專利名稱：：預(yù)測或診斷胃腸病癥或疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及預(yù)測受試者具有胃腸道疾病或病癥易感性或者具有胃腸道疾病或病癥的可能性。
背景技術(shù)：
：目前，臨床上沒有用于預(yù)測受試者可能患有、傾向患有或者患有胃腸病癥的基于基因表達(dá)譜的生物學(xué)試驗。
發(fā)明內(nèi)容本公開提供診斷無癥狀受試者胃腸道中癌癥或炎性疾病或病癥的方法。方法包括(i)從受試者頰部區(qū)域(例如口腔或口，包括舌、舌下、齒齦和內(nèi)頰)收集黏膜上皮細(xì)胞；(ii)測量選自CXCR2、0PN、C0Xl、PPARa、C0X2、IL8、P21、c-Myc、CD44和PPARS的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種多核苷酸的表達(dá)水平。多核苷酸可以包含選自SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、37、39、41和43的序列及其天然存在變體。檢測所收集細(xì)胞中的多核苷酸并且將多核苷酸的表達(dá)或者數(shù)量與正常對照中的同樣的多核苷酸水平比較，其中表達(dá)水平的改變預(yù)示著癌癥或非結(jié)直腸炎性疾病或病癥。在一個實施方案中，包含一組的至少10種多核苷酸被檢測和比較。本公開還提供診斷據(jù)認(rèn)為其胃腸道具有炎性疾病或病癥的無癥狀受試者胃腸道中非結(jié)直腸癌炎性疾病或病癥的方法。方法包括(i)擦拭受試者的頰或直腸區(qū)域以收集上皮細(xì)胞；(ii)測量所收集細(xì)胞中包含選自SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、37、39、41或43的序列的至少兩種多核苷酸的表達(dá)水平；(iii)比較所述至少兩種多核苷酸的表達(dá)水平與正常對照中同樣的多核苷酸的水平，其中表達(dá)水平的改變預(yù)示著非結(jié)直腸癌炎性疾病或病癥。本公開還提供診斷胃腸道炎性疾病或病癥的方法。方法包括(a)將受試者頰或直腸樣品與包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、37、39、41或43的至少8個連續(xù)核苷酸的至少一種探針接觸；和(b)定量雜交至至少一種探針的多核苷酸分子的量，其中多核苷酸的量相對于正常對照增加預(yù)示著受試者具有胃腸疾病或病癥，并且其中受試者不具有胃腸疾病或病癥家族病史或自身病史。本公開提供篩選處于發(fā)展成癌癥或胃腸疾病或病癥風(fēng)險的受試者的方法，包括(a)將受試者頰或直腸樣品與包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、37、39、41或43的至少8個連續(xù)核苷酸的至少一種探針接觸；和(b)定量雜交至至少一種探針的多核苷酸分子的量，其中多核苷酸數(shù)量相對于正常對照增加預(yù)示著受試者5具有發(fā)展成癌癥或胃腸疾病或病癥的風(fēng)險，并且其中受試者沒有胃腸疾病或病癥家族病史或自身病史。本公開提供診斷據(jù)認(rèn)為具有克羅恩病的受試者中的克羅恩病的方法。方法包括(i)使用拭子從受試者頰或直腸區(qū)域收集黏膜上皮細(xì)胞；(ii)測量包含選自SEQIDNO:1、3或5的序列的至少兩種多核苷酸的表達(dá)水平；(iii)比較所述至少兩種多核苷酸的表達(dá)水平與正常對照中同樣的多核苷酸的水平，其中表達(dá)水平與正常對照相比增加預(yù)示著克羅恩病。本公開還提供診斷據(jù)認(rèn)為具有巴雷特病(Barrett'sdisease)的受試者中巴雷特病的方法，包括(i)使用拭子從受試者頰或直腸區(qū)域收集黏膜上皮細(xì)胞；(ii)測量包含選自SEQIDN0:l、3或5的序列的至少兩種多核苷酸的表達(dá)水平；(iii)比較所述至少兩種多核苷酸的表達(dá)水平與正常對照中同樣的多核苷酸的水平，其中表達(dá)水平與正常對照相比增加預(yù)示著巴雷特病。還提供寡核苷酸/DNA芯片，其包含來自多核苷酸的至少8個連續(xù)核苷酸的一組生物標(biāo)志，所述多核苷酸包含選自SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、37、39、41、43或其任意組合的序列。在本公開的方法中，包含從頰部區(qū)域獲得的(例如通過拭子)多核苷酸的樣品與寡核苷酸/DNA芯片接觸，并且定量樣品和對照中多核苷酸間的雜交。本公開還提供方法，包括(a)提供從頰部拭子獲得的樣品，所述樣品包含從受試者獲得的多肽；(b)將樣品與特異性結(jié)合至基本上由如SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42或44中所述序列構(gòu)成的多肽的至少一種探針接觸；和(c)測定樣品是否包含多肽，其中一組多肽相對于正常對照增加或減少預(yù)示著受試者具有胃腸疾病或病癥或者具有患胃腸疾病或病癥的風(fēng)險。本公開還提供用于開展本文所述任何方法的許多種試劑盒。例如，試劑盒可以包含用于檢測包含如SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、37、39、41或43中所述序列的多核苷酸的寡核苷酸探針或引物對。在另一個實施方案中，本公開提供試劑盒，包含特異性檢測包含如SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42或44中所述序列的多肽的試劑?！獋€或更多個實施方案的詳細(xì)內(nèi)容在附圖和下面的說明書中描述。其他的特征、目標(biāo)和優(yōu)點根據(jù)說明書和附圖以及權(quán)利要求書是顯而易見的。圖1A-C顯示對于從(從左至右)對照、切除的結(jié)腸癌、有家族病史的個體和有息肉的個體獲得的活組織檢查樣品(67名受試者和15種基因)的馬氏距離(mahalanobisdistance),(B)顯示針對第二個患者群開展的同樣的分析，該患者群包括無息肉或家族/自身病史(對照)、有家族病史的個體、有息肉的個體，(C)顯示對從同一群個體取得的直腸涂片樣品開展的同樣的分析。圖2A和2B顯示拭子數(shù)據(jù)。(A)顯示對90名患者開展的通過直腸拭子獲得的每一受試者的16種基因的基因表達(dá)值研究，對照傾向于落于95%卡方分布線之下。在最右邊可以看到患有癌癥的受試者傾向于落在線之上。(B)顯示來自21名對照和8名癌癥受試者頰部拭子基因分析的95%卡方分布。具體實施例方式如本說明書和后附權(quán)利要求書所使用，單數(shù)形式"一"、"和"和"所述"包括復(fù)數(shù)對象，除非文中另有明確規(guī)定。因此，例如，提到"多核苷酸"，其包括多種此類多核苷酸，并且提到"變體"時，其包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一種或更多種變體，等等。同樣，除非另外說明，"或"的使用意思是指"和/或"。類似地，"包含"和"包括"是可互換的并且不是限制性的。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解，在描述許多種實施方案時使用術(shù)語"包含"，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解為，在一些特定情況下實施方案可以替代性地使用語言"基本上由......構(gòu)成"或"由......構(gòu)成"描述。除非另外定義，本文所使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與本公開所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解含義相同的含義。雖然與本文所述的那些相似或等效的方法和材料可以用于實施所公開的方法和組合物，但是示例性的方法、裝置和材料在本文描述。上面以及本文通篇所討論的公布在本申請的提交日之前單獨提供以便公開。此處不能解釋為承認(rèn)因為先前公開發(fā)明人沒有資格提前此公開的日期。門診病人臨床診斷對于降低不比要的、常常是創(chuàng)傷性的或疼痛的過程的成本是有用的。作為一種篩選工具，結(jié)腸鏡檢查被認(rèn)為是對于患者和承保人均負(fù)擔(dān)巨大，并且本身帶有小比率的風(fēng)險和并發(fā)癥。鋇灌腸和CT結(jié)腸成像(或者仿真結(jié)腸鏡)，像結(jié)腸鏡檢查，會提供完全的結(jié)腸檢查，但是小的息肉或者甚至小的癌癥被錯過。成本高，但如果放射科醫(yī)生解釋為息肉或癌癥或者甚至建議為息肉或癌癥則成本更高，因這需要額外的結(jié)腸鏡檢查過程以證實。鋇灌腸、CT結(jié)腸成像和結(jié)腸鏡檢查方法均需要患者在前一天進(jìn)行徹底的機(jī)械腸道準(zhǔn)備。本文所述的診斷試驗和組合物對于鑒定、診斷和預(yù)測將受隨訪或治療胃腸疾病或病癥，包括發(fā)展成息肉、癌性病變或其他非癌性炎性疾病的受試者是有用的。在一些情況下，受試者不可能獲得或者知道他們的家族病史。在此類情況下，本公開的診斷學(xué)可以用于基于FHSH生物標(biāo)志組確定他們是否具有患胃腸疾病或病癥的易感性。在受試者被鑒定具有FHSH胃腸道疾病或病癥的另外的方面中，可以基于癌癥生物標(biāo)志組檢測受試者中預(yù)示著癌性病變或息肉的生物標(biāo)志表達(dá)的變化。在存在與結(jié)直腸癌相關(guān)的生物標(biāo)志組的情況下，可以通過例如結(jié)腸鏡檢查監(jiān)測受試者用于早期檢測和去除息肉或癌性病變。本文提供的生物標(biāo)志組的一個優(yōu)點是，組可以通過拭子收集(例如5-10cm頰或直腸區(qū)域的拭子)檢測。此類方法可以在門診病人治療環(huán)境中開展。如上面所指出，統(tǒng)計學(xué)表明，早期檢測和去除癌性病變和息肉降低受試者發(fā)病率和死亡率。腺瘤、結(jié)腸腺瘤、扁平腺瘤和息肉在本文中用于描述結(jié)腸的任何癌前瘤形成。癌前結(jié)腸瘤形成被稱為腺瘤或腺瘤性息肉。腺瘤有代表性地是結(jié)腸內(nèi)表上的小的蘑菇樣或者疣樣生長，并且不浸入結(jié)腸壁。腺瘤可以通過裝置可見，例如結(jié)腸鏡或者能曲的乙狀結(jié)腸鏡。幾項研究表明，經(jīng)歷腺瘤篩選和去除的患者的結(jié)腸癌死亡率降低。由于該原因及其他原因，普遍承認(rèn)腺瘤是大多數(shù)結(jié)腸癌的專性前體。當(dāng)結(jié)腸瘤形成侵入到結(jié)腸基膜時，則其被認(rèn)為是結(jié)腸癌。最廣泛使用的分期系統(tǒng)普遍使用用于分期的下列特性中的至少一種特性腫瘤穿入到結(jié)腸壁的程度，更大的穿透通常與更危險性的腫瘤相關(guān)；腫瘤通過結(jié)腸壁并且侵入至其他鄰近組織的程度，更大的侵入通常與更危險性的腫瘤相關(guān)；腫瘤侵入至區(qū)域淋巴結(jié)的程度，更大的侵入通常與更危險性的腫瘤相關(guān)；和轉(zhuǎn)移侵襲至更遠(yuǎn)組織，例如肝臟的程度，更大的轉(zhuǎn)移侵襲通常與更危險的疾病狀態(tài)相關(guān)。