專利名稱：測定外部刺激對活細(xì)胞中生物通路影響的方法
測定外部刺激對活細(xì)胞中生物通路影響的方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明一般涉及系統(tǒng)生物學(xué)，更具體而言，涉及測定外部剌激對細(xì)胞傳導(dǎo)線路影
響的原位方法。
冃京fe息 如同任何其它復(fù)雜系統(tǒng)一樣，生物學(xué)系統(tǒng)依賴于組成子系統(tǒng)的許多組分的功能， 其中的每一個完成整個系統(tǒng)功能所需的具體過程。在多細(xì)胞生物中，所有細(xì)胞使用非常相 似的核心子系統(tǒng)集，其是維持每個細(xì)胞的完整性和基本功能所必需的。這些子系統(tǒng)主要在 于它們的活性水平不同，這取決于具體細(xì)胞類型必須完成什么特化功能。這些核心過程包 括使細(xì)胞適應(yīng)性地對應(yīng)激和損害應(yīng)答的功能。 多細(xì)胞生物通常從單個細(xì)胞發(fā)育而來。在從單個細(xì)胞發(fā)育的過程中，大量的細(xì)胞 彼此和與環(huán)境相互作用，以產(chǎn)生這樣一種有機體其中具體器官中的細(xì)胞完成對與它們相 關(guān)的組織類型(例如，心、肺、腦等)特異的特化活性類型。這些特化活性可以連續(xù)或間斷 地進(jìn)行。必須維持這些共同的以及組織特異性活性的混合的細(xì)胞必須在任何給定時間都非 常熟練地調(diào)節(jié)有活性的子系統(tǒng)集，以及非常熟練地使用可獲得的有關(guān)內(nèi)部和外部條件的信 息來決定需要子系統(tǒng)活性種類的哪種改變。還有，在復(fù)雜的人造系統(tǒng)和生物系統(tǒng)之間存在 驚人的相似。正如用于多種目的的人造裝置可以用非常少數(shù)的元件制造，使組合的成分相 互作用來以可選的方式起作用一樣，細(xì)胞僅僅通過改變細(xì)胞中存在的相互作用的成分的組 合來產(chǎn)生多種功能。 本質(zhì)上，所有生物學(xué)領(lǐng)域——其中有用的是，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞系統(tǒng)以這樣的方式來 改變它們的功能，所述方式能夠或提高子系統(tǒng)處理，允許系統(tǒng)在不同環(huán)境條件下運行或減 少疾病或寄生病——將獲益于對設(shè)計、表征和控制復(fù)雜人造系統(tǒng)的工程師而言可利用的工 具的生物學(xué)類似物。 對使細(xì)胞完成生命所必需的多種相關(guān)功能的細(xì)胞組分之間復(fù)雜相互作用的研究 通常稱為"系統(tǒng)生物學(xué)"。這是非常寬的術(shù)語，其涵蓋非常多樣化的主題和研究目的。將該 領(lǐng)域細(xì)分的一種方式是，考慮被研究的細(xì)胞系統(tǒng)中的水平、對研究所述水平在數(shù)據(jù)方面的 要求、以及這些研究通常的目標(biāo)種類。 系統(tǒng)生物學(xué)方法已經(jīng)用于研究代謝。這些方法要求非常詳細(xì)的下列知識詳細(xì)說 明催化酶的基因、這些基因的序列、催化反應(yīng)的小分子輸入物和排出物的生物化學(xué)特征、已 知的轉(zhuǎn)化速率和典型的代謝物水平、以及調(diào)節(jié)或細(xì)胞內(nèi)定位相互作用的知識，所述知識已 經(jīng)被獲得以產(chǎn)生在其中檢查生物中的新陳代謝的框架(構(gòu)架)，其中這種知識水平還沒有 發(fā)展形成。使用這些信息，可能模擬具有測序基因組的生物的可能的代謝網(wǎng)絡(luò)，推斷其它生 物的代謝網(wǎng)絡(luò)在新的生物上的功能和關(guān)系。盡管是非常有效的分析形式，但是對這些不同 種類的如此詳細(xì)的信息的要求嚴(yán)重限制了這種方法的應(yīng)用。相當(dāng)大小的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的其它組分沒有被表征到這種程度，這限制了這種方法對涉及新陳代謝問題的研究。
第二個研究領(lǐng)域——其對所需的數(shù)據(jù)類型的多樣性和對測量的定量精確性有較 少的苛刻要求——是多細(xì)胞生物從它們的單細(xì)胞起源如卵發(fā)育的領(lǐng)域。相對于新陳代謝， 該研究領(lǐng)域具有的優(yōu)勢是逐步的過程，具有可鑒定的中間體和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)展。取決于被研究的 生物的復(fù)雜性，在進(jìn)行每個具體步驟所需要的功能方面，可能很少有相當(dāng)可觀的的冗余，并 且基因可以在不同的組織中具有不同的作用，這使其成為更具挑戰(zhàn)性的分析。在目前的階 段，這項工作的大部分集中在非常大的挑戰(zhàn)，所述挑戰(zhàn)簡單地理解是什么分子過程涉及具 體說明描繪的過程、空間定位和獲得各種組織和身體部分的特化特征。 其它方法集中于基因表達(dá)的控制，著眼于每個基因啟動子中的序列元件，以及與 這些元件相互作用來允許或禁止基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。進(jìn)一步詳述顯示基因啟動子合理的 開關(guān)樣特性的工作，許多課題組已經(jīng)對如何修飾啟動子各種元件改變具體基因的轉(zhuǎn)錄特性 進(jìn)行了大量的實驗，完美地描述了這些元件串聯(lián)如何使轉(zhuǎn)錄因子在特定的時間和位置出現(xiàn) 在胚胎中，以詳細(xì)說明攜帶這些元件的基因中的特定轉(zhuǎn)錄程序。如在代謝的情況下，這種系 統(tǒng)研究包括實驗的巨大基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，以獲得啟動子元件和與啟動子元件相互作用的轉(zhuǎn)錄因子 的知識。 一旦可以得到這種知識，可以建立預(yù)測網(wǎng)絡(luò)上的具體擾動會如何影響網(wǎng)絡(luò)功能的 模型。這種預(yù)測的精確性受關(guān)于功能的重疊和冗余以及網(wǎng)絡(luò)運行中的其它代償機制的信息 有多完備的嚴(yán)重影響。
發(fā)明概述 本發(fā)明描述了在活細(xì)胞上實施實驗、測量轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程和分析產(chǎn)生的數(shù)據(jù)的方 法。該方法對于通過將生物通路分析與控制理論工程和數(shù)學(xué)分割分析結(jié)合來執(zhí)行細(xì)胞基因 組調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)活性中的程序性改變時，通過細(xì)胞基因組調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)來收集關(guān)于信息流的數(shù)據(jù)是 有用的。該方法還可以通過觀察細(xì)胞當(dāng)調(diào)節(jié)細(xì)胞過程活性時所做的決定，來收集細(xì)胞中信 息處理的結(jié)果數(shù)據(jù)。 在一個實施方式中，公開了測定細(xì)胞過程活性類型和水平的原位方法，包括在一 段時間內(nèi)每隔一定時間測定調(diào)節(jié)元件(例如，啟動子)的活性值和定位報道基因的分布值， 所述一段時間足以確定被監(jiān)測的細(xì)胞過程在培養(yǎng)條件下是否穩(wěn)定，所述培養(yǎng)條件用于由至 少一個載體轉(zhuǎn)化的至少一個非酵母真核細(xì)胞啟動子活性和定位報道基因的細(xì)胞分布。進(jìn)一 步，所述至少一個載體包括至少一個由可誘導(dǎo)的生物通路特異性啟動子組成的盒，其中所 述啟動子被可操作地連接到第一可檢測標(biāo)記物，以及至少一個由編碼第一細(xì)胞內(nèi)定位報道 基因的核酸序列組成的盒。而且，使轉(zhuǎn)化有載體的細(xì)胞經(jīng)受外部剌激，以及在暴露于剌激之 后在一段時間內(nèi)每隔一定時間反復(fù)測定啟動子活性值和定位報道基因分布值，所述一段時 間足以跟蹤由暴露于剌激所產(chǎn)生的細(xì)胞過程的逐步演化。因此，啟動子活性和/或報道基 因定位的改變可表示該剌激的內(nèi)源性生物通路調(diào)節(jié)。 在一方面，值的測定包括在一組轉(zhuǎn)化的非酵母細(xì)胞中確定啟動子的活性值和定位
