專利名稱：：確定肝細(xì)胞癌亞型和檢測(cè)肝癌干細(xì)胞的方法確定肝細(xì)胞癌亞型和檢測(cè)肝癌干細(xì)胞的方法
背景技術(shù)：
：肝細(xì)胞癌(HCC)是世界范圍內(nèi)癌癥死亡的第三大主要原因。HCC就其臨床表現(xiàn)以及基因組模式和轉(zhuǎn)錄模式來說是非常異質(zhì)的。HCC的異質(zhì)性和用于其檢測(cè)和亞型鑒定的適當(dāng)?shù)纳飿?biāo)志物的缺乏已經(jīng)妨礙了患者的預(yù)后和治療層級(jí)。因此，存在對(duì)于能夠在哺乳動(dòng)物中鑒定HCC的亞型的一種或多種生物標(biāo)志物以及對(duì)以HCC的亞型為基礎(chǔ)提供適當(dāng)治療的方法的需求。發(fā)明簡述本發(fā)明提供在受治療者中確定HCC的亞型的方法，所述方法包括a)從受治療者獲得樣品，b)測(cè)定樣品以檢測(cè)至少1種生物標(biāo)志物，以及c)將所檢測(cè)的生物標(biāo)志物與受治療者中的HCC亞型相關(guān)聯(lián)。在這一點(diǎn)上，所述生物標(biāo)志物選自由SEQIDNO:1_39標(biāo)識(shí)的生物標(biāo)志物所組成的組。本發(fā)明還提供在樣品中檢測(cè)HCC干細(xì)胞的方法，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括a)獲得樣品，b)測(cè)定樣品以檢測(cè)mir-181生物標(biāo)志物的存在，以及c)將mir-181生物標(biāo)志物的存在或不存在與樣品中HCC干細(xì)胞的存在或不存在相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明還提供用于治療患有HCC的受治療者的方法和組合物，其利用與HCC干細(xì)胞相關(guān)的生物標(biāo)志物。附圖的不同視圖的簡述圖1A顯示mir-181al的表達(dá)，其為以微小RNA分析為基礎(chǔ)的HSC-HCC細(xì)胞中(腫瘤與非腫瘤組織的)log(2)比率。圖1B顯示mir-181a2的表達(dá)，其為以微小RNA分析為基礎(chǔ)的HSC、DBE、HP和MH-HCC細(xì)胞中(腫瘤與非腫瘤組織的)log(2)比率。圖1C顯示mir-181bl的表達(dá)，其為以微小RNA分析為基礎(chǔ)的HSC、DBE、HP和MH-HCC細(xì)胞中(腫瘤與非腫瘤組織的)log(2)比率。圖1D顯示mir-181b2的表達(dá)，其為以微小RNA分析為基礎(chǔ)的HSC、DBE、HP和MH-HCC細(xì)胞中(腫瘤與非腫瘤組織的)log(2)比率。圖1E顯示mir-181c的表達(dá)，其為以微小RNA分析為基礎(chǔ)的HSC、DBE、HP和MH-HCC細(xì)胞中(腫瘤與非腫瘤組織的)log(2)比率。圖1F顯示mir-181a的表達(dá)，其為如通過RT-PCR所測(cè)定的HSC、DBE、HP和MH-HCC細(xì)胞中(腫瘤與非腫瘤組織的)log(2)比率。圖1G顯示mir-181b的表達(dá)，其為如通過RT-PCR所測(cè)定的HSC、DBE、HP和MH-HCC細(xì)胞中(腫瘤與非腫瘤組織的)log(2)比率。圖1H顯示mir-181c的表達(dá)，其為如通過RT-PCR所測(cè)定的HSC、DBE、HP和MH-HCC細(xì)胞中(腫瘤與非腫瘤組織的)log(2)比率。圖II顯示mir-181d的表達(dá)，其為如通過RT-PCR所測(cè)定的HSC、DBE、HP和MH-HCC細(xì)胞中(腫瘤與非腫瘤組織的)log(2)比率。圖1J顯示mir-213的表達(dá)，其為如通過RT-PCR所測(cè)定的HSC、DBE、HP和MH-HCC5細(xì)胞中(腫瘤與非腫瘤組織的)log(2)比率。圖2A顯示mir-181al的散布圖。圖2B顯示mir-181a2的散布圖。圖2C顯示mir-181bl的散布圖。圖2D顯示mir-181b2的散布圖。圖2E顯示mir-181c的散布圖。圖3A是顯示0、2和8天時(shí)ESC培養(yǎng)基相比于常規(guī)培養(yǎng)中mir_181a、mir_181b、mir-181c和mir-181d產(chǎn)生倍數(shù)的圖示。圖3B是顯示0、2和8天時(shí)ESC培養(yǎng)基相比于常規(guī)培養(yǎng)中CAR和UGT2B7的倍數(shù)的圖示。圖3C是顯示0、2和8天時(shí)ESC培養(yǎng)基相比于常規(guī)培養(yǎng)中CCND1和TACSTD1產(chǎn)生倍數(shù)的圖示。圖3D是顯示撤走ESC培養(yǎng)基后0、1、2和8天時(shí)mir-181a、mir-181b、mir-181c和mir-181d產(chǎn)生倍數(shù)的圖示。圖3E是顯示撤走ESC培養(yǎng)基后0、1、2和8天時(shí)CAR和UGT2B7產(chǎn)生倍數(shù)的圖示。圖3F是顯示撤走ESC培養(yǎng)基后0、1、2和8天時(shí)CCND1和TCSTD1產(chǎn)生倍數(shù)的圖示。圖4是在pMSCV-hTR和pMSCV-mir-181bl處理的HuHl細(xì)胞中mir-181b的相對(duì)表達(dá)的圖示。圖5是在用2'-0-甲基反義相比于對(duì)照轉(zhuǎn)染的HuH7細(xì)胞中mir-181的相對(duì)表達(dá)的圖示。圖6A是在pMSCV-hTR和p-MSCV-mir-181bl處理的HuHl細(xì)胞中CCND1的相對(duì)表達(dá)的圖示。圖6B是在pMSCV-hTR和p-MSCV-mir-181bl處理的HuHl細(xì)胞中TACTD1的相對(duì)表達(dá)的圖示。圖6C是在pMSCV-hTR和p-MSCV-mir-181bl處理的HuHl細(xì)胞中DKK1的相對(duì)表達(dá)的圖示。圖6D是在對(duì)照和反義處理的HuH7細(xì)胞中CCND1的相對(duì)表達(dá)的圖示。圖6E是在對(duì)照和反義處理的HuH7細(xì)胞中TACSTD1的相對(duì)表達(dá)的圖示。圖6F是在對(duì)照和反義處理的HuH7細(xì)胞中DKK1的相對(duì)表達(dá)的圖示。圖7A顯示在DKK1的611-6323，-UTR處的mir-181a、mir-181b、mir-181c和mir-181d的預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)。圖7B顯示在DKK1的771-7993'-UTR處的mir-181a、mir-181b、mir-181c和mir-181d的預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)。圖8A是預(yù)測(cè)的mir-181al和mir-181bl的TCF-4結(jié)合位點(diǎn)。圖8B是預(yù)測(cè)的mir-181a2和mir-181b2的TCF-4結(jié)合位點(diǎn)。圖8C是預(yù)測(cè)的mir-181c和mir-181d的TCF-4結(jié)合位點(diǎn)。圖8D是預(yù)測(cè)的mir-181c和mir_181d的另一個(gè)TCF-4結(jié)合位點(diǎn)。圖9是在每種細(xì)胞系(H印3bB型(HSC-HCC)、MHCC97C型(HP-HCC)、Smmc7721D型(MH-HCC))相比于原代肝細(xì)胞中mir-181a、mir-181b、mir-181c和mir-181d的倍數(shù)的圖示。6圖10是在HSC-HCC、BDE-HCC、HP-HCC和MH-HCC亞型中具有升高和降低表達(dá)的miRNA的數(shù)目的圖示。發(fā)明詳述微小RNA(或miRNA)是存在于許多生物中并且通過主要在3'未翻譯區(qū)中與mRNA的部分互補(bǔ)位點(diǎn)的堿基配對(duì)而在mRNA翻譯和降解中起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的小的非編碼的RNA基因產(chǎn)物(例如，約22nt)。Lee，Science,294(5543):862-864(2001);Lau，Science,294(5543):858-862(2001);Lagos，Science,294(5543):853-858(2001)。miRNA被表達(dá)為長的前體RNA，其被Drosha，一種細(xì)胞核酸酶加工并且隨后通過輸出蛋白-5(e鄧ortin-5)依賴性的機(jī)制被運(yùn)送至細(xì)胞質(zhì)中。Yi，GenesDev，17(24):3011-3016(2003);Gregory，CancerRes.，65(9):3509-3512(2005)。然后miRNA被DICER酶切害ij，產(chǎn)生與RNA誘導(dǎo)的沉默樣復(fù)合體相關(guān)聯(lián)的約17-24nt的miRNA。Lee，EMBOJ，21(17):4663-4670(2002);Hutvagner，Science,297(5589):2056-2060(2002)。本發(fā)明以發(fā)現(xiàn)miRNA生物標(biāo)志物與HCC亞型相關(guān)為基礎(chǔ)。為了本發(fā)明的目的，HCC亞型是指肝干細(xì)胞樣HCC(HSC-HCC)，其為上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)+a-胎蛋白(AFP)+;膽管上皮樣HCC(BDE-HCC)，其為EpCAM+AFP-;肝祖細(xì)胞樣HCC(HP-HCC)，其為EpCAM_AFP+;以及成熟肝細(xì)胞樣HCC(MH-HCC)，其為EpCAM-AFP-。本發(fā)明提供用于鑒定每一種HCC亞型的一套生物標(biāo)志物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在受治療者中確定HCC亞型的方法，其包括a)從受治療者獲得樣品，b)分析樣品的1種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)，以及c)將1種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)與受治療者中的HCC亞型相關(guān)聯(lián)。所述生物標(biāo)志物的表達(dá)可以是相對(duì)于正常對(duì)照降低或提高的。所述生物標(biāo)志物是由SEQIDN0:l-39(參見表1)標(biāo)識(shí)的。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選的是分析2種或更多種、5種或更多種、10種或更多種、15種或更多種、20種或更多種、25種或更多種、30種或更多種或者35種或更多種的生物標(biāo)志物。更優(yōu)選地，分析所有39種生物標(biāo)志物。為了確定HSC-HCC亞型，優(yōu)選地分析至少由SEQIDNO:1_19標(biāo)識(shí)的生物標(biāo)志物。為了確定BDE-HCC亞型，優(yōu)選地分析至少由SEQIDN0:2、9-17和19-35標(biāo)識(shí)的生物標(biāo)志物。為了確定HP-HCC亞型，優(yōu)選地分析至少由SEQIDNO:1-8、11-13、17_18、23、28-29和33-39標(biāo)識(shí)的生物標(biāo)志物。為了確定MH-HCC亞型，優(yōu)選地分析至少由SEQIDNO:1、8-12、14-17和19-39標(biāo)識(shí)的生物標(biāo)志物。