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      麥芽糖酸作為食物產品中的抗氧化劑的制作方法

      文檔序號:529913閱讀:623來源:國知局

      專利名稱::麥芽糖酸作為食物產品中的抗氧化劑的制作方法
      技術領域
      :本發(fā)明提供使用酶方法用直接由食物產品中已存在的淀粉或麥芽糖產生的抗氧化劑保存食品和飼料產品的方法。本發(fā)明還提供從淀粉或含淀粉產品產生麥芽糖酸(maltobionate)的方法。
      背景技術
      :防止食品和飼料產品的氧化降解對于保持這些產品的質量非常重要。產品中的氧化過程能導致顏色、氣味、芳香上的變化或者其它器官感覺上不可接受的變化。此外,氧化可以引起對必需氨基酸的損害,并導致維生素的損失。具體地,包含多不飽和脂肪酸的食物產品易于氧化,可能產生腐臭的食物產品。當食品分子,例如脂肪酸,在自由基、痕量金屬(如Fe和Cu)或反應性氧種類(reactiveoxygenspecies)(如單線態(tài)氧(singletoxygen)、過氧化物或過氧化氫)存在的情況下與氧組合時會發(fā)生氧化反應。使用抗氧化劑可以抑制這些反應。通常使用的抗氧化劑的實例是丁基羥基苯甲醚(BHA)和丁基羥基甲苯(BHT),其通常在富含脂肪和油的食品中使用,以及亞硫酸鹽,其主要用作抗氧化劑,以防止或減少水果和蔬菜變色(discoloration)。然而,BHA和BHT當在以高濃度使用時容易產生腫瘤,并且因此可能對人類的健康是不安全的,并且已知亞硫酸鹽會破壞維生素B。由于這些原因,通常優(yōu)選生物或天然抗氧化劑,如生育酚(維生素E)、L-抗壞血酸、檸檬酸、蛋白黑素(melanoidin)、類黃酮和五倍子酸。也已經使用螯合劑,如EDTA、鐵載體(siderohore)(來自微生物的鐵螯合劑)、檸檬酸和乳糖酸解決與氧化有關的問題,由于它們具有防止痕量金屬引起氧化的能力。美國專利3,899,604披露了使用劇臭假單胞菌(Pseudomonasgravlolens)菌種,通過發(fā)酵氧化由麥芽糖產生麥芽糖酸,和麥芽糖酸作為食品添加劑的用途;麥芽糖酸略有酸味,還對包含麥芽糖酸的食物產品的粘度有貢獻。此外,麥芽糖酸可以增強某些食物產品的天然氣味和味道(增香劑),如美國專利No.3,829,583所述。然而,未指示麥芽糖酸有助于食品中的抗氧化作用。歐洲專利No.O384534Bl披露了使用洋蔥假單胞菌(Pseudomonasc印acia)菌株,通過發(fā)酵氧化由麥芽糖產生麥芽糖酸。氧化不僅是在長時間保存過程中的問題,而且在生產過程中也能引起產物的不期望的變化,特別是當生產過程中存在氧時。因此,在食品的生產過程中提供天然抗氧化劑的方法是理想的。發(fā)明概述本發(fā)明提供通過酶方法由食品或飼料中存在的淀粉或麥芽糖產生麥芽糖酸,從而阻止食品和飼料產品中的氧化反應的方法。發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明,通過麥芽糖酸可以在食品和飼料產品的制造過程中防止或阻止食品和飼料產品中的氧化反應。就我們所知,這是首次在產生過程中和產生后使用麥芽糖酸作4為食品或飼料中的抗氧化劑。此外,本發(fā)明提供由食品或飼料產品的淀粉組分產生麥芽糖酸的方法,麥芽糖酸在其中起抗氧化劑作用。因此,本發(fā)明的抗氧化劑可以直接由產品中的組分產生,從而提供100%天然抗氧化劑并省略單獨制造和抗氧化劑添加步驟。定義術語"輔助物(adjunct)"應理解為谷物(grist)的一部分,所述谷物不是大麥麥芽。輔助物可以包含任何富含淀粉的植物材料,例如未發(fā)芽的(皿malted)谷物,如大麥、稻、玉米、小麥、黑麥、高粱和可容易發(fā)酵的糖和/或糖漿。如本文所使用的,術語"自食品或飼料產生方法分離的部分"應理解為分離的部分,其基本包含分離出所述部分的方法的一部分中通常使用的所有成分。優(yōu)選地,與其分離出所述部分的方法的一部分中通常存在的淀粉量相比,所述部分包含的淀粉量增加。所述部分可以在生產方法過程中的任何步驟獲得,并且也可以是終產物。在期望淀粉量增加的情況中,可以向分離的部分加入額外量的方法的含淀粉成分或純淀粉。如本文所使用的,術語"谷物"應理解為含淀粉或糖的材料,其為啤酒生產的基礎,例如大麥麥芽和輔助物。本文中使用的術語"分離的酶"指具有所述酶活性的多肽,其中所述多肽至少20%純,優(yōu)選至少40%純,更優(yōu)選至少60%純,甚至更優(yōu)選至少80%純,最優(yōu)選至少90%純,并且甚至最優(yōu)選至少95%純,如通過SDS-PAGE確定的。術語"麥芽"應理解為任何發(fā)芽的谷類谷物,特別是大麥。本文使用的術語"麥芽糖酸"涉及麥芽糖酸(CASReg.No.534-42-9;4-0-a_D_吡喃葡萄糖基-D-葡糖酸)或其鹽。合適的鹽包括,但不限于,麥芽糖酸鈉、麥芽糖酸鈣、麥芽糖酸銨和麥芽糖酸鉀。