等位基因指特定形式的基因座，其通過其特定的核苷酸序列或者在多態(tài)性位點發(fā)現(xiàn)的可選擇多態(tài)性之一與其它形式相區(qū)別。生物樣品指從受試者獲得的樣品，其中樣品包括細(xì)胞或者可以是無細(xì)胞的。生物樣品可以是血液、痰、唾液、組織、糞便、尿、血清、腦脊髓等。當(dāng)樣品是組織時，組織樣品可以通過活組織檢查獲得。活組織檢查樣品可以從胃腸道獲得(例如從盲腸和肝曲之間的結(jié)腸段獲得，歸類為升結(jié)腸樣品；從肝曲和脾曲間的結(jié)腸段獲得，歸為橫結(jié)腸樣品；從脾曲之下的結(jié)腸段獲得，歸為降結(jié)腸；從降結(jié)腸之下的結(jié)腸纏繞段獲得，歸類為直腸乙狀結(jié)腸結(jié)腸樣品(距離直腸約5-25cm))。生物樣品可以通過無創(chuàng)方式獲得(例如通過拭子)。例如，拭子可以從口或直腸獲得。在一個實施方案中，拭子從受試者的頰部區(qū)域獲得，例如頰或咽喉。最低程度的有創(chuàng)方法例如拭子，或者無創(chuàng)取樣方法例如糞便樣品可以獲得，并且在本公開方法中使用拭子或其制備物。與拭子樣品相比，活組織檢查傾向于得到更加異質(zhì)性的細(xì)胞類型混合物(例如上皮、基質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞)，拭子樣品具有更高比率的結(jié)直腸表面上的細(xì)胞類型(例如上皮和炎性細(xì)胞)。生物標(biāo)志指與特定表型或發(fā)展成特定表型風(fēng)險相關(guān)的可檢測生物實體。生物實體可以是多肽或多核苷酸。待檢測的生物標(biāo)志被稱為靶。例如，耙多核苷酸指包含待檢測多核苷酸(例如mRNA或cDNA)的生物標(biāo)志。在另一實例中，耙多肽指待檢測的所表達(dá)(即轉(zhuǎn)錄和翻譯的)蛋白質(zhì)。如國立衛(wèi)生研究院(NIH)所定義，生物標(biāo)志指可以用于測定疾病進(jìn)程或者治療效果的特定生物性質(zhì)、生物特性或方面的分子指示物。一組生物標(biāo)志是至少兩種生物標(biāo)志的選用。生物標(biāo)志可以來自多種類別的分子。原則上，所使用的基因數(shù)量越大，分析將會越靈敏。然而，隨組的大小增加，分析變得更復(fù)雜和耗時。組可包含2種至16種或更多種基因或生物標(biāo)志。在一個方面中，組包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多種基因或生物標(biāo)志。結(jié)果表明，對于患有癌癥的個體，三種或四種基因，例如C0X-2、IL-8和CD44足夠。然而，對于有息肉的個體或者有癌癥病史的個體，通過增加或者改變基因的組對分析進(jìn)行細(xì)調(diào)則提高特異性。術(shù)語"結(jié)腸"，如本文所使用，旨在包括右結(jié)腸(包括盲腸)、橫結(jié)腸、左結(jié)腸和直腸。對照受試者指無息肉和無癌癥或已知上胃腸問題家族或自身病史的個體。具有任何癌癥家族病史或者任何癌癥個人病史并且在當(dāng)前的結(jié)腸鏡檢查中沒有息肉的受試者被稱為FHSH受試者。具有息肉并且具有或不具有任何癌癥家族病史或自身病史的受試者被稱為息肉受試者并且包含F(xiàn)HSH受試者的生物標(biāo)志組。具有結(jié)腸癌的受試者被稱為癌癥受試者并且包含癌癥受試者的生物標(biāo)志組。大便潛血檢測(F0BT)是用于檢查糞便中隱藏血液的檢測。有時，癌癥或息肉可以出血，并且F0BT用于檢測小量出血。此外，可對結(jié)腸癌高風(fēng)險或者具有陽性F0BT和/或生物標(biāo)志結(jié)果的患者定期開展篩選試驗(例如直腸檢查、直腸鏡檢查和結(jié)腸鏡檢查)。直腸鏡檢查發(fā)現(xiàn)全部結(jié)腸和直腸癌癥的大約一半。在治療之后，可開展血液試驗和x-射線以篩選復(fù)發(fā)。結(jié)直腸癌也稱為結(jié)腸癌或大腸癌，包括結(jié)腸、直腸和闌尾中的癌性生長。許多結(jié)直腸癌由結(jié)腸中的腺瘤性息肉引起。這些生長通常是良性的，但是隨著時間的推移一些可能發(fā)展成癌癥。大多數(shù)時候，局部結(jié)腸癌通過結(jié)腸鏡檢查診斷。治療通常是通過手術(shù)，在許多情況下，手術(shù)之后是化學(xué)療法。結(jié)腸息肉，特別是腺瘤性息肉是結(jié)腸癌的危險因素。在結(jié)腸鏡檢查時去除結(jié)腸息肉減少了結(jié)腸癌的并發(fā)風(fēng)險。先前診斷為結(jié)腸癌并治療的個體具有在將來發(fā)展成結(jié)腸癌的風(fēng)險。已經(jīng)患有卵巢、子宮或乳腺癌的婦女具有發(fā)展成結(jié)直腸癌的較高風(fēng)險。特別是在55歲之前的近親屬或者多個親屬當(dāng)中具有結(jié)腸癌家族病史增加了受試者的癌癥風(fēng)險。胃腸炎癥指胃腸道黏膜層的炎癥，并且包括急性和慢性炎性情況。急性炎癥通常表征為短時間發(fā)作和嗜中性粒細(xì)胞的滲入或流入。慢性炎癥通常表征為相對長的發(fā)作期和單核細(xì)胞的滲入或流入。慢性炎癥還可以表征為周期性的自行緩解和自行發(fā)作。胃腸道黏膜層包括腸(包括小腸和大腸)、直腸、胃(胃的)內(nèi)壁、口腔等等的黏膜。慢性胃腸炎癥實例包括炎性腸病(IBD)、環(huán)境剌激引起的結(jié)腸炎(例如治療方案如施用化學(xué)療法、放射療法等等引起或與之相關(guān)(例如作為副作用)的胃腸炎癥(例如結(jié)腸炎))、在例如慢性肉芽腫病情況下的結(jié)腸炎(Sch即pi等.ArchDisChild.2001Feb;84(2):147-151)、腹腔疾病、乳糜瀉(一種對在攝入稱作谷蛋白的蛋白質(zhì)反應(yīng)時腸內(nèi)壁發(fā)炎的遺傳病)、食物過敏、胃炎、傳染性胃炎或小腸結(jié)腸炎(例如幽門螺桿菌感染性慢性活動性胃炎)和傳染原引起的其他形式的胃腸炎癥和其他相似情況。如本文所使用，"炎性腸病"或"IBD"指表征為全部或部分腸炎癥的任何種類疾病。炎性腸病的實例包括，但不限于克羅恩病、巴雷特病或潰瘍性結(jié)腸炎。在本說明書通篇提到的IBD常常在說明書中指示例性的胃腸炎性狀況，并且不意味著是限制性的。術(shù)語IBD包括假膜性結(jié)腸炎、出血性結(jié)腸炎、溶血尿毒癥綜合癥結(jié)腸炎、膠原性結(jié)腸炎、缺血性結(jié)腸炎、放射性結(jié)腸炎、藥物和化學(xué)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎、轉(zhuǎn)向性結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合癥、過敏性結(jié)腸綜合癥、巴雷特病和克羅恩??；并且在克羅恩病中包括活動型、頑固型和瘺型所有亞型和克羅恩病。胃腸道的非結(jié)直腸癌炎性疾病或病癥指無癌性病變、腫瘤或損害下的胃腸道炎癥。胃腸道非結(jié)直腸癌炎性疾病或病癥包括炎性腸病。基因指包含蛋白質(zhì)編碼序列的基因組DNA片段，其中片段可以包括啟動子、外顯子、內(nèi)含子和控制表達(dá)的其他非翻譯區(qū)?；蛐褪窃趥€體的一對同源染色體上的基因座中，在一套一個或更多個多態(tài)性位點存在的一個或多個核苷酸對的無序(皿phased)5'至3'序列。如本文所使用，基因型包括全基因型和/或亞基因型?；蚍中褪怯糜跍y定個體基因型的方法。單元型是在單一個體的單一染色體上的基因座中的一套一個或更多個多態(tài)性位點存在的核苷酸5'至3'序列。單元型對是在單一個體基因座中存在的兩個單元型。單元型分析是用于測定個體中一個或更多個單元型的方法并且包括使用家族系譜、分子技術(shù)和/或統(tǒng)計推斷?；蜃溉旧w或DNA分子上對應(yīng)于基因或物理或基因型特性的位置，其中物理9特性包括多態(tài)性位點。多態(tài)性位點(PS)是染色體或DNA分子上的、在種群中存在至少兩種可選擇序列的位置。多態(tài)性指在多態(tài)性位點上個體當(dāng)中存在序列變異。多態(tài)性包括核苷酸替代、插入、缺失和微衛(wèi)星，并且可以，但未必導(dǎo)致基因表達(dá)或蛋白質(zhì)功能的可檢測的差別。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是多態(tài)性位點上核苷酸變異中的單個改變。寡核苷酸探針或引物指長度在8和2000個核苷酸之間的核酸分子，或者指長度為大約6和1000個核苷酸。更加具體而言，這些寡核苷酸的長度可以在從大約8、10、15、20或30至100個核苷酸范圍內(nèi)，但是有代表性地是大約10至50(例如15至30個核苷酸)。對于特定的一組條件下的本公開試驗中寡核苷酸的適當(dāng)長度可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過經(jīng)驗確定。寡核苷酸引物和探針可以通過任何適當(dāng)方法制備，包括例如適當(dāng)序列的克隆和限制性處理和直接化學(xué)合成。寡核苷酸引物和探針可包含常規(guī)核苷酸，以及任何多樣的類似物。例如，術(shù)語"核苷酸"，如本文所使用，指包含連接至糖如核糖、阿拉伯糖、木糖和吡喃糖及其糖類似物C-1'碳的核苷酸堿基的化合物。術(shù)語核苷酸還包括核苷酸類似物。糖可以是取代的或非取代的。取代核糖包括，但不限于其中一個或更多個碳原子，例如2'碳原子被一個或更多個相同或不同的Cl、F、一R、一0R、一NR2或鹵素基取代的那些核糖，其中R獨立地是H、C「Ce烷基或C「CM芳基。示例性的核糖包括，但不限于2'-(Q-Ce)烷氧基核糖、2'_(C5-C14)芳氧基核糖，2'，3'-二脫氫核糖、2'-脫氧_3'-鹵核糖、2'-脫氧_3'_氟核糖、2'-脫氧_3'_氯核糖、2'-脫氧_3'_氨基核糖、2'-脫氧-3'-((^-(:6)烷基核糖、2'-脫氧_3'-((^-(:6)烷氧基核糖和2'-脫氧_3'_(C5-C14)芳氧基核糖、核糖、2'_脫氧核糖、2'，3'_二脫氧核糖、2'_鹵核糖、2'-氟核糖、2'_氯核糖和2'_烷基核糖，例如2'-0_甲基，4'_^-端基異構(gòu)核苷酸、1'-a-端基異構(gòu)核苷酸、2'-4'-和3'-4'-連接的和其他"鎖定的"或"LNA"雙環(huán)糖修飾(見例如PCT公布申請?zhí)朩O98/22489、W098/39352;和W099/14226)。示例性的多核苷酸內(nèi)LNA糖類似物包括，但不限于結(jié)構(gòu)其中B是任意核苷酸堿基。在核糖2'_或3'_位上的修飾包括，但不限于氫、甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、甲氧乙基、烷氧基、苯氧基、疊氮基、氨基、烷氨基、氟、氯和溴。核苷酸包括，但不限于天然D光學(xué)異構(gòu)體，以及L光學(xué)異構(gòu)體形式(見例如Garbesi(1993)Nucl.AcidsRes.21:4159-65;Fujimori(1990)J.Amer.Chem.Soc.112:7435;Urata，(1993)NucleicAcidsS卿osiumSer.No.29:69-70)。