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與成熟的肝臟細(xì)胞相比，HCC干細(xì)胞與miRNA生物標(biāo)志物的mir-181家族，尤其是mir-181al、mir-181a2、mir-181bl、mir-181b2和mir-181c(S卩，它們的表達(dá))相關(guān)，并且樣品中HCC干細(xì)胞的存在指示與不良預(yù)后相關(guān)的HSC-HCC亞型。相應(yīng)地，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中HCC干細(xì)胞存在的方法，其包括a)獲得樣品，b)測(cè)定樣品以檢測(cè)mir-181生物標(biāo)志物的存在，以及c)將mir-181生物標(biāo)志物的存在或不存在與樣品中HCC干細(xì)胞的存在或不存在相關(guān)聯(lián)。例如，做為選擇，EpCAM+AFP+HCC干細(xì)胞可通過任何適合的方法例如免疫熒光、免疫組織化學(xué)、冷凍活化的細(xì)胞分選、側(cè)群法、細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)法或原位雜交來檢測(cè)。例如，在側(cè)群技術(shù)中，將細(xì)胞通透性DNA結(jié)合染料Hoechst33342攙入到感興趣的細(xì)胞群中；干細(xì)胞和早期祖細(xì)胞隨后經(jīng)由ATP結(jié)合盒膜泵依賴性機(jī)制將這種染料泵出，在通過流式細(xì)胞計(jì)分析細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生低熒光"尾"。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法還包括將樣品中HCC干細(xì)胞的存在與樣品中HSC-HCC亞型的存在相關(guān)聯(lián)。7有利地，樣品中HCC干細(xì)胞的檢測(cè)允許受治療者中的HSC-HCC亞型的更早檢測(cè)并因此導(dǎo)致更大可能性的成功治療和存活。如本文所用的，術(shù)語"生物標(biāo)志物"可與"miRNA"交替使用并且是指與HCC相關(guān)的那些生物標(biāo)志物，其包括至少表1中的39種生物標(biāo)志物。在本發(fā)明的方法中，可檢測(cè)一些(即1、2、3、4、5、7、7、8、9、10、15、20、25、30或35種)或全部39種生物標(biāo)志物。優(yōu)選地，至少2種或更多種，更優(yōu)選地，至少5種或更多種生物標(biāo)志物被檢測(cè)。在檢測(cè)mir-181生物標(biāo)志物的實(shí)施方案中，該生物標(biāo)志物優(yōu)選地可以是mir-181al、mir-181a2、mir-181bl、mir-181b2和mir-181c中的一種或多種。在這一點(diǎn)上，檢測(cè)mir-181生物標(biāo)志物中的一些(即，1、2、3或4種)或全部5種。用于確定樣品中生物標(biāo)志物的表達(dá)的存在和水平的適合的技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)的范圍內(nèi)。根據(jù)一個(gè)這樣的方法，可在核酸提取緩沖液存在的情況下通過均質(zhì)化，之后通過離心從細(xì)胞純化總細(xì)胞RNA。核酸被沉淀并且通過使用DNA酶處理和沉淀除去DNA。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過瓊脂糖凝膠上的凝膠電泳分離RNA分子并通過例如所謂"RNA印跡"的印跡技術(shù)將RNA分子轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜。之后通過加熱將RNA固定在濾膜上。使用與研究的RNA互補(bǔ)的適當(dāng)標(biāo)記的DNA或RNA探針完成特異性RNA的檢測(cè)和定量。參見，例如MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，J.Sambrook等人編輯，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989，第7章，其全部公開內(nèi)容通過引用并入。用于制備標(biāo)記的DNA和RNA探針的方法和用于其與靶核酸序列雜交的條件描述于MolecularCloning:ALaboratoryMaruml，J.Sambrook等人編車茸，第二片反，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989，第10和11章中，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。例如，可使用例如放射性核素諸如^、"P、^P、"C或355;重金屬；或?qū)τ跇?biāo)記的配體(例如生物素、抗生物素蛋白或抗體)、熒光分子、化學(xué)發(fā)光分子、酶或類似物能夠起到特異性結(jié)合配對(duì)部分的作用的配體來標(biāo)記核酸探針。可通過Rigby等人，J.Mol.Biol.，113:237-251(1977)的切口平移法或通過Fienberg，Anal.Biochem.，132:6-13(1983)的隨機(jī)引物法將探針標(biāo)記至高比活性，其全部公開內(nèi)容通過引用并入本文。后者可作為用于從RNA模板合成高比活性的、標(biāo)記的探針的方法。例如，根據(jù)切口平移法通過用高放射性核苷酸取代預(yù)先存在的核苷酸，能夠制備具有超過108cpm/微克的比活性的、標(biāo)記的核酸探針。之后可通過將雜交濾膜對(duì)照相膠片曝光來進(jìn)行雜交的放射自顯影檢測(cè)。通過雜交濾膜曝光的照相膠片的光密度掃描提供生物標(biāo)志物水平的精確測(cè)量。使用另一種方法，可通過計(jì)算機(jī)化的成像系統(tǒng)，例如MolecularDynamics400-B2D磷光顯像儀(AmershamBiosciences,Piscataway,N.J)定量生物標(biāo)志物水平。當(dāng)不能實(shí)行DNA或RNA探針的放射核素標(biāo)記時(shí)，可使用隨機(jī)引物法將類似物，例如dTTP類似物5-(N-(N-生物素基-e-氨基己?；?_3-氨基烯丙基)脫氧尿苷三磷酸酯，并入探針分子中。可通過使用與產(chǎn)生顏色反應(yīng)的熒光染料或酶偶聯(lián)的生物素結(jié)合蛋白例如抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素和抗體(例如，抗生物素抗體)的反應(yīng)檢測(cè)生物素化的探針寡核苷酸。除了RNA印跡和其他的RNA印跡雜交技術(shù)，可使用原位雜交技術(shù)實(shí)現(xiàn)RNA表達(dá)水平的確定。這一技術(shù)需要比RNA印跡技術(shù)更少的細(xì)胞，其包括將整體細(xì)胞沉積在顯微鏡蓋玻片上并且用含有放射性或其他方式標(biāo)記的核酸(例如cDNA或RNA)探針的溶液探查細(xì)胞的核酸含量。這一技術(shù)尤其適用于分析來自受治療者的組織活檢樣品。原位雜交技術(shù)的實(shí)行更詳細(xì)地描述于美國專利第5，427，916號(hào)中，其全部公開內(nèi)容通過引用并入本文。樣品中miRNA的相對(duì)數(shù)目可通過反轉(zhuǎn)錄，以及之后的通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)的反轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄物的擴(kuò)增來確定。可與內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，例如，來自同一樣品中存在的標(biāo)準(zhǔn)基因的mRNA的水平相對(duì)比來定量RNA轉(zhuǎn)錄物的水平。用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的適合的基因包括例如肌球蛋白或3-磷酸甘油醛脫氫酶(G3PDH)。定量RT-PCR的方法及其變化形式在本領(lǐng)域技術(shù)的范圍內(nèi)。在一些情況下，可以期望同時(shí)確定樣品中多種不同生物標(biāo)志物基因的表達(dá)水平。在某些情況下，可以期望確定與HCC相關(guān)聯(lián)的所有已知生物標(biāo)志物基因的轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平。評(píng)估上百種生物標(biāo)志物基因的癌癥特異性表達(dá)水平是費(fèi)時(shí)的并且需要大量的總RNA(每個(gè)RNA印跡至少20iig)以及需要放射性同位素的放射自顯影技術(shù)。為了克服這些限制，可構(gòu)建含有對(duì)一套生物標(biāo)志物基因特異的一套探針寡核苷酸的微芯片形式的寡核苷酸文庫。例如寡核苷酸文庫可含有與來自人類基因組的所有已知的生物標(biāo)志物相應(yīng)的探針。微芯片寡核苷酸文庫可被擴(kuò)展至包括被發(fā)現(xiàn)的另外的miRNA。從產(chǎn)生自已知miRNA的基因特異性寡核苷酸探針制備微芯片。例如，該陣列可包含每一種miRNA的兩種不同的寡核苷酸探針，一種含有活性序列而另一種是對(duì)miRNA前體特異的。該陣列還可含有對(duì)照，諸如與人類直向同源物僅有少數(shù)堿基不同的一種或多種小鼠序列，其可作為雜交嚴(yán)格條件的對(duì)照。來自兩種物種的tRNA也可被點(diǎn)樣在微芯片上，為特異性雜交提供內(nèi)部的、相對(duì)穩(wěn)定的陽性對(duì)照。用于非特異性雜交的一種或多種適合的對(duì)照也可包括在微芯片上。為了這一目的，以缺少與任何已知miRNA的任何同源性為基礎(chǔ)選擇序列?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的技術(shù)制作微芯片。例如，將適當(dāng)長度諸如20個(gè)核苷酸的探針寡核苷酸在位置C6進(jìn)行5'氨基修飾，并使用適合的可得的微陣列系統(tǒng)例如GENEMACHINEOmniGrid100微陣列點(diǎn)樣儀和AmershamCODELINK活化的載玻片點(diǎn)樣。通過使用標(biāo)記的引物反轉(zhuǎn)錄靶RNA來制備相應(yīng)于靶RNA的標(biāo)記的cDNA寡聚物。第一條鏈合成后，將RNA/DNA雜種變性以降解RNA模板。之后由此制備的標(biāo)記的靶cDNA與微陣列芯片在例如6倍SSPE/30%甲酰胺25t:下的雜交條件下雜交18小時(shí)，之后在0.75倍TNT中于37。C清洗40分鐘。在陣列上固定的探針DNA識(shí)別樣品中互補(bǔ)的靶cDNA的位置，發(fā)生雜交。標(biāo)記的靶cDNA標(biāo)志出陣列上發(fā)生結(jié)合的準(zhǔn)確位點(diǎn)，并允許自動(dòng)化檢測(cè)和定量。輸出由一列雜交事件組成，指示受治療者的樣品中特定cDNA序列的相對(duì)豐度，以及由此得出的相對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)生物標(biāo)志物的相對(duì)豐度。在一個(gè)實(shí)例中，標(biāo)記的cDNA寡聚物是生物素標(biāo)記的cDNA，由生物素標(biāo)記的引物制備。然后使用例如Str印tavidin-Alexa647綴合物通過包含生物素的轉(zhuǎn)錄物的直接檢測(cè)處理微陣列，并且使用常規(guī)掃描方法將其掃描。