術語"醪液"應理解為含淀粉漿料,其中包含浸于水中的谷物。術語"純麥芽糖"應理解為組合物,其僅包含麥芽糖、水、無機鹽并可能包含緩沖劑,如無機鹽(例如磷酸鹽、碳酸鹽、氫氧化物鹽,等),有機鹽(例如磷酸檸檬酸鹽(citratephosphate)、乙酸鈉,等),和其它有機緩沖液(例如HEPES、Tris,等)。術語"弱"堿和相對的"強"堿指堿解離的能力。在本上下文中,弱堿定義為pKb值為至少3.5的堿(對于雙質子堿如C032—,此pKb值指第一步的數(shù)值)。術語"麥芽汁"應理解為在糖化過程中提取谷粉后留下的未發(fā)酵液體。酶麥芽糖酸可以通過麥芽糖氧化而產生。氧化可以使用溴化物進行,但是在食品生產方法中這是不理想的。在本發(fā)明中,麥芽糖到麥芽糖酸的轉化是酶反應的結果,其中對于麥芽糖具有底物特異性的氧化還原酶催化轉化。氧化還原酶是催化電子從一個分子轉移至另一個分子的酶。脫氫酶和氧化酶屬于氧化還原酶的酶類。通常,脫氫酶需要存在輔因子,例如NAD/NADP或黃素輔酶,如FAD或FMN,這對于氧化酶也可能如此。除非另外指明,下文和說明書全文所述的酶為分離的酶,必要時具有輔因子。適用于本發(fā)明的氧化還原酶的一個類別是氧化酶,其催化涉及分子氧(02)作為電子受體的氧化/還原反應。在這些反應中,氧還原成水(H20)或過氧化氫(H202)。具體地,糖氧化酶催化麥芽糖轉化為麥芽糖-s-內酯,后者立即在水中分解形成麥芽糖酸。所述方法產生過氧化氫。凈反應方案可描述為麥芽糖+02+H20—麥芽糖酸+H202(方程式1)已知很多能將麥芽糖轉化成麥芽糖酸的合適的糖氧化酶,并且技術人員可以得到這些酶。這些糖氧化酶的實例是醛糖氧化酶、纖維二糖氧化酶(EC1.1.99.18)、吡喃糖氧化酶(EC1.1.3.10),和己糖氧化酶(EC1.1.3.5)。通過研究EC1.1.3._、EC1.2.3._、EC1.4.3._和EC1.5.3._或根據(jù)國際生物化學與分子生物學聯(lián)合會(InternationalUnionofBiochemicstryandMolecularBiology)(IUBMB)命名委員會的推薦的相似酶類,本領域技術人員可容易地識別有用的糖氧化酶的其它實例。優(yōu)選的糖氧化酶是微生物糖氧化酶,特別是分離的糖氧化酶。己糖氧化酶(EC1.1.3.5)是能氧化幾種糖的糖氧化酶,所述糖包括葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、纖維二糖和乳糖。屬于己糖氧化酶類的酶是本發(fā)明中優(yōu)選的酶。己糖氧化酶由幾種海洋藻類物種天然產生。這些物種可在例如杉藻科(familyGigartinaceae)中發(fā)現(xiàn),其屬于杉藻目(orderGigartinales)。產生己糖氧化酶的屬于杉藻科的藻類物種的實例是皺波角叉菜(Chondruscrispus)和紅藻(Iridophycusflacci)。包括物種Euthoracristata的海蘿目(orderCryptomeniales)的藻類物種也是適用于本發(fā)明的己糖氧化酶的可能來源。具體地,適用于本發(fā)明的己糖氧化酶例如提取自紅藻(Iridophycusflaccid咖)(Bean和Hassid,1956,JBiolChem218:425-436)或芻皮波角叉菜,或者如W096/40935所述提取自Euthoracristata,W096/40935進一步描述了從鈹波角叉菜克隆并重組表達己糖氧化酶,如W096/40935中SEQIDNO:30和31所示。纖維二糖氧化酶(EC1.1.99.18)是能氧化幾種糖的糖氧化酶,所述糖包括纖維二糖、可溶纖維低聚糖、乳糖、木二糖和麥芽糖。屬于纖維二糖氧化酶類的酶也是本發(fā)明中優(yōu)選的酶。纖維二糖氧化酶是由多種木材降解真菌產生的胞外酶,如白腐真菌黃孢原毛平革菌(PhanerochaeteChrysosporium)、褐腐真菌粉孢革菌(ConiophoraPuteana)禾口軟腐真菌如叢梗孢屬菌種(Moniliasp.)、纖維素分解毛殼菌(Chaetomiumcellulolyticum)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)(嗜熱側孢霉(Sporotrichumthermophila))、齊整小核菌(Scleroti墜olfsii)和特異腐質霉(Schou等,1998,BiochemicalJournal330:565-571)。其它合適的糖氧化酶可以源自,例如有絲分裂孢子核菌綱(Pyrenomycetes)如枝頂孢霉屬(Acremonium),具體地,以ATCC34717保藏的點枝頂孢霉(A.strict咖)或點枝頂孢霉Tl(Lin等,1991,BiochimicaetBiophysicaActa1118:41-47);或以IFO31197保藏的A.potronii。