專利名稱：使用遺傳修飾的生物產(chǎn)生生物質(zhì)降解酶的制作方法
使用遺傳修飾的生物產(chǎn)生生物質(zhì)降解酶
交叉參考本申請(qǐng)要求下列美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益Mayfield等人于2007年6月1日 提交的標(biāo)題為“使用光合生物產(chǎn)生生物燃料”的USSN 60/941，452 ；Mayfield等人于2008 年3月20日提交的標(biāo)題為“使用遺傳修飾的生物產(chǎn)生生物質(zhì)降解酶”的USSN 61/070，384 ； 以及Mayfield等人于2008年3月20日提交的標(biāo)題為“高通量篩選遺傳修飾的光合生物” 的USSN 61/070,437。這些在先申請(qǐng)中的每一個(gè)通過(guò)引用并入本文。
參考并入本說(shuō)明書(shū)提及的所有公開(kāi)和專利申請(qǐng)通過(guò)引用并入本文，其程度如同每個(gè)單獨(dú)的 公開(kāi)或?qū)＠暾?qǐng)被具體并單獨(dú)地指出通過(guò)引用并入。
背景技術(shù)：
燃料變得越來(lái)越昂貴。同時(shí)，燃料精制與污染物的產(chǎn)生和全球溫室效應(yīng)相關(guān)。在工 業(yè)中存在尋找更廉價(jià)、更安全以及對(duì)環(huán)境更加無(wú)害的方式產(chǎn)生燃料的日益增加的需要。從 生物原料產(chǎn)生燃料的方法的開(kāi)發(fā)是未來(lái)能源藍(lán)圖的主要部分。從生物原料生產(chǎn)燃料的最重 要的因素之一是將某些分子結(jié)構(gòu)例如纖維素消化或還原為可公認(rèn)為用于燃料產(chǎn)生方法例 如發(fā)酵的底物的分子種類的能力。分子生物學(xué)和基因工程有希望用于大量生物活性分子的生產(chǎn)，所述生物活性分子 可用于產(chǎn)生這些燃料。例如，生產(chǎn)能夠?qū)⒂袡C(jī)原料分解為燃料的酶有希望解決對(duì)可選的燃 料增加的需要。使用基因工程技術(shù)用于產(chǎn)生這些酶的主要優(yōu)勢(shì)是該方法能夠產(chǎn)生大量所期 望的蛋白。在許多情況下，從非工程化分泌來(lái)源獲得足量生物原料的僅有的其它方法是通 過(guò)從產(chǎn)生該試劑的生物的細(xì)胞純化自然發(fā)生的生物原料。因此，在基因工程到來(lái)之前，能夠 降解有機(jī)原料的酶只能通過(guò)大量培養(yǎng)生物，通常為細(xì)菌或真菌物種并提取蛋白來(lái)分離。對(duì) 于用于燃料生產(chǎn)，這些方法通常是復(fù)雜的并且經(jīng)濟(jì)上受限制的。雖然基因工程提供方法以產(chǎn)生大量生物原料，特別是蛋白和核酸，但是對(duì)目前可 用的方法有局限性。細(xì)菌提供適合于產(chǎn)生這種酶的環(huán)境；但是，一些細(xì)菌產(chǎn)生的副產(chǎn)品會(huì)污 染燃料源。因此，即使細(xì)菌可用于產(chǎn)生生物原料，可能需要另外的步驟例如純化或精制以獲 得生物活性原料和/或生物燃料。而且，非光合系統(tǒng)的使用需要添加昂貴的糖類或其它有 機(jī)碳源以飼養(yǎng)重組生物。另外，通常存在與建造發(fā)酵罐相關(guān)的大量的資金投資。重組蛋白還可在真核細(xì)胞中產(chǎn)生，包括例如，真菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其 可提供必要的環(huán)境將表達(dá)的蛋白加工為生物活性劑。但是，這些系統(tǒng)通常要承受同樣的成 本限制(糖類/有機(jī)碳源和發(fā)酵罐)。因此，存在這樣方法的需要以方便地產(chǎn)生具有生物活 性的酶，該方法可產(chǎn)生大量酶和/或提供與產(chǎn)生降解酶相容的宿主生物。
發(fā)明概述本文提供的是用于產(chǎn)生生物質(zhì)降解酶和生物燃料的組合物和方法。本文公開(kāi)的發(fā)明提供用于產(chǎn)生生物質(zhì)降解酶的新的方法，其通常在遺傳修飾的光合生物例如藻類和藍(lán)細(xì) 菌中。本文還提供的是用于轉(zhuǎn)化光合生物的組合物和方法以及篩選轉(zhuǎn)化子的方法。因此，本發(fā)明的一方面提供載體，其包括編碼生物質(zhì)降解酶的核酸和設(shè)置用于在 非維管光合生物中表達(dá)核酸的啟動(dòng)子。本發(fā)明的載體可含有編碼多于一種的生物質(zhì)降解酶 的核酸，以及在其它情況下，可含有編碼共價(jià)連接生物質(zhì)降解酶的多肽的核酸。生物質(zhì)降解 酶可包括分解纖維素的酶、分解半纖維素的酶和分解木質(zhì)素的酶。更具體地，生物質(zhì)降解 酶可以是外切_ 0 _葡聚糖酶、內(nèi)切_ 0 _葡聚糖酶、0 “葡糖苷酶、內(nèi)切木聚糖酶或木質(zhì)酶。 編碼生物質(zhì)降解酶的核酸可源自真菌或細(xì)菌來(lái)源，例如，那些編碼綠色木霉(Trichoderma viride)中外切葡聚糖酶、里氏木霉(Trichoderma reesei)中外切葡聚糖酶、 棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)中外切-0 -葡聚糖酶、里氏木霉中內(nèi)切-0 -葡聚糖 酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中內(nèi)切-0 -葡聚糖酶、里氏木霉中葡糖苷酶、黑曲霉 中葡糖苷酶、里氏木霉中內(nèi)切木聚糖酶和黑曲霉中內(nèi)切木聚糖酶的核酸。其它編碼生 物質(zhì)降解酶的核酸可以是與來(lái)自這些生物的基因同源。本發(fā)明的載體還可含有選擇標(biāo)記，使得能夠直接篩選轉(zhuǎn)化的生物。本發(fā)明的載體 可以能夠在多種光合生物中穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，這些光合生物包括但不限于光合細(xì)菌(包括藍(lán)細(xì)菌 (cyanobacteria))(cyanophyta)(prochlorophyta)(rhodophyta)
藻(chlorophyta)、不等If更毛藻(heterokontophyta)、tribophyta、灰@藻(glaucophyta) > chlorarachniophytes、豐果藻(euglenophyta)、類目艮蟲(chóng)(euglenoids)、If更藻(haptophyta) > 金藻(chrysophyta)、疼急藻(cryptophyta)、疼急滴蟲(chóng)(cryptomonads)、甲藻(dinophyta)、 雙 I ■ (dinof lagellata) > Ifl ^ (pyrmnesiophyta) > r± ^ (bacillariophyta) > jt ^ (xanthophyta) > eustigmatophyta>(raphidophyta)(phaeophyta)禾口胃
物(phytoplankton)。本發(fā)明的其它載體能夠在萊茵衣藻(C. reinhardtii)、鹽生杜氏藻 (D. salina)或雨生紅球藻(H.pluvalis)中穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。還有其它載體含有傾向于生物(例 如，萊茵衣藻)的密碼子偏好的核酸。本發(fā)明的具體載體含有本文提供的序列(SEQ ID NO. 19,SEQ ID NO. 20,SEQ ID NO. 21,SEQ ID NO. 22,SEQ ID NO. 23,SEQ ID NO. 24,SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 26 或 SEQ ID NO. 27)。還提供包括本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞。在一些情況下，宿主細(xì)胞是非維管光合生物， 例如，分類為光合細(xì)菌(包括藍(lán)細(xì)菌)、藍(lán)藻、原綠藻、紅藻、綠藻、不等鞭毛藻、tribophyta、 灰色藻、chlorarachniophytes、裸藻、類眼蟲(chóng)、鞭藻、金藻、隱藻、隱滴蟲(chóng)、甲藻、雙鞭藻、定鞭 藻、硅藻、黃藻、eustigmatophyta、針胞藻、褐藻和浮游植物的生物。本發(fā)明的宿主細(xì)胞也可 以是微觀藻類物種，包括但不限于萊茵衣藻、鹽生杜氏藻或雨生紅球藻。在其它情況下，宿 主細(xì)胞可以是多細(xì)胞光合生物的一種或多種細(xì)胞。對(duì)于一些實(shí)施方式，宿主細(xì)胞可以在缺 乏光照下生長(zhǎng)和/或在有機(jī)碳源存在下生長(zhǎng)。本發(fā)明還提供組合物，其含有一種或多種外源生物質(zhì)降解酶，所述降解酶源自一 種或多種非維管光合生物。在一些情況下，這些組合物還可含有非維管光合生物的元件。酶 與生物元件的比值(W/V)可以是至少1 10，或經(jīng)發(fā)現(xiàn)元件可僅以痕量存在。組合物中的一 些包括至少一種下列酶外切_ 0 _葡聚糖酶、內(nèi)切_ 0 _葡聚糖酶、0 “葡糖苷酶、內(nèi)切木聚 糖酶和/或木質(zhì)酶；其中酶或多種酶從一種或多種下列生物分離萊茵衣藻、鹽生杜氏藻、 雨生紅球藻、光合細(xì)菌(包括藍(lán)細(xì)菌)、藍(lán)藻、原綠藻、紅藻、綠藻、不等鞭毛藻、tribophyta、灰色藻、chlorarachniophytes、裸藻、類眼蟲(chóng)、鞭藻、金藻、隱藻、隱滴蟲(chóng)、甲藻、雙鞭藻、定鞭 藻、硅藻、黃藻、eustigmatophyta、針胞藻、褐藻和浮游植物。對(duì)于一些實(shí)施方式，生物可以 在缺乏光照下生長(zhǎng)和/或在有機(jī)碳源存在下生長(zhǎng)。本發(fā)明還提供含有多個(gè)載體的組合物，其中每個(gè)載體編碼不同的生物質(zhì)降解酶和 在葉綠體中用于表達(dá)生物質(zhì)降解酶的啟動(dòng)子。這些組合物可含有編碼具體酶的具體載體 的多個(gè)拷貝。在一些情況下，載體將含有編碼分解纖維素的酶、分解半纖維素的酶和/或 分解木質(zhì)素的酶的核酸。更具體地，所述多個(gè)載體可含有能夠表達(dá)外切-β-葡聚糖酶、內(nèi) 切-β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、內(nèi)切木聚糖酶和/或木質(zhì)酶的載體。該實(shí)施方式的一些 載體能夠插入至葉綠體基因組，這些插入可導(dǎo)致破壞轉(zhuǎn)化的葉綠體的光合能力。其它載體 插入至葉綠體基因組并不破壞轉(zhuǎn)化的葉綠體的光合能力。一些載體提供用于表達(dá)生物質(zhì) 降解酶，其被隔離在轉(zhuǎn)化的葉綠體中。還有其它載體可含有本文提供的特定序列(SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 22 或 SEQ ID NO. 23、SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 26或SEQ ID NO. 27)。本發(fā)明還提供含有如上所述的載體組合物的 藻類細(xì)胞，并具體地提供含有載體組合物的萊茵衣藻、鹽生杜氏藻或雨生紅球藻細(xì)胞。對(duì)于 一些實(shí)施方式，細(xì)胞可以在缺乏光照下生長(zhǎng)和/或在有機(jī)碳源存在下生長(zhǎng)。本發(fā)明的另一個(gè)載體編碼多個(gè)不同的生物質(zhì)降解酶和在非維管光合生物中用于 表達(dá)生物質(zhì)降解酶的啟動(dòng)子。生物質(zhì)降解酶可以是一種或多種分解纖維素的、分解半纖維 素的或分解木質(zhì)素的酶。在一些載體中，多個(gè)不同的生物質(zhì)降解酶是外切-β-葡聚糖酶、 內(nèi)切-β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、木質(zhì)酶和內(nèi)切木聚糖酶中的兩種或更多種。在一些實(shí) 施方式中，多個(gè)酶是可操作連接的。在其它實(shí)施方式中，多個(gè)酶是作為一個(gè)功能蛋白復(fù)合體 表達(dá)。一些載體插入至宿主細(xì)胞基因組并不破壞生物的光合能力。編碼多個(gè)不同的酶的 載體可引起酶的產(chǎn)生，其被隔離在轉(zhuǎn)化的生物的葉綠體中。本發(fā)明還提供用編碼多個(gè)不同 的酶的載體轉(zhuǎn)化的藻類細(xì)胞或藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞。在一些情況下，藻類細(xì)胞是萊茵衣藻、鹽生杜 氏藻或雨生紅球藻。在其它情況下，藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞是集胞藻屬(Synechocystis)或聚球菌屬 (Synechococcus)或螺旋藻屬(Athrospira)的種。對(duì)于一些實(shí)施方式，生物可以在缺乏光 照下生長(zhǎng)和/或在有機(jī)碳源存在下生長(zhǎng)。本發(fā)明還另一方面提供產(chǎn)生一種或多種生物質(zhì)降解酶的遺傳修飾的葉綠體。 