當(dāng)核苷酸堿基是嘌呤時，例如A或G，核糖連接至核苷酸堿基的Nf位。當(dāng)核苷酸堿基是嘧啶時，例如C、T或U，戊糖連接至核苷酸堿基^-位，假尿苷除外，在假尿苷中戊糖連接至尿嘧啶核苷酸堿基的(:5位(見例如Kornberg禾口Baker，(1992)DNAReplication,2ndEd.，F(xiàn)reeman,SanFrancisco,Calif.)。探針的3'末端可以用捕獲標(biāo)記或可檢測標(biāo)記功能化，以幫助檢測靶多核苷酸多態(tài)性。本公開的任何寡核苷酸或核酸可通過摻入可通過光譜學(xué)、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)或化學(xué)手段可測量的可檢測標(biāo)記來標(biāo)記。例如，此類標(biāo)記可以包含放射活性物質(zhì)(例如32P、35S、3H、125I)、熒光染料(例如5-溴脫氧尿苷、熒光素、乙酰氨基芴、地高辛配基)、生物素、納米顆粒等等。此類寡核苷酸代表性地在其3'和5'末端被標(biāo)記。10探針指可檢測性地區(qū)分基因表達(dá)變化的分子，或者可以區(qū)分結(jié)構(gòu)不同的靶分子的分子。檢測可以以多種不同方式實現(xiàn)，這取決于所使用的探針類型和靶分子類型。因此，例如檢測可以基于靶分子活性水平的差別，但是有代表性地是基于對特異結(jié)合的檢測。此類特異結(jié)合的實例包括抗體結(jié)合和核酸探針雜交。因此，例如探針可以包括酶底物、抗體和抗體片段和核酸雜交探針(包括用于多核苷酸擴(kuò)增和/或檢測的引物)。因此，在一個實施方案中，檢測至少一種靶多核苷酸的存在或缺乏包括將生物樣品與探針、有代表性地寡核苷酸探針接觸，其中探針與包含互補序列的生物樣品中的一種形式的靶多核苷酸雜交，其中雜交在選擇性雜交條件下開展。此種寡核苷酸探針可以包括一個或更多個核酸類似物、標(biāo)記或其他替代物或部分，只要保留了堿基配對功能即可。參照或?qū)φ杖后w指這樣的一組受試者或個體，經(jīng)預(yù)測他們代表著在具有特定基因型或表達(dá)譜的一般群體中存在的遺傳變異。有代表性地，參照群體代表著群體中至少85%、有代表性的至少90%、至少95%和通常至少99%的確定水平的遺傳變異。參照或者對照群體可以包括證明個體沒有任何胃腸疾病或病癥的受試者，并且可以包括其家族系證明沒有或者已經(jīng)證明沒有任何胃腸疾病或病癥的個體。受試者包括其基因表達(dá)、基因型或單元型或?qū)χ委煹姆磻?yīng)或者疾病狀態(tài)有待確定的個體(例如哺乳動物受試者或人)。本公開提供用于預(yù)測受試者易患胃腸疾病或病癥易感性或存在胃腸疾病或病癥的許多生物標(biāo)志。本文鑒定的生物標(biāo)志可以與另外的預(yù)測性試驗，包括但不限于另外的SNP、突變和臨床試驗組合使用。所公開的一個此類實施方案是測量至少一個或一組具有選擇性和敏感性的生物標(biāo)志，所述這些生物標(biāo)志對于管理和診斷受試者具有或者易感胃腸疾病或病癥而言是必需的。表1提供用于本公開方法和組合物中的多核苷酸生物標(biāo)志列表(在表1中所述的與Entrez登錄號相關(guān)的每一序列通過參考并入本文)。表1SEQIDN0:多核苷酸和多肽NCBIEntrez數(shù)據(jù)庫名稱縮寫1和2XM—031289白細(xì)胞介素-8IL83和4NM—000389細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑lA(p21，Cipl)P215和6XM—030326CD44抗原CD447和8M94582白細(xì)胞介素8受體BCXCR29和10X54489黑素瘤生長刺激活性Gro-a11和12NM—002090趨化因子(C-X-C模體)配體3Gro-y11<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>本公開包括表1中所鑒定的任何前述多核苷酸的同系物和天然存在變體(例如多態(tài)性)。此類天然存在多態(tài)性的鑒定是常規(guī)鑒定，或者是本領(lǐng)域已知的。例如，IL-8和CXCR2的多態(tài)性包括IL-8的SNP-251、-353/+1530、-353/+3331和+1530/+3331和CXCR2的SNP+785/+1208。其他包括IL1B-31SNP(C至T)、IL10-819T/T。RS號包括rsl143627(IL1B)、rs2243250和rsl143634(IL4)、rsl801282(PPAR-y)、rs4073(IL8)、rsl800629(TNF)和rs20417、rs5277、rs20432和rs5275(C0X2)。在本公開的一個方面中，包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43所標(biāo)明生物標(biāo)志的多核苷酸的表達(dá)水平用于確定胃腸疾病或病癥或者易患胃腸疾病或病癥的易感性。多核苷酸表達(dá)水平的此類分析在本領(lǐng)域中常常被稱作基因表達(dá)譜分析。在基因表達(dá)譜分析中，測量樣品中mRNA水平作為生物狀態(tài)的指示劑，在該例中作為結(jié)腸癌或胃腸疾病或病癥的指示劑或者作為易患它們的易感性的指示劑。用于分析基因表達(dá)譜的最常用的方法之一是使用稱作逆轉(zhuǎn)錄的過程從生物樣品中的mRNA產(chǎn)生多份拷貝。在逆轉(zhuǎn)錄過程中，來自樣品的mRNA用于產(chǎn)生對應(yīng)于mRNA的DNA拷貝。從mRNA產(chǎn)生的拷貝被稱為拷貝DNA或cDNA。mRNA多少有點不穩(wěn)定并且易被RNA酶降解。在一個方面中，可以通過使用本領(lǐng)域已知的RNA酶抑制劑和混合物保護(hù)RNA。表2提供用于檢測本公開多核苷酸生物標(biāo)記的探針和引物。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>本領(lǐng)域已知的方法可以用于定量測定樣品中存在的細(xì)胞所轉(zhuǎn)錄的mRNA的量。此類方法的實例包括定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、Northern印跡和Southern印跡。PCR使得可以使用擴(kuò)增過程檢測和測量極低量的mRNA。在任何特定生物狀態(tài)中基因可以被上調(diào)或者下調(diào)，并且因此mRNA水平相應(yīng)地變化。在一個實施方案中，基因表達(dá)譜分析的方法包括測量組中所選擇生物標(biāo)志的mRNA水平。此種方法可以包括使用引物、探針、酶和用于mRNA制備、檢測和定量的其他試劑(例如通過PCR、Northern印跡等等)。SEQIDNO:45-88中所列引物特別適用于基于多核苷酸生物標(biāo)志的使用RT-PCR的基因表達(dá)譜分析中。雖然本公開提供特定的引物和探針，本領(lǐng)域技術(shù)人員會容易地認(rèn)識到，另外的探針和引物可以基于本公開所提供的多核苷酸序列產(chǎn)生。關(guān)于本文中例舉的弓l物禾口探針，使用PrimerExpressSoftware(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，Calif.)設(shè)計一系列引物。SEQIDNO:45-88中所列引物被設(shè)計、選擇并相應(yīng)地試驗。除了引物之外，對于RT-PCR還使用試劑，例如具有所有四種二核苷酸三磷酸(例如dATP、dGTP、dCTP和dTTP)的二核苷酸三磷酸混合物、逆轉(zhuǎn)錄酶和熱穩(wěn)定DNA聚合酶。此外，對于RT-PCR過程還使用緩沖液、抑制劑和激活劑。一旦cDNA已經(jīng)充分?jǐn)U增至特定的終點，可以制備cDNA樣品用于檢測和定量。雖然考慮了許多檢測方案，如將在下面更加詳細(xì)討論，但是考慮用于檢測多核苷酸的一個方法是熒光光譜學(xué)，并且因此適于熒光光譜學(xué)的標(biāo)簽是多核苷酸標(biāo)記所需要的。此種熒光標(biāo)簽的一個實例是SYBRGreen，雖然眾多相關(guān)熒光分子是已知的，包括但不限于DAPI、Cy3、Cy3.5、Cy5、CyS.5、Cy7、傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明、二氯三嗪氨基熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白。在本公開的一個實施方案中，寡核苷酸探針包含如表1中所述c-myc、CD44抗原("CD44")、環(huán)加氧酶1禾P2("C0X-l"和"C0X-2")、細(xì)胞周期蛋白Dl、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑("p2ri—a"")、白細(xì)胞介素8("IL-8")、白細(xì)胞介素8受體("CXCR2")、骨橋蛋白("OPN")、黑素瘤生長剌激活性("Groa/MGSA")、GR03癌基因("Groy")、巨噬細(xì)胞集落剌激因子l("MCSF-1")、過氧化物酶體增殖活化的受體、a、S和Y("PPAR-a、S和Y")和血清淀粉狀蛋白Al("SM1")的片段。用于本發(fā)明方法的寡核苷酸探針和引物包含SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的至少8個核苷酸(包括其中T可以是U的寡核苷酸)，其中寡核苷酸特異性雜交至來自受試者的包含SEQIDN0:1、3、5、7、9U1、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的多核苷酸樣品。本公開的任何寡核苷酸引物和探針可以被固定化在固體支持物上。固體支持物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且包括反應(yīng)盤孔壁、試管、聚苯乙烯珠、磁珠、硝酸纖維素條、膜、微粒例如乳膠顆粒、玻璃等等。固體支持物不是關(guān)鍵性的并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。因此，乳膠顆粒、微粒、磁珠或非磁珠、膜、塑料管、微量滴定孔壁、玻璃或硅芯片等等均是適宜的實例。用于將寡核苷酸固定化于固相上的適宜方法包括離子相互作用、疏水相互作用、共價相互作用等等。固體支持物可以根據(jù)其吸引或者固定化捕獲試劑的內(nèi)在能力選擇。本公開的寡核苷酸探針或引物可以個別地附著至或者固定化于固體支持物上或者以一組大約2-10，000種不同的本公開寡核苷酸的附著至或者固定化于一個固體支持物上。包含本公開多種寡核苷酸引物或探針的基質(zhì)可以用于檢測或擴(kuò)增所靶向的序列。本公開的寡核苷酸探針和引物可以附在固體支持物上的連續(xù)區(qū)域或者隨機(jī)位置。