報道基因的分布值，其中每個細(xì)胞含有不同的載體，所述載體包含單獨的和不同的通路特
異性啟動子。進(jìn)一步，組中不同的細(xì)胞對施加的剌激顯示單獨的和不同的應(yīng)答，其中每個剌
激引發(fā)的組中細(xì)胞的不同組成所產(chǎn)生的細(xì)胞過程的差異可以被分開和單獨分析。 在進(jìn)一步的方面，該方法包括使用觀察的已知生物化學(xué)通路的數(shù)據(jù)和人造網(wǎng)絡(luò)連通性和過程調(diào)節(jié)的模型數(shù)據(jù)來分析時間間隔，以模擬觀察的內(nèi)源性生物通路的過程和調(diào)節(jié) 管道之間的連接。這些連通性和過程調(diào)節(jié)包括但不限于，計算機網(wǎng)絡(luò)、通信系統(tǒng)/子系統(tǒng)、 統(tǒng)計過程控制以及工程過程控制。 在另一方面，該方法進(jìn)一步包括應(yīng)用狀態(tài)空間建模來限定控制策略，以證明由剌
激引發(fā)的細(xì)胞過程會導(dǎo)致擾動的細(xì)胞狀態(tài)或未擾動的細(xì)胞狀態(tài)的可能性的增加或減少。 在一方面，該方法包括確定測定終點，諸如細(xì)胞增殖、細(xì)胞衰老和細(xì)胞死亡。 在一方面，所述組包含大約10至200個細(xì)胞或更多個細(xì)胞。在另一方面，生物通
路是內(nèi)源性或外源性信號傳導(dǎo)通路，其包括但不限于，PI3K/Akt/mT0R通路。 在一方面，測定所述值通過圖像分析完成，其中所述圖像分析包括數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)分
割，諸如分水嶺法(watershedding)。 在相關(guān)方面，所述分割包括對組中的細(xì)胞進(jìn)行活體染色、定位來自活體染色和熒 光的分離的信號作為區(qū)域閾值二值圖像(regionally threshoded binary image)、組合 二值信號，以產(chǎn)生包含閾值二值圖像的第一合并圖像(merged image)、將標(biāo)記線(marker line)放置在由熒光信號產(chǎn)生的谷中的拐點處，以產(chǎn)生第二圖像、以及將第一合并圖像與第 二圖像組合。 在一個實施方式中，公開了數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)分割產(chǎn)生的模型。 附圖簡述

圖1說明規(guī)避腫瘤對EGFR通路機制依賴的逃逸途徑。 圖2顯示細(xì)胞中細(xì)胞核的熒光圖像。 圖3顯示通過基于分水嶺的分割而分離的細(xì)胞圖像。 圖4顯示通過將基于分水嶺的分割應(yīng)用于閾值結(jié)果而分離的細(xì)胞圖像，其中分割 的細(xì)胞核充當(dāng)細(xì)胞存在的標(biāo)記物。 圖5圖示說明HEK和HT29細(xì)胞中的各種啟動子的基于分水嶺分割和閾值結(jié)果作 為血清可利用的函數(shù)的應(yīng)用。虛線顯示不含啟動子對照中的eGFP熒光水平?；疑€顯示 在血清饑餓的細(xì)胞中的eGFP熒光水平。點線顯示在5%胎牛血清(FBS)中連續(xù)生長的細(xì)胞 的eGFP熒光水平。黑線顯示在加入FBS至最終濃度為20%前饑餓8小時的細(xì)胞中的eGFP 熒光水平。
發(fā)明詳述 在描述本組合物、方法和方法學(xué)之前，可以理解，本發(fā)明不限于所描述的具體組合 物、方法和實驗條件，這是因為這些組合物、方法和實驗條件可以變化。也可以理解，本文所 用的術(shù)語的目的僅僅是描述具體的實施方式，而不意圖進(jìn)行限制，因為本發(fā)明的范圍僅僅 被所附權(quán)利要求所限制。 如本說明書和所附權(quán)利要求書中所用，除非上下文另有明確說明，單數(shù)形式"一 (a)"、"一 (an)"和"該(the)"包括復(fù)數(shù)引用。因此，例如，提及"核酸(a nucleic acid)" 包括一種或多種核酸，和/或本文描述類型的組合物，這在本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀本公開等 后其將變得明顯。 除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與該發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所一般理解的相同的含義。類似或等同于本文所描述的那些的任何方法和材料都可 以用于本發(fā)明的實踐或測試，如同可理解的，修改和變化被包括在本公開的精神和范圍內(nèi)。
"載體"為復(fù)制子，諸如質(zhì)粒、噬菌體或黏粒，另一個DNA片段可以連接到該復(fù)制子， 以產(chǎn)生所連接的片段的復(fù)制。"載體"可以進(jìn)一步定義為可復(fù)制的核酸構(gòu)建物，例如，質(zhì)?；?br> 病毒核酸。 表達(dá)載體是可復(fù)制的構(gòu)建物，其中編碼多肽的核酸序列可操作地連接到適合的控 制序列，所述控制序列能夠影響細(xì)胞中多肽的表達(dá)。對這些控制序列的需要將取決于所選 擇的細(xì)胞和所選擇的轉(zhuǎn)化方法而變化。 一般而言，控制序列包括轉(zhuǎn)錄啟動子和/或增強子、 適合的mRNA核糖體結(jié)合位點和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方 法可以用于構(gòu)建包含適當(dāng)轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號的表達(dá)載體。參見，例如，在Sambrook等人， 1989， Molecular Cloning :ALaboratory Manual(2nd Ed.)， Cold Spring Harbor Press, N. Y中描述的技術(shù)。如果轉(zhuǎn)錄控制序列有效地控制基因的轉(zhuǎn)錄，則該基因及其轉(zhuǎn)錄控制序列 定義為"可操作地連接"。本發(fā)明的載體包括但不限于，質(zhì)粒載體和病毒載體。本發(fā)明的優(yōu)選 的病毒載體是源自反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、SV40病毒或皰疹病毒的那些。 