的氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)藻類5至7天，或培養(yǎng)到藻長(zhǎng)成淡黃色。這使得藻的生長(zhǎng)達(dá)到期望水平。葉綠素和藻青蛋白的濃度降低。在低碳中氮培養(yǎng)基中初始培養(yǎng)藻之后，將培養(yǎng)基中的碳源濃度提高到0.2至1.5g/L，同時(shí)將氮源濃度降低到0.005至0.03g/L。然后再讓藻培養(yǎng)物生長(zhǎng)5至7天。在此期間，定時(shí)用檸檬酸鹽或醋酸鹽化合物或其組合形式的高碳有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物補(bǔ)充培養(yǎng)基，以增強(qiáng)類胡蘿卜素的產(chǎn)生并增加生物質(zhì)。在12至15天之后，收獲藻培養(yǎng)物，獲得藻類生物質(zhì)形式的富含類胡蘿卜素的金黃色藻類。本發(fā)明中的富含類胡蘿卜素的金黃色藻類可以通過(guò)培養(yǎng)任何藻獲得，只要其可以產(chǎn)生類胡蘿卜素即可。優(yōu)選，本發(fā)明中的富含類胡蘿卜素的金黃色藻類是通過(guò)培養(yǎng)藍(lán)綠藻，如顫藻、螺旋藻、念珠藻、席藻、水華束絲藻(Aphinozemanon-flos-aquae)和魚(yú)腥藻而獲得的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用的藻選自螺旋藻屬。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用的螺旋藻是鈍頂螺旋藻。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在培養(yǎng)過(guò)程中改變培養(yǎng)基中碳氮含量的比例，并用高碳有機(jī)化合物定時(shí)補(bǔ)充培養(yǎng)基，類胡蘿卜素的產(chǎn)量提高了2至3倍。其還使葉綠素和藻青蛋白的水平降低，并使藍(lán)綠藻的顏色變?yōu)榻瘘S色。能夠在本發(fā)明中使用來(lái)生產(chǎn)富含類胡蘿卜素的藻的藍(lán)綠藻在自然界中是顯微可見(jiàn)的，屬于藍(lán)藻門。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的顯微可見(jiàn)的藍(lán)綠藻可以選自屬于但不限于螺旋藻屬(節(jié)選藻屬)、顫藻屬、念珠藻屬、席藻屬、水華束絲藻和魚(yú)腥藻屬的藻類。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，按照本發(fā)明生產(chǎn)的富含類胡蘿卜素的藻是螺旋藻。根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的螺旋藻可以選自下述的螺旋藻種鈍頂螺旋藻、極大螺旋藻、梭狀螺旋藻、太平洋螺旋藻、S.indica.S.massartii、方胞螺旋藻和鹽澤螺旋藻。優(yōu)選本發(fā)明中培養(yǎng)的富含類胡蘿卜素的螺旋藻是鈍頂螺旋藻。菌種是通過(guò)下述步驟獲得的從天然環(huán)境或貯藏處或種子銀行機(jī)構(gòu)獲得期望的藍(lán)綠藻菌種，并在適當(dāng)?shù)幕A(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上在最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng)所述的藻，獲得用于本發(fā)明中的培養(yǎng)方法的期望的生物質(zhì)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，菌種由螺旋藻屬的鈍頂螺旋藻制得。所述藻的培養(yǎng)是在250mL培養(yǎng)容器中，pH范圍為約8.60-10.60下，在連續(xù)稀釋50%濃度的傳統(tǒng)Zarrouk's培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其中含或不含1.5%瓊脂，光強(qiáng)度為02-10K1UX的光照和黑暗段各12小時(shí)，并且每隔2小時(shí)攪動(dòng)一次來(lái)提高光合效率并加速藻的培養(yǎng)生長(zhǎng)。