備選地，本公開的寡核苷酸可以有序陣列附著，其中每一寡核苷酸附在固體支持物的獨立區(qū)域，該區(qū)域與任何其他寡核苷酸附著位置不重疊。有代表性地，此類寡核苷酸陣列是"可尋址的"，以致于作為試驗過程的一部分，不同的位置被記錄并且可以被訪問。陣列上寡核苷酸位置的獲知使得"可尋址"陣列可用于雜交試驗中。例如，寡核苷酸探針可用于寡核苷酸芯片中，例如由Affymetrix投放市場的那些芯片和美國專利號5，143，854;PCT公布W090/15070和92/10092中描述的那些芯片，其公開內(nèi)容通過參考并入本文。這些陣列可以使用機(jī)械合成方法或整合了光刻方法和固相寡核苷酸合成組合的光定向合成方法生產(chǎn)。通過開發(fā)通常稱作"極大規(guī)模固定化多聚體合成"的技術(shù)，使得寡核苷酸陣列在固體支持物上的固定成為可能，其中探針被固定在芯片固體表面上的高密度陣列中(見例如美國專利號5，143，854;和5，412，087和PCT公布W090/15070，WO92/10092和WO95/11995，每一文獻(xiàn)通過參考并入本文)，其描述了通過技術(shù)如光定向合成技術(shù)制備寡核苷酸陣列的方法。在另一方面中，與靶基因亞序列互補的寡核苷酸陣列用于確定靶的身份、測定其數(shù)量和檢測靶與參照野生型序列之間的差別。雜交技術(shù)還可以用于鑒定本公開的生物標(biāo)志和/或多態(tài)性，并且因此確定或預(yù)測結(jié)直腸癌或胃腸炎性疾病或病癥。在該方面中，基于與錯配探針相比完全匹配探針的更高的熱穩(wěn)定性鑒定表達(dá)譜或多態(tài)性。雜交反應(yīng)可以以固體支持物(例如膜或芯片)形式開展，在其中例如靶核酸被固定在硝酸纖維素或尼龍膜上并且用本公開的寡核苷酸探針探測?？梢允褂萌魏我阎碾s交形式，包括Southern印跡、狹縫印跡、"反向"斑點印跡、溶液雜交、基于固體支持物的夾心雜交、基于珠的雜交形式、基于硅芯片的雜交形式和基于微量滴定孔的雜交形式。寡核苷酸探針與靶多核苷酸的雜交可以以兩種實體均在溶液中的形式實現(xiàn)，或者此類雜交可以以寡核苷酸或者靶多核苷酸共價或非共價附著至固體支持物上的方式實現(xiàn)。附著可以通過例如抗體-抗原相互作用、聚-L-Lys、鏈親和素或抗生物素蛋白-生物素、鹽橋、疏水相互作用、化學(xué)鍵、UV交聯(lián)烘烤等介導(dǎo)。寡核苷酸可以直接在固體支持物上合成或者在合成之后附著至固體支持物上。適宜在本公開檢測方法中使用的固體支持物包括由硅、玻璃、塑料、紙等制成的基質(zhì)，其可以形成例如孔(如在96孔板中)、載玻片、片、膜、纖維、芯片、盤和珠。固體支持物可以經(jīng)過處理、包被或者衍生化，以促進(jìn)等位基因特異的寡核苷酸或靶核酸固定化。在一個方面中，夾心雜交試驗包括使用固定在固體支持物上的共同的捕獲寡核苷酸分離樣品中的變體和/或野生型靶核酸生物標(biāo)志，然后與用于檢測變體和野生型核酸的特異性探針接觸。寡核苷酸探針有代表性地用可檢測標(biāo)簽標(biāo)記?；诠押塑账彡嚵械碾s交試驗依賴于短寡核苷酸與完全匹配靶變體和錯配靶變體雜交穩(wěn)定性的差異。每一DNA芯片可以包含數(shù)千至數(shù)百萬個各合成的DNA探針，它們以網(wǎng)格樣方式排列，并且小型化至一角硬幣大小或者更小。此種芯片可以包含代表野生型和變體序列的寡核苷酸。本公開的寡核苷酸可以設(shè)計成特異性雜交至多核苷酸的靶區(qū)。如本文所使用，特異性雜交意味著寡核苷酸在某些雜交條件下與靶區(qū)域形成反平行的雙鏈結(jié)構(gòu)，而在同樣的雜交條件下與不同靶多核苷酸或者多核苷酸的另一區(qū)域或者缺乏目的基因座的多核苷酸孵育時不能形成此種結(jié)構(gòu)。有代表性地，寡核苷酸在常規(guī)高嚴(yán)格條件下特異性地雜交至靶區(qū)域。如果核酸分子如寡核苷酸或多核苷酸的一個分子的每一個核苷酸與其他分子的相應(yīng)位置上的核苷酸互補，則核酸分子被稱作另一核酸分子的"完全"互補體。如果核酸分子在常規(guī)低嚴(yán)格條件下與另一分子雜交具有足以保持雙鏈體形式的穩(wěn)定性，則該核酸分子與另一分子"基本上互補"。常規(guī)雜交條件描述于例如Sambrook等，MolecularCloning,ALaboratoryMa皿al，2nded.，ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)禾口Haymes等，NucleicAcidHybridization,APracticalApproach,IRLPress,Washington,D.C.(1985)。盡管在檢測耙多核苷酸或多態(tài)性的大多數(shù)試驗中使用完全互補的寡核苷酸時，但也考慮了使用不完全互補的寡核苷酸，其中這種不完全互補不阻止分子特異性雜交至靶區(qū)域。例如，寡核苷酸引物可以在其5'或3'末端具有非互補性片段，而引物的剩余部分與靶區(qū)域互補。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉影響雜交的參數(shù)；例如溫度、探針或引物長度和組成、緩沖液組成和鹽濃度，并且可以容易地調(diào)整這些參數(shù)以完成核酸與靶序列的特異雜交。在本公開中可以使用多種雜交條件，包括高嚴(yán)格條件、中嚴(yán)格條件和低嚴(yán)格條件；見例如Maniatis等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，1989，禾口ShortProtocolsinMolecularBiology,編者Ausubel等，所述文獻(xiàn)通過參考并入本文。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，并且將根據(jù)情況的不同而不同。更長的序列在更高的溫度下特異性雜交。雜交核酸的多方面指南可以在Tijssen，TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology__HybridizationwithNucleicAcidProbes,〃Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofhucleicacidassays"(1993)中找到。一般而言，選擇的嚴(yán)格條件比確定的離子強度和pH下特定序列的熱熔解點(TJ低大約5-l(TC。1是在平衡狀態(tài)下50%的與靶互補的探針雜交至(在確定的離子強度、pH和核酸濃度下)多聚腺苷酸mRNA靶序列的溫度(如靶序列過量存在，在Tm時，在平衡狀態(tài)下50%的探針被占據(jù))。嚴(yán)格條件將會是那樣的條件，即在pH7.0至8.3下鹽濃度小于大約1.OM鈉離子，有代表性地大約0.01至1.0M鈉離子濃度(或者其他鹽)并且溫度對于短探針(例如10至50個核苷酸)至少大約3(TC并且對于長探針(例如大于50個核苷酸)至少大約6(TC。嚴(yán)格條件還可以通過添加螺旋去穩(wěn)定劑如甲酰胺達(dá)到。當(dāng)使用如本領(lǐng)域已知的非離子主鏈，即PNA時，雜交條件也可以變動。此外，在靶結(jié)合之后可以加入交聯(lián)劑，以交聯(lián)即共價連接雜交復(fù)合體的兩條鏈。本公開的方法和組合物可用于診斷或測定發(fā)展成結(jié)直腸癌或胃腸炎性疾病或病癥的風(fēng)險。此類試驗可以使用從血液、細(xì)胞、組織刮取物或其他細(xì)胞材料收集的DNA或RNA樣品開展，并且可以通過多種方法，包括但不限于使用生物標(biāo)志特異性探針的雜交、酶突變檢測、錯配的化學(xué)斷裂、質(zhì)譜分析法或DNA測序，包括微測序?qū)崿F(xiàn)。診斷試驗可包括常常在固體支持物上的或者使用PCR技術(shù)的一組的一種或更多種遺傳標(biāo)記(基因表達(dá)譜)，這使得能夠同時確定一種或更多種基因中的一個以上的變異或者一種或更多種基因的表達(dá)。靶生物標(biāo)志或其一個或多個區(qū)域(例如包含目的多態(tài)性)可以使用任何寡核苷酸指導(dǎo)的擴(kuò)增方法，包括但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(美國專利號4，965，188)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)(Barany等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:189-93(1991);W090/01069)和寡核苷酸連接試驗(0LA)(Landegren等，Science241:1077-80(1988))擴(kuò)增。另外的已知核酸擴(kuò)增方法可以用于擴(kuò)增靶的一個或多個區(qū)域，包括基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(美國專利號5，130，238;歐洲專利號EP329，822;美國專利號5，169，766;W089/06700)和等溫方法(Walker等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:392-6(1992))。連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)技術(shù)可以使用，并且對于檢測多態(tài)性變體特別有用。LCR僅在寡核苷酸堿基完全配對時發(fā)生。連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)利用熱穩(wěn)定Taq連接酶用于連接擴(kuò)增，其對于查詢基因座是有用的(例如包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43)。與PCR類似的DNA擴(kuò)增方法LCR與PCR不同的原因在于，LCR擴(kuò)增探針分子，而不是通過核苷酸的聚合產(chǎn)生復(fù)制子。對于每一DNA鏈?zhǔn)褂脙蓚€探針，并且連接在一起形成一個探針。LCR使用DNA聚合酶和DNA連接酶兩種酶以驅(qū)動反應(yīng)。像PCR—樣，LCR需要熱循環(huán)儀以驅(qū)動反應(yīng)并且每一循環(huán)導(dǎo)致靶核酸分子加倍。LCR可以具有比PCR更高的特異性。提高的反應(yīng)溫度允許連接反應(yīng)以高嚴(yán)格條件開展。當(dāng)發(fā)生錯配時，不能完成連接。例如，在兩個片段中合成基于靶基因或基因變體的引物，并且與在兩個引物片段邊界具有可能的突變的模板復(fù)性(即上面的加下劃線的核苷酸將存在于寡核苷酸的5'或3'末端)。如果它們與模板序列恰好匹配，則連接酶連接兩個引物。在一個實施方案中，將兩種雜交探針設(shè)計成每一探針具有靶特異區(qū)。將第一雜交探針設(shè)計成與靶多核苷酸的第一靶結(jié)構(gòu)域(例如多核苷酸片段)基本上互補，并且第二雜交探針與靶多核苷酸的第二靶結(jié)構(gòu)域(例如多核苷酸片段)基本上互補。