專利名稱：：用于降解纖維素材料的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于降解或轉(zhuǎn)化含纖維素材料的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物和產(chǎn)生與使用所述組合物的方法。相關(guān)領(lǐng)域描述纖維素是簡單糖類葡萄糖通過β-1，4_鍵共價鍵合的聚合物。許多微生物產(chǎn)生水解β-連接的葡聚糖的酶。這些酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。內(nèi)切葡聚糖酶在隨機位置消化纖維素聚合物，將其打開(openingit)以受到纖維二糖水解酶攻擊(attack)。纖維二糖水解酶繼而從纖維素聚合物的末端釋放纖維二糖的分子。纖維二糖是水溶性的β_1，4-連接的葡萄糖二聚體。葡糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。將纖維素原料轉(zhuǎn)化為乙醇具有以下優(yōu)勢大量原料現(xiàn)成可用，避免燃燒或填埋材料的合意性，和乙醇燃料的清潔性。木材、農(nóng)業(yè)殘余物、草本作物和城市固體廢物已被認為是用于乙醇生產(chǎn)的原料。這些材料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。一旦將纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖，葡萄糖將容易地由酵母發(fā)酵成乙醇。WO2005/074647披露了來自土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)的具有增強纖維素分解的活性(celluolyticenhancingactivity)的分離的多肽及其多核苷酸。WO2005/074656披露了來自桔橙嗜熱霉(Thermoascusauranticaus)的具有增強纖維素分解的活性的分離的多肽及其多核苷酸。美國公開的申請系列號2007/0077630披露了來自里氏木霉(Trichodermareesei)的具有增強纖維素分解的活性的分離的多肽及其多核苷酸。本領(lǐng)域中的一個優(yōu)勢是提高纖維素分解蛋白質(zhì)組合物降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的能力。本發(fā)明涉及降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的能力改進的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物。發(fā)明簡述本發(fā)明涉及絲狀真菌宿主細胞，其包含(a)編碼具有增強纖維素分解的活性的天然或異源多肽的第一多核苷酸；(b)編碼天然或異源葡糖苷酶的第二多核苷酸；和(c)編碼選自下組的天然或異源纖維素分解酶的一個或多個(幾個)第三多核苷酸里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)、里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)，和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)，和它們的直向同源物或變體。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生纖維素分解蛋白質(zhì)組合物的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生該纖維素分解組合物的條件下培養(yǎng)這些絲狀真菌宿主細胞；和(b)回收所述纖維素分解蛋白質(zhì)組合物。本發(fā)明還涉及由這種方法獲得的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物。本發(fā)明還涉及纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，其包含(a)具有增強纖維素分解的活性的多肽；(b)β-葡糖苷酶；和(c)選自下組的一種或多種(幾種)纖維素分解酶里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)、里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)，和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)，和它們的直向同源物或變體。本發(fā)明還涉及用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，其包括用有效量的這種纖維素分解蛋白質(zhì)組合物處理纖維素材料。本發(fā)明進一步涉及產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括(a)用有效量的這種纖維素分解蛋白質(zhì)組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵步驟(a)中經(jīng)糖化的纖維素材料，以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(c)從發(fā)酵液回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。附圖簡述圖1顯示pMJ04的限制圖譜。圖2顯示pCaHj527的限制圖譜。圖3顯示pMT2188的限制圖譜。圖4顯示pCaHj568的限制圖譜。圖5顯示pMJ05的限制圖譜。圖6顯示pSMail30的限制圖譜。圖7顯示米曲霉(Aspergillusoryzae)β-葡糖苷酶天然信號序列的DNA序列和氨基酸序列(SEQIDNO:91和92)。圖8顯示特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)內(nèi)切葡聚糖酶V信號序列的DNA序列和氨基酸序歹Ij(SEQIDNO95和96)。圖9顯示pSMail35的限制圖譜。圖10顯示pSMail40的限制圖譜。圖11顯示pSaMe-Fl的限制圖譜。圖12顯示pSaMe-FX的限制圖譜。圖13顯示pAlLo47的限制圖譜。圖14顯示pSaMe-FH的限制圖譜。定義增強纖維素分解的活性術(shù)語“增強纖維素分解的活性”在本文定義為增強具有纖維素分解活性的蛋白對含纖維素材料的水解的生物活性。就本發(fā)明而言，通過測量與使用相等總蛋白加樣量但不含增強纖維素分解的活性的對照水解(l-50mg的纖維素分解蛋白/gPCS(經(jīng)預處理的玉米秸稈)中的纖維素)相比，來自在如下條件下纖維素分解蛋白對含纖維素材料的水解的還原糖增加或總的纖維二糖和葡萄糖的增加來確定增強纖維素分解的活性l_50mg的總蛋白/gPCS中的纖維素，其包含80-99.5%w/w纖維素分解蛋白和0.5-20%w/w增強纖維素分解活性的蛋白，在50°C進行1-7天。在一個優(yōu)選的方面，在3%米曲霉β-葡糖苷酶(根據(jù)WO02/095014在米曲霉中重組產(chǎn)生)或3%煙曲霉β-葡糖苷酶(根據(jù)WO02/095014的實施例22在米曲霉中重組產(chǎn)生)的存在下GEIXUGLAST1.5L(NovozymesA/S，Bagsvaerd,Denmark)的混合物的纖維素酶蛋白質(zhì)加樣量用作纖維素分解活性的標準物。具有增強纖維素分解的活性的多肽具有SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14的成熟多肽的增強纖維素分解的活性的至少20%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少100%。所述具有增強纖維素分解的活性的多肽通過下述方式增強由具有纖維素分解活性的蛋白質(zhì)所催化的含纖維素材料的水解將達到相同水解程度所需要的纖維素分解酶量降低優(yōu)選至少0.1倍，更優(yōu)選至少0.2倍、更優(yōu)選至少0.3倍、更優(yōu)選至少0.4倍、更優(yōu)選至少0.5倍、更優(yōu)選至少1倍、更優(yōu)選至少3倍、更優(yōu)選至少4倍、更優(yōu)選至少5倍、更優(yōu)選至少10倍、更優(yōu)選至少20倍、甚至更優(yōu)選至少30倍、最優(yōu)選至少50倍、并且甚至最優(yōu)選至少100倍。纖維素分解活性術(shù)語“纖維素分解活性”在本文定義為水解含纖維素材料的纖維素酶活性(如內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、葡糖苷酶或其組合)。纖維素分解蛋白可水解或水解羧甲基纖維素(CMC)，由此降低溫育混合物的粘度?？梢酝ㄟ^振動粘度計(vibrationviscosimeter)(如來自法國Sofraser的MIVI3000)測定所產(chǎn)生的粘度降低。纖維素酶活性的測定按照纖維素酶粘度單位(CEVU)來測量，所述測定通過測量樣品降低羧甲基纖維素(CMC)溶液粘度的能力來定量該樣品中存在的催化活性的量。該測定法在適于纖維素分解蛋白質(zhì)和底物的溫度和PH進行。就本發(fā)明而言，通過測量與不加入纖維素分解蛋白的對照水解相比，在以下條件下纖維素分解組合物對含纖維素材料的水解的增加來測定纖維素分解活性l_50mg纖維素分解蛋白/gPCS中的纖維素，在50°C進行1-7天內(nèi)切葡聚糖酶術(shù)語“內(nèi)切葡聚糖酶”在本文中的定義為內(nèi)切-1，4-(1，3;l，4)-i3-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-l，4-(1，3;1，4)-β-D-glucan4-glucanohydrolase)(Ε.C.No.3.2.1.4)，其催化纖維素、纖維素衍生物(如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉、混合的β-1，3葡聚糖如谷類β-D-葡聚糖或木葡聚糖中的β_1，4鍵和其它含有纖維素成分的植物材料中l(wèi)，4-i3-D-糖苷鍵的內(nèi)水解。就本發(fā)明而言，根據(jù)Ghose，1987，PureandApp1.Chem.59=257-268中的方法使用羧甲基纖維素(CMC)水解測定內(nèi)切葡聚糖酶的活性。纖維二糖水解酶術(shù)語“纖維二糖水解酶”在本文中的定義為1，4_β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶(Ε.C.3.2.1.91)，其催化纖維素、纖維寡糖或任何包含β-1,4-連接的葡萄糖的聚合物中l(wèi)，4-i3-D葡糖苷鍵的水解，從鏈的還原端或非還原端釋放纖維二糖。就本發(fā)明而言，根據(jù)Lever等，1972，Anal.Biochem.47:273_279和vanTilbeurgh等，1982，F(xiàn)EBSLetters149152-156；vanTilbeurgh禾口Claeyssens，1985，F(xiàn)EBSLetters187:283—288所描述的方法測定纖維二糖水解酶的活性。在本發(fā)明中，使用Lever等方法來評估玉米秸稈中纖維素的水解，同時使用vanTilbeurgh等的方法來測定對于熒光二糖衍生物的纖維二糖水解酶活性。β-葡糖苷酶術(shù)語“β-葡糖苷酶”在本文定義為β-D-葡糖苷葡糖水解酶(Ε.C.3.2.1.21)，其催化末端非還原性β-D-葡萄糖殘基的水解，并且釋放β-D-葡萄糖。就本發(fā)明而言，根據(jù)Venturi等，2002，J.BasicMicrobiol.42:55_66描述的基本方法來測定β-葡糖苷酶活性，只是采用如本文所述的不同的條件。將1單位的β-葡糖苷酶活性定義為在50°C、pH5，從IOOmM檸檬酸鈉、0.01%Tween20中作為底物的4mM對硝基苯基-β-D-葡萄吡喃糖苷每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾對硝基苯酚。家族1、家族3、家族5、家族6、家族7、家族9、家族12、家族45、家族61，或家族74糖苷水解酶術(shù)語“家族1、家族3、家族5、家族6、家族7、家族9、家族12、家族45、家族61，或家族74糖苷水解酶”或“家族GHl、家族GH3、家族GH5、家族GH6、家族GH7、家族GH9、家族GH12、家族GH45、家族GH61，或家族GH74”在本文中定義為根據(jù)HenrissatB.，1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309_316,禾口HenrissatB.,禾口BairochΑ.,1996,Updatingthesequence—basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695_696分別歸入糖苷水解酶家族1、家族3、家族5、家族6、家族7、家族9、家族12、家族45、家族61，或家族74的多肽。目前，Henrissat將GH61家族列為未分類，說明對于屬于此家族的多肽而言，諸如機制、催化親核體/堿、催化質(zhì)子供體和3-D結(jié)構(gòu)等性質(zhì)是未知的。含纖維素材料生物質(zhì)的初生細胞壁中的主要多糖是纖維素，第二豐富的多糖是半纖維素，而第三是果膠。在細胞停止生長之后產(chǎn)生的次生細胞壁也含有多糖，并且其通過與半纖維素共價交聯(lián)的聚合木質(zhì)素強化。纖維素是無水纖維二糖的均聚物，并且因此是線性的β_(l-4)-D-葡聚糖，而半纖維素在具有一系列取代基的復雜分支結(jié)構(gòu)中包括多種化合物，例如木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖。盡管通常是多形態(tài)的，纖維素在植物組織中主要作為平行葡聚糖鏈的不溶晶體基質(zhì)存在。半纖維素通常與纖維素以及與其它半纖維素通過氫鍵連接，其幫助穩(wěn)定細胞壁基質(zhì)。含纖維素材料可以是任何含纖維素的材料。纖維素通常存在于例如植物的莖、葉、果/種殼(hulls)、果/種皮(husks)、和穗軸(cob)中，或樹的葉、枝和木材中。含纖維素材料可以是但不限于草本材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、市政固體廢物、廢紙和紙漿及造紙廠殘余物。含纖維素材料可以是任意類型的生物質(zhì)，其包括但不限于木材資源、市政固體廢物、廢紙、作物和作物殘余物(參見，例如，Wiselogel等，1995，于HandbookonBioethanol(CharlesE·Wyman編)中，105-118頁，Taylor&Francis,WashingtonD.C.；ffyman,1994,BioresourceTechnology503-16；Lynd,1990,AppliedBiochemistryandBiotechnology24/25695-719；Mosier等，1999,RecentProgressinBioconversionofLignocellulosics,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,T.Scheper,managing編，Volume65,23-40頁，Springer-Verlag,NewYork)。在本文中可理解的是含纖維素材料優(yōu)選為木素纖維素的形式，例如，在混合基質(zhì)中含有木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的植物細胞壁材料。在優(yōu)選的方面，含纖維素材料是玉米秸稈。在另一個優(yōu)選的方面，含纖維素材料是玉米纖維。在另一個優(yōu)選的方面，含纖維素材料是玉米穗軸。在另一個優(yōu)選的方面，含纖維素材料是柳枝稷(switchgrass)。在另一個優(yōu)選的方面，含纖維素材料是稻草(ricestraw)0在另一優(yōu)選的方面，含纖維素材料是紙和紙漿加工廢料。在另一優(yōu)選的方面，含纖維素材料是木本或草本植物。在另一優(yōu)選的方面，纖維素材料是蔗渣?？梢园丛瓨邮褂煤w維素材料或可使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法對含纖維素材料進行預處理。例如，物理預處理技術(shù)可包括多種類型的磨制、照射、汽蒸/蒸汽爆炸和水熱解(hydrothermolysis)；化學預處理技術(shù)可包括稀酸、堿、有機溶劑、氨、二氧化硫、二氧化碳和PH控制的水熱解；而生物預處理技術(shù)可包括應用溶解木質(zhì)素的微生物(參見，例如，Hsu,Τ.-A.，1996，Pretreatmentofbiomass，于HandbookonBioethanolProductionandUtilization,Wyman,C.Ε.編，Taylor&Francis，Washington,DC，179-212；Ghosh，P.，禾口Singh，A.，1993，Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.Appl.Microbiol.39295~333；McMillan，J.D.，1994，Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview,inEnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction，Himme1,Μ.E.，Baker，J.0.，禾口Overend，R.P.編，ACSSymposiumSeries566，AmericanChemicalSociety,Washington,DC，chapter15；Gong,C.S.，Cao,N.J.，Du,J.，禾口Tsao，G.Τ.，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources，于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg，Germany,65207-241；Olsson，L，禾口Hahn-Hagerdal，B.，1996，F(xiàn)ermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction，Enz.Microb.Tech.18:312_331；以及Vallander,L，禾口Eriksson，K.-Ε.L，1990，ProductionofethanolfromlignocellulosicmaterialsStateoftheart，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63_95)。預處理的玉米秸稈術(shù)語“PCS”或“預處理的玉米秸稈”在本文中的定義為源自通過熱和稀酸處理的玉米秸稈的含纖維素的材料。就本發(fā)明而言，PCS由本文所述方法產(chǎn)生。全長多肽術(shù)語“全長多肽”在本文定義為具有生物活性的多肽的前體形式，其中所述前體包含信號肽區(qū)域，或者還包含前肽區(qū)，其中一旦從細胞分泌，信號肽即被切割，或者前肽也被切割，得到具有生物活性的多肽。信號肽術(shù)語“信號肽”在本文定義為以符合讀框的方式連接至多肽的氨基末端并指導編碼的多肽進入細胞的分泌途徑的肽。信號肽編碼序列術(shù)語“信號肽編碼序列”在本文定義為肽編碼區(qū)，其編碼以符合讀框的方式連接至多肽的氨基末端并指導編碼的多肽進入細胞的分泌途徑的氨基酸序列。前肽術(shù)語“前肽”在本文定義為以符合讀框的方式連接至多肽的氨基末端的肽。得到的多肽稱作前酶或前多肽(或者在一些情況中為酶原)。前多肽通常沒有活性，并且可以通過前肽的催化或自催化裂解由前多肽轉(zhuǎn)化為成熟活性多肽。當多肽的氨基末端同時存在信號肽和前肽區(qū)時，前肽區(qū)以符合讀框的方式連接至多肽的氨基末端，并且信號肽以符合讀框的方式連接至前肽區(qū)的氨基末端。前肽編碼序列術(shù)語“前肽編碼序列，，在本文定義為肽編碼區(qū)，其編碼以符合讀框的方式連接至多肽的氨基末端的氨基酸序列，形成前酶或前多肽(或者在一些情況中為酶原)。催化域術(shù)語“催化域”在本文定義為β-葡糖苷酶或內(nèi)切葡聚糖酶的氨基序列的結(jié)構(gòu)部分或區(qū)域，其具有β"葡糖苷酶或內(nèi)切葡聚糖酶的催化活性。β-葡糖苷酶融合蛋白術(shù)語“β_葡糖苷酶融合蛋白”在本文定義為表現(xiàn)出β-葡糖苷酶活性并至少包含β"葡糖苷酶催化域和內(nèi)切葡聚糖酶催化域的多肽。β-葡糖苷酶融合蛋白的組件術(shù)語“β"葡糖苷酶融合蛋白的組件”在本文定義為β-葡糖苷酶融合蛋白的個體(切割的)片段，其中每個片段都具有β-葡糖苷酶活性，并且包括內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶催化域或者融合蛋白的β-葡糖苷酶催化域。例如，在融合蛋白的內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶組件之間存在裂解位點，例如，Kex2位點，能夠?qū)е庐a(chǎn)生具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽和另一個具有β“葡糖苷酶活性的多肽。纖維素結(jié)合域術(shù)語“纖維素結(jié)合域(CBD)”在本文定義為內(nèi)切葡聚糖酶(纖維素酶)的部分氨基酸序列，其與內(nèi)切葡聚糖酶的纖維素結(jié)合活性有關(guān)。纖維素結(jié)合域通常通過將內(nèi)切葡聚糖酶非共價連接至纖維素、纖維素衍生物，或其多糖等同物而發(fā)揮作用。CBD通常獨立于催化域發(fā)揮作用。β-葡糖苷酶融合構(gòu)建體“術(shù)語β"葡糖苷酶融合構(gòu)建體”指由可操作連接的不同基因或其部分組成的核酸構(gòu)建體。組件從5’末端開始包括至少包含內(nèi)切葡聚糖酶催化域的DNA分子，和至少包含β-葡糖苷酶催化域的DNA分子。分離的多肽術(shù)語“分離的多肽”用于本文中指的是從來源分離的多肽。在優(yōu)選的方面，如通過SDS-PAGE測定的，多肽至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，以及最優(yōu)選至少90%純?；旧霞兊亩嚯男g(shù)語“基本上純的多肽”在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物按重量計含有至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%,更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然結(jié)合的(associated)或重組結(jié)合的其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%純，最優(yōu)選至少99.5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式，即，所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然結(jié)合的或重組結(jié)合的其它多肽材料。這能夠通過以下方法實現(xiàn)，例如，通過公知的重組方法或由經(jīng)典純化方法制備多肽。成熟多肽術(shù)語“成熟多肽”在本文中定義為具有生物活性(如酶活性)的多肽，所述多肽以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。成熟多肽編碼序列術(shù)語“成熟多肽編碼序列”在本文中定義為編碼具有生物活性的成熟多肽的核苷酸序列。同一性參數(shù)“同一性”描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的同一性程度使用EMBOSS程序包(EMBOSSTheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,TrendsinGenetics16276-277)的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，J.Mol.Biol.48=443-453)來測定，優(yōu)選版本3.0或更新的版本。使用的可選參數(shù)是缺口開啟罰分(gapopenpenalty)10，缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)0.5和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。使用Needle標記為“最長同一性”(使用-nobrief選項得到)的輸出作為百分比同一性并且計算如下(相同的殘基XlOO)/(比對的長度-比對中的缺口總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個脫氧核糖核酸序列之間的同一性程度使用EMBOSS程序包(EMBOSSTheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite，Rice等，2000，見上文)的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，I97O,見上文)來測定，優(yōu)選版本3.0或更新的版本。使用的可選參數(shù)是缺口開啟罰分10，缺口延伸罰分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)取代矩陣。使用Needle標記為“最長同一性”(使用-nobrief選項得到)的輸出作為百分比同一性并且如下計算(相同的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對的長度-比對中的缺口總數(shù))同源序列術(shù)語“同源序列”在本文定義為使用blastp(用于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫)或tblastn(用于核酸數(shù)據(jù)庫)算法，及BL0SUM62矩陣、字長(wordsize)3、缺口存在分值(gapexistencecost)11、缺口延伸分值(gapextensioncost)1、無低復雜性過濾并且使用成熟蛋白序列作為查詢對象時，E值(或期望得分(expectancyscore))小于0.001的序列。參見Altschul等，1997，NucleicAcidsRes.25:3389_3402。多肽片段術(shù)語“多肽片段”在本文中定義為從成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個(幾個)氨基酸的多肽，或者其同源序列；其中所述片段具有其成熟多肽的活性。亞序列術(shù)語“亞序列(subsequence)”在本文中定義為從成熟多肽編碼序列的5’和/或3’端缺失一個或多個(幾個)核苷酸的核苷酸序列，或其同源序列；其中所述亞序列編碼具有其成熟多肽的活性的多肽片段。等位變體(allelicvariant)術(shù)語“等位變體”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸術(shù)語“分離的多核苷酸”用于本文中指與來源分離的多核苷酸。在優(yōu)選的方面，如通過瓊脂糖電泳測定的，所述多核苷酸為至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，以及最優(yōu)選至少90%純?；旧霞兊亩嗪塑账嵝g(shù)語“基本上純的多核苷酸”用于本文指不含其它外來的或不期望的核苷酸的多核苷酸制備物，并且所述多核苷酸制備物處于適合于在遺傳工程的蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然結(jié)合的或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，例如啟動子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99%，并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純的。本發(fā)明所述多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式，即，所述多核苷酸制備物基本上不含與其天然結(jié)合的或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任思組合。cDNA:術(shù)語“cDNA”在本文中定義為能夠通過逆轉(zhuǎn)錄從得自真核細胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內(nèi)含子序列。因而源自mRNA的cDNA沒有任何內(nèi)含子序列。核酸構(gòu)建體術(shù)語“核酸構(gòu)建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的或者合成的基因，或所述核酸分子以本來不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式被修飾以含有核酸的片段，或所述核酸分子是合成的。當所述核酸構(gòu)建體含有表達本發(fā)明中的編碼序列所需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達盒”同義。調(diào)控序列(controlsequence)術(shù)語“調(diào)控序列”在本文定義為包括對于本發(fā)明中編碼多肽的多核苷酸的表達是必需的所有組分。各調(diào)控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接。可操作地連接術(shù)語“可操作地連接”在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的合適位置，使得調(diào)控序列指導多肽的編碼序列的表達。編碼序列當用于本文時術(shù)語“編碼序列”的意思是直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框確定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可選的起始密碼子例如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的核苷酸序列。表達術(shù)語“表達”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達載體術(shù)語“表達載體”在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達的額外核苷酸可操作地連接。宿主細胞如本文中所使用的術(shù)語“宿主細胞”包括任何細胞類型，所述細胞類型對于用包含多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導等是易感的(susceptible)0修飾術(shù)語“修飾”在本文的意思是，對成熟多肽或其同源序列的任何化學修飾，以及對編碼這種多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個或多個(幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個(幾個)氨基酸側(cè)鏈的取代。人工變體當用在本文時，術(shù)語“人工變體”的意思是由表達成熟多肽編碼序列的修飾的核苷酸序列或其同源序列的生物體產(chǎn)生的多肽。所述修飾的核苷酸序列通過人為干預(humanintervention)，通過修飾多核苷酸序列或其同源序列來獲得。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及絲狀真菌宿主細胞，其包含(a)編碼具有增強纖維素分解的活性的天然或異源多肽的第一多核苷酸；(b)編碼天然或異源葡糖苷酶的第二多核苷酸；和(c)編碼選自下組的天然或異源的一個或多個(幾個)纖維素分解酶的一個或多個(幾個)第三多核苷酸里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)，里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)，和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)，和它們的直向同源物或變體。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生纖維素分解蛋白質(zhì)組合物的方法，其包括(a)有益于產(chǎn)生所述纖維素分解蛋白質(zhì)組合物的條件下培養(yǎng)這樣的絲狀真菌宿主細胞；和(b)回收所述纖維素分解蛋白質(zhì)組合物。本發(fā)明還涉及由這種方法獲得的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物。本發(fā)明還涉及纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，其包含(a)具有增強纖維素分解的活性的多肽；(b)β-葡糖苷酶；和(c)選自下組的一個或多個(幾個)纖維素分解酶里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)，里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)，和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)，和它們的直向同源物或變體。在優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞產(chǎn)生包含下述的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物SEQIDNO8的成熟多肽的具有增強纖維素分解的活性的多肽；SEQIDNO106的β-葡糖苷酶融合蛋白；SEQIDNO:52的成熟多肽的里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)，SEQIDNO54的成熟多肽的里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)，和SEQIDNO56的成熟多肽的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)。在優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是里氏木霉，特別是里氏木霉RutC30o在另一個優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞產(chǎn)生包含下述的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物SEQIDNO:8的成熟多肽的具有增強纖維素分解的活性的多肽；SEQIDNO:106的β-葡糖苷酶融合蛋白；SEQIDNO52的成熟多肽的里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)，SEQIDNO:54的成熟多肽的里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)JPSEQIDNO:56的成熟多肽的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)，并且進一步產(chǎn)生選自下組的一個或多個(幾個)酶SEQIDNO58的成熟多肽的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(CEL5A)，SEQIDNO62的成熟多肽的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(CEL45A)，和SEQIDNO60的成熟多肽的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(CEL12A)。在另一個優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是里氏木霉，特別是里氏木霉RutC30。在另一個優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞產(chǎn)生包含下述的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物SEQIDNO:8的成熟多肽的具有增強纖維素分解的活性的多肽；SEQIDNO:106的β-葡糖苷酶融合蛋白；SEQIDNO52的成熟多肽的里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)，SEQIDNO:54的成熟多肽的里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)JPSEQIDNO:56的成熟多肽的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)，并且還產(chǎn)生SEQIDNO:64的成熟多肽的土生梭孢霉纖維二糖水解酶。在另一個優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是里氏木霉，特別是里氏木霉RutC30。在另一個優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞產(chǎn)生包含下述的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物SEQIDNO:8的成熟多肽的具有增強纖維素分解的活性的多肽；SEQIDNO106的β-葡糖苷酶融合蛋白；SEQIDNO52的成熟多肽的里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)，SEQIDNO:54的成熟多肽的里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)JPSEQIDΝ0:56的成熟多肽的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)，并且進一步產(chǎn)生(1)選自下組的一個或多個(幾個)酶SEQIDNO:58的成熟多肽的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(CEL5A)，SEQIDNO:62的成熟多肽的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(CEL45A)JPSEQIDNO:60的成熟多肽的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(CEL12A)，和/或(2)還產(chǎn)生SEQIDNO64的成熟多肽的土生梭孢霉纖維二糖水解酶。在另一個優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是里氏木霉，特別是里氏木霉RutC30。在另一個優(yōu)選的方面，纖維素分解蛋白質(zhì)組合物包含SEQIDNO:8的成熟多肽的具有增強纖維素分解的活性的多肽；SEQIDNO:106的β-葡糖苷酶融合蛋白；SEQIDNO52的成熟多肽的里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)，SEQIDNO54的成熟多肽的里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)，和SEQIDNO56的成熟多肽的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)。在另一個優(yōu)選的方面，纖維素分解蛋白質(zhì)組合物包含SEQIDNO:8的成熟多肽的具有增強纖維素分解的活性的多肽；SEQIDNO:106的β-葡糖苷酶融合蛋白；SEQIDNO52的成熟多肽的里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)，SEQIDNO54的成熟多肽的里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)，和SEQIDNO56的成熟多肽的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)，并且進一步包含選自下組的一個或多個(幾個)酶SEQIDNO:58的成熟多肽的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(CEL5A)，SEQIDNO62的成熟多肽的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(CEL45A)，和SEQIDNO60的成熟多肽的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(CEL12A)。在另一個優(yōu)選的方面，纖維素分解蛋白質(zhì)組合物包含SEQIDNO8的成熟多肽的具有增強纖維素分解的活性的多肽；SEQIDNO:106的β-葡糖苷酶融合蛋白；SEQIDNO52的成熟多肽的里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)，SEQIDNO54的成熟多肽的里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)，和SEQIDNO56的成熟多肽的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)，并且進一步包含SEQIDNO:64的成熟多肽的土生梭孢霉纖維二糖水解酶。在另一個優(yōu)選的方面，纖維素分解蛋白質(zhì)組合物包含SEQIDNO:8的成熟多肽的具有增強纖維素分解的活性的多肽；SEQIDNO:106的β-葡糖苷酶融合蛋白；SEQIDNO52的成熟多肽的里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)，SEQIDNO54的成熟多肽的里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)，和SEQIDNO56的成熟多肽的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)，并且進一步包含(1)選自下組的一個或多個(幾個)酶SEQIDNO58的成熟多肽的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(CEL5A)，SEQIDNO62的成熟多肽的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(CEL45A)，和SEQIDNO:60的成熟多肽的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(CEL12A)，和/或(2)還包含SEQIDNO64的成熟多肽的土生梭孢霉纖維二糖水解酶。具有增強纖維素分解的活性的多肽及其多核苷酸用于處理含纖維素材料的具有增強纖維素分解的活性的任何多肽可以在本發(fā)明的組合物中使用。編碼具有增強纖維素分解的活性的這種多肽的多核苷酸能用于產(chǎn)生組合物。在第一方面，具有增強纖維素分解的活性的分離的多肽包含以下基序(motif)[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]禾口[Fff]-[TF]-K-[AIV],其中X是任何氨基酸，X(4,5)是在4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，并且X(4)是在4個鄰接位置上的任何氨基酸。包含上述基序的分離的多肽可進一步包含H-X(1,2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]，[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，或H-X(1,2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]禾口[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，其中X是任何氨基酸，X(1，2)是在1個位置或2個鄰接位置上的任何氨基酸，X(3)是在3個鄰接位置上的任何氨基酸，并且X(2)是在2個鄰接位置上的任何氨基酸。在上述基序中，采用公認的IUPAC單字母氨基酸縮寫。在優(yōu)選的實施方案中，具有增強纖維素分解的活性的分離的多肽進一步包含H-X(1，2)-G-P-X(3)_[YW]-[AILMV]。在另一個優(yōu)選的實施方案中，具有增強纖維素分解的活性的分離的多肽還包含[EQ]-X-Y-X⑵-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在另一個優(yōu)選的實施方案中，具有增強纖維素分解的活性的分離的多肽還包含H-X(l，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]禾口[EQ]-Χ—Υ—Χ(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在第二方面，具有增強纖維素分解的活性的分離的多肽包含以下基序[ILMV]-P-X(4，5)-G—x—Y-[ILMV]—x—R—x—[EQ]-χ(3)-A-[HNQ]，其中χ是任何氨基酸，χ(4,5)是在4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，并且χ(3)是在3個鄰接位置上的任何氨基酸。在以上基序中，采用公認的IUPAC單字母氨基酸縮寫。在第三個方面，具有增強纖維素分解的活性的分離的多肽包含或組成為與SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8，或SEQIDNO10，SEQIDNO:12，或SEQIDNO:14的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，97%，98%，或99%的同一性程度的氨基酸序列，其具有增強纖維素分解的活性(下文中的“同源多肽”)。在優(yōu)選的方面，所述同源多肽包含或組成為與SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDNO:8，或SEQIDNO:10，SEQIDNO:12，或SEQIDNO:14的成熟多肽相差十個氨基酸，優(yōu)選五個氨基酸，更優(yōu)選四個氨基酸，甚至更優(yōu)選三個氨基酸，最優(yōu)選兩個氨基酸，并且甚至最優(yōu)選一個氨基酸的氨基酸序列。具有增強纖維素分解的活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有增強纖維素分解的活性的片段。在優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:2的成熟多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO2的氨基酸20至326，或其等位變體；或它們的具有增強纖維素分解的活性的片段。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:2的氨基酸20至326。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位變體；或者由它們具有增強纖維素分解的活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO2的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO2的成熟多肽組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:2的氨基酸20至326或其等位變體；或它們的具有增強纖維素分解的活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO2的氨基酸20至326組成。具有增強纖維素分解的活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO:4的氨基酸序列或其等位變體；或者它們的具有增強纖維素分解的活性的片段。在優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:4的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:4的成熟多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:4的氨基酸18至240，或其等位變體；或者它們的具有增強纖維素分解的活性的片段。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO4的氨基酸18至240。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:4的氨基酸序列或其等位變體；或者它們的具有增強纖維素分解的活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO4的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO4的成熟多肽組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:4的氨基酸18至240或其等位變體；或者它們的具有增強纖維素分解的活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO4的氨基酸18至240組成。具有增強纖維素分解的活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO:6的氨基酸序列或其等位變體；或者它們的具有增強纖維素分解的活性的片段。在優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:6的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:6的成熟多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:6的氨基酸20至258，或其等位變體；或者它們的具有增強纖維素分解的活性的片段。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO6的氨基酸20至258。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:6的氨基酸序列或其等位變體；或者它們的具有增強纖維素分解的活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO6的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO6的成熟多肽組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO6的氨基酸20至258或其等位變體；或者它們的具有增強纖維素分解的活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO6的氨基酸20至258組成。具有增強纖維素分解的活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO:8的氨基酸序列或其等位變體；或者它們的具有增強纖維素分解的活性的片段。在優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:8的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:8的成熟多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:8的氨基酸19至226，或其等位變體；或者它們的具有增強纖維素分解的活性的片段。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO8的氨基酸19至226。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:8的氨基酸序列或其等位變體；或者它們的具有增強纖維素分解的活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO8的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO8的成熟多肽組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:8的氨基酸19至226或其等位變體；或者它們的具有增強纖維素分解的活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO8的氨基酸19至226組成。具有增強纖維素分解的活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO10的氨基酸序列或其等位變體；或者它們的具有增強纖維素分解的活性的片段。在優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:10的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:10的成熟多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:10的氨基酸20至304，或其等位變體；或者它們的具有增強纖維素分解的活性的片段。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO10的氨基酸20至304。