在優(yōu)選的方面,糖氧化酶獲得自(Lin等,1991,BiochimicaetBiophysicaActa1118:41-47)以及JP5084074中披露的來源。在另一個優(yōu)選的實施方案中,糖氧化酶是獲得自真菌的糖氧化酶,所述真菌屬于微結節(jié)菌屬(Microdochium),更優(yōu)選其中所述真菌是雪霉葉枯菌(Microdochiumnivale),并且甚至最優(yōu)選其中所述真菌是以CBS100236保藏的雪霉葉枯菌。在WO99/31990中詳細描述了分離自CBS100236的氧化酶(W099/31990的SEQIDNO:1和2通過提述并入本文)。先前已經描述了通過在包含麥芽糖的底物上生長的假單胞菌屬細菌的發(fā)酵而產6生麥芽糖酸(US2'496,297、US3,862,005、US3,899,604和EP384534)。本發(fā)明也可使用脫氫酶。這些脫氫酶系統(tǒng)可以分離自假單胞菌屬,具體地分離自卵狀假單胞菌(P.ovalis)、灰白色假單胞菌(P.schuylkilliensis)、劇臭假單胞菌(P.graveolens)(例如以IFO3460保藏)、莓實假單胞菌(P.fragi)、碘假單胞菌(P.iodin咖)、P.amyloderamosa(例如以ATCC21262保藏)或洋蔥假單胞菌(例如以CBS659.88或CBS658.88保藏)。使用的氧化酶/脫氫酶的量通常將取決于特定的要求和特定的酶。氧化酶加入的量優(yōu)選足以在特定時間內產生麥芽糖到麥芽糖酸的期望程度的轉化。通常,約1至約100000XU每kg底物的氧化酶加入是足夠的,特別是約5至約50000XU每kg底物,并且更特別地約5至約5000XU每kg底物。調整麥芽糖到麥芽糖酸的轉化所需的特定酶的量是技術人員的公知常識。在文獻中,氧化酶單位(OXU)通常定義為在特定條件下氧化一微摩爾麥芽糖的酶量。然而,在本文提供的實例中,OXU定義為一mg純氧化酶_相對于酶標準物測定。在本發(fā)明的另一個方面,通過兩個酶催化的反應產生麥芽糖酸。第一個反應使用淀粉酶,由食品或飼料生產過程中存在的淀粉組分形成麥芽糖。第二個反應如上述方面所述,將麥芽糖氧化成麥芽糖酸。這兩個反應能同時或順序進行。在優(yōu)選的實施方案中,淀粉酶反應首先進行,然后是麥芽糖到麥芽糖酸的反應。淀粉酶能水解淀粉形成寡糖作為主要產物,具體為麥芽糖,這是技術人員公知的方法。淀粉酶可以源自細菌或真菌,具體來自曲霉屬(Aspergillus)的菌株,優(yōu)選黑曲霉(A.niger)或米曲霉(A.oryzae)的菌株,或者源自芽孢桿菌屬(Bacillus)的菌株。一些實例是a-淀粉酶,例如來自解淀粉芽孢桿菌,和淀粉葡糖苷酶,例如來自黑曲霉。商業(yè)產品包括BAN和AMG(NovoNordiskA/S,Denmark的產品),GrindamylA1000或A5000(可由GrindstedProducts,Denmark獲f尋)禾口淀私、醇H禾口淀私、醇P(Gist—Brocades,TheNetherlands的產品)??梢灶愃频厥褂肞_淀粉酶或導致麥芽糖形成的其它淀粉降解酶。在本發(fā)明的另一個方面,加入過氧化氫酶(EC1.11.1.6)以防止限制由糖氧化酶驅動的反應,并消除終產物中不期望的&02。過氧化氫酶是催化下述反應的酶<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(方程式2)。如上所述,糖氧化酶依賴于氧,但是產生過氧化氫。向本發(fā)明的方法加入過氧化氫酶的優(yōu)勢是與氧一起提供糖氧化酶,并且同時去除具有強氧化性的過氧化氫。如果作為食品或飼料產生方法的整合的部分而產生麥芽糖酸,這就是特別恰當?shù)摹<夹g人員已知很多合適的過氧化氫酶,例如,商業(yè)上可得到的過氧化氫酶,來自NovozymesA/s的Catazyme⑧。生產通過發(fā)酵,例如使用生長在含麥芽糖底物上的假單胞菌屬的細菌來產生麥芽糖酸是本領域公知的(US2,496,297、US3,862,005、US3,899,604和EP384534)。此外,W099/31990描述了使用糖氧化酶將純麥芽糖氧化成麥芽糖酸。本發(fā)明的一個方面涉及麥芽糖酸的產生,通過加工食品或飼料生產中天然存在的淀粉和/或麥芽糖,在與實際的食品或飼料生產分開的反應中進行。用于產生麥芽糖酸的方法包括下述步驟i)獲得可用于飼料或食品產生方法中的含淀粉和/或麥芽糖底物;ii)通過酶反應將淀粉轉化成麥芽糖;禾口iii)通過酶反應將麥芽糖轉化成麥芽糖酸??梢约兓矸鄄糠?,從而在轉化成麥芽糖之前富集淀粉含量。步驟ii)中的酶反應優(yōu)選由淀粉酶催化。如果步驟i)中的底物包含麥芽糖,則可以省略步驟ii)。步驟iii)中的酶反應由氧化還原酶/脫氫酶,優(yōu)選由上述糖氧化酶之一,甚至更優(yōu)選由上述己糖氧化酶之一,并且最優(yōu)選由可獲得自以CBS100236保藏的雪霉葉枯菌的糖氧化酶催化。