陣列上每一個(gè)點(diǎn)的成像密度與受治療者的樣品中相應(yīng)的生物標(biāo)志物的豐度成比例。陣列的使用對(duì)于miRNA表達(dá)檢測(cè)來說具有一個(gè)或多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。首先，可在相同的樣品中在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)鑒定幾百種基因的整體表達(dá)。第二，通過仔細(xì)的設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，成熟和前體分子的表達(dá)都可鑒定。第三，與RNA印跡分析相比，芯片要求少量的RNA，并且用低至92.5iig的總RNA提供可重復(fù)的結(jié)果。相對(duì)有限數(shù)目的miRNA(每個(gè)物種幾百個(gè))允許構(gòu)建對(duì)一些物種來說具有用于每一物種的不同寡核苷酸探針的通用的微陣列。這一工具將允許分析在不同的條件下每種已知的生物標(biāo)志物的跨物種的表達(dá)。受治療者可以是表現(xiàn)出HCC的癥狀人類或動(dòng)物。優(yōu)選地，受治療者是人類。受治療者還可以具有或沒有乙型肝炎病毒或肝硬化(例如酒精導(dǎo)致的，原發(fā)性膽汁性肝硬化、遺傳性血色病、自身免疫性肝炎、原發(fā)性硬化性膽管炎)。HCC可為孤立性腫瘤、多結(jié)節(jié)性腫瘤和/或轉(zhuǎn)移病灶。獲自受治療者的樣品可是肝組織，其可是腫瘤組織或正常組織?？蛇x擇地，樣品可來自受治療者的血清或血漿、冷凍的活檢組織、石蠟包埋的活檢組織和其組合。本發(fā)明還提供用于通過確定受治療者是否患有HSCHCC、BDE-HCC、HP-HCC或MH-HCC亞型來確定受治療者預(yù)后的方法。本發(fā)明的預(yù)后的方法可代替現(xiàn)有的預(yù)后方法使用?？蛇x擇地，本發(fā)明的方法可與常規(guī)的預(yù)后方法協(xié)同使用。當(dāng)使用組合的方法時(shí)，傳統(tǒng)的預(yù)后方法可包括肝臟和胸腔的螺旋計(jì)算層析X射線照相術(shù)(CT)、對(duì)比增強(qiáng)的磁共振成像(MRI)或使用乙碘油注射的血管造影術(shù)和活檢以及現(xiàn)有的分期系統(tǒng)。該方法還提供可以受治療者中HCC亞型為基礎(chǔ)的為受治療者設(shè)計(jì)的治療方案。就這一點(diǎn)而言，本發(fā)明方法允許更個(gè)人化的醫(yī)學(xué)方法，以便可以使治療的攻擊性適合受治療者中的HCC亞型。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明利用了生物標(biāo)志物和HCC亞型之間的相關(guān)性。因此，本發(fā)明提供包括施用治療有效量的組合物的治療方法，所述組合物包括含有與HSC-HCC、BDE-HCC、HP-HCC或MH-HCC相關(guān)的生物標(biāo)志物的至少一種互補(bǔ)的核酸的試劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明利用mir-181生物標(biāo)志物和HCC干細(xì)胞之間的相關(guān)性以便確定受治療者中的HCC亞型，并且任選地將患者中的HCC亞型與預(yù)后相關(guān)聯(lián)。mir-181生物標(biāo)志物與EpCAM和AFP陽性的肝干細(xì)胞樣(HSC)HCC亞型相關(guān)。EpCAM是含有三個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和一個(gè)細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白。EpCAM的功能和其表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制很大程度上還是未知的，但被認(rèn)為包括細(xì)胞-細(xì)胞粘著(Winter,E鄧.Cell.Res.，285(1):50-58(2003))。EpCAM和AFP不在成熟肝組織中表達(dá)。HSCHCC亞型通常具有不良的預(yù)后和存活結(jié)果(Lee，H印atology，40(3):667-676(2004);Lee，Nat.Med.，12(4):410-416(2006))。因此，本發(fā)明提供確定所檢測(cè)的HCC是否是HSCHCC亞型的方法。特別地，因?yàn)镋PCAM+AFP+HCC與Wnt-P聯(lián)蛋白(Wnt-P-catenin)信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)，HCC亞型的確定尤其用在確定受治療者的適當(dāng)?shù)闹委熤?。Wnt-P聯(lián)蛋白信號(hào)是對(duì)于維持干細(xì)胞的功能來說是至關(guān)重要的，并且非正常的活化已經(jīng)與許多人類癌包括HCC有關(guān)。mir-181可能通過Wnt-P聯(lián)蛋白通路的抑制劑Dickkoph-l(即，DKK1)和nemo樣激酶(即，NLK)可促進(jìn)Wnt-P聯(lián)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)活化。本發(fā)明利用mir-181和HCC干細(xì)胞之間的調(diào)節(jié)關(guān)系，并且提供預(yù)后的方法和以其為基礎(chǔ)的治療。治療選擇可包括傳統(tǒng)治療以及特異地耙向本文描述的miRNA的基因治療方法。HCC的傳統(tǒng)治療包括，例如，經(jīng)皮乙醇注射(PEI)、射頻消融、化療栓塞和化療。治療是以受治療者的狀態(tài)為基礎(chǔ)決定的并且指導(dǎo)方針是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。(參見例如Ryder，Gut，52:1-8(2003))。本發(fā)明還提供用于本發(fā)明的治療方法的藥物組合物。就這一點(diǎn)而言，本發(fā)明提供包括治療有效量的試劑和藥學(xué)上可接受的載體的組合物，所述試劑包括含有與選自由SEQIDNO:1-39標(biāo)識(shí)的生物標(biāo)志物的至少一種優(yōu)選至少兩種生物標(biāo)志物互補(bǔ)的一種核酸或多種核酸?？蛇x擇地，試劑包括與生物標(biāo)志物中的至少5種或更多種、10種或更多種、15種或更多種、20種或更多種、25種或更多種、30種或更多種或者35種或更多種互補(bǔ)的核酸。該試劑可只包括核酸或者與遞送試劑例如重組質(zhì)粒、病毒載體、脂質(zhì)體等組合的核酸。優(yōu)選地，對(duì)于HSC-HCC的治療來說，該組合物包括與由SEQIDNO:1-19標(biāo)識(shí)的生物標(biāo)志物互補(bǔ)的核酸，甚至更優(yōu)選地，該組合物包括與mir-181al、mir-181a2、mir-181bl、mir-181b2和mir-181c互補(bǔ)的核酸和藥學(xué)上可接受的載體。優(yōu)選地，對(duì)于BDE-HCC的治療來說，該組合物包括與由SEQIDNO:2、9-17和19-35標(biāo)識(shí)的至少一種優(yōu)選至少2種生物標(biāo)志物互補(bǔ)的核酸以及藥學(xué)上可接受的載體。優(yōu)選地，對(duì)于HP-HCC的治療來說，該組合物包括與由SEQIDNO:1-8、11-13、17-18、23、28、29和33-39標(biāo)識(shí)的至少一種優(yōu)選至少兩種的生物標(biāo)志物互補(bǔ)的核酸以及藥學(xué)上可接受的載體。優(yōu)選地，對(duì)于MH-HCC的治療來說，該組合物包括與由SEQIDNO:1，8-12、14-17和19-39標(biāo)識(shí)的至少一種優(yōu)選至少兩種生物標(biāo)志物互補(bǔ)的核酸以及藥學(xué)上可接受的載體。該組合物可結(jié)合生物標(biāo)志物和/或使生物標(biāo)志物無效(即，抑制)，或可選擇地，改變編碼生物標(biāo)志物的基因的表達(dá)，由此改變所產(chǎn)生的生物標(biāo)志物的量或水平，用于其的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。在本治療方法的實(shí)行中，抑制生物標(biāo)志物中的至少一種的有效量的至少一種組合物也可被施用至受治療者。如本文所用的，"抑制"意味著治療后癌細(xì)胞中的生物標(biāo)志物的水平和/或來自相應(yīng)基因的生物標(biāo)志物基因產(chǎn)物的產(chǎn)生少于治療之前產(chǎn)生的量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，增加生物標(biāo)志物中的一種或多種的表達(dá)的組合物可被施用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用例如前文討論的用于確定生物標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄物的技術(shù)，可容易地確定在癌細(xì)胞中生物標(biāo)志物水平或基因表達(dá)是已經(jīng)被抑制還是被提高。如本文所用的，抑制生物標(biāo)志物和生物標(biāo)志物基因表達(dá)的組合物的"有效量"是足以抑制患有HCC的受治療者中癌細(xì)胞的增殖的量。本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過考慮諸如受治療者的身高和體重；疾病滲透的程度；受治療者的年齡、健康和性別；施用途徑以及施用是局部的還是全身性的因素，能夠很容易地確定有待對(duì)給定的受治療者施用的抑制組合物的有效量。例如，改變表達(dá)的組合物的有效量能以有待治療的腫瘤塊的大約的重量為基礎(chǔ)。腫瘤塊的大約的重量可通過計(jì)算該塊的大約的體積來確定，其中一立方厘米的體積大致等于一克。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用以腫瘤塊的重量為基礎(chǔ)的有效量?？蛇x擇地，組合物的有效量能以有待治療的受治療者的大約的或估計(jì)的體重為基礎(chǔ)。優(yōu)選地，這樣的有效的量是腸胃外或腸內(nèi)施用的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也可很容易地確定用于對(duì)給定的受治療者施用改變生物標(biāo)志物水平或基因表達(dá)的組合物的適當(dāng)?shù)慕o藥方案。例如，該組合物可被一次(例如單一注射或放置)施用給受治療者?？蛇x擇地，該組合物可被每天一次或兩次施用給受治療者從約三至約二十八天，更優(yōu)選地從約七至約十天的時(shí)間段?？蛇x擇地，該組合物可一天被施用一次施用七天。當(dāng)給藥方案包括多次施用時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解的是施用給受治療者的組合物的有效量可包括整個(gè)給藥方案所施用的組合物的總量。用于抑制生物標(biāo)志物基因表達(dá)的適當(dāng)?shù)慕M合物包括雙鏈RNA(例如短的或小的干11擾RNA或"siRNA")、反義核酸和酶促RNA分子例如核酶。這些組合物中的每一種可被靶向給定的生物標(biāo)志物基因產(chǎn)物并且破壞靶生物標(biāo)志物基因產(chǎn)物或誘導(dǎo)靶生物標(biāo)志物基因產(chǎn)物的破壞。