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO10的氨基酸序列或其等位變體；或者它們的具有增強纖維素分解的活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:10的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO10的成熟多肽組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO10的氨基酸20至304或其等位變體；或者它們的具有增強纖維素分解的活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO10的氨基酸20至304組成。具有增強纖維素分解的活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO12的氨基酸序列或其等位變體；或者它們的具有增強纖維素分解的活性的片段。在優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:12的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:12的成熟多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:12的氨基酸23至250，或其等位變體；或者它們的具有增強纖維素分解的活性的片段。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:12的氨基酸23至250。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:12的氨基酸序列或其等位變體；或者它們的具有增強纖維素分解的活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:12的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:12的成熟多肽組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:12的氨基酸23至250或其等位變體；或者它們的具有增強纖維素分解的活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO12的氨基酸23至250組成。具有增強纖維素分解的活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO14的氨基酸序列或其等位變體；或者它們的具有增強纖維素分解的活性的片段。在優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:14的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:14的成熟多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:14的氨基酸20至249，或其等位變體；或者它們的具有增強纖維素分解的活性的片段。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:14的氨基酸20至249。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:14的氨基酸序列或其等位變體；或者它們的具有增強纖維素分解的活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:14的氨基酸序列組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:14的成熟多肽組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:14的氨基酸20至249或其等位變體；或者它們的具有增強纖維素分解的活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO14的氨基酸20至249組成。優(yōu)選地，SEQIDNO:2的成熟多肽的片段包含至少277個氨基酸殘基，更優(yōu)選地至少287個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少297個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDNO:4的成熟多肽的片段包含至少185個氨基酸殘基，更優(yōu)選地至少195個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少205個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDNO6的成熟多肽的片段包含至少200個氨基酸殘基，并且優(yōu)選地至少212個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少224個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDN08的成熟多肽的片段包含至少175個氨基酸殘基，更優(yōu)選地至少185個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少195個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDNO:10的成熟多肽的片段包含至少240個氨基酸殘基，更優(yōu)選地至少255個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少270個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDN0:12的成熟多肽的片段包含至少175個氨基酸殘基，更優(yōu)選地至少190個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少205個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDN0:14的成熟多肽的片段包含至少200個氨基酸殘基，更優(yōu)選地至少210個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少220個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列的亞序列包含至少831個核苷酸，更優(yōu)選地至少861個核苷酸，并且最優(yōu)選至少891個核苷酸。優(yōu)選地，SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列的亞序列包含至少555個核苷酸，更優(yōu)選地至少585個核苷酸，并且最優(yōu)選至少23615個核苷酸。優(yōu)選地，SEQIDNO:5的成熟多肽編碼序列的亞序列包含至少600個核苷酸，更優(yōu)選地至少636個核苷酸，并且最優(yōu)選至少672個核苷酸。優(yōu)選地，SEQIDNO7的成熟多肽編碼序列的亞序列包含至少525個核苷酸，更優(yōu)選地至少555個核苷酸，并且最優(yōu)選至少585個核苷酸。優(yōu)選地，SEQIDNO9的成熟多肽編碼序列的亞序列包含至少720個核苷酸，更優(yōu)選地至少765個核苷酸，并且最優(yōu)選至少810個核苷酸。優(yōu)選地，SEQIDNO11的成熟多肽編碼序列的亞序列包含至少525個核苷酸，更優(yōu)選地至少570個核苷酸，并且最優(yōu)選至少615個核苷酸。優(yōu)選地，SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列的亞序列包含至少600個核苷酸，更優(yōu)選地至少630個核苷酸，并且最優(yōu)選至少660個核苷酸。在第四方面，具有增強纖維素分解的活性的分離的多肽由包含下述核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列在至少非常低嚴緊條件下，優(yōu)選至少低嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中_高嚴緊條件下，甚至更優(yōu)選至少高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選至少非常高嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNOSEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11，或SEQIDNO13的成熟多肽編碼序列，(ii)包含在SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO11的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或包含SEQIDNO:7、SEQIDNO:9或SEQIDNO13的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，(iii)⑴或(ii)的亞序列，或者(iv)(i)、(ii)或(iii)的全長互補鏈(JJ.Sambrook,E.F.Fritsch禾口T.Maniatis,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarbor，NewYork)。SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5,SEQIDN0:7、SEQIDNO:9、SEQIDN0:11，或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少100個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽片段。在優(yōu)選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO1的核苷酸388至1332、SEQIDNO3的核苷酸98至821、SEQIDNO5的核苷酸126至978、SEQIDNO7的核苷酸55至678、SEQIDNO9的核苷酸58至912、SEQIDNO11的核苷酸67至796，或SEQIDNO13的核苷酸77至766。SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDN0:11，或SEQIDNO13的核苷酸序列或其亞序列，以及SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDN0:6、SEQIDNO:8，或SEQIDNO10、SEQIDNO:12，或SEQIDNO:14的氨基酸序列或其片段，可以用于設(shè)計核酸探針，以從不同屬和種的菌株鑒定和克隆編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽的DNA。尤其，這樣的探針可用于根據(jù)標準Southern印跡程序與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑒定和分離其中相應的目的基因。這樣的探針可能比整個序列短很多，但是其長度應該是至少14，優(yōu)選至少25，更優(yōu)選至少35，并且最優(yōu)選至少70個核苷酸。然而，優(yōu)選所述核酸探針的長度為至少100個核苷酸。例如，核酸探針的長度可為至少200個核苷酸，優(yōu)選至少300個核苷酸，更優(yōu)選至少400個核苷酸，或最優(yōu)選至少500個核苷酸。甚至可以用更長的探針，例如，長度為至少600個核苷酸，至少優(yōu)選至少700個核苷酸，更優(yōu)選至少800個核苷酸，或最優(yōu)選至少900個核苷酸的核酸探針。DNA和RNA探針都可以使用。通常將探針加以標記用于檢測相應的基因(例如，用32p、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。這些探針都包含在本發(fā)明中。因而，可從由這些其它菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽?？梢酝ㄟ^瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過其它分離技術(shù)來分離來自這些其它菌株的基因組或其它DNA?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至并固定在硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料上。為了鑒定與SEQIDNO:1或其亞序列同源的克隆或DNA，優(yōu)選將所述載體材料用在Sounthern印跡中。就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴緊條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應于SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO7,SEQIDN0:9、SEQIDN0:11，或SEQIDNO13的成熟多肽編碼序列，包含在SEQIDNO:USEQIDN0:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO11的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或包含SEQIDNO:7、SEQIDNO:9或SEQIDNO13的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，它的全長互補鏈或其亞序列?？墒褂美鏧射線片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與所述核酸探針雜交的分子。在優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的核苷酸388至1332。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:2的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含于大腸桿菌(E.coli)NRRLB-30699中的質(zhì)粒PEJG120所包含的多核苷酸序列，其中它的多核苷酸序列編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含于大腸桿菌NRRLB-30699中的質(zhì)粒pEJG120所包含的成熟多肽編碼區(qū)。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:3的核苷酸98至821。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:4的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:3。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含于大腸桿菌NRRLB-30813中的質(zhì)粒pTter61C所包含的多核苷酸序列，其中它的多核苷酸序列編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含于大腸桿菌NRRLB-30813中的質(zhì)粒pTter61C所包含的成熟多肽編碼區(qū)。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:5的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:5的核苷酸126至978。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:6的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:5。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含于大腸桿菌NRRLB-30812中的質(zhì)粒pTter61D所包含的多核苷酸序列，其中它的多核苷酸序列編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含于大腸桿菌NRRLB-30812中的質(zhì)粒pTter61D所包含的成熟多肽編碼區(qū)。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:7的核苷酸55至678。在另一個、優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:8的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:7。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含于大腸桿菌NRRLB-30814中的質(zhì)粒pTter61E所包含的多核苷酸序列，其中它的多核苷酸序列編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含于大腸桿菌NRRLB-30814中的質(zhì)粒pTter61E所包含的成熟多肽編碼區(qū)。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:9的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:9的核苷酸58至912。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:10的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:9。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含于大腸桿菌NRRLB-30811中的質(zhì)粒pTter61G所包含的多核苷酸序列，其中它的多核苷酸序列編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含于大腸桿菌NRRLB-30811中的質(zhì)粒pTter61G所包含的成熟多肽編碼區(qū)。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO11的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:11的核苷酸67至796。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:12的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO=Il0在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含于大腸桿菌NRRLB-30704中的質(zhì)粒PDZA2-7所包含的多核苷酸序列，其中它的多核苷酸序列編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽。在另一優(yōu)選方面，核酸探針是包含于大腸桿菌NRRLB-30704中的質(zhì)粒pDZA2-7所包含的成熟多肽編碼區(qū)。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO13的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:13的核苷酸77至766。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:14的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDN0:13。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含于大腸桿菌NRRLB-30878中的質(zhì)粒pTr333所包含的多核苷酸序列，其中它的多核苷酸序列編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含于大腸桿菌NRRLB-30878中的質(zhì)粒pTr333所包含的成熟多肽編碼區(qū)。對于長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴緊條件定義為在42°C，在5XSSPE.0.3%SDS、200μg/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對于非常低和低嚴緊性為25%的甲酰胺、對于中和中-高嚴緊性為35%的甲酰胺、或?qū)τ诟吆头浅８邍谰o性為50%的甲酰胺，根據(jù)標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交最佳12至24小時。對于長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2XSSC,0.2%SDS優(yōu)選至少在450C(非常低嚴緊性)，更優(yōu)選至少在50°C(低嚴緊性)，更優(yōu)選至少在55°C(中嚴緊性)，更優(yōu)選至少在60°C(中-高嚴緊性)，甚至更優(yōu)選至少在65°C(高嚴緊性)，并且最優(yōu)選至少在70°C(非常高嚴緊性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴緊條件定義為在比牛艮據(jù)Bolton禾口McCarthy計算法(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA481390)得出的Tm低大約5°C至大約10°C，在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA,0.5%NP-40，1XDenhardt溶液，ImM焦磷酸鈉(sodiumpyrophosphate)，ImM舞酸二fiil^l(sodiummonobasicphosphate),0.ImMATP禾口0.2mg每ml的酵母RNA中，根據(jù)標準的Southern印跡步驟進行預雜交、雜交和雜交后洗滌最佳12至24小時。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在比計算的Tm低5°C至10°C的溫度下在6XSSC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，并用6XSSC洗滌兩次，每次15分鐘。在第五方面，具有增強纖維素分解的活性的分離的多肽由包含或組成為如下核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO11或SEQIDNO13的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%的序列同一性程度，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，97%，98%，或99%的同一性程度，其編碼具有增強纖維素分解的活性的活性多肽。在優(yōu)選的方面，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO1的核苷酸388至1332，SEQIDNO3的核苷酸98至821，SEQIDNO5的核苷酸126至978，SEQIDNO7的核苷酸55至678，SEQIDNO9的核苷酸58至912，SEQIDNO11的核苷酸67至796，或SEQIDNO13的核苷酸77至766。參見本文中多核苷酸部分。在第六方面，具有增強纖維素分解的活性的分離的多肽是人工變體，所述人工變體在SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8，或SEQIDNO:10、SEQIDN0:12，或SEQIDNO:14的成熟多肽，或其同源序列中包含一個或多個(幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入。優(yōu)選氨基酸改變對性質(zhì)是較不重要的(ofaminornature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為1至大約30個氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進純化的小延伸(如多組氨酸區(qū)(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合域(bindingdomain))。保守取代的實例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H.Neuratt^PR.L.Hill,1979，于TheProteins,AcademicPress,NewYork描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu禾口Asp/Gly。除了20個標準氨基酸，可以以非標準的氨基酸(例如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)取代野生型多肽的氨基酸殘基?？梢杂糜邢迶?shù)目的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸取代氨基酸殘基?！胺翘烊话被帷痹诘鞍踪|(zhì)合成后已經(jīng)過修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上能夠獲得的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑烷羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸?？晒┻x擇的是，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)以使多肽的物理化學性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可改進多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適PH等。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變導入到分子中的每個殘基，并且測試所得突變分子的生物活性以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271274699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結(jié)構(gòu)的物理分析而測定，如通過以下這些技術(shù)如核磁共振、晶體學、電子衍射或光親和標記，連同推定的接觸位點氨基酸的突變來測定。參見例如deVos等，1992，Science255:306_312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224899-904；Wlodaver等，1992，F(xiàn)EBSLett.309:59_64。也可通過分析與本發(fā)明多肽的相關(guān)多肽的同一性來推斷必需氨基酸的身份。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如那些由Reidhaar-Olson禾ΠSauer,1988，Science241:53_57；Bowie禾ΠSauer,1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152_2156；WO95/17413；或W095/22625公開的那些方法來進行并測試單個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.3010832-10837；美國專利No.5，223，409；WO92/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire等，1986，Gene46145；Ner等，1988，DNA7127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnology17:893-896)。能夠從宿主細胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標準方法快速測序。這些方法允許快速確定感興趣的多肽中單個氨基酸殘基的重要性，并且能夠應用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8、SEQIDNO10,SEQIDNO:12，或SEQIDNO:14的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10，優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選至多6，更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選1。具有增強纖維素分解的活性的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關(guān)的術(shù)語“獲得自”，意思是由核苷酸序列編碼的多肽由所述來源產(chǎn)生，或由其中插入了來自所述來源的核苷酸序列的菌株產(chǎn)生。在優(yōu)選的方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。具有增強纖維素分解的活性的多肽可以是細菌多肽。例如，多肽可以是革蘭氏陽性細菌的多肽，如具有增強纖維素分解的活性的芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)>IflifM(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)，或海洋芽孢菌屬(Oceanobacillus)多肽，或革蘭氏陰性細菌的多肽，如具有增強纖維素分解的活性的大腸桿菌、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)>^MIfliiM(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬(Ureaplasma)多肽。在優(yōu)選的方面，多肽是具有增強纖維素分解的活性的嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、!軍定^1Ur包!f胃(Bacillusamyloliquefaciens)lif(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus28licheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),或蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)多肽。在另一個優(yōu)選的方面，多肽是具有增強纖維素分解的活性的似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、酉良月農(nóng)鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸痕亞禾中(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)多月太。在另一個優(yōu)選的方面，多肽是具有增強纖維素分解的活性的不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)，或淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)多月太。具有增強纖維素分解的活性的多肽還可以是具有增強纖維素分解的活性的真菌多肽，并且更優(yōu)選是酵母多肽，如念珠菌屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)多肽；或更優(yōu)選是具有增強纖維素分解的活性的絲狀真菌多肽，如枝頂孢霉屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、Botryospaeria、擬賭菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、麥角菌屬(Clavic印s)、方寵孢腔菌屬(Cochliobolus)、鬼傘屬(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼菌屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二孢屬(Diplodia)、黑膠菌屬(Exidia)、Filibasidium、鍵抱屬(Fusarium)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotorides)、腐質(zhì)霄屬(Humicola)、奉巴菌屬(Irpex)、香屬(Lentinula)、Leptospaeria、梨抱菌屬(Magnaporthe)、Melanocarpus、亞灰樹花菌屬(Meripilus)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霄屬(Myceliophthora)、新考瑪月旨霄屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)>擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia,假黑盤菌屬(Pseudoplectania)、假披發(fā)蟲屬(Pseudotrichonympha)、根毛霉屬(Rhizomucor)、裂裙菌屬(Schizophyllum)、柱霉屬(Scytalidium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱霉屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、長毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、草屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽。在優(yōu)選的方面，多肽是具有增強纖維素分解的活性的卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)>MSlH^Sl#(Saccharomycesdiastaticus)>itIl-feKSl母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多月太。在另一優(yōu)選的方面，多肽是具有增強纖維素分解的活性的解纖維枝頂抱霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、曰本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、漂曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、嗜角質(zhì)金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、獎狀金抱子菌(Chrysosporiummerdarium)、Chrysosporiuminops、Chrysosporiumpannicola、昆士蘭金抱子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、Chrysosporiumzonatum、桿抱狀德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、庫威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀,廉抱(Fusariumculmorum)、禾本禾斗德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圓,廉抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱,廉抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicolalanuginosa)、乳白奉巴菌(Irpexlacteus)、米赫毛毒(Mucormiehie)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)、繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、無色梭抱殼(Thielaviaachromatica)、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱殼(Thielaviaaustraleinsis)、Thielaviafimeti、微抱梭抱殼(Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱殼(Thielaviaovispora)、Thielaviaperuviana、Thielaviaspededonium、€包冑(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila、土生梭抱霉、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningji)、長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉、綠色木^(Trichodermaviride)Trichophaea在更優(yōu)選的方面，多肽是具有增強纖維素分解的活性的土生梭孢霉多肽。在最優(yōu)選的實施方案中，多肽是具有增強纖維素分解的活性的土生梭孢霉NRRL8126多肽，例如，SEQIDNO:2、4、6、8或10的成熟多肽，或其具有增強纖維素分解的活性的片段。在另一更優(yōu)選的方面，多肽是具有增強纖維素分解的活性的桔橙嗜熱霉(Thermoascusaurantiacus)多月太,例如，SEQIDNO12的成熟多月太。在另一更優(yōu)選的方面，多肽是具有增強纖維素分解的活性的里氏木霉多肽。在另一最優(yōu)選的方面，多肽是具有增強纖維素分解的活性的里氏木霉RutC30(ATCC56765)多肽，例如，SEQIDNO:14的成熟多肽，或其具有增強纖維素分解的活性的片段?？衫斫獾氖菍τ谇笆龅奈锓N，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates)兩者，和其它分類學的等同物(equivalent)，例如無性型(anamorph)，而無論它們已知的種名。本領(lǐng)域技術(shù)人員將輕易地識別適合的等同物的身份。這些物種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對于公眾能夠輕易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammiungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心，北區(qū)研究中心30(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得這些多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。然后可通過相似地篩選這種微生物的基因組或cDNA文庫來獲得所述多核苷酸。一旦用所述探針檢測到編碼多肽的多核苷酸序列，就能夠使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)來分離或克隆所述多核苷酸(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。具有增強纖維素分解的活性的多肽還可以包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另一種多肽融合到所述具有增強纖維素分解的活性的多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼另一種多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽的核苷酸序列(或其部分)來產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，并且使融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的控制下。關(guān)于具有增強纖維素分解的活性的多肽及其多核苷酸的詳細信息，參見WO2005/074647、WO2005/074656，和美國公開申請系列號2007/0077630，所述文獻通過提述并入本文。可以分離包含核苷酸序列(其編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽)的多核苷酸并用于實施本發(fā)明的方法，如本文所述。多核苷酸包含或組成為如下核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO=USEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11，或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，97%，98%或99%的同一性程度，其編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽。在優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:1。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為包含在大腸桿菌NRRLB-30699中的質(zhì)粒pEJG120所包含的序列。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO1的成熟多肽編碼區(qū)。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為包含在大腸桿菌NRRLB-30699中的質(zhì)粒pEJG120所包含的成熟多肽編碼區(qū)。本發(fā)明還包括編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含或組成為SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，所述氨基酸序列由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQIDNO:1。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:1的亞序列，其編碼SEQIDNO:2的具有增強纖維素分解的活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:3。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為包含在大腸桿菌NRRLB-30813中的質(zhì)粒pTter61C所包含的序列。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:3的成熟多肽編碼區(qū)。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為包含在大腸桿菌NRRLB-30813中的質(zhì)粒pTter61C所包含的成熟多肽編碼區(qū)。本發(fā)明還包括編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含或組成為SEQIDNO:4的氨基酸序列或其成熟多肽，所述氨基酸序列由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQIDNO:3。本發(fā)明還涉及SEQIDNO3的亞序列，其編碼SEQIDNO4的具有增強纖維素分解的活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:5。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為包含在大腸桿菌NRRLB-30812中的質(zhì)粒pTter61D所包含的序列。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:5的成熟多肽編碼區(qū)。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為包含在大腸桿菌NRRLB-30812中的質(zhì)粒PTterBlD所包含的成熟多肽編碼區(qū)。本發(fā)明還包括編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含或組成為SEQIDNO6的氨基酸序列或其成熟多肽，所述氨基酸序列由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQIDNO:5。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:5的亞序列，其編碼SEQIDNO:6的具有增強纖維素分解的活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:7。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為包含在大腸桿菌NRRLB-30814中的質(zhì)粒pTter61E所包含的序列。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:7的成熟多肽編碼區(qū)。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為包含在大腸桿菌NRRLB-30814中的質(zhì)粒PTterBlE所包含的成熟多肽編碼區(qū)。本發(fā)明還包括編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含或組成為SEQIDNO8的氨基酸序列或其成熟多肽，所述氨基酸序列由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQIDNO:7。本發(fā)明還涉及SEQIDNO7的亞序列，其編碼SEQIDNO8的具有增強纖維素分解的活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:9。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為包含在大腸桿菌NRRLB-30811中的質(zhì)粒pTter61G所包含的序列。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:9的成熟多肽編碼區(qū)。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為包含在大腸桿菌NRRLB-30811中的質(zhì)粒pTter61G所包含的成熟多肽編碼區(qū)。本發(fā)明還包括編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含或組成為SEQIDNO10的氨基酸序列或其成熟多肽，所述氨基酸序列由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQIDNO:9。本發(fā)明還涉及SEQIDNO9的亞序列，其編碼SEQIDNO10的具有增強纖維素分解的活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO=Il0在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為包含在大腸桿菌NRRLB-30704中的質(zhì)粒pDZA2_7所包含的序列。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:11的成熟多肽編碼區(qū)。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為包含在大腸桿菌NRRLB-30704中的質(zhì)粒PDZA2-7所包含的成熟多肽編碼區(qū)。本發(fā)明還包括編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含或組成為SEQIDNO12的氨基酸序列或其成熟多肽，所述氨基酸序列由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQIDNO=Il0本發(fā)明還涉及SEQIDNO:11的亞序列，其編碼SEQIDNO12的具有增強纖維素分解的活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:13。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為包含在大腸桿菌NRRLΒ-30878中的質(zhì)粒pTr3337所包含的序列。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:13的成熟多肽編碼區(qū)。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為包含在大腸桿菌NRRLB-30878中的質(zhì)粒pTr3337所包含的成熟多肽編碼區(qū)。本發(fā)明還包括編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含或組成為SEQIDNO14的氨基酸序列或其成熟多肽，所述氨基酸序列由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQIDNO:13ο本發(fā)明還涉及SEQIDNO13的亞序列，其編碼SEQIDNO14的具有增強纖維素分解的活性的片段。本發(fā)明還涉及在SEQIDNO=USEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDNO:7、SEQIDN0:9、SEQIDN0:11，或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變的突變多核苷酸，其中所述突變核苷酸序列編碼SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8，或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12，或SEQIDNO14的成熟多肽。在優(yōu)選的方面，所述成熟多肽是SEQIDNO2的氨基酸20至326，SEQIDNO4的氨基酸18至240，SEQIDNO6的氨基酸20至258，SEQIDNO8的氨基酸19至226，或SEQIDNO10的氨基酸20至304，SEQIDNO12的氨基酸23至250，或SEQIDNO14的氨基酸20至249。在另一優(yōu)選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO1的核苷酸388至1332、SEQIDNO3的核苷酸98至821、SEQIDNO:5的核苷酸126至978、SEQIDNO:7的核苷酸55至678、SEQIDNO:9的核苷酸58至912、SEQIDNO:11的核苷酸67至796，或SEQIDNO13的核苷酸77至766。如前所述，用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，并包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合。多肽還可以包含多核苷酸，所述多核苷酸包含或組成為核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽，所述多核苷酸在至少非常低嚴緊條件下，優(yōu)選至少低嚴緊條件，更優(yōu)選至少中等嚴緊條件，更優(yōu)選至少中_高嚴緊條件，甚至更優(yōu)選至少高嚴緊條件，并且最優(yōu)選至少非常高的嚴緊條件下，與以下雜交(i)SEQIDNOSEQIDN0:3、SEQIDNO5,SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDN0:11，或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列，()包含在SEQIDNO=USEQIDN0:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO11的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列或包含SEQIDNO:7、SEQIDNO:9或SEQIDN0:13的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈；或它們的等位變體和亞序列(Sambrook等，1989，見上文)，如本文所定義的。在優(yōu)選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO1的核苷酸388至1332，SEQIDNO3的核苷酸98至821，SEQIDNO5的核苷酸126至978，SEQIDNO7的核苷酸55至678，SEQIDNO9的核苷酸58至912，SEQIDNO:11的核苷酸67至796，或SEQIDNO:13的核苷酸77至766。