通常，雜交探針的每一靶特異序列長度至少大約5個核苷酸，有代表性的是大約15至30個核苷酸的序列，特別常用的是20個核苷酸的序列。在一個實施方案中，第一和第二靶結(jié)構(gòu)域正好相鄰，例如它們沒有間插核苷酸。在該實施方案中，至少第一雜交探針雜交至第一靶結(jié)構(gòu)域并且第二雜交探針雜交至第二靶結(jié)構(gòu)域。如果在連接處存在完全的互補性，則形成連接結(jié)構(gòu)以致于兩種探針可以連接在一起形成連接的探針。如果不存在該互補性(由于基于變體的錯配)，則不能形成連接結(jié)構(gòu)并且探針不能以可覺察的程度連接在一起。這可以使用熱循環(huán)完18成，以允許連接的探針變性脫離靶核苷酸以致于它可以充當(dāng)進(jìn)一步反應(yīng)的模板。如果加入dNTP和聚合酶，則方法還可以使用三種雜交探針或通過一個或更多個核苷酸分開的雜交探針實現(xiàn)(這有時被稱為"遺傳位元"分析)。DNA中的點突變(例如多態(tài)性變體)的分析也可以使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及其改變形式開展。錯配可以通過在有利于完全匹配引物結(jié)合的雜交條件下的競爭性寡核苷酸引發(fā)檢測。在擴(kuò)增受阻突變體系技術(shù)(ARMS)中，將引物設(shè)計成與靶序列的內(nèi)部或者3'殘基完全匹配或者錯配(Newton等，Nucl.Acids.Res.17:2503-2516(1989))。在適宜條件下，只有完全復(fù)性的寡核苷酸作為PCR反應(yīng)的引物起作用，因此提供了區(qū)分正常序列和變體序列的方法。還可以使用單一核苷酸引物指導(dǎo)的延伸試驗，其中正確堿基的特異性摻入通過DNA聚合酶的保真性提供。檢測目的多態(tài)性位點的核苷酸或核苷酸對還可以使用錯配檢測技術(shù)，包括但不限于使用核糖核酸探針的RNA酶保護(hù)方法(Winter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:7575(1985);Meyers等，Science230:1242(1985))和識別核苷酸錯配的蛋白質(zhì)，例如大腸桿菌(E.coli)mutS蛋白質(zhì)(Modrich，Ann.Rev.Genet.25:229-53(1991))確定。備選地，變體等位基因可以通過單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析(Orita等，Genomics5:874-9(1989);Humphries等，MOLECULARDIAGNOSISOFGENETICDISEASES,Elles編，第321-340頁，1996)或者變性梯度凝膠電泳(DGGE)(Wartell等，Nucl.AcidsRes.18:2699-706(1990);Sheffield等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:232-6(1989))鑒定。聚合酶介導(dǎo)的引物延伸方法還可以用于鑒定多態(tài)性。幾種此類方法已經(jīng)描述于專利和科學(xué)文獻(xiàn)中，并且包括"遺傳位元分析"法(WO92/15712)和連接酶/聚合酶介導(dǎo)的遺傳位元分析(美國專利號5，679，524)。相關(guān)方法描述于W091/02087、WO90/09455、WO95/17676和美國專利號5，302，509和5，945，283中。包含多態(tài)性互補物的延長的引物可以通過如美國專利號5，605，798中所述的質(zhì)譜分析法檢測。另一引物延伸方法是等位基因特異性PCR(Ruano等，1989，同上；Ruano等，1991，同上；WO93/22456;Turki等，J.Clin.Invest.95:1635-41(1995))。可以用于分析基因表達(dá)和多態(tài)性的另一技術(shù)包括多組分集成系統(tǒng)，其將過程如PCR和毛細(xì)管電泳反應(yīng)小型化在單一功能裝置上并做區(qū)劃。此類技術(shù)的實例描述于美國專利號5，589，136中，其公開全部通過參考并入本文，在其中描述了PCR擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳在芯片上的集成。定量PCR和數(shù)字PCR可以用于測量樣品中的多核苷酸水平。數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(數(shù)字PCR、dPCR或dePCR)可以用于直接定量和克隆性擴(kuò)增核酸，包括DNA、cDNA或RNA。數(shù)字PCR通過核酸分子與DNA聚合酶的溫度循環(huán)擴(kuò)增核酸。在PCR擴(kuò)增之前，反應(yīng)有代表性地在許多分開的室或區(qū)域內(nèi)的、捕獲樣品中存在的每一個別核酸分子的乳狀液分散相中開展。對包含可檢測水平PCR終產(chǎn)物的室的計數(shù)是對絕對核酸數(shù)量的直接測量。定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的改良并且實時定量PCR通過使用熒光標(biāo)記物或其他可檢測標(biāo)記物用于測量每一PCR循環(huán)之后的DNA的數(shù)量。定量PCR方法添加連續(xù)稀釋的競爭性RNA(對于逆轉(zhuǎn)錄酶PCR)或DNA，或者共擴(kuò)增內(nèi)部對照以保證在指數(shù)生長期停止擴(kuò)增。對PCR和PCR技術(shù)的修改在本領(lǐng)域是常規(guī)性的并且可以商業(yè)獲得用于PCR擴(kuò)增的試劑盒?？蓹z測標(biāo)記可以是放射性標(biāo)記或者可以是發(fā)光標(biāo)記、熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記。間接檢測方法有代表性地包含以半抗原或配體如地高辛(DIG)或生物素共價標(biāo)記的探針。在一個方面中，在雜交步驟之后，通過抗體_酶復(fù)合體或鏈親和素_酶復(fù)合體檢測靶_探針雙鏈體。在DNA診斷中通常使用的酶是辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶。直接檢測方法包括使用熒光體標(biāo)記的寡核苷酸、鑭系螯合物標(biāo)記的寡核苷酸或寡核苷酸_酶綴合物。熒光體標(biāo)記的實例是熒光素、羅丹明和酞菁染料。對于所公開方法考慮的檢測模式實例包括，但不限于，光譜技術(shù)，例如熒光和紫外-可見光(UV-Vis)光譜法、閃爍計數(shù)和質(zhì)譜法。與這些檢測模式相對應(yīng)的、用于在這些方法中檢測和定量目的的標(biāo)記的實例包括，但不限于發(fā)色標(biāo)記、閃爍標(biāo)記和質(zhì)量標(biāo)記。使用這些方法測量的多核苷酸和多肽的表達(dá)水平可以以對照標(biāo)準(zhǔn)化，所述對照為了定向測定目的建立。標(biāo)記檢測將基于特定試驗中所使用標(biāo)記的類型。此類檢測方法是本領(lǐng)域已知的。例如，放射性同位素檢測可以通過放射自顯影、閃爍計數(shù)或磷光體成像實現(xiàn)。對于半抗原或生物素標(biāo)記，使用結(jié)合至報告酶如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的抗體或鏈親和素檢測，這通過酶方法檢測。對于熒光體或鑭系-螯合物標(biāo)記，熒光信號可以用帶有或不帶有時間解析模式的熒光分光計或者使用自動微量滴定板閱讀器測量。對于酶標(biāo)記，檢測可以通過顏色或染料沉積(對于堿性磷酸酶是對硝基苯磷酸鹽或5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽/氮藍(lán)四唑，對于辣根過氧化物酶是3，3'-二氨基聯(lián)苯胺-Nicg.熒光(例如對于堿性磷酸酶是4-甲基傘形酮磷酸酯(4-methylumbel1iferylphosphate))或化學(xué)發(fā)光(來自Lumigenlnc.，DetroitMich.的堿性磷酸酶二氧環(huán)丁烷底物L(fēng)umiPhos530或者來自Tropix，Inc.的AMPPD和CSPD)進(jìn)行?；瘜W(xué)發(fā)光檢測可以使用X光片或者偏振片或者通過使用單光子計數(shù)發(fā)光計開展。在本公開的另一方面中，包含SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42和/或44的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，包括例如Western印跡、ELISA試驗等測量和定量。術(shù)語"多肽"或"多種多肽"與本文的"蛋白質(zhì)"或"多種蛋白質(zhì)"互換使用。在另一實施方案中，用于蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析的方法包括使用針對一種或更多種生物標(biāo)志的一種或更多種(例如許多種)抗體，以測量生物樣品中靶多肽的水平。在考慮用于本發(fā)明方法的一個實施方案中，對于組的抗體結(jié)合至固體支持物上。用于蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析的方法可以使用對所結(jié)合多肽的某些部分具有特異性的第二種抗體。此類第二種抗體可以以用于檢測和定量所結(jié)合多肽的分子進(jìn)行可檢測性標(biāo)記。此外，考慮用于檢測和定量的其他試劑包括例如小分子，例如輔因子、底物、絡(luò)合劑等等，或者大分子，例如凝集素、肽、寡核苷酸等等。此類部分可以是天然存在的或者合成的。本公開進(jìn)一步考慮了能夠特異性結(jié)合至生物標(biāo)志多肽的抗體，所述多肽由上面所鑒定多核苷酸生物標(biāo)志序列(例如包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43)基于轉(zhuǎn)錄和翻譯起始以正確的讀碼框編碼。本公開因此包括分離的、純化的和重組的多肽，所述多肽包含至少4個、有代表性地至少6個、更加通常至少8至10個連續(xù)長度，其由包含SEQIDNO:1、3、5、7、9U1、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、37、39、41或43的多核苷酸編碼。本公開還考慮免疫試驗技術(shù)用于測量本文所鑒定多肽生物標(biāo)志的用途。多肽生物標(biāo)志可以分離和用于制備特異性檢測生物標(biāo)志基因產(chǎn)物的抗血清和單克隆抗體。突變的基因產(chǎn)物也可以用于免疫動物以產(chǎn)生多克隆抗體。重組產(chǎn)生的肽也可以用于產(chǎn)生抗體。例如，為了產(chǎn)生免疫反應(yīng)，將重組產(chǎn)生的多肽片段與佐劑一起注射入小鼠內(nèi)。以至少1X107M—1的結(jié)合親和性結(jié)合重組片段的鼠免疫球蛋白可以以抗血清從所免疫小鼠收集，并可以通過親和層析或其他手段進(jìn)一步純化。