例如，可通過使用與生物標(biāo)志物基因產(chǎn)物的至少一部分具有至少90%，例如95%、98%、99%或100X的序列同源性的分離的雙鏈RNA("dsRNA")分子誘導(dǎo)生物標(biāo)志物基因的RNA干擾來抑制給定的生物標(biāo)志物基因的表達(dá)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，dsRNA分子是"短的或小的干擾RNA"或"siRNA"。用于本方法的siRNA包括在長度上約17個(gè)核苷酸至約29個(gè)核苷酸的，優(yōu)選地在長度上約19個(gè)核苷酸至約25個(gè)核苷酸的短的雙鏈RNA。siRNA包括一起通過標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick堿基配對(duì)相互作用(下文中"堿基配對(duì)的")退火的有義RNA鏈和互補(bǔ)反義RNA鏈。有義鏈包括與包含在靶生物標(biāo)志物基因產(chǎn)物中的核酸序列大致上相同的核酸序列。如本文所用的，siRNA是與包含在靶核酸序列中的靶序列"基本上相同的"，是與靶序列相同的核酸序列，或與靶序列相差一或兩個(gè)核苷酸的核酸序列。siRNA的有義和反義鏈可包括兩種互補(bǔ)的單鏈RNA分子，或可包括其中兩種互補(bǔ)部分是堿基配對(duì)的并且通過單鏈的"發(fā)夾"區(qū)共價(jià)相連的單一分子。siRNA也可是經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)核苷酸的添加、缺失、取代和/或改變而與天然存在的RNA不同的改變的RNA。這種改變可包括將非核苷酸物質(zhì)諸如向siRNA的末端或siRNA的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部核苷酸的添加，或使得siRNA對(duì)核酸酶消化具有抗性的修飾，或脫氧核糖核苷酸對(duì)siRNA中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代。siRNA的一條或兩條鏈還可包括3'突出端。如本文所用的"3'突出端"是指從雙鏈的RNA鏈的3'末端延伸出的至少一個(gè)未配對(duì)的核苷酸。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，siRNA包括長度上1至約6個(gè)核苷酸(其包括核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)的，優(yōu)選地長度上1至約5個(gè)核苷酸的，更優(yōu)選地長度上1至約4個(gè)核苷酸的，尤其優(yōu)選地長度上約2至約4個(gè)核苷酸的至少一種3'突出端。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，3'突出端在siRNA的兩條鏈上都存在，并且長度上為2個(gè)核苷酸。例如，siRNA的每條鏈可包括雙胸腺嘧啶核苷酸("TT")或雙尿嘧啶核苷酸("皿")的3'突出端。siRNA可化學(xué)或生物地產(chǎn)生，或可從重組的質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)，用于分離的生物標(biāo)志物基因產(chǎn)物。產(chǎn)生和檢測(cè)dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于美國公開的專利申請(qǐng)第2002/0173478號(hào)和美國專利第7，148，342號(hào)，其全部公開內(nèi)容通過引用并入本文。給定生物標(biāo)志物基因的表達(dá)還可被反義核酸抑制。如本文所用的，"反義核酸"是指通過RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-肽核酸的相互作用的方式與靶RNA結(jié)合的核酸分子，其改變靶RNA的活性。適合在本方法中使用的反義核酸是通常包含與生物標(biāo)志物基因產(chǎn)物中的連續(xù)的核酸序列互補(bǔ)的核酸序列的單鏈核酸(例如RNA、DNA、RNA-DNA嵌合體、PNA)。優(yōu)選地，反義核酸包括與生物標(biāo)志物基因產(chǎn)物中的連續(xù)的核酸序列50-100%互補(bǔ)的、更優(yōu)選地75-100%互補(bǔ)的和最優(yōu)選地95-100%互補(bǔ)的核酸序列。反義核酸還可包含對(duì)核酸主鏈的修飾或?qū)μ呛蛪A基部分(或它們的等同物)的修飾以增強(qiáng)靶特異性、核酸酶抗性、遞送或與分子的功效有關(guān)的其他特性。這樣的修飾包括膽固醇部分、雙鏈插入劑諸如吖啶或一種或多種核酸酶抗性基團(tuán)的包含物。反義核酸可化學(xué)或生物地產(chǎn)，或可從重組的質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)，如前文所述用于分離的生物標(biāo)志物基因產(chǎn)物。產(chǎn)生和檢測(cè)的示例性方法屬于本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)，參見例如，Stein，Science,261:1004(1993)和Woolf等人的美國專利第5，849，902號(hào)，其全部公開內(nèi)容通過引用并入本文。給定的生物標(biāo)志物基因的表達(dá)還可被酶促核酸抑制，如本文所用的"酶促核酸"是指含有與生物標(biāo)志物基因產(chǎn)物的連續(xù)的核酸序列互補(bǔ)的底物結(jié)合區(qū)的核酸，并且其能夠特異性切割生物標(biāo)志物基因產(chǎn)物。優(yōu)選地，酶促核酸底物結(jié)合區(qū)是與生物標(biāo)志物基因產(chǎn)物的連續(xù)的核酸序列50-100%互補(bǔ)的、更優(yōu)選地75-100%互補(bǔ)的和最優(yōu)選地95-100%互補(bǔ)的。酶促核酸還可包括堿基、糖和/或磷酸基團(tuán)的修飾。用于在本方法中使用的示例性酶促核酸是核酶。酶促核酸可化學(xué)或生物地產(chǎn)生，或可從重組的質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)，如前文所述用于分離的生物標(biāo)志物基因產(chǎn)物。產(chǎn)生和檢測(cè)dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于Werner，Nucl.AcidsRes.，23:2092-96(1995)、Hammann，AntisenseandNucleicAcidDrugDev.，9:25-31(1999)和美國專利第4，987，071號(hào)中，其全部公開內(nèi)容通過引用并入本文。用于抑制至少一種生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物基因的表達(dá)的至少一種組合物的施用將抑制患有HCC的受治療者中癌細(xì)胞的增殖。如本文所用的"抑制癌細(xì)胞的增殖"意指殺死細(xì)胞或永久地或暫時(shí)地阻止或減緩細(xì)胞的生長。如果受治療者中癌細(xì)胞的數(shù)目在施用本發(fā)明的組合物之后不變或減少，那么可推知這種細(xì)胞的增殖的抑制。如果癌細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目增加，但腫瘤生長的速度減小，那么也可推知這種細(xì)胞的增殖的抑制。受治療者體內(nèi)癌細(xì)胞的數(shù)目可通過直接測(cè)量或通過從原發(fā)或轉(zhuǎn)移的腫瘤塊的大小估計(jì)來確定。例如受治療者中癌細(xì)胞的數(shù)目可通過免疫組織學(xué)的方法、流式細(xì)胞計(jì)或設(shè)計(jì)來檢測(cè)癌細(xì)胞的表征的表面標(biāo)志的其他技術(shù)來測(cè)量。腫瘤塊的大小可通過直接的目視觀察或通過診斷成像的方法例如X-射線、磁共振成像、超聲波和閃爍掃描法來確定。如本領(lǐng)域已知的，用來確定腫瘤塊的大小的診斷成像方法可與或不與造影劑一起使用。腫瘤塊的大小還可通過物理方法來確定，例如組織塊的觸診或使用測(cè)量工具例如卡鉗的組織塊的測(cè)量。本發(fā)明的組合物通過適合于將這些組合物遞送至受治療者的癌細(xì)胞的任何方法施用給受治療者。例如組合物可通過適合于用這些組合物轉(zhuǎn)染受治療者的細(xì)胞的方法施用。優(yōu)選地，可用含有編碼至少一種生物標(biāo)志物基因產(chǎn)物或生物標(biāo)志物基因表達(dá)的抑制組合物的序列的質(zhì)?；虿《据d體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用于真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法是本領(lǐng)域中熟知的，并且包括例如將核酸直接注射至細(xì)胞的核或前核中、電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移或由親脂物質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、受體介導(dǎo)的核酸遞送、基因槍或粒子加速、磷酸鈣沉淀和由病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。例如，可用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移組合物例如D0TAP(N-[l-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基-銨甲基硫酸酯，Boehringer-Mannheim)或等同物諸如LIPOFECTIN轉(zhuǎn)染細(xì)胞。核酸的量對(duì)于本發(fā)明的實(shí)行來說不是至關(guān)重要的；可使用0.1-100微克核酸/105細(xì)胞獲得可接受的結(jié)果。例如，可使用每105細(xì)胞3微克DOTAP中約0.5微克質(zhì)粒載體的比率。該組合物還可通過任何適當(dāng)?shù)哪c內(nèi)或腸胃外的施用途徑施用給受治療者。適用于本方法的腸內(nèi)的施用途徑包括例如口服的、直腸的或鼻內(nèi)的遞送。適合的腸胃外的施用途13徑包括例如血管內(nèi)施用(例如，靜脈內(nèi)推注、靜脈內(nèi)輸注、動(dòng)脈內(nèi)推注、動(dòng)脈內(nèi)輸注和進(jìn)入脈管系統(tǒng)中的導(dǎo)管滴注)；組織外圍或組織內(nèi)注射(例如，腫瘤外圍或腫瘤內(nèi)注射、視網(wǎng)膜內(nèi)注射或視網(wǎng)膜下注射)；皮下的注射或放置，包括皮下輸注(例如，通過滲透泵)；直接應(yīng)用于感興趣的組織例如通過導(dǎo)管或其他放置裝置(例如，視網(wǎng)膜小丸或栓劑或含有有孔、無孔或膠狀材料的植入物)以及吸入。優(yōu)選的施用途徑是注射、輸注和直接向腫瘤注射。在本方法中，組合物作為與遞送試劑組合的裸露的RNA或作為含有表達(dá)生物標(biāo)志物基因產(chǎn)物或表達(dá)抑制組合物的核酸(例如重組質(zhì)?；虿《据d體)施用給受治療者。適合的遞送試劑包括例如MirusTransitTKO親脂試劑、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染劑、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑、細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑、聚陽離子(例如，聚賴氨酸)和脂質(zhì)體。