β-葡糖苷酶及其多核苷酸用于處理含纖維素材料的具有葡糖苷酶活性的任何多肽可以是本發(fā)明的組合物的組件。編碼這種具有葡糖苷酶活性的多肽的多核苷酸可以用于產(chǎn)生所述組合物。在第一方面，具有葡糖苷酶活性的分離的多肽包含或組成為如下氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO16,SEQIDNO18,SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24,SEQIDΝ0:26，或SEQIDNO:28的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，97%，98%，或99%同一性程度，其具有葡糖苷酶活性(下文稱作“同源多肽”)。在優(yōu)選的方面，所述同源多肽包含或組成為如下氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO22,SEQIDNO24,SEQIDΝ0:26，或SEQIDNO:28的成熟多肽相差十個氨基酸，優(yōu)選相差五個氨基酸，更優(yōu)選相差四個氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個氨基酸，最優(yōu)選相差兩個33氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個氨基酸。具有β-葡糖苷酶活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO16的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有β-葡糖苷酶活性的片段。在優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO16的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:16的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:16的氨基酸20至861，或其等位變體；或它們的具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:16的氨基酸20至861。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:16的氨基酸序列或其等位變體組成；或由它們的具有葡糖苷酶活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO16的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:16的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:16的氨基酸20至861或其等位變體組成；或由它們的具有β-葡糖苷酶活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDΝ0:16的氨基酸20至861組成。具有β-葡糖苷酶活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO18的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有葡糖苷酶活性的片段。在優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO18的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:18的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:18的氨基酸20至861，或其等位變體；或它們的具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:18的氨基酸20至861。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:18的氨基酸序列或其等位變體組成；或由它們的具有葡糖苷酶活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDΝ018的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:18的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:18的氨基酸20至861或其等位變體組成；或由它們的具有β-葡糖苷酶活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDΝ0:18的氨基酸20至861組成。具有β-葡糖苷酶活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO20的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有葡糖苷酶活性的片段。在優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDΝ0:20的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDΝ0:20的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:20的氨基酸20至863，或其等位變體；或它們的具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:20的氨基酸20至863。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:20的氨基酸序列或其等位變體組成；或由它們的具有葡糖苷酶活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDΝ020的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO20的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:20的氨基酸20至863或其等位變體組成；或由它們的具有葡糖苷酶活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDΝ0:20的氨基酸20至863組成。具有β-葡糖苷酶活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO22的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有葡糖苷酶活性的片段。在優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDΝ0:22的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDΝ0:22的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:22的氨基酸37至878，或其等位變體；或它們的具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:22的氨基酸37至878。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO22的氨基酸序列或其等位變體組成；或由它們的其具有葡糖苷酶活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO22的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO22的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:22的氨基酸37至878或其等位變體組成；或由它們的具有葡糖苷酶活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDΝ0:22的氨基酸37至878組成。具有β-葡糖苷酶活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO24的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有葡糖苷酶活性的片段。在優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDΝ0:24的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDΝ0:24的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:24的氨基酸32至744，或其等位變體；或它們的具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:24的氨基酸32至744。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO24的氨基酸序列或其等位變體組成；或由它們的具有葡糖苷酶活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDΝ0:24的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:24的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:24的氨基酸32至744或其等位變體組成；或由它們的具有β-葡糖苷酶活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDΝ0:24的氨基酸32至744組成。具有β-葡糖苷酶活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO26的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有β-葡糖苷酶活性的片段。在優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDΝ0:26的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDΝ0:26的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:26的氨基酸20至860，或其等位變體；或它們的具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:26的氨基酸20至860。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:26的氨基酸序列或其等位變體組成；或由它們的具有葡糖苷酶活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDΝ0:26的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:26的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:26的氨基酸20至860或其等位變體組成；或由它們的具有β-葡糖苷酶活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDΝ0:26的氨基酸20至860組成。具有β-葡糖苷酶活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO28的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有葡糖苷酶活性的片段。在優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDΝ0:28的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDΝ0:28的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:28的氨基酸20至860，或其等位變體；或它們的具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:28的氨基酸20至860。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:28的氨基酸序列或其等位變體組成；或由它們的具有葡糖苷酶活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDΝ0:28的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:28的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:28的氨基酸20至860或其等位變體組成；或由它們的具有β-葡糖苷酶活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDΝ0:28的氨基酸20至860組成。35優(yōu)選地，SEQIDNO16的成熟多肽的片段包含至少720個氨基酸殘基，更優(yōu)選地至少760個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少800個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDN0:18的成熟多肽的片段包含至少720個氨基酸殘基，更優(yōu)選地至少760個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少800個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDNO:20的成熟多肽的片段包含至少770個氨基酸殘基，更優(yōu)選地至少800個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少830個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDNO22的成熟多肽的片段包含至少720個氨基酸殘基，更優(yōu)選地至少760個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少800個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDNO:24的成熟多肽的片段包含至少620個氨基酸殘基，更優(yōu)選地至少650個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少680個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDNO26的成熟多肽的片段包含至少720個氨基酸殘基，更優(yōu)選地至少760個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少800個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDNO:28的成熟多肽的片段包含至少720個氨基酸殘基，更優(yōu)選地至少760個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少800個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDNO15的成熟多肽編碼序列的亞序列包含至少2160個核苷酸，更優(yōu)選地至少2280個核苷酸，并且最優(yōu)選至少2400個核苷酸。優(yōu)選地，SEQIDN0:17的成熟多肽編碼序列的亞序列包含至少2160個核苷酸，更優(yōu)選地至少2280個核苷酸，并且最優(yōu)選至少2400個核苷酸。優(yōu)選地，SEQIDNO19的成熟多肽編碼序列的亞序列包含至少2310個核苷酸，更優(yōu)選地至少2400個核苷酸，并且最優(yōu)選至少2490個核苷酸。優(yōu)選地，SEQIDNO21的成熟多肽編碼序列的亞序列包含至少2160個核苷酸，更優(yōu)選地至少2280個核苷酸，并且最優(yōu)選至少2400個核苷酸。優(yōu)選地，SEQIDNO:23的成熟多肽編碼序列的亞序列包含至少I860個核苷酸，更優(yōu)選地至少1950個核苷酸，并且最優(yōu)選至少2040個核苷酸。優(yōu)選地，SEQIDNO:25的成熟多肽編碼序列的亞序列包含至少2160個核苷酸，更優(yōu)選地至少2280個核苷酸，并且最優(yōu)選至少2400個核苷酸。優(yōu)選地，SEQIDNO,21的成熟多肽編碼序列的亞序列包含至少2160個核苷酸，更優(yōu)選地至少2280個核苷酸，并且最優(yōu)選至少2400個核苷酸。在優(yōu)選的方面，具有葡糖苷酶活性的多肽由獲得自米曲霉葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼。在最優(yōu)選的實施方案中，具有葡糖苷酶活性的多肽由獲得自米曲霉β-葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼，所述基因包含SEQIDNO:15的成熟多肽編碼序列，其編碼SEQIDNO16的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，具有葡糖苷酶活性的多肽由獲得自米曲霉葡糖苷酶突變體基因的多核苷酸編碼。在最優(yōu)選的實施方案中，具有葡糖苷酶活性的多肽由獲得自米曲霉β-葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼，所述基因包含SEQIDΝ0:17的成熟多肽編碼序列，其編碼SEQIDNO18的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，具有葡糖苷酶活性的多肽由獲得自煙曲霉葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼。在最優(yōu)選的實施方案中，具有葡糖苷酶活性的多肽由獲得自煙曲霉β-葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼，所述基因包含SEQIDNO19的成熟多肽編碼序列，其編碼SEQIDNO20的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，具有葡糖苷酶活性的多肽由獲得自巴西青霉(Penicilliumbrasilianum)菌株IBT20888β-葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼。在最優(yōu)選的實施方案中，具有β“葡糖苷酶活性的多肽由獲得自巴西青霉菌株ΙΒΤ20888β-葡糖苷36酶基因的多核苷酸編碼，所述基因包含SEQIDNO:21的成熟多肽編碼序列，其編碼SEQIDNO22的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，具有β_葡糖苷酶活性的多肽由獲得里氏木霉菌株QM9414β_葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼。在最優(yōu)選的實施方案中，具有β_葡糖苷酶活性的多肽由獲得自里氏木霉菌株QM9414β-葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼，所述基因包含SEQIDNO23的成熟多肽編碼序列，其編碼SEQIDNO24的成熟多肽(GenBank登錄號U09580)。在另一優(yōu)選的方面，具有葡糖苷酶活性的多肽由獲得黑曲霉葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼。在最優(yōu)選的實施方案中，具有葡糖苷酶活性的多肽由獲得自黑曲霉β-葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼，所述基因包含SEQIDNO:25的成熟多肽編碼序列，其編碼SEQIDNO26的成熟多肽(GenBank登錄號AJ132386)。在另一優(yōu)選的方面，具有葡糖苷酶活性的多肽由獲得棘孢曲霉葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼。在最優(yōu)選的實施方案中，具有葡糖苷酶活性的多肽由獲得自棘孢曲霉葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼，所述基因包含SEQIDNO:27的成熟多肽編碼序列，其編碼SEQIDNO28的成熟多肽(GenBank登錄號D64088)。具有β-葡糖苷酶活性的米曲霉多肽可以根據(jù)WO2002/095014獲得。具有β-葡糖苷酶活性的米曲霉多肽變體可以根據(jù)WO2004/099228獲得。具有β-葡糖苷酶活性的煙曲霉多肽可以根據(jù)WO2005/047499獲得。具有β-葡糖苷酶活性的巴西青霉多肽可以根據(jù)TO2007/019442獲得。具有β-葡糖苷酶活性的里氏木霉菌株QM9414可以根據(jù)美國專利6，022，725獲得。具有β-葡糖苷酶活性的黑曲霉多肽可以根據(jù)Dan等，2000，J.Biol.Chem.275=4973-4980獲得。具有β-葡糖苷酶活性的棘孢曲霉多肽可以根據(jù)Kawaguchi等，1996，Genel73:287_288獲得。在優(yōu)選的方面，SEQIDNO16的成熟多肽由包含在大腸桿菌DSM14240的質(zhì)粒中所包含的多核苷酸編碼。在另一優(yōu)選的方面，SEQIDNO:20的成熟多肽由包含在大腸桿菌NRRLB-30695的質(zhì)粒pEJG113中所包含的多核苷酸編碼。在另一優(yōu)選的方面，SEQIDNO:22的成熟多肽由包含在大腸桿菌NRRLB-30860的質(zhì)粒pKKAB中所包含的多核苷酸編碼。在第二方面，具有葡糖苷酶活性的分離的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為以下核苷酸序列，所述核苷酸序列在至少非常低嚴緊條件下，優(yōu)選至少低嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中_高嚴緊條件下，甚至更優(yōu)選至少高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選至少非常高嚴緊條件下，與以下雜交(i)SEQIDN0:15、SEQIDN0:17、SEQIDN0:19、SEQIDN0:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27的成熟多肽編碼序列，(ii)包含在SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO27的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或包含SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDN0:25、SEQIDNO:27的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，(iii)(i)或(ii)的亞序列，或者(iv)(i)、(ii)或(iii)的全長互補鏈(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989見上文)。SEQIDNO15,SEQIDNO17,SEQIDNO19,SEQIDN0:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO25,SEQIDNO:27的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少100個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有葡糖苷酶活性的多肽片段。37SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO23,SEQIDNO25,SEQIDNO:27的核苷酸序列或其亞序列，以及SEQIDNO16、SEQIDNO18,SEQIDNO20,SEQIDN0:22，或SEQIDNO24、SEQIDN0:26，或SEQIDNO:28的氨基酸序列或其片段，可以用于設(shè)計核酸探針，以從不同屬和種的菌株鑒定和克隆編碼具有葡糖苷酶活性的多肽的DNA，如上所述。就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴緊條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應于SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDN0:21、SEQIDNO23,SEQIDNO25,SEQIDNO:27的成熟多肽編碼序列，包含在SEQIDN0:15、SEQIDN0:17、SEQIDN0:19、SEQIDN0:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO27的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或包含SEQIDNO15、SEQIDNO:17、SEQIDNO19,SEQIDN0:21、SEQIDNO23,SEQIDNO25,SEQIDN0:27的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，它的全長互補鏈或其亞序列。如上文所述。在優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO15的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:15的核苷酸58至2584。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:16的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDN0:15。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含于大腸桿菌DSM14240中的多核苷酸序列，其中它的多核苷酸序列編碼具有葡糖苷酶活性的多肽。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含于大腸桿菌DSM14240中的成熟多肽編碼區(qū)。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO17的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDΝ0:17的核苷酸58至2584。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:18的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:17。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO19的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:19的核苷酸73至1413。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:20的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:19。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在質(zhì)粒pEJG113中的多核苷酸序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30695中，其中它的多核苷酸序列編碼具有β-葡糖苷酶活性的多肽。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在質(zhì)粒PEJG113中的成熟多肽編碼區(qū)，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLΒ-30695中。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO21的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:21的核苷酸67至1377。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:22的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:21。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在質(zhì)粒ρΚΚΑΒ中的多核苷酸序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLΒ-30860中，其中它的多核苷酸序列編碼具有β-葡糖苷酶活性的多肽。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在包含在大腸桿菌NRRLΒ-30860中的成熟多肽編碼區(qū)。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO23的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:23的核苷酸88至2232。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:24的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:23。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO25的成熟多肽編碼序列。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:25的核苷酸59至2580。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:26的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:25ο在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO27的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:27的核苷酸59至2580。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:28的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:27。對于長度至少100個核苷酸的長探針，非常低至非常高的嚴緊條件如在本文所定義。對于長度為至少100個核苷酸的長探針，將載體材料進行最終洗滌，如在本文中定義。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，嚴緊條件如本文所定義。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，經(jīng)載體材料進行洗滌，如在本文中定義。在第三方面，具有葡糖苷酶活性的多肽由包含或組成為如下核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO2USEQIDNO23,SEQIDNO25、SEQIDNO:27的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，97%，98%，或99%的同一性程度，其編碼活性多肽。在第六方面，具有葡糖苷酶活性的多肽是人工變體，所述人工變體包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO20、SEQIDNO22,SEQIDNO24,SEQIDΝ0:26，或SEQIDNO:28的成熟多肽或其同源序列。制備這樣的人工變體的方法如上所述。SEQIDNO16,SEQIDNO18,SEQIDNO20,SEQIDNO22,SEQIDNO24,SEQIDΝ0:26，或SEQIDNO:28的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10，優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選至多6，更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選1ο在另一優(yōu)選的方面，具有β_葡糖苷酶活性的多肽由獲得自家族1β_葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼。在另一優(yōu)選的方面，具有β_葡糖苷酶活性的多肽由獲得自家族3β-葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼。在另一優(yōu)選的方面，具有β_葡糖苷酶活性的多肽由獲得自家族5β-葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼。可用作本發(fā)明的多核苷酸來源的其它葡糖苷酶的實例包括，但不限于，米曲霉β-葡糖苷酶(W002/095014；WO04/099228)；棘孢曲霉β-葡糖苷酶(Kawaguchi等，1996，Gene173:287_288)；燕麥狀曲霉(Aspergillusavenaceus)β-葡糖苷酶(GenBank登錄號AY943971)；煙曲霉β-葡糖苷酶(GenBank登錄號ΧΜ745234)；川地曲霉(Aspergilluskawachii)β-葡糖苷酶(GenBank登錄號AB003470)；黑曲霉β-葡糖苷酶(GenBankAJ132386)；灰梨孢菌(Magnaporthegrisea)β-葡糖苷酶(GenBank登錄號AY849670)；黃孢平革菌β-葡糖苷酶(GenBank登錄號ΑΒ253327)；埃默森踝節(jié)菌(Talaromycesemersonii)β-葡糖苷酶(GenBank登錄號ΑΥ072918)；和里氏木霉β-葡糖苷酶(GenBank登錄號U09580、AB003110、AY281374、AY281375、AY281377、AY281378，和AY281379)。β-葡糖苷酶的變體也可以用作多核苷酸的來源，如WO04/099228中所述的那些。使用根據(jù)HenrissatB·,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino—acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316,HenrissatB.禾口BairochA.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316695-696的分類，公開了超過13個糖基水解酶家族的其它葡糖苷酶。具有葡糖苷酶活性的多肽也可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，術(shù)語“獲得自，，如本文所定義。在優(yōu)選的方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。具有葡糖苷酶活性的多肽可以是細菌多肽。例如，多肽可以是革蘭氏陽性細菌的多肽，如具有葡糖苷酶活性的芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬，或海洋芽孢桿菌屬多肽，或者革蘭氏陰性細菌的多肽，如具有葡糖苷酶活性的大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬或脲原體屬多肽。在優(yōu)選的方面，多肽是具有β”葡糖苷酶活性的嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌，或蘇云金芽孢桿菌多肽。在另一優(yōu)選的方面，多肽是具有β”葡糖苷酶活性的似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌，或馬鏈球菌獸疫亞種多肽。在另一優(yōu)選的方面，多肽是具有葡糖苷酶活性的不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、灰色鏈霉菌，或淺青紫鏈霉菌多肽。具有葡糖苷酶活性的多肽還可以是具有葡糖苷酶活性的真菌多肽，并且更優(yōu)選是酵母多肽，如念珠菌屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬多肽；或更優(yōu)選是具有葡糖苷酶活性的絲狀真菌多肽，如枝頂孢霉屬、傘草屬、鏈格孢屬、曲霉屬、短梗霉屬、葡萄座腔菌屬(Botryospaeria)、擬蠟菌屬、毛殼菌屬(Chaetomidium)、金孢子菌屬、麥角屬、旋孢腔菌屬、鬼傘屬、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼菌、隱球菌屬、色二孢屬、黑耳屬(Exidia)、Filibasidium、鐮孢屬、赤霉屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬、腐質(zhì)霉屬、耙菌屬、香菇屬、小球腔菌屬(Leptospaeria)、梨孢菌屬、Melanocarpus、多孔菌屬(Meripilus)、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、瘤胃壺菌屬、Poitrasia、假黑盤菌屬、假披發(fā)蟲屬、根毛霉屬、裂褶菌屬、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節(jié)菌屬、嗜熱霉屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、木霉屬、Trichophaea、輪枝孢屬、小包腳菇屬(Volvariella)或炭角菌屬多肽。40在優(yōu)選的方面，多肽是具有β“葡糖苷酶活性的卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母多肽。在另一個優(yōu)選的方面，多肽是具有葡糖苷酶活性的解纖維枝頂孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角質(zhì)金孢子菌、ChrysosporiumIucknowense>熱帶金抱子菌、獎狀金抱子菌、Chrysosporiuminops、Chrysosporiumpannicola、昆士蘭金抱子菌、Chrysosporiumzonatum、桿抱狀鍵抱、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、灰腐質(zhì)霉、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、乳白耙菌、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、繩狀青霉、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌、無色梭孢殼、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭孢殼、Thielaviafimeti、微孢梭孢殼、卵孢梭孢殼、Thielaviaperuviana、Thielaviaspededonium、毛梭抱殼、Thielaviasubthermophila、土生梭抱霉、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉、綠色木霉或TrichophaeaSaccata0可理解的是對于前述的物種，本發(fā)明包含完全和不完全階段兩種，和其它分類學的等同物，例如無性型，無論它們已知的種名。本領(lǐng)域技術(shù)人員將輕易地識別適合的等同物的身份。這些物種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對于公眾能夠輕易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammiungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心，北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得這些多肽，如本文所述。具有葡糖苷酶活性的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中別的多肽融合在具有葡糖苷酶活性的多肽或其片段的N-末端或C-末端。如本文所述產(chǎn)生融合多肽?？梢苑蛛x包含核苷酸序列或由其組成的多肽并用于實施本發(fā)明的方法，如本文所述，其中所述核苷酸序列編碼具有β“葡糖苷酶活性的多肽。多核苷酸包含以下核苷酸序列，或者由以下核苷酸序列組成，所述核苷酸序列與SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDN0:21、SEQIDNO23,SEQIDNO:25、SEQIDNO27的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，97%，98%或99%的同一性程度，所述核苷酸序列編碼具有葡糖苷酶活性的多肽。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:15。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為大腸桿菌DSM14240中包含的核苷酸序列。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:15的成熟多肽編碼序列。在另一更優(yōu)選的方面，41核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:15的核苷酸58至2584。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為大腸桿菌DSM14240中包含的成熟多肽編碼區(qū)。本發(fā)明還包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼包含或組成為SEQIDNO:16的氨基酸序列的多肽或其成熟多肽，由于遺傳密碼的簡并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:15或者其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:15的亞序列，其編碼SEQIDN0:16的具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:17。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:17的成熟多肽編碼區(qū)。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:17的核苷酸58至2584。本發(fā)明還包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼包含或組成為SEQIDNO:18的氨基酸序列的多肽或其成熟多肽，由于遺傳密碼的簡并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:17或者其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:17的亞序列，其編碼SEQIDN0:18的具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:19。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為質(zhì)粒PEJG113中的核苷酸序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLΒ-30695中。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDΝ0:19的成熟多肽編碼區(qū)。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:19的核苷酸58至2580。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為質(zhì)粒PEJG113中的成熟多肽編碼區(qū)，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLΒ-30695中。本發(fā)明還包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼包含或組成為SEQIDNO:20的氨基酸序列的多肽或其成熟多肽，由于遺傳密碼的簡并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:19或者其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明還涉及SEQIDNO19的亞序列，其編碼SEQIDNO20的具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:21。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為質(zhì)粒PKKAB中的核苷酸序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLΒ-30860中。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:21的成熟多肽編碼區(qū)。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:21的核苷酸109至2751。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為質(zhì)粒PKKAB中的成熟多肽編碼區(qū)，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLΒ-30860中。本發(fā)明還包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼包含或組成為SEQIDNO:22的氨基酸序列的多肽或其成熟多肽，由于遺傳密碼的簡并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:21或者其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明還涉及SEQIDΝ021的亞序列，其編碼SEQIDNO22的具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:23。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:23的成熟多肽編碼區(qū)。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:23的核苷酸88至2232。本發(fā)明還包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼包含或組成為SEQIDNO:24的氨基酸序列的多肽或其成熟多肽，由于遺傳密碼的簡并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:23或者其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明還涉及SEQIDNO23的亞序列，其編碼SEQIDNO24的具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:25。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:25的成熟多肽編碼區(qū)。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:25的核苷酸88至2232。本發(fā)明還包含如下核苷酸序列，所42述核苷酸序列編碼包含或組成為SEQIDNO:26的氨基酸序列的多肽或其成熟多肽，由于遺傳密碼的簡并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:25或者其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明還涉及SEQIDNO25的亞序列，其編碼SEQIDNO26的具有β-葡糖苷酶活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:27。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:27的成熟多肽編碼區(qū)。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:27的核苷酸88至2232。本發(fā)明還包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼包含或組成為SEQIDNO:28的氨基酸序列的多肽或其成熟多肽，由于遺傳密碼的簡并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:27或者其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明還涉及SEQIDNO27的亞序列，其編碼SEQIDNO28的具有β-葡糖苷酶活性的片段。本發(fā)明還涉及在SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO23,SEQIDNO25,SEQIDNO:27的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變的突變多核苷酸，其中所述突變核苷酸序列編碼SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO20、SEQIDN0:22、SEQIDNO24,SEQIDN0:26，或SEQIDNO:28的成熟多肽。如早前所述，用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合。多核苷酸還可為包含或組成為如下核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列編碼具有β_葡糖苷酶活性的多肽，其在至少非常低嚴緊條件下，優(yōu)選至少低嚴緊條件，更優(yōu)選至少中等嚴緊條件，更優(yōu)選至少中_高嚴緊條件，甚至更優(yōu)選至少高嚴緊條件，并且最優(yōu)選至少非常高的嚴緊條件下，與以下雜交(i)SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDN0:21、SEQIDNO23,SEQIDNO25,SEQIDNO:27的成熟多肽編碼序列，(ii)包含在SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO27的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列或包含SEQIDNO:15、SEQIDN0:17、SEQIDN0:19、SEQIDN0:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈；或它們的等位變體和亞序列(Sambrook等，1989，見上文)，如本文所定義的。在上述每一個優(yōu)選的方面，所述成熟多肽是SEQIDNO:16的氨基酸20至861，SEQIDNO18的氨基酸20至861，SEQIDNO22的氨基酸20至863，SEQIDNO22的氨基酸37至878，SEQIDNO24的氨基酸32至744，SEQIDNO26的氨基酸20至860，或SEQIDNO28的氨基酸20至860，并且所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO15的核苷酸58至2584，SEQIDNO17的核苷酸58至2584，SEQIDNO19的核苷酸58至2580，SEQIDNO21的核苷酸109至2751，SEQIDNO23的核苷酸88至2232，SEQIDNO25的核苷酸59至2580，或SEQIDNO27的核苷酸59至2580。β-葡糖苷酶融合多肽及其多核苷酸β-葡糖苷酶還可以是β-葡糖苷酶融合蛋白的形式。通過將編碼具有β-葡糖苷酶活性的多肽的核苷酸序列(或其部分)與編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列(或其部分)，以及編碼信號肽的核苷酸融合而產(chǎn)生葡糖苷酶融合多肽，其中所述編碼信號肽的核苷酸與編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列(或其部分)可操作連接。