菌種轉(zhuǎn)入大規(guī)模生產(chǎn)藍(lán)綠色藻的常規(guī)培養(yǎng)基中。分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的碳和氮的濃度為0.1-0.15g/L和0.06-0.35g/L，藻在其中生產(chǎn)5_7天，直至藻開(kāi)始變成黃色，其對(duì)于大規(guī)模培養(yǎng)藻的專業(yè)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，培養(yǎng)基可以在淡水或鹽水中制備。5-7天后，分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的碳和氮的濃度為0.2-1.5g/L和0.005-0.03g/L，然后再培養(yǎng)藻5-7天。在這期間，采用高碳有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物定時(shí)補(bǔ)入培養(yǎng)基中，有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為檸檬酸鹽或醋酸鹽化合物或它們的組合，以提高藻細(xì)胞中生物質(zhì)和類胡蘿卜素的產(chǎn)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，采用選自檸檬酸鐵或檸檬酸鈉的檸檬酸鹽化合物來(lái)補(bǔ)入培養(yǎng)基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，采用選自醋酸鉀或醋酸鈉的醋酸鹽化合物來(lái)補(bǔ)入培養(yǎng)基。本發(fā)明中采用的檸檬酸鹽和醋酸鹽化合物的濃度如表1所示表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本發(fā)明對(duì)于用來(lái)生產(chǎn)富含類胡蘿卜素的藻的培養(yǎng)體系沒(méi)有特殊的限制，只要培養(yǎng)體系可以支持藻的生長(zhǎng)和光合效率即可。小型的培養(yǎng)體系包括試管，瓶子，燒瓶，大玻璃瓶，桶，盆，罐，各式生物反應(yīng)器，或開(kāi)放，或溫室，或玻璃房子，水池的水道，生產(chǎn)范圍從50mL到IOOOL0大型的培養(yǎng)體系可以選自開(kāi)放或密閉的圓筒形容器，罐，各式生物反應(yīng)器，或開(kāi)放，或溫室，或玻璃房子，水池的水道。上述培養(yǎng)體系可以裝備有通風(fēng)、攪拌、照明和溫控裝置。培養(yǎng)基進(jìn)一步含有營(yíng)養(yǎng)成分，選自但不限于，磷酸氫二鉀，硫酸鉀，硫酸鎂，氯化鈣，硫酸亞鐵，如Mn，Zn,Co,Cu,Mo的A5元素，氯化鈉等，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所熟知這些成分可能是藻類生長(zhǎng)可能需要的。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，表2示出了含低碳量和中氮量的培養(yǎng)基表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本發(fā)明的培養(yǎng)基可以采用淡水或海水或它們的組合來(lái)制備。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，用于本發(fā)明的碳源選自碳酸鈉或碳酸氫鈉或它們的組合。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，用于本發(fā)明的氮源選自硝酸鈉或硫酸銨。然而，其他可供藍(lán)綠色藻生長(zhǎng)的氮源也可用于本發(fā)明的目的。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，表3示出了含高碳量和低氮量的培養(yǎng)基表3<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，藻培養(yǎng)的溫度維持在6-36攝氏度的范圍內(nèi)。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，溫度優(yōu)選維持在26-30攝氏度的范圍內(nèi)。