專利名稱：在特定位置檢測甲基化dna的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因組DNA樣品中甲基化核苷酸的鑒定。本發(fā)明還涉及通過鑒定特定的甲基化核苷酸診斷特定狀況的方法。
背景技術：
人類DNA中5-甲基胞嘧啶(通常在CpG 二核苷酸上)的檢測在診斷上非常重要，因為在此類胞嘧啶，特別是在基因控制序列(例如，啟動子序列)上的此類胞嘧啶的甲基化通常與癌癥的發(fā)作相關。這一所謂的DNA后生(因為其在通常意義上不是可遺傳的)修飾對于發(fā)育也是非常重要的，并且通常導致基因沉默。在癌癥中，該后生改變是異常的，并且可以導致涉及抑制腫瘤形成的基因的沉默，或涉及腫瘤發(fā)生的基因的活化。
當前廣泛使用的檢測此類DNA修飾的方法使用化學物質(zhì)亞硫酸氫鹽處理DNA，并且其具有就進行有效診斷分析而言的缺點。在它們當中，尤其是高復雜性、需要很長的時間、缺乏重復性以及待檢測DNA的顯著損失。此外，使用亞硫酸氫鹽與在遺留PCR產(chǎn)物污染的控制中使用的尿嘧啶_n-糖基化酶是不相容的。需要有不具這些缺點的方法。
同時，還需要以高敏感度以及在相同、未修飾的DNA序列的高背景水平的存在下檢測此類DNA修飾的方法。在腫瘤中，并不是所有的細胞均含有在感興趣的序列上甲基化的DNA——實際上，大多數(shù)細胞都沒有。此外，在應用散布的腫瘤細胞或在血流中能找到的腫瘤DNA進行癌癥早期檢測的情況下，大多數(shù)DNA在感興趣的序列上沒有甲基化。最多僅有很少百分比的序列拷貝可能是甲基化的。此類序列的濃度可能是每毫升樣品體積中少于1個拷貝。在檢測中對于高敏感性和高特異性的需求是明顯的且通過之前的方法是難以獲得的。 發(fā)明簡述 本發(fā)明涉及檢測位于樣品中特定位置的甲基化DNA的方法，其包括(a)用甲基活性切割方法處理樣品，所述甲基活性切割方法在位于樣品中特定位置的甲基化DNA的存在下在一致位點切割DNA ; (b)添加與在或接近該特定位置的DNA互補的引物；(c)使該樣品進行聚合酶鏈式反應，并且當在該樣品的特定位置存在甲基化DNA時產(chǎn)生擴增產(chǎn)物；以及(d)檢測擴增產(chǎn)物的存在，表明在該樣品的特定位置存在甲基化DNA。 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的是檢測位于樣品中特定位置的甲基化DNA的方法，其包括(a)
用甲基活性切割方法處理樣品，所述甲基活性切割方法在位于樣品中特定位置的甲基化
DNA的存在下在一致位點導致堿基切除；(b)改變在該切割或堿基切除位點上的DNA序列；
(c)添加與在或接近該特定位置的DNA互補的引物和/或探針，并且它們至少之一能特異性
地識別所述經(jīng)改變的DNA序列；(d)使該樣品進行聚合酶鏈式反應，并且當在該樣品的特定
位置存在甲基化DNA時產(chǎn)生擴增產(chǎn)物和/或探針信號；以及(e)當特異性地產(chǎn)生擴增產(chǎn)物
或探針信號時，檢測擴增產(chǎn)物的存在，表明在該樣品的特定位置存在甲基化DNA。 本發(fā)明還包括通過檢測位于基因組DNA樣品特定位置上的甲基化胞嘧啶從而診
斷某些狀況的方法。
本發(fā)明還涉及檢測位于樣品中特定位置的甲基化DNA的方法，其包括用甲基活性切割方法處理樣品，所述甲基活性切割方法在位于樣品中特定位置的甲基化DNA的存在下在一致位點切割DNA ;添加與在或接近該特定位置的DNA互補的引物；使該樣品進行聚合酶鏈式反應，并且當在該樣品的特定位置存在甲基化DNA時產(chǎn)生擴增產(chǎn)物；以及檢測擴增產(chǎn)物的存在，表明在該樣品的特定位置存在甲基化DNA。