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且包括，例如，連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，并且使融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的控制下。還可以使用內(nèi)蛋白技術(shù)構(gòu)建融合蛋白，其中在翻譯后產(chǎn)生融合蛋白(Cooper等，1993，EMBOJ.122575-2583；Dawson等，1994，Science266:776_779)。與至少不存在內(nèi)切葡聚糖酶的催化域的情況相比，具有葡糖苷酶活性的融合蛋白增加了融合蛋白的分泌，其中所述融合蛋白至少包含與信號肽以符合讀框的方式連接的內(nèi)切葡聚糖酶的催化域。與至少不存在內(nèi)切葡聚糖酶的催化域的情況相比，具有葡糖苷酶活性的融合蛋白的分泌增加至少25%，優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少100%，甚至更優(yōu)選至少150%，甚至更優(yōu)選至少200%，最優(yōu)選至少500%，并且甚至最優(yōu)選至少1000%。在如下每個優(yōu)選方面中，β-葡糖苷酶融合蛋白構(gòu)建體的組件由5’末端可操作地連接至構(gòu)建體的3’末端。在優(yōu)選的方面，葡糖苷酶融合蛋白構(gòu)建體包含以下多核苷酸包含編碼信號肽的序列的多核苷酸，包含編碼內(nèi)切葡聚糖酶的催化域的序列的多核苷酸；和包含編碼β“葡糖苷酶的催化域的序列的多核苷酸。在另一優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶融合蛋白構(gòu)建體包含以下多核苷酸包含編碼信號肽的序列的多核苷酸，包含編碼內(nèi)切葡聚糖酶的成熟多肽的序列的多核苷酸；和包含編碼葡糖苷酶的催化域的序列的多核苷酸。在另一優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶融合蛋白構(gòu)建體包含以下多核苷酸包含編碼信號肽的序列的多核苷酸，包含編碼內(nèi)切葡聚糖酶的催化域的序列的多核苷酸；和包含編碼葡糖苷酶的成熟多肽的序列的多核苷酸。在另一優(yōu)選的方面，葡糖苷酶融合蛋白構(gòu)建體包含以下多核苷酸包含編碼信號肽的序列的多核苷酸，包含編碼內(nèi)切葡聚糖酶的成熟多肽的序列的多核苷酸；和包含編碼葡糖苷酶的成熟多肽的序列的多核苷酸。在另一優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶融合蛋白構(gòu)建體包含以下多核苷酸包含編碼信號肽的序列的多核苷酸，包含編碼內(nèi)切葡聚糖酶的催化域的序列的多核苷酸；和包含編碼葡糖苷酶的全長多肽的序列的多核苷酸。在另一優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶融合蛋白構(gòu)建體包含以下多核苷酸包含編碼信號肽的序列的多核苷酸，包含編碼內(nèi)切葡聚糖酶的成熟多肽的序列的多核苷酸；和包含編碼葡糖苷酶的全長多肽的序列的多核苷酸。在另一優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶融合蛋白構(gòu)建體包含以下多核苷酸包含編碼內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽(信號肽和成熟多肽)的序列的多核苷酸；和包含編碼葡糖苷酶的全長多肽的序列的多核苷酸。在另一優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶融合蛋白構(gòu)建體包含以下多核苷酸包含編碼信號肽的序列的多核苷酸，包含編碼內(nèi)切葡聚糖酶的催化域的序列的多核苷酸，和任選的接頭和/或纖維素結(jié)合域；和包含編碼β“葡糖苷酶的催化域的序列的多核苷酸。在另一優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶融合蛋白構(gòu)建體包含以下多核苷酸包含編碼信號肽的序列的多核苷酸，包含編碼內(nèi)切葡聚糖酶的成熟多肽的序列的多核苷酸，和任選的接頭和/或纖維素結(jié)合域；和包含編碼β“葡糖苷酶的催化域的序列的多核苷酸。在另一優(yōu)選的方面，葡糖苷酶融合蛋白構(gòu)建體包含以下多核苷酸包含編碼信號肽的序列的多核苷酸，包含編碼內(nèi)切葡聚糖酶的催化域的序列的多核苷酸，和任選的接頭和/或纖維素結(jié)合域；和包含編碼β“葡糖苷酶的成熟多肽的序列的多核苷酸。在另一優(yōu)選的方面，葡糖苷酶融合蛋白構(gòu)建體包含以下多核苷酸包含編碼信號肽的序列的多核苷酸，包含編碼內(nèi)切葡聚糖酶的成熟多肽的序列的多核苷酸，和任選的接頭和/或纖維素結(jié)合域；和包含編碼β“葡糖苷酶的成熟多肽的序列的多核苷酸。在另一優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶融合蛋白構(gòu)建體包含以下多核苷酸包含編碼信號肽的序列的多核苷酸，包含編碼內(nèi)切葡聚糖酶的催化域的序列的多核苷酸，和任選的接頭和/或纖維素結(jié)合域；和包含編碼β“葡糖苷酶的全長多肽的序列的多核苷酸。在另一優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶融合蛋白構(gòu)建體包含以下多核苷酸包含編碼信號肽的序列的多核苷酸，包含編碼內(nèi)切葡聚糖酶的成熟多肽的序列的多核苷酸，和任選的接頭和/或纖維素結(jié)合域；和包含編碼β“葡糖苷酶的全長多肽的序列的多核苷酸。在另一優(yōu)選的方面，葡糖苷酶融合蛋白構(gòu)建體包含以下多核苷酸包含編碼信號肽的序列的多核苷酸；包含編碼內(nèi)切葡聚糖酶的催化域的序列的多核苷酸；包含編碼另一個信號肽的序列的多核苷酸；和包含編碼葡糖苷酶的催化域的序列的多核苷酸。在另一優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶融合蛋白構(gòu)建體包含以下多核苷酸包含編碼信號肽的序列的多核苷酸；包含編碼內(nèi)切葡聚糖酶的成熟多肽的序列的多核苷酸；包含編碼另一個信號肽的序列的多核苷酸；和包含編碼葡糖苷酶的催化域的序列的多核苷酸。在另一優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶融合蛋白構(gòu)建體包含以下多核苷酸包含編碼信號肽的序列的多核苷酸；包含編碼內(nèi)切葡聚糖酶的催化域的序列的多核苷酸；包含編碼另一個信號肽的序列的多核苷酸；和包含編碼葡糖苷酶的成熟多肽的序列的多核苷酸。在另一優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶融合蛋白構(gòu)建體包含以下多核苷酸包含編碼信號肽的序列的多核苷酸；包含編碼內(nèi)切葡聚糖酶的成熟多肽的序列的多核苷酸；包含編碼另一個信號肽的序列的多核苷酸；和包含編碼β“葡糖苷酶的成熟多肽的序列的多核苷酸。在另一優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶融合蛋白構(gòu)建體包含以下多核苷酸包含編碼信號肽的序列的多核苷酸；包含編碼內(nèi)切葡聚糖酶的催化域的序列的多核苷酸；，和任選的接頭和/或纖維素結(jié)合域；包含編碼另一個信號肽的序列的多核苷酸；和包含編碼β“葡糖苷酶的催化域的序列的多核苷酸。在另一優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶融合蛋白構(gòu)建體包含以下多核苷酸包含編碼信號肽的序列的多核苷酸；包含編碼內(nèi)切葡聚糖酶的成熟多肽的序列的多核苷酸；，和任選的接頭和/或纖維素結(jié)合域；包含編碼另一個信號肽的序列的多核苷酸；和包含編碼β“葡糖苷酶的催化域的序列的多核苷酸。在另一優(yōu)選的方面，葡糖苷酶融合蛋白構(gòu)建體包含以下多核苷酸包含編碼信號肽的序列的多核苷酸；包含編碼內(nèi)切葡聚糖酶的催化域的序列的多核苷酸；，和任選的接頭和/或纖維素結(jié)合域；包含編碼另一個信號肽的序列的多核苷酸；和包含編碼β“葡糖苷酶的成熟多肽的序列的多核苷酸。在另一優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶融合蛋白構(gòu)建體包含以下多核苷酸包含編碼信號肽的序列的多核苷酸；包含編碼內(nèi)切葡聚糖酶的成熟多肽的序列的多核苷酸；，和任選的接頭和/或纖維素結(jié)合域；包含編碼另一個信號肽的序列的多核苷酸；和包含編碼多核苷酸。在上述每個優(yōu)選的方面中，β-葡糖苷酶融合蛋白構(gòu)建體的組件還包含啟動子區(qū)域。編碼催化域、成熟多肽或全長多肽的具有β-葡糖苷酶活性或內(nèi)切葡聚糖酶活性的多核苷酸可以獲得自任何生物體。就本發(fā)明而言，術(shù)語“多肽”應理解為包括全長多肽、成熟多肽或催化域，或其具有葡糖苷酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的部分。術(shù)語“獲得自”如本文所定義的使用。很多內(nèi)切葡聚糖酶具有多域結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)由通過接頭肽與纖維素結(jié)合域(CBD)分隔開的催化域組成(Suurnakki等，2000，Cellulose7189-209)。催化域包含活性位點，而CBD通過將酶與其結(jié)合而與纖維素反應(vanTilbeurgh等，1986，F(xiàn)EBSLetters204223-227；Tomme等，1988,EuropeanJournalofBiochemistry170:575_581)。編碼具有β-葡糖苷酶活性的多肽的多核苷酸如前所述。編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的多核苷酸可以獲得自編碼細菌多肽的基因。例如，多肽可以是革蘭氏陽性細菌的多肽，包括但不限于芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬，或海洋芽孢桿菌屬多肽，例如，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌，和馬鏈球菌獸疫亞種，淺青紫鏈霉菌，或鼠灰鏈霉菌多肽；或者革蘭氏陰性細菌的多肽，包括但不限于大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬或脲原體屬多肽?？捎米鞅景l(fā)明的方法中的多核苷酸來源的細菌內(nèi)切葡聚糖酶的實例包括，但不限于，解纖維熱酸菌(Acidothermuscellulolyticus)內(nèi)切葡聚糖酶(W091/05039；WO93/15186；美國專利5，275，944；WO96/02551；美國專利5，536，655；WO00/70031,WO05/093050)；Thermobifidafusca內(nèi)切葡聚糖酶III(W005/093050)JPThermobifidafusca內(nèi)切葡聚糖酶V(WC)05/093050)。編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的多核苷酸還可以獲得自編碼真菌多肽的基因，并且更優(yōu)選是酵母多肽，如念珠菌屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬多肽；或者更優(yōu)選是絲狀真菌多肽，如枝頂孢霉屬、傘草屬、鏈格孢屬、曲霉屬、短梗霉屬、葡萄座腔菌屬、擬蠟菌屬、毛殼菌屬、金孢子菌屬、麥角屬、旋孢腔菌屬、鬼傘屬、Coptotermes、棒囊殼屬、隱叢赤殼菌屬、隱球菌屬、色二孢屬、黑耳屬、Filibasidium、鐮孢屬、赤霉屬、全鞭毛蟲屬、腐質(zhì)霉、耙菌屬、香菇屬、小球腔菌屬、梨孢菌屬、Melanocarpus、多孔菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、瘤胃壺菌屬、Poitrasia、假黑盤菌屬、假披發(fā)蟲屬、根毛霉屬、裂褶菌屬、柱頂孢屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱霉屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、木霉屬、Trichophaea、輪枝孢屬、小包腳菇屬或炭角菌屬多月太。在優(yōu)選的方面，編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的多核苷酸可以獲得自編碼下述多肽的基因卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母多肽。46在另一個優(yōu)選的方面，編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的多核苷酸可以獲得自編碼下述多肽的基因解纖維枝頂孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角質(zhì)金孢子菌、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金孢子菌、獎狀金包子菌、Chrysosporiuminops>Chrysosporiumparmicola、昆士蘭金包子菌、Chrysosporiumzonatum、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、灰腐質(zhì)霉、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、乳白耙菌、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、繩狀青霉、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌、無色梭抱殼、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱殼、Thielaviafimeti、微抱梭抱殼、卵抱梭抱殼、Thielaviaperuviana、Thielaviaspededonium、毛梭抱殼、Thielaviasubthermophila、土生梭孢霉、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉、綠色木Trichophaeasaccata能用作本發(fā)明的方法中多核苷酸的來源的真菌內(nèi)切葡聚糖酶的實例包括，但不限于，里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(Penttila等，1986，Gene45:253_263;GenBank登錄號M15665)；里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(Saloheimo等，1988，Gene63:11_22;GenBank登錄號M19373)；里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(Okada等，1988，Appl.Environ.Microbiol.64555-563；GenBank登錄號AB003694)；里氏木霉內(nèi)切葡聚糖IV(Saloheimo等，1997，Eur.J.Biochem.249:584_591；GenBank登錄號Yl1113)；和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(Saloheimo等，1"4，MolecularMicrobiologyI3:219-228;GenBank登錄號Z3338D；棘孢曲霉內(nèi)切葡聚糖酶(Ooi等，1990，NucleicAcidsResearch18:5884)；川地曲霉內(nèi)切葡聚糖酶(Sakamoto等，1995，CurrentGenetics27:435-439)；金孢子菌屬菌種Cl(美國專利6，573，086；GenPept登錄號AAQ38150)；Corynascusheterothallicus(美國專利6，855，531;GenP印t登錄號AAY00844)；胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovara)內(nèi)切葡聚糖酶(Saarilahti等，1990，Gene90:9_14)；尖鐮孢內(nèi)切葡聚糖酶(GenBank登錄號L29381)；灰腐質(zhì)霉高溫變種(Humicolagriseavar.thermoidea)內(nèi)切葡聚糖酶(GenBank登錄號AB003107)；Melanocarpusalbomyces內(nèi)切葡聚糖酶(GenBank登錄號MAL515703)；粗糙脈孢菌內(nèi)切葡聚糖酶(GenBank登錄號XM324477)；馬瘤胃壺M(Piromycesequi)(Eberhardt^,2000,Microbiology1461999-2008；GenPeptg錄號CAB92325)；米根霉(Rhizopusoryzae)(Moriya等，2003，J.Bacteriology1851749-1756；GenBank登錄號AB047927，AB056667和AB056668)；和土生梭孢霉(WO2004/053039；EMBL登錄號CQ827970)。使用根據(jù)HenrissatB·,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino—acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316,HenrissatB.禾口BairochA.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316695-696的分類，在超過13個糖基水解酶家族中公開了其它內(nèi)切葡聚糖酶。用于分離或克隆編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，并且包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合?？赏ㄟ^例如使用熟知的聚合酶鏈式反應(PCR)或表達文庫的抗體篩選以檢測具有共有結(jié)構(gòu)特性的克隆DNA片段，從而實現(xiàn)從這種基因組DNA中克隆多核苷酸。參見，例如，Innis等，1990，PCRProtocols=AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。胃^Uiffi胃方法，如連接酶鏈式反應(LCR)，連接活化轉(zhuǎn)錄(LAT)和基于核苷酸序列的擴增(NASBA)?？衫斫獾氖菍τ谇笆龅奈锓N，本發(fā)明包含完全和不完全階段兩種，和其它分類學的等同物，例如無性型，而無論它們已知的種名。本領(lǐng)域技術(shù)人員將輕易地識別適合的等同物的身份。這些物種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對于公眾能夠輕易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammiungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心，北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。在優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自內(nèi)切葡聚糖酶I基因的多核苷酸編碼。在另一個優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自內(nèi)切葡聚糖酶II基因的多核苷酸編碼。在另一個優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自內(nèi)切葡聚糖酶III基因的多核苷酸編碼。在另一個優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自內(nèi)切葡聚糖酶IV基因的多核苷酸編碼。在另一個優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自內(nèi)切葡聚糖酶V基因的多核苷酸編碼。在更優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V基因的多核苷酸編碼。在最優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V基因的多核苷酸編碼，所述基因包含編碼SEQIDNO:30的多肽的SEQIDNO:29。在另一個優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自內(nèi)切葡聚糖酶VI基因的多核苷酸編碼。在另一個優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自家族5內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼。在更優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自嗜熱毀絲霉CBS117.65內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼。在最優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自嗜熱毀絲霉CBS117.65內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼，所述基因包含編碼SEQIDNO:32的多肽的SEQIDN0:31。在另一個更優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自擔子菌CBS495.95內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼。在另一個最優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自擔子菌CBS495.95內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼，所述基因包含編碼SEQIDNO34的多肽的SEQIDNO:33。在另一個更優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自擔子菌CBS494.95內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼。在另一個最優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟48多肽，或催化域由獲得自擔子菌CBS494.95內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼，所述基因包含編碼SEQIDNO36的多肽的SEQIDNO:35。在另一個優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自家族6內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼。在更優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自土生梭孢霉NRRL8126CEL6B內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼。在最優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自土生梭孢霉NRRL8126CEL6B內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼，所述基因包含編碼SEQIDNO:38的多肽的SEQIDN0:37。在另一個更優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自土生梭孢霉NRRL8126CEL6C內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼。在另一個最優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自土生梭孢霉NRRL8126CEL6C內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼，所述基因包含編碼SEQIDNO:40的多肽的SEQIDNO:39。在另一個優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自家族7內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼。在更優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自土生梭孢霉NRRL8126CEL7C內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼。在最優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自土生梭孢霉NRRL8126CEL7C內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼，所述基因包含編碼SEQIDN0:42的多肽的SEQIDN0:41。在另一個更優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自土生梭孢霉NRRL8126CEL7E內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼。在另一個最優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自NRRL8126CEL7E內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼，所述基因包含編碼SEQIDNO:44的多肽的SEQIDN0:43。在另一個更優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自土生梭孢霉NRRL8126CEL7F內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼。在另一個最優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自NRRL8126CEL7F內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼，所述基因包含編碼SEQIDNO:46的多肽的SEQIDNO:45。在另一個更優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自CladorrhinumfoecundissimumATCC62373CEL7A內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼。在另一個最優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽,或催化域由獲得自CladorrhinumfoecundissimumATCC62373CEL7A內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼，所述基因包含編碼SEQIDNO48的多肽的SEQIDNO:47。在另一個最優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自里氏木霉菌株VTT-D-80133內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼，所述基因包含編碼SEQIDNO50的多肽的SEQIDNO49(GenBank登錄號Ml5665)。在另一個優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自家族9內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼。在另一個優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自家族12內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼。在另一個優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自家族45內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼。在更優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成49熟多肽，或催化域由獲得自家族45內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼。在最優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V基因的多核苷酸或其直向同源物和變體編碼，所述基因包含編碼SEQIDNO:30的多肽的SEQIDN0:29。其它優(yōu)選的家族45內(nèi)切葡聚糖酶及其多核苷酸獲得子金孢霉菌種Cl(美國專利6，573，086；GenPept登錄號AAQ38150)；Corynascusheterothallicus(美國專利6，855，531；GenP印t登錄號AAY00844)；馬瘤胃壺菌屬(Eberhardt等，2000，Microbiology1461999-2008；GenPept登錄號CAB92325)；和米根霉(Moriya等，2003，J.Bacteriology1851749-1756；GenBank登錄號AB047927、AB056667，和AB056668)。在另一個優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自家族74內(nèi)切葡聚糖酶基因的多核苷酸編碼。在優(yōu)選的方面，葡糖苷酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自家族1β“葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼。在另一個優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自家族3β-葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼。在另一個優(yōu)選的方面，葡糖苷酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自家族5β-葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼。在另一個優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自米曲霉葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼。在最優(yōu)選的實施方案中，葡糖苷酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自米曲霉葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼，所述基因包含編碼SEQIDΝ0:16的多肽的SEQIDNO15，或者獲得自米曲霉β-葡糖苷酶突變基因，所述基因包含編碼SEQIDNO18的多肽的SEQIDNO:17。在另一個優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自煙曲霉葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼。在最優(yōu)選的實施方案中，葡糖苷酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自煙曲霉葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼，所述基因包含編碼SEQIDNO20的多肽的SEQIDNO:19。在另一個優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自巴西青霉菌株IBT20888β-葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼。在最優(yōu)選的實施方案中，β-葡糖苷酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自巴西青霉菌株IBT20888β-葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼，所述基因包含編碼SEQIDNO:22的多肽的SEQIDΝ0:21。在另一個優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自里氏木霉菌株QM9414β-葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼。在最優(yōu)選的實施方案中，β-葡糖苷酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自里氏木霉菌株QM9414i3-葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼，所述基因包含編碼SEQIDNO:24的多肽的SEQIDNO23(GenBank登錄號U09580)。在另一個優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自黑曲霉葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼。在最優(yōu)選的實施方案中，葡糖苷酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自黑曲霉葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼，所述基因包含編碼SEQIDNO26的多肽的SEQIDNO:25。在另一個優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自棘孢曲霉葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼。在最優(yōu)選的實施方案中，葡糖苷酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自棘孢曲霉葡糖苷酶基因的多核苷酸編碼，所述基因包含編碼SEQIDNO28的多肽的SEQIDNO:27。在另一個優(yōu)選的方面，葡糖苷酶是天然分泌的。在另一個優(yōu)選的方面，葡糖苷酶不是天然分泌的。在另一個優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自編碼同源多肽的基因的多核苷酸編碼，其中所述同源多肽包含以下氨基酸序列或由其組成，所述氨基酸序列與SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48，或SEQIDNO:50的全長多肽、成熟多肽或催化域的氨基酸序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，97%，98%，或99%的同一性程度，其具有內(nèi)切葡聚糖酶活性。在優(yōu)選的方面，同源多肽具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO40,SEQIDNO42,SEQIDNO44,SEQIDNO46,SEQIDΝ0:48，或SEQIDNO50的全長多肽、成熟多肽或催化域相差十個氨基酸，優(yōu)選相差五個氨基酸，更優(yōu)選相差四個氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個氨基酸，最優(yōu)選相差兩個氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個氨基酸。在另一個優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由獲得自編碼同源多肽的基因的多核苷酸編碼，其中所述同源多肽包含或組成為以下氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO16,SEQIDNO18,SEQIDNO20,SEQIDNO22,SEQIDNO:24,SEQIDN0:26，或SEQIDNO:28的全長多肽、成熟多肽或催化域的氨基酸序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，97%，98%，或99%的同一性程度，其具有內(nèi)切葡聚糖酶活性。在優(yōu)選的方面，同源多肽包含或組成為以下氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO16,SEQIDNO18,SEQIDNO20、SEQIDN0:22、SEQIDNO24、SEQIDN0:26，或SEQIDNO:28的全長多肽、成熟多肽或催化域相差十個氨基酸，優(yōu)選相差五個氨基酸，更優(yōu)選相差四個氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個氨基酸，最優(yōu)選相差兩個氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個氨基酸。在另一個優(yōu)選的方面，內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由包含或組成為以下核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列在非常低嚴緊條件下，優(yōu)選低嚴緊條件下，更優(yōu)選中嚴緊條件下，更優(yōu)選中_高嚴緊條件下，甚至更優(yōu)選高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選非常高嚴緊條件下，與以下序列雜交(i)SEQIDNO29,SEQIDNO:31、SEQIDNO33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDN0:45、SEQIDN0:47，或SEQIDNO:49，(ii)包含在SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO45,SEQIDN0:47，或SEQIDNO:49中的cDNA序列，或包含SEQIDNO29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47，或SEQIDNO49的基因組DNA序列，(iii)51⑴或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全長互補鏈(JJ.Sambrook,E.F.Fritsch禾口T.Maniatis,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:29、SEQIDN0:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO37,SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDN0:47，或SEQIDNO49的亞序列含有至少100個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。在另一個優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域由包含或組成為以下核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列在非常低嚴緊條件下，優(yōu)選低嚴緊條件下，更優(yōu)選中嚴緊條件下，更優(yōu)選中_高嚴緊條件下，甚至更優(yōu)選高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選非常高嚴緊條件下，與以下雜交(i)SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25，或SEQIDNO:27，(ii)包含在SEQIDNO17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDN0:25，或SEQIDN0:27中的cDNA序列，或包含SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO23,SEQIDN0:25，或SEQIDNO:27的基因組DNA序列，(iii)(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全長互補鏈(JJ.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO15,SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDN0:25，或SEQIDNO27的亞序列含有至少100個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。SEQIDNO29,SEQIDNO:31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39,SEQIDN0:41、SEQIDNO43,SEQIDNO45,SEQIDN0:47，或SEQIDNO49的核苷酸序列，或其亞序列，以及SEQIDNO30,SEQIDNO32,SEQIDNO34,SEQIDN0:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDN0:48，或SEQIDNO:50的氨基酸序列，或其用于內(nèi)切葡聚糖酶的片段，和SEQIDNO:15、SEQIDN0:17、SEQIDNO19、SEQIDNO:21、SEQIDNO23、SEQIDN0:25，或SEQIDNO27的核苷酸序列，或其亞序列，以及SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO22,SEQIDNO24、SEQIDN0:26，或SEQIDNO:28的氨基酸序列，或其用于β-葡糖苷酶的片段，可用于設(shè)計核酸探針，以從不同屬和種的菌株鑒定和克隆編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶或β“葡糖苷酶活性的多肽的DNA，如上文所述。就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴緊條件下與對應于上述核苷酸序列之一的標記的核酸探針雜交，如上文所述。對于長度至少100個核苷酸的長探針，非常低至非常高的嚴緊條件如在本文所定義。對于長度為至少100個核苷酸的長探針，將載體材料進行最終洗滌，如在本文中定義。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，嚴緊條件如本文所定義。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將載體材料進行洗滌，如在本文中定義。在另一個優(yōu)選方面，也可以使用如“具有纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽及其多核苷酸”部分所述的內(nèi)切葡聚糖酶的全長多肽、成熟多肽，或催化域構(gòu)建β_葡糖苷酶融合蛋白。在優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶融合蛋白包含或組成為SEQIDΝ0:104。在另一優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶融合蛋白由包含或組成為SEQIDΝ0:103的多核苷酸編碼。在另一優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶融合蛋白包含或組成為SEQIDNO:106。在另一優(yōu)選的方面，β-葡糖苷酶融合蛋白由包含或組成為SEQIDNO105的多核苷酸編碼。如上所述，很多內(nèi)切葡聚糖酶具有通過接頭肽與纖維素結(jié)合域分隔開的催化域組成的多域結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的方法中，β_葡糖苷酶融合構(gòu)建體進一步包含接頭，所述接頭位于包含內(nèi)切葡聚糖酶催化域的序列3’，和包含葡糖苷酶催化域的序列5’。接頭可以獲得自與內(nèi)切葡聚糖酶催化域相同的基因，或者獲得自不同的內(nèi)切葡聚糖酶基因。另一方面，接頭可以是合成來源的。能用于本發(fā)明的方法中的接頭的實例包括，但不限于，獲得自下述酶的基因的接頭里氏木霉纖維二糖水解酶I(Srisodsuk等，1993，JournalofBiologicalChemistry26820765-20761)；紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)(以前為里氏木霉)Cel7A纖維二糖水解酶(Mulakala等，2005，Proteins60598-605)；特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V；和土生梭孢霉NRRL8126CEL7C內(nèi)切葡聚糖酶。在優(yōu)選的方面，接頭獲得自特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶基因。在另一優(yōu)選的方面，接頭獲得自里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因。在更優(yōu)選的方面，接頭獲得自特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V(eg5)基因。在另一個優(yōu)選的方面，接頭獲得自土生梭孢霉內(nèi)切葡聚糖酶基因。在另一更優(yōu)選的方面，接頭獲得自土生梭孢霉NRRL8126CEL7C內(nèi)切葡聚糖酶基因。在優(yōu)選的方面，接頭至少為5個氨基酸殘基。在更優(yōu)選的方面，接頭至少為15個氨基酸殘基。在最優(yōu)選的方面，接頭至少為25個氨基酸殘基。在優(yōu)選的方面，接頭在約5至60個氨基酸殘基之間。在更優(yōu)選的方面，接頭在約15至50個氨基酸殘基之間。在最優(yōu)選的方面，接頭在約25至45個氨基酸殘基之間。盡管已經(jīng)描述了很多類型的糖結(jié)合域，但是其中大部分通常稱作纖維素結(jié)合域(CBD)。典型的纖維素結(jié)合域出現(xiàn)在纖維素酶中。相似地，CBD的其它亞類可包括，例如，幾丁質(zhì)結(jié)合域(通常出現(xiàn)在幾丁質(zhì)酶中的CBD)、甘露聚糖結(jié)合域(通常出現(xiàn)在甘露聚糖酶中的CBD)和淀粉結(jié)合域。CBD作為大的多肽或蛋白質(zhì)的整合部分存在，其中所述大的多肽或蛋白質(zhì)由兩個或多個多肽氨基酸序列區(qū)組成，特別是在水解酶中，其通常包含催化域和糖結(jié)合域(CBD)，催化域包含用于底物水解的活性位點，而糖結(jié)合域用于結(jié)合所述的糖底物。這種酶包含多于一個催化域和一個、兩個或三個CBD，任選地還包含一個或多個(幾個)連接CBD與催化域的多肽氨基酸序列區(qū)，后一類型的區(qū)域通常稱作“接頭”。包含CBD的水解酶的實例為纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶和幾丁質(zhì)酶(參見P.TommeCellulose-BindingDomains-ClassificationandPropertiesinEnzymaticDegradationofInsolubleCarbohydrates,JohnN.Saddler禾口MichaelH.Penner(編)，ACSSymposiumSeries，No.618，1996)。大多數(shù)已知的CBD源自纖維素酶和木聚糖酶。CBD可以位于蛋白質(zhì)或多肽的N或C末端，或者內(nèi)部位置。多肽或蛋白質(zhì)的構(gòu)成CBD的區(qū)域通常由多于約30個并少于約250個氨基酸殘基組成。例如依照Tomme等，1996，上文中列出并歸類入家族I中的那些CBD，其由33-37個氨基酸殘基組成；列出并歸類入家53族IIa類中的那些CBD，其由95-108個氨基酸殘基組成；列出并歸類入家族VI類中的那些CBD，其由85-92個氨基酸殘基組成；和列出并歸類入家族VII類中的一個CBD(源自來自熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)的纖維素酶)，其由240個氨基酸殘基組成。因此，構(gòu)成CBD的氨基酸序列的分子量通常在約4kDa至約40kDa的范圍內(nèi)，并通常低于約35kDa。在本發(fā)明的方法中，可以使用任何CBD。CBD可以與內(nèi)切葡聚糖酶天然相關(guān)，或者可以對于內(nèi)切葡聚糖酶是異源的。在優(yōu)選的方面，CBD獲得自里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶(EG)基因。在更優(yōu)選的方面，CBD獲得自里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶EGI基因。在另一更優(yōu)選的方面，CBD獲得自里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶EGII基因。在另一更優(yōu)選的方面，CBD獲得自里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶EGV。在另一個優(yōu)選的方面，CBD獲得自里氏木霉纖維二糖水解酶(CBH)基因。在另一優(yōu)選的方面，CBD獲得自里氏木霉CBHI基因(Terri等，1987，Gene5142~52；Linder和Teeri,1996,Biochemistry9312251-12255)。在另一優(yōu)選的方面，CBD獲得自里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶CBHII基因。在另一個優(yōu)選的方面，CBD獲得自土生梭孢霉內(nèi)切葡聚糖酶基因。在另一更優(yōu)選的方面，CBD獲得自土生梭孢霉NRRL8126CEL7C內(nèi)切葡聚糖酶基因。β-葡糖苷酶融合構(gòu)建體可進一步包含切割位點。切割位點優(yōu)選位于至少包含內(nèi)切葡聚糖酶催化域的序列之后，并位于至少包含葡糖苷酶催化域的序列之前。通過β“葡糖苷酶融合蛋白的分泌，位點被切割以釋放來自融合蛋白的有β_葡糖苷酶活性的多肽。切割位點的實例包括，但不限于，編碼二肽Lys-Arg的Kex2位點(Martin等，2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3568-76；Svetina^,2000,J.Biotechnol.76245-251；Rasmussen-Wilson等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63:3488_3493；Ward等，1995，Biotechnology13:498_503；禾口Contreras等，1991，Biotechnology9:378_381)，在精氨酸殘基之后被因子Xa蛋白酶切割的IIe-(Glu或Asp)-Gly-Arg位點(Eaton等，1986，Biochem.25:505_512)；在賴氨酸之后被腸激酶切割的Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位點(Collins-Racie等，1995，Biotechnology13:982-987);被GenenaseI切害Ij的His-Tyr-Glu或His-Tyr-Asp位點(Carte等，1989,ProteinsStructure,FunctionandGenetics6:240-248)；在Arg之后被凝血酶切割的Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位點(Stevens,2003,DrugDiscoveryWorld4:35-48)；在Gln之后被TEV蛋白酶切割的Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位點(Stevens，2003,見上文)；和在Gln之后被遺傳工程化形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割的Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位點(Stevens,2003，見上文)。具有纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽及其多核苷酸在本發(fā)明中，具有纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽及它們的多核苷酸優(yōu)選選自下組里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)，里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)，和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)，及其直向同源物或變體，還選自下組里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(CEL5A)，里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(CEL12A)，和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(CEL45A)，及其直向同源物或變體。