步驟ii)和步驟iii)可以作為一個步驟或者作為兩步驟方法進行,其中可以向反應混合物一起加入淀粉酶和糖氧化酶,或者使淀粉酶在向反應混合物加入糖氧化酶之前以單獨的步驟作用于淀粉。所述方法導致淀粉/麥芽糖幾乎完全轉化成麥芽糖酸,底物中優(yōu)選80%,更優(yōu)選85%,更優(yōu)選90%,甚至更優(yōu)選95%,最優(yōu)選99%,并且甚至最優(yōu)選100%淀粉和/或麥芽糖轉化成麥芽糖酸??梢詫Ⅺ溠刻撬嵋云谕牧考踊厥称坊蝻暳袭a品中。任選地,如果純度不足的話,可以純化在上述方法中獲得的麥芽糖酸。本方法的優(yōu)勢是使用的組分為食品或飼料生產中總要使用的那些組分,因此麥芽糖酸并未源自任何添加劑。優(yōu)選地,獲得自食品或飼料產品的包含淀粉和/或麥芽糖的部分包含5%_60%,更優(yōu)選10%_40%,甚至更優(yōu)選15%_30%,甚至更優(yōu)選20%_25%的淀粉和/或麥芽糖。所述方法的另一個優(yōu)勢是來自食品或飼料產品的其它組分不會使方法復雜化。由于食品或飼料產品中其它組分而使方法復雜的因素可以是例如由于糖氧化酶可能需要向反應混合物中加入氧而形成泡沫,這能在包含蛋白質的反應混合物中產生泡沫。使用淀粉酶將淀粉轉化成麥芽糖的條件通常在本領域中已知。需要時,技術人員如下所述能選擇與麥芽糖轉化成麥芽糖酸的條件相容的條件。包含淀粉和/或麥芽糖的底物可以例如獲得自食品或飼料產生方法,在所述方法中使用例如竹芋、大麥、木薯、玉米、玉蜀黍、小米、燕麥、馬鈴薯、稻、黑麥、西米、大豆、高粱、甘薯和/或小麥。天然存在淀粉和/或麥芽糖的食品產生方法是例如啤酒釀造、一些白酒或烈酒的生產、軟飲料生產、烘培、炸薯片(chips)或小吃食品生產。具體地,在啤酒釀造方法中,麥芽糖天然存在,因為糖化(mashing)方法產生麥芽糖用于發(fā)酵。具體地,麥芽汁含有高麥芽糖含量。本發(fā)明的方法所使用的包含淀粉和/或麥芽糖的底物可以是如上所述包含純淀粉的原材料,優(yōu)選通過例如研磨或碾磨而粉碎并懸浮于液體中的原材料?;蛘撸梢允谦@得自食品或飼料產生方法的部分,如醪液、麥芽汁、小吃食品、炸薯條和用于制備軟飲料的制備物。優(yōu)選地,本發(fā)明的方法所使用的包含淀粉和/或麥芽糖的底物不構成純麥芽糖。用于產生麥芽糖酸的方法必須在允許糖氧化酶將麥芽糖轉化成麥芽糖酸的條件下進行。這些條件包括,但不限于,溫度、pH、氧、糖氧化酶的量和性質,其它添加劑例如過氧化氫酶和反應/溫育時間。合適的溫育時間應允許一定程度的麥芽糖到感興趣的麥芽糖酸的轉化。通常,合適的溫育時間選自1/2小時到3天的范圍,優(yōu)選地,2小時到48小時,更優(yōu)選從5小時到24小時,最優(yōu)選從8小時到18小時。氧是本方法中的重要因素,因為麥芽糖到麥芽糖酸的轉化消耗氧(參見上面的等8式1)。因此,如果在酶反應方法中監(jiān)控氧,通??捎^察到氧量的初始下降,例如如果恒量供氣時,當酶反應終止時,氧量將回到大約初始水平。當氧回到初始水平的大于90%時,酶反應已經停止或者至少顯著減慢,說明所有底物(例如淀粉、糊精和/或麥芽糖)已被處理成為麥芽糖酸。因此,合適的溫育時間可優(yōu)選至少持續(xù)直至生產批次中氧水平回到初始水平的大于90%,特別是如果期望麥芽糖的最大轉化時?;蛘?,能通過需要保持pH恒定所需的堿量來監(jiān)控反應。當需要維持pH所需的堿量下降時,表明反應已經停止或至少顯著減慢。然而,酶反應的下降可不僅僅由于底物的耗盡。酶隨時間的穩(wěn)定性也是可能影響反應的參數(shù)。因此,如果酶隨時間降解,這也可能引起反應減慢。在這種情況下,底物的加入不會導致氧和pH重新下降。合適的氧來源包括大氣空氣(約20%氧)、富氧的大氣空氣(氧含量>20%)和純氧。在高于1大氣壓的壓力下運行方法可增加氧的溶解度,并且在適當時候可為優(yōu)選的??梢韵蚍椒ü┭?,例如在溫育方法中連續(xù)將空氣混合入反應混合物。提供02的另一個選擇是通過在存在過氧化氫酶的情況下加入H202(參見上面的方程式2)?;蛘撸梢允褂糜商茄趸柑烊划a生的11202。當使用固定化酶進行方法時,使用H202作為氧來源可為特別優(yōu)選,在這種情況下氧的加入更困難,或者例如在包含蛋白質的反應混合物中,由于通過將空氣混合入反應中來加入氧而導致形成泡沫是一個問題??梢栽谌魏魏线m的時間例如與糖氧化酶一起加入過氧化氫酶,或者在反應方法中加入,這時02水平下降,優(yōu)選在溫育開始時(時間=0)加入過氧化氫酶。與糖氧化酶一起加入過氧化氫酶的優(yōu)勢是氧需求可以顯著降低(達到50%)。因此,供氧,例如以空氣形式供氧,可以顯著降低。實際上,通過與&02—起加入足量的過氧化氫酶可能完全省略供氧。額外加入的11202可以源自任何商業(yè)來源。因此,本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是通過加入過氧化氫酶獲得麥芽糖氧化成麥芽糖酸所需的基本上所有的氧,所述過氧化氫酶通過轉化可用的H202而產生所需的氧。