一般而 言，表達(dá)載體包含啟動子序列，所述啟動子序列促進(jìn)插入的DNA片段的有效轉(zhuǎn)錄以及用于 與具體宿主的結(jié)合。表達(dá)載體典型地包含復(fù)制起點、啟動子(一個或多個)、終止子(一個 或多個)以及能夠在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇的特定基因。適合用于本發(fā)明的載體包括但 不限于，用于原核生物中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體(Rosenberg等人，Gene， 56 :125,1987)、 ORFEXll載體系統(tǒng)(Ho等人，EMBO J，6 :133， 1987)或用于哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND 表達(dá)載體(Lee和Nathans, J. Biol. Chem. ，263 :3521,1988)和用于昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的源自 桿狀病毒的載體。DNA片段可以存在于可操作地連接到調(diào)節(jié)元件——例如，啟動子(例如， T7、金屬硫蛋白1、巨細(xì)胞病毒即時早期或多角體蛋白啟動子)的載體中。可以根據(jù)本領(lǐng)域 中已知的方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主，以達(dá)到待被檢測應(yīng)答的最佳細(xì)胞生長條件。
DNA "編碼序列"是雙鏈DNA序列，所述雙鏈DNA序列當(dāng)置于適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列的控 制下時在體內(nèi)被轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽。編碼序列的邊界通常由在5'(氨基)端的起始密碼 子和在3'(羧基)端的翻譯終止密碼子決定。編碼序列可以包括但不限于，原核序列、來 自真核mRNA的cDNA、來自真核(例如，哺乳動物)DNA的基因組DNA序列、以及甚至合成的 DNA序列。多腺苷酸化信號和轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于編碼序列的3'端。
轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列是在宿主細(xì)胞中提供編碼序列表達(dá)的DNA調(diào)節(jié)序列，諸如啟 動子、增強子、多腺苷酸化信號、終止子等等。"啟動子序列"是DNA調(diào)節(jié)區(qū)，所述DNA調(diào)節(jié)區(qū)能夠結(jié)合細(xì)胞中的RNA聚合酶并啟 動下游(3'方向)編碼序列的轉(zhuǎn)錄。為了定義本發(fā)明的目的，啟動子序列被轉(zhuǎn)錄起始位 點限定在其3'端并且向上游(5'方向)延伸，以包括在高于背景的可檢測水平下啟動轉(zhuǎn) 錄所必需的最少數(shù)量的堿基或元件。在啟動子序列中將找到轉(zhuǎn)錄起始位點、以及蛋白結(jié)合 結(jié)構(gòu)域(共有序列)，所述蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)RNA聚合酶的結(jié)合。真核啟動子通常，但 不總是包含"TATA"框和"CAT"框。除-10和-35共有序列之外，原核啟動子典型地包含 Shine-Dalgarno核糖體結(jié)合序列。 在一個實施方式中，啟動子是生物通路特異性啟動子。術(shù)語"生物通路特異性啟動 子"指由一組導(dǎo)致選擇生物學(xué)反應(yīng)或活性的相互作用的分子和反應(yīng)中的一個或多個成員調(diào)節(jié)的啟動子。例如，這些通路包括但不限于，代謝途徑、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和基因調(diào)節(jié)途徑。在相關(guān)方面，這些啟動子包括但不限于，PI3K途徑和細(xì)胞周期蛋白Dl啟動子、MEKK和c-j皿啟動子；cAMP/PKA途徑和ACE啟動子等。 進(jìn)一步，真核啟動子包括但不限于，CMV即時早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、來自反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs、人金屬硫蛋白1IA、HSP70、膠原酶、a -2-巨球蛋白以及小鼠金屬硫蛋白-I。適合的載體和啟動子的選擇完全在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平內(nèi)。表達(dá)載體還包含翻譯起始和轉(zhuǎn)錄終止子的核糖體結(jié)合位點。載體還可以包括適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增表達(dá)序列。可以使用具有可選擇的標(biāo)記物的CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)載體或其它載體從任意期望的基因中選擇啟動區(qū)。 在一方面，所公開的一般方法使要產(chǎn)生的數(shù)據(jù)與細(xì)胞中啟動子的活性相關(guān)，和與大分子的細(xì)胞定位和分析技術(shù)相關(guān)，所述分析技術(shù)使用該信息推斷細(xì)胞調(diào)節(jié)決定對細(xì)胞過程的影響并且解釋這種知識來在所述過程中確定最佳點以操作驅(qū)動細(xì)胞系統(tǒng)達(dá)到期望的狀態(tài)。"表達(dá)控制序列"是控制和調(diào)節(jié)另一 DNA序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的DNA序列。當(dāng)RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA時，編碼序列處于細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列的"控制下"，所述mRNA然后被翻譯成由編碼序列編碼的蛋白質(zhì)。"信號序列"可以被包括在編碼序列附近。該序列編碼信號肽——多肽的N端，所述信號肽通信宿主細(xì)胞，以將多肽引導(dǎo)到細(xì)胞表面或?qū)⒍嚯姆置诘脚囵B(yǎng)基中，并且該信號肽在蛋白質(zhì)離開細(xì)胞之前被宿主細(xì)胞剪去?？梢园l(fā)現(xiàn)信號序列與多種天然的原核生物和真核生物的蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)。 細(xì)胞已經(jīng)被外源性或異源性DNA "轉(zhuǎn)化"——當(dāng)這種DNA已經(jīng)被導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)時。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的傳統(tǒng)技術(shù)來實施。這些方法包括但不限于，磷酸鈣共沉淀法、諸如顯微注射法的傳統(tǒng)機械法、電穿孔法、插入包裝在脂質(zhì)體中的質(zhì)粒，或者可以使用病毒載體。另一個方法是使用真核病毒載體，諸如猿病毒40 (SV40)或牛乳頭瘤病毒，瞬時感染或轉(zhuǎn)化感興趣的真核細(xì)胞和表達(dá)序列(參見，例如，EukaryotesViral Vectors, Cold SpringHarbor Laboratory, Gluzman ed. ，1982)。