在特定實施方案中，該樣品包含基因組DNA。 在優(yōu)選的實施方案中，該特定位置是已知基因的啟動子區(qū)域。在其它實施方案中，該樣品來自患者，并且在該已知基因的啟動子區(qū)域存在甲基化DNA表明該患者中存在癌細胞。 在其它優(yōu)選的實施方案中，在甲基化DNA的存在下在一致位點切割DNA的甲基活性切割方法是甲基活性限制性酶。在其它實施方案中，在甲基化DNA的存在下在一致位點切割DNA的甲基活性切割方法是用5-甲基脫氧胞苷糖基化酶/裂解酶處理，用5-甲基脫氧胞苷糖基化酶、隨后用獨立的脫嘌呤/脫嘧啶裂解酶(或獨立的脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶)處理，或用5-甲基脫氧胞苷糖基化酶、隨后通過堿水解處理。 本發(fā)明還包括通過檢測位于來自患者的樣品中特定位置的甲基化DNA，從而檢測患者中癌癥的方法，其包括用甲基活性切割方法處理樣品，所述甲基活性切割方法在位于樣品中特定位置的甲基化DNA的存在下在一致位點切割DNA ;添加與在或接近該特定位置的DNA互補的引物；使該樣品進行聚合酶鏈式反應，并且當在該樣品的特定位置存在甲基化DNA時產(chǎn)生擴增產(chǎn)物；檢測擴增產(chǎn)物的存在，表明在該樣品的特定位置存在甲基化DNA ;以及從擴增產(chǎn)物的存在檢測該患者中的癌癥。 在某些實施方案中，該樣品包含基因組DNA。在某些實施方案中，該特定位置是已知基因的啟動子區(qū)域。在某些實施方案中，在甲基化DNA的存在下在一致位點切割DNA的甲基活性切割方法是甲基活性限制性酶。在某些實施方案中，在甲基化DNA的存在下在一致位點切割DNA的甲基活性切割方法是用5-甲基脫氧胞苷糖基化酶/裂解酶處理，用5-甲基脫氧胞苷糖基化酶、隨后用獨立的脫嘌呤/脫嘧啶裂解酶(或獨立的脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶)處理，或用5-甲基脫氧胞苷糖基化酶、隨后通過堿水解處理。
在某些實施方案中，本發(fā)明包括通過檢測位于來自患者的樣品中基因組DNA中特定位置的甲基化DNA，從而檢測患者中癌癥的方法，其包括用甲基活性限制性酶處理基因組DNA以產(chǎn)生切割產(chǎn)物；添加與在或接近該特定位置的DNA互補的引物；使該樣品進行聚合酶鏈式反應，以當在該特定位置存在甲基化DNA時獲得擴增產(chǎn)物；檢測擴增產(chǎn)物的存在，其表明在該特定位置存在甲基化DNA;以及通過檢測擴增產(chǎn)物的存在檢測該患者中的癌癥。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述特定位置是已知基因的啟動子區(qū)域，所述甲基活性限制性酶是大腸桿菌(E. coli)McrBC和/或該方法還包括以下步驟在切割產(chǎn)物上產(chǎn)生平端(blunt end)，連接切割產(chǎn)物的末端以產(chǎn)生切割產(chǎn)物封閉環(huán)，并且如此定向引物以使得擴增產(chǎn)物僅能從切割產(chǎn)物的封閉連接環(huán)產(chǎn)生。 在某些實施方案中，本發(fā)明包括通過檢測位于來自患者的樣品中的基因組DNA中特定位置的甲基化DNA，從而檢測患者中癌癥的方法，其包括用甲基活性限制性酶處理基因組DNA以產(chǎn)生切割產(chǎn)物；在切割產(chǎn)物上產(chǎn)生平端；連接切割產(chǎn)物的末端以產(chǎn)生切割產(chǎn)物封閉環(huán)；添加與在或接近該特定位置的DNA互補的引物，其中如此定向引物以使得擴增產(chǎn)物
5僅能從切割產(chǎn)物的封閉連接環(huán)產(chǎn)生；使該樣品進行聚合酶鏈式反應以獲得擴增產(chǎn)物；檢測擴增產(chǎn)物的存在，其表明在該特定位置存在甲基化DNA;以及通過檢測擴增產(chǎn)物的存在檢
測該患者中的癌癥。
發(fā)明詳述
定義 術語"擴增子"是指作為擴增反應(諸如聚合酶鏈式反應)的結(jié)果產(chǎn)生的雙鏈DNA分子。 本文所使用的術語"CpG位點"是指在一些基因組DNA分子中在胞嘧啶上可能被甲基化的胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸。 一般地，CpG 二核苷酸在較大的核酸序列中存在。