此外，從小鼠收集脾細(xì)胞并與骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生抗體分泌性雜交瘤細(xì)胞庫?？梢詫﹄s交瘤庫篩選分泌以至少1X106M—1的親和性結(jié)合重組產(chǎn)生片段的免疫球蛋白的克隆。更加具體而言，通過以野生型蛋白質(zhì)預(yù)吸附，或者通過篩選結(jié)合變體多肽而不結(jié)合野生形多肽的特定獨特型的雜交瘤細(xì)胞系，選擇出選擇性結(jié)合變體多肽而較差或者根本不結(jié)合野生型多肽的免疫球蛋白。能夠表達(dá)多肽的多核苷酸可以基于本文所鑒定序列使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)產(chǎn)生。此類多核苷酸可以在宿主中表達(dá)，其中多核苷酸有效連接至表達(dá)控制序列(即以保證有功能的方式放置)。表達(dá)載體有代表性地是在宿主生物中作為附加體或者作為宿主染色體組成部分可復(fù)制的。表達(dá)載體可包含選擇標(biāo)記(例如基于四環(huán)素抗性或潮霉素抗性的標(biāo)記)以便可以檢測和/或選擇轉(zhuǎn)化有目的多核苷酸的那些細(xì)胞。編碼變體多肽的多核苷酸可以包括促進(jìn)所編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯從而產(chǎn)生所編碼多肽產(chǎn)物的序列。此類多核苷酸的構(gòu)建是本領(lǐng)域已知的。例如，此類多核苷酸可以包括啟動子、轉(zhuǎn)錄終止位點(真核表達(dá)宿主中的多腺苷化位點)、核糖體結(jié)合位點、和任選的用于在真核表達(dá)宿主中使用的增強子、和任選的載體復(fù)制所需的序列。原核生物可以用作表達(dá)變體多肽的宿主細(xì)胞，此類技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。其它微生物，例如酵母也可以用于表達(dá)。除了微生物之外，哺乳動物組織細(xì)胞培養(yǎng)物也可以用于表達(dá)和生產(chǎn)本公開的多肽。用于本公開方法的真核細(xì)胞包括CH0細(xì)胞系、各種COS細(xì)胞系、HeLa細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞系、Jurkat細(xì)胞等等。對于這些細(xì)胞的表達(dá)載體可以包括表達(dá)控制序列，例如復(fù)制原點、啟動子、增強子、必需的信息加工位點如核糖體結(jié)合位點、RNA剪接位點、多腺苷化位點和轉(zhuǎn)錄終止子序列。用于多核苷酸克隆和表達(dá)的技術(shù)可在本公開中使用以產(chǎn)生能夠雜交至多核苷酸生物標(biāo)志的探針或者產(chǎn)生用于結(jié)合本公開多肽生物標(biāo)志的抗體。在更多方法中，與生物標(biāo)志(例如多核苷酸或包含對應(yīng)于本文所述生物標(biāo)志的序列的至少長4個、至少6個或有代表性地至少8至10個或更多個連續(xù)氨基酸的多肽、蛋白質(zhì)、或者片段)相互作用的肽、藥物、脂肪酸、脂蛋白或小分子可以用作測定生物標(biāo)志的檢測劑。待用于結(jié)合試驗的分子以可檢測標(biāo)記例如熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記或酶標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。在去除非特異性結(jié)合的分子之后，使用合適的方法檢測所結(jié)合的分子。這些結(jié)果以及參照下面的圖與特定實施例表明，通過最低限度創(chuàng)傷擦拭收集方法從距癌性病變較遠(yuǎn)但能指示非正常結(jié)腸狀況的區(qū)域獲得樣品細(xì)胞是可能的。在此方面，以最低限度創(chuàng)傷性方式或者無創(chuàng)方式得到的樣品將使得樣品能夠使用所公開的生物標(biāo)志組分析。此類無創(chuàng)過程不但降低了CRC測定的成本，而且降低了當(dāng)前方法學(xué)相關(guān)的不適和風(fēng)險。所有這些因素加在一起增加了定期試驗的吸引力以及因此增加患者依從性。增加的患者依從性加上有效的CRC測定增強了早期檢測和提高存活率的前景。21下面的表3表明了基于本公開生物標(biāo)志的表達(dá)譜的差異。FHSH指受試者家族病史和自身病史。FHSH受試者缺乏息肉病史。如表3中所提到，"其他"指具有胃腸疾病或病癥病史的受試者。因此，在本公開的一個方面中，對于胃腸炎性疾病或病癥的預(yù)測性生物標(biāo)志將包括檢測IL-8、CD44、c-myc和/或P21表達(dá)的改變，所有這些均顯示有大的變化(例如相對于對照分別為大約19%、63%、50%和56%)。重要的是注意到，本公開生物標(biāo)志的改變相對于對照而言表達(dá)未必必須增加。而是，改變可以相對于對照而言增加或者減少，只要改變相對于對照具有統(tǒng)計學(xué)意義的差異即可。在一個方面中，改變是相對于對照而言至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或更高的增加或減少。當(dāng)一組生物標(biāo)志用于檢測疾病或病癥時，與每一單獨生物標(biāo)志的改變相比，相對于對照而言的較小的改變可以預(yù)示著疾病或病癥或者其風(fēng)險。本領(lǐng)域的熟練統(tǒng)計學(xué)家能夠鑒定出生物標(biāo)志中或者生物標(biāo)志組中相對于對照數(shù)值的統(tǒng)計學(xué)意義的顯著差異。在另一方面中，本公開提供通過基于直腸或頰部拭子測量表3中的任何生物標(biāo)志來早期檢測或診斷結(jié)直腸癌或胃腸炎性疾病或病癥的方法。在該方法之后是在更晚時間通過測量同樣的或者一種或更多種另外的生物標(biāo)志來確定。例如，早期檢測或診斷可以基于篩選任何的所述一種或更多種生物標(biāo)志的變化，其中生物標(biāo)志表達(dá)(例如IL-8、P21、c-myc、和/或CD44)的增加預(yù)示著胃腸炎性疾病或病癥或者患胃腸炎性疾病或病癥的風(fēng)險；在初次診斷或預(yù)測之后，可以測量同樣的或者不同的標(biāo)志(例如IL-8)以確定疾病的預(yù)后或者發(fā)展。下面的數(shù)據(jù)表明，例如，生物標(biāo)志IL-8和0PN可以指示胃腸疾病或病癥的后期發(fā)展。表3拭子拭子活組織檢查樣品活組織檢查樣品FHSH，n=16其他，n=9FHSH，n=17其他，n=8總體n<0.0000n<0.0000n<0.0001n<0.0001CXCR231%56%57%38%OPN19441863C0X138331813PPARa25221213C0X225441213Groa44562925Groy4456172522<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表4給出了關(guān)于基于本公開方法的受試者譜分析的細(xì)節(jié)。—拭子-FHSH用于分子標(biāo)志組的多核苷酸和多肽表達(dá)譜分析的方法和試劑盒也考慮作為本公開的一部分。在一個實施方案中，用于基因表達(dá)譜分析的試劑盒包含用于生物標(biāo)志或生物標(biāo)志組基因表達(dá)譜分析的試劑和說明書。因此，例如，試劑可以包括用于制備、檢測和定量所要求保護(hù)生物標(biāo)志組cDNA的引物、酶和其他試劑。SEQIDNO:45-88中所列引物特別適宜用于基于所要求保護(hù)的組的RT-PCR基因表達(dá)譜分析。因此，SEQIDNO:45-88中所列引物被特別地設(shè)計、選擇和試驗。除了引物之外，還包含試劑例如二核苷酸三磷酸鹽(例如dATP、dGTP、dCTP和dTTP)、逆轉(zhuǎn)錄酶和熱穩(wěn)定DNA聚合酶。此外，用于RT-PCR方法的緩沖液、抑制劑和激活劑是包含在試劑盒實施方案中的適宜試劑。一旦cDNA已經(jīng)充分?jǐn)U增至指定的終點，必須制備用于檢測和定量的cDNA樣品。考慮用于檢測多核苷酸的一種方法是使用熒光部分或者標(biāo)記的熒光光譜學(xué)，所述部分或標(biāo)記適宜于熒光光譜學(xué)并且希望用于標(biāo)記多核24苷酸，并且也包括在試劑盒實施方案的試劑中。在一個實施方案中，本公開提供用于鑒定預(yù)示胃腸疾病或病癥的生物標(biāo)志的試劑盒。例如，本公開試劑盒可以包含一種或更多種設(shè)計用于鑒定本公開等位基因和/或生物標(biāo)志的寡核苷酸。在另一實施方案中，試劑盒還包含帶有說明的手冊，用于(a)對人核酸樣品開展一種或更多種反應(yīng)以鑒定受試者中存在的生物標(biāo)志和/或等位基因。本公開試劑盒中的寡核苷酸可以固定化在固體表面上或者在固體表面上合成，例如微芯片、珠或載玻片(見例如W098/20020和W098/20019)。此類固定化寡核苷酸可以用于多種檢測試驗中，包括但不限于，探針雜交和聚合酶延伸試驗。用于實施本公開的固定化寡核苷酸可以包含經(jīng)設(shè)計快速篩選核酸樣品的寡核苷酸有序陣列。本公開試劑盒還可以包含其他成分，例如雜交緩沖液(例如在使用寡核苷酸探針時)或者雙脫氧核苷酸三磷酸鹽(ddNTP;例如對于引物延伸)。在一個實施方案中，寡核苷酸組由引物延伸寡核苷酸構(gòu)成。試劑盒還包含聚合酶和反應(yīng)緩沖液，所述反應(yīng)緩沖液針對聚合酶介導(dǎo)的引物延伸而優(yōu)化。試劑盒還包括檢測試劑，例如帶生物素標(biāo)記的或者熒光標(biāo)記的寡核苷酸或ddNTP和/或酶標(biāo)記的抗體和當(dāng)酶作用時可產(chǎn)生可檢測信號的一種或更多種底物。還考慮上述的本公開方法和組合物可以與其他生物標(biāo)志技術(shù)組合使用。核酸樣品，例如用于鑒定差異的核酸樣品可以從本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種來源得到，或者可以通過已知方法從基因組或cDNA來源得到。在另一實施方案中，用于蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析的試劑盒包含對于多肽生物標(biāo)志組的蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析必須的試劑和說明書。因此，在該實施方案中，用于蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析的試劑盒包括提供基于一組生物標(biāo)志的抗體組，用于測量生物樣品中的靶多肽水平。對于此類組考慮的一個實施方案包括結(jié)合至固體支持物上的抗體組。此外，用于蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析的試劑盒中所包含的試劑還使用對所結(jié)合多肽的一些部分具有特異性的第二抗體。此類第二抗體可以標(biāo)記有用于檢測和定量所結(jié)合多肽的分子。