在第一方面，具有纖維二糖水解酶I活性的分離的多肽包含或組成為以下氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:52(里氏木霉纖維二糖水解酶I；CEL7A)的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，97%，98%，或99%同一性程度，其具有纖維二糖水解酶I活性(下文稱作“同源多肽”)。在優(yōu)選的方面，同源多肽包含或組成為以下氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:52的成熟多肽相差十個氨基酸，優(yōu)選相差五個氨基酸，更優(yōu)選相差四個氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個氨基酸，最優(yōu)選相差兩個氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個氨基酸。具有纖維二糖水解酶I活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO52的氨基酸序列或其等位變體；或其具有纖維二糖水解酶I活性的片段。在優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDN0:52的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:52的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO52的氨基酸18至514，或其等位變體；或其具有纖維二糖水解酶I活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:52的氨基酸18至514。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:52的氨基酸序列或其等位變體；或其具有纖維二糖水解酶I活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:52的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:52的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO52的氨基酸18至514或其等位變體；或其具有纖維二糖水解酶I活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO52的氨基酸18至514組成。在另一個第一方面，具有纖維二糖水解酶II活性的分離的多肽包含或組成為以下氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:54(里氏木霉纖維二糖水解酶II；CEL6A)的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，97%，98%，或99%同一性程度，其具有纖維二糖水解酶I活性(下文稱作“同源多肽”)。在優(yōu)選的方面，同源多肽包含或組成為氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO54的成熟多肽相差十個氨基酸，優(yōu)選相差五個氨基酸，更優(yōu)選相差四個氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個氨基酸，最優(yōu)選相差兩個氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個氨基酸。具有纖維二糖水解酶II活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO54的氨基酸序列或其等位變體；或其具有纖維二糖水解酶II活性的片段。在優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDN0:54的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:54的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:54的氨基酸25至471，或其等位變體；或其具有纖維二糖水解酶II活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:54的氨基酸25至471。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO54的氨基酸序列或其等位變體；或其具有纖維二糖水解酶II活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:54的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:54的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:54的氨基酸25至471或其等位變體；或其具有纖維二糖水解酶II活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO54的氨基酸25至471組成。在另一個第一方面，具有內(nèi)切葡聚糖酶I活性的分離的多肽包含或組成為以下氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:56(里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I;CEL7B)的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，97%，98%，或99%同一性程度，其具有內(nèi)切葡聚糖酶I活性(下文稱作“同源多肽”)。在優(yōu)選的方面，同源多肽包含或組成為以下氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO56的成熟多肽相差十個氨基酸，優(yōu)選相差五個氨基酸，更優(yōu)選相差四個氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個氨基酸，最優(yōu)選相差兩個氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個氨基酸。具有內(nèi)切葡聚糖酶I活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO56的氨基酸序列或其等位變體；或其具有內(nèi)切葡聚糖酶I活性的片段。在優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDN0:56的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDN0:56的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:56的氨基酸23至459，或其等位變體；或其具有內(nèi)切葡聚糖酶I活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:56的氨基酸23至459。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO56的氨基酸序列或其等位變體；或其具有內(nèi)切葡聚糖酶I活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:56的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO56的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO56的氨基酸23至459或其等位變體；或其具有內(nèi)切葡聚糖酶I活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO56的氨基酸23至459組成。在另一個第一方面，具有內(nèi)切葡聚糖酶II活性的分離的多肽包含或組成為以下氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:58(里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II；CEL5A)的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，97%，98%，或99%同一性程度，其具有內(nèi)切葡聚糖酶II活性(下文稱作“同源多肽”)。在優(yōu)選的方面，同源多肽包含或組成為以下氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO58的成熟多肽相差十個氨基酸，優(yōu)選相差五個氨基酸，更優(yōu)選相差四個氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個氨基酸，最優(yōu)選相差兩個氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個氨基酸。具有內(nèi)切葡聚糖酶II活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO58的氨基酸序列或其等位變體；或其具有內(nèi)切葡聚糖酶II活性的片段。在優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDN0:58的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDN0:58的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:58的氨基酸22至418，或其等位變體；或其具有內(nèi)切葡聚糖酶II活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:58的氨基酸22至418。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO58的氨基酸序列或其等位變體；或其具有內(nèi)切葡聚糖酶II活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:58的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:52的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO58的氨基酸22至418或其等位變體；或其具有內(nèi)切葡聚糖酶II活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO58的氨基酸22至418組成。在另一個第一方面，具有內(nèi)切葡聚糖酶III活性的分離的多肽包含或組成為以下氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:60(里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III;CEL12A)的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，97%，98%，或99%同一性程度，其具有內(nèi)切葡聚糖酶111活性(下文稱作“同源多肽”)。在優(yōu)選的方面，同源多肽包含或組成為以下氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO60的成熟多肽相差十個氨基酸，優(yōu)選相差五個氨基酸，更優(yōu)選相差四個氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個氨基酸，最優(yōu)選相差兩個氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個氨基酸。具有內(nèi)切葡聚糖酶III活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO60的氨基酸序列或其等位變體；或其具有內(nèi)切葡聚糖酶III活性的片段。在優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO60的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDN0:60的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:60的氨基酸17至234，或其等位變體；或其具有內(nèi)切葡聚糖酶III活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:60的氨基酸17至234。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:60的氨基酸序列或其等位變體；或其具有內(nèi)切葡聚糖酶III活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:60的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:60的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:60的氨基酸17至234或其等位變體；或其具有內(nèi)切葡聚糖酶III活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO60的氨基酸17至234組成。在另一個第一方面，具有內(nèi)切葡聚糖酶V活性的分離的多肽包含或組成為以下氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:62(內(nèi)切葡聚糖酶V;CEL45A)的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，97%，98%，或99%同一性程度，其具有內(nèi)切葡聚糖酶V活性(下文稱作“同源多肽”)。在優(yōu)選的方面，同源多肽包含或組成為以下氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:62的成熟多肽相差十個氨基酸，優(yōu)選相差五個氨基酸，更優(yōu)選相差四個氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個氨基酸，最優(yōu)選相差兩個氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個氨基酸。具有內(nèi)切葡聚糖酶V活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO62的氨基酸序列或其等位變體；或其具有內(nèi)切葡聚糖酶V活性的片段。在優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDN0:62的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDN0:62的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:62的氨基酸18至242，或其等位變體；或其具有內(nèi)切葡聚糖酶V活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:62的氨基酸18至242。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:62的氨基酸序列或其等位變體；或其具有內(nèi)切葡聚糖酶V活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:62的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO62的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO62的氨基酸18至242或其等位變體；或其具有內(nèi)切葡聚糖酶V活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO62的氨基酸18至242組成。在另一個第一方面，具有纖維二糖水解酶II活性的分離的多肽包含或組成為以下氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:64(土生梭孢霉纖維二糖水解酶II;CEL6A)的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，97%，98%，或99%同一性程度，其具有纖維二糖水解酶11活性(下文稱作“同源多肽”)。在優(yōu)選的方面，同源多肽包含或組成為以下氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:64的成熟多肽相差十個氨基酸，優(yōu)選相差五個氨基酸，更優(yōu)選相差四個氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個氨基酸，最優(yōu)選相差兩個氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個氨基酸。具有纖維二糖水解酶II活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO64的氨基酸序列或其等位變體；或其具有纖維二糖水解酶II活性的片段。在優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO6457的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:64的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:64的氨基酸18至481，或其等位變體；或其具有纖維二糖水解酶II活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:64的氨基酸18至481。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO64的氨基酸序列或其等位變體；或其具有纖維二糖水解酶II活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:64的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:64的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:64的氨基酸18至481或其等位變體；或其具有纖維二糖水解酶II活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO64的氨基酸18至481組成。優(yōu)選地，SEQIDNO52的成熟多肽的片段包含至少425個氨基酸殘基，更優(yōu)選地至少450個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少475個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDNO54的成熟多肽的片段包含至少390個氨基酸殘基，更優(yōu)選地至少410個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少430個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDNO:56的成熟多肽的片段包含至少370個氨基酸殘基，更優(yōu)選地至少390個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少410個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDNO58的成熟多肽的片段包含至少340個氨基酸殘基，更優(yōu)選地至少360個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少380個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDNO60的成熟多肽的片段包含至少190個氨基酸殘基，更優(yōu)選地至少200個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少210個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDNO62的成熟多肽的片段包含至少190個氨基酸殘基，更優(yōu)選地至少200個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少210個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDNO:64的成熟多肽的片段包含至少400個氨基酸殘基，更優(yōu)選地至少420個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少440個氨基酸殘基。優(yōu)選地，SEQIDNO51的成熟多肽編碼序列的亞序列包含至少1275個核苷酸，更優(yōu)選地至少1350個核苷酸，并且最優(yōu)選至少1425個核苷酸。優(yōu)選地，SEQIDNO53的成熟多肽編碼序列的亞序列包含至少1170個核苷酸，更優(yōu)選地至少1230個核苷酸，并且最優(yōu)選至少1290個核苷酸。優(yōu)選地，SEQIDNO55的成熟多肽編碼序列的亞序列包含至少1110個核苷酸，更優(yōu)選地至少1170個核苷酸，并且最優(yōu)選至少1230個核苷酸。優(yōu)選地，SEQIDNO57的成熟多肽編碼序列的亞序列包含至少1020個核苷酸，更優(yōu)選地至少1080個核苷酸，并且最優(yōu)選至少1140個核苷酸。優(yōu)選地，SEQIDNO:59的成熟多肽編碼序列的亞序列包含至少570個核苷酸，更優(yōu)選地至少600個核苷酸，并且最優(yōu)選至少630個核苷酸。優(yōu)選地，SEQIDNO:61的成熟多肽編碼序列的亞序列包含至少570個核苷酸，更優(yōu)選地至少600個核苷酸，并且最優(yōu)選至少630個核苷酸。優(yōu)選地，SEQIDNO:63的成熟多肽編碼序列的亞序列包含至少1200個核苷酸，更優(yōu)選地至少1260個核苷酸，并且最優(yōu)選至少1320個核苷酸。在第二方面，具有纖維二糖水解酶I活性的分離的多肽由包含或組成為以下核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列在至少非常低嚴緊條件下，優(yōu)選至少低嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中_高嚴緊條件下，甚至更優(yōu)選至少高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選至少非常高嚴緊條件下，與以下雜交(i)SEQIDNO:51的成熟多肽編碼序列，()包含在SEQIDNO51的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或包含SEQIDNO51的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，(iii)⑴或(ii)的亞序列，或(iv)⑴、(ii)或(iii)的全長互補鏈(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，見上文)。SEQID58NO51的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少100個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有纖維二糖水解酶I活性的多肽片段。在另一個第二方面，具有纖維二糖水解酶II活性的分離的多肽由包含或組成為以下核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列在至少非常低嚴緊條件下，優(yōu)選至少低嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中_高嚴緊條件下，甚至更優(yōu)選至少高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選至少非常高嚴緊條件下，與以下雜交(i)SEQIDN0:53的成熟多肽編碼序列，()包含在SEQIDNO53的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或包含SEQIDNO:53的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，(iii)⑴或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全長互補鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，見上文)。SEQIDNO:53的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少100個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有纖維二糖水解酶II活性的多肽片段。在另一個第二方面，具有內(nèi)切葡聚糖酶I活性的分離的多肽由包含或組成為以下核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列在至少非常低嚴緊條件下，優(yōu)選至少低嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，甚至更優(yōu)選至少高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選至少非常高嚴緊條件下，與以下雜交(i)SEQIDN0:55的成熟多肽編碼序列，()包含在SEQIDNO55的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或包含SEQIDNO55的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，(iii)⑴或(ii)的亞序列，或(iv)⑴、(ii)或(iii)的全長互補鏈(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，見上文)。SEQIDNO55的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少100個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有纖維二糖水解酶II活性的多肽片段。在另一個第二方面，具有內(nèi)切葡聚糖酶II活性的分離的多肽由包含或組成為以下核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列在至少非常低嚴緊條件下，優(yōu)選至少低嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中_高嚴緊條件下，甚至更優(yōu)選至少高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選至少非常高嚴緊條件下，與以下雜交(i)SEQIDN0:57的成熟多肽編碼序列，(ii)包含在SEQIDNO57的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或包含SEQIDNO:57的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，(iii)(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全長互補鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989，見上文)。SEQIDNO:57的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少100個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶II活性的多肽片段。在另一個第二方面，具有內(nèi)切葡聚糖酶III活性的分離的多肽由包含或組成為以下核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列在至少非常低嚴緊條件下，優(yōu)選至少低嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，甚至更優(yōu)選至少高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選至少非常高嚴緊條件下，與以下雜交(i)SEQIDN0:59的成熟多肽編碼序列，(ii)包含在SEQIDNO:59的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或包含SEQIDN0:59的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，(iii)⑴或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全長互補鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989，見上文)。SEQIDNO:59的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少100個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶III活性的多肽片段。在另一個第二方面，具有內(nèi)切葡聚糖酶V活性的分離的多肽由包含或組成為以下核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列在至少非常低嚴緊條件下，優(yōu)選至少低嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中_高嚴緊條件下，甚至更優(yōu)選至少高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選至少非常高嚴緊條件下，與以下雜交(i)SEQIDN0:61的成熟多肽編碼序列，()包含在SEQIDNO61的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或包含SEQIDNO61的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，(iii)⑴或(ii)的亞序列，或(iv)⑴、()或(iii)的全長互補鏈(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，見上文)。SEQIDNO61的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少100個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有內(nèi)切葡聚糖酶V活性的多肽片段。在另一個第二方面，具有纖維二糖水解酶II活性的分離的多肽由包含或組成為以下核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列在至少非常低嚴緊條件下，優(yōu)選至少低嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中_高嚴緊條件下，甚至更優(yōu)選至少高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選至少非常高嚴緊條件下，與以下雜交(i)SEQIDN0:63的成熟多肽編碼序列，()包含在SEQIDNO63的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或包含SEQIDNO:63的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，(iii)⑴或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全長互補鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989，見上文)。SEQIDNO:63的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少100個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有纖維二糖水解酶II活性的多肽片段。在優(yōu)選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO51的核苷酸52至1542、SEQIDNO53的核苷酸73至1413、SEQIDNO55的核苷酸67至1377、SEQIDNO57的核苷酸64至1254、SEQIDNO59的核苷酸49至702、SEQIDNO61的核苷酸52至726，或SEQIDNO63的核苷酸52至1443。SEQIDN0:51、SEQIDNO53,SEQIDNO55,SEQIDNO57,SEQIDNO59,SEQIDN0:61，或SEQIDNO:63的核苷酸序列或其亞序列，以及SEQIDNO52、SEQIDNO:54、SEQIDNO56,SEQIDN0:58，或SEQIDNO60、SEQIDN0:62，或SEQIDNO:64的氨基酸序列或其片段，可用于設(shè)計核酸探針，以從不同屬和種的菌株鑒定和克隆編碼具有纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽的DNA，如上所述。就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴緊條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應于SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO57,SEQIDNO59、SEQIDN0:61，或SEQIDNO:63的成熟多肽編碼序列，包含在SEQIDN0:51、SEQIDNO53,SEQIDNO55、SEQIDNO57,SEQIDNO59,SEQIDN0:61，或SEQIDNO63的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或包含SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61，或SEQIDNO63的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，它的全長互補鏈，或它們的亞序列，如上文所述。在優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO51的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:51的核苷酸52至1542。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:52的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:51ο在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO53的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:53的核苷酸73至1413。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:54的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:53。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO55的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:55的核苷酸67至1377。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:56的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:55。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO57的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:57的核苷酸64至1254。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:58的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:57。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO59的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:59的核苷酸49至702。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:60的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:59。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO61的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:61的核苷酸52至726。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:62的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:61ο在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO63的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:63的核苷酸52至1443。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:64的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:63。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是質(zhì)粒pTter6A中包含的多核苷酸序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30802中，其中它的多核苷酸序列編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是質(zhì)粒PTter6A中包含的成熟多肽編碼區(qū)，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30802中。對于長度至少100個核苷酸的長探針，非常低至非常高的嚴緊條件如本文所定義。對于長度為至少100個核苷酸的長探針，將載體材料進行最終洗滌，如在本文中定義。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，嚴緊條件如本文所定義。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將載體材料進行洗滌，如在本文中定義。在第三方面，具有纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的分離的多肽由包含或組成為以下核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO5USEQIDNO53、SEQIDN0:55、SEQIDN0:57，或SEQIDNO59，SEQIDN0:61，或SEQIDNO:63的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，97%，98%，或99%的同一性程度，其編碼活性多肽。在優(yōu)選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO51的核苷酸52至1542，SEQIDNO53的核苷酸73至1413，SEQIDNO55的核苷酸67至1377，SEQIDNO57的核苷酸64至1254，SEQIDNO59的核苷酸49至702，SEQIDNO61的核苷酸52至726，或SEQIDNO63的核苷酸52至1443。參見本文中的多核苷酸部分。在第六方面，具有纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的分離的多肽是人工變體，所述人工變體在SEQIDNO52,SEQIDNO54,SEQIDNO56,SEQIDNO58,SEQIDNO:60、SEQIDNO:62，或SEQIDNO64的成熟多肽或其同源序列中包含取代、缺失和/或插入一個或多個(或幾個)氨基酸。制備這樣的人工變體的方法如上文所述。SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDN0:62，或SEQIDNO:64的成熟多肽中氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10，優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選至多6，更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選1ο具有纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，如本文所定義的使用術(shù)語“獲得自”。在優(yōu)選的方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。具有纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽可以是細菌多肽。例如，多肽可以是具有纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的革蘭氏陽性細菌多肽，如芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬，或海洋芽孢桿菌屬多肽，或者具有纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的革蘭氏陰性細菌多肽，如大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬或脲原體屬多肽。在優(yōu)選的方面，多肽是具有纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌，或蘇云金芽孢桿菌多肽。在另一個優(yōu)選的方面，多肽是具有纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌，或馬鏈球菌獸疫亞種多肽。在另一個優(yōu)選的方面，多肽是具有纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、灰色鏈霉菌，或淺青紫鏈霉菌多肽。具有纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽還可以是具有纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的真菌多肽，并且更優(yōu)選是酵母多肽，如念珠菌屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬多肽；或者更優(yōu)選是具有纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的絲狀真菌多肽，如枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、隱球菌屬、Filibasidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、瘤胃壺菌屬、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱霉屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、木霉屬多肽。在優(yōu)選的方面，多肽是具有纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母多肽。在另一個優(yōu)選的方面，多肽是具有纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、Diplodiagossyppina、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、灰梨孢菌、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌、Pseudoplectanianigrella、桔橙嗜熱霉、土生梭孢霉、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉、綠色木霉或Trichophaeasaccata^SXo在更優(yōu)選的方面，多肽是具有纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的里氏木霉多肽。在另一最優(yōu)選的實施方案中，多肽是具有纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的里氏木霉RutC30(ATCC56765)多肽，例如，SEQIDNO:52或54的成熟多肽，或其具有纖維二糖水解酶活性的片段，和SEQIDN0:56、58、60或62的成熟多肽，或其具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的片段在另一更優(yōu)選的方面，多肽是具有纖維二糖水解酶活性的土生梭孢霉多肽。在另一最優(yōu)選的方面，多肽是具有纖維二糖水解酶II活性的土生梭孢霉(NRRL8126)多肽，例如，SEQIDNO:64的成熟多肽，或其具有纖維二糖水解酶活性的片段?？衫斫獾氖菍τ谇笆龅奈锓N，本發(fā)明包含完全和不完全階段兩種，和其它分類學的等同物，例如無性型，無論它們已知的種名。本領(lǐng)域技術(shù)人員將輕易地識別適合的等同物的身份。這些物種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對于公眾能夠輕易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammiungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心，北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得這些多肽，如本文所述。具有纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另一種多肽融合到具有纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽或其片段的N末端或C末端。如本文所述產(chǎn)生融合多肽。可以分離包含或組成為核苷酸序列(其編碼具有纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽)的多核苷酸并將其用于實施本發(fā)明的方法，如本文所述。多核苷酸包含或組成為以下核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61，或SEQIDNO63的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，97%，98%或99%的同一性程度，其編碼具有纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽。在優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:51。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:51的成熟多肽編碼區(qū)。本發(fā)明還包括編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含或組成為SEQIDNO:52的氨基酸序列或其成熟多肽，所述核苷酸序列由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQIDN0:51。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:51的亞序列，其編碼SEQIDNO52的具有纖維二糖水解酶I活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:53。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:53的成熟多肽編碼區(qū)。本發(fā)明還包括編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含或組成為SEQIDNO:54的氨基酸序列或其成熟多肽，所述核苷酸序列由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQIDN0:53。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:53的亞序列，其編碼SEQIDNO54的具有纖維二糖水解酶II活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:55。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:55的成熟多肽編碼區(qū)。本發(fā)明還包括編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含或組成為SEQIDNO:56的氨基酸序列或其成熟多肽，所述核苷酸序列由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQIDN0:55。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:55的亞序列，其編碼SEQIDNO56的具有內(nèi)切葡聚糖酶I活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:57。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:57的成熟多肽編碼區(qū)。本發(fā)明還包括編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含或組成為SEQIDNO:58的氨基酸序列或其成熟多肽，所述核苷酸序列由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQIDN0:57。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:57的亞序列，其編碼SEQIDNO58的具有內(nèi)切葡聚糖酶II活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:59。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:59的成熟多肽編碼區(qū)。本發(fā)明還包括編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含或組成為SEQIDNO:60的氨基酸序列或其成熟多肽，所述核苷酸序列由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQIDN0:59。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:59的亞序列，其編碼SEQIDNO60的具有內(nèi)切葡聚糖酶III活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:61。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:61的成熟多肽編碼區(qū)。本發(fā)明還包括編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含或組成為SEQIDNO:62的氨基酸序列或其成熟多肽，所述核苷酸序列由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQIDN0:61。