本發(fā)明中短語"甲基活性限制性酶"是指僅當在DNA中存在甲基化胞嘧啶時切割DNA的限制性酶。不同的此類酶可能需要甲基化胞嘧啶位于特定的位點。
本發(fā)明中的短語"甲基活性切割"是指僅在甲基化核酸的存在下發(fā)生的核酸切割。在本發(fā)明中，甲基活性切割方法包括但不限于使用甲基活性限制性酶。 在本發(fā)明中，術語"5_甲基脫氧胞苷糖基化酶/裂解酶"是指在5_甲基脫氧胞苷的存在下為活性的酶(糖基化酶和裂解酶兩者)(Morales-Ruiz T， Ortega-Galisteo AP，Ponferrada—Marin MI，Martinez—Macias MI，Ariza RR，Roldan_Arjona T. Proc Natl AcadSci US A. (2006) 103(18) :6853-8 ;Gehring M， Huh JH， Hsieh TF， Penterman J， Choi Y，Harada JJ，Goldberg RB，F(xiàn)ischer RL. Cell. (2006) 124(3) :495-506)。 5-甲基脫氧胞苷糖基化酶/裂解酶的糖基化酶活性一般地破壞DNA的5-甲基脫氧胞苷和核糖之間的N-糖苷鍵。裂解酶活性也稱為脫嘌呤/脫嘧啶(AP)裂解酶，其通過13 _消除反應將DNA骨架3'切割為無堿基糖。 核酸-在本發(fā)明中，術語"核酸"可以指任何天然或合成的核酸，包括但不限于單鏈和雙鏈核酸、DNA、 RNA、 zDNA、合成核苷酸類似物和肽連接的合成核苷酸。
感興趣的基因-在本發(fā)明中，術語"感興趣的基因"可以指存在于基因組序列中的任何編碼或非編碼區(qū)域，其用于研究或臨床檢測甲基化。 啟動子區(qū)-本發(fā)明中，"控制區(qū)域"可以是靠近感興趣的基因且不必要包括在該基
因中的任何核酸部分?？刂茀^(qū)域可以或可以不對感興趣基因的表達具有直接的調(diào)控作用。
在感興趣的基因的表達受到影響的某些細胞中，控制區(qū)域一般是可以具有甲基化5-脫氧
胞苷的區(qū)域。 甲基活性切割 本發(fā)明包含若干種甲基活性切割的方法。在本發(fā)明中可使用在甲基化CpG的存在下切割DNA，但是沒有甲基化DNA的存在下則不切割DNA的任何方法。方法包括但不限于甲基活性限制性酶，諸如McrBC (Stewart, F.J.和Raleigh E. A. (1998) Biol. Chem. 379 :611-616.)和與裂解酶組合的5-甲基胞苷糖基化酶。
擴增方法 本發(fā)明設想了各種擴增方法，包括但不限于聚合酶鏈式反應(PCR)、連接酶鏈式反
應以及滾環(huán)復制。 檢測方法 本發(fā)明考慮了若干種檢測特定擴增產(chǎn)物種類的方法。檢測方法包括但不限于摻入并檢測標記、探針捕獲方法、T叫man分析、電泳方法和雜交方法。標記包括但不限于放射標記的核苷酸、熒光團、量子點(quantum dots)、生物素綴合的核苷酸以及發(fā)色酶。
可以應用結(jié)合了檢測特定位置甲基化CpG和擴增的各種方法。例如，可通過在甲基化CpG的存在下為活性的甲基活性酶切割基因組樣品?？墒箯拇祟惽懈钪挟a(chǎn)生的DNA片段進行酶法"鈍化(bl皿t)"末端，將已知序列的寡核苷酸接頭(adapter)連接到該末端。然后該樣品可具有兩個添加的引物，其中一個與特定位置附近的區(qū)域雜交，而其中的第二個與寡核苷酸接頭上的已知序列雜交。上述實例在以下

圖1中得以闡述。