包含表達(dá)生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物基因表達(dá)抑制組合物的序列的重組質(zhì)粒和病毒載體，和用于向癌細(xì)胞遞送這種質(zhì)粒和載體的技術(shù)是上文討論的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂質(zhì)體被用來向受治療者遞送生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物基因表達(dá)抑制組合物(或包含編碼它們的序列的核酸)。脂質(zhì)體還可增加基因表達(dá)產(chǎn)物或核酸的血液半衰期。適用于在本發(fā)明中使用的脂質(zhì)體可從標(biāo)準(zhǔn)的形成囊泡的脂質(zhì)形成，其通常包括中性或帶負(fù)電荷的磷脂和固醇例如膽固醇。脂質(zhì)的選擇通常受到對(duì)諸如所期望的脂質(zhì)體的大小和血流中脂質(zhì)體的半衰期的因素的考量的指導(dǎo)。用于制備脂質(zhì)體的各種方法，例如，如Szoka，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，9:467(1980)和美國專利第4，235，871、4，501，728、4，837，028和5，019，369號(hào)中所描述的是已知的，其全部公開內(nèi)容通過引用并入。用于在本方法中使用的脂質(zhì)體可包含將脂質(zhì)體靶向癌細(xì)胞的配體分子。優(yōu)選與癌細(xì)胞中普遍存在的受體結(jié)合的配體，例如與癌細(xì)胞抗原結(jié)合的單克隆抗體。本發(fā)明的組合物可包括藥學(xué)上可接受的載體。如本文所用的術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"意指適于在人類或獸醫(yī)的患者中施用的一種或多種可接受的固體或液體填充劑、稀釋劑、其他賦形劑或包封物質(zhì)。術(shù)語"載體"意指天然的或合成的有機(jī)或無機(jī)成分，其與活性成分組合以幫助使用。藥物組合物的組分還能夠與本發(fā)明的分子以及彼此之間以大致上不損害所期望的藥學(xué)功效的方式共混。"藥學(xué)上可接受的"物質(zhì)能夠施用于患者而不產(chǎn)生不期望的生理作用例如惡心、頭暈、皮疹或胃不適。例如，所期望的是當(dāng)為了治療目包括藥學(xué)上可接受的賦形劑的治療性組合物被施用于人患者時(shí)，其為非免疫原性的。該藥物組合物可包含適合的緩沖劑，包括乙酸鹽、擰檬酸鹽、硼酸鹽和磷酸鹽。該藥物組合物還可任選地包含適合的防腐劑例如苯扎氯銨、三氯叔丁醇、對(duì)羥基苯甲酸酯和乙基汞硫代水楊酸鈉。該藥物組合物可方便地以單位劑量形式存在，并且可通過制藥領(lǐng)域中熟知的任何方法制備。所有方法包括將活性劑與組成一種或多種助劑的載體結(jié)合的步驟。通常，該組合物可通過將活性組合物與液體載體、精細(xì)分離的固體載體或兩者都均一且緊密的結(jié)合來制備，并且然后如果必要的話將產(chǎn)物成形。適用于腸胃外施用的組合物通常包括本發(fā)明組合物的無菌含水制劑，其優(yōu)選地與接受者的血液等滲。這種含水制劑可根據(jù)已知的方法使用適合的分散或潤濕劑和懸浮劑來配制。無菌的可注射的制劑還可是在無毒的可胃腸外接受的稀釋劑或溶劑中的無菌的可注射的溶液或懸浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的載體或溶劑中有水、林格氏溶液和等滲的氯化鈉溶液。此外，無菌的非揮發(fā)油通常被用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為了這一目的，可使用任何溫和的非揮發(fā)油，包括合成的單_甘油酯或雙_甘油酯。此外，脂肪酸例如油酸也可被用于可注射的制劑。適用于口服、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)等施用的載體制齊阿在Remington'sPharmaceuticalSciences,(雷明頓藥物科學(xué))MackPublishingCo.，Easton，PA中找到，其通過引用全文并入本文。本發(fā)明的遞送系統(tǒng)被設(shè)計(jì)以包括隨時(shí)間釋放的、延遲釋放的或持續(xù)釋放的遞送系統(tǒng)以便使本發(fā)明的組合物的遞送在足夠的時(shí)間之前或伴隨足夠的時(shí)間發(fā)生，以導(dǎo)致有待治療的部位的敏化。本發(fā)明的組合物可與其他治療劑或治療協(xié)同使用。這種系統(tǒng)可避免本發(fā)明組合物的重復(fù)施用，增加受治療者和醫(yī)生的方便性，并且尤其適用于本發(fā)明的某些組合物。許多類型的釋放遞送系統(tǒng)是可獲得的并且是本領(lǐng)域的那些普通技術(shù)人員已知的。它們包括聚合物基礎(chǔ)的系統(tǒng)例如聚(丙交脂_乙交酯)、共聚草酸酯、聚己內(nèi)酯、聚酰胺酯、聚原酸酯、聚羥基丁酸和聚酐。含有藥物的前述的聚合物的微膠囊描述于例如美國專利第5，075，109號(hào)中。遞送系統(tǒng)還包括非聚合物系統(tǒng)，其為包括固醇例如膽固醇、膽固醇脂和脂肪酸或中性脂肪例如單_甘油酯、雙_甘油酯和三_甘油酯的液體；水凝膠釋放系統(tǒng)；硅橡膠(sylastic)系統(tǒng)；基于肽的系統(tǒng)、蠟包衣；使用傳統(tǒng)結(jié)合劑和賦形劑的壓縮的片劑；部分融合植入物以及類似系統(tǒng)。特定的實(shí)例包括但不限于(a)侵蝕系統(tǒng)，其中以在基質(zhì)中的形式包含活性組合物，例如，美國專利第4，452，775、4，667，014、4，748，034和5，239，660號(hào)中描述的那些，以及(b)擴(kuò)散系統(tǒng)，其中活性成分以可控制的速度從聚合物中滲出，如美國專利第3，832，253和3，854，480號(hào)中所描述的。此外，可使用基于泵的硬件遞送系統(tǒng)，其中一些是適于植入的。本發(fā)明還提供通過在一療程的治療后確定是否有任何存留的HCC干細(xì)胞存留在受治療者的肝中評(píng)估受治療者中HCC的治療功效的方法。就這一點(diǎn)而言，樣品從受治療者獲得并被測(cè)定以檢測(cè)mir-181生物標(biāo)志物的存在或不存在。之后將mir-181生物標(biāo)志物的存在或不存在分別與受治療者中EpCAM+AFP+HCC的存在或不存在相關(guān)聯(lián)。這一信息被用來確定受治療者中HCC的治療是否已經(jīng)是或不是有效的。下列實(shí)施例進(jìn)一步示例性說明本發(fā)明，但是，當(dāng)然不應(yīng)當(dāng)被理解為以任何形式限制其范圍。實(shí)施例下列技術(shù)被用于下文敘述的實(shí)施例。臨床樣本。在知情同意的情況下從2002和2003年間在肝癌研究所和中山醫(yī)院(中國上海復(fù)旦大學(xué))經(jīng)歷根治切除的受治療者獲得肝組織。研究經(jīng)肝癌研究所的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)和國立衛(wèi)生研究院批準(zhǔn)。樣品采納標(biāo)準(zhǔn)包括具有HBV感染史或HBV相關(guān)的肝硬化、經(jīng)由兩個(gè)獨(dú)立的病理學(xué)家診斷的HCC，臨床表現(xiàn)和生理學(xué)表征的詳細(xì)信息以及至少三年的詳細(xì)隨訪數(shù)據(jù)的那些，隨訪數(shù)據(jù)包括肝內(nèi)的復(fù)發(fā)、肝內(nèi)靜脈轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)受累、肝外轉(zhuǎn)移、無病、整體存活和致死。對(duì)于用于分析miRNA的預(yù)測(cè)能力的經(jīng)歷切除并且因此被選定以分級(jí)為早期受治療者(TNMI和II期)的HCC受治療者來說，最新的TNM分類優(yōu)于其他分期系統(tǒng)，包括CLIP和OKUDA。Varotti，EurJ.Surg0nco1，31(7):760-767(2005);Huang等人，JGastroenterolH印ato1，20(5):765-771(2005)。預(yù)期的研究顯示BCLC系統(tǒng)優(yōu)于2002年更新的新的TNM分類系統(tǒng)，因此還進(jìn)行了以通過BCLC分類的早期受治療者(0和A期)為基礎(chǔ)的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)建模。在來自244個(gè)中國HCC受治療者的原發(fā)HCC和相應(yīng)的非癌肝組織中建立基因表達(dá)譜。其中，93X具有潛在的肝硬化而68X具有〉20ng/mL的血清a胎蛋白(AFP)水平?？偣?34個(gè)明確定義的病例被用作訓(xùn)煉組。其中，30名具有在門靜脈(n=25)、下腔靜脈(n=2)或膽總管(n=4;—名還具有下腔靜脈中的腫瘤血栓)的主要分支中發(fā)現(xiàn)的伴隨有瘤栓的原發(fā)HCC損傷，而104名具有在隨訪(3年)發(fā)現(xiàn)的無轉(zhuǎn)移/復(fù)發(fā)的孤立性HCC。在有效性分析中，使用了110名獨(dú)立病例的測(cè)試組，其預(yù)后在切除時(shí)不能由一些HCC分期機(jī)制精確的確定。測(cè)試的病例包括43名多結(jié)節(jié)的HCC和67名孤立性HCC。43名多結(jié)節(jié)的HCC病例中，18名發(fā)展肝內(nèi)的復(fù)發(fā)并且一名除了肝內(nèi)的復(fù)發(fā)外還發(fā)展了肝外的轉(zhuǎn)移。67名孤立性HCC病例中，4名受治療者患有具有出現(xiàn)集合小節(jié)的孤立性腫瘤，10名發(fā)展肝內(nèi)和/或肝外的轉(zhuǎn)移，而49名發(fā)展了在隨訪(3年)證實(shí)的肝內(nèi)復(fù)發(fā)。此外，包括來自無病受治療者的八種正常的肝組織(描述于Budhu，CancerCell,10(2):99-111(2006))作為正常對(duì)照。RNA分離和miRNA陣列。如Ye，NatMed，9(4):416-423(2003);Calin，NEnglJ.Med，353(17):1793-1802(2005)中描述的進(jìn)行RNA分離和miRNA陣列的方法學(xué)。在244個(gè)HCC病例的分析中，以配對(duì)的形式從腫瘤或非腫瘤組織中分離RNA并且以隨機(jī)順序選擇用于miRNA分析的樣品以避免分組偏差。進(jìn)行總共488個(gè)微陣列。微陣列臺(tái)(V2.0)主要由250個(gè)非冗余的人類miRNA和200個(gè)小鼠miRNA組成。為了檢測(cè)miRNA微陣列臺(tái)的穩(wěn)健性，分析miRNA以確定表達(dá)是否將244個(gè)組織與它們配對(duì)的周圍的非癌肝組織區(qū)分開。使用具有單變量配對(duì)t檢驗(yàn)和多變量檢驗(yàn)的監(jiān)督分類比較法，鑒定可顯著地將HCC腫瘤組織(T)與它們配對(duì)的非腫瘤組織(NT)區(qū)分開的209個(gè)非冗余miRNA，多變量檢驗(yàn)具有1000種分類標(biāo)記排列、具有設(shè)置為《1的假發(fā)現(xiàn)率并具有99%置信水平。通過系統(tǒng)聚類(hierarchicalclustering)分析示例性說明，這些顯著的miRNA清楚地將T和NT樣品分離。