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:61的亞序列，其編碼SEQIDNO62的具有內(nèi)切葡聚糖酶V活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDN0:63。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為質(zhì)粒pTter6A所包含的序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30802中。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:63的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為SEQIDNO:63的核苷酸52至1443。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含或組成為質(zhì)粒pTter6A所包含的成熟多肽編碼區(qū)，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30802中。本發(fā)明還包括編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含或組成為SEQIDNO:64的氨基酸序列或其成熟多肽，所述核苷酸序列由于遺傳密碼的簡并性而不同于SEQIDNO:63或其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:63的亞序列，其編碼SEQIDNO64的具有纖維二糖水解酶II活性的片段。本發(fā)明還涉及在SEQIDN0:51、SEQIDNO53、SEQIDNO55、SEQIDNO57、SEQIDNO59,SEQIDN0:61，或SEQIDNO:63的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變的突變多核苷酸，其中所述突變核苷酸序列編碼SEQIDNO52,SEQIDNO54,SEQIDNO:56、SEQIDN0:58，或SEQIDNO60、SEQIDN0:62，或SEQIDNO:64的成熟多肽。在優(yōu)選的方面，所述成熟多肽是SEQIDNO:52的氨基酸18至541，SEQIDNO:54的氨基酸25至471，SEQIDNO56的氨基酸23至459，SEQIDNO58的氨基酸22至418，SEQIDNO60的氨基酸17至234，SEQIDNO:62的氨基酸18至242，或SEQIDNO:64的氨基酸18至481。在另一優(yōu)選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:51的核苷酸52至1542、SEQIDNO53的核苷酸73至1413、SEQIDNO55的核苷酸67至1377、SEQIDNO57的核苷酸64至1254、SEQIDNO59的核苷酸49至702、SEQIDNO61的核苷酸52至726，或SEQIDNO63的核苷酸52至1443。如前所述，用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合。多肽還可以包含多核苷酸，所述多核苷酸包含或組成為以下核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽，所述多肽在至少非常低嚴緊條件下，優(yōu)選至少低嚴緊條件，更優(yōu)選至少中等嚴緊條件，更優(yōu)選至少中_高嚴緊條件，甚至更優(yōu)選至少高嚴緊條件，并且最優(yōu)選至少非常高的嚴緊條件下，與以下雜交(i)SEQIDN0:51、SEQIDNO53,SEQIDNO55,SEQIDNO57,SEQIDNO59,SEQIDN0:61，或SEQIDNO63的成熟多肽編碼序列，(ii)包含在SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61，或SEQIDNO63的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列或包含SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDN0:59、SEQIDN0:61，或SEQIDNO:63的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或()的全長互補鏈；或它們的等位變體和亞序列(Sambrook等，1989，見上文)，如本文所定義的。在優(yōu)選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDN0:51的核苷酸52至1542，SEQIDNO53的核苷酸73至1413，SEQIDNO55的核苷酸67至1377，SEQIDNO57的核苷酸64至1254，SEQIDNO59的核苷酸49至702，SEQIDNO61的核苷酸52至726，或SEQIDNO63的核苷酸52至1443。核酸構(gòu)建體分離的多核苷酸，其編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽、具有葡糖苷酶活性的多肽，β“葡糖苷酶融合多肽，具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽，具有纖維二糖水解酶活性的多肽，或具有其它纖維素分解酶活性的多肽，可以用許多方式操作所述分離的多核苷酸，從而通過構(gòu)建核酸構(gòu)建體來提供所述多肽的表達，所述核酸構(gòu)建體包含編碼多肽的分離的多核苷酸，其與一個或多個(幾個)調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導編碼序列的表達。依賴于表達載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對其進行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。調(diào)控序列可以是合適的啟動子序列，其是由宿主細胞識別用于表達編碼這種多肽的多核苷酸的核苷酸序列。啟動子序列含有介導所述多肽表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所選的宿主細胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，并且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于指導本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從編碼下述酶的基因獲得的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、鑲片鐮孢Daria(WC)00/56900)、鑲片鐮孢Quinn(WC)00/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(TO96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變、截短和雜合的啟動子。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，其是由宿主細胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地連接?？梢詫⒃谒x宿主細胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的終止子獲得自下述基因米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α_葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。調(diào)控序列還可以是合適的前導序列，其是對于宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何前導序列用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的前導序列從米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因獲得。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核苷酸序列的3，末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時，宿主細胞將其識別為將聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號?？梢詫⒃谒x宿主細胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本發(fā)明中使用。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列獲得自下述的基因米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。調(diào)控序列還可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的氨基末端相連的氨基酸序列，并且指導編碼的多肽進入細胞的分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5’端可固有地包含信號肽編碼區(qū)，其與編碼分泌多肽的編碼區(qū)片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中。可供選擇的是，編碼序列5’端可含有對于所述編碼序列是外源的信號肽編碼區(qū)。外源信號肽編碼區(qū)在編碼序列不天然地含有信號肽編碼區(qū)時可能是必需的?；蛘?，外源信號肽編碼區(qū)可以簡單地取代天然信號肽編碼區(qū)以增強多肽的分泌。然而，指導表達的多肽進入所選宿主細胞的分泌途徑(即，分泌至培養(yǎng)基中)的任何信號肽編碼區(qū)可在本發(fā)明中使用。對于絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼區(qū)是從如下的基因獲得的信號肽編碼區(qū)米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V和疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶。在優(yōu)選的方面，信號肽包含SEQIDNO2的氨基酸1至19，或由SEQIDNO2的氨基酸1至19組成。在另一個優(yōu)選的方面，信號肽編碼區(qū)包含SEQIDNO1的核苷酸330至387或由SEQIDNO1的核苷酸330至387組成。在另一優(yōu)選的方面，信號肽包含SEQIDNO4的氨基酸1至17或由SEQIDNO4的氨基酸1至17組成。在另一個優(yōu)選的方面，信號肽編碼區(qū)包含SEQIDNO:3的核苷酸47至97或由SEQIDNO3的核苷酸47至97組成。在另一優(yōu)選的方面，信號肽包含SEQIDNO6的氨基酸1至19或由SEQIDNO6的氨基酸1至19組成。在另一個優(yōu)選的方面，信號肽編碼區(qū)包含SEQIDN0:5的核苷酸69至125或由SEQIDNO5的核苷酸69至125組成。在另一優(yōu)選的方面，信號肽包含SEQIDNO8的氨基酸1至18或由SEQIDNO8的氨基酸1至18組成。在另一個優(yōu)選的方面，信號肽編碼區(qū)包含SEQIDNO7的核苷酸1至54或由SEQIDNO7的核苷酸1至54組成。在另一優(yōu)選的方面，信號肽包含SEQIDNO10的氨基酸1至19或由SEQIDNO:10的氨基酸1至19組成。在另一個優(yōu)選的方面，信號肽編碼區(qū)包含SEQIDNO:9的核苷酸1至57或由SEQIDNO9的核苷酸1至57組成。在另一優(yōu)選的方面，信號肽包含SEQIDNO12的氨基酸1至22或由SEQIDNO:12的氨基酸1至22組成。在另一個優(yōu)選的方面，信號肽編碼區(qū)包含SEQIDNO11的核苷酸1至66或由SEQIDNO11的核苷酸1至66組成。在另一優(yōu)選的方面，信號肽包含SEQIDNO14的氨基酸1至19或由SEQIDNO:14的氨基酸1至19組成。在另一個優(yōu)選的方面，信號肽編碼區(qū)包含SEQIDNO13的核苷酸20至76或由SEQIDNO13的核苷酸20至76組成。調(diào)控序列還可以是前肽編碼區(qū)，其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolyp印tide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))0前多肽通常是無活性的并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化為成熟活性多肽。前肽編碼區(qū)可以從釀酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)的基因獲得。當信號肽和前肽區(qū)二者均出現(xiàn)在多肽的氨基末端時，將前肽區(qū)置于緊接著(nextto)多肽氨基末端，并且將信號肽區(qū)置于緊接著前肽區(qū)的氨基末端。同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對于宿主細胞的生長來調(diào)節(jié)多肽的表達。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是引起基因表達響應化學或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKAa-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表達載體可以將本文描述的多種核酸和調(diào)控序列結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達載體，其包含編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽、具有β“葡糖苷酶活性的多肽、β“葡糖苷酶融合多肽、具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽、具有纖維二糖水解酶活性的多肽，或具有其它纖維素分解酶活性的多肽的多核苷酸，啟動子，和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。所述表達載體可以包括一個或多個(幾個)方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼所述多肽的核苷酸序列。可供選擇的是，可以通過將所述核苷酸序列或包含該序列的核酸構(gòu)建體插入用于表達的適當載體中從而表達編碼這樣的多肽的多核苷酸。在制備表達載體的過程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與適當?shù)挠糜诒磉_的調(diào)控序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其能夠方便地進行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生核苷酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴于載體與將導入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復制載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其復制獨立于染色體復制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有用于確保自復制的任何手段(means)?；蛘撸d體可以是一種當被導入宿主細胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復制的載體。此外，可以使用單獨的載體或質(zhì)粒或兩個或更多的載體或質(zhì)粒，其共同含有待導入宿主細胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。所述載體優(yōu)選地含有一個或多個(幾個)選擇性標記，其允許簡單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導等的細胞。選擇性標記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)，argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等價物。優(yōu)選用在曲霉屬細胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水鏈霉菌(Sti^ptomyceshygroscopicus)的bar基因。所述載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細胞基因組或載體在細胞中獨立于基因組的自主復制。為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件?；蛘撸d體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導通過同源重組整合入宿主細胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應該優(yōu)選含有足夠數(shù)目的核酸，如100至10，000堿基對，優(yōu)選400至10，000堿基對，并且最優(yōu)選800至10，000堿基對，其與相應的靶序列具有高同一性程度以增強同源重組的概率。整合元件可以是與宿主細胞基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以通過非同源重組將載體整合到宿主細胞基因組中。為了自主復制，載體可以進一步包含復制起點，其使載體能夠在所述的宿主細胞中自主地復制。復制起點可以是介導自主復制的任何質(zhì)粒復制子(r印licator)，其在細胞中發(fā)揮功能。術(shù)語“復制起點”或“質(zhì)粒復制子”在本文定義為能夠使質(zhì)粒或載體在體內(nèi)復制的核苷酸序列。在絲狀真菌細胞中有用的復制起點的實例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch159163-9175；WO00/24883)。分離AMAl基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)?；蜉d體能夠根據(jù)公開于WO00/24883中的方法完成?？梢詫⒍嘤谝粋€拷貝的編碼這樣的多肽的多核苷酸插入宿主細胞以增加該多肽的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過如下獲得將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組，或使所述多核苷酸包括可擴增選擇性標記基因，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細胞來選擇含有選擇性標記基因的擴增拷貝并且由此含有多核苷酸的額外拷貝的細胞。用于連接上述元件以構(gòu)建所述重組表達載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。宿主細胞重組絲狀真菌宿主細胞，其包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼具有增強纖維素分解的活性的多肽，具有葡糖苷酶活性的多肽，葡糖苷酶融合多肽，具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的多肽，具有纖維二糖水解酶活性，或具有其它纖維素分解酶活性的多肽，可將所述重組宿主細胞有利地用于所述多肽的重組產(chǎn)生。將包含這種多核苷酸的載體導入宿主細胞，從而保留該載體作為染色體整合體(chromosomalintegrant)或作為自復制的染色體外載體，如前所述。術(shù)語“宿主細胞”包含親本細胞的任何子代，其由于復制過程中發(fā)生的突變而與親本細胞不同。宿主細胞的選擇將很大程度依賴于編碼多肽的基因和它的來源?！敖z狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門(Oomycota)的亞門(如Hawksworth等，1995，見上文所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養(yǎng)生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母如釀酒酵母的營養(yǎng)生長通過單細胞菌體的出芽生殖(budding)進行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。在優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬蠟菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、Filibasidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱霉屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)，或木霉屬(Trichoderma)細胞。在更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)MHβΚτΙ^Bjerkanderaadusta,-Ρ^|if(Ceriporiopsisaneirina)>干擬賭菌、Ceriporiopsiscaregiea、淺黃擬賭菌(Ceriporiopsisgilvescens)>Ceriporiopsispannocinta>Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、蟲擬M菌(Ceriporiopsissubvermispora)、Chrysosporiumlucknowense、灰蓋鬼傘、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌、輻射射脈菌(Phlebiaradiata)、刺芹側(cè)耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢霉、長絨毛栓菌(Trametesvillosa)、雜色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細胞。在最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是米曲霉。在另一最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是里氏木霉細胞。在另一最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是鑲片鐮孢細胞。在另一最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是ChrysosporiumIucknowense細胞可以將真菌細胞通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細胞壁重建的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細胞的合適方法在EP238023和Yelton^,1984,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA811470-1474中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文獻描述的方法轉(zhuǎn)化酵母=Becker和Guarente，于Abelson,J.N.禾口Simon,Μ.I.編，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194,pp182—187,AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等，1983,JournalofBacteriology153:163；禾口Hinnen等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920o產(chǎn)生方法用于產(chǎn)生本發(fā)明的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)絲狀真菌細胞，所述細胞以其野生型形式能產(chǎn)生所述多肽的；和(b)回收所述多肽?；蛘?，用于產(chǎn)生本發(fā)明的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)重組絲狀真菌宿主細胞；和(b)回收所述多肽。在所述產(chǎn)生方法中，使用本領(lǐng)域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)絲狀真菌細胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養(yǎng)，和實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應商獲得或可以根據(jù)公布的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果蛋白質(zhì)組分分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，則能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收該蛋白質(zhì)組分。如果蛋白質(zhì)組分不分泌到培養(yǎng)基中，其能夠從細胞裂解物(Iysate)回收?？梢允褂帽疚乃龌虮绢I(lǐng)域已知的方法來檢測所述組合物中的蛋白質(zhì)組分。可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收所得纖維素分解蛋白質(zhì)組合物。例如，可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀?？梢酝ㄟ^多種本領(lǐng)域已知的方法純化組合物的蛋白質(zhì)組分，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見，例如，ProteinPurification,J.-C.Janson禾口LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)，以獲得基本上純的多肽。加工含纖維素材料的方法本發(fā)明還涉及用于降解或轉(zhuǎn)化含纖維素材料的方法，其包括用有效量的本發(fā)明的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物處理含纖維素材料。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括(a)用有效量的本發(fā)明的纖維素分解蛋白質(zhì)糖化含纖維素材料；(b)用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵步驟(a)中糖化的含纖維素材料，以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(C)從發(fā)酵中回收發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明的方法可以用于將含纖維素材料(例如，木素纖維素)水解(糖化)成可發(fā)酵糖并將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)換成許多有用的物質(zhì)，例如化學品和燃料。由含纖維素材料生產(chǎn)期望的發(fā)酵產(chǎn)物通常包括預處理、酶水解(糖化)和發(fā)酵。依照本發(fā)明，含纖維素材料的加工可以使用本領(lǐng)域已知的方法來完成。而且，可以使用設(shè)置為按照本發(fā)明來操作的任何生物質(zhì)加工設(shè)備來實施本發(fā)明的方法。水解(糖化)和發(fā)酵，分別或同時包括但不限于分別水解和發(fā)酵(SHF)、同時糖化和發(fā)酵(SSF)、同時糖化和共發(fā)酵(SSCF)、混合水解和發(fā)酵(HHF)、SHCF(分別水解和共發(fā)酵)、HHCF(混合水解和發(fā)酵)和直接微生物轉(zhuǎn)化(DMC)。在本文中可理解的是本領(lǐng)域已知任何方法包括預處理、酶水解(糖化)、發(fā)酵或其組合可以用在本發(fā)明的方法實施中。常規(guī)設(shè)備可以包括補料分批攪拌反應器(fed-batchstirredreactor)、分批攪拌反應器(batch-stirredreactor)、帶有超濾的連續(xù)流攪拌反應器(continuousflowstirredreactorwithultrafiltration)禾口/或連續(xù)活塞流柱式反應器(continuousplug-flowcolumnreactor)(FernandadeCastilhosCorazza,FlavioFariadeMoraes,GisellaMariaZanin禾口IvoNeitzel,2003,Optimalcontrolinfed-batchreactorforthecellobiosehydrolysis,ActaScientiarum.Technology25:33-38；Gusakov,A.V.,禾口Sinitsyn,A.P.,1985,Kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose:1.Amathematicalmodelforabatchreactorprocess,Enz.Microb.Technol.7:346_352)、研磨反應器(attritionreactor)(Ryu,S.K.，和Lee,J.M.，1983，Bioconversionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor,Biotechnol.Bioeng.2553-65)或具有由電磁場引起的強力攪拌的反應器(Gusakov，Α.V.，Sinitsyn,A.P.,Davydkin,I.Y.,Davydkin,V.Y.,Protas,0.V.,1996,Enhancementofenzymaticcellulosehydrolysisusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfield,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。用于水解和/或發(fā)酵的其他反應器類型包括，例如，流化床(fluidizedbed)、上流式床(upflowblanket)、固定化的、和擠出機型反應器。預處理在實施本發(fā)明的方法中，本領(lǐng)域已知的任何預處理方法都可以用于破壞含纖維素材料的植物細胞壁組分。在預處理之前，也可以用本領(lǐng)域已知的方法對含纖維素材料進行預浸泡、濕潤或調(diào)理(conditioning)。常規(guī)的預處理包括而不限于蒸汽預處理(帶有或不帶有爆炸)、稀酸預處理、熱水預處理、石灰預處理、濕氧化、濕式爆炸(wetexplosion)、氨纖維爆炸、有機溶劑預處理和生物學預處理。另外的預處理包括超聲、電穿孔、微波、超臨界CO2、超臨界H2O和氨滲濾法。在水解和/或發(fā)酵作用之前可以預處理含纖維素材料。預處理優(yōu)選在水解之前進行。或者，預處理可以與水解同時進行，例如與用一種或多種纖維素分解酶或其他酶活性處理含纖維素材料同時進行，以釋放可發(fā)酵糖，如葡萄糖和/或麥芽糖。在大多數(shù)情況下預處理步驟本身導致生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖(甚至在酶不存在的情況下)。蒸汽預處理在蒸汽預處理中，加熱含纖維素材料以破壞植物細胞壁組分(包括木質(zhì)素、半纖維素和纖維素)，從而使纖維素和其它級分(如半纖維素)更易于讓酶接近。將纖維素材料傳送至或穿過反應容器，在所述反應容器中注入蒸汽將溫度升高到所需的溫度和壓強，并且將其在預期的反應時間里保持在其中。蒸汽預處理優(yōu)選在140-230°C，更優(yōu)選160-200°C，并且最優(yōu)選170-190°C完成，其中最適溫度范圍取決于化學催化劑的加入。蒸汽預處理的停留時間(residencetime)優(yōu)選1_15分鐘，更優(yōu)選3_12分鐘，并且最優(yōu)選4_10分鐘，其中最適停留時間取決于溫度范圍和化學催化劑的加入。蒸汽預處理允許相對高的固體加樣量(loading)，從而使得含纖維素材料一般僅在預處理時濕潤。所述蒸汽預處理經(jīng)常與預處理后材料的爆炸性卸載，其稱作蒸汽爆炸，即，快速閃蒸(rapidflashing)至大氣壓及材料的湍流組合以通過片段化增加可接近表面積(Duff和Murray，1996,BioresourceTechnology855:1_33；Galbe和Zacchi，2002，Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618_628；美國專利申請No.20020164730)。在蒸汽預處理之前常常加入催化劑如H2SO4或SO2(通常0.3至3%w/w)，其能減少時間和降低溫度，增加回收率以及改善酶水解(Ballesteros等，2006，Appl.Biochem.Biotechnol.129-132496-508；Varga^,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116509-523；Sassner等，2006，EnzymeMicrob.Technol.39:756_762)?；瘜W預處理術(shù)語“化學處理”指的是促進纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放的任何化學預處理。適當?shù)幕瘜W預處理方法的實例包括，例如，稀酸預處理、石灰預處理、濕氧化、氨纖維/冷凍爆炸(ammoniafiber/freezeexplosion)(AFEX)、氨滲透(ammoniapercolation)(APR)或有機溶劑預處理。在稀酸預處理中，將含纖維素材料與稀酸(通常SH2SO4)和水混合以形成漿料，通過蒸汽加熱到所需的溫度，并在一段停留時間后，閃蒸至大氣壓?？梢栽诙鄠€反應器設(shè)計中進行稀酸預處理，例如，活塞流反應器、逆流反應器或連續(xù)逆流收縮床反應器(counter-currentshrinkingbedreactors)(Duff禾口Murray，1996,見上文；Schell^,2004,BioresourceTechnol.91179-188；Leeφ,1999,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93_115)。也可以使用在堿性條件下的幾種預處理方法。這些堿預處理包括，但不限于，石灰預處理、濕氧化、氨滲透(APR)，和氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)。在85-150°C的低溫下用碳酸鈣、氫氧化鈉或氨進行石灰預處理，并且停留時間為1小時至幾天(Wyman等，2005，BioresourceTechnol.961959-1966；Mosier等，2005，BioresourceTechnol.96:673_686)。WO2006/11089UW02006/110899,WO2006/110900和TO2006/110901披露了使用氨的預處理方法。濕氧化為通常在加入氧化劑(例如過氧化氫或超壓氧)的條件下在180_200°C進行5-15分鐘的熱預處理(Schmidt和Thomsen，1998,BioresourceTechnol.64:139_151；Palonen^,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.1171-17；Varga^,2004,Biotechnol.Bioeng.88:567_574；Martin等，2006，J.Chem.Technol.Biotechnol.811669-1677)。以優(yōu)選1-40%的干物質(zhì)，更優(yōu)選2-30%的干物質(zhì)，并且最優(yōu)選5-20%的干物質(zhì)進行預處理，并且通常初始PH值隨著堿(例如碳酸鈉)的加入而增加。已知的濕氧化預處理方法的改進方法為濕爆炸(濕氧化和蒸汽爆炸的組合)，其可以處理干物質(zhì)高達30%。在濕爆炸中，在經(jīng)過一定的駐留時間后在預處理過程中引入氧化劑。然后，通過閃蒸至大氣壓來結(jié)束預處理(W02006/032282)。氨纖維爆炸(AFEX)包括在合適的溫度(例如90_100°C)和高壓(例如17_20bar)用液態(tài)或氣態(tài)氨處理含纖維素材料5-10分鐘，其中干物質(zhì)含量可以高達60%(Gollapalli^,2002,Appl.Biochem.Biotechnol.9823-35；Chundawatφ,2007,Biotechnol.Bioeng.96219-231；Alizadeh^,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.1211133-1141；Teymouri等，2005，BioresourceTechnol.96:2014_2018)。通過在160-200°C使用乙醇水溶液(40-60%乙醇)萃取30-60分鐘，有機溶劑預處理使含纖維素材料脫木素(Pan等，2005，Biotechnol.Bioeng.90473-481；Pan等，2006，Biotechnol.Bioeng.94:851_861；Kurabi等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121219-230)。通常加入硫酸作為催化劑。在有機溶劑預處理中，大部分的半纖維素被除去。Schell等，2003，Appl.Biochem.andBiotechnol.Vol.105-108,p.69-85禾口Mosier等，2005，BioresourceTechnology96:673_686和公開的美國申請2002/0164730描述了合適的預處理方法的其它實例。在一個方面，優(yōu)選以酸處理，并且更優(yōu)選以連續(xù)稀酸和/或弱酸處理進行所述化學預處理。所述酸通常是硫酸，但是也可以使用其它酸，如乙酸、檸檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氫或其混合物。在優(yōu)選1-5，更優(yōu)選1-4，并且最優(yōu)選1-3的pH范圍進行弱酸處理。在一個方面，所述酸濃度在優(yōu)選0.01至20wt%酸，更優(yōu)選0.05至10襯％酸，甚至更優(yōu)選0.1至5襯％酸，并且最優(yōu)選0.2至2.Owt%酸的范圍內(nèi)。使所述酸與含纖維素材料接觸，并在一定的溫度(例如在160-220°C，優(yōu)選165-195°C的范圍)保持數(shù)秒至數(shù)分鐘(例如1秒至60分鐘)的時間。在另一方面，以氨纖維爆炸步驟(AFEX預處理步驟)進行預處理。在另一方面，在含水漿料中進行預處理。在優(yōu)選的方面，在預處理過程中，含纖維素材料以優(yōu)選10-80wt%，更優(yōu)選20-70wt%，并且最優(yōu)選30-60wt%，如大約50wt%的量存在。所述預處理的含纖維素材料可以是未經(jīng)洗滌的，或者是使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法洗滌的，例如用水洗滌。機械預處理術(shù)語“機械預處理”指的是各種類型的研磨或磨制(例如干磨、濕磨或振動球磨)。物理預處理術(shù)語“物理預處理”指的是促進纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從含纖維素材料中分離和/或釋放出來的任何預處理。例如，物理預處理可涉及輻照(例如，微波輻照)、汽蒸/蒸汽爆炸、水熱解(hydrothermolysis)及其組合。物理預處理可涉及高壓和/或高溫(蒸汽爆炸)。在一個方面，高壓指的是范圍在優(yōu)選約300至約600psi，更優(yōu)選為約350至約550psi，并且最優(yōu)選為約400至約500psi，例如大約450psi的壓力。在另一方面，高溫指的是范圍在大約100至大約300°C，優(yōu)選大約140至大約235°C的溫度。在優(yōu)選的方面，在使用如上所限定的高壓和高溫的蒸汽槍水解儀系統(tǒng)(例如，SundsHydrolyzer，可由SundsDefibratorAB，Sweden獲得)中以分批法進行機械預處理。組合的物理和化學預處理含纖維素材料可以同時進行物理和化學預處理。例如，預處理步驟可以涉及稀酸或弱酸處理和高溫和/或高壓處理。可以根據(jù)需要依次或同時進行物理和化學預處理。也可以包括機械預處理。因此，在優(yōu)選的方面，使含纖維素材料進行機械、化學或物理預處理或者其任意組合以促進纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放。生物預處理術(shù)語“生物預處理”指的是促進纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從含纖維素材料中分離和/或釋放出來的任何生物學預處理。生物預處理技術(shù)可涉及應用溶解木質(zhì)素的微生物(參見，例如，Hsu,Τ.-A.，1996，Pretreatmentofbiomass,于HandbookonBioethanolProductionandUtilization,ffyman,C.Ε.編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh禾口Singh,1993,Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.App1.Microbiol.39295-333；McMillan,J.D.，1994,Pretreatinglignocellulosicbiomass；areview,于EnzymaticConversionofBiomassforFueIsProduction,Himmel,Μ.Ε.,Baker,J.0.禾口Overend,R.P.編，ACSSymposiumSeries566,AmericanChemicalSociety,Washington,DC,chapter15；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.禾口Tsao,G.Τ.,1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241；Olsson禾口Hahn-Hagerdal,1996,Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312_331；及Vallander禾口Eriksson,1990,Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63_95)。糖化在也稱為糖化的水解步驟中，將經(jīng)預處理的含纖維素材料水解以將纖維素以及可選地還有半纖維素分解成可發(fā)酵的糖，例如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。使用本發(fā)明的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物進行酶水解。也可以依次加入組合物的酶組分。優(yōu)選在本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠容易地確定的條件下，在合適的含水環(huán)境中進行酶水解。在優(yōu)選的方面，在適于酶活性的條件(即，對酶最佳的條件)下進行水解?？梢砸匝a料分批或連續(xù)方法進行水解，在連續(xù)方法中將經(jīng)預處理的含纖維素材料(底物)逐漸加入到例如包含酶的水解溶液中。糖化通常在受控的pH、溫度和混合條件下，在攪拌釜式反應器或發(fā)酵罐中進行。合適的過程時間、溫度和PH條件能夠由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。例如，糖化可以持續(xù)多至200小時，但是通常進行優(yōu)選大約12至大約96小時，更優(yōu)選大約16至大約72小時，并且最優(yōu)選大約24至大約48小時。所述溫度在優(yōu)選大約25°C至大約70°C，更優(yōu)選大約30°C至大約65°C，并且更優(yōu)選大約40°C至60°C的范圍內(nèi)，特別地為大約50°C。所述pH在優(yōu)選大約3至大約8，更優(yōu)選大約3.5至大約7，并且最優(yōu)選大約4至大約6的范圍內(nèi)，特別地為大約PH5。干固體的含量在優(yōu)選大約5至大約50wt%，更優(yōu)選大約10至大約40wt%并且最優(yōu)選大約20至大約30wt%的范圍內(nèi)。具有增強纖維素分解的活性的多肽和酶的最優(yōu)量依賴于幾個因素，所述因素包括但不限于組分纖維素分解蛋白質(zhì)的混合物、纖維素底物、纖維素底物濃度、纖維素底物的預處理、溫度、時間、PH和發(fā)酵微生物(例如，用于同時糖化和發(fā)酵的酵母)的內(nèi)含物(inclusion)。在優(yōu)選的方面，纖維素分解蛋白對于含纖維素材料的有效量是每克含纖維素材料大約0.5至大約50mg，優(yōu)選大約0.5至大約40mg，更優(yōu)選大約0.5至大約25mg，更優(yōu)選大約0.75至大約20mg，更優(yōu)選大約0.75至大約15mg，甚至更優(yōu)選大約0.5至大約10mg，并且最優(yōu)選大約2.5至大約10mg。在另一優(yōu)選的方面，具有增強纖維素分解的活性的多肽對于含纖維素材料的有效量是每克含纖維素材料大約0.5至大約50mg，優(yōu)選大約0.5至大約40mg，更優(yōu)選大約0.5至大約25mg，更優(yōu)選大約0.75至大約20mg，更優(yōu)選大約0.75至大約15mg，甚至更優(yōu)選大約0.5至大約10mg，并且最優(yōu)選大約2.5至大約10mg。在另一優(yōu)選的方面，具有增強纖維素分解的活性的多肽對于含纖維素材料的有效量是每克含纖維素材料大約0.01至大約50.Omg，優(yōu)選大約0.01至大約40mg，更優(yōu)選大約0.01至大約30mg，更優(yōu)選大約0.01至大約20mg，更優(yōu)選大約0.01至大約10mg，更優(yōu)選大約0.01至大約5mg，更優(yōu)選大約0.025至大約1.5mg,更優(yōu)選大約0.05至大約1.25mg,更優(yōu)選大約0.075至大約1.25mg,更優(yōu)選大約0.1至大約1.25mg,甚至更優(yōu)選大約0.15至大約1.25mg,并且最優(yōu)選大約0.25至大約1.Omgo在另一優(yōu)選的方面，具有增強纖維素分解的活性的多肽對于纖維素分解蛋白的有效量是每克纖維素分解蛋白大約0.005至大約1.0g，優(yōu)選大約0.01至大約1.0g，更優(yōu)選大約0.15至大約0.75g，更優(yōu)選大約0.15至大約0.5g，更優(yōu)選大約0.1至大約0.5g，甚至更優(yōu)選大約0.1至大約0.5g，并且最優(yōu)選大約0.05至大約0.2g。皿.通過一種或多種能夠直接或間接將糖發(fā)酵成期望的發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵微生物可以發(fā)酵從經(jīng)預處理和水解的含纖維素材料得到的可發(fā)酵的糖?！鞍l(fā)酵”或“發(fā)酵方法”指任何發(fā)酵方法或任何包括發(fā)酵步驟的方法。發(fā)酵方法還包括在生物燃料工業(yè)、可消費醇工業(yè)(例如，啤酒和葡萄酒(wine))、乳品工業(yè)(例如，發(fā)酵乳制品)、皮革工業(yè)和煙草工業(yè)中使用的發(fā)酵方法。發(fā)酵的條件依賴于期望的發(fā)酵產(chǎn)物和發(fā)酵生物，并且可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定。在發(fā)酵步驟中，將作為預處理和酶水解步驟的結(jié)果從含纖維素材料釋放的糖通過發(fā)酵生物例如酵母發(fā)酵成產(chǎn)物，例如乙醇。水解(糖化)和發(fā)酵可以是分別的或同時的。這些方法包括，但不限于，分別水解和發(fā)酵(SHF)、同時糖化和發(fā)酵(SSF)、同時糖化和共發(fā)酵(SSCF)、混合水解和發(fā)酵(HHF)、SHCF(分別水解和共發(fā)酵)、HHCF(混合水解和共發(fā)酵)和直接微生物轉(zhuǎn)化(DMC)。在實施本發(fā)明時，任何合適的經(jīng)水解的含纖維素材料可以用于發(fā)酵步驟中。所述材料通?；谄谕陌l(fā)酵產(chǎn)物(即，要從發(fā)酵獲得的物質(zhì))和采用的方法來進行選擇，如本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的。術(shù)語“發(fā)酵培養(yǎng)基”在本文中應理解為指在加入發(fā)酵微生物之前的培養(yǎng)基，例如，糖化處理產(chǎn)生的培養(yǎng)基，以及例如在同時糖化和發(fā)酵方法(SSF)中使用的培養(yǎng)基?！鞍l(fā)酵微生物”指適用于期望的發(fā)酵方法以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的任何微生物，包括細菌和真菌生物體。發(fā)酵生物體可以是(6和/或C5發(fā)酵生物體，或者其組合。C6和C5發(fā)酵生物都是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的。合適的發(fā)酵生物能夠發(fā)酵，即，能夠直接或間接地將糖，例如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖轉(zhuǎn)化成期望的發(fā)酵產(chǎn)物。Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627_642描述了生產(chǎn)乙醇的細菌和真菌發(fā)酵生物的實例?？梢园l(fā)酵C6糖的發(fā)酵微生物的實例包括細菌和真菌生物，如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬(Saccharomyces)菌種，優(yōu)選為釀酒酵母的菌株。可以發(fā)酵C5糖的發(fā)酵生物的實例包括細菌和真菌生物，如酵母。優(yōu)選的發(fā)酵C5的酵母包括畢赤酵母屬，優(yōu)選為樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)的菌株，如樹干畢赤酵母CBS5773；念珠菌屬，優(yōu)選博伊丁念珠菌(Candidaboidinii)、蕓苔念珠菌(Candidabrassicae)、休哈塔念珠菌(Candidasheatae)、迪丹斯念珠菌(Candidadiddensii)、假熱(Candidapseudotropicalis)(Candidautilis)的其它發(fā)酵生物包括發(fā)酵單孢菌屬(Zymomonas)，如運動發(fā)酵單孢菌(Zymomonasmobilis)的菌株；漢遜酵母屬，如異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)的菌株；克魯維酵母屬，如脆壁克魯維酵母(K.fragilis)的菌株；裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)的菌株；和大腸桿菌，特別是已經(jīng)進行了遺傳修飾以改進乙醇產(chǎn)率的大腸桿菌菌株。在優(yōu)選的方面，酵母是酵母屬菌種。在更優(yōu)選的方面，酵母是釀酒酵母。在另一更優(yōu)選的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomycesdistaticus)。在另一更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)。在另一優(yōu)選的方面，酵母是克魯維酵母屬。在另一更優(yōu)選的方面，酵母是馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)。在另一更優(yōu)選的方面，酵母是脆壁克魯維酵母。在另一優(yōu)選的方面，酵母是念珠菌屬。在另一更優(yōu)選的方面，酵母是博伊丁念珠菌。在另一更優(yōu)選的方面，酵母是蕓苔念珠菌。在另一更優(yōu)選的方面，酵母是迪丹斯念珠菌。在另一更優(yōu)選的方面，酵母是假熱帶念珠菌。在另一更優(yōu)選的方面，酵母是產(chǎn)朊念珠菌。在另一優(yōu)選的方面，酵母是棒孢酵母屬(Clavispora)。在另一更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)。在另一更優(yōu)選的方面，酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavisporaopuntiae)。在另一優(yōu)選的方面，酵母是管囊酵母屬(Pachysolen)。在另一更優(yōu)選的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母(Pachysolentannophilus)0在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是畢赤酵母屬。