在優(yōu)選的實施方案中，可如下實施本發(fā)明可在DNA中兩個5-甲基胞嘧啶位點附近用酶產(chǎn)生可特異地檢測的DNA序列改變。如在下圖1和2中所示那樣，限制性酶大腸桿菌McrBC可特異地識別并切割直接在dA或dG(嘌呤=Pu)之后的5-甲基dC殘基附近的dsDNA。這些包括在dG殘基之前的5-甲基dC以形成CpG 二核苷酸，哺乳動物DNA甲基化的主要位點。如果該dC殘基沒有被甲基化，則不會發(fā)生切割。因為這一原因，McrBC被稱為"甲基活性"，以與"甲基化敏感"相對，后者描述對其而言反之才成立的更大的已知的限制性酶類型，即，其切割未甲基化的靶序列而不切割甲基化的靶序列。 嚴格的說，為切割DNA， McrBC —般需要間隔55bp至最多至3kbp的兩個PumC位點。切割位點可以是離該兩個PiTC之一的約30bp處。因為參與基因調(diào)控的DNA甲基化位點含有高密度的甲基化CpG 二核苷酸，因此圖1和2所示的導致產(chǎn)生新甲基化_特異性DNA片段的情況很可能發(fā)生。應當注意該切割不必須在識別位點之間，而是以示例的方式圖示。當其確實發(fā)生時，在切割位點產(chǎn)生甲基化特異性序列改變是可能的。例如，在以下圖1和2中，如在參考文獻中描述的那樣處理甲基化特異性DNA片段，以產(chǎn)生可連接的片段末端。如在圖1中那樣，如果然后使得DNA片段在DNA連接酶的存在下環(huán)化的話，可產(chǎn)生共價-封閉的DNA環(huán)?？蓱煤屑谆谢?例如來自人類腫瘤的DNA)的樣品經(jīng)驗地確定連接接合位點和序列。這可應用DNA克隆和測序來完成。 一旦知道后，可如圖解那樣設計并合成用于擴增特定DNA產(chǎn)物的PCR的特異DNA引物，其具有一條對新接合序列特異的引物。DNA片段環(huán)化之后的擴增被稱為"反向"PCR(Ochman H， Gerber AS， Hart 1 DL. Genetics.(1988) 120(3) :621-623)。備選地，如圖2那樣，可將合成的、稱為"連接子(linker)"或"接頭(adapter)"的dsDNA片段連接至片段的任一末端或兩個末端。因為所有顯示的序列都將是已知的，因此可以設計這樣的PCR引物，其特異地靶向甲基化特異性片段和連接子之間的接合序列。為增加特異性(因為許多不同的片段現(xiàn)在都含有該連接子序列)，可如圖示那樣進行"巢式"PCR。 還可能應用與PCR相容的熒光寡核苷酸探針(例如，T叫man探針)靶向新的接合序列，并且應用側(cè)翼PCR擴增引物。然而，用PCR引物代替探針靶向新序列在下述情況下具有優(yōu)點，所述情況是甲基化_特異性靶在可擴增備選物的背景中是少數(shù)序列(如果診斷應用是從在諸如血清或血槳的體液中發(fā)現(xiàn)的DNA來早期檢測癌癥_大多數(shù)DNA是"野生型"且沒有被甲基化，其是可能的)。如果兩者都擴增的話，可由探針產(chǎn)生的信號會減少。如果僅擴增甲基化_特異性靶的話，能增強信號與背景之比。 應用側(cè)翼引物，并且應用反向PCR，沒有可擴增的備選物是可能的。在感興趣的區(qū)域中不存在顯著甲基化的情況下，所切割的序列將很大，并且可以如此的放置擴增引物，以使得在不存在甲基化的情況下，擴增產(chǎn)物將大到無法有效地擴增。
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也可以適用其它核酸擴增方法(諸如SDA)來檢測甲基化-特異性序列改變。
在其它優(yōu)選的實施方案中，可如下實施本發(fā)明。如圖3所示，酶5-甲基脫氧胞苷 糖基化酶/裂解酶能特異性地識別并從dsDNA中(尤其是從CpG 二核苷酸中)移除5-甲 基胞嘧啶核苷酸，留下在5'之前有擁有3'磷酸或a ， 13 -未飽和醛(未顯示)的核苷酸的 一個核苷酸缺口，所述3'磷酸或a ， P-未飽和醛均可使用大腸桿菌核酸內(nèi)切酶IV移除， 留下適于通過DNA聚合酶延伸核苷酸鏈的游離3'羥基。在圖3A中，應用"誘變"的單核苷 酸三磷酸(dNTP)進行此類鏈延伸。也就是說，該dNTP可有效地插入到這一位置，當隨后通 過DNA聚合酶復制含有該誘變核苷酸的DNA鏈時，插入了改變最初堿基序列的核苷酸。