這些酶可以是分解纖維素的、分解半纖維素的或分解木質(zhì)素的酶，更具體地，可以是外 切_ β _葡聚糖酶、內(nèi)切_ β _葡聚糖酶、β “葡糖苷酶、內(nèi)切木聚糖酶、木質(zhì)酶和/或其組合。 在一些實(shí)施方式中，一種或多種酶被隔離在葉綠體中。本發(fā)明還提供含有本發(fā)明的遺傳修 飾的葉綠體的光合生物。還另一方面提供用于制備生物質(zhì)降解酶的方法。該方法包括步驟(1)轉(zhuǎn)化光合、 非維管生物以產(chǎn)生所述生物質(zhì)降解酶或增加所述生物質(zhì)降解酶的產(chǎn)生以及(2)從所述轉(zhuǎn) 化的生物收集生物質(zhì)降解酶。轉(zhuǎn)化可以用組合物進(jìn)行，所述組合物含有編碼不同生物質(zhì)降 解酶的多個(gè)不同載體。轉(zhuǎn)化還可用編碼多個(gè)不同的生物質(zhì)降解酶的載體進(jìn)行。任何或所有 酶可以是可操作互相連接的。在一些情況下，葉綠體被轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的該方法可具有一種 或多種另外的步驟，其包括(a)收獲轉(zhuǎn)化的生物；(b)干燥轉(zhuǎn)化的生物；(c)從細(xì)胞培養(yǎng)基 收獲酶；(d)機(jī)械破壞轉(zhuǎn)化的生物；或(e)化學(xué)破壞轉(zhuǎn)化的生物。該方法還可包括進(jìn)一步通 過(guò)高效液體色譜純化酶。在一些情況下，轉(zhuǎn)化的生物是藻類或光合細(xì)菌，例如藍(lán)細(xì)菌。對(duì)于一些實(shí)施方式，生物可以在缺乏光照下生長(zhǎng)和/或在有機(jī)碳源存在下生長(zhǎng)。本發(fā)明還另一個(gè)方法能夠制備生物燃料。該方法的一個(gè)步驟包括用源自光合非 維管生物的一種或多種生物質(zhì)降解酶處理生物質(zhì)一段足夠的時(shí)間以降解至少一部分所述 生物質(zhì)。產(chǎn)生的生物燃料可以是乙醇。該方法的酶可含有至少痕量的所述光合非維管生 物，所述酶源于所述光合非維管生物。另外，用于該方法一些實(shí)施方式的酶包括分解纖維素 的、分解半纖維素的和分解木質(zhì)素的酶。用于該方法一些方面的特定酶包括外切_葡 聚糖酶、內(nèi)切-β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、內(nèi)切木聚糖酶和/或木質(zhì)酶。該方法的生物 可包括光合細(xì)菌(包括藍(lán)細(xì)菌)、藍(lán)藻、原綠藻、紅藻、綠藻、不等鞭毛藻、tribophyta、灰色 藻、chlorarachniophytes、裸藻、類眼蟲(chóng)、鞭藻、金藻、隱藻、隱滴蟲(chóng)、甲藻、雙鞭藻、定鞭藻、 硅藻、黃藻、eustigmatophyta、針胞藻、褐藻和浮游植物。用于該方法的其它生物是微觀藻 類，包括但不限于萊茵衣藻、鹽生杜氏藻和雨生紅球藻。對(duì)于一些實(shí)施方式，生物可以在缺 乏光照下生長(zhǎng)和/或在有機(jī)碳源存在下生長(zhǎng)。多種類型的生物質(zhì)——包括農(nóng)業(yè)廢棄物、造紙 廠廢棄物、玉米秸稈、小麥秸稈、大豆秸稈、柳枝稷、浮萍、楊樹(shù)、木片、木屑、濕酒糟、干酒糟、 人類廢棄物、新聞紙、回收紙產(chǎn)品或人類垃圾——可以是用本發(fā)明的該方法處理。生物質(zhì)還 可源自高-纖維素含量生物，例如柳枝稷或浮萍。用于該方法的酶或多種酶可以從所述生 物釋放，該釋放可涉及化學(xué)或機(jī)械破壞生物的細(xì)胞。在可選的實(shí)施方式中，酶或多種酶選自 所述生物，然后從培養(yǎng)基中收集。生物質(zhì)的處理可涉及發(fā)酵過(guò)程，其可利用微生物而不是產(chǎn) 生酶或多種酶的生物。在一些情況下，非維管光合生物可以添加至糖化槽。該本發(fā)明的該 方法還可包括收集所述生物燃料的步驟。收集可以通過(guò)蒸餾進(jìn)行。在一些情況下，生物燃 料與另一種燃料混合。本發(fā)明的另外方法提供制備至少一種生物質(zhì)降解酶，其通過(guò)轉(zhuǎn)化葉綠體以制備生 物質(zhì)降解酶。生物質(zhì)降解酶可以是分解纖維素的酶、分解半纖維素的酶或分解木質(zhì)素的酶， 以及具體地可以是外切_ β _葡聚糖酶、內(nèi)切_ β _葡聚糖酶、β “葡糖苷酶、內(nèi)切木聚糖酶 或木質(zhì)酶。在一些情況下，生物質(zhì)降解酶被隔離在轉(zhuǎn)化的葉綠體中。該方法可進(jìn)一步涉及 通過(guò)化學(xué)或機(jī)械方法破壞轉(zhuǎn)化的葉綠體以釋放生物質(zhì)降解酶或多種酶。在一些情況下，多 種酶將通過(guò)轉(zhuǎn)化的葉綠體產(chǎn)生。生物質(zhì)降解酶可以是真菌或細(xì)菌來(lái)源，例如，外切葡 聚糖酶、內(nèi)切_ β _葡聚糖酶、β “葡糖苷酶、內(nèi)切木聚糖酶、木質(zhì)酶或其組合。本發(fā)明還另一個(gè)方法提供篩選轉(zhuǎn)化的非維管光合生物，其通過(guò)從所述生物的葉綠 體中擴(kuò)增第一核酸序列，從所述生物的葉綠體擴(kuò)增第二核酸序列以及測(cè)定所述生物的原生 質(zhì)狀態(tài)，其基于從所述第一序列和第二序列擴(kuò)增的結(jié)果。在一些情況下，第一和第二擴(kuò)增步 驟同時(shí)進(jìn)行。第一核酸序列可以是內(nèi)源葉綠體基因組序列，第二核酸序列可以是至少部分 來(lái)自外源核酸。在一些情況下，來(lái)自葉綠體的第三核酸序列可以作為對(duì)照擴(kuò)增。該第三核 酸序列可以是野生型序列，其在外源核酸或多個(gè)外源核酸整合后保持完整。其中該第三核 酸被擴(kuò)增，該擴(kuò)增可與第一或第二擴(kuò)增步驟同時(shí)進(jìn)行或所有三個(gè)擴(kuò)增可以同時(shí)進(jìn)行。對(duì)于 該方法的擴(kuò)增，本文提供的特異性引物——SEQ ID NO. 1、SEQ ID Ν0· 2、SEQID NO. 3、SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 5,SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、
SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13,SEQ ID NO. 14或SEQID NO. 15-可以使用。
第一和/或第二核酸的擴(kuò)增可利用大于三十個(gè)循環(huán)的PCR。在一些情況下，測(cè)定原生質(zhì)狀 態(tài)通過(guò)視覺(jué)分析從擴(kuò)增步驟得到的產(chǎn)物進(jìn)行。一種或多種擴(kuò)增可以使用實(shí)時(shí)或定量PCR進(jìn)行。由該方法測(cè)定的原生質(zhì)狀態(tài)可以是同質(zhì)性(homoplasmy)，測(cè)試的生物可以是微觀 藻類，具體地，是微觀藻類物種萊茵衣藻、鹽生杜氏藻或雨生紅球藻的其中之一。在該方法 中，生物可含有外源核酸，所述外源核酸含有感興趣的基因和選擇標(biāo)記。感興趣的基因可編 碼生物質(zhì)降解酶，例如分解纖維素的、分解半纖維素的或分解木質(zhì)素的酶。具體地，生物質(zhì) 降解酶可以是外切_β _葡聚糖酶、內(nèi)切_β _葡聚糖酶、β “葡糖苷酶、內(nèi)切木聚糖酶或木 質(zhì)酶。另外，外源核酸可以是本文具體提供的核酸之一——SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 20、 SEQ ID NO. 2USEQ ID NO. 22,SEQ ID NO. 23,SEQ ID NO. 24,SEQ ID NO. 25,SEQID NO. 26、 SEQ ID NO. 27、SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29、SEQ IDN0. 30 或 SEQ ID NO. 31。本發(fā)明還提供含有同質(zhì)葉綠體群體的非維管光合生物，其中所述葉綠體群體包括 外源核酸以及其中葉綠體群體的同質(zhì)狀態(tài)由至少兩個(gè)不同的PCR反應(yīng)測(cè)定。在一些情況 下，葉綠體群體是多于一個(gè)的葉綠體。非維管光合生物可以是微觀藻類，具體地是萊茵衣 藻、鹽生杜氏藻或雨生紅球藻物種之一?？梢允褂弥辽賰蓚€(gè)同時(shí)進(jìn)行的不同PCR反應(yīng)篩選 生物。這些PCR反應(yīng)可利用本文公開(kāi)的具體引物之一——SEQ IDN0. U SEQ ID N0. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ IDN0. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14 或 SEQ ID NO. 15。PCR反應(yīng)可利用大于三十個(gè)循環(huán)。生物可含有外源核酸，其包括至少一種感興趣的基因和選擇標(biāo)記。該基因可編碼 生物質(zhì)降解酶，具體地是分解纖維素的、分解半纖維素的或分解木質(zhì)素的酶。甚至更具體 地，生物質(zhì)降解酶可以是外切_ β _葡聚糖酶、內(nèi)切_ β _葡聚糖酶、β “葡糖苷酶、內(nèi)切木聚 糖酶或木質(zhì)酶。存在于本發(fā)明該生物中的外源核酸可以是本文具體所述的核酸之一—— SEQ ID Ν0. 19,SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 2USEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23、SEQ ID NO. 24、 SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 26、SEQID NO. 27、SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29、SEQ ID NO. 30 或 SEQ IDN0. 31。本文提供的另一個(gè)方法用于產(chǎn)生遺傳修飾的同質(zhì)非維管光合生物。該方法涉及用 外源核酸轉(zhuǎn)化生物的至少一個(gè)葉綠體，擴(kuò)增第一核酸序列和第二核酸序列，以及測(cè)定生物 的原生質(zhì)狀態(tài)，其基于擴(kuò)增步驟的結(jié)果。第一和第二核酸序列可以在葉綠體基因組內(nèi)。另 外，第一核酸序列可以是內(nèi)源葉綠體序列。第二核酸序列可以至少部分來(lái)自外源核酸。該方 法還可涉及從葉綠體擴(kuò)增第三核酸序列作為對(duì)照。在一些情況下，第三核酸是野生型序列， 其在整合外源核酸后保持完整。該方法可涉及PCR，其使用本文具體公開(kāi)的引物之一—— SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2,SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 5,SEQ ID NO. 6,SEQID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14或SEQ ID NO. 15。第一和第二核酸序列的擴(kuò)增可利用大于三十個(gè)循 環(huán)的PCR。使用該方法的原生質(zhì)狀態(tài)測(cè)定可涉及視覺(jué)分析擴(kuò)增(多個(gè))步驟的產(chǎn)物。由該方法測(cè)定的原生質(zhì)狀態(tài)可以是同質(zhì)性，生物可以是微觀藻類，具體地是萊茵 衣藻、鹽生杜氏藻或雨生紅球藻物種之一。外源核酸可含有至少一種感興趣的基因和選擇 標(biāo)記。在一些情況下，感興趣的基因編碼生物質(zhì)降解酶，具體地編碼分解纖維素的、分解半 纖維素的或分解木質(zhì)素的酶。甚至更具體地，生物質(zhì)降解酶可以是外切_ β _葡聚糖酶、內(nèi) 切_ β _葡聚糖酶、β “葡糖苷酶、內(nèi)切木聚糖酶或木質(zhì)酶。而且，外源核酸可以是本文具體所述之一-SEQ ID NO. 19,SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 2USEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23、
SEQ ID NO. 24、SEQID NO. 25、SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 27、SEQ ID NO. 28、SEQ IDNO. 29、 SEQ ID NO. 30 或 SEQ ID NO. 31。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是試劑盒，其用于測(cè)定遺傳修飾的非維管光合生物的原 生質(zhì)狀態(tài)。這種試劑盒可含有擴(kuò)增引物(多個(gè)擴(kuò)增引物)，用于擴(kuò)增與內(nèi)源序列相應(yīng)的葉 綠體基因組的第一核酸序列；以及擴(kuò)增引物(多個(gè)擴(kuò)增引物)，用于擴(kuò)增葉綠體基因組的第 二核酸序列，其是引入的或非自然發(fā)生的序列。試劑盒還可含有PCR緩沖液和/或用于擴(kuò) 增對(duì)照核酸序列的擴(kuò)增引物(多個(gè)擴(kuò)增引物)。試劑盒可含有本文具體公開(kāi)的一種或多種