在另一更優(yōu)選的方面，酵母是樹干畢赤酵母。在另一優(yōu)選的方面，酵母是酒香酵母屬(Bretarmomyces)。在另一更優(yōu)選的方面，酵母是克勞森酒香酵母(Bretannomycesclausenii)(Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversiontechnology,于HandbookonBioethanolProductionandUtilization,Wyman,C.Ε.編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。能夠有效地將己糖和戊糖發(fā)酵成乙醇的細菌包括例如運動發(fā)酵單孢菌和熱纖維梭菌(Philippidis，1996，見上文)。在優(yōu)選的方面，細菌是發(fā)酵單孢菌屬。在更優(yōu)選的方面，細菌是運動發(fā)酵單孢菌。在另一優(yōu)選的方面，細菌是梭菌屬。在另一更優(yōu)選的方面，細菌是熱纖維梭菌。商業(yè)上可得到的適合于乙醇生產(chǎn)的酵母包括，例如，ETHANOLRED酵母(可得自Fermentis/Lesaffre,USA)、FALI(可得自Fleischmann，sYeast,USA)、SUPERSTART禾口THERMOSACC新鮮酵母(可得自EthanolTechnology，WI，USA)、BIOFERMAFT和XR(可得自NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation，GA，USA)、GERTSTRAND(可得自GertStrandAB,Sweden)和FERMI0L(購自DSMSpecialties)。在優(yōu)選的方面，發(fā)酵微生物已被遺傳修飾以提供發(fā)酵戊糖的能力，例如，利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物(xyloseandarabinoseco-utilizingmicroorganism)。將異源基因克隆至多種發(fā)酵微生物中已經(jīng)導致構(gòu)建了能夠?qū)⒓禾呛臀焯寝D(zhuǎn)化為乙醇的生物(共發(fā)酵)(Chen和Ho，1993，CloningandimprovingtheexpressionofPichiastipitisxylosereductasegeneinSaccharomycescerevisiae，Appl.Biochem.Biotechnol.39-40135-147；Ho等，1998，GeneticallyengineeredSaccharomycesyeastcapableofeffectivelycofermentingglucoseandxylose,Appl.Environ.Microbiol.641852-1859；Kotter禾口Ciriacy，1993，XylosefermentationbySaccharomycescerevisiae,Appl.Microbiol.Biotechnol.38776-783；Walfridsson等，1995，Xylose-metabolizingSaccharomycescerevisiaestrainsoverexpressingtheTKLlandTALIgenesencodingthepentosephosphatepathwayenzymestransketoIaseandtransaldolase，Appl.Environ.Microbiol.614184-4190；Kuyper等，2004，MinimalmetabolicengineeringofSaccharomycescerevisiaeforefficientanaerobicxylosefermentation:aproofofprinciple，F(xiàn)EMSYeastResearch4:655_664；Beall等，1991，ParametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantEscherichiacoli，Biotech·Bioeng·38:296_303;Ingram等，1998，Metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction，Biotechnol·Bioeng·58204~214；Zhang等，1995，MetabolicengineeringofapentosemetabolismpathwayinethanologenicZymomonasmobilis，Science267:240_243；Deanda等，1996，Developmentofanarabinose-fermentingZymomonasmobilisstrainbymetabolicpathwayengineering，Appl.Environ.Microbiol.624465-4470)。在優(yōu)選的方面，經(jīng)遺傳修飾的發(fā)酵微生物是釀酒酵母。在另一優(yōu)選的方面，經(jīng)遺傳修飾的發(fā)酵微生物是運動發(fā)酵單孢菌。在另一優(yōu)選的方面，經(jīng)遺傳修飾的發(fā)酵微生物是大腸桿菌。在另一優(yōu)選的實施方式中，經(jīng)遺傳修飾的發(fā)酵微生物是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)0通常加入發(fā)酵微生物以降解纖維素或水解產(chǎn)物，并且發(fā)酵進行大約8到大約96小時，例如大約24至大約60小時。溫度通常為大約26°C至大約60°C，特別是大約32°C或50°C，并且在大約pH3至大約pH8，如大約pH4-5、6或7。在優(yōu)選的方面，將發(fā)酵微生物應用于降解的纖維素或水解產(chǎn)物，并且發(fā)酵進行大約12至大約96小時，如通常為24-60小時。在優(yōu)選的方面，溫度優(yōu)選在大約20°C至大約60°C，更優(yōu)選大約25°C至大約50°C，并且最優(yōu)選大約32°C至大約50°C，特別是大約32°C或50°C，并且pH通常從大約pH3至大約pH7，優(yōu)選大約pH4_7。然而，例如，一些細菌發(fā)酵生物具有更高的最佳發(fā)酵溫度。發(fā)酵微生物優(yōu)選以每毫升的發(fā)酵液大約IO5至1012，優(yōu)選大約IO7至101(1，特別是大約2XIO8的活細胞計數(shù)的量應用。有關(guān)使用酵母發(fā)酵的其它指導可參見例如"TheAlcoholTextbook"(K.Jacques,Τ.P.Lyons禾口D.R.Kelsall編，NottinghamUniversityPress,UnitedKingdom1999)，將其通過提述并入本文。對于乙醇產(chǎn)生，在發(fā)酵之后蒸餾發(fā)酵漿料以提取乙醇。根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的乙醇可以用作例如燃料乙醇、飲用乙醇，即，可飲用中性酒精(potableneutralspirits)；或工業(yè)乙醇?？梢詫l(fā)酵刺激物(fermentationstimulator)與本文描述的任何酶方法組合使用以進一步改進發(fā)酵方法，特別是改進發(fā)酵微生物的性能，如，速率增益和乙醇產(chǎn)率?！鞍l(fā)酵刺激物”指用于發(fā)酵微生物，特別是酵母的生長的刺激物。優(yōu)選的用于生長的發(fā)酵刺激物包括維生素和礦物。維生素的實例包括多種維生素、生物素、泛酸、煙酸、內(nèi)消旋肌醇、硫胺素、吡哆醇、對氨基苯甲酸、葉酸、核黃素和維生素A、B、C、D和E。參見，例如，Alfenore等,ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiaebyavitaminfeedingstrategyduringfed-batchprocess,Springer-Verlag(2002)，將其通過提述并入本文。礦物的實例包括能夠提供營養(yǎng)物的礦物和礦物鹽，所述營養(yǎng)物包括ρ、κ、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn禾口Cu。發(fā)酵產(chǎn)物發(fā)酵產(chǎn)物可以為源自發(fā)酵的仵何物質(zhì)。所述發(fā)酵產(chǎn)物可以是，但不限于，醇(例如，阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3_丙二醇、山梨糖醇和木糖醇)；有機酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、延胡索酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮類(例如，丙酮)；醛類(例如，甲醛)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)；氣體(例如，甲烷、氫氣(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。發(fā)酵產(chǎn)物還可以為蛋白質(zhì)作為有高價值產(chǎn)物。在優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是醇。應該理解術(shù)語“醇”包含含有一個或多個羥基的物質(zhì)。在更優(yōu)選的方面，所述醇是阿拉伯糖醇。在另一更優(yōu)選的方面，所述醇是丁醇。在另一更優(yōu)選的方面，所述醇是乙醇。在另一更優(yōu)選的方面，所述醇是甘油。在另一更優(yōu)選的方面，所述醇是甲醇。在另一更優(yōu)選的方面，所述醇是1，3_丙二醇。在另一更優(yōu)選的方面，所述醇是山梨糖醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是木糖醇。參見，例如，Gong,C.S.，Cao,N.J.,Du,J.,禾口Tsao,G.Τ·,1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207_241；Silveira,Μ.M.禾口Jonas，R.，2002，Thebiotechnologicalproductionofsorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59400-408；Nigam,P.禾口Singh，D.,1995,Processesforfermentativeproductionofxylitol-asugarsubstitute,ProcessBiochemistry30(2):117_124；Ezeji,T.C.,Qureshi,N.禾口Blaschek,H.P.,2003,Productionofacetone,butanolandethanolbyClostridiumbeijerinckiiBAlOlandinsiturecoverybygasstripping,WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology19(6):595_603o另一個優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是有機酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述有機酸是乙酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述有機酸是醋酮酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述有機酸是己二酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述有機酸是抗壞血酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述有機酸是檸檬酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述有機酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述有機酸是甲酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述有機酸是延胡索酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述有機酸是葡糖二酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述有機酸是葡糖酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述有機酸是葡糖醛酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述有機酸是戊二酸。在另一優(yōu)選的方面，所述有機酸是3-羥基丙酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述有機酸是衣康酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述有機酸是乳酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述有機酸是蘋果酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述有機酸是丙二酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述有機酸是草酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述有機酸是丙酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述有機酸是琥珀酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述有機酸是木糖酸。參見，例如，Chen,R.和Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediatedextractivefermentationforlacticacidproductionfromcellulosicbiomass,App1.Biochem.Biotechnol.63-65:435_448。在另一優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是酮。應該理解的是術(shù)語“酮”涵蓋含有一個或多個酮基的物質(zhì)。在另一更優(yōu)選的方面，所述酮是丙酮。參見，例如，Qureshi和Blaschek，2003，見上文。在另一優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是醛。在另一更優(yōu)選的方面，所述醛為甲醛。在另一優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是氨基酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述有機酸是天冬氨酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是賴氨酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是絲氨酸。在另一更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是蘇氨酸。參見，例如，Richard，Α.禾口Margaritis,A.,2004,Empiricalmodelingofbatchfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers,BiotechnologyandBioengineering87(4):501_515o在另一優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是氣體。在另一更優(yōu)選的方面，所述氣體是甲烷。在另一更優(yōu)選的方面，所述氣體是H2。在另一更優(yōu)選的方面，所述氣體是co2。在另一更優(yōu)選的方面，所述氣體是⑶。參見，例如，Kataoka，N.，A.Miya和K.Kiriyama，1997，Studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria,WaterScienceandTechnology36(6-7):41_47；禾口GunaseelanV.N.于BiomassandBioenergy,Vol.13(1-2),pp.83-114,1997,Anaerobicdigestionofbiomassformethaneproduction:Areview。使用本領(lǐng)域已知的方法可以從發(fā)酵培養(yǎng)基中任選地回收發(fā)酵產(chǎn)物，所述方法包括，但不限于，層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、蒸餾或提取。例如，從發(fā)酵的含纖維素材料中分離乙醇，并通過常規(guī)的蒸餾方法純化?？梢垣@得純度高至大約96vol.%的乙醇，其可以用作，例如燃料乙醇、飲用乙醇，即，可飲用中性酒精(potableneutralspirits)；或工業(yè)乙醇。通過以下實施例進一步對本發(fā)明進行描述，但不應將其理解為對本發(fā)明范圍的限制。實施例用作緩沖液和底物的化學品為至少試劑級的商業(yè)產(chǎn)品。DNA測序使用AppliedBiosystemsModel3130XGeneticAnalyzer(3130X型遺傳分析儀)(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA,USA)，利用染料終止子化學(Giesecke等，1992，JournalofVirol.Methods38:47_60)進行DNA測序。使用phred/phrap/consed(UniversityofWashington,Seattle,WA,USA)用序列特異性引物組裝序列。培養(yǎng)基與溶液YP培養(yǎng)基由每升IOg酵母提取物和20g細菌用胰蛋白胨組成。纖維素酶-誘導培養(yǎng)基由每升20g纖維素、IOg玉米漿固體、1.45g(NH4)2S04、2.08gKH2P04、0.28gCaCl2,0.42gMgSO4·7H20和0.42ml痕量金屬溶液組成。痕量金屬溶液由每升216gFeCl3·6H20、58gZnSO4·7H20、27gMnS04·H2OUOgCuSO4·5Η20、2·4gH3BO3和336g檸檬酸組成。STC由IM山梨醇、IOmMCaCl2禾口IOmMTris-HCl,pH7.5組成。COVE平板由每升342g蔗糖、IOmlCOVE鹽溶液、IOmlIM乙酰胺、IOml1.5MCsCl,和25gNoble瓊脂組成。COVE鹽溶液由每升26gKCl、26gMgS04、76gKH2PO4和50mlCOVE痕量金屬溶液組成。COVE痕量金屬溶液由每升0.04gNa2B4O7·10Η20、0·4gCuSO4·5Η20、1·2gFeSO4·7Η20、0·7gMnSO4·H20,0.8gNa2MoO2·H2O和IOgZnSO4·7H20組成。C0VE2平板由每升30g蔗糖、20mlCOVE鹽溶液、25gNoble瓊脂和IOmlIM乙酰胺組成。PDA平板由每升39克馬鈴薯葡萄糖瓊脂組成。LB培養(yǎng)基由每升IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物和5gNaCl組成。2XYT-Amp平板由每升IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化鈉和15g細菌用瓊脂組成，在高壓滅菌后加入2ml過濾滅菌的50mg/ml氨芐青霉素溶液。MDU2BP培養(yǎng)基由每升45g麥芽糖、IgMgSO4·7Η20、IgNaCl、2gK2HS04、12gKH2PO4,2g脲和500μ1AMG痕量金屬溶液，pH調(diào)至5.0，然后用0.22μm過濾裝置過濾除菌。AMG痕量金屬溶液由每升14.3gZnSO4·7Η20、2·5gCuSO4·5Η20、0·5gNiCl2·6Η20、13.8gFeSO4·Η20、8·5gMnSO4·7Η20和3g檸檬酸組成。礦物質(zhì)培養(yǎng)基平板由每升6gNaN03、0.52gKCl、1.52gKH2PO4、ImlCOVE痕量金屬溶液、20gNoble瓊脂、20ml50%葡萄糖、2.5ml20%MgSO4·7Η20，和20ml生物素保存溶液組成。生物素保存溶液由每升0.2g生物素組成。SOC培養(yǎng)基由2%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、IOmMNaCl,2.5mMKClUOmMMgCl2和IOmMMgSO4組成，然后在高壓滅菌后加入過濾除菌的葡萄糖至20mM。孟德爾培養(yǎng)基由每升1.4g(NH4)2SO4,2.OgKH2P04、0.3g脲、0.3gCaCl2、0.3gMgSO4.7H20、5mgFeSO4.7Η20、1·6mgMnSO4.H2OU.4mgZnS04.H2O和2mgCoCl2組成。實施例1:pMJ04表達載體的構(gòu)建通過使用下述所示的引物993429(反義)和993428(有義)從里氏木霉RutC30基因組DNAPCR擴增里氏木霉纖維二糖水解酶I基因(cbhl，CEL7A)終止子而構(gòu)建表達載體PMJ04。工程改造反義引物，使其在5’末端包含PacI位點，并在有義引物的3’末端包含SpeI位點。引物"3429(反義)5，-AACGTTAATTAAGGAATCGTTTTGTGTTT-3，(SEQIDNO65)引物993428(有義)5，-AGTACTAGTAGCTCCGTGGCGAAAGCCTG-3，(SEQIDNO66)使用DNEASYPlantMaxiKit(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)分離里氏木霉RutC30基因組DNA。擴增反應液(50μ1)由下述物質(zhì)組成1XThermoPol反應緩沖液(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA,USA),0.3mMdNTP,IOOng里氏木霉RutC30基因組DNA，0.3μM引物993429，0.3μM引物993428和2單位VentDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA,USA)在EPPENDORFMASTERCYCLER5333(EppendorfScientific,Inc.，Westbury，NY,USA)中溫育反應物，程序為94°C30秒，50°C30秒，和72°C60秒的5個循環(huán)，然后進行94V30秒，65°C30秒，和72°C120秒的25個循環(huán)(5分鐘的最后延伸)。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳，使用40mMTris堿-20mM乙酸鈉-ImMEDTA二鈉(TAE)緩沖液分離反應產(chǎn)物，其中從凝膠切下229bp的產(chǎn)物條帶，并使用QIAQUICKGelExtractionKit(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)，根據(jù)生產(chǎn)商的說明純化用PacI和SpeI消化得到的PCR片段，并使用快速連接試劑盒(Roche，Indianapolis,IN,USA)連接入用相同的限制性酶消化的pAlLol(W005/067531)中，以產(chǎn)生pMJ04(圖1)。實施例2=PCaHj568的構(gòu)建由PCaHjl70(美國專利No.5，763，254)和pMT2188構(gòu)建質(zhì)粒pCaHj568。質(zhì)粒PCaHjl70包含特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V(CEL45A)全長編碼區(qū)(SEQIDN0:15，其編碼SEQIDNO16的氨基酸序列)。pMT2188的構(gòu)建由使用下述所示引物142779和142780從pCaHj483(W098/00529)PCR擴增pUC19的復制起點而開始。引物142780在PCR片段中引ΛBbuI位點。引物1427795，-TTGAATTGAAAATAGATTGATTTAAAACTTC-3，(SEQIDNO67)引物1427805，-TTGCATGCGTAATCATGGTCATAGC-3，(SEQIDNO68)使用EXPANDPCR系統(tǒng)(RocheMolecularBiochemicals,Basel,Switzerland)，按照生產(chǎn)商的說明進行此擴增。在瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，并使用JetquickGelExtractionSpinKit(Genomed,Wielandstr,Germany)分離禾口純化1160bp片段。使用EXPANDPCR系統(tǒng)，用下述所示引物140288和142778，從常用的釀酒酵母克隆載體pYES2(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)擴增URA3基因。引物140288在PCR片段中引入EcoRI位點。引物140288:5，-TTGAATTCATGGGTAATAACTGATAT-3，(SEQIDNO69)引物1427785，-AAATCAATCTATTTTCAATTCAATTCATCATT-3，(SEQIDNO70)在瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，并使用JetquickGelExtractionSpinKit分離和純化1126bp片段。通過混合將兩個PCR片段融合，并通過重疊剪接方法(Horton等，1989，Gene7761-68)用上述所示引物142780和140288進行擴增。在瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，并使用JetquickGelExtractionSpinKit分離和純化2263bp片段。用EcoRI和BbuI消化得到的片段，并使用標準規(guī)程連接至用相同的限制性酶消化的pCaHj483的最大片段。將連接混合物轉(zhuǎn)化入由Mandel和Higa，1970，J.Mol.Biol.45154方法制成感受態(tài)的pyrF-陰性大腸桿菌菌株DB6507(ATCC35673)。在每升補加Ig酪蛋白氨基酸、500μg硫胺素和IOmg卡那霉素的固體M9培養(yǎng)基(Sambrook等，1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress)上篩選轉(zhuǎn)化體。從一個轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒并命名為PCaHj527(圖2)。將PCaHj527上存在的NA2_tpi啟動子通過使用EXPANDPCR系統(tǒng)根據(jù)生產(chǎn)商的說明進行定點突變。使用下述所示突變引物141223將核苷酸134-144從GTACTAAAACC(SEQIDNO71)轉(zhuǎn)變成CCGTTAAATTT(SEQIDNO:72)。引物1412235，-GGATGCTGTTGACTCCGGAAATTTAACGGTTTGGTCTTGCATCCC-3，(SEQIDNO73)使用下述所示突變引物141222將核苷酸423-436從ATGCAATTTAAACT(SEQIDN0:74)轉(zhuǎn)變成CGGCAATTTAACGG(SEQIDNO:75)。引物1412225，-GGTATTGTCCTGCAGACGGCAATTTAACGGCTTCTGCGAATCGC-3，(SEQIDNO76)將得到的質(zhì)粒命名為pMT2188(圖3)。將特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V編碼區(qū)從PCaHjl70作為BamHI-SalI片段轉(zhuǎn)入用BamHI和XhoI消化的pMT2188，以產(chǎn)生pCaHj568(圖4)。質(zhì)粒pCaHj568包含突變的NA2-tpi啟動子，其與特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V全長編碼序列可操作連接。實施例3:pMJ05的構(gòu)建通過使用下述所示引物HiEGV-F和HiEGV-R，由pCaHj568PCR擴增915bp特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V全長編碼區(qū)而構(gòu)建質(zhì)粒pMJ05。引物HiEGV-F(有義)5，-AAGCTTAAGCATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3，(SEQIDNO77)引物HiEGV-R(反義)5，-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3，(SEQIDNO78)擴增反應液(50μ1)由下述組成1XThermoPol反應緩沖液(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA,USA),0.3mMdNTP,lOng/μ1pCaHj568，0·3μMHiEGV-F弓|物，0·3μΜHiEGV-R引物，和2單位VentDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs,Beverly,ΜΑ,USA)。在EPPENDORFMASTERCYCLER5333(EppendorfScientific,Inc.,ffestbury,NY,USA)中溫育反應物，程序為94°C30秒，50°C30秒，和72°C60秒的5個循環(huán)，然后進行94°C30秒，65°C30秒，和72°C120秒的25個循環(huán)(5分鐘的最后延伸)。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳，使用TAE緩沖液分離反應產(chǎn)物，其中從凝膠切下937bp的產(chǎn)物條帶，并使用QIAQUICK.凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)，根據(jù)生產(chǎn)商的說明純化。將937bp純化的片段用作使用下述引物的后續(xù)擴增的模板DNA引物HiEGV-R(反義)5，-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3，(SEQIDNO79)引物HiEGV-F-重疊(有義)5，-ACCGCGGACTGCGCATCATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3，(SEQIDNO80)斜體表示的引物序列與里氏木霉纖維二糖水解酶I基因(cbhl)啟動子的17bp同源，并且加下劃線的引物序列與特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V編碼區(qū)的29bp同源。啟動子和編碼序列之間的36bp重疊允許將包含里氏木霉cbhl啟動子的994bp片段精確融合至包含特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V編碼區(qū)的918bp片段。擴增反應液(50μ1)由下述物質(zhì)組成1XThermoPol反應緩沖液，0.3mMdNTP,1μ1純化的937bpPCR片段，0.3μMHiEGV-F-重疊引物，0.3μMHiEGV-R引物，和2單位VentDNA聚合酶。在EPPENDORFMASTERCYCLER5333中溫育反應物，程序為94°C30秒，50°C30秒，和72°C60秒的5個循環(huán)，然后進行94°C30秒，65°C30秒，和720C120秒的25個循環(huán)(5分鐘的最后延伸)。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳，使用TAE緩沖液分離反應產(chǎn)物，其中從凝膠切下945bp的產(chǎn)物條帶，并使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商的說明純化。使用下述所示引物進行單獨的PCR，以從里氏木霉RutC30基因組DNA擴增從基因的ATG起始密碼子的994bp上游延伸的里氏木霉cbhl啟動子序列(有義引物進行工程改造以在5’末端包含SalI限制性位點)。使用DNEASYPlantMaxiKit分離里氏木霉RutC30基因組DNA。引物TrCBHIpro-F(有義)5，-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3，(SEQIDNO81)弓丨物TrCBHIpro-R(反義)5，-GATGCGCAGTCCGCGGT-3，(SEQIDNO82)擴增反應液(50μ1)由下述物質(zhì)組成1XThermoPol反應緩沖液，0.3mMdNTP,lOOng/μ1里氏木霉RutC30基因組DNA，0.3μΜTrCBHIpro-F引物，0·3μMTrCBHIpro-R弓丨物，和2單位VentDNA聚合酶。在EPPENDORFMASTERCYCLER5333中溫育反應物，程序為94°c30秒，550C30秒，和72°C120秒的30個循環(huán)(5分鐘的最后延伸)。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳，使用TAE緩沖液分離反應產(chǎn)物，其中從凝膠切下998bp的產(chǎn)物條帶，并使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商的說明純化。將998bp純化的片段用作使用下述引物的后續(xù)擴增的模板DNA。引物TrCBHIpro-F5，-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3，(SEQIDNO83)弓丨物TrCBHIpro-R-重疊5，-GGAGGGGGGAGGAACGCATGATGCGCAGTCCGCGGT-3’(SEQIDNO84)斜體表示的引物序列與里氏木霉cbhl啟動子的17bp同源，并且加下劃線的引物序列與特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V編碼區(qū)的29bp同源。啟動子和編碼序列之間36bp的重疊允許將包含里氏木霉cbhl啟動子的994bp片段精確融合至包含特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V編碼區(qū)的918bp片段。擴增反應液(50μ1)由下述物質(zhì)組成1XThermoPol反應緩沖液，0.3mMdNTP,1μ1純化的998bpPCR片段，0·3μMTrCHBlpro-F引物，0·3μMTrCBHlpro-R-重疊引物，和2單位VentDNA聚合酶。在EPPENDORFMASTERCYCLER5333中溫育反應物，程序為94°C30秒，50°C30秒，和72°C60秒的5個循環(huán)，然后進行94°C30秒，65°C30秒，和72°C120秒的25個循環(huán)(5分鐘的最后延伸)。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳，使用TAE緩沖液分離反應產(chǎn)物，其中從凝膠切下ioi7bp的產(chǎn)物條帶，并使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商的說明純化。使用下述引物，用1017bp里氏木霉cbhl啟動子PCR片段和945bp特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶VPCR片段作為后續(xù)擴增的模板DNA，利用重疊PCR將994bpcbhl啟動子精確融合至918bp內(nèi)切葡聚糖酶V全長編碼區(qū)。引物TrCBHIpro-F5，-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3，(SEQIDNO85)引物HiEGV-R:5，-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3，(SEQIDNO86)擴增反應液(50μ1)由下述物質(zhì)組成1XThermoPol反應緩沖液，0.3mMdNTP,0.3μΜTrCHBlpro-F弓丨物，0·3μΜHiEGV-R弓丨物，和2單位VentDNA聚合酶。在EPPENDORFMASTERCYCLER5333中溫育反應物，程序為94°C30秒，50°C30秒，和72°C60秒的5個循環(huán)，然后進行94°C30秒，65°C30秒，和72°C120秒的25個循環(huán)(5分鐘的最后延伸)。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳，使用TAE緩沖液分離反應產(chǎn)物，其中從凝膠切下1926bp的產(chǎn)物條帶，并使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商的說明純化。使用ZEROBLUNTTOPOPCR克隆試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，按照生產(chǎn)商的說明，將得到的1926bp片段克隆入pCR-Blimt-II-TOPO載體(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。用NotI和SalI消化得到的質(zhì)粒，使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒將1926bp片段凝膠純化，并使用T4DNA連接酶(Roche，Indianapolis,IN,USA)連接入也用相同的兩個限制性酶消化的pMJ04，以產(chǎn)生pMJ05(圖5)。質(zhì)粒pMJ05包含里氏木霉纖維二糖水解酶I啟動子和終止子，其與特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V全長編碼序列可操作連接。實施例4:PSMail30表達載體的構(gòu)建用下述所示引物993467(有義)和993456(反義)，從作為模板的pJaL660(TO2002/095014)PCR擴增2586bpDNA片段，所述片段從ATG起始密碼子到TAA終止密碼子，跨越米曲霉β-葡糖苷酶全長編碼序列(cDNA序列為SEQIDNO15，而SEQIDNO16為推定的氨基酸序列；大腸桿菌DSM14240)。SpeI位點經(jīng)工程改造位于反義引物的5’末端以促進連接。斜體表示的引物序列與里氏木霉cbhl啟動子的24bp同源，并且加下劃線的引物序列與米曲霉β“葡糖苷酶編碼區(qū)的22bp同源。引物993467:5，-ATAGTCAACCGCGGACTGCGCATCATGAAGCTTGGTTGGATCGAGG-3’(SEQIDNO87)引物9934565，-ACTAGTTTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3，(SEQIDNO88)擴增反應液(50μ1)由下述物質(zhì)組成Pfx擴增緩沖液(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)，0.25mMdNTP,IOngpJaL660，6.4μM引物993467，3.2μM引物993456，ImMMgCl2,和2·5單位PfxDNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)。在EPPENDORFMASTERCYCLER5333中溫育反應物，程序為94°C1分鐘，55°C1分鐘，和72°C3分鐘的30個循環(huán)(15分鐘的最后延伸)。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳，使用TAE緩沖液分離反應產(chǎn)物，其中從凝膠切下2586bp的產(chǎn)物條帶，并使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商的說明純化。使用如下所示的引物993453(有義)和引物993463(反義)進行單獨的PCR，以擴增里氏木霉cbhl啟動子序列，所述序列從基因的ATG起始密碼子的IOOObp上游延伸，從而產(chǎn)生IOOObpPCR片段引物993453:5，-GTCGACTCGAAGCCCGAATGTAGGAT-3，(SEQIDNO89)引物993463:5’-CCTCGATCCAACCAAGCTTCATGATGCGCAGTCCGCGGTTGACTA-3’(SEQIDNO90)斜體表示的引物序列與里氏木霉cbhl啟動子的24bp同源，并且加下劃線的引物序列與米曲霉β“葡糖苷酶全長編碼區(qū)的22bp同源。啟動子和編碼序列之間46bp的重疊允許將包含里氏木霉cbhl啟動子的IOOObp片段精確融合至包含米曲霉β-葡糖苷酶編碼區(qū)的2586bp片段。擴增反應液(50μ1)由下述物質(zhì)組成Pfx擴增緩沖液，0.25mMdNTP,IOOng里氏木霉RutC30基因組DNA，6.4μM引物993453，3.2μM引物993463，ImMMgCl2，和2.5單位PfxDNA聚合酶。在EPPENDORFMASTERCYCLER5333中溫育反應物，程序為940C1分鐘，55°C1分鐘，和72°C3分鐘的30個循環(huán)(15分鐘的最后延伸)。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳，使用TAE緩沖液分離反應產(chǎn)物，其中從凝膠切下IOOObp的產(chǎn)物條帶，并使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商的說明純化。使用上述所示引物993453(有義)和引物993456(反義)，通過重疊PCR，將純化的片段用作后續(xù)擴增的模板DNA，將包含里氏木霉cbhl啟動子的IOOObp片段精確融合至包含米曲霉β-葡糖苷酶全長編碼區(qū)的2586bp片段。擴增反應液(50μ1)由下述物質(zhì)組成Pfx擴增緩沖液，0.25mMdNTP，6.4yi^|*993453，3.24]引物993456，11111MgCl2，和2.5單位PfxDNA聚合酶。在EPPENDORFMASTERCYCLER5333中溫育反應物，程序為94°C1分鐘，60°C1分鐘，和72°C4分鐘的30個循環(huán)(15分鐘的最后延伸)。用SalI和SpeI消化得到的3586bp片段并連接入用相同的兩個限制性酶消化的PMJ04，以產(chǎn)生pSMail30(圖6)。質(zhì)粒pSMAil30包含里氏木霉纖維二糖水解酶I基因啟動子和終止子，其與米曲霉天然葡糖苷酶信號序列和編碼序列(即，全長米曲霉葡糖苷酶編碼序列)可操作連接。實施例5:PSMail35的構(gòu)建用下述引物993728(有義)和993727(反義)，從作為模板的pJaL660PCR擴增從Lys-20到TAA終止密碼子的米曲霉β_葡糖苷酶成熟編碼區(qū)(不包含天然信號序列，參見圖7；SEQIDNO91和92是其信號肽和編碼序列)。引物993728:5，-TGCCGGTGTTGGCCCTTGCCAAGGATGATCTCGCGTACTCCC-3’(SEQIDNO93)引物993727:5，-GACTAGTCTTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3，(SEQIDNO94)斜體表示的序列與特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V信號序列的20bp同源，并且加下劃線的序列與米曲霉β-葡糖苷酶編碼區(qū)的22bp同源。SpeI位點經(jīng)工程改造入反義引物的5，末端。擴增反應液(50μ1)由下述物質(zhì)組成Pfx擴增緩沖液，0.25mMdNTP,lOng/μ1ρJaL660，6.4μM引物993728，3.2μM引物993727，ImMMgCl2，和2.5單位PfxDNA聚合酶。在EPPENDORFMASTERCYCLER5333中溫育反應物，程序為94°C1分鐘，55°C1分鐘，和72°C3分鐘的30個循環(huán)(15分鐘的最后延伸)。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳，使用TAE緩沖液分離反應產(chǎn)物，其中從凝膠切下2523bp的產(chǎn)物條帶，并使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商的說明純化。使用如下所示的引物993724(有義)和引物993729(反義)，進行單獨的PCR擴增，以擴增IOOObp里氏木霉cbhl啟動子和63bp特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V信號序列(ATG起始密碼子到Ala-21,圖8，SEQIDNO95和96)。引物993724:5，-ACGCGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATCC-3，(SEQIDNO97)引物993729:5，-GGGAGTACGCGAGATCATCCTTGGCAAGGGCCAACACCGGCA-3’(SEQIDNO98)斜體表示的引物序列與特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V信號序列的20bp同源，并且加下劃線的引物序列與米曲霉β“葡糖苷酶編碼區(qū)的22bp同源。使用質(zhì)粒pMJ05作為模板產(chǎn)生包含里氏木霉cbhl啟動子和特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V信號序列片段的1063bp片段，所述質(zhì)粒pMJ05包含在cbhl啟動子控制下的特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V編碼區(qū)。里氏木霉cbhl啟動子和特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V信號序列和米曲霉β-葡糖苷酶成熟編碼序列之間共有42bp重疊，從而在2523bp米曲霉β-葡糖苷酶編碼區(qū)的啟動子和ATG起始密碼子之間提供完美的連接。擴增反應液(50μ1)由下述物質(zhì)組成Pfx擴增緩沖液，0.25mMdNTP,IOOng/μ1pMJ05，6.4μM引物993728，3.2μM引物993727，ImMMgCl2，和2.5單位PfxDNA聚合酶。在EPPENDORFMASTERCYCLER5333中溫育反應物，程序為94°C1分鐘，60°C1分鐘，和72°C4分鐘的30個循環(huán)(15分鐘的最后延伸)。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳，使用TAE緩沖液分離反應產(chǎn)物，其中從凝膠切下1063bp的產(chǎn)物條帶，并使用QIAQUICK-凝膠提取試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商的說明純化。使用上述引物993724(有義)和引物993727(反義)，通過重疊PCR，將純化的重疊片段用作擴增模板，從而將包含里氏木霉cbhl啟動子和特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V信號序列的1063bp片段精確融合至包含米曲霉β-葡糖苷酶成熟編碼區(qū)框的2523bp片段。擴增反應液(50μ1)由下述物質(zhì)組成Pfx擴增緩沖液，0.25mMdNTP，6.4yi^|*993724，3.2μM引物993727，ImMMgCl2，和2.5單位PfxDNA聚合酶。在EPPENDORFMASTERCYCLER5333中溫育反應物，程序為94°C1分鐘，60°C1分鐘，和72°C4分鐘的30個循環(huán)(15分鐘的最后延伸)。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳，使用TAE緩沖液分離反應產(chǎn)物，其中從凝膠切下3591bp的產(chǎn)物條帶，并使用QIAqUICK凝膠提取試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商的說明純化。用SalI和SpeI消化得到的3591bp片段并連接入用相同的限制性酶消化的PMJ04,以產(chǎn)生pSMail35(圖9)。質(zhì)粒pSMAil35包含里氏木霉纖維二糖水解酶I基因啟動子和終止子，其與特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V信號序列和米曲霉葡糖苷酶成熟編碼序列可操作連接。實施例6米曲霉β-葡糖苷酶與特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V分泌信號的表達將編碼與特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V分泌信號連接的成熟米曲霉β_葡糖苷酶的質(zhì)粒pSMail35(圖8)通過PEG介導的轉(zhuǎn)化(Penttila等，1987，Gene61155-164)導入里氏木霉RutC30。該質(zhì)粒包含構(gòu)巢曲霉amdS基因，以使轉(zhuǎn)化子能以乙酰胺為唯一氮源生長。在27°C和90rpm，在補加2%(w/v)葡萄糖和IOmM尿苷的25mlYP培養(yǎng)基中將里氏木霉RutC30培養(yǎng)17小時。使用真空驅(qū)動一次性過濾系統(tǒng)(Millipore，Bedford,ΜΑ,USA)，通過過濾收集菌絲體，并用去離子水洗滌兩次，用1.2M山梨醇洗滌兩次。通過將已洗滌的菌絲體懸浮于包含15mgGLUCANEX(NovozymesA/S,Bagsva^rd,Denmark)每ml和0.36單位殼多糖酶(SigmaChemicalCo.，St.Louis,MO,USA)每ml的20ml1.2M山梨醇中，并在34°C以90rpm輕輕震蕩溫育15-25分鐘，以產(chǎn)生原生質(zhì)體。通過在400xg離心7分鐘而收集原生質(zhì)體，并用冰冷的1.2M山梨醇洗滌兩次。使用血球計數(shù)器為原生質(zhì)體計數(shù)，并重懸于STC中至終濃度為IXlO8原生質(zhì)體每ml。過量的原生質(zhì)體在-80°C儲存在Cryo1°CFreezingContainer(Nalgene,Rochester,NY,USA)中。將約7μg用PmeI消化的pSMail35加入100μ1原生質(zhì)體溶液并輕輕混合，然后加入260μ1PEG緩沖液，混合，并在室溫溫育30分鐘。然后加入STC(3ml)并混合，并將轉(zhuǎn)化溶液涂布在使用構(gòu)巢曲霉amdS篩選的COVE平板上。將平板在28°C溫育5_7天。將轉(zhuǎn)化體在C0VE2平板上傳代培養(yǎng)并在28°C生長。將用pSMail35獲得的命名為SMA135的六十七個轉(zhuǎn)化體在含乙酰胺的新鮮平板上傳代培養(yǎng)，并使其在28°C培養(yǎng)7天形成孢子。將67個SMA135里氏木霉轉(zhuǎn)化子在包含25ml纖維素酶誘導培養(yǎng)基的125ml帶擋板搖瓶中在PH6.0培養(yǎng)，接種轉(zhuǎn)化子的孢子，并在28°C和200rpm培養(yǎng)7天。使用里氏木霉RutC30作為對照。在第7天移出培養(yǎng)液樣品。在微型離心機中在15，700xg將一ml每種培養(yǎng)液離心5分鐘，并將上清液轉(zhuǎn)移至新管中。樣品在進行酶試驗前于4°C保存。使用對硝基苯基-β-D-葡萄吡喃糖苷作為底物測試上清液的β-葡糖苷酶活性，如下所述。使用在50mM琥珀酸ρΗ5.0中以110稀釋的培養(yǎng)物上清液的25μ1等分試樣，在溶于50mM琥珀酸ρΗ5.0中的200μ10.5mg/ml作為底物的對硝基苯基-β-D-葡萄吡喃糖苷中，在環(huán)境溫度確定β-葡糖苷酶活性。在15分鐘溫育后，通過加入100μ1IMTris-HClρΗ8.0而終止反應，并用分光光度計讀取405nm處的吸光度。一單位的葡糖苷酶活性對應于在PH5.0、環(huán)境溫度，每升每分鐘產(chǎn)生1微摩爾對硝基苯(p-nitrophenyl)。使用黑曲霉β-葡糖苷酶(N0V0ZYM188，NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark)作為酶標準。很多SMA135轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的β-葡糖苷酶活性是由里氏木霉RutC30分泌的酶活性的幾倍高。在篩選的SMA135轉(zhuǎn)化體中，轉(zhuǎn)化體SMA135-04產(chǎn)生最高的β-葡糖苷酶活性。用CRITERION系統(tǒng)(Bio-Rad，Hercules,CA,USA)，使用CRITERIONTris-HCl(5%解析)凝膠進行SDS-PAGE。將五微升第7天的上清液(見上文)懸浮于2X濃度的Laemmli樣品緩沖液(Bio-Rad，Hercules,CA,USA)中，并在存在5%β-巰基乙醇的情況下煮沸3分鐘。將上清液樣品上樣于聚丙烯酰胺凝膠并用IXTris/甘氨酸/SDS作87為電泳緩沖液(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)進行電泳。將得到的凝膠用BIO-,SAFE考馬斯染料(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)染色。