其 實例，但不是唯一的實例是5-溴脫氧尿苷酸三磷酸(5-BrdUTP)，其能通過DNA聚合酶有效 地插入到dG殘基對面，尤其是在不存在dCTP的情況下更是如此。但是當在所有四種天然 dNTP都存在的情況下復制時，優(yōu)選插入dA殘基而不是dC殘基(Lasken RS， Goodman MF. J BiolChem. (1984)259(18) :11491-5)。為避免類似物一旦摻入就被移除，聚合酶可缺乏3' 核酸外切酶校正活性。 一旦摻入此類類似物，可使其與缺口上的5'磷酸連接。備選地，可 移除該dNTP類似物，并且可以用DNA聚合酶(缺乏3'核酸外切酶)和四種天然dNTP，沿著 之前存在的、退火DNA鏈的替代鏈，使從所摻入的核苷酸類似物3' OH的鏈延伸繼續(xù)進行。
隨后是分離兩條DNA鏈，例如通過熱變性，并且通過DNA聚合酶弓|發(fā)合成含有誘變 核苷酸類似物的鏈拷貝。由于類似物，制得具有經(jīng)改變的核苷酸堿基序列的拷貝。 一旦鑒 定了基因組甲基化位點和周圍的序列，可進行模式實驗以鑒定由這一過程產(chǎn)生的特定序列 改變。可通過引物指導的DNA擴增(例如，PCR)高效且敏感地檢測此類經(jīng)改變的序列。公 知PCR能鑒別與引物的單堿基錯配，尤其是與引物3'端的錯配；可將此類錯配設計到用于 給定分析的引物中。 備選地，如圖3B所示，可提供DNA聚合酶(缺乏3'核酸外切酶校正活性)和單獨 的dGTP、dATP或dTTP。在不存在dCTP的情況下，錯配的核苷酸堿基能被迫摻入到dG的對
面。可通過1!1++的存在和使用有錯誤摻入傾向的聚合酶(諸如病毒逆轉(zhuǎn)錄酶)來促進這
一摻入。提供的單dNTP應當不是預期摻入5-甲基dC替換的上游一個堿基的dNTP，因為這 一位置的切口或缺口可能翻譯為替換位點，從而給出假陽性結(jié)果。還可使得發(fā)生與dG錯配 的核苷酸堿基的有效的、酶介導的連接(Lu J， Tong J， Feng H， Huang J， Afonso CL， Rock DL，Barany F， Cao W. Biochim Biophys Acta. (2004) 1701(1-2) :37-48.)?；蛘?，不發(fā)生連 接，而是一旦允許發(fā)生了錯誤摻入，則可提供剩余的3種天然dNTP，在缺乏3'核酸外切酶校 正活性的情況下，可以使得發(fā)生從所摻入的錯配核苷酸的有效延伸。如上，這導致特異地可 知、可擴增且可檢測的序列改變。
附圖簡述 圖1圖示了擴增檢測的方法。圖示的方法應用了特異連接子的連接，并且使用了 與該連接子和切除的DNA雜交的引物。在該切除的DNA序列內(nèi)的巢式引物增加了擴增和檢 測的特異性。 圖2圖示了應用"反向"PCR的另一擴增和檢測方法。切除后，使切除的DNA片段 環(huán)化，并且應用在連接的接合處擴增擴增子的引物，以擴增并檢測DNA的成功切割。
圖3圖示了應用核苷酸切除和誘變的另一擴增和檢測方法。應用對5-甲基胞苷 特異的糖基化酶，起始核苷酸切除?？赏ㄟ^誘變類似物(A)，或通過錯誤摻入的天然核苷酸(B)代替切除的單核苷酸。在任一種情況下，通過DNA聚合酶復制該經(jīng)修飾的DNA鏈均產(chǎn)生 可特異性地擴增并檢測(例如通過PCR)的序列改變。
實施例 以下是預言性的，并且不代表實際實驗
實施例1 可從患者取得液體樣品?？蓱靡阎椒◤脑摶颊邩悠诽崛』蚪MDNA。
然后用在CpG位點中的甲基化胞嘧啶的存在下為活性的限制性酶處理提取的基 因組DNA，產(chǎn)生酶處理的樣品。然后使該酶處理的樣品與連接子組合，所述連接子與通過限 制性酶切割的分子的末端相連接。 使該混合物與以下兩條引物組合，其中一條引物與感興趣基因的啟動子區(qū)域附近
的序列雜交，以及第二條引物與連接子雜交，所述連接子與通過限制性酶切割的分子的末
端相連接。使用該引物和第二引物，然后可使該混合物進行擴增反應，諸如PCR。當特定的