PCR 引物-SEQ ID N0. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ
ID NO. 6、SEQ IDNO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13,SEQ ID NO. 14或SEQ ID NO. 15。本發(fā)明試劑盒中用于擴(kuò)增第一核酸 序列的引物(多個(gè)引物)可結(jié)合至少一部分的PsbA 5’ UTR、psbA編碼序列、psbC 5’ UTR、 psbD 5，UTR、atpA 5，UTR或3HB基因座。在一些情況下，用于擴(kuò)增第二核酸序列的引物 (多個(gè)引物)的至少一個(gè)可結(jié)合編碼生物質(zhì)降解酶的序列的至少一部分，例如分解纖維素 的、分解半纖維素的或分解木質(zhì)素的酶。由第二核酸編碼的具體的生物質(zhì)降解酶可以是外 切-β-葡聚糖酶、內(nèi)切-β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、內(nèi)切木聚糖酶或木質(zhì)酶。引物可擴(kuò) 增本文具體公開(kāi)的一種或多種序列的至少一部分——SEQ ID Ν0. 19,SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23、SEQ ID NO. 24、SEQID NO. 25、SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 28, SEQ IDNO. 29, SEQ ID NO. 30 或 SEQ ID NO. 31。另外，試劑盒可含有 使用說(shuō)明書(shū)。
附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明的新的特征在所附權(quán)利要求中具體說(shuō)明?？赏ㄟ^(guò)參考下列闡明說(shuō)明性實(shí)施 方式的詳述獲得對(duì)本發(fā)明特征和優(yōu)勢(shì)的更好理解，其中利用本發(fā)明的原則，附圖如下

圖1圖解了藻類細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、選擇、確認(rèn)和測(cè)量酶的產(chǎn)生。圖2圖解了用于將基因插入至葉綠體基因組的兩個(gè)構(gòu)建體。圖3圖解了用于PCR篩選轉(zhuǎn)化子的引物對(duì)以及預(yù)期的野生型、異質(zhì)和同質(zhì)菌株的 條帶分布。圖4圖解了轉(zhuǎn)化內(nèi)切-β-葡聚糖酶的萊茵衣藻(C.reinhardtii)克隆的PCR篩 選和Western印跡分析的結(jié)果。圖5圖解了轉(zhuǎn)化外切- β _葡聚糖酶的萊茵衣藻(C. reinhardtii)克隆的PCR篩 選和Western印跡分析的結(jié)果。圖6圖解了轉(zhuǎn)化β -葡糖苷酶的萊茵衣藻(C. reinhardtii)克隆的PCR篩選和 Western印跡分析的結(jié)果。圖7圖解了轉(zhuǎn)化內(nèi)切木聚糖酶的萊茵衣藻(C.reinhardtii)克隆的PCR篩選和 Western印跡分析的結(jié)果。圖8圖解了測(cè)定由轉(zhuǎn)化的萊茵衣藻(C.reinhardtii)克隆產(chǎn)生的內(nèi)切-β-葡聚 糖酶蛋白的水平。圖9是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式的示意圖，其顯示產(chǎn)生的用于將多個(gè)基因插入至葉綠體基因組的構(gòu)建體。圖10圖解了轉(zhuǎn)化內(nèi)切-β-葡聚糖酶的萊茵衣藻(C.reinhardtii)克隆的PCR篩 選和Western印跡分析結(jié)果。圖11圖解了轉(zhuǎn)化β -葡糖苷酶的萊茵衣藻(C. reinhardtii)克隆的PCR篩選和 Western印跡分析的結(jié)果。圖12是用于插入至葉綠體基因組的兩個(gè)外源DNA構(gòu)建體的示意圖。圖13是用于插入至藍(lán)細(xì)菌基因組的兩個(gè)外源DNA構(gòu)建體的示意圖。圖14圖解了轉(zhuǎn)化內(nèi)切-β-葡聚糖酶的萊茵衣藻(C.reinhardtii)克隆的PCR篩 選和Western印跡分析的結(jié)果。圖15圖解了轉(zhuǎn)化內(nèi)切木聚糖酶的萊茵衣藻(C. reinhardtii)克隆的PCR篩選和 Western印跡分析的結(jié)果。圖16圖解了轉(zhuǎn)化外切-β-葡聚糖酶的萊茵衣藻(C.reinhardtii)克隆的PCR篩 選和Western印跡分析的結(jié)果。圖17圖解了細(xì)菌產(chǎn)生的生物質(zhì)降解酶的活性。 發(fā)明詳述本文所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的意 思，除非另外定義。本文參考對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種原料和方法。闡明重組 DNA技術(shù)一般原理的標(biāo)準(zhǔn)參考著作包括Sambrook等，“Molecular Cloning :A Laboratory Manual，，,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,N. Y. , 1989 ；Kaufman 等編輯，"Handbook of Molecular and Cellular Methods inBiology and Medicine，，， CRC Press,Boca Raton, 1995 ；以及McPherson編輯,“Directed Mutagenesis :A Practical Approach", IRL Press, Oxford, 19910用于本發(fā)明的選擇方面，教導(dǎo)酵母遺傳學(xué)的一般 方法和原理的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)包括=Sherman等“Laboratory Course ManualMethods in Yeast Genetics，，，Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor, N. Y. , 1986 ；以 及Guthrie等,“Guide to YeastGenetics and Molecular Biology",Academic,New York, 1991。當(dāng)提供數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解的是除非內(nèi)容另有說(shuō)明，在該范圍上限限定和下限限 定之間的每個(gè)介于其間的數(shù)值，至下限限定的單位的十分之一也是具體地公開(kāi)的。包括在 所述范圍內(nèi)的任何所述的數(shù)值或介于其間的數(shù)值與所述范圍內(nèi)的任何其它所述或介于其 間的數(shù)值之間的每個(gè)較小范圍。這些較小范圍的上限和下限可獨(dú)立地包括在范圍內(nèi)或排除 在范圍以外，并且界限之一或兩個(gè)包括在或兩個(gè)均不包括在較小范圍的每個(gè)范圍也是被包 括的，其中服從于在所述范圍內(nèi)任何具體排除的界限。當(dāng)所述范圍包括界限之一或兩個(gè)時(shí)， 排除那些包括的界限之一或兩個(gè)的范圍也是被包括的。本發(fā)明涉及通過(guò)遺傳修飾的生物生產(chǎn)酶，例如，生物質(zhì)降解酶。本發(fā)明另一方面涉 及組合物和方法，用于使用生物原料來(lái)產(chǎn)生產(chǎn)物，例如乙醇，其使用由光合微生物例如但不 限于藻類產(chǎn)生的生物質(zhì)降解酶。通常地，光合生物不具有降解生物質(zhì)所有必要的酶。本發(fā) 明利用將外源核酸引入藻類細(xì)胞，特別是引入那些細(xì)胞的葉綠體的能力。使用分子生物學(xué) 和基因工程產(chǎn)生表達(dá)酶的和/或表達(dá)酶促途徑的藻類菌株的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是產(chǎn)生大量活性酶的潛力。構(gòu)建遺傳操作的藻類菌株的一個(gè)方法如圖1的流程圖所示?？梢?jiàn)，藻類細(xì)胞(例 如，萊因衣藻(Chlamydomonas reinhardti)、鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)、雨生紅球 藻(Hema tococcus pluvalis))用編碼感興趣的基因——通常為生物質(zhì)降解酶——的核酸 轉(zhuǎn)化。在一些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)化可將核酸引入宿主藻類細(xì)胞的任何質(zhì)體(例如，葉綠體)。 在引入外源核酸之后，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞通常鋪于選擇培養(yǎng)基上。該方法還可包括幾個(gè)篩選步驟。 最初，通常進(jìn)行初次轉(zhuǎn)化子的篩選以測(cè)定克隆哪個(gè)具有外源核酸的正確插入?？梢匀★@示 正確整合的克隆并再篩選以確保遺傳穩(wěn)定性。這種方法確保轉(zhuǎn)化子含有感興趣的基因。在 許多情況下，這種篩選通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行；但是，可以使用任何其它合適的本領(lǐng) 域已知的技術(shù)。許多不同的PCR方法是本領(lǐng)域已知的(例如，嵌套式PCR、實(shí)時(shí)PCR)。對(duì) 于任何給定的篩選，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到PCR成分可以變化以獲得最佳的篩選結(jié) 果。例如，當(dāng)在破壞的藻類細(xì)胞上進(jìn)行PCR時(shí)，因?yàn)樵S多這類生物具有鎂螯合劑，鎂濃度可 根據(jù)需要向上調(diào)節(jié)。在這些情況下，鎂濃度可根據(jù)需要向上或向下調(diào)節(jié)(與購(gòu)得的PCR試 劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)濃度比較)0. 1、0· 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 1、1. 2,1. 3,1. 4、
1.5,1. 6,1. 7,1. 8、1. 9或2. OmM0因此，調(diào)節(jié)后，PCR反應(yīng)的最終鎂濃度可以是例如0. 7,0. 8、 0. 9、1· 0、1· 1、1· 2、1· 3、1· 4、1· 5、1· 6、1· 7、1· 8、1· 9、2· 0、2· 1、2· 2、2· 3、2· 4、2· 5、2· 6、2· 7、
2.8,2. 9,3. 0,3. 1,3. 2,3. 3,3. 4,3. 5mM或更高。具體的例子在本文所述實(shí)施例中使用；但 是，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到其它PCR技術(shù)可用于代替所述的具體方案法。篩選具有 外源核酸正確整合的克隆后，通常地篩選存在編碼的蛋白的克隆。蛋白表達(dá)篩選通常通過(guò) Western印跡分析和/或酶活性分析進(jìn)行。確認(rèn)核酸整合和/或蛋白表達(dá)后，選擇的克隆可以進(jìn)行擴(kuò)增用于通過(guò)生物質(zhì)降解 產(chǎn)生生物燃料，首先以較小的體積:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、6061、62、63、64、65、66、67、68、69、 70、71、72，73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、 95、96、97、98、99、100或更多升。在最初擴(kuò)增后，可以更大數(shù)量進(jìn)行生物質(zhì)更大規(guī)模的降解。 部分封閉的生物反應(yīng)器系統(tǒng)的一個(gè)例子顯示于圖1，第6步。但是，用于生物質(zhì)降解和/或 生物燃料產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的菌株的生長(zhǎng)也可以在人造結(jié)構(gòu)中完成，例如水池、溝渠、水槽和/或 堆填池。可選地，菌株也可直接在自然發(fā)生的水體中生長(zhǎng)，例如，在海洋、海水、湖泊或河流。 在某些情況下，轉(zhuǎn)化的菌株在乙醇生產(chǎn)工廠或其它設(shè)施附近生長(zhǎng)?？蛇x地，生物質(zhì)降解細(xì)胞 可以在產(chǎn)生CO2的地區(qū)附近生長(zhǎng)(例如，發(fā)電廠、混凝土廠、煉油廠、其它工業(yè)設(shè)施、城市或 高速公路，等等)。