具有10%交叉驗(yàn)證和lOO種隨機(jī)排列的多變量分類預(yù)測(cè)算法分析顯示這些miRNA可通過緊鄰預(yù)測(cè)程序以大于97X的準(zhǔn)確性提供T和NT樣品的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的預(yù)測(cè)(p<0.01)。這些初始分析表明miRNA陣列是穩(wěn)健的并且能夠鑒定腫瘤和非癌肝組織之間的顯著的差巳升°統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過由AlexanderSturn(IBMT-TUG，Graz，Austria)開發(fā)的GENESIS軟件版本1.5進(jìn)行非監(jiān)督系統(tǒng)聚類分析。BRBArrayTools軟件版本3.3被用于如之前描述的監(jiān)督分析(Ye，NatMed，9(4):416-423(2003);Budhu，CancerCell,10(2):99-111(2006))。使用基于Excel的WinSTAT軟件，K即lan-Meier存活分析被用于以預(yù)測(cè)結(jié)果為基礎(chǔ)比較受治療者的存活。統(tǒng)計(jì)的P值通過Cox-Mantel時(shí)序檢驗(yàn)產(chǎn)生。使用STATA9.2(CollegeStation,TX)，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸被用來分析十六個(gè)臨床變量對(duì)受治療者存活或復(fù)發(fā)的作用，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性被定義為P<0.05。TargetScan分析是以由BenLewis(Lewis，Cell，120(1):15-20(2005))開發(fā)的網(wǎng)點(diǎn)工具為基礎(chǔ)的。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸被用于分析臨床變量對(duì)受治療者整體和無復(fù)發(fā)存活的作用，臨床變量包括年齡、性別、HBV活性狀態(tài)、預(yù)切除的AFP、肝硬化、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)、Child-Pugh評(píng)分、腫瘤大小、腫瘤包囊作用、結(jié)節(jié)類型、微血管侵入狀態(tài)、Edmondson等級(jí)和幾種HCC預(yù)后分期系統(tǒng)，包括BCLC分16期(Llovet，SeminLiverDis，19(3):329-338(1999))、CLIP分類("TheCanceroftheLiverltalianProgram(意大利肝癌計(jì)劃)"，H印atology，28(3):751-755(1998))、Okuda分期(0kuda，Cancer，56(4):918-928(1985))禾PTNF分類(AmericanJointCommitteeonCancer(AJCC)/InternationalUnionAgainstCancer(UICC)'sTNMClassificationofMalignantTumours(美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)/國際抗癌聯(lián)合會(huì)(UICC)的惡性腫瘤TNM分類)，第6版，Hoboken，NJ，JohnWiley&Sons2002)。qRT-PCR。使用TRIzol(Invitrogen，Carlsbad,CA)提取總RNA。使用AppliedBiosystems7700序列檢測(cè)系統(tǒng)(FosterCity，CA)—式三份測(cè)量TACSTD1、BAMBI、DKKl、CCND1、CTNNB1和MYC表達(dá)。所用的探針是TACSTDl，Hs00158980_ml;CTNNBl，HS00170025_ml;BAMBI，HS00180818、DKKl，Hs00183740_ml、CCNDl，Hs00277039_ml、CT腿1，MYC，Hs00153408_ml;18S，Hs999999901_sl(AppliedBiosystems)。依照制造商的建議進(jìn)行所有程序。免疫組織化學(xué)分析。使用Envision+試劑盒(DAK0USA，Carpinteria，CA)依照制造商說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。如下第一抗體被使用抗-P-聯(lián)蛋白單克隆抗體克隆14(BDTransductionLaboratories，SanJose，CA)和抗EpCAM單克隆抗體克隆VU-1D9(OncogeneResearchProducts,SanDiego，CA)。理48小時(shí)。之后將細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定10分鐘，用甲醇固定20分鐘并在磷酸鹽緩沖的鹽水中孵育。將樣品用10%正常的驢血清于室溫封閉1小時(shí)并用第一抗體于37t:染色1小時(shí)，之后是軛合Alexa568TexasRed的抗小鼠抗體(MolecularProbes,Eugene,OR)。EMSA。將重組的Tcf-4在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)為GST融合蛋白并提取。使用LightShiftChemiluminescentEMSA試劑盒(Pierce,Rockford，IL)根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行EMSA。含有EpCAM啟動(dòng)子的推定的Tcf結(jié)合位點(diǎn)和10個(gè)相鄰的上游和下游核苷酸的雙鏈的DNA寡核苷酸被構(gòu)建并被用作探針。還使用了突變的TBE1和TBE2探針。細(xì)胞系，反義和質(zhì)粒。常規(guī)培養(yǎng)已知的H印3BB型、MHCC97C型、Smmc7721D型、HUHl和HUH7HCC細(xì)胞系。將細(xì)胞用pMSCV-mir-181b-l轉(zhuǎn)染以用于功能分析。還用2'-0-甲基mir-181反義，mir-181的抑制劑，處理HUH7細(xì)胞。實(shí)施例l這一實(shí)施例證實(shí)miRNA表達(dá)可將HCC組織與非癌組織區(qū)分開并且可區(qū)分HCC的四種亞型。使用來自總共230個(gè)HCC患者的配對(duì)的HCC組織和周圍非HCC組織樣品，發(fā)現(xiàn)總共209個(gè)非冗余miRNA在正確鑒定樣品上提供97%的準(zhǔn)確性(多變量p<0.01)。該樣品的異質(zhì)性是明顯的并且該樣品以四種HCC亞型(HSC、BDE、HP和腿)為基礎(chǔ)被聚類。尋找四種HCC亞型中顯著的miRNA表達(dá)。系統(tǒng)聚類顯示來自以分類比較和具有建立預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性的10倍交叉驗(yàn)證(10-foldcrossvalidation)的分類預(yù)測(cè)兩者為基礎(chǔ)的重疊基因的39種前體miRNA基因在四種HCC亞型中顯示顯著改變的表達(dá)(p<0.002，F(xiàn)DR<0.05)(表1)。39種miRNA中，在每種亞型中一些是上調(diào)的而其他是下調(diào)的(圖10)?；騍EQ,IDIVo,符號(hào)基因定位表1參數(shù)FDR排列P值P值強(qiáng)度的幾何平均值突變序列HCCBDEHSCUPCMH非-HCC上升正常的一肝臟BDEHSC股CMH/下降HSC101le"7a-let-7a-tet-7blet-7clet-7dlet醫(yī)7f醫(yī)2129-1mir-129-29q22.32ugagguaguagguuguauagu0.00020.00890.00037204914425927204030291022822409上升llq2《lugagguaguagguugua膽guu0.00030-01010000315921035878U36157019，194203192上升22ql3Jl22ql3.3l9q22.323p21>2ugagguaguagguuguaugguuugagguagu鄉(xiāng)uugugugguuugagguaguagguuguaugguu0,0027O.翻0.00190.00020加28o.o鵬0.03620.04550.02810.00870.03620.01380.則80加370.00130咖20加260腳3140621341614柳482104399616751226632345766999152910485S6658118518261353670422則14502202201797647896212461471048119173320501386l犯105510716611419W741159692144113171289806611363上升上升上升上升上升上升9129-17q32.1cuuuuugcggucugggcm:gcu0.哪40.01160.卿32742652131701783002306727792859上升11pU.2c,uugcggucu鵬cuugcuO.醒0細(xì)3O.0001484338404446608219920072U71989上升U181卜1lq31.3aacauucauugcugucggu戰(zhàn)g0.00000.00010.0000U821344926719608615525513509上升i2181bJ9q33.3aacauucauugcugucggu鵬0.00000.0007O.讓12981613"53卯88641434143113321294上升CN101711287AsA14/24X〔0118u<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>基因基因SEQ.IDNo.符號(hào)定位;f^t咖P值排列P值強(qiáng)度的幾何平均值HCC正常的非-HCC上升突變序列BDEHSCHPCMH肝臟B眺股C附CMH/下降28mir-329q313uauugca咖uacuaaguugcO.CHM)OO.O柳mir-29323I4q32.31^acauuacacggucgaccucu0.00010.0079mir-1830117q23.2cagugcaauag咖ugucaaagc0>00440.0473"pl3.，cgcauccccuag坊cauuggugu0.00380.041836rmr-3243799bI9ql3.41cacccguagaaccgaccuugcg0.00360.0410ll恥1536122780012鄰13秘U42U19i卿上升p補(bǔ)O.