如果H202的量限制了方法,則可以加入額外的H202。在本上下文中,使用表述"基本上所有的氧"描述酶反應充分作用所需的氧供應,并且特別地,不需要在方法過程中主動地加入額外的氧。在優(yōu)選的實施方案中,加入過氧化氫酶的量與無過氧化氫酶的相似方法相比降低了H202濃度。更優(yōu)選地,向如本文所述方法中加入的過氧化氫酶量是與可比的對照方法相比足以獲得H202量的至少25%、50%、75%、85%或95%降低,所述對照方法中唯一可比的差異是未加入過氧化氫酶;甚至更優(yōu)選地,向如本文所述的方法加入的過氧化氫酶量是與可比的對照方法相比足以獲得^02量的100%降低,所述對照方法中唯一可比的差異是未加入過氧化氫酶。優(yōu)選地,加入的過氧化氫酶量還可改進麥芽糖到麥芽糖酸的轉化程度。溫育溫度通常依賴于使用的糖氧化酶,并且通常根據(jù)糖氧化酶的最適反應溫度而選擇。然而,因為氧溶解度隨著溫度的增加而下降,所以要考慮其它因素來獲得最優(yōu)方法。技術人員知道如何相對于例如酶活性和氧溶解度平衡最適溫度。通常,合適的溫度為約(TC至約99°C的范圍中,更優(yōu)選5°C至90°C的范圍中,甚至更優(yōu)選在15°C至85°C的范圍中,最優(yōu)選在25t:至8(TC的范圍中,甚至最優(yōu)選在3(TC至6(TC的范圍中。最適pH可以依賴于使用的糖氧化酶而變化。然而,來自雪霉葉枯菌的糖氧化酶的動力學分析(Nordkvist等,2007,Biotechno1Bioeng97:694-707)表明,使用強堿(Na0H)可以影響糖氧化酶的穩(wěn)定性。此外,W097/004082描述了當方法在穩(wěn)定的pH進行時,使用糖氧化酶可以獲得增加的乳糖醛酸的產量(yield)。因此,為了增加本方法的麥芽糖酸產量,可為理想的是在麥芽糖轉化成麥芽糖酸的過程中(上文的步驟iii),通過加入足夠的堿將pH維持在穩(wěn)定水平。在特定的實施方案中,通過加入堿,將穩(wěn)定的pH水平維持在約3.0至約9.0的范圍中。可使用任何堿將pH維持在指定的范圍內。原則上,本方法可以使用能中和所產生的酸的任何物質。技術人員了解多種能用于本發(fā)明的方法中的堿,例如強堿如Ca(OH)2、KOH、NaOH和Mg(OH)2。在優(yōu)選的實施方案中,使用弱堿或碳酸鹽將pH維持在穩(wěn)定水平。弱堿的實例包括,但不限于,CaC03、Na2C03、K2C03、(NH4)2C03和NH4OH。目前,優(yōu)選的弱堿是NH4OH和Na2C03。對于感興趣的特定方法,優(yōu)選的穩(wěn)定pH依賴于很多因素,如技術人員所理解的。例如,如果食物產品是啤酒,麥芽汁的生產pH已知為約5.0至5.7,優(yōu)選約5.1至5.3。因此,優(yōu)選將pH維持在約5.3的穩(wěn)定水平,如pH5.0至5.6。對于其它食品/飼料產品,優(yōu)選的pH范圍可為pH3.0至4.0的范圍中,例如對于果汁或軟飲料如可樂;或者在4.0至5.0的范圍中,例如啤酒或蛋黃醬或沙律汁;或者在5.6至6.5的范圍中,例如肉制品;或在從6.6至7.5的范圍中,例如乳和蛋產品。應了解的是,在進行的酶轉化之后或其結束時,還可以將根據(jù)本發(fā)明的麥芽糖酸產品或包含麥芽糖酸的組合物的pH調至優(yōu)選的pH水平。例如當已經實現(xiàn)麥芽糖的95%的期望轉化時,可以使PH下降至期望水平。在本上下文中,"穩(wěn)定pH水平"可廣義地理解為通過加入堿,在方法過程中將pH控制和維持在特定范圍內,或者接近/處于特定值。在酶方法過程中pH的控制和調整/維持是標準步驟,其能以非常高的精確度進行。因此,穩(wěn)定的pH可為維持在恒定水平的數(shù)值,變動小于1.5pH單位,優(yōu)選小于1.OpH單位,更優(yōu)選小于O.5pH單位,更優(yōu)選小于0.3pH單位,甚至更優(yōu)選小于0.2或0.lpH單位。由此可對于根據(jù)本發(fā)明的特定酶方法確定最優(yōu)范圍,并且可以在這個范圍內以所述精確度控制和維持pH。在本發(fā)明的方法中,合適的特定pH范圍或特定的pH值選自約pH3至約pH9的范圍內。優(yōu)選從酶反應開始如本文所述將pH維持在穩(wěn)定的pH水平。換句話說,在向包含麥芽糖的產品加入氧化酶后立即加入堿,以維持如本文所述的穩(wěn)定的PH。特別地,如果期望麥芽糖的最大轉化,則將pH維持在如本文所述的穩(wěn)定水平一段時間,其至少持續(xù)至反應混合物的氧水平回到初始水平的多于90%,或者用于保持pH恒定的堿量與期望的轉化程度相對應。優(yōu)選地,將pH維持在如本文所述的穩(wěn)定的pH水平一段時間,30分鐘到3天,優(yōu)選2小時到48小時,更優(yōu)選5小時到24小時,最優(yōu)選8小時到18小時。在本發(fā)明的特定實施方案中,麥芽糖到麥芽糖酸的轉化在獲得自糖化方法的麥芽汁批料上進行。包含麥芽糖酸的麥芽汁可以用作系列麥芽汁批料的成分用于啤酒生產。