同樣，本文公開(kāi)的方法進(jìn)一步考慮商業(yè)方法，用于在制造和催化燃料生產(chǎn) 的同時(shí)，通過(guò)在乙醇生產(chǎn)廠附近培養(yǎng)本文所述的一種或多種修飾的生物，將碳信用(carbon credit)銷售給乙醇廠或其它設(shè)施或產(chǎn)生CO2的地區(qū)。本發(fā)明考慮通過(guò)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(例如，藻類細(xì)胞例如萊茵衣藻、鹽生杜氏藻、雨生 紅球藻和藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞)和/或生物——包括具有編碼一種或多種不同生物質(zhì)降解酶(例 如，分解纖維素的酶、分解半纖維素的酶、木聚糖酶、木質(zhì)酶和纖維素酶)的核酸的宿主細(xì) 胞——制造生物質(zhì)降解酶。在一些實(shí)施方式中，可生產(chǎn)單個(gè)酶。例如，可產(chǎn)生將預(yù)處理的纖 維素片段分解為雙葡萄糖分子(纖維二糖)的纖維素酶或?qū)⒗w維二糖分解為葡萄糖的纖維素酶。一些宿主細(xì)胞可以用編碼一種或多種酶的多個(gè)基因轉(zhuǎn)化。例如，單個(gè)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞 可含有編碼整個(gè)生物降解途徑的外源核酸。途徑的一個(gè)例子可包括編碼外切_葡聚糖 酶(作用于纖維素末端鏈)、內(nèi)切_葡聚糖酶(作用于纖維素鏈的內(nèi)部)、β _葡糖苷酶 (避免反應(yīng)抑制劑/降解纖維二糖)和內(nèi)切木聚糖酶(作用于半纖維素交聯(lián))的基因。這 種轉(zhuǎn)化了整個(gè)途徑的細(xì)胞和/或從它們中提取的酶可降解生物質(zhì)的某些組分。構(gòu)建體可含 有相同基因的多拷貝，和/或編碼來(lái)自不同生物的相同酶的多個(gè)基因，和/或在編碼序列的 一個(gè)或多個(gè)部分具有突變的多個(gè)基因?？蛇x地，通過(guò)用途徑的各個(gè)酶轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，然后將產(chǎn)生各個(gè)酶的細(xì)胞組合可產(chǎn) 生生物質(zhì)降解途徑。通過(guò)改變多個(gè)轉(zhuǎn)化的菌株的相對(duì)比例，該方法可進(jìn)行酶的組合使其更 具體地與感興趣的生物質(zhì)匹配。例如，將兩倍于表達(dá)途徑中第一種酶的細(xì)胞可添加至混合 物，其中反應(yīng)途徑的第一步驟是限制性步驟。在用編碼酶的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化后，培養(yǎng)宿主細(xì)胞和/或生物?？梢詮纳?細(xì)胞收集 生物質(zhì)降解酶?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法收集，包括但不限于濃縮細(xì)胞、機(jī)械或化學(xué) 破壞細(xì)胞以及從細(xì)胞培養(yǎng)物和/或細(xì)胞裂解液純化酶?？墒辜?xì)胞和/或生物生長(zhǎng)，然后通 過(guò)任何方式收集酶或多種酶。提取酶的一個(gè)方法是通過(guò)收獲宿主細(xì)胞或一組宿主細(xì)胞，然 后干燥宿主細(xì)胞。然后通過(guò)粉碎細(xì)胞以暴露酶收獲來(lái)自干燥的宿主細(xì)胞的酶或多種酶。然 后將粉碎的細(xì)胞的總產(chǎn)物用于降解生物質(zhì)。許多從天然細(xì)胞提取蛋白的方法是本領(lǐng)域熟知 的，也是本文考慮的(例如，引入外源核酸構(gòu)建體，其中編碼酶的序列可操作地連接至編碼 分泌信號(hào)的序列——分泌的酶從生長(zhǎng)培養(yǎng)基分離)。從細(xì)胞/生物和/或周圍培養(yǎng)基提取 蛋白后，可從粗提取物純化蛋白，以使該酶可包括總蛋白的百分之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99 或更高。純化步驟包括但 不限于使用HPLC、親和柱和基于抗體的純化方法。提取和利用生物質(zhì)降解酶也可通過(guò)在宿主細(xì)胞中表達(dá)含有編碼生物質(zhì)產(chǎn)生_調(diào) 節(jié)分子的核酸的載體來(lái)完成。在該實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞產(chǎn)生生物質(zhì)，也產(chǎn)生生物質(zhì)降解 酶。然后生物質(zhì)降解酶可降解宿主細(xì)胞產(chǎn)生的生物質(zhì)。在一些情況下，用于生產(chǎn)生物質(zhì)降 解酶的載體可以不必持續(xù)地具有活性。這些載體可包括一個(gè)或多個(gè)可活化的啟動(dòng)子和一個(gè) 或多個(gè)生物質(zhì)降解酶。這些啟動(dòng)子激活生物質(zhì)降解酶的產(chǎn)生，例如，在生物質(zhì)已生長(zhǎng)至足夠 密度或達(dá)到某種成熟度時(shí)。本發(fā)明的方法可通過(guò)將重組核酸分子引入葉綠體進(jìn)行，其中該重組核酸分子包括 第一多核苷酸，其編碼至少一個(gè)多肽(即，1、2、3、4或更多)。在一些實(shí)施方式中，多肽可操 作地連接至第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和/或隨后的多肽。例如， 在生物降解途徑中的幾個(gè)酶可以是直接或間接連接的，以使一旦由途徑中的一個(gè)酶產(chǎn)生產(chǎn) 物，該產(chǎn)物接近途徑中的下一個(gè)酶。對(duì)于葉綠體轉(zhuǎn)化，本發(fā)明的一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)是利用重組核酸構(gòu)建體，其含有選擇標(biāo) 記和一個(gè)或多個(gè)感興趣的基因。通常地，通過(guò)用兩個(gè)構(gòu)建體共轉(zhuǎn)化葉綠體來(lái)對(duì)葉綠體進(jìn)行 轉(zhuǎn)化，這兩個(gè)構(gòu)建體一個(gè)含有選擇標(biāo)記，第二個(gè)含有感興趣的基因。這種轉(zhuǎn)化子的篩選由于 多種原因是費(fèi)力和費(fèi)時(shí)的。首先，使一些轉(zhuǎn)化的生物生長(zhǎng)所需要的時(shí)間長(zhǎng)。第二，必須同時(shí) 存在選擇標(biāo)記和感興趣基因的情況下篩選轉(zhuǎn)化子。通常，通過(guò)Southern印跡對(duì)感興趣基因進(jìn)行二次篩選(參見(jiàn)，例如PCT/US2007/072465)。本發(fā)明的構(gòu)建體(圖2、圖9和圖12)可進(jìn)行基于PCR的篩選方法，其中可使用對(duì) 插入和野生型序列特異的引物組合篩選轉(zhuǎn)化子(圖3，道G-基因特異反應(yīng)；C-對(duì)照反應(yīng)； WT-野生型反應(yīng)；M-多重)。該方法提供快速篩選方法并比舊的技術(shù)先進(jìn)。例如，對(duì)接收未 連接的標(biāo)記的轉(zhuǎn)化子的選擇固有地產(chǎn)生較低百分比的具有轉(zhuǎn)基因的克隆。由于這個(gè)原因， 從初次轉(zhuǎn)化獲得同質(zhì)系的可能性很低。通過(guò)將標(biāo)記和感興趣的基因連接，獲得具有該轉(zhuǎn)基 因的轉(zhuǎn)基因克隆，特別是同質(zhì)克隆的可能性在第一次傳代(pass)時(shí)提高。篩選轉(zhuǎn)化子的具 體PCR方案在以下實(shí)施例中詳述，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到可以改變這些方案以 提供轉(zhuǎn)化子的定量分析。例如，可以利用不同比例的具體反應(yīng)的引物以將插入拷貝數(shù)與對(duì) 照反應(yīng)比較?？梢赃M(jìn)行這樣的變化，其中多重反應(yīng)(圖3，M排)同時(shí)或分開(kāi)進(jìn)行。插入拷貝數(shù)的測(cè)定在一些實(shí)施方式中可能是重要的，其中感興趣的外源基因最佳 的表達(dá)水平部分地由基因拷貝數(shù)確定。例如，藻類宿主細(xì)胞(例如，萊茵衣藻、鹽生杜氏藻、 雨生紅球藻)的轉(zhuǎn)化，其引起外源核酸并入在細(xì)胞中小于一半的葉綠體基因組拷貝中，可 產(chǎn)生感興趣的基因較少的或不可檢測(cè)的表達(dá)。可選地，外源核酸并入在細(xì)胞葉綠體基因組 所有拷貝中可產(chǎn)生較少的或不可檢測(cè)的感興趣基因的表達(dá)，其中存在很少的基因組原始拷 貝(例如，定量PCR分析應(yīng)可進(jìn)行同質(zhì)克隆的排除，其具有較低的插入拷貝數(shù)，并因此可能 不能產(chǎn)生足夠多的感興趣基因和/或多肽)。在其它實(shí)施方式中，可以是外源核酸并入的最 優(yōu)水平。在一些情況下，外源DNA可編碼蛋白，其中當(dāng)它存在于拷貝數(shù)具體范圍之中時(shí)，無(wú) 論通過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯或其它控制機(jī)制，被最優(yōu)產(chǎn)生。因此，這種外源DNA拷貝數(shù)的測(cè)定——例 如通過(guò)定量PCR，可進(jìn)行轉(zhuǎn)化的生物的選擇和/或產(chǎn)生，其以有效水平產(chǎn)生感興趣的蛋白。另外，本發(fā)明的重組核酸分子可以被可操作地連接至第二和/或其后的核苷酸序 列。例如，編碼生物降解途徑酶的核苷酸序列可以被可操作地連接以使這些序列的表達(dá)可 以用單個(gè)誘導(dǎo)刺激控制或由單個(gè)轉(zhuǎn)錄激活子控制。這些系統(tǒng)與細(xì)菌操縱子(例如，大腸桿 菌(Escherischia coli)Lac操縱子)相似。但是，本發(fā)明中可操作地連接的核苷酸序列的 這些分組是合成的并被設(shè)計(jì)為在植物質(zhì)體中發(fā)揮功能，優(yōu)選地被并入葉綠體基因組。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”意思是兩個(gè)或多個(gè)分子互相關(guān)聯(lián)定位以使它們 作為單個(gè)單元發(fā)揮作用并影響歸因于一個(gè)或兩個(gè)分子或其組合的功能。例如，編碼多肽的 多核苷酸可以可操作地連接至轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控元件，在這種情況下，該元件賦予其調(diào)控多 核苷酸的作用，其類似于該調(diào)控元件影響在細(xì)胞中與其正常相連的多核苷酸序列的方式。 第一多核苷酸編碼序列還可以可操作地連接至第二(或更多)編碼序列，以使嵌合多肽可 以從可操作地連接的編碼序列表達(dá)。從這樣的構(gòu)建體產(chǎn)生的嵌合多肽可以是融合蛋白，其 中兩個(gè)(或更多)編碼的肽被翻譯為單個(gè)多肽，即，通過(guò)肽鍵，或直接地或帶有短的間隔區(qū) 地共價(jià)連接。在葉綠體中，基因表達(dá)調(diào)控通常地發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后和通常在翻譯起始過(guò)程 中。該調(diào)控取決于葉綠體翻譯裝置，以及核-編碼的調(diào)控因子(參見(jiàn)Barkan和 Goldschmidt-Clermont, Biochemie 82 :559_572，2000 ；Zerges, Biochemie 82 :583_601， 2000)。葉綠體翻譯裝置通常地類似細(xì)菌中的裝置；葉綠體含有70S核糖體；具有缺乏5’ 帽和通常不含有3，多聚腺嘌呤化的尾的mRNA(Harris等，Microbiol. Rev. 58 =700-754, 1994)；以及通過(guò)選擇試劑例如氯霉素在葉綠體和細(xì)菌中抑制翻譯。