轉(zhuǎn)化的DNA可以整合或可以不被整合(共價連接)到細(xì)胞的基因組中。在例如，原核生物、酵母以及哺乳動物細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化的DNA可以維持在諸如質(zhì)粒的游離型元件上。對于真核細(xì)胞，被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是這樣的細(xì)胞其中轉(zhuǎn)化的DNA已經(jīng)整合到染色體中，以便其通過染色體復(fù)制被子細(xì)胞遺傳。通過真核細(xì)胞建立細(xì)胞系或克隆的能力來證明該穩(wěn)定性，所述細(xì)胞系或克隆由一群包含轉(zhuǎn)化的DNA的子細(xì)胞組成。"克隆"是一群通過有絲分裂從單個細(xì)胞或祖先衍生的細(xì)胞。"細(xì)胞系"是能夠在體外穩(wěn)定生長許多代的原代細(xì)胞(初級細(xì)胞)的克隆。 進(jìn)一步，同樣地，"宿主細(xì)胞"是在其中載體能夠增殖并且其DNA可以表達(dá)的細(xì)胞，
該術(shù)語還包括目標(biāo)宿主細(xì)胞的任何后代?？梢岳斫?，所有后代可以不同于親代細(xì)胞，這是因
為在復(fù)制期間可以發(fā)生突變。然而，當(dāng)使用術(shù)語"宿主細(xì)胞"時，包括這些后代。穩(wěn)定傳遞
的方法——含義是外源DNA被持續(xù)地保持在宿主中——在本領(lǐng)域中是已知的。 如本文所用，術(shù)語"寡核苷酸"定義為由兩個或更多個脫氧核糖核酸，優(yōu)選三個以
上脫氧核糖核酸組成的分子。寡核苷酸的精確大小取決于許多因素，其又取決于寡核苷酸的最終功能和用途。如本文所用，術(shù)語"引物"指這樣的寡核苷酸——不論是自然產(chǎn)生(如在純化的限制性消化中)還是合成產(chǎn)生，并且當(dāng)被置于合適的條件下，B卩，在核苷酸和諸如DNA聚合酶的誘導(dǎo)劑存在的情況下和在適合的溫度和pH下時，所述寡核苷酸能夠啟動與核酸互補的鏈的合成。引物最初可以是單鏈或雙鏈并且必須是足夠地長，以在誘導(dǎo)劑存在的情況下引導(dǎo)期望的延伸產(chǎn)物的合成。引物的精確長度將取決于許多因素，這包括溫度、引物的序列和/或同源性以及使用的方法。例如，在診斷應(yīng)用中，寡核苷酸引物典型地包含15-25或更多個核苷酸，這取決于靶序列的復(fù)雜性——盡管其可以包含較少的核苷酸。
術(shù)語"分割"含義是區(qū)別圖像中感興趣的對象和背景(例如，區(qū)別前景和背景)。在相關(guān)方面，"閾值化"是分割的方法，其中圖像被標(biāo)記為"對象"——如果它們的值高于設(shè)定值或閾值(假定對象比背景更明亮)——和"背景"——如果低于該設(shè)定值。
"分水嶺變換"是分割灰度圖像的工具，其中灰度圖像被認(rèn)為是地形地貌；S卩，像素的灰度級變?yōu)楦叱厅c(elevation of point)，地貌的"盆地"和"低谷"對應(yīng)于黑暗區(qū)，其中"山脈"和"山脊線"對應(yīng)于明亮區(qū)。分水嶺線可以作為點的集合直觀地被引入，其中落在分水嶺線的一滴水可以向下流向地貌的幾個集水盆地(參見，例如，S. Beucher和Meyer， inMathematical Morphology in Image Processing,E. R. Dougherty,Ed. ，New York :MarcellDekker，1993， vol. 12， pp.433-481)。 術(shù)語"原位篩選"含義是不破壞/溶解細(xì)胞而對細(xì)胞進(jìn)行測定，以分析亞細(xì)胞組分。在這種測定中，待被分析的細(xì)胞在整個過程中保持完整。 術(shù)語"定位報道基因"含義是包含這樣的序列的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段，所述序列在
與信號或其它蛋白質(zhì)融合時，將融合的信號或其它蛋白質(zhì)結(jié)合到具體的細(xì)胞器或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。例如，這些定位報道基因包括但不限于，包含全部或部分RhoB的融合蛋白；細(xì)胞色素c氧化酶的亞單位VIII ;SV40T-抗原NLS ;鈣網(wǎng)蛋白的引導(dǎo)肽；來自13 1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的引導(dǎo)肽；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的棕櫚?；Y(jié)構(gòu)域；來自hA-Ras的法尼基化序列；過氧化物酶體導(dǎo)向信號；P -肌動蛋白；AKT1 ;PLCG ;組蛋白H2B和a -微管蛋白。 術(shù)語"時間間隔"包括選擇的最佳長度，其在觀察時期(例如，離散時間情況下)中的每一段時間內(nèi)或在給定的觀察測量中的每個時間點可變化。 術(shù)語"網(wǎng)絡(luò)連通性"含義是在復(fù)雜的系統(tǒng)中兩個或更多個節(jié)點之間的連接和通信，典型地這些連接遍及由一個或更多個通路相互連接的一系列點。在一方面，本發(fā)明公開了使用人造網(wǎng)絡(luò)和過程來模仿生物子系統(tǒng)中的網(wǎng)絡(luò)和過程。這些人造模型包括計算機網(wǎng)絡(luò)、通信系統(tǒng)/子系統(tǒng)、涉及整合統(tǒng)計過程控制(SPC)和工程過程控制(EPC)組合的工業(yè)聚合過程，等等。 術(shù)語"過程調(diào)節(jié)"或"過程控制"包括面對動態(tài)相關(guān)的觀察結(jié)果時通過對一個或更多個補償工藝變量進(jìn)行有規(guī)律的調(diào)節(jié)使輸出量的可變性最小化。 術(shù)語"擾動的狀態(tài)"和"未擾動的狀態(tài)"涉及給定的系統(tǒng)的平衡狀態(tài)。如果擾動沖
擊系統(tǒng)，并且該系統(tǒng)趨于返回至其平衡，則該系統(tǒng)是穩(wěn)定的并且處于未擾動的狀態(tài)。如果擾
動沖擊系統(tǒng)，并且該系統(tǒng)不趨于返回至其平衡，則該系統(tǒng)是不穩(wěn)定的并且處于擾動的狀態(tài)。
如果擾動沖擊系統(tǒng)以及該系統(tǒng)沒有移向或遠(yuǎn)離平衡，則該系統(tǒng)是在中性狀態(tài)。 術(shù)語"逐步演化"指這樣的過程，其變化以程度、等級或成比例分級為標(biāo)記，或以程
度、等級或成比例分級進(jìn)行，或其變化涉及系統(tǒng)階段中的一系列連續(xù)改變。