用于診斷試驗的方法在本領(lǐng)域眾所周知。通常，本公開的診斷試驗包括測定個體是否具有變異，或者基因的變體形式或者表達(dá)的改變。當(dāng)使用微流體系統(tǒng)時，可以主要考慮集成系統(tǒng)。這些系統(tǒng)設(shè)計在微芯片所包含的玻璃、硅、石英或塑料片上的微通道模式。樣品的移動通過跨微芯片不同區(qū)域施加的電力、電滲力或流體靜力控制。微流體系統(tǒng)可以集成核酸擴(kuò)增、微量測序、毛細(xì)管電泳和檢測方法例如激光誘導(dǎo)熒光檢測。還考慮將基因表達(dá)譜傳送到遠(yuǎn)程位置再分析。例如，與來自第一時間和第二時間的基因表達(dá)相關(guān)的可檢測信號的改變經(jīng)通訊傳送至遠(yuǎn)程位置用于分析?？蓹z測信號的數(shù)字表示形式是可以通過許多種介質(zhì)傳輸?shù)?。例如，此類?shù)字?jǐn)?shù)據(jù)可以通過互聯(lián)網(wǎng)以加密形式或者公開可得的形式傳輸。數(shù)據(jù)可以通過電話線、光纜或許多種電波頻率傳輸。然后通過遠(yuǎn)程位置的中央處理裝置分析數(shù)據(jù)和/或?qū)?shù)據(jù)存檔用于數(shù)據(jù)集編譯，所述數(shù)據(jù)集將被分析以確定例如相對于受試者遺傳表達(dá)譜歷史平均"正常值"的改變。本公開實施方案包括系統(tǒng)(例如基于互聯(lián)網(wǎng)的系統(tǒng))，特別是儲存和處理對應(yīng)于可檢測信號的數(shù)據(jù)得到的表達(dá)譜的計算機(jī)系統(tǒng)。如本文所使用，"計算機(jī)系統(tǒng)"指用于分析數(shù)字表示形式表達(dá)譜或多個譜的硬件構(gòu)件、軟件構(gòu)件和數(shù)據(jù)儲存構(gòu)件。計算機(jī)系統(tǒng)有代表25性地包括用于加工、訪問和處理數(shù)據(jù)的處理器。處理器可以是任何眾所周知類型的中央處理單元。有代表性地，計算機(jī)系統(tǒng)是包含處理器、和用于儲存數(shù)據(jù)的一個或更多個內(nèi)部數(shù)據(jù)儲存部件、和用于檢索在數(shù)據(jù)儲存部件所儲存數(shù)據(jù)的一個或更多個數(shù)據(jù)檢索裝置的通用系統(tǒng)。技術(shù)人員可以容易地理解，任何一個當(dāng)前可用的計算機(jī)系統(tǒng)是適宜的。在一個特定實施方案中，計算機(jī)系統(tǒng)包括連接至總線的處理器和一個或更多個內(nèi)部數(shù)據(jù)儲存裝置，例如硬驅(qū)和/或在其上記錄數(shù)據(jù)的其他計算機(jī)可讀介質(zhì)，所述總線連接至主存儲器(優(yōu)選作為RAM實現(xiàn))。在一些實施方案中，計算機(jī)系統(tǒng)還包括一個或更多個數(shù)據(jù)檢索裝置，用于讀取儲存在內(nèi)部數(shù)據(jù)儲存裝置上的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)檢索裝置可以表現(xiàn)為例如軟盤驅(qū)動器、光盤驅(qū)動器、磁帶驅(qū)動器、或者能夠連接至遠(yuǎn)程數(shù)據(jù)儲存系統(tǒng)(例如通過互聯(lián)網(wǎng))的調(diào)制解調(diào)器等等。在一些實施方案中，內(nèi)部數(shù)據(jù)儲存裝置是包含控制邏輯和/或其上所記錄數(shù)據(jù)的可移動計算機(jī)可讀介質(zhì)，例如軟盤、光盤、磁帶等等。計算機(jī)系統(tǒng)可以有利地包括適當(dāng)軟件或者通過適當(dāng)軟件程序化控制，所述軟件用于在數(shù)據(jù)存儲部件一旦插入到數(shù)據(jù)檢索裝置中時即從數(shù)據(jù)存儲部件讀取控制邏輯和/或數(shù)據(jù)。實施例表達(dá)組中的基因分為四大組l)APC/b-連環(huán)蛋白途徑，包括c-myc、細(xì)胞周期蛋白Dl和增殖過氧化物酶體活化受體(PPARa，S和Y);2)NF-kB/炎癥途徑，包括生長相關(guān)癌基因(Gro)-a和Y骨橋蛋白(0PN)和集落剌激因子(M_CSF_1)、環(huán)加氧酶(C0X)-1和2、白細(xì)胞介素-8(IL-8)和細(xì)胞因子受體CXCR2;3)細(xì)胞周期/轉(zhuǎn)錄因子，包括p21、細(xì)胞周期蛋白Dl、c-myc、PPARa、S禾口y;禾口4)細(xì)胞通訊信號，包括IL-8、PPARa、S禾口y、CXCR2、CD44和0PN。來自直腸乙狀結(jié)腸或直腸區(qū)域的結(jié)腸黏膜的活組織檢查樣品在結(jié)腸鏡檢查過程中從受試者獲得。受試者包括帶有大多數(shù)結(jié)腸癌前體的腺瘤性息肉的個體；具有癌癥家族病史或自身病史的個體；和充當(dāng)正常對照的無息肉或家族/自身病史的個體。在所有情況下，活組織檢查樣品由表觀正常的黏膜構(gòu)成。直腸黏膜樣品通過使用小肛門鏡的直腸涂片從所有組的個體獲得。通過肛門鏡將小的刷子插入到直腸內(nèi)幾厘米，并且通過溫和的刮取取出細(xì)胞。此外，頰黏膜樣品通過在口腔內(nèi)大約3-5厘米(有代表性地在面頰的后面)擦拭口腔得到。從每一組織樣品或拭子提取總RNA，并且使用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)化成cDNA。然后使用PCR和設(shè)計擴(kuò)增每一基因的引物測定多種基因的每一基因的表達(dá)。圖1和2中所示數(shù)據(jù)證明了通過從受試者口腔獲得拭子確定結(jié)直腸癌風(fēng)險或存在的能力。此類拭子技術(shù)是有益的并且促進(jìn)了患者依從性，因為它們與結(jié)腸鏡、直腸拭子和活組織檢查相比產(chǎn)生的不適更少。在大約90個個體，其中37個具有病史的個體、25個有息肉的個體(具有或不具有病史)和23個無息肉、無癌癥家族病史或自身病史且無已知的明顯上胃腸道問題的對照中，比較了作為組織收集手段的直腸拭子和活組織檢查的信息。在該90名患者的研究中，沒有原位癌癥病例，5個因為結(jié)腸癌已安排手術(shù)的個體被擦拭。統(tǒng)計學(xué)方法使用總體多變量方差分析(AN0VA)，其將不同基因的表達(dá)水平之間的相關(guān)性考慮進(jìn)去。該類型分析通過提供基于亞組中所有基因的表達(dá)方式在各組間或個體之間是否不同的單一檢驗控制假陽性率。如果總體檢驗對于特定個體或特定組是顯著的，然后使用單變量檢驗確定哪些基因促成了總體差異。這通過基于馬哈拉諾比斯距離(馬氏距離)的分析補充。馬氏距離是來自患者的單一基因表達(dá)值與來自對照樣品池平均值之間的距離的多變量測量。期望馬氏距離具有自由度等于基因數(shù)量的卡方分布。選擇任意的臨界點，例如第95百分位數(shù)，大多數(shù)個體對照值落于其之下。因此，具有高于該標(biāo)準(zhǔn)的馬氏樣品值的試驗受試者可以被認(rèn)為與對照樣品具有顯著性差異。可以對每一個體活組織檢查樣品或從個體取出的拭子，或者對從個體獲得的所有樣品的基因表達(dá)值平均值確定馬氏距離值。然后將這些馬氏距離值繪圖，來自每一樣品或者每一個體的值用單一點表示。從這些圖表中可以容易地顯現(xiàn)方法的敏感性和特異性。敏感性是試驗組中高于第95百分位數(shù)(在圖中表示為水平線)的值的比例，而特異性是試驗組中高于該線的個體的所有值的比例。選擇馬哈拉諾比斯(馬氏距離)確定統(tǒng)計學(xué)顯著性，因為它以單一數(shù)值概括任何個體基因表達(dá)方式對個體群體的平均值之間的差異，它將每一基因表達(dá)的變異性和基因?qū)χg的相關(guān)性考慮在內(nèi)。這允許我們以概率級別確定一種基因表達(dá)方式與另一種如何不同。首先，對于每一對照活組織檢查樣品，計算距其它正常對照活組織檢查樣品多變量平均值的馬氏距離。然后，對于每一活組織檢查樣品，計算距具有息肉、癌癥家族/自身病史的每一個體的馬氏距離，其中馬氏距離測量距正常對照樣品混合平均值的個體多變量距離(即表達(dá)方式的差異)。使用該方法，人們可以以任意顯著水平，如第95百分位數(shù)確定正常對照的上限。這允許分析任何個體試驗患者基因表達(dá)值與正常對照群體的顯著性。圖l顯示從(從左至右)對照、切除的結(jié)腸癌、有家族病史的個體和有息肉的個體得到的活組織檢查樣品的馬氏距離。每一圓圈代表單一組織樣品的馬氏距離，并且在單一垂直線中的所有圓圈代表來自單一個體的樣品。水平線代表對應(yīng)于正常對照第95百分位數(shù)的馬氏距離，因此高于該線的任何值與混合的正常對照值在P<0.05的顯著性水平存在顯著性差異(即結(jié)果不同于正常對照的結(jié)果)。如所預(yù)期，來自對照個體的大多數(shù)樣品(99/104)落在第95百分位數(shù)之下。17個個體中有4個個體至少有一個樣品高于該線，17個個體中僅1個個體(1/17)有兩個樣品高于該線。相比之下，來自切除的結(jié)腸癌組織的所有活組織檢查樣品具有高于第95百分位數(shù)的馬氏距離值，并且對于6/7的個體，每一值遠(yuǎn)高于該線(p<0.001)。對于有家族病史的個體和有息肉的個體，一些樣品高于第95百分位數(shù)，而一些樣品低于第95百分位數(shù)，但是全部13個有家族病史的個體有至少一個樣品高于該線，對于有息肉的個體21/24(87.5%)高于該線。13個有家族病史的個體中有10個個體(77%)具有一個以上活組織檢查樣品其馬氏距離值高于該線，而有息肉的個體中14/24(58%)高于該線。圖1B顯示針對第二個患者群開展的同樣的分析，該患者群包括無息肉或家族/自身病史(對照)、有家族病史的個體、有息肉的個體。結(jié)果與較早研究結(jié)果類似。所有對照活組織檢查樣品具有低于第95百分位數(shù)的馬氏距離值。18個有家族病史的個體中有15個個體(83%)至少一個值高于該百分位數(shù)，而4/9(44%)的有息肉個體至少一個值高于該百分位數(shù)。圖1C顯示對取自與圖1B所示研究所使用個體相同的個體的直腸涂片樣品開展的同樣分析。正常對照活組織檢查樣品除一個以外全部位于或低于第95百分位數(shù)。15/17(88%)的具有家族/自身病史的個體至少一個馬氏距離值高于第95百分位數(shù)，并且13/17(76.5%)至少兩個值高于第95百分位數(shù)。所有9個有息肉的個體至少一個值高于第95百分位數(shù)，并且5/9(56%)的個體至少兩個值高于該標(biāo)準(zhǔn)。此外，取自兩個個體的已知結(jié)腸癌的全部涂片具有遠(yuǎn)高于第95百分位數(shù)的馬氏距離值。圖2A-B顯示基于拭子的相似分析。圖2A顯示對90名患者開展的每一受試者的16種基因的基因表達(dá)值研究，對照傾向于落于95%卡方分布線之下。在最右邊可以看到患有癌癥的受試者傾向于落在線之上。圖2B顯示來自21名對照和8名癌癥受試者頰部拭子基因分析的95%卡方分布。數(shù)據(jù)證明頰部拭子和對樣品中一組基因的分析可以用于鑒定基因表達(dá)譜與正常對照不同的受試者。差異預(yù)示著結(jié)直腸癌的風(fēng)險因子。