CpG位點被甲基化時，基因組DNA分子被切割，連接了連接子，并且從該擴增反應產(chǎn)生了特
定的擴增子。在缺乏特定的甲基化CpG的情況下，不會產(chǎn)生特定的擴增子。 然后可通過各種已知方法檢測該特定的擴增子。如果檢測到該特定的擴增子，表
明了該特定CpG位點的甲基化狀態(tài)，然后可表明并診斷特定腫瘤狀態(tài)。 實施例2 在其它實施方案中，可從患者獲得實體瘤活組織?？蓱靡呀⒌募夹g從該實體 瘤活組織提取基因組DNA以產(chǎn)生樣品。 然后用在CpG位點中的甲基化胞嘧啶的存在下為活性的限制性酶處理該基因組 DNA樣品，產(chǎn)生酶處理的樣品。然后可在這樣的物質(zhì)中處理該經(jīng)酶處理的樣品，所述物質(zhì)產(chǎn) 生平端化的雙鏈DNA。隨后可用連接酶處理這一樣品，從短DNA短片段產(chǎn)生環(huán)狀DNA。這一 實施例如下圖2所示。 然后可使該樣品與一組引物結(jié)合，所述引物與感興趣的基因組序列附近的序列雜
交，當在感興趣的基因組序列附近的某些位點被切割并連接成為某種環(huán)狀DNA時，其產(chǎn)生
僅在該某種環(huán)狀DNA的存在下才可能產(chǎn)生的擴增子。然后可使該樣品和引物組進行擴增反
應，當在感興趣的基因組序列附近的CpG位點被甲基化時，產(chǎn)生特定的擴增子。 可檢測特定的擴增子，表明從其中取得該活組織的實體瘤是由感興趣的基因組序
列附近的CpG位點的甲基化表明的特定類型的腫瘤。 實施例3 在其它實施方案中，可從患者獲得實體瘤活組織。可應用已建立的技術從該實體 瘤活組織提取基因組DNA以產(chǎn)生樣品。 所述基因組DNA然后用在CpG位點中的甲基化胞嘧啶的存在下為活性的組合的 5_甲基胞嘧啶糖基化酶/裂解酶處理，或用在CpG位點中的甲基化胞嘧啶的存在下為活性 的5_甲基胞嘧啶糖基化酶、隨后用獨立的AP裂解酶或AP核酸內(nèi)切酶處理，產(chǎn)生在其雙鏈 DNA中具有缺口的經(jīng)酶處理的樣品。然而可以以下方式處理該經(jīng)酶處理的樣品，所述方式允 許通過與dC具有不同的堿基配對特異性的核苷酸填充該缺口 。 然后使該樣品與下述引物組合，其中一條引物與感興趣的癌癥相關基因中的序列雜交，并且第二引物與第一引物附近的現(xiàn)已突變的序列特異性雜交。在某些實施方案中，為 了最大的PCR的特異性，第二引物的3'核苷酸或3'倒數(shù)第二個核苷酸與突變的堿基相對。 使用該引物和第二引物，然后可使該混合物進行擴增反應，諸如PCR。當特定CpG位點被甲 基化時，從該擴增反應產(chǎn)生特定的擴增子。在不存在特定甲基化CpG時，不會產(chǎn)生特定的擴 增子。 然后可通過各種已知方法檢測該特定的擴增子。如果檢測到該特定的擴增子，表 明了該特定CpG位點的甲基化狀態(tài)，然后可表明并診斷特定腫瘤狀態(tài)。
權(quán)利要求
檢測位于樣品中特定位置的甲基化DNA的方法，其包括用甲基活性切割方法處理樣品，所述甲基活性切割方法在位于樣品中特定位置的甲基化DNA的存在下在一致位點切割DNA；添加與在或接近該特定位置的DNA互補的引物；使該樣品進行聚合酶鏈式反應，并且當存在成功的甲基活性切割時產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，但是當不存在成功切割時沒有擴增；以及檢測擴增產(chǎn)物的存在，表明在該樣品的特定位置存在甲基化DNA。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述特定位置是已知基因的啟動子區(qū)域。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述樣品來自患者，并且其中在所述已知基因的啟動子區(qū)域存在甲基化DNA表明該患者中存在癌細胞。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中在甲基化DNA的存在下在一致位點切割DNA的甲基活性切割方法是甲基活性限制性酶。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中在甲基化DNA的存在下在一致位點切割DNA的甲基活性切割方法是用5-甲基脫氧胞苷糖基化酶/裂解酶處理。