本發(fā)明的一些方法利用核糖體結(jié)合序列(RBS)相對(duì)于編碼序列的適當(dāng)定位。以前 已注意到RBS的這種設(shè)置引起植物葉綠體中的粗放翻譯(參見(jiàn)美國(guó)申請(qǐng)2004/0014174，通 過(guò)引用并入本文)，也注意到該多肽在葉綠體中表達(dá)多肽的優(yōu)勢(shì)是該多肽不通過(guò)通常由核 基因表達(dá)的多肽穿越的細(xì)胞區(qū)室進(jìn)行，并且因此，不進(jìn)行某些翻譯后修飾例如糖基化。同 樣，由本發(fā)明的一些方法產(chǎn)生的多肽和蛋白復(fù)合體可預(yù)期的不經(jīng)這些翻譯后修飾而產(chǎn)生。僅通過(guò)背景方式提供下列討論，并且申請(qǐng)人不試圖將公開(kāi)的發(fā)明以范圍或通過(guò)理 論限制于葉綠體基因調(diào)控機(jī)制的公開(kāi)。在葉綠體中，核糖體結(jié)合和適合的翻譯起始位點(diǎn)選 擇被認(rèn)為至少部分由順式作用RNA元件調(diào)節(jié)。潛在調(diào)控子的一個(gè)例子已在葉綠體mRNA的 5，UTR，中鑒定(Alexander 等，Nucl. Acids Res. 26 :2265_2272，1998 ；Hirose 和 Sugiura, EMBO J. 15 1687-1695，1996 ；Mayfield 等，J.Cell Biol. 127 1537-1545，1994 ；Sakamoto 等，Plant J.6 :503-512，1994，其中每個(gè)通過(guò)引用并入本文)。這些元件可與核-編碼的因 子相互作用。許多葉綠體mRNA含有類似原核生物RBS元件的元件(Bonham-Smith和Bourque， Nucl. Acids Res. 17 :2057_2080，1989 ；Ruf 和 Kossel，F(xiàn)EBS Lett. 240 :41_44，1988，其 中每個(gè)通過(guò)引用并入本文)。但是，如幾項(xiàng)研究已顯示，葉綠體翻譯中這些RBS序列的 功能利用性還不清楚，其區(qū)分這些元件在翻譯上的作用(Betts和Spremulli，J.Biol. Chem. 269 26456-26465,1994 ；Hirose 等，F(xiàn)EBS Lett. 430 257-260,1998 ；Fargo 等，Mol. Gen. Genet. 257 :271_282，1998 ；Koo 和 Spremulli, J.Biol. Chem. 269 :7494_7500，1994 ； Rochaix, Plant Mol. Biol. 32 :327_341，1996)。由于缺乏葉綠體RBS元件的共有序列以及 由于產(chǎn)生的以研究這些推定的RBS序列的突變可能已改變5’ UTR中其它重要序列的內(nèi)容， 這些結(jié)果的解釋十分復(fù)雜。本發(fā)明的一些方面(例如，載體)可包括RBS。這些RBS可化學(xué)合成，或可從自然 發(fā)生的核酸分子分離(例如，從葉綠體基因分離)。另外，對(duì)于RBS，具有5’ UTR的實(shí)施方 式可包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，例如啟動(dòng)子。對(duì)于本發(fā)明所用的RBS，5’ UTR可以是化學(xué)合成的 或可從自然發(fā)生的核酸分子分離。可用于本發(fā)明的5’ UTR的非限制性例子包括但不限于 atpA5，UTR、psbC 5，UTR、psbD 5，UTR、psbA 5，UTR、rbcL 5，UTR 禾Π / 或 16S rRNA 5，UTR。 核糖核苷酸序列可進(jìn)一步包括起始密碼子(例如，AUG密碼子)，其可操作地連接至RBS。起 始密碼子可以是內(nèi)源的(例如，在克隆的基因中自然發(fā)生的)或可合成的(例如，在連接多 肽或PCR引物中插入)?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法獲得分離的核糖核苷酸序列，方法包括但不限于化 學(xué)合成，使用酶促方法產(chǎn)生(例如，使用依賴DNA的RNA聚合酶或依賴RNA的RNA聚合酶從 DNA或RNA模板產(chǎn)生)。編碼本發(fā)明核糖核苷酸的DNA模板可化學(xué)合成，可從自然發(fā)生的 DNA分子分離，或可源自被修飾為具有所需要特征的自然發(fā)生的DNA序列。在本文中廣泛使用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”或“核苷酸序列”或“核酸分子”意思是通過(guò) 磷酸二酯鍵連接在一起的兩個(gè)或多個(gè)脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的序列。同樣，這些術(shù) 語(yǔ)包括RNA和DNA，其可以是基因或其部分、cDNA、合成的多聚脫氧核糖核酸序列或類似物， 并且可以是單鏈或雙鏈，以及DNA/RNA雜交。而且，本文所用的術(shù)語(yǔ)包括自然發(fā)生的核酸分 子，其可從細(xì)胞分離，以及合成的多核苷酸，其可由例如化學(xué)合成的方法或酶促方法例如聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)制備。應(yīng)認(rèn)識(shí)到的是，使用不同術(shù)語(yǔ)僅為了討論方便，以便區(qū)分例如組合物的不同組分，除了本文所用的術(shù)語(yǔ)“合成的多核苷酸”是指已被修飾的以反映葉綠體密 碼子使用的多核苷酸。通常，包括多核苷酸的核苷酸是自然發(fā)生的脫氧核糖核苷酸，例如連接至2’ _脫 氧核糖的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤或胸腺嘧啶，或連接至核糖的核糖核苷酸，例如腺嘌呤、 胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤或尿嘧啶。但是，根據(jù)使用，多核苷酸也可含有核苷酸類似物，包括非自 然發(fā)生的合成的核苷酸或修飾的自然發(fā)生的核苷酸。核苷酸類似物是本領(lǐng)域熟知的并 且是可購(gòu)得的，如作為含有這些核苷酸類似物的多核苷酸(Lin等，Nucl. Acids Res. 22 5220-5234，1994 Jellinek 等，Biochemistry34 :11363_11372，1995 ；Pagratis 等，Nature Biotechnol. 15 :68_73，1997)。通常，磷酸二酯鍵連接本發(fā)明多核苷酸的核苷酸，但是 可以利用其它鍵，包括硫二酯鍵、硫代磷酸酯鍵、肽-樣鍵和本領(lǐng)域已知的任何其它鍵 以產(chǎn)生合成的多核苷酸(Tam 等，Nucl. Acids Res. 22 :977_986，1994 ;Ecker 和 Crooke， BioTechnology 13:351360,1995)。多核苷酸，其包括自然發(fā)生的核苷酸和磷酸二酯鍵，可化學(xué)合成或可使用重組DNA 方法，使用合適的多核苷酸作為模板產(chǎn)生。作為比較，多核苷酸——其包括核苷酸類似物 或共價(jià)鍵而不是磷酸二酯鍵，通常是化學(xué)合成的，雖然酶例如T7聚合酶可將某些類型的核 苷酸類似物并入多核苷酸，因此，可用于從合適的模板重組地產(chǎn)生這種多核苷酸(Jellinek 等，上文，1995)。用于實(shí)踐本發(fā)明方法的多核苷酸可以從任何生物分離。通常地，用于實(shí)踐 本發(fā)明的生物降解酶由來(lái)自細(xì)菌或真菌的核苷酸序列編碼。這種酶和其它們來(lái)源的非限制 性例子顯示于表I。這些多核苷酸可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法分離和/或合成，所述方 法包括但不限于克隆、亞克隆和PCR。編碼多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)密碼子可偏向于反映葉綠體密碼子使用。大部分氨 基酸由兩個(gè)或多個(gè)不同(簡(jiǎn)并)密碼子編碼，并被充分意識(shí)到各種生物優(yōu)選于其它密碼子 來(lái)利用某些密碼子。這些優(yōu)選的密碼子使用，也在葉綠體中使用，在本文是指“葉綠體密碼 子使用”。已報(bào)道萊因衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的密碼子偏好。參見(jiàn)美國(guó)申請(qǐng) 2004/0014174。當(dāng)用于指密碼子時(shí)，術(shù)語(yǔ)“偏好”意思是多核苷酸中密碼子序列已被改變以使密碼 子是在靶中優(yōu)選使用的一個(gè)，靶偏好是例如，藻類細(xì)胞、葉綠體或類似物。偏好葉綠體密碼 子使用的多核苷酸可重頭合成，或可使用常規(guī)重組DNA技術(shù)——例如通過(guò)位點(diǎn)定向突變方 法——進(jìn)行遺傳修飾以改變一個(gè)或多個(gè)密碼子以使它們偏好葉綠體密碼子使用。葉綠體密 碼子偏好可在不同植物中有不同偏愛(ài)，其包括例如，與煙草相比在藻類葉綠體中。通常，選 擇的葉綠體密碼子偏好反映植物的葉綠體密碼子使用，該植物用本發(fā)明核酸轉(zhuǎn)化。例如，如 果萊茵衣藻(C. reinhardtii)是宿主，那么葉綠體密碼子使用偏向于反映藻類葉綠體密碼 子使用(在第三密碼子位置約74. 6% AT偏好)。本發(fā)明的一種方法可使用編碼第一多肽和至少第二多肽的多核苷酸進(jìn)行。因此， 多核苷酸可編碼例如第一多肽和第二多肽；第一多肽、第二多肽和第三多肽；等等。而且， 任何或所有編碼的多肽可相同或不同。微觀藻類萊茵衣藻(C. reinhardtii)葉綠體中表達(dá) 的多肽可以組裝以形成功能多肽和蛋白復(fù)合體。因此，本發(fā)明的方法提供產(chǎn)生功能蛋白復(fù) 合體的方法，包括例如二聚體、三聚體和四聚體，其中復(fù)合體的亞基可相同或不同(例如， 分別為同源二聚體或異源二聚體)。
術(shù)語(yǔ)“重組核酸分子”用于本文是指由人為干預(yù)操作的多核苷酸。重組核酸分子可 含有兩個(gè)或多個(gè)核苷酸序列，其以這樣的方式連接以使在自然界的細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)物。 具體地，兩個(gè)或多個(gè)核苷酸序列可以可操作地連接，以及例如，可編碼融合多肽或可包括編 碼核苷酸序列和調(diào)控元件。重組核酸分子還可基于但被操作以使其不同于自然發(fā)生的多核 苷酸(例如葉綠體密碼子使用偏好、限制酶位點(diǎn)插入、啟動(dòng)子插入、復(fù)制起點(diǎn)插入)。重組核 酸分子可進(jìn)一步含有肽標(biāo)簽(例如，His-6標(biāo)簽)，其可便于鑒定在細(xì)胞中的多肽表達(dá)。另 外的標(biāo)簽包括例如FLAG表位、c-myc表位、生物素以及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶。這些標(biāo)簽可通 過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法(例如，抗-標(biāo)簽抗體、鏈霉親和素)檢測(cè)。這些標(biāo)簽還可用于分 離可操作連接的多肽，例如通過(guò)親和層析。鉬合物核酸本文的組合物包括編碼一種或多種不同生物質(zhì)降解酶和/或一種或多種不同生 物質(zhì)-產(chǎn)生調(diào)節(jié)劑的核酸以及這些核酸的載體。核酸對(duì)它們插入的光合宿主細(xì)胞可以是異 源的。載體可包括編碼生物質(zhì)降解酶的核酸的一個(gè)或多個(gè)拷貝和/或編碼生物質(zhì)_產(chǎn)生調(diào) 節(jié)劑的核酸的一個(gè)或多個(gè)拷貝。當(dāng)使用多個(gè)拷貝時(shí)，核酸(例如，編碼單個(gè)生物質(zhì)降解酶) 的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)拷貝可插入至單個(gè)載體。這可在宿主細(xì)胞中增加它們產(chǎn) 生的水平。用于本發(fā)明方法的重組核酸分子可包含在載體中。而且，當(dāng)使用第二(或更多) 重組核酸分子進(jìn)行該方法時(shí)，第二重組核酸分子還可包含在載體中，其可以但不必與含有 第一重組核酸分子的載體相同。載體可以是可用于將多核苷酸引入葉綠體的任何載體，優(yōu) 選地包括葉綠體基因組DNA的核苷酸序列，其足夠與葉綠體基因組DNA進(jìn)行同源重組，例 如這樣的核苷酸序列——其包括葉綠體基因組DNA的約400至1500或更多個(gè)的基本上連 續(xù)的核苷酸。葉綠體載體和選擇葉綠體基因組用作載體的區(qū)域的方法是熟知的(參見(jiàn)，例 如，Bock，J. Mol. Biol. 312 :425-438，2001 ；還參見(jiàn)，Staub 和 Maliga，Plant Cell 4:39-45， 1992 ；Kavanagh 等，Genetics 152 :1111_1122，1999，其中每個(gè)通過(guò)引用并入本文)。在一些情況下，這樣的載體包括啟動(dòng)子。用于本發(fā)明的啟動(dòng)子可來(lái)自任何來(lái)源 (例如，病毒、細(xì)菌、真菌、原生生物、動(dòng)物)。本文考慮的啟動(dòng)子可以對(duì)光合生物、非維管光 合生物和維管光合生物(例如，藻類、開(kāi)花植物)是特異的。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“非維管光合 生物”是指任何宏觀的或微觀的生物，其包括但不限于藻類、藍(lán)細(xì)菌和光合細(xì)菌，其不具有 例如在高等植物中發(fā)現(xiàn)的維管系統(tǒng)。在一些情況下，上述核酸被插入至包括光合生物例如 藻類啟動(dòng)子的載體。啟動(dòng)子可以是在葉綠體和/或其它質(zhì)體中用于表達(dá)的啟動(dòng)子。在一些 情況下，核酸是基于葉綠體的?？紤]用于將本文的任何核酸插入至葉綠體的啟動(dòng)子的例子 包括美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?004/0014174公開(kāi)的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng) 子。啟動(dòng)子通常地包括接近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的必要核酸序列(例如，TATA元件)。