培養(yǎng)在約1-100千勒克斯的光照下進(jìn)行，優(yōu)選在40-60千勒克斯的范圍內(nèi)進(jìn)行。培養(yǎng)的ρΗ維持在7.8-10.8的范圍內(nèi)，優(yōu)選通過(guò)通CO2維持在9.2-9.6的范圍內(nèi)。為了釋放產(chǎn)生的氧氣，促進(jìn)最佳的營(yíng)養(yǎng)吸收和在最佳光照下培養(yǎng)，在培養(yǎng)時(shí)人工或機(jī)械地以5rpm或以上攪拌，優(yōu)選以12-16rpm攪拌。為了對(duì)藻類生物質(zhì)的生長(zhǎng)有積極的影響以獲得更高產(chǎn)量的類胡蘿卜素，保持培養(yǎng)體系的深度在5cm或以上，優(yōu)選在12-16cm。本方法可以以分批的方式進(jìn)行，或以連續(xù)的方式進(jìn)行，其是通過(guò)重復(fù)上述的培養(yǎng)方案，即在低碳中氮含量培養(yǎng)基中培養(yǎng)，續(xù)以添加高碳低氮含量的培養(yǎng)基，并且進(jìn)一步定時(shí)補(bǔ)入檸檬酸鹽和醋酸鹽化合物。富含類胡蘿卜素的藻可以任意常規(guī)的方法收集，優(yōu)選通過(guò)100-150目的尼龍篩或布收集。收集的富含類胡蘿卜素的螺旋藻類生物質(zhì)的PH在9.6到10.8之間。為了降低富含類胡蘿卜素的藻的PH，采用足夠的水清洗生物質(zhì)，優(yōu)選采用酸性水來(lái)洗去附著的鹽并使PH為中性或約為7.O。根據(jù)最終用途，可以通過(guò)各種烘干濕生物質(zhì)的方法將藻轉(zhuǎn)化成干物質(zhì)形式，如曬干、噴霧干燥、烘干、轉(zhuǎn)鼓式干燥、熱風(fēng)干燥或冷凍干燥。由本發(fā)明得到的富含類胡蘿卜素的藻或生物質(zhì)，不論是濕物質(zhì)形式還是干物質(zhì)形式，都可以采用適當(dāng)?shù)牟煌腹狻夂退陌b材料優(yōu)選在真空或氮?dú)鈬婌F的條件下包裝起來(lái)，其可以在約4-28攝氏度的條件下保存。根據(jù)本發(fā)明獲得的藻每IOOgm干細(xì)胞物質(zhì)含有至少600mg的混合性類胡蘿卜素或更多。本發(fā)明的富含類胡蘿卜素的藻除了增加了混合性類胡蘿卜素的含量水平外，在碳水化合物含量方面也有顯著的增加，每IOOgm的干細(xì)胞物質(zhì)含40000-60000mg。根據(jù)本發(fā)明的方法培養(yǎng)出的藻的混合性類胡蘿卜素的含量水平是自然生長(zhǎng)或常規(guī)培養(yǎng)的藻的2-3倍，是天然的混合性類胡蘿卜素的有效來(lái)源。與自然生長(zhǎng)或常規(guī)培養(yǎng)的藍(lán)綠色藻的無(wú)吸引力的形態(tài)和感官特征相比較，藻的葉綠素和藻青蛋白的含量水平的減少改善了視覺(jué)上的形態(tài)和感官特征。因而，可以擴(kuò)展其在食品和飼料添加劑，保健營(yíng)養(yǎng)品，化妝品和其他工業(yè)產(chǎn)品方面的應(yīng)用。盡管在本文中已經(jīng)描述了本發(fā)明的各種示例性的實(shí)施方案，但是不脫離本發(fā)明主旨和范圍的各種實(shí)施例的改良、改進(jìn)及其組合以及修改和變形對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。實(shí)施例實(shí)施例1富含類胡蘿卜素的金黃色鈍頂螺旋藻為了獲得富含類胡蘿卜素的鈍頂螺旋藻，使用制備好的菌種。菌種的制備是在無(wú)菌條件下，將鈍頂螺旋藻藻絲在含0.75-1.5%瓊脂、pH9.5的50%濃度的Zarrouk's的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)的光管理是12:12小時(shí)的黑暗和2-10千勒克斯光強(qiáng)的光照，培養(yǎng)溫度是28-32°C。這樣獲得的菌種進(jìn)一步在50%濃度的Zarrouk's培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其初始PH9-9.5，12小時(shí)的光強(qiáng)2-lOKlux的光照階段和12小時(shí)的黑暗階段，并且不斷地?cái)嚢枰跃鶆蚧旌吓囵B(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分，以便獲得更好的光合效率和獲得充分成長(zhǎng)的菌種。