6. 通過檢測位于來自患者的樣品中特定位置的甲基化DNA，從而檢測患者中癌癥的方法，其包括用甲基活性切割方法處理樣品，所述甲基活性切割方法在位于樣品中特定位置的甲基化DNA的存在下在一致位點切割DNA ;添加與在或接近該特定位置的DNA互補的引物；使該樣品進行聚合酶鏈式反應，并且當在所述樣品的特定位置存在甲基化DNA時產(chǎn)生擴增產(chǎn)物；檢測擴增產(chǎn)物的存在，表明在該樣品的特定位置存在甲基化DNA;以及從擴增產(chǎn)物的存在檢測該患者中的癌癥。
7. 權(quán)利要求1或6的方法，其中所述樣品包含基因組DNA。
8. 權(quán)利要求6的方法，其中所述特定位置是已知基因的啟動子區(qū)域。
9. 權(quán)利要求6的方法，其中在甲基化DNA的存在下在一致位點切割DNA的甲基活性切割方法是甲基活性限制性酶。
10. 權(quán)利要求6的方法，其中在甲基化DNA的存在下在一致位點切割DNA的甲基活性切割方法是用5-甲基脫氧胞苷糖基化酶/裂解酶處理。
11. 通過檢測位于來自患者的樣品中基因組DNA中特定位置的甲基化DNA，從而檢測患者中癌癥的方法，其包括用甲基活性限制性酶處理所述基因組DNA以產(chǎn)生切割產(chǎn)物；添加與在或接近該特定位置的DNA互補的引物；使該樣品進行聚合酶鏈式反應，以當在所述特定位置存在甲基化DNA時獲得擴增產(chǎn)物；檢測擴增產(chǎn)物的存在，其表明在該特定位置存在甲基化DNA ;以及通過檢測擴增產(chǎn)物的存在檢測該患者中的癌癥。
12. 權(quán)利要求ll的方法，其中所述特定位置是已知基因的啟動子區(qū)域。
13. 權(quán)利要求ll的方法，其中所述的甲基活性限制性酶是大腸桿菌McrBC。
14. 權(quán)利要求11的方法，其中所述方法還包括以下步驟在切割產(chǎn)物上產(chǎn)生平端，連接切割產(chǎn)物的末端以產(chǎn)生切割產(chǎn)物封閉環(huán)，以及其中如此定向引物以使得擴增產(chǎn)物僅能從切割產(chǎn)物的封閉連接環(huán)產(chǎn)生。
15. 通過檢測位于來自患者的樣品中的基因組DNA中特定位置的甲基化DNA，從而檢測患者中癌癥的方法，其包括用甲基活性限制性酶處理基因組DNA以產(chǎn)生切割產(chǎn)物；在切割產(chǎn)物上產(chǎn)生平端；連接切割產(chǎn)物的末端以產(chǎn)生切割產(chǎn)物封閉環(huán)；添加與在或接近該特定位置的DNA互補的引物，其中如此定向引物以使得擴增產(chǎn)物僅能從切割產(chǎn)物的封閉連接環(huán)產(chǎn)生；使該樣品進行聚合酶鏈式反應以獲得擴增產(chǎn)物；檢測擴增產(chǎn)物的存在，其表明在該特定位置存在甲基化DNA ;以及通過檢測擴增產(chǎn)物的存在檢測該患者中的癌癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因組DNA樣品中甲基化核苷酸的鑒定。本發(fā)明還涉及通過鑒定特定甲基化核苷酸診斷特定狀況的方法。
文檔編號C12Q1/68GK101765666SQ200880101227
公開日2010年6月30日 申請日期2008年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月30日
發(fā)明者R·希古奇 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司