“組成型”啟動(dòng)子是在大部分環(huán)境和發(fā)育條件下有活性的啟動(dòng)子?！罢T導(dǎo)型”啟動(dòng) 子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)控下有活性的啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子/調(diào)控元件的例子包括例如硝酸 鹽-誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(Back等，Plant Mol. Biol. 17 9(1991))或光-誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(Feinbaum 等，MoIGen. Genet. 226 449 (1991) ；Lam 和 Chua，Science 248:471(1990))或熱響應(yīng)啟動(dòng) 子(Muller 等，Gene 111:165-73(1992))。萊茵衣藻(C. reinhardtii)的整個(gè)葉綠體基因組在萬(wàn)維網(wǎng)(world wide web)上是公眾可獲得的，其 URL 為"biology, duke. edu/chlamy_genome/-chloro. html，，(參見(jiàn) "viewcomplete genome as text file” 鏈接禾口 "maps of the chloroplastgenome” 鏈 接)，其中每個(gè)通過(guò)引用并入本文(J. Maul, J. W. Lilly和D. B. Stern，未公開(kāi)的結(jié)果；2002 年1月28日修訂；將作為GenBankAcc. No. AF396929公開(kāi))。通常，選擇葉綠體基因組DNA 的核苷酸序列以使其不是基因的部分，包括調(diào)控序列或編碼序列，特別是這樣的基因，即如 果由于同源重組事件被破壞將產(chǎn)生對(duì)于葉綠體有害作用的基因，例如，對(duì)于葉綠體基因組 復(fù)制或?qū)τ诤腥~綠體的植物細(xì)胞。在這方面，含有萊茵衣藻(C.reinhardtii)葉綠體基 因組序列的網(wǎng)站還提供顯示葉綠體基因組編碼和非-編碼區(qū)域的圖譜，從而便于選擇用于 構(gòu)建本發(fā)明載體的序列。例如，葉綠體載體P322，其用于本文公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)，是從大約位置 143. Ikb的Eco (Eco RI)位點(diǎn)延伸至大約位置148. 5kb的Xho (Xho I)位點(diǎn)的克隆(參見(jiàn)， 萬(wàn)維網(wǎng)，其 URL 為"biology, duke, edu/chlamy_genome/chloro. html，，并點(diǎn)擊"maps ofthe chloroplast genome” 鏈接和"140_150kb” 鏈接；也可在萬(wàn)維網(wǎng)，URL 為"biology, duke. edu/chlam-y/chloro/chlorol40. html” 上直接獲得；還參見(jiàn)實(shí)施例 1)。用于本發(fā)明實(shí)踐的載體也可含有一個(gè)或多個(gè)另外的核苷酸序列，其在載體上賦予 期望的特征，包括例如序列，例如便于載體操作的克隆位點(diǎn)、指導(dǎo)載體復(fù)制或其中含有的核 苷酸序列轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件、編碼選擇標(biāo)記的序列，等等。同樣，載體可含有例如，一個(gè)或多個(gè) 克隆位點(diǎn)，例如多克隆位點(diǎn)，其可但不必被定位以使異源多核苷酸可插入至載體并可操作 地連接至所期望的元件。載體也可含有原核生物復(fù)制起點(diǎn)(ori)，例如，大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn) 或黏粒復(fù)制起點(diǎn)，從而使載體如所期望地在原核生物宿主細(xì)胞以及植物的葉綠體中傳代。調(diào)控元件，如本文所用術(shù)語(yǔ)，廣泛地指調(diào)節(jié)多核苷酸轉(zhuǎn)錄或翻譯或可操作地連 接的多肽定位的核苷酸序列。例子包括但不限于RBS、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、起始 (start)密碼子、內(nèi)含子切除和正確讀碼框維持的剪接信號(hào)、STOP密碼子、amber或ochre 密碼子、IRES。另外，細(xì)胞區(qū)室化信號(hào)(即，將多肽靶向至胞質(zhì)、核、葉綠體膜或細(xì)胞膜的序 列)。這些信號(hào)是本領(lǐng)域熟知的并已廣泛報(bào)道(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5，776，689)。載體或其它重組核酸分子可包括編碼報(bào)告子多肽或其它選擇標(biāo)記的核苷酸序列。 術(shù)語(yǔ)“報(bào)告子”或“選擇標(biāo)記”是指賦予可檢測(cè)表型的多核苷酸(或編碼的多肽)。報(bào)告子通 常編碼可檢測(cè)的多肽，例如綠色熒光蛋白或酶例如熒光素酶，其中，當(dāng)與合適的試劑接觸時(shí) (分別為特定波長(zhǎng)的光或熒光素)，產(chǎn)生可目測(cè)或使用合適的儀器檢測(cè)的信號(hào)(Giacomin， Plant Sci. 116 59-72,1996 ；Scikantha, J.Bacteriol. 178 121,1996 ；Gerdes, FEBS Lett. 389 44-47,1996 ；還參見(jiàn)，Jefferson，EMBO J. 6 :3901_3907，1997，f 1-葡糖苷酸酶)。 選擇標(biāo)記通常地是分子，當(dāng)其在細(xì)胞中存在或表達(dá)時(shí)，提供給含有標(biāo)記的細(xì)胞選擇的優(yōu)勢(shì) (或劣勢(shì))，例如，在試劑存在的情況下生長(zhǎng)的能力，否則該試劑將殺死細(xì)胞。選擇標(biāo)記可提供工具以獲得表達(dá)標(biāo)記的原核生物細(xì)胞或植物細(xì)胞或二者，因此， 可用作本發(fā)明載體的組分(參見(jiàn)例如，Bock，上文，2001)。選擇標(biāo)記的例子包括但不限 于賦予抗代謝物抗性的標(biāo)記，例如，二氫葉酸還原酶，其賦予對(duì)甲氨蝶呤的抗性(Reiss， PlantPhysiol. (Life Sci. Adv.) 13 143-149，1994)；新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，其賦予對(duì)氨基糖 苷新霉素、卡那霉素和嘌呤霉素的抗性(Herrera-Estrella, EMBO J. 2 =987-995,1983)； hygro，其賦予對(duì)潮霉素的抗性(Marsh, Gene 32 =481-485,1984) ；trpB，其可使細(xì)胞利用 吲哚來(lái)替代色氨酸；hisD，其可使細(xì)胞利用組胺醇來(lái)替代組氨酸(Hartman，Proc. Natl.Acad. Sci. , USA 85 =8047,1988)；甘露糖_6_磷酸異構(gòu)酶，其可使細(xì)胞利用甘露糖(TO 94/20627)；鳥(niǎo)氨酸脫羧酶，其賦予對(duì)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶抑制劑2-( 二氟甲基)-DL-鳥(niǎo)氨酸的抗 個(gè)生(DFM0 ；McConlogue,1987, In Current Communications in MolecularBiology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.)；以及來(lái)自土曲霉(Aspergillus terreus)的脫氨酶， 其賦予對(duì)殺稻瘟菌素 S 的抗性(Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 :2336_2338， 1995)。另外的選擇標(biāo)記包括那些賦予除草劑抗性的選擇標(biāo)記，例如，草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移 酶基因，其賦予對(duì)革胺膦的抗性(White等，Nucl. Acids Res. 18 1062，1990 ；Spencer 等，Theor. Appl. Genet. 79 =625-631,1990)；突變的EPSPV-合成酶，其賦予草甘膦抗性 (Hinchee等，Biotechnology91 =915-922,1998)；突變的乙酰乳酸合成酶，其賦予咪唑啉 (imidazolione)或磺酰尿抗性(Lee 等，EMBO J. 7 1241-1248，1988)；突變的 psbA，其賦 予對(duì)繡去津的抗性(Smeda等，Plant Physiol. 103 :911_917，1993)，或突變?cè)策?化酶(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5，767，373)，或其它標(biāo)記，其賦予對(duì)除草劑例如草丁磷的抗性。選 擇標(biāo)記包括多核苷酸，其賦予對(duì)真核細(xì)胞的二氫葉酸還原酶(DHFR)或新霉素抗性，和四 環(huán)素；對(duì)原核生物例如大腸桿菌的氨芐青霉素抗性；以及植物中博來(lái)霉素、慶大霉素、草甘 膦、潮霉素、卡那霉素、甲氨蝶呤、福來(lái)霉素、草銨磷、大觀霉素、鏈霉素、氨磺酰和磺酰尿抗 性(參見(jiàn)，例如，Maliga 等，Method in Plant Molecular Biology, Cold SpringHarbor Laboratory Press,1995,第 39 頁(yè))。報(bào)告基因已成功用于高等植物的葉綠體，并已報(bào)道重組蛋白高水平表達(dá)。另外，報(bào) 告基因已用于萊茵衣藻的葉綠體，但是，在大多數(shù)情況下，產(chǎn)生極低量的蛋白。報(bào)告基因大 大增強(qiáng)在大量生物有機(jī)體中監(jiān)控基因表達(dá)的能力。在高等植物葉綠體中，葡糖苷酸酶 (uidA，Staub 和 Maliga，EMBO J. 12 :601_606，1993)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptII，Carrer 等， Mol. Gen. Genet. 241 :49_56，1993)、腺苷-3-腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶(aadA，Svab 和 Maliga，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA90 :913_917，1993)和維多利亞多管發(fā)光水母(Aequorea victoria) GFP(Sidorov 等，Plant J. 19 :209_216，1999)已用作報(bào)告基因(Heifetz, Biochemie 82 655-666, 2000) 0這些基因的每一個(gè)均已成為葉綠體基因表達(dá)的有用的報(bào)告子，例如分 析簡(jiǎn)便、靈敏度、或原位檢測(cè)表達(dá)的能力?；谶@些研究，其它異源蛋白已在高等植物葉 綠體中表達(dá)，例如蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensisKry毒素，其賦予昆蟲(chóng)食 草動(dòng)物抗性(Kota 等，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 96 1840-1845,1999)，或人生長(zhǎng)激素 (Staub等，Nat. Biotechnol. 18 =333-338,2000)——一種潛在的生物藥物。幾種報(bào)告基 因已表達(dá)在真核綠色藻類——萊茵衣藻的葉綠體中，包括aadA(Goldschmidt-Clermont， Nucl.Acids Res. 19 4083-40891991 ；Zerges 和 Rochaix, Mol. Cell Biol. 14 :5268_5277， 1994))、uidA (Sakamoto 等，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 90 :477_501，19933，Ishikura 等， J. Biosci. Bioeng. 87 307-3141999)、花蟲(chóng)型熒光素酶(Minko 等，Mol. Gen. Genet. 262 421-425,1999)和鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumanii)的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 aphA6 (Bateman 禾口 Purton，Mol. Gen. Genet 263 404-410,2000)。