上述的螺旋藻用做本發(fā)明的菌種。20L的鈍頂螺旋藻菌種在一個(gè)深12-16cm的2X2的水池中持續(xù)生長(zhǎng)5-7天，其中含有如下所示成分的低碳中氮含量的培養(yǎng)基<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>低碳中氮培養(yǎng)基每隔約2-3天補(bǔ)入一次。生長(zhǎng)允許的培養(yǎng)條件為溫度26_36°C，光強(qiáng)10-80千勒克斯，在照明期間每隔約1-2小時(shí)有規(guī)律的攪拌。在所述5-7天的培養(yǎng)周期的最后，螺旋藻藻絲出現(xiàn)長(zhǎng)的、半漂浮的可見(jiàn)的粘液分泌物，呈帶有深黃色的暗褐綠色。接著增加碳和氮的濃度以使鈍頂螺旋藻在含有以下成分的高炭低氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)生長(zhǎng)約5-7天<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>培養(yǎng)基的溫度維持在16-36攝氏度。培養(yǎng)在Ι-lOOKlux光強(qiáng)下進(jìn)行。在高碳低氮培養(yǎng)基中生長(zhǎng)完成后，鈍頂螺旋藻藻絲出現(xiàn)長(zhǎng)的、幾乎不漂浮的可見(jiàn)的粘液分泌物，并且為金黃色。上述螺旋藻培養(yǎng)進(jìn)一步定時(shí)補(bǔ)入如下所示的檸檬酸鹽和醋酸鹽化合物<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>通入氣泡形式的5%含量水平的CO2氣體來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)的pH。溫度維持在16_36°C。光強(qiáng)為10-80K1UX。藻培養(yǎng)需要經(jīng)常攪拌。螺旋藻藻絲出現(xiàn)長(zhǎng)的，幾乎不漂浮的粘液分泌物。藻培養(yǎng)物為深金黃色。獲得的富含類胡蘿卜素的金黃色螺旋藻的生物質(zhì)約為0.75g/L。螺旋藻每IOOgm干細(xì)胞物質(zhì)含有880mg的天然混合性類胡蘿卜素。富含類胡蘿卜素的金黃色螺旋藻除增加了混合性類胡蘿卜素的含量水平外，在碳水化合物含量方面也表現(xiàn)出顯著的增加，每IOOgm干細(xì)胞物質(zhì)含43600mg。權(quán)利要求一種培養(yǎng)富含類胡蘿卜素的金黃色藻類的方法，包括以下步驟a.在含0.1-0.15g/L碳源和0.06-0.35g/L氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)藻5-7天；b.完成步驟(a)后將培養(yǎng)基中的碳源濃度增加到0.2-1.5g/L，氮源濃度減少到0.005-0.03g/L，再培養(yǎng)藻5-7天；c.在步驟(b)中將高碳有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物定時(shí)補(bǔ)入培養(yǎng)基中；和d.步驟(c)后收集產(chǎn)生的藻。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中培養(yǎng)的藻選自螺旋藻屬(Spirulina)、顫藻屬(Oscillatoria)、念珠藻屬(Nostoc)、席藻屬(Phormidium)、水華束絲藻(Aphinoζemanon-f1οs-aquae)禾口魚(yú)月星藻屬(anabaena)。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中培養(yǎng)中所用的螺旋藻選自鈍頂螺旋藻(S.platensis)、極大螺旋藻(S.maxima)、梭狀螺旋藻(S.fusiformis)、太平洋螺旋藻(S.pacifica)、S.indica、S.massartii、方胞螺旋藻(S.jenneri)和鹽澤螺旋藻(S.subsala)。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中螺旋藻是鈍頂螺旋藻。