術(shù)語"狀態(tài)空間建模"指測定可能性和概率的統(tǒng)計學(xué)方法，以及包括馬爾可夫和非馬爾可夫模型，諸如離散時間馬爾可夫鏈(discrete-time Moarkov Chain)、連續(xù)時間馬爾可夫鏈(conti皿ous-timeMarkov Chain)、馬爾可夫回應(yīng)模型(Markov reward model)、半馬爾可夫模型(semi-Markov model)、馬爾可夫再生模型(markov regenerativemodel)禾口非齊次馬爾可夫模型(non_homogenous Markov model)。 熒光標(biāo)記對于標(biāo)記感興趣的蛋白質(zhì)、細(xì)胞或有機體是特別有用的工具。傳統(tǒng)地，感
興趣蛋白質(zhì)被純化，然后共價結(jié)合到熒光團(tuán)衍生物。對于體內(nèi)研究，然后使用微量加液器或
可逆的滲透方法將蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物插入感興趣的細(xì)胞中。然而，染料附著和插入步驟
使過程費力并且難以控制。標(biāo)記感興趣的蛋白質(zhì)的可選的方法是將表達(dá)感興趣蛋白質(zhì)的基
因與表達(dá)標(biāo)記物的基因連接或融合，然后表達(dá)融合產(chǎn)物。用于這種蛋白質(zhì)標(biāo)記方法的典型
的標(biāo)記物包括但不限于，P-半乳糖苷酶、螢火蟲熒光素酶和細(xì)菌熒光素酶。然而，這些這些
標(biāo)記物需要外源性底物或輔因子并且因此對于體內(nèi)研究具有有限的用途。 不需要外源性輔因子或底物的標(biāo)記物是多管水母(Aequorea victoria)的綠色
熒光蛋白(GFP)，所述蛋白質(zhì)具有在395nm處的最大激發(fā)、在475nm處的第二激發(fā)峰和在
510nm處的最大發(fā)射。綠色熒光蛋白為238個氨基酸的蛋白質(zhì)，氨基酸65-67涉及發(fā)色團(tuán)的形成。 將綠色熒光蛋白用于基因表達(dá)和蛋白質(zhì)定位的研究是熟知的。致密結(jié)構(gòu)使得GFP在多種和/或惡劣條件諸如蛋白酶處理下非常穩(wěn)定，這通常使GFP成為極其有用的報道基因。 已經(jīng)開發(fā)出新式的綠色熒光蛋白，諸如"人源化的"GFPDNA，它的蛋白產(chǎn)物在哺乳
動物細(xì)胞中具有增加的合成。 一種這樣的人源化蛋白是"增強綠色熒光蛋白"(EGFP)。綠
色熒光蛋白的其它突變已經(jīng)產(chǎn)生發(fā)射藍(lán)、藍(lán)綠和黃綠光的熒光蛋白形式。 設(shè)計用于細(xì)胞調(diào)節(jié)研究的廣泛應(yīng)用的工具被稱為表達(dá)譜(e鄧ression
profiling)。表達(dá)譜允許在一系列樣品中同時測定許多基因表達(dá)的RNA的相對量，這提供
了在取樣的時刻細(xì)胞中許多基因的轉(zhuǎn)錄活性的快照(sn即shot)。 EP采用破壞性取樣。為了進(jìn)行這種測定，待研究的細(xì)胞必須被破碎成其大分子組分，從其它組分純化RNA部分，然后由所述RNA制成的標(biāo)記的代表物用作可定量的分析物。破壞這些待被分析細(xì)胞的要求導(dǎo)致以這種方式收集數(shù)據(jù)的兩個關(guān)鍵不足在非常大量的細(xì)胞上獲得動態(tài)數(shù)據(jù)和平均演化數(shù)據(jù)有困難。 對復(fù)雜系統(tǒng)功能的成功分析要求研究者能夠以非常詳細(xì)的方式跟蹤系統(tǒng)從一個
狀態(tài)到另一個狀態(tài)的演變。如果跟蹤系統(tǒng)的方法包括使該系統(tǒng)失效，則研究者有必要面臨經(jīng)歷相同的狀態(tài)改變集合的許多幾乎同樣的系統(tǒng)，以及沿著待被研究的狀態(tài)演變軌跡在不
同的時間舍棄系統(tǒng)，以便建立代表性系統(tǒng)通過的各種中間狀態(tài)的詳細(xì)圖。該方法通常具有
實踐限制。測定很快變得非常昂貴，這是因為你不得不準(zhǔn)備許多用以經(jīng)歷平行測試的代表
性系統(tǒng)，以及然后你必須在大量系統(tǒng)上實施測試。選擇取樣的時間點是非常反復(fù)的過程，因
為你在開始時沒有狀態(tài)演變中事件的精確時間圖，而必須從實驗中學(xué)習(xí)它。 在目前進(jìn)行的大部分生物學(xué)實驗中，該問題是相當(dāng)嚴(yán)重的。盡管在時間進(jìn)程中獲
取了少量數(shù)據(jù)，但大部分?jǐn)?shù)據(jù)根本不是來自仔細(xì)的時間依賴性實驗一或來自時控的實驗。
在許多在人樣品上實施的轉(zhuǎn)錄工作中，研究對正常和病理樣品進(jìn)行了比較，每個樣品代表取自單個個體的單次取樣。由于缺乏時程實驗，所以通常假定數(shù)據(jù)來自穩(wěn)態(tài)分布的系統(tǒng)。限于穩(wěn)態(tài)數(shù)據(jù)，推理問題是下列分類的逆問題假設(shè)樣品來自穩(wěn)態(tài)分布，相對于網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)可以獲得何種推理。該逆問題是強烈不適定的。穩(wěn)態(tài)行為限制了動態(tài)行為，但不決定動態(tài)行為。從穩(wěn)態(tài)數(shù)據(jù)建立動態(tài)模型是一種過擬合。原因在于從穩(wěn)態(tài)數(shù)據(jù)設(shè)計的網(wǎng)絡(luò)動態(tài)行為從被認(rèn)為是人造品(人為現(xiàn)象，artifact)，以及我們必須限制自己將推理的網(wǎng)絡(luò)認(rèn)為是提供必須被解釋的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)，以便將推理的網(wǎng)絡(luò)限制成這樣的網(wǎng)絡(luò)，所述網(wǎng)絡(luò)與觀察的穩(wěn)態(tài)行
為和強加于該模型的任何生物假定，諸如連通性或吸引子(attractor)結(jié)構(gòu)相一致。
盡管在使用穩(wěn)態(tài)數(shù)據(jù)建模時可能捕獲生物網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)態(tài)，但網(wǎng)絡(luò)的許多重要運行特征取決于其動態(tài)行為。例如，因為吸引子循環(huán)取決于動態(tài)行為，所以這些不能由穩(wěn)態(tài)數(shù)據(jù)確定并且沒有動態(tài)特性，典型地需要假定模型僅僅具有非-循環(huán)的穩(wěn)態(tài)行為。而且，許多重要的信息包含在網(wǎng)絡(luò)的瞬時行為中。例如，不同的吸引子可相容的網(wǎng)絡(luò)可以具有不同的瞬時行為，以便推理網(wǎng)絡(luò)的行為可以或可以不與已知的行為相符，諸如p53的誘導(dǎo)凋亡或內(nèi)穩(wěn)態(tài)行為，其在擾動后需要快速返回到吸引子。更一般的問題涉及穩(wěn)態(tài)概率。盡管可以獲得關(guān)于吸引子的良好推理，但是在隨機初始化(或在更一般的網(wǎng)絡(luò)中隨機擾動)后，在給定的吸引子中僅僅可以實現(xiàn)以差的系統(tǒng)概率推理結(jié)束。這是因為如果吸引子盆地(basin)是小的，那么與如果吸引子盆地是大的相比，更不可能追蹤到隨機初始化。當(dāng)從穩(wěn)態(tài)取樣時，具有小盆地的吸引子更不可能出現(xiàn)，而具有大的盆地的吸引子可以出現(xiàn)多次。