在一些情況下，本發(fā)明的載體應(yīng)含有元件例如大腸桿菌或釀酒酵母 (S. cerevisiae)復(fù)制起點(diǎn)。這些特征，與合適的選擇標(biāo)記組合，可使載體在靶宿主細(xì)胞和細(xì) 菌和/或酵母細(xì)胞之間“穿梭”。本發(fā)明的穿梭載體在二級(jí)宿主中傳代的能力可使得對(duì)載體 特征進(jìn)行更方便的操作。例如，含有載體和推定的插入的感興趣多核苷酸的反應(yīng)混合物可轉(zhuǎn)化至原核生物宿主細(xì)胞例如大腸桿菌，使用常規(guī)方法擴(kuò)增和收集并檢測(cè)以鑒定含有感興 趣的插入體或構(gòu)建體的載體。如果期望，載體可進(jìn)一步被操作，例如，通過(guò)對(duì)插入的多核苷 酸進(jìn)行位點(diǎn)定向誘變，然后再擴(kuò)增和選擇具有感興趣的突變多核苷酸的載體。然后，可將穿 梭載體引入至植物細(xì)胞葉綠體，其中可表達(dá)感興趣的多肽，如果期望，可根據(jù)本發(fā)明的方法 分離。使用本領(lǐng)域已知的任何方法，可將本發(fā)明的多核苷酸或重組核酸分子引入至植物 葉綠體。通過(guò)多種方法可將多核苷酸引入細(xì)胞，這些方法是本領(lǐng)域熟知的并部分地基于 具體宿主細(xì)胞選擇。例如，使用直接的基因轉(zhuǎn)移方法，例如電穿孔或微粒介導(dǎo)的(生物射 彈)轉(zhuǎn)化，使用粒子槍或“玻璃珠方法”或通過(guò)花粉介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)體-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、使 用創(chuàng)傷的或酶_降解的未成熟胚或創(chuàng)傷的或酶_降解的胚胎發(fā)生的愈傷組織進(jìn)行的轉(zhuǎn)化， 可將多核苷酸引入至植物細(xì)胞(Potrykus, Ann. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol. 42 205-225，1991)。術(shù)語(yǔ)“外源的”以比較的含義用于本文以表明核苷酸序列(或多肽)是指來(lái)自不 是參考來(lái)源的來(lái)源，或連接至通常不被連接的第二核苷酸序列(或多肽)或被修飾以使其 以一種在參考材料中通常不相關(guān)的形式。例如，編碼生物質(zhì)降解酶的多核苷酸相對(duì)于植物 葉綠體核苷酸序列是異源的，其是重組核酸分子的組分，其包括例如，可操作地連接至第二 核苷酸序列的第一核苷酸序列，其是引入至葉綠體的突變的多核苷酸，其中突變的多核苷 酸通常未在葉綠體中發(fā)現(xiàn)。質(zhì)體轉(zhuǎn)化是常規(guī)和熟知的方法，用于將多核苷酸引入植物細(xì)胞葉綠體(參見(jiàn)美國(guó) 專利號(hào) 5，451，513,5, 545，817 和 5，545，818 ；W095/16783 ；McBride 等，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 91 :7301-7305，1994)。在一些實(shí)施方式中，葉綠體轉(zhuǎn)化涉及引入所期望的核苷 酸序列側(cè)翼的葉綠體DNA區(qū)域，以使外源DNA同源重組入靶葉綠體基因組。在一些情況下， 可以使用葉綠體基因組DNA側(cè)翼的1至1. 5kb的核苷酸序列。使用該方法，在葉綠體16S rRNA和rpsl2基因中的點(diǎn)突變——其賦予大觀霉素和鏈霉素抗性，可用作轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記 (Svab 等，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 87 :8526_8530，1990)并可產(chǎn)生穩(wěn)定的同質(zhì)轉(zhuǎn)化子， 其以每100個(gè)靶葉片轟擊大約一個(gè)的頻率。微粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化還可用于將多核苷酸引入至植物細(xì)胞葉綠體(Klein等，Nature 327 :70-73，1987)。該方法利用微粒例如金或鎢，其通過(guò)氯化鈣、亞精胺或聚乙二醇沉淀 用所期望的多核苷酸包被。使用設(shè)備例如生物射彈PD-1000粒子槍(BioRad ；Hercules Calif.)，將微粒粒子以高速加速至植物組織。使用生物射彈方法用于轉(zhuǎn)化的方法是本領(lǐng)域 熟知的(參見(jiàn)，例如；Christou，Trends in Plant Sciencel :423_431，1996)。已使用微粒介 導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，例如，以產(chǎn)生大量轉(zhuǎn)基因植物物種，包括棉花、煙草、玉米、雜交白楊和番木瓜。重 要的谷類作物，例如小麥、燕麥、大麥、高粱和水稻也已使用微粒介導(dǎo)的遞送轉(zhuǎn)化(Duan等， Nature Biotech. 14 494-498,1996 ；Shimamoto, Curr.Opin.Biotech. 5 158—162，1994)。 用上述方法轉(zhuǎn)化大多數(shù)雙子葉植物是可能的。單子葉植物的轉(zhuǎn)化也可使用例如上述生物射 彈方法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、部分透化的細(xì)胞電穿孔、使用玻璃纖維引入DNA、玻璃珠攪拌方法等 等轉(zhuǎn)化。可以用顯性選擇標(biāo)記包括但不限于細(xì)菌aadA基因代替隱性rRNA或r_蛋白抗 生素抗性基因提高轉(zhuǎn)化頻率(Svab 和 Maliga，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 90 :913_917，1993)。轉(zhuǎn)化后通常需要大約15至20個(gè)細(xì)胞分裂周期以達(dá)到同質(zhì)狀態(tài)。對(duì)本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是葉綠體可含有其基因組的多拷貝，因此，術(shù)語(yǔ)“同質(zhì)的”或“同質(zhì)性”是 指感興趣的具體基因座的所有拷貝是基本上相同的狀態(tài)。質(zhì)體表達(dá)——其中基因通過(guò)同源 重組插入至存在于每個(gè)植物細(xì)胞中的環(huán)形質(zhì)體基因組的所有幾千個(gè)拷貝，利用與核-表達(dá) 的基因相比巨大的拷貝數(shù)優(yōu)勢(shì)以使表達(dá)水平能夠容易超過(guò)全部可溶植物蛋白的10%。
使用微觀藻類——萊茵衣藻來(lái)示例本發(fā)明的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法使用微 觀藻類表達(dá)多肽或蛋白復(fù)合體提供了大量的微觀藻類可生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)，其包括商業(yè)用途 (Cyanotech Corp. ；KaiIua-Kona HI)，從而產(chǎn)生大量所期望的產(chǎn)物，以及如果期望，可分 離大量所期望的產(chǎn)物。但是，在任何植物的葉綠體中表達(dá)例如功能性哺乳動(dòng)物多肽—— 包括蛋白復(fù)合體一一的能力可產(chǎn)生這些植物的作物，并因此，具有方便地產(chǎn)生大量多肽 的能力。因此，可使用任何具有葉綠體的植物實(shí)踐本發(fā)明的方法，包括例如，大型藻類、 例如，海洋藻類和海草，以及生長(zhǎng)在土壤中的植物，例如，玉米(Zea mays)、蕓苔屬某種 (例如，B. napus, B. rapa, B. juncea)——特別是用作種子油來(lái)源的蕓苔屬物種、紫花苜 猜(Medicago sativa)、7jC 禾S (Oryza sativa)、黑麥(Secale cereale)、高梁(Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、稷(例如，珍珠稷(Pennisetum glaucum)、黃米(Panicum miliaceum)、小米(Setariaitalica)、禾裹子(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、紅花(Carthamus tinctorius)、小麥(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、 煙草(Nicotiana tabacum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、 棉花(Gossypium barbadense、Gossypium hirsutum)、舌甘馬鈴薯(Ipomoea batatus)、 cassaya (Manihotesculenta)、助P 口非(Cofea M I @ 禾中)、(Cocos nucifera)、M Μ. (Ananas comosus)、柑橘樹(shù)(Citrus 屬些某禾中)、可可(Theobromacacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa 屬某些種)、鍔梨(Perseaultilane)、無(wú)花果(Ficus casica)、番 ^ Wi (Psidium gua java) > τ ^ (Mangifera indica) > It (Olea europaea) > # /R (Carica papaya) > ^ (Anacardium occidentale) >(Macadamia integrifolia) >
杏樹(shù)(Prunus amygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、甘蔴(Saccharum 屬某些種)、燕麥、浮 萍(Lemna)、大麥、西紅棉(Lycopersiconesculentum)、萵苣(例如，Lactuca sativa)、綠 J3. (Phaseolusvulgaris)、禾U 馬豆(Phaseolus limensis)、豆|5豆(Lathyrus 屬某些禾中)， 和 Cucumis 屬的成員例如黃瓜(C. sativus)、香瓜(C. cantalupensis)，和甜瓜(C. melo)。 觀賞植物，例如杜鵑(Rhododendron屬某些種)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、木槿 (Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(Rosa屬某些種)、郁金香(Tulipa屬某些種)、水仙花 (Narcissus MIiS禾中),Μ^Ψ (Petunia hybirda)(Dianthuscaryophyllus)、
猩猩木(Euphorbia pulcherrima)和菊花也包括在內(nèi)。用于實(shí)踐本發(fā)明方法的另外的觀賞 植物包括鳳仙花、海棠、天竺葵、堇菜、仙客來(lái)、馬鞭草、長(zhǎng)春花、萬(wàn)壽菊、報(bào)春花、非洲堇英、 藿香薊、莧菜、金魚(yú)草、耬斗菜、瓜葉菊、苜蓿、Cosmo、豇豆、大麗花、曼陀羅、飛燕草、非洲菊、 劍蘭、孤挺花、松葉菊、Salpiglossos和百日菊。可以應(yīng)用于實(shí)踐本發(fā)明的針葉類包括例如， 松樹(shù)，例如火炬松(Pinustaeda)、沼澤松(Pinus elliotii)、西黃松(Pinus ponderosa)、 黑豐公(Pinus contorta)禾口$高身寸豐公(Pinus radiata)、花旗豐公(Pseudotsugamenziesii)； Western hemlock(Tsuga ultilane) ；Sitka spruce (Piceaglauca) ； ^X ^· (Sequoia sempervirens)；真冷杉例如銀揪(Abiesamabilis)和膠揪(Abies balsamea)；以及雪松例如西紅雪松(Thujaplicata)和阿拉斯加黃雪松(Chamaecyparis nootkatensis)。用于實(shí)踐本發(fā)明方法的豆科植物包括豆和豌豆。豆包括瓜爾豆、刺槐豆、胡蘆巴、 大豆、青刀豆、豇豆、綠豆、利馬豆、蠶豆、小扁豆、鷹嘴豆等等。豆科植物包括但不限于落花 生(Arachis)，例如花生、蠶豆(Vicia)，例如冠野豌豆、巢菜、赤豆、綠豆和鷹嘴豆、羽扇豆 (Lupinus)，例如扁豆、三葉草、菜豆(Phaseolus)，例如、菜豆和利馬豆，Pisum例如田野豆， 草木樨(Melilotus)例如三葉草，苜蓿(Medicago)例如紫花苜蓿，蓮花(Lotus)例如三葉 草，lens例如小扁豆和紫穗槐。本發(fā)明方法中使用的優(yōu)選飼料和草坪草包括紫花苜蓿、果 園草、高羊茅、多年生黑麥草、剪股穎和糠草。