咖l200213203830.0040604714523Ul訴2531075卯H7651597915213上升0.00354134324359415379384405403上升0.0034239248257200165200179202190上升1let-7a-9q22J2ugagguaguagguuguauagu11q24.1ugagguaguagguug咖aguu0.00020.00890細(xì)30.01010.0003720491442592720U91107110"934下降0.00035921035878H361570230320821983，947下降3322ql3.31ugagguaguagguuguaugguu0.00270.03620.0018l艦996柳"851450219920072127l鄉(xiāng)下降4kt-7bZ2ql3.31ugagguaguagguugugu瞎uu0.00410-04550朋3716751529182622023002306727792859下降let-7cugagguaguagguuguaugguu0細(xì)9O.O加0.0013122610481353Z0I7247727422432下降6let-7daga^uaguagguugcauagu0.00020.00870.0002柳6325566709761080t咖1023下降7let-7f-2Xpll"ugagguaguagauuguauagu0細(xì)0.03620.0026啦345326422478733661下降8let-7g3p21.2ugagguagu紹uuuguacagu0.00060.01380.00031043766658抑l9位"34143113321294下降CN101711287A每s步18/24:3<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>前體(A)和成熟miRNA(B)兩者的mir-181表達(dá)水平，相比于在其相應(yīng)的非HCC組織中，在HSC-HCC和BDE-HCC中被顯著提高，但在HP-HCC和MH-HCC中被顯著降低。HSC-HCC和BDE-HCC分別是指具有干細(xì)胞樣特征和膽管上皮細(xì)胞樣特征的HCC。以miRNA前體的miRNA微陣列分析為基礎(chǔ)，與來自230名患者的相應(yīng)的非HCC組織相比的每種HCC亞型中Mir-181表達(dá)，示于分別是mir-181al、mir-181a2、mir-181bl、mir-181b2和mir-181c的圖1A-E中?；虮磉_(dá)比率以log2比率表示(平均值±95%CI)。圖1F-J顯示在40個(gè)HCC和非HCC樣品對(duì)中所有成熟mir-181的RT-PCR分析。前體mir-181和成熟mir-181的散布圖分析示于圖2，具有代表Spearman相關(guān)系數(shù)的r值。其次，在臨床樣品和培養(yǎng)的HCC細(xì)胞系兩者中mir-181表達(dá)與Wnt_|3-聯(lián)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)活化正相關(guān)而與許多成熟的肝細(xì)胞基因負(fù)相關(guān)。進(jìn)行了5種前體mir-181、15種肝細(xì)胞特異基因和5種13-聯(lián)蛋白相關(guān)基因的系統(tǒng)聚類，從微陣列數(shù)據(jù)和mRNA陣列數(shù)據(jù)之間的相關(guān)分析得出其表達(dá)彼此顯著相關(guān)(p<0.001)。在3種不同類型的HCC細(xì)胞系中，mir-181的表達(dá)與13-聯(lián)蛋白蛋白水平正相關(guān)(圖9)。用ESC培養(yǎng)基培養(yǎng)HuHl細(xì)胞后，所述ESC培養(yǎng)基為對(duì)于未分化的胚胎干(ES)細(xì)胞來說最好的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，如qRT-PCR(圖3A-C)以及使用抗P-聯(lián)蛋白和肌動(dòng)蛋白(作為對(duì)照)的抗體的免疫印跡所分析的，mir-181和P-聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)增加而肝細(xì)胞特異基因的表達(dá)降低。撤回ESC培養(yǎng)基后，如qRT-PCR(圖3D-F)所分析的，上述基因的表達(dá)相反變化。一式三份測(cè)量基因表達(dá)并將其顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。實(shí)施例3這一實(shí)施例證實(shí)在wnt-e-聯(lián)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的活化中涉及mir-181表達(dá)。將pMSCV-mir-181b-l轉(zhuǎn)染至HuHl細(xì)胞后，通過RT-PCR檢測(cè)mir_181b并且將表達(dá)與pMSCV-hTR細(xì)胞的表達(dá)相比較。一式三份測(cè)量基因表達(dá)并將其于圖4中顯示為平均值±SD。如所示的，mir-181在HuHl細(xì)胞中是過量表達(dá)的。用2'_0-甲基11111-181反義處理他117細(xì)胞并且之后檢測(cè)所有11111-181的表達(dá)。一式三份測(cè)量的基因表達(dá)上的顯著降低(與對(duì)照寡聚物相比)在圖5中顯示為平均值±SD。mir-181在HuHl細(xì)胞中過表達(dá)之后，通過RT-PCR檢測(cè)P-聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)的基因(CCND1、TACSTD1和DKKl)的表達(dá)并將其與pMSCV-hTR細(xì)胞的表達(dá)相比較(圖6A_C)。還通過使用抗P-聯(lián)蛋白和肌動(dòng)蛋白的抗體的免疫印跡分析細(xì)胞系的細(xì)胞溶解產(chǎn)物。mir-181在HuH7細(xì)胞中下調(diào)之后，通過RT-PCR檢測(cè)P-聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)的基因(CCND1、TACSTD1和DKKl)的表達(dá)并將其與pMSCV-hTR細(xì)胞的表達(dá)相比較(圖6D-F)。還通過使用抗P-聯(lián)蛋白和肌動(dòng)蛋白的抗體的免疫印跡分析細(xì)胞系的細(xì)胞溶解產(chǎn)物。Mir-181影響wnt-e-聯(lián)蛋白表達(dá)。這通過功能的反饋聯(lián)系而發(fā)生是可能的。DKKl是P-聯(lián)蛋白的抑制劑。P-聯(lián)蛋白誘導(dǎo)mir-181以及隨后抑制P-聯(lián)蛋白的DKK1。人們認(rèn)為mir-181起作用以抑制DKKl的抑制活性。DKKl3'-UTR中預(yù)測(cè)的mir-181結(jié)合位點(diǎn)示于圖7A-B。使用了BC001539，人類dickkopf類似物1的cDNA。圖7A顯示在DKKl3'_UTR的611-632位置中的結(jié)合位點(diǎn)。圖7B顯示在DKKl3'-UTR的771-799位置中的預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)。mir-181的啟動(dòng)子中預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子4(TCF_4)結(jié)合位點(diǎn)((A/T)(A/T)CAAAG)或(CTTTG(A/T)(A/T))示于圖8A-D。分析了位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的6，060堿基對(duì)。圖8A顯示染色體1中的mir-181al和mir-181bl的啟動(dòng)子，為其使用了麗_926128，人類染色體1基因組重疊群。圖8B顯示染色體9中的mir-181a2和mir-181b2的啟動(dòng)子，為其使用了NT_008470，人類染色體9基因組重疊群。在Sanger數(shù)據(jù)庫中，兩種EST基因是在mir-181c和mir-181d定位的區(qū)域中預(yù)測(cè)的，其具有不同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(圖8C-D)。圖8C中染色體19中的mir-181c和mir-181d的啟動(dòng)子是來自ENSESTT00000290819的啟動(dòng)子。圖8D中染色體19中的mir-181c和mir-181d的啟動(dòng)子是來自ENSESTT00000290818的啟動(dòng)子。本文引用的所有文獻(xiàn)，包括出版物、專利申請(qǐng)和專利通過引用并入本文，其引用程度就如同每一篇文獻(xiàn)在此被個(gè)別并且特別地指出以通過引用并入并且全文展示于本文中。除非本文另有說明或以其他方式由上下文明確地否認(rèn)，描述本發(fā)明的上下文中(尤其是在隨后的權(quán)利要求的上下文中)的術(shù)語"一(a)"、"一(an)"和"該(the)"以及相似的指示將被解釋為涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)。除非另有注釋，術(shù)語"包括(comprising)"、"具有"、"包括(including)"和"含有"被解釋為開放式術(shù)語(即，意指"包括但不限于")。除非本文以其他方式指出，本文的值的范圍的描述僅僅意指作為個(gè)別地引用落入這一范圍中的每一個(gè)單獨(dú)的值的速記法，并且每個(gè)單獨(dú)的值如同其在本文中被個(gè)別引用地并入說明書中。除非本文以其他方式指出或以其他方式由上下文明確地否認(rèn)，本文描述的所有方法可以任何適當(dāng)?shù)捻樞驅(qū)嵭?。除非以其他方式要求，任何和所有?shí)施例的使用，或本文提供的示例性語言(例如，"諸如")僅僅旨在更好的說明本發(fā)明而不是設(shè)定對(duì)本發(fā)明的范圍的限制。說明書中的語言不應(yīng)當(dāng)被解釋為說明任何未要求的元素為本發(fā)明的實(shí)行所必需的。本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案描述于本文，包括發(fā)明人已知的用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的最好方式。當(dāng)閱讀前述說明時(shí)，那些優(yōu)選的實(shí)施方案的變化形式對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。發(fā)明人期望技術(shù)人員適當(dāng)使用這些變化形式，并且發(fā)明人希望本發(fā)明以除了如本文具體描述的其他方式被實(shí)施。因此，此發(fā)明包括在由可適用的法律允許的附加的權(quán)利要求中記述的主題的所有改變和同等物。而且，除非本文另有說明或以其他方式由上下文明確地否認(rèn)，以本發(fā)明的所有可能的變化形式的上文描述的要素的任何組合都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。28權(quán)利要求在受治療者中確定肝細(xì)胞癌(HCC)亞型的方法，其包括a)從所述受治療者獲得樣品，b)分析所述樣品的1種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)，以及c)將所述1種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)與所述受治療者中HCC的亞型相關(guān)聯(lián)，其中所述生物標(biāo)志物選自由SEQIDNO1-39標(biāo)識(shí)的生物標(biāo)志物組成的組。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品選自由肝臟腫瘤組織、肝臟正常組織、冷凍的活檢組織、石蠟包埋的活檢組織、血清、血槳以及其組合組成的組。3.如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過選自由微陣列技術(shù)、PCR擴(kuò)增、RNA雜交、原位雜交、凝膠電泳及其組合組成的組的一種或多種方法分析所述樣品。4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中分析所述樣品的5種或更多種生物標(biāo)志物。