本發(fā)明描述了通過控制一個或更多個變量(或基因)在基因網(wǎng)絡(luò)動力學(xué)中的干預(yù)。在以前的工作中，當(dāng)從穩(wěn)態(tài)數(shù)據(jù)推斷網(wǎng)絡(luò)時，已經(jīng)顯示控制被施加到穩(wěn)態(tài)分布被有利地改變的程度；然而，改變的程度取決于從穩(wěn)態(tài)數(shù)據(jù)推理的具體模型，這是因為，如上所述，已選擇缺少動力學(xué)信息的模型推理來與數(shù)據(jù)——也可能連同一些現(xiàn)有的生物學(xué)假定——一致，因此不可以提供真實分布的精確測量。 此外，平均化——其經(jīng)常用于抽取許多細(xì)胞樣品的方法——通常在推理分析中導(dǎo)致信息的丟失。簡單地說，平均化掩蓋了正在發(fā)生的狀態(tài)變化的形式。區(qū)別數(shù)字、有或無改變和類似物、分級的改變之間的能力喪失。在其中細(xì)胞將最終實現(xiàn)可以表示為1的轉(zhuǎn)錄改變的過渡期間，不可能僅僅從過渡期間的0. 25的平均測量知道其是代表了所有細(xì)胞具有全值的25%的改變，還是代表了 25%的細(xì)胞具有完全100%改變。在逐個細(xì)胞基礎(chǔ)上收集數(shù)據(jù)的方法產(chǎn)生這種信息，所述信息對研究者如何設(shè)計靶向該過渡的干涉有影響。
由取自多個不同個體的樣品所產(chǎn)生的第二種問題是正確地推理與具體個體中具體基因轉(zhuǎn)錄物的量的改變相關(guān)聯(lián)的生物學(xué)"含義"的問題。眾所周知，來自不同組織的細(xì)胞對相同的信號以完全不同的方式反應(yīng)。整體暴露于強的伽馬輻射將對非?？焖偕L的、產(chǎn)生血細(xì)胞的細(xì)胞以及布滿消化道的細(xì)胞具有最深遠(yuǎn)的致死影響——即使所有細(xì)胞具有大致相當(dāng)?shù)膭┝?，并且所有?xì)胞將經(jīng)歷許多相同組應(yīng)激反應(yīng)基因的即時上調(diào)。細(xì)胞死亡率的差異是由于這樣的方式基于細(xì)胞應(yīng)答中其它基因產(chǎn)物的類型和量，最初的調(diào)節(jié)改變將被隨后翻譯成不同的應(yīng)答。在作為單個(或少數(shù))時間點序列收集的數(shù)據(jù)集中，通過每個不同細(xì)胞系統(tǒng)引起的信息元件的解釋的差異是不容易解決的。在試圖將具體的基因產(chǎn)物與被研究的過程相關(guān)聯(lián)時，可以犯幾種可能的錯誤。因為生物學(xué)系統(tǒng)顯示出與穩(wěn)定的復(fù)雜系統(tǒng)相關(guān)聯(lián)的高度冗余性，所以在過程中一個具體基因產(chǎn)物的參與對于過程的總體成功可能是不必要的。這變得非常明確，因為有可能產(chǎn)生模型生物，所述生物完全缺少已知在實施具體的發(fā)育過程中重要的基因。 研究者必須頻繁地敲除幾種相關(guān)的基因，以了解對正討論的過程的有效阻斷。除 了基因是冗余的之外，基因可以具有多種功能，其取決于細(xì)胞中何種其它基因存在和起作 用。在這種情況下，基因的功能"含義"在基因產(chǎn)物中不完全是固有的，而僅僅可以通過其 正在工作的環(huán)境來完全確定。許多蛋白質(zhì)通過諸如磷酸化的翻譯后修飾或通過結(jié)合到另一 個蛋白質(zhì)而被活化或抑制。在冗余性的情況下，蛋白質(zhì)可以不存在而與其正常相關(guān)的過程 可以繼續(xù)。在活化的情況下，蛋白質(zhì)可以存在于所有樣本中并且僅在其中蛋白質(zhì)在感興趣 的過程中起作用的所述蛋白質(zhì)部分中活化。確定在過程中重要的基因產(chǎn)物因此可以是困難 的——當(dāng)僅從多個樣品對比中進(jìn)行時。 以上描述的系統(tǒng)類型研究將對正常情況下正常細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)功能進(jìn)行說明作為它 們的目。在研究者希望從細(xì)胞的正常狀態(tài)改變它們的活性的情況下——生物生產(chǎn)的典型目 的，或在研究者希望對處于異常狀態(tài)下的細(xì)胞活性進(jìn)行干預(yù)的情況下——醫(yī)師處理病理組 織的典型問題，需要完全不同的觀點。觀察正常狀態(tài)下的正常細(xì)胞沒有揭示大量聯(lián)鎖調(diào)節(jié) 關(guān)系，所述聯(lián)鎖調(diào)節(jié)關(guān)系當(dāng)細(xì)胞經(jīng)受異常的暴露、應(yīng)激或需求，或當(dāng)細(xì)胞的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)被突變 或基因組重排擾動時，開始起作用，因而普通的、熟知的關(guān)系對在異常情況下所發(fā)生的關(guān)系
來說不是可靠的建模指導(dǎo)。這在所應(yīng)用的生物學(xué)中具有嚴(yán)重的局限性。 對生物生產(chǎn)領(lǐng)域存在持續(xù)的興趣，所述生物生產(chǎn)能夠產(chǎn)生用來產(chǎn)生小分子而改變 的微生物或真菌菌株。盡管在這些系統(tǒng)中可以產(chǎn)生許多期望的分子，但是驅(qū)動細(xì)胞產(chǎn)生大 量分子諸如維生素、油和異戊二烯的類胡蘿卜素衍生物的能力非常有限——雖然對可應(yīng)答 的酶、通量率有非常清楚的了解并且將基因放入生物的基因組和從生物的基因組移除基因 的能力容易獲得。問題出現(xiàn)在系統(tǒng)的更高水平，代謝子系統(tǒng)與其它細(xì)胞子系統(tǒng)的相互作 用——其調(diào)節(jié)代謝中間產(chǎn)物的定位和儲存，以及維持細(xì)胞膜。 類似地，試圖設(shè)計藥物對癌癥進(jìn)行干預(yù)，即使研究者可以知道具體的基因正在剌 激持續(xù)的細(xì)胞增殖，但是消除該剌激的治療可能未能使腫瘤生長停止，這是因為其它的增 殖信號在系統(tǒng)中起作用。在目的是對細(xì)胞調(diào)節(jié)系統(tǒng)施加控制以實現(xiàn)非正常狀態(tài)或改變非正 常狀態(tài)的應(yīng)用中，努力的焦點應(yīng)該首先在調(diào)節(jié)序位(hierachy，層級)中向上調(diào)節(jié)，以檢查 整個子系統(tǒng)的功能，以更清楚地限定控制的目標(biāo)。 簡而言之，為了獲得現(xiàn)有工程化分析方法的全部力量(power,功能)，可以期望獲 得具有下述性質(zhì)的關(guān)于細(xì)胞系統(tǒng)的數(shù)據(jù)1.所述數(shù)據(jù)反映系統(tǒng)的動力學(xué)。其以足夠緊密的 間隔收集，以允許基因組調(diào)節(jié)系統(tǒng)的各種狀態(tài)改變，所述基因組調(diào)節(jié)系統(tǒng)作為從一個狀態(tài) 演化到下一個狀態(tài)的系統(tǒng)被觀察。2.數(shù)據(jù)收集的方法是非破壞性的，并且允許研究者跟蹤 細(xì)胞的相同集合中的生物程序的進(jìn)程。3.數(shù)據(jù)收集的方法應(yīng)該是實用的，具有最適量的細(xì) 胞，以便可以獲得和測試來自生物的具體組織。4.應(yīng)該在逐個細(xì)胞的基礎(chǔ)上收集數(shù)據(jù)，以便 可以測定整個群體改變的一致性和程度。5.