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中碳源選自碳酸鈉、碳酸氫鈉或它們的組合。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中氮源選自硝酸鈉、硫酸銨或它們的組合。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中高碳有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物選自檸檬酸鹽化合物、醋酸鹽化合物或它們的組合。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中檸檬酸鹽化合物為5mg/L-10mg/L的檸檬酸鐵。9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中檸檬酸鹽化合物為5mg/L-10mg/L的檸檬酸鈉。10.如權(quán)利要求7所述的方法，其中醋酸鹽化合物為75mg/L-250mg/L的醋酸鉀。11.如權(quán)利要求7所述的方法，其中醋酸鹽化合物為75mg/L-250mg/L的醋酸鈉。12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中培養(yǎng)基進(jìn)一步包括磷酸氫二鉀、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸亞鐵、A5元素Mn、Zn、Co、Cu、Mo的鹽和氯化鈉。13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(a)、(b)和(c)在6-36°C的溫度下實(shí)施。14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(a)、(b)和(c)在Ι-lOOKlux的光強(qiáng)度下實(shí)施。15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(a)、(b)和(c)在pH8.2-10.8的條件下實(shí)施。16.如權(quán)利要求1所述的方法，其中培養(yǎng)基的深度至少為5cm。17.采用權(quán)利要求1-16所述的方法產(chǎn)生的富含類胡蘿卜素的金黃色藻類，其中所述藻含有至少600mg/gm的干細(xì)胞物質(zhì)的混合性類胡蘿卜素。18.如權(quán)利要求17所述的富含類胡蘿卜素的金黃色藻類，其中所述藻的每IOOgm干細(xì)胞物質(zhì)中含有600mg-1200mg混合性類胡蘿卜素。19.如權(quán)利要求17所述的富含類胡蘿卜素的金黃色藻類，其每IOOgm的干細(xì)胞物質(zhì)還含有40000-60000mg碳水化合物。20.如權(quán)利要求17所述的富含類胡蘿卜素的金黃色藻類，其中藻培養(yǎng)自能產(chǎn)生混合性類胡蘿卜素的藻。21.如權(quán)利要求17所述的富含類胡蘿卜素的金黃色藻類，其中藻由選自螺旋藻屬、顫藻屬、念珠藻屬、席藻屬、水華束絲藻和魚(yú)腥藻屬的藍(lán)綠藻培養(yǎng)得到。22.如權(quán)利要求21所述的富含類胡蘿卜素的金黃色藻類，其中選自螺旋藻屬的藻為鈍頂螺旋藻、極大螺旋藻、梭狀螺旋藻、太平洋螺旋藻、S.indica,S.massartii、方胞螺旋藻和鹽澤螺旋藻。23.如權(quán)利要求22所述的富含類胡蘿卜素的金黃色藻類，其中選自螺旋藻屬的藻優(yōu)選為鈍頂螺旋藻。24.一種生產(chǎn)富含類胡蘿卜素的藻類生物質(zhì)的方法，包括以下步驟a.在含0.1-0.15g/L碳源和0.06-0.35g/L氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)藻5_7天；b.完成步驟(a)后將培養(yǎng)基中的碳源濃度增加到0.2-1.5g/L，氮源濃度減少到0.005-0.03g/L,再培養(yǎng)藻5-7天；c.在步驟(b)中將高碳有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物定時(shí)補(bǔ)入培養(yǎng)基中；和d.步驟(c)后收集產(chǎn)生的藻類生物質(zhì)。25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中培養(yǎng)的藻選自螺旋藻屬、顫藻屬、念珠藻屬、席藻屬、水華束絲藻和魚(yú)腥藻屬。