用于本發(fā)明的其它植物包括金合歡(Acaci)、 蒔蘿、朝鮮薊、芝麻、黑莓、油菜、香菜、小柑橘、萵苣菜、桉樹(shù)、茴香、葡萄柚、蜜露、豆薯、獼猴 桃、檸檬、酸橙、蘑菇、堅(jiān)果、黃秋葵、柑橘、歐芹、柿子、車前草、石榴、楊樹(shù)、輻射松、菊苣、南 方松、楓香樹(shù)、橘子、黑小麥、葡萄、甘薯、蘋(píng)果、梨、榲梓、櫻桃、杏、甜瓜、麻、蕎麥、葡萄、山 莓、藜、藍(lán)莓、油桃、桃、李、草莓、西瓜、茄子、胡椒、花椰菜、蕓苔(Brassica)、例如椰菜、卷心 菜、ultilan sprouts、洋蔥、胡蘿卜、韭菜、甜菜、蠶豆、芹菜、蘿卜、南瓜、菊苣、葫蘆、大蒜、 食莢菜豆、菠菜、南瓜、蕪箐、ultilane、菊苣、落花生和西葫蘆。因此，本文考慮的組合物包 括宿主生物，其包括上述任何核酸。宿主生物可以是任何含有葉綠體的生物。在本文中廣泛使用的術(shù)語(yǔ)“植物”是指含有質(zhì)體，特別是葉綠體的真核生物，并包 括在任何發(fā)育階段的任何這種生物或植物的部分，包括植物切塊、植物細(xì)胞、植物細(xì)胞培養(yǎng) 物、植物器官、植物種子和小植株。植物細(xì)胞是植物的結(jié)構(gòu)和生理單位，其包括原生質(zhì)體和 細(xì)胞壁。植物細(xì)胞可以是分離的單個(gè)細(xì)胞或培養(yǎng)的細(xì)胞的形式，或可以是較高組織單位的 部分，例如，植物組織、植物器官或植物。因此，植物細(xì)胞可以是原生質(zhì)體、產(chǎn)生細(xì)胞的配子 或可再生為整個(gè)植物的細(xì)胞或細(xì)胞集合。同樣，種子——其包括多植物細(xì)胞并能夠再生為 整個(gè)植物，被認(rèn)為是用于本公開(kāi)目的的植物細(xì)胞。植物組織或植物器官可以是種子、原生質(zhì) 體、愈傷組織或植物細(xì)胞的任何其它組群，其可被組織成結(jié)構(gòu)或功能單位。特別有用的植物 部分包括可收獲的部分和用于繁殖后代植物的部分。植物可收獲的部分可以是植物任何有 用的部分，例如，花、花粉、幼苗、塊莖、葉、莖、果實(shí)、種子、根等等。植物用于繁殖的部分包括 例如，種子、果實(shí)、切塊、幼苗、塊莖、根狀莖等等。本發(fā)明的方法可產(chǎn)生植物，其含有被遺傳修飾的葉綠體以含有穩(wěn)定整合的多核苷 酸(Hager 和 Bock，Appl. Microbiol. Biotechnol. 54 :302_310，2000)。因此，本發(fā)明進(jìn)一步 提供轉(zhuǎn)基因(轉(zhuǎn)質(zhì)體，trans plastomic)植物，例如萊茵衣藻，其包括一個(gè)或多個(gè)含有編碼 一種或多種異源多肽的多核苷酸的葉綠體，所述多肽包括可特異地結(jié)合以形成功能蛋白復(fù) 合體的多肽。在一些情況下，包括編碼具體生物降解途徑(例如，纖維素途徑)單個(gè)酶的重組多 核苷酸的轉(zhuǎn)化子和/或轉(zhuǎn)質(zhì)體植物可與包括編碼生物降解途徑的其它酶的重組多核苷酸 的轉(zhuǎn)化子組合。例如，如果生物化學(xué)途徑利用四個(gè)酶以從底物產(chǎn)生產(chǎn)物，可將四個(gè)轉(zhuǎn)化系組 合以提供那個(gè)途徑的酶。這些組合可含有必要的多個(gè)轉(zhuǎn)化系以包括產(chǎn)生整個(gè)酶途徑或其部 分的細(xì)胞混合物。另外，這些組合可包括不同比例的不同轉(zhuǎn)化子的細(xì)胞。例如，如果降解途 徑的一個(gè)酶是該途徑的限速步驟，細(xì)胞的組合可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更大數(shù)量 的產(chǎn)生限速酶的細(xì)胞。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到轉(zhuǎn)化子比例的多種組合可以通過(guò)簡(jiǎn)單 方法獲得(例如，稱重干燥的轉(zhuǎn)化子并組合)?？蛇x地，單個(gè)酶可以從轉(zhuǎn)化子分離(例如，“裂解”藻類轉(zhuǎn)化子以分離被隔離的酶)并在分離后組合。這些方法可將酶濃度適應(yīng)于不同 生物質(zhì)或其它底物原料，其可含有底物或其它成分的不同的相對(duì)比例。在一些情況下，由本發(fā)明轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)生的蛋白在它產(chǎn)生后被分離。因此，本發(fā)明 還考慮在葉綠體或轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生異源多肽或蛋白復(fù)合體的方法，其可包括從植物細(xì)胞 葉綠體分離表達(dá)的多肽或蛋白復(fù)合體的步驟。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“分離的”或“基本上純化” 意思是所指的多肽或多核苷酸以相對(duì)不含與其天然結(jié)合的蛋白、核酸、脂類、碳水化合物或 其它物質(zhì)的形式。分離的多肽(或多核苷酸)可構(gòu)成樣品的至少百分之1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100?？蓮娜~綠體分離多肽或蛋白復(fù)合體，其使用任何適合于具體多肽或蛋白復(fù)合體的 方法，包括例如，鹽分餾方法和層析方法例如親和層析方法，使用特異結(jié)合多肽或蛋白復(fù)合 體的配體或受體。根據(jù)本發(fā)明的方法測(cè)定產(chǎn)生的多肽或蛋白復(fù)合體是以分離的形式，其可 使用熟知的方法進(jìn)行，例如進(jìn)行電泳和鑒定具體分子作為相對(duì)不連續(xù)的條帶或鑒定具體復(fù) 合物為一系列條帶之一。因此，本發(fā)明還提供通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的分離的多肽或蛋白 復(fù)合體。在一些情況下，可產(chǎn)生本發(fā)明的酶但被隔離在葉綠體中。在這些實(shí)施方式中，可以 在“裂解”含有酶的細(xì)胞(例如，使用機(jī)械、化學(xué)和/或生物方法以破壞細(xì)胞壁)后到達(dá)有活 性的酶。這些裂解的時(shí)機(jī)可計(jì)劃為在由細(xì)胞產(chǎn)生的酶用于發(fā)揮它們的酶學(xué)能力時(shí)發(fā)生。在 其它情況下，酶可以是由宿主細(xì)胞分泌。在這些情況下，酶可以直接地從生物體的培養(yǎng)基收 集。這些培養(yǎng)基中存在的酶可不經(jīng)純化直接使用，可干燥(例如，空氣干燥、凍干)和/或 可以進(jìn)行通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法(例如，親和層析、高效液相層析)純化。生物質(zhì)降解酶和編碼那些酶的核酸的例子顯示于表I。生物質(zhì)降解酶的非限制 性例子包括分解纖維素的酶、分解半纖維素的酶、分解果膠的酶、木聚糖酶、分解木質(zhì)素的 酶、纖維素酶、纖維二糖酶、軟化酶(例如，內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶)、淀粉酶、脂肪酶、蛋白 酶、RNAse, DNAse、菊粉酶、裂解酶、磷酸脂肪酶、果膠酶、支鏈淀粉酶、葡萄糖異構(gòu)酶、內(nèi)切木 聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶、α-葡糖苷酸酶、α-半乳糖苷酶、乙 酰木聚糖酯酶和阿魏酸酯酶。編碼這些酶的基因的例子包括但不限于淀粉酶、纖維素酶、 半纖維素酶(例如，葡糖苷酶、內(nèi)切纖維素酶、外切纖維素酶)、外切葡聚糖酶、內(nèi) 切- β -葡聚糖酶和木聚糖酶(內(nèi)切木聚糖酶和外切木聚糖酶)。分解木質(zhì)素的酶的例子 包括但不限于來(lái)自黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechryososporium)的木質(zhì)素過(guò)氧化酶 和錳過(guò)氧化酶。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，這些酶僅是可用于本發(fā)明的酶的部分列舉。 表1.生物質(zhì)降解酶的例子 生物質(zhì)-產(chǎn)生調(diào)節(jié)劑包括如在光合生物的生物中增加生物質(zhì)產(chǎn)生的試劑。宿主細(xì)胞/生物本發(fā)明還考慮用本文的一種或多種核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方式中， 宿主細(xì)胞是光合成的。在某些情況下，宿主細(xì)胞是光合的和非維管的。在其它情況下，宿主 細(xì)胞是光合和有維管的。宿主細(xì)胞可以是真核或原核的。用本文所述的載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞(例如，包括一種或多種生物質(zhì)降解酶和/或一 種或多種生物質(zhì)-產(chǎn)生調(diào)節(jié)劑的載體)。載體可含有質(zhì)體啟動(dòng)子或核啟動(dòng)子，用于轉(zhuǎn)染宿主 細(xì)胞葉綠體或其它質(zhì)體。載體還可編碼選擇性地將載體產(chǎn)物靶向至葉綠體或其它質(zhì)體的融 合蛋白或試劑。宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)染可使用本領(lǐng)域已知的任何方法發(fā)生。宿主生物是包括宿主細(xì)胞的生物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，宿主生物是光合成的。 光合生物是一種天然地光合成(具有質(zhì)體)的生物或被遺傳工程化的或另外被修飾成光合 成的生物。在一些情況下，光合生物可以是用本發(fā)明的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，其補(bǔ)償了不能操作的全 部或部分光合裝置。在一些情況下，它是非維管和光合成的。宿主細(xì)胞可以是原核的。本 發(fā)明的一些原核生物的例子包括但不限于藍(lán)細(xì)菌(例如，聚球菌(Synechococcus)、集胞藻 (Synechocystis)、螺旋藻(Athrospira))。宿主生物可以是單細(xì)胞或多細(xì)胞的。在大部分 實(shí)施方式中，宿主生物是真核的(例如綠色藻類)。本文考慮的生物的例子包括但不限于紅藻、綠藻、不等鞭毛藻、tribophyta、灰色藻、chlorarachniophytes、類眼蟲(chóng)、鞭藻、隱滴蟲(chóng)、 雙鞭藻和浮游植物。宿主生物可以在允許進(jìn)行光合成的條件下生長(zhǎng)，但是，這不是必需的(例如，宿主 生物可以在缺乏光照下生長(zhǎng))。在一些情況下，宿主生物可以是遺傳修飾的，以降低和/或 破壞光合能力的方式進(jìn)行遺傳修飾(參見(jiàn)以下例子)。在宿主生物不能進(jìn)行光合成的生長(zhǎng) 條件下(例如，由于缺乏光和/或遺傳修飾)，通常地，應(yīng)給生物提供必要的營(yíng)養(yǎng)物以支持其 在缺乏光合成條件下的生長(zhǎng)。例如，向生物生長(zhǎng)其中(或其上)的培養(yǎng)基中可添加任何所 需的營(yíng)養(yǎng)物，包括有機(jī)碳源、氮源、磷源、維生素、金屬、脂質(zhì)、核酸、微營(yíng)養(yǎng)物或生物特異性 需要。有機(jī)碳源包括宿主生物能夠代謝的任何碳源，包括但不限于醋酸鹽、簡(jiǎn)單的碳水化合 物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖)、復(fù)雜的碳水化合物(例如，淀粉、糖原)、蛋白和脂質(zhì)。本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，不是所有的生物都能夠充分代謝特定的營(yíng)養(yǎng)物，以及從一種生 物到另一種生物可能需要修飾營(yíng)養(yǎng)物混合物以提供合適的營(yíng)養(yǎng)物混合物。宿主生物可生長(zhǎng)在陸地上，例如，水池、溝渠、堆填池或封閉或部分封閉的生物反 應(yīng)器系統(tǒng)。本文的宿主生物也可直接生長(zhǎng)在水中，例如，在海洋、海水、湖泊、河流、水庫(kù)等 等。在藻類大量培養(yǎng)的實(shí)施方式中，藻類可在高密度光生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)。大量培養(yǎng)藻類 的方法是已知的。例如，藻類可以在高密度光生物反應(yīng)器(參見(jiàn)，例如，Lee等，Biotech. Bioengineering 44:1161-1167,1994)和其它生物反應(yīng)器(例如用于污水和廢水處理的反 應(yīng)器)(例如，Sawayama 等，Appl. Micro. Biotech. ,41 :729_731，1994)中生長(zhǎng)。另外，藻類 可以被大量-培養(yǎng)以去除重金屬(例如，Wilkinson，Biotech. Letters, 11 :861_864，1989)、 氫(例如，美國(guó)專利申請(qǐng)
發(fā)明者B·奧奈爾, M·門(mén)德斯, S·梅菲爾德, Y·潘 申請(qǐng)人:藍(lán)寶石能源公司;斯克里普斯研究學(xué)院