鑒定被研究的各種過程的功能狀況的推論數(shù)據(jù) 也應(yīng)該被收集，以便可以研究逐步改變對過程的實際影響。 —個獲得具有這些特征的數(shù)據(jù)的方法是進(jìn)行這樣的實驗，所述實驗允許在試圖控 制之前觀察各種細(xì)胞子系統(tǒng)的功能，以確定它們在起始狀態(tài)下是如何被調(diào)控的，以及應(yīng)用 控制干預(yù)和觀測子系統(tǒng)功能狀態(tài)的演變，以了解控制是否影響了所設(shè)計的目標(biāo)，還有目標(biāo) 功能的有效改變是否在子系統(tǒng)的其它組分中和與目標(biāo)子系統(tǒng)相互作用的子系統(tǒng)中產(chǎn)生了預(yù)期的改變。如果控制失敗，那么可能了解到，其失敗的原因是存在將目標(biāo)子系統(tǒng)恢復(fù)至功 能性的可選的功能源或存在能夠代替其正常相互作用的其它子系統(tǒng)上的目標(biāo)子系統(tǒng)輸入 的可選的功能源。在這些背景中出現(xiàn)的相互作用的類型不太可能在這樣的步驟中遇到，所 述步驟建立了對以正常功能為基礎(chǔ)的調(diào)節(jié)關(guān)系的深刻理解。 因此，所公開的方法的特征是l.獨立地測驗每個細(xì)胞系藥物反應(yīng)并獲取藥物暴 露之前和藥物暴露之后有關(guān)其狀態(tài)的完整的數(shù)據(jù)。2.將同時檢查許多途徑的作用和相互 作用。3.在整個處理前和處理后的時間跨度內(nèi)以短的間隔( 15分鐘)獲取數(shù)據(jù)點，以 允許在應(yīng)答中所有的中間步驟被捕獲。4.逐個細(xì)胞獲取數(shù)據(jù)，而不是以所有測試細(xì)胞的單 次平均數(shù)。5. —些指示劑將允許對增殖和凋亡的直接肉眼評估。6.檢查多種細(xì)胞系或腫 瘤，以對其中可能使用藥物的許多可能的腫瘤背景進(jìn)行取樣。7.每個細(xì)胞系中藥物成功時 和其失敗時發(fā)生的具體分子應(yīng)答事件將可用于橫向比較。8.可以鑒定成功應(yīng)答所必需的相 互作用鏈。9.可以鑒定拮抗過程。 在一個實施方式中，公布了測定細(xì)胞過程活性種類和水平的體內(nèi)方法，包括在一 段時間內(nèi)每隔一定時間反復(fù)測定啟動子的活性值和定位報道基因的分布值，所述一段時間 足以確定被監(jiān)測的細(xì)胞過程在培養(yǎng)條件下是否穩(wěn)定，所述培養(yǎng)條件用于用至少一個載體轉(zhuǎn) 化的至少一種非酵母真核細(xì)胞的啟動子活性和定位報道基因細(xì)胞分布，其中所述至少一個 載體包括至少一個由可誘導(dǎo)生物通路特異性啟動子組成的盒，其中所述啟動子可操作地連 接到第一可檢測標(biāo)記物，以及至少一個由編碼第一細(xì)胞內(nèi)定位報道基因的核酸序列組成的 盒；使轉(zhuǎn)化細(xì)胞經(jīng)受外部剌激；以及在暴露于剌激后在一段時間內(nèi)每隔一定時間反復(fù)測定 啟動子活性值和定位報道基因分布值，所述一段時間足以跟蹤由暴露于剌激所產(chǎn)生的細(xì)胞 過程的逐步演變，其中啟動子活性和/或報道基因定位的改變表明剌激的內(nèi)源性生物通路 調(diào)節(jié)。 在相關(guān)的方面，測定包括在一組轉(zhuǎn)化的非酵母細(xì)胞中確定啟動子活性值和定位報 道基因分布值，其中每個細(xì)胞含有不同的載體，所述載體包含單獨的和不同途徑特異性的 啟動子，從而不同的細(xì)胞能夠?qū)κ┘拥呢菁ふ故締为毢筒煌膽?yīng)答，并且其中由每個剌激 引發(fā)的細(xì)胞過程的差異可以被分開并單獨分析。 在一方面，方法包括使用觀察的已知生物化學(xué)通路的數(shù)據(jù)和人造網(wǎng)絡(luò)連通性和過 程調(diào)節(jié)觀察的模型數(shù)據(jù)分析時間間隔數(shù)據(jù)，以模擬對內(nèi)源性生物通路觀察的過程和調(diào)節(jié)管 道之間的連通。 在另一方面，方法進(jìn)一步包括應(yīng)用狀態(tài)空間建模來限定控制策略，以證明由剌激 引發(fā)的細(xì)胞過程會導(dǎo)致擾動的細(xì)胞狀態(tài)或未擾動的細(xì)胞狀態(tài)的可能性的增加或減少。
這些方法可以包括但不限于，數(shù)學(xué)控制或控制工程理論?？刂颇繕?biāo)含義是影響其 行為以達(dá)到期望的目的。 一般而言，在控制理論中存在兩條主要的工作路線。其中一個是 基于這樣的思想待被控制目標(biāo)的優(yōu)良模型是可得的并且研究者想要如何對其行為進(jìn)行某 些優(yōu)化。另一個主要的工作路線是基于由有關(guān)模型或有關(guān)目標(biāo)運行的環(huán)境的不確定性施加 的限制。用于這種類型建模的主要工具是使用反饋，以便糾正與期望行為的偏離(例如，從 擾動狀態(tài)和未擾動狀態(tài)的觀察)。 對于本發(fā)明，可以應(yīng)用某些控制理論的原理。例如，一階近似(first order approximation)足以表征局部行為?；诰€性化原理，基于線性化的模型局部地為原系統(tǒng)工作。術(shù)語"局部"指對那些最初(例如，未擾動的)狀態(tài)可以期望滿意的行為 的事實，所述最初狀態(tài)接近于進(jìn)行線性化的點周圍。對控制理論更深入的分析可以在 F. L. Lewis, Applied Optimal Control and Estimation, Prentice_Hall， New York, NY， 1992禾口 E. D. Sontag， Mathematical Control Theory -Deterministic FiniteDimensional Systems, Second Edition, Springer-Verlag, New York, NY， 1998中發(fā)現(xiàn)。
在本發(fā)明的一方面，測定步驟包括在一段時間內(nèi)每隔一定時間反復(fù)測定暴露于剌 激后的啟動子活性值和定位報道基因分布值，所述一段時間足以跟蹤由暴露于剌激所產(chǎn)生 的細(xì)胞過程的逐步演變，其中啟動子活性和/或報道基因定位的改變表明剌激的內(nèi)源性生 物通路調(diào)節(jié)。例如，生物通路組分活化的增加或減少可以在線性化模型中進(jìn)行分析。
分子腫瘤學(xué)的新進(jìn)展已經(jīng)產(chǎn)生了這樣的樂觀癌癥藥物的開發(fā)和治療的選擇可以 從組織病理學(xué)和群體導(dǎo)向方法(populationguided a卯roach)轉(zhuǎn)變成為靶驅(qū)動(target driven)的方法。存在強有力的證據(jù)，活化信號傳導(dǎo)通路中的突變可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對這 樣的通路"上癮(addiction)"，所述通路導(dǎo)致期望被開發(fā)用來抑制這些通路的藥物將導(dǎo)致 腫瘤死亡。但是已經(jīng)變得清楚，腫瘤細(xì)胞對設(shè)計用來抑制具體通路的藥物的反應(yīng)是以獨立 于那一個步驟的大量細(xì)胞活性為條件。這已經(jīng)導(dǎo)致這樣的理解必須評價更寬的細(xì)胞背 景，以確定藥物會產(chǎn)生期望反應(yīng)的條件。目前評價細(xì)胞背景最常用的方法是在治療前對腫 瘤取樣。然后通過復(fù)雜和昂貴的實驗評價腫瘤背景，所述實驗包括蛋白質(zhì)印跡法、mRNA微 陣法等。產(chǎn)生的數(shù)據(jù)是mRNA豐度水平和蛋白質(zhì)豐度/修飾水平的一次性快照(one-time snapshot)，其是許多細(xì)胞的平均數(shù)。 根據(jù)本發(fā)明，以某些方式處理和分析細(xì)胞圖像，以獲取與相關(guān)的生物通路有關(guān)的 特征。使用這些特征、本發(fā)明的裝置和方法可以自動得出有關(guān)細(xì)胞的生物學(xué)的某些結(jié)論。