26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中培養(yǎng)中所用的螺旋藻選自鈍頂螺旋藻、極大螺旋藻、梭狀螺旋藻、太平洋螺旋藻、S.indica,S.massartii、方胞螺旋藻和鹽澤螺旋藻。27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中螺旋藻是鈍頂螺旋藻。28.如權(quán)利要求24所述的方法，其中碳源選自碳酸鈉、碳酸氫鈉或它們的組合。29.如權(quán)利要求24所述的方法，其中氮源選自硝酸鈉、硫酸銨或它們的組合。30.如權(quán)利要求24所述的方法，其中高碳有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物選自檸檬酸鹽化合物、醋酸鹽化合物或它們的組合。31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中檸檬酸鹽化合物為5mg/L-10mg/L的檸檬酸鐵。32.如權(quán)利要求30所述的方法，其中檸檬酸鹽化合物為5mg/L-10mg/L的檸檬酸鈉。33.如權(quán)利要求30所述的方法，其中醋酸鹽化合物為75mg/L-250mg/L的醋酸鉀。34.如權(quán)利要求30所述的方法，其中醋酸鹽化合物為75mg/L-250mg/L的醋酸鈉。35.如權(quán)利要求24所述的方法，其中培養(yǎng)基進(jìn)一步包括磷酸氫二鉀、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸亞鐵、A5元素Mn、Zn、Co、Cu、Mo的鹽和氯化鈉。36.如權(quán)利要求24所述的方法，其中步驟(a)、(b)和(c)在6_36°C的溫度下實(shí)施。37.如權(quán)利要求24所述的方法，其中步驟(a)、(b)和(c)在Ι-lOOKlux的光強(qiáng)度下實(shí)施。38.如權(quán)利要求24所述的方法，其中步驟(a)、(b)和(c)在pH8.2-10.8的條件下實(shí)施。39.如權(quán)利要求24所述的方法，其中培養(yǎng)基的深度至少為5cm。40.采用權(quán)利要求24-39所述的方法生產(chǎn)的富含類胡蘿卜素的藻類生物質(zhì)。41.如權(quán)利要求40所述的富含類胡蘿卜素的藻類生物質(zhì)，其中所述藻類生物質(zhì)每IOOgm干細(xì)胞物質(zhì)含有600mg-1200mg混合性類胡蘿卜素。42.如權(quán)利要求26所述的富含類胡蘿卜素的藻類生物質(zhì)，其每IOOgm的干細(xì)胞物質(zhì)還含有40000-60000mg的碳水化合物。43.如權(quán)利要求40所述的富含類胡蘿卜素的藻類生物質(zhì)，其中藻培養(yǎng)自能產(chǎn)生混合性類胡蘿卜素的藻。44.如權(quán)利要求40所述的富含類胡蘿卜素的藻類生物質(zhì)，其中藻由選自螺旋藻屬、顫藻屬、念珠藻屬、席藻屬、水華束絲藻和魚(yú)腥藻屬的藍(lán)綠藻培養(yǎng)得到。45.如權(quán)利要求44所述的富含類胡蘿卜素的藻類生物質(zhì)，其中選自螺旋藻屬的藻為鈍頂螺旋藻、極大螺旋藻、梭狀螺旋藻、太平洋螺旋藻、S.indica,S.massartii、方胞螺旋藻和鹽澤螺旋藻。46.如權(quán)利要求45所述的富含類胡蘿卜素的藻類生物質(zhì)，其中選自螺旋藻屬的藻優(yōu)選為鈍頂螺旋藻。全文摘要本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)富含類胡蘿卜素的金黃色藻類的方法，其通過(guò)在培養(yǎng)期間改變培養(yǎng)基的碳氮比，并且定時(shí)向培養(yǎng)基中補(bǔ)入檸檬酸鹽和醋酸鹽化合物來(lái)促進(jìn)類胡蘿卜素的產(chǎn)生，并使藍(lán)綠藻的顏色轉(zhuǎn)變?yōu)榻瘘S色。文檔編號(hào)C12N1/12GK101802167SQ200880020882公開(kāi)日2010年8月11日申請(qǐng)日期2008年6月17日優(yōu)先權(quán)日2007年6月18日發(fā)明者巴布羅·康伯·納格那斯申請(qǐng)人:查德哈利·韋迪