在本發(fā)明的另一個特定實施方案中,淀粉到麥芽糖到麥芽糖酸的轉化在糖化方法之前在醪液批料上進行。方法可以包括將淀粉酶與糖氧化酶一起加入。包含麥芽糖酸的醪液可以用作系列糖化方法中的成分。本發(fā)明的特定方面涉及在將麥芽糖到麥芽糖酸的酶轉化中獲得增加的產量和/或減少的反應時間的方法。方法由下述步驟定義i)向包含麥芽糖的底物加入糖氧化酶;ii)在允許糖氧化酶將麥芽糖轉化成麥芽糖酸的條件下溫育底物;禾口iii)通過加入堿,在步驟ii)的過程中將pH維持在約3.0至約9.0的范圍中。在這個特定的方面,用于麥芽糖酸生產的底物可以構成純麥芽糖。優(yōu)選地,通過使用例如如上所述的淀粉酶的酶反應,將例如來自飼料或食品產生方法的淀粉轉化成麥芽糖而獲得底物。明顯地,本發(fā)明公開的方法本身可用于麥芽糖酸的工業(yè)生產。然而,這些方法還可以形成用于生產食品或飼料產品的制造方法的一部分,此時在生產過程中天然存在麥芽糖。本發(fā)明的另一個方面涉及通過加工天然存在于方法中的淀粉和/或麥芽糖而在食品或飼料產生方法中直接(原位)產生麥芽糖酸。因此,在這個方面,麥芽糖酸是在食品或飼料產生過程中如此形成,而不是在如上所述的單獨反應中形成。用于產生麥芽糖酸的方法(其中所述方法整合入飼料或食品產生方法中)包括以下步驟i)向食品或飼料產生方法中加入氧化還原酶或脫氫酶,優(yōu)選糖氧化酶;ii)在允許麥芽糖到麥芽糖酸的酶轉化的條件下保持所述方法;iii)繼續(xù)進行食品或飼料產生方法??梢酝ㄟ^淀粉降解反應進行步驟i)中的酶反應,例如由淀粉酶催化,所述淀粉酶可為內源提供的(例如來自已經存在于方法中的麥芽),或者外源提供的(例如通過在步驟i)的酶之前與步驟i)的酶一起加入)。允許進行酶轉化的糖氧化酶和條件基本上與上述相同。然而,對于最適溫度,應該考慮到反應在食品/飼料產生方法中進行。因此,這樣的方法的優(yōu)勢為,糖氧化酶能在最適溫度進行。在食品或飼料產生方法過程中直接產生麥芽糖酸的優(yōu)勢是一旦將方法優(yōu)化,將不再需要為產生麥芽糖酸而進行的單獨產生步驟。在本發(fā)明的特定實施方案中,在啤酒生產的子方法,如糖化方法或發(fā)酵方法過程中,通過向該子方法加入糖氧化酶和可能的過氧化氫酶而產生麥芽糖酸。麥芽糖到麥芽糖酸的轉化可以在糖化前,或者在糖化方法過程中或在發(fā)酵前烹煮麥芽汁后,或者甚至在發(fā)酵過程中在醪液(谷物+流體)中進行。然而,后者需要食品準用的(food即proved)酶。然而,麥芽汁中麥芽糖的存在是將麥芽汁發(fā)酵成為啤酒所需要的。因此,麥芽糖到麥芽糖酸的轉化必須經過優(yōu)化,使得麥芽糖僅部分轉化成麥芽糖酸。優(yōu)選地,麥芽汁包含高達2%麥芽糖,更優(yōu)選高達5%麥芽糖,并且最優(yōu)選高達10%麥芽糖。糖化方法在溫度上通常采用受控的逐步增加,其中每個步驟相對于其他更偏好一種酶作用,最后降解蛋白質、細胞壁和淀粉。糖化溫度曲線(profile)通常在本領域中已知。在本發(fā)明中,麥芽糖到麥芽糖酸的轉化優(yōu)選與55t:-66t:的糖化(淀粉降解)步驟相關發(fā)生。在優(yōu)選的實施方案中,糖氧化酶在這個溫度范圍有活性?;蛘?,糖化方法可以在較低的溫度保持足夠長的時間,以允許淀粉轉化成麥芽糖,再轉化成麥芽糖酸,在所述溫度糖氧化酶有活性。在這個步驟可以外源加入淀粉酶,促進淀粉轉化成麥芽糖。在本發(fā)明的另一個實施方案中,在啤酒發(fā)酵后產生麥芽糖酸。在這種情況下,需要的麥芽糖的量必須與糖氧化酶和可能的過氧化氫酶一起提供,因為在發(fā)酵過程中所有可用的麥芽糖都已被同化。在本發(fā)明的另一個實施方案中,食物產品是特征為具有高淀粉含量,即>25%,更優(yōu)選高于50%,和高脂質含量,即>10%,更優(yōu)選高于15%的小吃食品。淀粉酶、糖氧化酶和可能的過氧化氫酶可以與常規(guī)成分一起加入小吃食品中,所述常規(guī)成分例如蛋白質,如乳品或乳粉、麩質(gluten)和大豆;蛋類(完整的蛋、蛋黃或蛋白);油酥(shortening)如粒狀脂肪或油;還原劑如L-半胱氨酸;糖;鹽如氯化鈉、乙酸鈣、硫酸鈉或硫酸鈣。直接在小吃食品中產生麥芽糖酸可以在一定程度上取代常規(guī)的抗氧化劑如抗壞血酸、溴酸鉀、碘酸鉀、偶氮二甲酰胺(azodicarbonamide)(ADA)或過硫酸銨?;蛘?,方法可以按照本發(fā)明的第一方面進行,其中向來自小吃食品生產的淀粉材料的批料中加入淀粉酶、糖氧化酶和可能的過氧化氫酶。在這種情況下,可以確保該批料中麥芽糖到麥芽糖酸的高轉化率并且該批料的一部分可以加回至小吃食品產生中。麥芽糖酸純化任選地,可能以任何合適的方式純化麥芽糖酸,以獲得具有期望程度的麥芽糖酸純度的麥芽糖酸產品或包含具有期望程度的麥芽糖酸純度的麥芽糖酸的組合物。技術人員知道如何進行麥芽糖酸的純化,并且依賴于感興趣的特定需要,可以獲得包含至少70%麥芽糖酸,至少80%,至少90%麥芽糖酸或甚至至少95%或至少99%麥芽糖酸的組合物。