本發(fā)明提供方法和裝置，其用于分析細(xì)胞圖像和從該細(xì)胞圖像獲取生物學(xué)上有意 義的與通路相關(guān)的特征。獲取的特征可以與由處理細(xì)胞的生物活性劑(例如，藥物、肽、蛋 白質(zhì)、核酸、感染劑、激素、小的有機分子、無機分子、金屬、有機金屬共軛物、抗原、抗體、趨 化因子、細(xì)胞因子、碳水化合物、脂質(zhì)、維生素等)或物理因素(例如，熱、光、壓力、磁場、 x-輻射或非熱微波輻射)誘導(dǎo)的具體狀況相關(guān)聯(lián)，從而使細(xì)胞的自動化分析能夠基于通路 利用參數(shù)(pathwayutilization parameter)。具體而言，本發(fā)明提供使用許多單獨的圖像 的數(shù)據(jù)分割圖像中細(xì)胞的方法。 本發(fā)明的一個應(yīng)用包括結(jié)合圖像數(shù)據(jù)使用參比細(xì)胞通路(優(yōu)選這樣的細(xì)胞通路， 其細(xì)胞圖像的指示特征先前已經(jīng)被鑒定和分割以及因此其鑒定和分割參數(shù)被充分了解并 且可以重復(fù))，以在第二個細(xì)胞上進(jìn)行分割，從而獲得有關(guān)第二個細(xì)胞的通路或子系統(tǒng)的數(shù) 據(jù)。本發(fā)明這種應(yīng)用在參比細(xì)胞特征(例如，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞骨架或 其它看得見的特征)先前已經(jīng)被分割時特別有效。本發(fā)明進(jìn)一步提供從分割的細(xì)胞圖像提 取生物學(xué)上相關(guān)的與通路有關(guān)的細(xì)胞特征的技術(shù)。 根據(jù)本發(fā)明，可以獲得這樣的細(xì)胞的圖像，所述細(xì)胞已經(jīng)用化學(xué)試劑處理，以使可 見的(或在電磁波頻譜區(qū)中可另外檢測到)細(xì)胞子系統(tǒng)組分和/或定位組分或標(biāo)記物的特 異性結(jié)合(例如，易位)進(jìn)入亞細(xì)胞區(qū)室。這種試劑的常見實例是對表示細(xì)胞形狀的具體 細(xì)胞組分特異的有色染料。其它這種試劑可以包括與細(xì)胞組分直接或間接結(jié)合(例如，通 過抗體或其它中間結(jié)合劑)的熒光或磷光化合物。根據(jù)本發(fā)明，許多細(xì)胞組分可以用不同的試劑處理并且單獨成像——只要試劑不歪曲感興趣的細(xì)胞反應(yīng)。 用作本發(fā)明方法起始點的圖像通常在將標(biāo)記物與其它細(xì)胞組分和圖像背景對比 的條件下從已經(jīng)被特殊處理和/或成像的細(xì)胞獲得。在一個實施方式中，細(xì)胞用活細(xì)胞染 色劑處理，所述染色劑使圖像中每個細(xì)胞產(chǎn)生不同的可見標(biāo)記。在一方面，選擇的顯像劑不 加區(qū)別地與細(xì)胞結(jié)合或在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合。該試劑應(yīng)該提供與給定圖像中其它特征的強烈對 比。為此目的，試劑應(yīng)該是發(fā)光的、熒光的等等。各種染色劑和熒光化合物可以達(dá)到該目的。
根據(jù)具體的標(biāo)記物，可利用各種顯像劑，并且適于標(biāo)記細(xì)胞骨架、細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜、細(xì) 胞核和其它不連續(xù)的(discrete)細(xì)胞組分的試劑在組織學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域中是熟知 的。 用于制備和使處理的細(xì)胞適當(dāng)成像的各種技術(shù)在本領(lǐng)域中是熟知的(參見，例 如，美國專利第6， 734， 576號)。 在每種情況下，獲得的圖像將成像的標(biāo)記物表示為相應(yīng)的"圖像參數(shù)"。圖像參數(shù) 是圖像中顯示的光或輻射的強度值。通常，強度值在逐像素基礎(chǔ)(per pixel basis)上提 供。另外，強度值可以以具體的波長或相應(yīng)于顯像劑發(fā)射頻率的窄范圍的波長提供，所述顯 像劑特異性地與成像的標(biāo)記物相關(guān)聯(lián)。 有時必須對測量的強度進(jìn)行校正。這是因為強度的絕對量值由于染色和/或圖像 采集程序和/或儀器的改變可以每個圖像均不同。具體的光學(xué)色差可以通過各種圖像收集 組件諸如透鏡、濾波器、分束器、偏光器等引入。其它的可變性源可以通過激發(fā)光源、光學(xué)顯 微鏡的寬帶光源、檢測器的檢波特性等引入。甚至相同圖像的不同區(qū)域可以具有不同的特 征。例如，一些光學(xué)元件不提供"平像場"。結(jié)果，圖像中央附近的像素與圖像邊緣的像素相 比具有過大的強度。校正算法可以用于彌補這種效應(yīng)。使用那些成像系統(tǒng)，這種算法可以 容易地開發(fā)成具體的光學(xué)系統(tǒng)和使用的參數(shù)集。研究者只需知道在給定的采集參數(shù)集下系 統(tǒng)的反應(yīng)。 閾值下的概念是熟知的?？梢酝ㄟ^各種技術(shù)計算適當(dāng)?shù)拈撝?。?b>具體實施方式
中，閾值選擇為對比度直方圖模式(最高值)。在該技術(shù)中，對圖像中的每個像素進(jìn)行對比 度計算。對比度可以是像素和其鄰近像素之間的強度差異。其次，對每個強度值(八字節(jié) 圖像中0-255)計算平均對比度。對比度直方圖提供平均對比度作為強度的函數(shù)。閾值被 選擇為具有最大對比度的強度值。參見"The ImageProcessing Handbook",第三版，John C. Russ 1999 CRC Press UX IEEEPress，以及"A Survey of Thresholding Techniques", P. K. Sahoo， S.Soltani禾口 A. K. C. Wong， Computer Vision, Graphics,and ImageProcessing 41,233-260(1988)。在一個實施方式中，邊緣檢測包括用高斯型拉普拉斯算子(L即lacian ofa Gaussian)濾波器巻積圖像。零相交被檢測為邊緣點(edge point)。連接邊緣點 形成閉合的周線(輪廓線)，從而分割相關(guān)的圖像對象。參見，以上引用的圖像處理手 冊(ImageProcessing Handbook)。有關(guān)按照本發(fā)明的細(xì)胞核的分割和相關(guān)的儀器和技 術(shù)的更詳細(xì)內(nèi)容描述在共同未決專利申請系列號09/729， 754和09/792， 012中(
發(fā)明者E·R·多爾蒂, M·比特納 申請人:平移基因組學(xué)研究所