結(jié)腸癌是結(jié)腸黏膜組織內(nèi)層中分子和細(xì)胞改變進(jìn)展的結(jié)果。雖然這些改變未被完全了解，但是它們伴隨著許多基因表達(dá)水平的改變。利用該事實，我們先前已經(jīng)證明來自有息肉、癌癥家族/自身病史個體的表觀正常結(jié)腸黏膜具有不同的表達(dá)譜。來自這些研究的組織樣品通過結(jié)腸鏡檢查獲得，但是在此我們已經(jīng)證明樣品還可以通過直腸涂片獲得，直腸涂片是一種無創(chuàng)方法，它可以在任何內(nèi)科醫(yī)生辦公室快速且廉價地開展，而無需腸準(zhǔn)備或麻醉。這些結(jié)果表明，人們可以鑒定所有結(jié)腸癌病例，并且能以高百分比區(qū)分有腺瘤性息肉的個體與無息肉的那些個體。可以建議具有癌癥風(fēng)險的個體進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查，而無此風(fēng)險的那些個體可以選擇避免進(jìn)行該項昂貴且創(chuàng)傷性過程。已經(jīng)描述了許多實施方案。然而，應(yīng)當(dāng)理解可以在不脫離本說明書精神和范圍的情況下做許多修改。因此，其它實施方案處于后附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。權(quán)利要求診斷無癥狀受試者中結(jié)直腸癌或胃腸炎性疾病或病癥的方法，包括(i)從受試者頰部區(qū)域收集黏膜上皮細(xì)胞；(ii)測量所收集細(xì)胞中包含選自SEQIDNO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、37、39、41和43的序列的至少兩種多核苷酸的表達(dá)水平；(iii)比較所述至少兩種多核苷酸的表達(dá)水平與同樣的多核苷酸在正常對照中的水平，其中與正常對照相比表達(dá)水平的改變預(yù)示著結(jié)直腸癌或炎性疾病或病癥。2.診斷無癥狀受試者的結(jié)直腸癌或炎性疾病或病癥的方法，包括(i)擦拭受試者頰部區(qū)域以收集上皮細(xì)胞；(ii)測量所收集細(xì)胞中包含選自SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、37、39、41和43的序列的至少兩種多核苷酸的表達(dá)水平；(iii)比較所述至少兩種多核苷酸的表達(dá)水平與同樣的多核苷酸在正常對照中的水平，其中與正常對照相比表達(dá)水平的改變預(yù)示著結(jié)直腸癌或炎性疾病或病癥。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中至少兩種多核苷酸包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種多核苷酸。4.權(quán)利要求3的方法，其中至少兩種多核苷酸每一種編碼選自CXCR2、OPN、C0X1、PPARa、C0X2、IL8、P21、c_Myc，CD44禾卩PPARS的多肽。5.權(quán)利要求3的方法，其中改變是表達(dá)水平的增加。6.權(quán)利要求1或2的方法，其中多種探針用于檢測至少兩種多核苷酸的表達(dá)水平。7.權(quán)利要求6的方法，其中多種探針雜交至選自下列的一組多核苷酸(a)包含SEQIDNO:3的第一種多核苷酸和包含SEQIDNO:5的第二種多核苷酸；(b)包含SEQIDNO:3的第一種多核苷酸、包含SEQIDNO:5的第二種多核苷酸和包含SEQIDNO:17的第三種多核苷酸；或(c)包含SEQIDN0:3的第一種多核苷酸、包含SEQIDNO:5的第二種多核苷酸、包含SEQIDNO:9或11的第三種多核苷酸和包含SEQIDNO:17的第四種多核苷酸。8.權(quán)利要求6的方法，其中多種探針包含選自SEQIDNO:45-87或88的序列。9.權(quán)利要求6的方法，其中多種探針被可檢測性標(biāo)記。10.權(quán)利要求8的方法，其中多種探針用于擴(kuò)增至少兩種多核苷酸。11.權(quán)利要求1或2的方法，其中炎性疾病或病癥選自假膜性結(jié)腸炎、出血性結(jié)腸炎、溶血尿毒癥綜合癥結(jié)腸炎、膠原性結(jié)腸炎、缺血性結(jié)腸炎、放射性結(jié)腸炎、藥物和化學(xué)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎、轉(zhuǎn)向性結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合癥、過敏性結(jié)腸綜合癥、巴雷特病和克羅恩病。12.權(quán)利要求ll的方法，其中克羅恩病選自活動型、頑固型和瘺管型克隆病。13.權(quán)利要求l的方法，其中上皮細(xì)胞收集通過擦拭受試者頰部區(qū)域或直腸區(qū)域完成。14.診斷受試者中結(jié)直腸癌或炎性疾病或病癥的方法，包括(a)將來自受試者的頰或直腸樣品與包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、37、39、41或43的至少8個連續(xù)核苷酸的至少兩種探針接觸；禾口(b)定量雜交至所述至少兩種探針的多核苷酸分子的數(shù)量，其中多核苷酸數(shù)量相對于正常對照增加預(yù)示著受試者具有結(jié)直腸癌或胃腸疾病或病癥，并且其中受試者不具有胃腸疾病或病癥家族病史或自身病史。15.篩選處于發(fā)展成結(jié)直腸癌或胃腸疾病或病癥風(fēng)險的受試者的方法，包括(a)將來自受試者的頰或直腸樣品與包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、37、39、41或43的至少8個連續(xù)核苷酸的至少兩種探針接觸；禾口(b)定量雜交至所述至少兩種探針的多核苷酸分子的數(shù)量，其中多核苷酸數(shù)量相對于正常對照增加預(yù)示著受試者具有發(fā)展成結(jié)直腸癌或胃腸疾病或病癥的風(fēng)險，并且其中受試者不具有結(jié)直腸癌或胃腸疾病或病癥家族病史或自身病史。16.權(quán)利要求14或15的方法，其中至少兩種探針包含三種或更多種探針。17.權(quán)利要求14或15的方法，其中至少兩種探針包含雜交至下列一組多核苷酸的一組探針(a)SEQIDNO:3禾PSEQIDNO:5;(b)SEQIDNO:3、SEQIDNO:5禾PSEQIDNO:17;或者(c)SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDN0:9或11、和SEQIDNO:17。18.權(quán)利要求14或15的方法，還包括監(jiān)測受試者的預(yù)后，包括監(jiān)測選自SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDN0:11、SEQIDN0:13禾口SEQIDN0:17的至少兩種多核苷酸生物標(biāo)志的表達(dá)譜，其中表達(dá)譜在多時間點監(jiān)測。19.權(quán)利要求14或15的方法，其中至少兩種探針包含選自SEQIDNO:45-87或88的兩種序列。20.權(quán)利要求14或15的方法，其中胃腸疾病或病癥是炎性疾病或病癥選自假膜性結(jié)腸炎、出血性結(jié)腸炎、溶血尿毒癥綜合癥結(jié)腸炎、膠原性結(jié)腸炎、缺血性結(jié)腸炎、放射性結(jié)腸炎、藥物和化學(xué)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎、轉(zhuǎn)向性結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合癥、過敏性結(jié)腸綜合癥、巴雷特病和克羅恩病。21.權(quán)利要求20的方法，其中克羅恩病選自活動型、頑固型和瘺型克羅恩病。22.—種方法，包括(a)提供從受試者頰樣品獲得的包含多肽的樣品；(b)將樣品與特異性結(jié)合至由選自SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42或44的序列構(gòu)成的至少兩種多肽的至少兩種探針接觸；禾口(c)測定樣品中至少兩種多肽的水平，其中多肽數(shù)量相對于正常對照的增加預(yù)示著受試者具有結(jié)直腸癌或胃腸疾病或病癥或具有患結(jié)直腸癌或胃腸疾病或病癥的風(fēng)險。23.權(quán)利要求22的方法，其中樣品通過擦拭受試者頰部區(qū)域獲得。24.權(quán)利要求22的方法，其中受試者不具有結(jié)直腸癌或胃腸疾病或病癥家族病史或自身病史。25.權(quán)利要求22的方法，其中至少兩種多肽選自CXCR2、OPN、COXl、PPARa、COX2、IL8、P21、c-Myc、CD44禾卩PPARS。26.權(quán)利要求22的方法，其中炎性疾病或病癥選自假膜性結(jié)腸炎、出血性結(jié)腸炎、溶血尿毒癥綜合癥結(jié)腸炎、膠原性結(jié)腸炎、缺血性結(jié)腸炎、放射性結(jié)腸炎、藥物和化學(xué)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎、轉(zhuǎn)向性結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合癥、過敏性結(jié)腸綜合癥、巴雷特病和克羅恩病。27.權(quán)利要求26的方法，其中克羅恩病選自活動型、頑固型和瘺型克羅恩病。28.權(quán)利要求22的方法，其中至少兩種探針包含3、4、5、6、7、8、9、10或更多種探針。29.權(quán)利要求22的方法，其中探針包含抗體。30.用于開展權(quán)利要求1、2、14、15或22的方法的試劑盒。31.權(quán)利要求30的試劑盒，包含用于檢測包含在SEQIDNO:1、3、5、7、9U1、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、37、39、41或43所述序列的多核苷酸的寡核苷酸探針或引物對。32.權(quán)利要求30的試劑盒，包含特異性檢測包含在SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42或44所述序列的多肽的試劑。33.權(quán)利要求30的試劑盒，包含頰部拭子。34.權(quán)利要求30的試劑盒，包含頰部拭子裝置。35.—種方法，包括測量受試者頰部拭子中存在的選自CXCR2、OPN、COXl、PPARa、COX2、IL8、P21、c-Myc、CD44和PPARS的至少兩個基因的表達(dá)譜；禾口傳遞表達(dá)譜至技師或看護(hù)者。全文摘要本公開提供用于鑒定受試者對胃腸疾病或病癥的易感性的方法和組合物。文檔編號C12Q1/68GK101772581SQ200880101222公開日2010年7月7日申請日期2008年5月30日優(yōu)先權(quán)日2007年5月31日發(fā)明者南希·M·李,彼得·L·李申請人:加利福尼亞太平洋醫(yī)學(xué)中心