用于純化麥芽糖酸的合適方法包括過濾、離子交換、濃縮和干燥。包含麥芽糖酸的組合物可以用于食物產品例如食物添加劑或食物成分的生產,特別是作為食物產品中的抗氧化劑。麥芽糖酸在食品和飼料產品中的用途本發(fā)明還涉及麥芽糖酸作為食品或飼料產品中抗氧化劑,特別是作為螯合劑的用途。在本發(fā)明的一個方面,以有效量向食品或飼料產品中加入麥芽糖酸。技術人員能鑒定在食品或飼料產品中獲得抗氧化作用所需的麥芽糖酸的量。還可以如上文所述在生產方法過程中提供麥芽糖酸。在生產方法不天然包含淀粉或麥芽糖的情況中,可以在方法的過程中加入麥芽糖酸?;蛘?,可以向最終的食品或飼料產品加入麥芽糖酸。在本發(fā)明中,向食品或飼料產品加入麥芽糖酸的目的是其抗氧化作用,而不是對食物產品粘度的影響,也不是其增強某些食物產品的天然氣味和味道的能力(增香劑)。實施例實施例1麥芽糖酸的產生通過由糖氧化酶(M.NivaleCBS100236,如W099/31990中所述)和過氧化氫酶(Catazyme25L,Novozymes,Denmark)催化的氧化從麥芽糖產生麥芽糖酸鈉。酶劑量為糖氧化酶400mg酶蛋白質/kg麥芽糖和,過氧化氫酶6g/kg麥芽糖。將麥芽糖以10%的濃度在38t:溶解。使用包含3L溶液的攪拌反應器進行反應。在反應過程中,以1L/分鐘加入大氣空氣,并且通過連續(xù)加入1MNa2C03溶液而將pH恒定保持在6.4。總反應時間為17小時。在反應過程中,基本上所有的麥芽糖都轉化成麥芽糖酸。實施例2通過鐵還原抗氧化力(FRAP)測定法測量麥芽糖酸的抗氧化作用簡言之,F(xiàn)RAP測定法如下起作用將Fe"-三吡啶基三嗪(TPTZ)復合物在低pH還原成Fe"-TPTZ。亞鐵(Fe2+)形式為藍色,并且能在593nm通過分光光度計測量。方法用已知濃度的Fe2+溶液校準。吸光度越高意味著抗氧化狀態(tài)越高。對于FRAP測定法,由下述組分制備作用試劑乙酸鹽緩沖液3.lgCH3C00Na3H20和16mL濃CH3C00H于約800mL水溶液中。核對pH為3.6。否則用Na0H/CH3C00H調整。加水至1L。TPTZ溶液10mmol/L2,4,6_三(2-妣啶基)-s-三嗪(TPTZ)于40mmol/LHC1中。Fe(III)溶液20mMFe(III)CL36H20。作用試劑(每天制備):50mL乙酸鹽緩沖液+5.OmLTPTZ溶液+5.OmLFe(III)溶液。通過向2mL深色印pendorf小瓶中的1.5mL作用試劑加入50yL樣品/標準/空白,然后在熱混合儀中在37t:溫育30分鐘而進行測定。樣品由不同濃度的麥芽糖酸組成,標準包含F(xiàn)e2+和抗壞血酸,并且空白是水樣品。一式三份進行測定。立即讀取593nm處的吸光度,吸光度越高則抗氧化狀態(tài)越高(tAbs—抗氧化劑t)。結果示于表l中。[cmo]表1:FRAP中麥芽糖酸鈉(g/L)在593nm處的吸光度(Abs)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>麥芽糖酸通過還原Fe(III)而表現(xiàn)出抗氧化能力,并且因此由于亞鐵-三吡啶基三嗪復合物而使吸光度改變。測定顯示清晰的抗氧化劑劑量響應作用。實施例3糖氧化酶和/或過氧化氫酶在啤酒麥芽汁中的抗氧化作用在53t:在250g水中由經過充分修飾的大麥麥芽50g產生啤酒麥芽汁。使用以下溫度譜將大麥麥芽制成醪液52°C30分鐘,以1°C/分鐘增加進行11分鐘,63t:30分鐘,以TC/分鐘增加進行9分鐘,72。C30分鐘,以TC/分鐘增加進行6分鐘,78。C15分鐘,然后冷卻至20°C。通過向麥芽汁加入糖氧化酶和/或過氧化氫酶而進行一系列實驗,并與對照樣品比較。在糖化步驟之前加入酶。根據(jù)以LOXU測量的活性配入糖氧化酶,其中一LOXU對應于lmg酶蛋白。根據(jù)以CIU測量的活性配入的過氧化氫酶。1CIU是在pH=7.0和T=25°C每分鐘分解1微摩爾H202的酶量。為了測量糖氧化酶和/或過氧化氫酶的抗氧化能力,向所有樣品加入lmMFe2+。使用二甲酚橙復合物測定法(XO-測定法)間接測量氧化。在這個測定法中,麥芽汁中的過氧化氫將二甲酚橙復合物中的Fe2+氧化成Fe3+,其與二甲酚橙形成有色復合物??梢酝ㄟ^分光光度計測量氧化的復合物,吸光度越低則抗氧化狀態(tài)越高(IAbs—抗氧化劑t)。由下述組分制備XO作用試劑A:2.5mM六水合硫酸亞鐵銨,1.OmM二甲酚橙四鈉鹽(XO)于1250mMH2S04中。B:4.89mM丁基化的羥基甲苯(BHT)于甲醇中。XO作用試劑將1份A和9份B混合。如果保存在深色瓶中可在冰箱中穩(wěn)定1個月。通過向900ii1XO作用試劑中加入100ii1樣品而開始測定。在室溫攪拌溫育30分鐘。在20°C以14000rpm將每個樣品離心10分鐘。在560nm用分光光度計測來上清液的吸收。由于有色XO復合物及Fe2+氧化成Fe3+的增加,所有樣品中的吸光度都增加。