5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中分析所述樣品的10種或更多種生物標(biāo)志物。6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中分析所述樣品的15種或更多種生物標(biāo)志物。7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中分析所述樣品的20種或更多種生物標(biāo)志物。8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中分析所述樣品的25種或更多種生物標(biāo)志物。9.如權(quán)利要求l-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中分析所述樣品的30種或更多種生物標(biāo)志物。10.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中當(dāng)至少分析由SEQIDNO:1-19標(biāo)識(shí)的生物標(biāo)志物時(shí)，將這些生物標(biāo)志物的表達(dá)與肝干細(xì)胞樣肝細(xì)胞癌(HSC-HCC)的存在相關(guān)聯(lián)。11.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中當(dāng)至少分析由SEQIDN0:2、9-17和19-35標(biāo)識(shí)的生物標(biāo)志物時(shí)，將這些生物標(biāo)志物的表達(dá)與膽管上皮細(xì)胞樣肝細(xì)胞癌(BDE-HCC)的存在相關(guān)聯(lián)。12.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中當(dāng)至少分析選自由1-8、11-13、17-18、23、28、29和33-39組成的組的SEQIDNO標(biāo)識(shí)的生物標(biāo)志物時(shí)，將這些生物標(biāo)志物的表達(dá)與肝祖細(xì)胞樣肝細(xì)胞癌(HP-HCC)的存在相關(guān)聯(lián)。13.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中當(dāng)至少分析由SEQIDNO:l、8-12、14-17和19-39標(biāo)識(shí)的生物標(biāo)志物時(shí)，將這些生物標(biāo)志物的表達(dá)與成熟肝細(xì)胞樣肝細(xì)胞癌(MH-HCC)的存在相關(guān)聯(lián)。14.一種在生物樣品中檢測(cè)HCC干細(xì)胞的方法，其包括a)獲得樣品，b)測(cè)定所述樣品以檢測(cè)mir-181生物標(biāo)志物的存在或不存在，以及c)將所述mir-181生物標(biāo)志物的存在或不存在與所述樣品中所述HCC干細(xì)胞的存在或不存在相關(guān)聯(lián)。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述mir-181生物標(biāo)志物選自由mir_181al、mir-181a2、mir-181bl、mir-181b2和mir-181c組成的組。16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中檢測(cè)2種或更多種mir-181生物標(biāo)志物的存在。17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中檢測(cè)3種或更多種所述mir-181生物標(biāo)志物的存在。18.如權(quán)利要求15所述的方法，其中檢測(cè)4種或更多種所述mir-181生物標(biāo)志物的存在。19.如權(quán)利要求14-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品選自由肝臟腫瘤組織、肝臟正常組織、冷凍的活檢組織、石蠟包埋的活檢組織、血清、血槳以及其組合組成的組。20.如權(quán)利要求14-19中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括d)將所述HCC干細(xì)胞的存在與所述樣品中肝細(xì)胞癌細(xì)胞的存在相關(guān)聯(lián)。21.如權(quán)利要求14-20中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過選自由微陣列技術(shù)、PCR擴(kuò)增、RNA雜交、原位雜交、凝膠電泳及其組合組成的組的一種或多種技術(shù)分析所述樣品中所述mir-181生物標(biāo)志物的存在或不存在。22.如權(quán)利要求20所述的方法，其還包括確定所述受治療者的預(yù)后。23.如權(quán)利要求20中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括治療所述受治療者的所述HCC亞型。24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述治療包括選自由肝切除、移植、經(jīng)皮乙醇注射、射頻消融、化療栓塞、化療、基因治療、P-聯(lián)蛋白抑制及其組合組成的組的至少一種操作。25.如權(quán)利要求23-24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述治療包括向所述受治療者施用P-聯(lián)蛋白抑制劑。26.如權(quán)利要求23-25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述治療包括施用有效量的與mir-181互補(bǔ)的核酸，所述mir-181選自由mir-181al、mir-181a2、mir-181bl、mir-181b2、mir-181c及其組合組成的組。27.—種在生物樣品中檢測(cè)HSC-HCC亞型的方法，其包括a)獲得樣品，b)檢測(cè)EpCAM+AFP+干細(xì)胞的存在，以及c)將EpCAM+AFP+干細(xì)胞的存在與所述樣品中所述HSC-HCC亞型的存在相關(guān)聯(lián)。28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中通過測(cè)定所述樣品的mir-181生物標(biāo)志物檢測(cè)所述干細(xì)胞。29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述mir-181生物標(biāo)志物選自由mir-181a1、mir-181a2、mir-181bl、mir-181b2、mir-181c及其組合組成的組。30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中通過選自由免疫熒光、原位雜交、免疫組織化學(xué)分析、冷凍活化的細(xì)胞分選、側(cè)群分析、細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)法及其組合組成的組的方法檢測(cè)所述干細(xì)胞。31.—種藥物組合物，其包括與至少兩種生物標(biāo)志物互補(bǔ)的核酸以及藥學(xué)上可接受的載體，所述生物*示志物選自由mir-181al、mir-181a2、mir—181bl、mir—181b2、mir—181c組成的組。32.—種治療患有HSCHCC亞型的受治療者的方法，其包括施用治療上有效量的一種試劑，所述試劑選自由P-聯(lián)蛋白抑制劑、mir-181生物標(biāo)志物抑制劑及其組合組成的組。33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述mir-181生物標(biāo)志物抑制劑包括一種試劑，所述試劑含有與選自由mir-181a1、mir-181a2、mir-181bl、mir-181b2、mir-181c及其組合組成的組的至少一種生物標(biāo)志物互補(bǔ)的核酸。34.—種治療患有BDE-HCC亞型的受治療者的方法，其包括施用有效量的含有與至少5種生物標(biāo)志物互補(bǔ)的核酸的一種試劑，所述生物標(biāo)志物選自由SEQIDNO:2、9-17和19-35標(biāo)識(shí)的生物標(biāo)志物組成的組。35.—種治療患有HP-HCC亞型的受治療者的方法，其包括施用有效量的含有與至少5種生物標(biāo)志物互補(bǔ)的核酸的一種試劑，所述生物標(biāo)志物選自由SEQIDNO:1-8、11-13、17-18、23、28、29和33-39標(biāo)識(shí)的生物標(biāo)志物組成的組。36.—種治療患有MH-HCC亞型的受治療者的方法，其包括施用有效量的含有與至少5種生物標(biāo)志物互補(bǔ)的核酸的一種試劑，所述生物標(biāo)志物選自由SEQIDNO:1、8-12、14-17和19-39標(biāo)識(shí)的生物標(biāo)志物組成的組。37.—種治療患有HSC-HCC亞型的受治療者的方法，其包括施用有效量的含有與至少5種生物標(biāo)志物互補(bǔ)的核酸的一種試劑，所述生物標(biāo)志物選自由SEQIDNO:1-19標(biāo)識(shí)的生物標(biāo)志物組成的組。38.如權(quán)利要求32-37中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述治療還包括選自由肝切除、肝移植、經(jīng)皮乙醇注射、射頻消融、化療栓塞、化療、基因治療、P-聯(lián)蛋白抑制及其組合組成的組的至少一種操作。39.—種藥物組合物，其包括與由SEQIDNO:1-19標(biāo)識(shí)的至少兩種生物標(biāo)志物互補(bǔ)的核酸和藥學(xué)上可接受的載體。40.—種藥物組合物，其包括與由SEQIDN0:2、9-17和19-35標(biāo)識(shí)的至少兩種生物標(biāo)志物互補(bǔ)的核酸和藥學(xué)上可接受的載體。41.一種藥物組合物，其包括與由SEQIDNO:1-8、11-13、17-18、23、28、29和33-39標(biāo)識(shí)的至少兩種生物標(biāo)志物互補(bǔ)的核酸和藥學(xué)上可接受的載體。42.—種藥物組合物，其包括與由SEQIDNO:1、8-12、14-17和19-39標(biāo)識(shí)的至少兩種生物標(biāo)志物互補(bǔ)的核酸和藥學(xué)上可接受的載體。全文摘要本發(fā)明提供了在受治療者中確定HCC亞型的方法，其包括a)從所述受治療者獲得樣品，b)測(cè)定樣品以檢測(cè)1種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)，以及c)將所述生物標(biāo)志物的表達(dá)與受治療者中的HCC亞型相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明還提供了在樣品中檢測(cè)HCC干細(xì)胞的方法。此外，本發(fā)明提供了用于治療患有HCC的受治療者的方法和組合物，其利用了與HCC干細(xì)胞相關(guān)的生物標(biāo)志物。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101711287SQ200880025276公開日2010年5月19日申請(qǐng)日期2008年6月9日優(yōu)先權(quán)日2007年6月8日發(fā)明者C·M·克羅斯,J·季,T·亞瑪史塔,X·W·王申請(qǐng)人:由衛(wèi)生與公眾服務(wù)部代表的美利堅(jiān)合眾國政府;俄亥俄州立大學(xué)研究基金會(huì)