具有50L0XU的麥芽汁樣品與對照相比防止氧化的形成(對照的吸光度=0.410,而對于50L0XU則為0.257)。當劑量為一半即25L0XU時作用不良(吸光度=0.421),然而可通過與600CIU過氧化氫酶組合而改善(吸光度=0.308)。1200CIU的過氧化氫酶也可防止形成有色復合物(吸光度=0.264),并且作用是劑量依賴型的,因為600CIU與對照幾乎沒有不同(吸光度=0.439)。權利要求用于產生麥芽糖酸的方法,包括下述步驟a)獲得適用于飼料或食品生產方法的包含淀粉和/或麥芽糖的底物;b)通過酶反應將淀粉轉化成麥芽糖;和c)通過酶反應將麥芽糖轉化成麥芽糖酸。2.根據(jù)權利要求l的方法,其中步驟b)中的酶反應由淀粉酶催化。3.根據(jù)權利要求l或2的方法,其中權利要求l的步驟c)中的酶反應由氧化還原酶催化。4.根據(jù)權利要求3的方法,其中氧化還原酶是糖氧化酶。5.根據(jù)權利要求4的方法,其中糖氧化酶選自己糖氧化酶、纖維二糖氧化酶、醛糖氧化酶和吡喃糖氧化酶。6.根據(jù)權利要求4的方法,其中糖氧化酶可由以CBS100236保藏的雪霉葉枯菌(Microdochiumnivale)獲得。7.根據(jù)前述權利要求中任一項的方法,其中權利要求l的步驟a)中包含淀粉和/或麥芽糖的底物包含麥芽糖,并且省略權利要求1的步驟b)。8.根據(jù)權利要求1至6中任一項的方法,其中步驟b)和步驟c)中催化酶反應的酶同時加入。9.根據(jù)前述權利要求中任一項的方法,其中向所述方法加入過氧化氫酶。10.根據(jù)權利要求9的方法,其中向權利要求l的步驟c)中的酶反應加入過氧化氫酶。11.根據(jù)前述權利要求中任一項的方法,其中包含淀粉和/或麥芽糖的底物是自食品或飼料生產方法分離的部分。12.根據(jù)權利要求11的方法,其中所述部分獲得自醪液。13.根據(jù)權利要求11的方法,其中所述部分獲得自麥芽汁。14.根據(jù)權利要求11至13中任一項的方法,其中在權利要求1的步驟b)或c)的酶方法之前,向所述部分加入額外量的淀粉或含淀粉底物。15.根據(jù)權利要求1至10中任一項的方法,其中所述方法整合入飼料或食品產生方法,由此在飼料和/或食品產生過程中形成麥芽糖酸。16.根據(jù)權利要求15的方法,其中向食品或飼料產生方法加入權利要求l的步驟c)的酶。17.根據(jù)權利要求15或16的方法,其中所述食品產生方法是啤酒產生中的子方法。18.根據(jù)權利要求17的方法,其中所述子方法是糖化(mashing)方法。19.根據(jù)前述權利要求中任一項的方法,其中通過在所述方法過程中加入堿而將權利要求1的步驟c)維持在穩(wěn)定的pH水平。20.根據(jù)權利要求19的方法,其中穩(wěn)定的pH水平是維持在恒定水平,而變動小于1.5pH單位,優(yōu)選小于1.0pH單位,并且最優(yōu)選小于0.3pH單位的pH值。21.根據(jù)權利要求19或20的方法,其中所述pH值選自3.0至9.0的范圍,優(yōu)選4.5至6.5的范圍,并且甚至更優(yōu)選在5.0至5.7的范圍。22.根據(jù)權利要求21的方法,其中所述pH值是5.3。23.根據(jù)權利要求19至22中任一項的方法,其中權利要求1)的步驟a)的包含淀粉和/或麥芽糖的底物包含純麥芽糖,并且省略權利要求1的步驟b)。24.麥芽糖酸在食品或飼料產品中作為抗氧化劑的用途。25.麥芽糖酸在食品或飼料產品中作為螯合劑的用途。26.根據(jù)權利要求24或25的用途,其中所述食物產品是麥芽汁或啤酒。27.在食品或飼料產生方法過程中防止氧化的方法,所述方法包括進行權利要求ll的方法,然后將由所述方法獲得的產品的一部分加回所述食品或飼料產生中。28.根據(jù)權利要求27的方法,其中所述食品產生方法是糖化或啤酒發(fā)酵方法。29.在食品或飼料產生方法過程中防止氧化的方法,所述方法包括進行根據(jù)權利要求15至18中的一項的方法。30.根據(jù)權利要求29的方法,其中所述食品生產方法是糖化或啤酒發(fā)酵方法。31.在食品或飼料產物中防止氧化的方法,所述方法包括向所述產物加入有效量的麥芽糖酸。32.根據(jù)權利要求31的方法,其中所述食物產品是麥芽汁或啤酒。全文摘要麥芽糖酸在食物和飼料產品中具有抗氧化作用。可以使用酶催化方法,從食物產品中已經存在的淀粉或麥芽糖直接產生抗氧化劑??寡趸瘎┥a可在食物產品的分離部分上進行,由此可將食物產品的分離部分加回至食品生產方法或者最終的食物產品中?;蛘撸梢酝ㄟ^向方法中加入相關酶來產生抗氧化劑作為食品生產方法的整合的部分。文檔編號C12P19/44GK101765664SQ200880100522公開日2010年6月30日申請日期2008年7月18日優(yōu)先權日2007年7月27日發(fā)明者珀·M·尼爾森申請人:諾維信公司
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