在通過SDS-PAGE分析的38個里氏木霉SMA135轉(zhuǎn)化體中，26個產(chǎn)生約IlOkDa的蛋白質(zhì)，其在作為對照的里氏木霉RutC30中見不到。轉(zhuǎn)化體里氏木霉SMA135-04產(chǎn)生最高水平的β-葡糖苷酶，如通過由SDS-PAGE所見的IlOkDa條帶的豐度(abundance)所證明的。實施例7表達載體pSMail40的構(gòu)建通過用NcoI消化質(zhì)粒pSATelllBG41(W004/099228)，其攜帶米曲霉β-葡糖苷酶變體BG41全長編碼區(qū)(SEQIDNO17，其編碼SEQIDNO18的氨基酸序列)，構(gòu)建表達載體pSMail40。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳，使用TAE緩沖液分離得到的1243bp片段，并使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商的說明純化。用NcoI消化表達載體pSMai135，并通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳，使用TAE緩沖液分離8286bp片段，并使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商的說明純化。然后使用T4DNA連接酶(Roche,Indianapolis,IN,USA)，根據(jù)生產(chǎn)商的規(guī)程，將1243bp由NcoI消化的米曲霉β-葡糖苷酶變體BG41片段連接至8286bp載體片段，以產(chǎn)生表達載體pSMai140(圖10)。質(zhì)粒pSMai140包含里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)基因啟動子和終止子，其與特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V信號序列和米曲霉β-葡糖苷酶變體成熟編碼序列可操作連接。實施例8用pSMai140轉(zhuǎn)化里氏木霉RutC30用PmeI將質(zhì)粒pSMail40線性化，并轉(zhuǎn)化入如實施例6所述的里氏木霉RutC30菌株。從四次獨立的轉(zhuǎn)化實驗獲得共100個轉(zhuǎn)化體，所有轉(zhuǎn)化體在搖瓶中以纖維素酶誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)，并如實施例6所述由轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基測定β-葡糖苷酶活性。很多里氏木霉SMA140轉(zhuǎn)化體顯示出的β-葡糖苷酶活性為里氏木霉RutC30的幾倍高。通過如實施例6所述的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和對相同的13份培養(yǎng)物上清液考馬斯染色(由此分析酶活)，檢測培養(yǎng)基中是否存在米曲霉葡糖苷酶變體BG41蛋白質(zhì)。具有高葡糖苷酶活性的全部十三個轉(zhuǎn)化體還以不同的產(chǎn)率表達約IlOKDa米曲霉β-葡糖苷酶變體BG41。將如通過β-葡糖苷酶活性試驗和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳評價的，最高β_葡糖苷酶變體表達的轉(zhuǎn)化體，命名為里氏木霉SMA140-43。實施例9表達載體pSaMe-Fl的構(gòu)建用pMJ05為模板和下述所示引物，PCR擴增包含里氏木霉纖維二糖水解酶I基因啟動子的209bp和特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V基因的核心區(qū)(SEQIDNO15的核苷酸1至702，其編碼SEQIDNO16的氨基酸1至234；W091/17243)的DNA片段。引物995103:5'-cccaagcttagccaagaaca-3'(SEQIDNO99)引物995137:5'-gggggaggaacgcatgggatctggacggc-3'(SEQIDNO100)擴增反應液(50μ1)由下述物質(zhì)組成IXPfx擴增緩沖液，IOmMdNTP,50mMMgSO4,IOng/μ1pMJ05，50皮摩爾995103引物，50皮摩爾995137引物，和2單位PfxDNA聚合酶。在EPPENDORFMASTERCYOLER5333中溫育反應物，程序為94°C30秒，550C30秒，和72°C60秒的30個循環(huán)(3分鐘的最后延伸)。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳，使用TAE緩沖液分離反應產(chǎn)物，其中從凝膠切下9llbp的產(chǎn)物條帶，并使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商的說明純化。使用如下所示的引物，以pSMail40為模板，PCR擴增包含米曲霉β-葡糖苷酶變體BG41基因的806bp的DNA片段。引物995133:5'-gccgtccagatccccatgcgttcctccccc-3'(SEQIDNO101)引物995111:5'-ccaagcttgttcagagtttc-3'(SEQIDNO102)擴增反應液(50μ1)由下述物質(zhì)組成IXPfx擴增緩沖液，IOmMdNTP,50mMMgSO4,IOOngpSMail40，50皮摩爾995133引物，50皮摩爾995111引物，和2單位PfxDNA聚合酶。在EPPENDORFMASTERCYCLER5333中溫育反應物，程序為94°C30秒，550C30秒，和72°C120秒的30個循環(huán)(3分鐘的最后延伸)。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳，使用TAE緩沖液分離反應產(chǎn)物，其中從凝膠切下806bp的產(chǎn)物條帶，并使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商的說明純化。然后將上述兩個PCR片段進行重疊PCR。使用上述引物995103(有義)和引物995111(反義)，將純化的重疊片段用作擴增模板，通過重疊PCR將包含里氏木霉纖維二糖水解酶I基因啟動子的209bp和特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V核心序列的702bp片段精確融合至包含米曲霉β-葡糖苷酶變體BG41編碼區(qū)部分的806bp片段。擴增反應液(50μ1)由下述物質(zhì)組成IXPfx擴增緩沖液，IOmMdNTP,50mMMgSO4,2.5μ1每個片段(20ng/μ1)，50皮摩爾995103引物，50皮摩爾995111引物，和2單位高保真PfxDNA聚合酶。在EPPENDORFMASTERCYCLER5333中溫育反應物，程序為95°C3分鐘的初始變性，然后是30個循環(huán)的1分鐘變性，60°C1分鐘退火，和720C3分鐘延伸。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳，使用TAE緩沖液分離反應產(chǎn)物，其中從凝膠切下l.7kb的產(chǎn)物條帶，并使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商的說明純化。根據(jù)生產(chǎn)商說明，將1.7kb片段連接入pCR‘4Blunt載體(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)。然后根據(jù)生產(chǎn)商的快速化學轉(zhuǎn)化方法，將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入ONESHOTT0P10化學感受態(tài)大腸桿菌細胞(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)。選擇菌落并通過質(zhì)粒分離進行分析，并用HindIII消化以釋放1.7kb重疊PCR片段。用HindIII消化質(zhì)粒pSMail40以使質(zhì)粒線性化。使用快速DNA連接試劑盒，按照生產(chǎn)商的說明，將兩個經(jīng)消化的片段合并在連接反應物中，以產(chǎn)生PSaMe-Fl(圖11)。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-Blue亞克隆級感受態(tài)細胞(Stratagene，Lajolla，CA,USA)。通過對來自由已轉(zhuǎn)化大腸桿菌純化的質(zhì)粒的里氏木霉纖維二糖水解酶I基因啟動子、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V信號序列、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V核心、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V信號序列、米曲霉β-葡糖苷酶變體BG41，和里氏木霉纖維二糖水解酶I基因終止子序列進行DNA測序，確認構(gòu)建體的身份。將包含重組質(zhì)粒的一個克隆命名為PSaMe-Fl0質(zhì)粒pSaMe-Fl包含里氏木霉纖維二糖水解酶I基因啟動子和終止子，和與特異89腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V核心多肽直接連接的特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V信號肽序列，它們直接融合至與米曲霉葡糖苷酶變體BG41成熟編碼序列直接連接的特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V信號肽。米曲霉β-葡糖苷酶變體BG融合蛋白的DNA序列和推定的氨基酸序列分別如SEQIDNO103和104所示。實施例10用pSaMe-Fl轉(zhuǎn)化里氏木霉RutC30用5X107個里氏木霉RutC30孢子接種包含補加2%葡萄糖和IOmM尿苷的25mlYP培養(yǎng)基的搖瓶。在27°C和90rpm過夜培養(yǎng)約16小時后，使用真空驅(qū)動一次性過濾系統(tǒng)收集菌絲體，將菌絲體在IOOml去離子水中和1.2M山梨醇中各洗滌兩次。如實施例6中所述產(chǎn)生原生質(zhì)體。將用PmeI線性化的兩微克pSaMe_FlDNA,100μ1里氏木霉RutC30原生質(zhì)體，和50%PEG(4000)混合并在室溫溫育30分鐘。然后加入3mlSTC并將內(nèi)容物倒在補加IOmM尿苷的COVE平板上。然后在28°C溫育平板。到第6天開始出現(xiàn)轉(zhuǎn)化體，并將轉(zhuǎn)化體挑取到C0VE2平板，28°C生長6天。回收了22個里氏木霉轉(zhuǎn)化體。在搖瓶中以纖維素酶誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，并如實施例6所述測定β-葡糖苷酶活性。很多pSaMe-Fl轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生β-葡糖苷酶活性。一個命名為里氏木霉SaMeFl_9的轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的葡糖苷酶量最高，并且活性是表達米曲霉葡糖苷酶變體的菌株(實施例9)的兩倍。根據(jù)Beguin，1983，AnalyticalBiochem.131(2):333_336，使用羧甲基纖維素(CMC)覆蓋試驗測定內(nèi)切葡聚糖酶活性。將來自五個培養(yǎng)液樣品(具有最高的葡糖苷酶活性的那些)的五微克總蛋白質(zhì)在天然樣品緩沖液(Bio-Rad，Hercules,CA,USA)中稀釋，并在CRITERION8-16%Tris-HCl凝膠(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)上使用IOXTris/甘氨酸電泳緩沖液(Bio-Rad，Hercules,CA,USA)跑膠，然后將凝膠放在包含羧甲基纖維素酶(CMC)的平板頂部。在37°C溫育1小時后，用0.剛果紅將凝膠染色20分鐘。然后使用IMNaCl將平板脫色，以鑒定指示內(nèi)切葡聚糖酶活性的澄清區(qū)域?？梢妰蓚€澄清區(qū)，上面的區(qū)域約IlOkDa,下面的區(qū)域約25kDa。如果兩個蛋白質(zhì)未剪切并且仍為單一的多肽，特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V和米曲霉β-葡糖苷酶變體BG41融合體的預計蛋白質(zhì)大小為118kDa，單個內(nèi)切葡聚糖酶V核心域和β-葡糖苷酶的糖基化會導致每個蛋白質(zhì)遷移到比由一級序列預計的值更高的mw。如果兩個蛋白質(zhì)被剪切，那么特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V核心域的預計大小為24kDa，而米曲霉β-葡糖苷酶變體BG41的預計大小為94kDa。因為有IlOkDa的澄清區(qū)，這一結(jié)果說明內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶融合蛋白的群體作為單個的大蛋白質(zhì)最低限度地保持完整。下面的澄清區(qū)最可能代表內(nèi)源的內(nèi)切葡聚糖酶活性，并且可能額外由于特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V核心域從米曲霉β-葡糖苷酶部分剪切而產(chǎn)生。結(jié)果證明特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V核心即使與米曲霉β-葡糖苷酶連接也是有活性的。此外，葡糖苷酶活性的增加看來是由于與非融合葡糖苷酶分泌效率相比，蛋白質(zhì)分泌增加。通過將米曲霉葡糖苷酶變體BG41序列連接至有效分泌的特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V核心，分泌了更多的β-葡糖苷酶。實施例11載體pSaMe-FX的構(gòu)建通過修飾pSaMe-Fl而構(gòu)建質(zhì)粒pSaMe-FX。用BstZ17和EcoRI消化質(zhì)粒pSaMe-Fl，產(chǎn)生包含β-葡糖苷酶變體BG41變體編碼序列的Ikb片段和包含質(zhì)粒剩余部分的9.2kb片段。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳，使用TAE緩沖液分離片段，其中從凝膠切下9.2kb的產(chǎn)物條帶，并使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商的說明純化。質(zhì)粒pSMail35也用BstZ17和EcoRI消化，產(chǎn)生包含與米曲霉β_葡糖苷酶變體BG41編碼序列同源的堿基的Ikb片段和包含質(zhì)粒剩余部分的8.5kb片段。如上分離并純化Ikb片段。使用快速DNA連接試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商的說明將9.2kb和Ikb片段合并在連接反應中，產(chǎn)生pSaMe-FX，其除了包含野生型β-葡糖苷酶成熟編碼序列而不是變體成熟編碼序列之外，與pSaMe-Fl相同。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌SURE.感受態(tài)細胞(Stratagene，LaJolla,CA,USA)。通過對來自由已轉(zhuǎn)化大腸桿菌純化的質(zhì)粒的里氏木霉纖維二糖水解酶I基因啟動子、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V信號序列、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V核心序列、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V信號序列、米曲霉β_葡糖苷酶成熟編碼序列，和里氏木霉纖維二糖水解酶I基因終止子序列進行DNA測序，確認構(gòu)建體的身份。將包含重組質(zhì)粒的一個克隆命名為PSaMe-FX(圖12)。米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白的DNA序列和推定的氨基酸序列分別如SEQIDNO105和106所示。實施例12木霉屬轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)化和表達用PmeI將pSaMe-FX線性化并如實施例10所述轉(zhuǎn)化入里氏木霉RutC30菌株。一次轉(zhuǎn)化獲得共63個轉(zhuǎn)化體。在搖瓶中以纖維素酶誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，并如實施例6所述測定β-葡糖苷酶活性。很多PSaMe-FX轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生β-葡糖苷酶活性。一個命名為SaMe-FX16的轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的β-葡糖苷酶活性的量是里氏木霉SaMeFl_9(實施例10)的兩倍。實施例13里氏木霉轉(zhuǎn)化體的分析通過將特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V核心(包含其本身的天然信號序列)和與特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V信號序列連接的米曲霉β-葡糖苷酶變體BG41成熟編碼序列融合，如實施例9所述構(gòu)建融合蛋白。這個融合構(gòu)建體和與特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V信號序列連接的米曲霉β-葡糖苷酶變體BG41成熟編碼序列相比，分泌的葡糖苷酶活性增加兩倍。如實施例11所述制備由如下組成的第二個融合構(gòu)建體融合于與特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V信號序列連接的米曲霉野生型β-葡糖苷酶編碼序列的特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V核心(包含其本身的信號序列)組成，這進一步改善葡糖苷酶活性。用野生型融合體轉(zhuǎn)化的菌株相對于用葡糖苷酶變體BG41融合體轉(zhuǎn)化的菌株，具有兩倍的分泌的β-葡糖苷酶活性。實施例14將β-葡糖苷酶融合蛋白編碼序列克隆入米曲霉表達載體設(shè)計兩個合成寡核苷酸引物，如下所示，從編碼β-葡糖苷酶融合蛋白的PSaMeFXPCR擴增全長開放閱讀框。PCR正向引物5'-GGACTGCGCAGCATGCGTTC-3'(SEQIDNO107)PCR反向引物5，-AGTTAATTAATTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3，(SEQIDNO108)黑體字代表編碼序列。正向引物中加下劃線的“G”代表引入而產(chǎn)生SphI限制性位點的堿基變化。其余序列包含與PSaMeFX的插入位點相比的序列同一性。反向引物中加下劃線的序列代表加入以促進克隆入表達載體pAlLo2(W004/099228)的PacI限制性位點ο在PCR反應中使用上述引物各五十皮摩爾，反應物在50μ1終體積中包含50ngpSaMeFXDNA,IXPfx擴增緩沖液，6μ1IOmMdATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物，2.5單位PLATINUMPfxDNA聚合酶，和1μ150mMMgS04。使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333擴增片段，程序為98°C2分鐘的1個循環(huán)；和96°C30秒，61°C30秒，和68°C3分鐘的35個循環(huán)。在35個循環(huán)后，在68°C溫育反應物10分鐘，然后在10°C冷卻，直至進一步處理。使用TAE緩沖液和0.Iyg溴化乙錠每ml，在0.8%GTG-瓊月旨糖凝膠(CambrexBioproductsOneMeadowlandsPlazaEastRutherford,NJ,USA)上分離3.3kbPCR反應產(chǎn)物。在DARKREADER(ClareChemicalResearch,Dolores,CO,USA)輔助下顯示DNA，以避免UV誘導的突變。用一次性剃刀片剪切3.3kbDNA條帶，并用ULTRAFREE.-DA旋轉(zhuǎn)杯(Millipore，Billerica,MA,USA)，根據(jù)生產(chǎn)商的說明純化。將純化的3.3kbPCR產(chǎn)物克隆入pCR4Blunt-.TOPO載體(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)。將四微升純化的PCR產(chǎn)物與1μ12M氯化鈉溶液和1μ1TOPO載體混合。在室溫溫育反應物15分鐘，然后使用2μ1反應物，根據(jù)生產(chǎn)商的說明，轉(zhuǎn)化OneShotT0P10化學感受態(tài)大腸桿菌細胞。將83μ1各轉(zhuǎn)化反應物的三份等分試樣涂布在三個補加100μg氨芐青霉素每ml的150mm2XYT平板上，并在37°C過夜溫育。使用八個重組菌落，接種于包含3mlLB培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)基中，所述LB培養(yǎng)基補加100μg氨芐青霉素每ml。使用BIOROBOT9600(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)由這些培養(yǎng)基制備質(zhì)粒DNA。通過用PacI限制性酶消化而分析克隆。用PacI消化來自每個克隆的質(zhì)粒DNA，并使用TAE緩沖液通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。所有八個克隆都具有期望的限制性消化模式，并且選擇克隆5、6、7和8測序，確認克隆的插入物中沒有突變。它們5’和3’末端的序列分析表明所有4個克隆都具有正確的序列。選擇克隆5和7進行進一步測序。兩個克隆測序的PhredQ數(shù)值大于40，確保沒有PCR誘導的錯誤?？寺?和7顯示出具有期望的序列，并且選擇克隆5重新克隆入pAILo2中。通過用SphI消化而將來自克隆5的質(zhì)粒DNA線性化。然后通過加入1.2μ1IOmMdATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物和6單位T4DNA聚合酶(NewEnglandBioloabs,Inc.，Ipswich,MA,USA)而將線性化的克隆平端化。在12°C溫育混合物20分鐘，然后通過加入1μ10.5ΜEDTA并在75°C加熱20分鐘使酶失活以終止反應。如上所述通過凝膠電泳和超濾而純化編碼β-葡糖苷酶融合蛋白的3.3kb片段。通過用NcoI消化而將載體pAILo2線性化。然后通過加入0.5μ1IOmMdATP,dTTP、dGTP和dCTP的混合物和一單位DNA聚合酶I而使線性化的載體平端化。在25°C溫育混合物15分鐘，然后通過加入1μ10.5ΜEDTA并在75°C加熱15分鐘使酶失活而終止反應。然后用PacI消化載體。如上所述通過凝膠電泳和超濾而純化平端化的載體。用快速連接試劑盒將編碼葡糖苷酶融合蛋白的3.3kb片段克隆入線性化并純化的pAILo2載體。使用Iyl反應樣品根據(jù)生產(chǎn)商的說明轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLlOSOLOPACKGold細胞(Stratagene，LaJolla,CA,USA)在恢復期(recoveryperiod)后，將來自轉(zhuǎn)化反應物的兩份100μ1等分試樣涂布在兩個補加100μg氨芐青霉素每ml的150mm2XYT平板上，并在37°C過夜溫育。隨機從選擇平板上選擇一組八個推定的重組克隆，并使用BIOROBOT9600由每個克隆制備質(zhì)粒DNA。選擇克隆1-4，用pAILo2-特異性引物測序，以確認接合載體/插入物具有正確的序列?？寺?具有完美的載體/插入物接合，并命名為pAILo47(圖13)。為了產(chǎn)生無標記物的表達菌株，進行限制性內(nèi)切酶消化以將blaA基因與表達構(gòu)建體其余部分分離，所述blaA基因賦予對抗生素氨芐青霉素的抗性。用PmeI消化三十微克pAILo47。然后通過如上所述瓊脂糖電泳純化消化的DNA。用剃刀片切下包含表達構(gòu)建體但缺乏blaA基因的6.4kbDNA，并用QIAQUICK,凝膠提取試劑盒純化。實施例15特異腐質(zhì)霉/米曲霉cel45Acore-cel3A融合基因在米曲霉JaL355中的表達根據(jù)Christensen等，1988，Bio/Technology6:1419_1422的方法制備米曲霉JaL355(W000/240694)原生質(zhì)體。使用十微升純化的實施例14的表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)化米曲霉JaL355原生質(zhì)體。米曲霉JaL355的轉(zhuǎn)化得到約90個轉(zhuǎn)化體。將五十個轉(zhuǎn)化體分離到單獨的PDA平板，并在34°C溫育五天。用3ml0.01%TWEEN80洗滌四十八塊匯合的孢子平板，并使用孢子懸浮液接種125ml玻璃搖瓶中的25mlMDU2BP培養(yǎng)基。在34°C以200rpm恒定震蕩溫育轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)物。5天后，將每個培養(yǎng)物的Iml等分試樣以12，OOOxg離心并收集上清液。將每份上清液的五微升與相等體積的2X上樣緩沖液(10%β-巰基乙醇)混合，并載于1.5mm8%-16%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝膠上，并用BIO-SAFE考馬斯藍G250蛋白質(zhì)染料(Bio-Rad，Hercules,CA,USA)染色。培養(yǎng)液的SDS-PAGE譜表明48個轉(zhuǎn)化體中有33個能表達新蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)的表觀分子量與期望的IlSkDa非常接近。轉(zhuǎn)化體21產(chǎn)量最大，選擇它進行進一步的研究。實施例16米曲霉JaL355轉(zhuǎn)化體21的單孢子分離將米曲霉JaL355轉(zhuǎn)化體21孢子涂布在PDA平板上，并在34°C溫育5天。用0.5ml0.01%TWEEN80洗滌匯合的孢子平板其中一小部分，以重懸孢子。用0.01%TWEEN80將孢子懸浮液的100μ1等分試樣稀釋至終體積5ml。在血球計數(shù)器的幫助下，確定孢子濃度，并稀釋至終濃度為0.1孢子每微升。將孢子稀釋液的200μ1等分試樣涂布在150mm基本培養(yǎng)基平板并在34°C溫育2-3天。從平板切下出現(xiàn)的菌落并轉(zhuǎn)移至PDA平板，并在34°C溫育3天。然后將孢子涂布在平板上，并在34°C再溫育5天。用3ml0.01%TWEEN80洗滌匯合的孢子平板，并使用孢子懸浮液接種125ml玻璃搖瓶中的25mlMDU2BP培養(yǎng)基。在34°C以200rpm恒定震蕩溫育單孢子培養(yǎng)物。5天后，在12，OOOxg將每種培養(yǎng)物的Iml等分試樣離心，并收集它們的上清液。將五微升每份上清液與等體積的2X上樣緩沖液(10%β-巰基乙醇)混合，并載于1.5mm8%-16%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝膠上，并用BIO-SAFE考馬斯藍G250蛋白質(zhì)染料染色。培養(yǎng)液的SDS-PAGE譜顯示所有8個轉(zhuǎn)化體都能以非常高的水平表達β-葡糖苷酶融合蛋白，并且一種命名為米曲霉JaL355AILo47的培養(yǎng)物能產(chǎn)生最大的產(chǎn)量。實施例17:pCW087的構(gòu)建設(shè)計如下所示的兩個合成寡核苷酸引物，以從質(zhì)粒PDZA2-7PCR擴增桔橙嗜熱霉GH61A多肽基因(W02005/074656)。正向引物具有平端5，末端，并且反向引物在3，末端93并入PacI位點。正向引物5，-ATGTCCTTTTCCAAGATAATTGCTACTG-3，(SEQIDNO109)反向引物5，-GCTTAATTAACCAGTATACAGAGGAG-3，(SEQIDNO110)在PCR反應中使用上述引物各五十皮摩爾，反應物在50μ1終體積中包含50ngPDZA2-7,1μ1IOmMdATP、dTTP、dGTP和dCTP的混合物，5μIlOXACCUTAQDNA聚合酶緩沖液(Sigma-Aldrich，St.Louis，M0，USA)，和5單位ACCUTAQDNA聚合酶(Sigma-Aldrich，St.Louis,MO,USA)使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333擴增DNA片段，程序為95°C3分鐘的1個循環(huán)；94°C45秒，55°C60秒，和72°C1分鐘的30個循環(huán)。在25個循環(huán)后，在72°C溫育反應物10分鐘，然后在4°C冷卻，直至進一步處理。使用PacI消化桔橙嗜熱霉GH61APCR片段的3，末端。根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用MINELUTEReactionCleanup試劑盒(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)純化消化產(chǎn)物。用5’末端的平端NcoI位點和3’末端的PacI位點，將純化的GH61A片段直接克隆入pSMail55(W02005/074647)。用NcoI和PacI消化質(zhì)粒pSMail55。然后使用Klenow酶填充進5’凹陷的NcoI位點而使NcoI位點補平。Klenow反應物由20μ1pSmal55消化反應混合物加ImMdNTP和1μlKlenow酶組成，一起在室溫簡單溫育。根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用MINELUTEReactionCleanup試劑盒純化剛剛線性化的pSMail55質(zhì)粒。這些反應導致產(chǎn)生與新產(chǎn)生的GH61A片段相容的5’平末端和3’PacI位點。然后使用快速DNA連接試劑盒(Roche，Indianapolis,IN，USA)，按照生產(chǎn)商的說明，將GH61片段克隆入pSMail55表達載體。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-Blue亞克隆級感受態(tài)細胞(Stratagene，LaJolla,CA,USA)。通過將來自純化自轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的質(zhì)粒的GH61A編碼序列進行DNA測序而確認構(gòu)建體的身份。將包含重組質(zhì)粒的一個大腸桿菌克隆命名為PCW087-8。實施例18:pSaMe-Ta61A的構(gòu)建通過用NsiI消化攜帶amdS選擇性標記的質(zhì)粒pMJ09而構(gòu)建表達載體PSaMe-Ta61(W02005/056772)，其釋放了2.7kb的amdS片段。然后使用TAE緩沖液，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離2.7kbamdS片段，并使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒純化。用NsiI消化表達載體pCW087，使用TAE緩沖液，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離4.7kb片段，并使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒純化。然后使用T4DNA連接酶(Roche，Indianapolis,IN,USA)，根據(jù)生產(chǎn)商的規(guī)程，將2.7kbamdS片段連接至4.7kb載體片段，產(chǎn)生表達載體pSaMe-Ta61A。質(zhì)粒PSaMe_Ta61包含里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)基因啟動子和終止子，其與桔橙嗜熱霉GH6IA成熟編碼序列可操作地連接。實施例19里氏木霉菌株SaMe_MF268的構(gòu)建使用共轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒pSaMe-FX和pSaMe_Ta6IA導入里氏木霉RutC30。將質(zhì)粒pSaMe-FX和pSaMe_Ta61A通過PEG介導的轉(zhuǎn)化導入里氏木霉RutC30(Penttila等，1987，見上文)。每個質(zhì)粒包含構(gòu)巢曲霉amdS基因，以使轉(zhuǎn)化體能以乙酰胺為唯一氮源而生長。在27°C和90rpm，在補加2%(w/v)葡萄糖和IOmM尿苷的25mlYP培養(yǎng)基中培養(yǎng)里氏木霉RutC3017小時。使用真空驅(qū)動一次性過濾系統(tǒng)過濾而收集菌絲體，并用去離子94水洗滌兩次，用1.2M山梨醇洗滌兩次。通過將已洗滌的菌絲體懸浮于20ml1.2M山梨醇中而產(chǎn)生原生質(zhì)體,所述山梨醇包含I5mgGLUCANEX(NovozymesA/s,Bagsvaerd,Denmark)每ml和0.36單位殼多糖酶(SigmaChemicalCo.，St.Louis,MO,USA)每ml,并在34°C以90rpm溫和震蕩溫育15-25分鐘。通過在400xg離心7分鐘而收集原生質(zhì)體，并用冷1.2M山梨醇洗滌兩次。使用血球計數(shù)器為原生質(zhì)體計數(shù)，并將其重懸于STC中至終濃度為IXlO8原生質(zhì)體每ml。將過量的原生質(zhì)體于_80°C保存在Cryo1°CFreezingContainer(Nalgene,Rochester,NY,USA)中。用PmeI消化約各4μg質(zhì)粒pSaMe-FX和PSaMe_Ta61A，以促進去除抗生素抗性標記ampR。在用PmeI消化后，使用TAE緩沖液在1%瓊脂糖凝膠上將線性片段跑膠，以分離各個片段。從凝膠切下來自PSaMe-FX的7.5kb片段和來自pSaMe-Ta61A的4.7kb片段，并根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用QIAquick凝膠提取試劑盒純化。這些純化的片段包含amdS選擇性標記盒，里氏木霉cbhl基因啟動子和終止子；此外，片段包括特異腐質(zhì)霉EGV核心/米曲霉BG融合編碼序列或桔橙嗜熱霉GH61A編碼序列。轉(zhuǎn)化中使用的片段不包含抗生素標記，因為這個凝膠純化步驟去除了ampR片段。然后向100μ1原生質(zhì)體溶液加入純化片段，并溫和混合，之后加入260μ1PEG緩沖液，混合，并在室溫溫育30分鐘。然后加入STC(3ml)并混合，并將轉(zhuǎn)化溶液涂布在使用amdS選擇的COVE平板上。在28°C溫育平板5_7天。將轉(zhuǎn)化體在C0VE2平板上傳代培養(yǎng)，并在28°C生長。將超過400個轉(zhuǎn)化體在包含乙酰胺的新鮮平板上傳代培養(yǎng)，并在28°C7天產(chǎn)生孢子。在包含25ml纖維素酶誘導培養(yǎng)基的125ml帶擋板搖瓶中培養(yǎng)里氏木霉轉(zhuǎn)化體，所述培養(yǎng)基在PH6.0接種轉(zhuǎn)化體的孢子，并在28°C和200rpm培養(yǎng)5天。將里氏木霉RutC30作為對照。在第5天移出培養(yǎng)液樣品。將各一毫升培養(yǎng)液在微型離心機中以15，700xg離心5分鐘，并將上清液轉(zhuǎn)移至新管。使用CRITERIONTris-HCl(5%解析)凝膠，用CRITERION系統(tǒng)進行SDS-PAGE。將五微升第5天的上清液(見上文)懸浮于2X濃度的Laemmli樣品緩沖液(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)中，并在存在5%β-巰基乙醇的情況下煮沸3分鐘。將上清液樣品載于聚丙烯酰胺凝膠上，并用IXTris/甘氨酸/SDS作為電泳緩沖液(Bio-Rad，Hercules,CA,USA)進行電泳。將得到的凝膠用BIO-SAFE考馬斯染料染色。然后在PCS水解反應中測試轉(zhuǎn)化體以鑒定產(chǎn)生最佳水解培養(yǎng)液的菌株，所述轉(zhuǎn)化體顯示桔橙嗜熱霉GH61A多肽和融合蛋白表達，該融合蛋白由與米曲霉β-葡糖苷酶融合的特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V核心(Cel45A)組成，如通過觀察SDS-PAGE凝膠上的條帶所見。實施例20里氏木霉菌株SaMe_MF268的鑒定在包含25ml纖維素酶誘導培養(yǎng)基的125ml帶擋板搖瓶中培養(yǎng)顯示桔橙嗜熱霉GH61A多肽和米曲霉葡糖苷酶融合蛋白的表達的轉(zhuǎn)化體，所述培養(yǎng)基在pH6.0接種轉(zhuǎn)化體的孢子，并在28°C和200rpm溫育5天。在6000xg離心搖瓶培養(yǎng)液，并使用STERICUPEXPRESS(Millipore,Bedford,MA,USA)在水解前過濾至0.22μm。通過水解PCS并產(chǎn)生糖的能力來測定培養(yǎng)液的活性，所述糖可通過對其還原末端進行化學測定來檢測。在美國能源部國家可再生能源實驗室(U.S.DepartmentofEnergy95NationalRenewableEnergyLaboratory(NREL),Boulder,CO,USA)使用稀硫酸預處理玉米秸稈。使用下述條件預處理0.048g硫酸/g干燥生物質(zhì)，在190°C，重量百分比為25%干燥固體，約1分鐘。經(jīng)預處理的玉米秸稈(PCS)中不溶于水的固體包含59.2%纖維素，如通過有限消化PCS以釋放葡萄糖和纖維二糖而確定的。在酶水解前，用大體積雙去離子水洗滌PCS；水洗PCS的干重為17.73%。將Ikg量的PCS懸浮于約20升雙去離子水中并且，在PCS沉淀后，將水傾析。重復這個過程直至洗滌水為PH4.0以上，此時還原糖低于0.06g每升。對于小體積實驗(例如，lml)，通過100目篩子篩沉淀的漿料，確保能移取。經(jīng)洗滌的PCS的百分比干重含量通過將樣品在105°C烘箱干燥至少24小時(至恒重)并與濕重相比而確定。在由ALPS300自動實驗室封板儀(ABgeneInc.，Rochester，NY，USA)加熱密封的96孔深孔板中，以Iml體積進行PCS水解。在50mM乙酸鈉pH5.0中的PCS濃度為IOg每升。在50°C進行PCS水解，除了在所述取樣過程中之外無其它攪拌。每個反應重復進行三次。通過對-羥基苯甲酸酰胼(PHBAH)試劑，如下所述分析釋放的還原糖。將體積為0.8ml的PCS(12.5g每升水中)移取到96孔深孔板的每個孔中，然后加入0.IOml0.5M乙酸鈉pH5.0，并且然后加入0.IOml稀釋的酶溶液以啟動反應，最終反應體積為10ml，PCS濃度為IOg每升。將板密封。通過在水解開始時和每次取樣時間點前倒置深孔板而使反應混合物混合。在每個取樣時間點，將板混合，然后在2000rpm將深孔板離心(SorvallRT7，配備RTH-250轉(zhuǎn)子)10分鐘，然后移出20μ1水解物(上清液)，并加入96孔微孔板中的180μ10.4%NaOH中。必要時，可將這個終止溶液進一步稀釋至還原糖的正確范圍。通過對_羥基苯甲酸酰胼試劑(PHBAH，Sigma，4-羥基苯甲酰胼)分析釋放的還原糖將50μ1PHBAH試劑(1.5%)與100μ1樣品在V型底96孔THERM0WELL板(Costar6511)中混合，在板加熱塊上在95°C溫育10分鐘，然后向每個孔加入50μ1雙去離子水，混合并將100μ1轉(zhuǎn)移至另一塊平底96孔板(Costar9017)，并在410nm處讀取吸收值。使用葡萄糖校準曲線在相同條件下計算還原糖。纖維素轉(zhuǎn)化成還原糖的百分比轉(zhuǎn)化率計算為%轉(zhuǎn)化率=還原糖(mg/ml)/(加入的纖維素(mg/ml)xl.11)因子1.11修正將纖維素水解成葡萄糖中的重量增加。在lmlPCS水解測試后，將最好的候選菌株在2升發(fā)酵罐中生長，重復兩次(induplicate)。搖瓶培養(yǎng)基由每升20g葡萄糖，IOg玉米漿固體，1.45g(NH4)2S04，2.08gKH2PO4,0.36gCaCl2,0.42gMgSO4·7Η20，和0.42ml痕量金屬溶液組成。痕量金屬溶液由每升216gFeCl3·6H20，58gZnSO4·7H20，27gMnSO4·H2O,IOgCuSO4·5Η20，2·4gH3BO3,禾口336g檸檬酸組成。向500ml搖瓶中加入十毫升搖瓶培養(yǎng)基。用來自固體平板培養(yǎng)物的兩塊瓊脂塊接種搖瓶，并在28°C在定軌搖床上以200rpm溫育48小時。使用五十毫升搖瓶培養(yǎng)液接種3升發(fā)酵容器。發(fā)酵分批培養(yǎng)基由每升30g纖維素，4g葡萄糖，IOg玉米漿固體，3.Sg(NH4)2SO4,2.8gKH2PO4,2.64gCaCl2,1.63gMgSO4·7Η20，1.8ml消泡劑，和0·66ml痕量金屬溶液組成。痕量金屬溶液由每升216gFeCl3·6H20,58gZnS04·7H20，27gMnSO4·H2O,IOgCuSO4·5H20，2.4gH3BO3，和336g檸檬酸組成。發(fā)酵補料培養(yǎng)基由葡萄糖和纖維素組成。向3升發(fā)酵罐中加入共1.8升的發(fā)酵批式培養(yǎng)基。以0至4g/l/小時的速率在165小時的期間內(nèi)補加發(fā)酵補料培養(yǎng)基。發(fā)酵容器保持在28°C的溫度，并且pH控制在4.75+/-0.1的設(shè)置點。以Ivvm的速率向容器加入空氣，并通過Ruston葉輪在1100至1300rpm旋轉(zhuǎn)而攪拌培養(yǎng)液。在發(fā)酵結(jié)束時，從容器收獲全部培養(yǎng)液，并以3000rpmxg離心去除生物質(zhì)。將上清液無菌過濾并在35至40°C保存。確定總蛋白質(zhì)濃度，并如下所述在50gPCS水解反應中重復測試培養(yǎng)液。在每次實驗前，由保存于4°C的儲備酶溶液新鮮制備酶稀釋液。根據(jù)NREL實驗室分析規(guī)程#008，使用50g的總反應物質(zhì)量，使用帶螺旋蓋的125mlErlenmeyer三角瓶(VWR，WestChester,PA,USA)進行PCS的水解。在這個規(guī)程中，使用不同蛋白質(zhì)加載量(用mg蛋白質(zhì)每克纖維素表示)的2升發(fā)酵培養(yǎng)液樣品進行PCS(在50mM乙酸鈉pH5.0緩沖水溶液中約11.4的PCS和6.8%的纖維素)的水解。在50°C使用INNOVA4080培養(yǎng)箱(NewBrunswickScientific,Edison,NJ,USA)以150rpm的定軌振蕩進行PCS水解能力的測試。在水解過程中，在72、120和168小時取等分試樣并離心，并且使用MULTISCREENHV0·45μπι膜(Millipore，Billerica,MA,USA)通過SORVALLRT7板離心機(ThermoFisherScientific,ffaltham,MA,USA)在2000rpm離心10分鐘過濾上清液。在不立即使用時，將過濾的含糖等分試樣在-20°C冷凍。通過0.005MH2SO4以0.4ml每分鐘的流速在65"C從4.6x250mmAMINEXHPX-87H柱(Bio-Rad，Hercules,CA,USA)洗脫，并使用以純糖樣品校準的CHEMSTATIONAGILENT1100HPLC(AgilentTechnologies,SantaClara，CA,USA)，由折射系數(shù)檢測通過積分葡萄糖和纖維二糖信號而定量后，測量稀釋于0.005MH2SO4的樣品的糖濃度。所得的等同物用于計算每個反應的纖維素轉(zhuǎn)化的百分數(shù)。使用下述等式計算纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖與纖維二糖的程度(轉(zhuǎn)化率，％)轉(zhuǎn)化率=(葡萄糖+纖維二糖xl.053)(mg/ml)X100X162/(纖維素(mg/ml)xl80)=(葡萄糖+纖維二糖xl-053)(mg/ml)X100/(纖維素(mg/ml)xl.Ill)在這個等式中，因子1.111反映在將纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖的過程中的重量增加，而因子1.053反映將纖維二糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖的過程中的重量增加。在上述50g三角瓶實驗中PCS水解反應的結(jié)果如表1所示。將產(chǎn)生最佳性能的培養(yǎng)液的一株菌命名為里氏木霉SaMe-MF268。表1在168小時的時間點轉(zhuǎn)化為糖的百分比權(quán)利要求絲狀真菌宿主細胞，其包含(a)編碼具有增強纖維素分解的活性的天然或異源多肽的第一多核苷酸；(b)編碼天然或異源β葡糖苷酶的第二多核苷酸；和(c)編碼選自下組的天然或異源纖維素分解酶的一個或多個(幾個)第三多核苷酸里氏木霉(Trichodermareesei)纖維二糖水解酶I(CEL7A)、里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)，和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)，和它們的直向同源物或變體。2.權(quán)利要求1的絲狀真菌宿主細胞，其中具有增強纖維素分解的活性的多肽選自下組(a)包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]禾口[Fff]-[TF]-K-[AIV]的具有增強纖維素分解的活性的多肽，其中X是任何氨基酸，X(4，5)是4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，并且X(4)是4個鄰接位置上的任何氨基酸；和(b)包含[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-χ(3)-A-[HNQ]的具有增強纖維素分解的活性的多肽，其中χ是任何氨基酸，χ(4，5)是4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，并且χ(3)是3個鄰接位置上的任何氨基酸；其中包含[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]禾口[Fff]-[TF]-K-[AIV]的具有增強纖維素分解的活性的多肽可選地進一步包含H-X(l,2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]，[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，或H-X(l,2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]禾口[EQ]-Χ—Υ—Χ(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，其中X是任何氨基酸，X(l,2)是1個位置或2個鄰接位置上的任何氨基酸，X(3)是3個鄰接位置上的任何氨基酸，并且X(2)是2個鄰接位置上的任何氨基酸。3.權(quán)利要求1的絲狀真菌宿主細胞，其中具有增強纖維素分解的活性的多肽選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8，或SEQIDNO10,SEQIDN0:12，或SEQIDNO:14的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，和甚至最優(yōu)選至少95%同一性的氨基酸序列；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選至少高嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO=USEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11或SEQIDNO13的成熟多肽編碼序列，()包含在SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO5或SEQIDNO11的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或者包含SEQIDNO:7、SEQIDNO:9或SEQIDNO13的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈；(c)多肽,其由包含與SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDNO5,SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDN0:11或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；(d)SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDNO:8，或SEQIDNO:10、SEQIDN0:12，或SEQIDNO:14的成熟多肽中包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體；和(e)具有增強纖維素分解的活性的多肽，其包含或組成為SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDN0:6、SEQIDNO:8，或SEQIDNO10、SEQIDNO:12，或SEQIDNO14的成熟多肽，或者其具有增強纖維素分解的活性的片段。4.權(quán)利要求1的絲狀真菌宿主細胞，其中所述β-葡糖苷酶是β-葡糖苷酶融合蛋白。5.權(quán)利要求4的絲狀真菌宿主細胞，其中所述β-葡糖苷酶融合蛋白包含(a)包含信號肽的第一氨基酸序列；(b)至少包含內(nèi)切葡聚糖酶的催化域的第二氨基酸序列；和(c)至少包含β-葡糖苷酶的催化域的第三氨基酸序列；其中第一氨基酸序列的C-末端以符合讀框的方式連接至第二氨基酸序列的N-末端，并且第二氨基酸序列的C-末端以符合讀框的方式連接至第三氨基酸序列的N-末端。6.權(quán)利要求5的絲狀真菌宿主細胞，其中所述β-葡糖苷酶融合蛋白包含或組成為SEQIDNO103或SEQIDNO:105。7.權(quán)利要求1的絲狀真菌宿主細胞，其中所述里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)的直向同源物或變體選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO:52的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的氨基酸序列；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選至少高嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDN0:51的成熟多肽編碼序列，()包含在SEQIDNO51的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或者包含SEQIDNO51的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或者(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈；(c)多肽，其由包含與SEQIDNO:51的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；(d)SEQIDNO52的成熟多肽中包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。8.權(quán)利要求1的絲狀真菌宿主細胞，其中所述里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)包含或組成為SEQIDNO52的成熟多肽。9.權(quán)利要求1的絲狀真菌宿主細胞，其中所述里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)的直向同源物或變體選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO:54的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的氨基酸序列；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選至少高嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDN0:53的成熟多肽編碼序列，()包含在SEQIDNO53的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或者包含SEQIDNO53的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或者(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈；(c)多肽，其由包含與SEQIDNO:53的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；和(d)SEQIDNO:54的成熟多肽中包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。10.權(quán)利要求1的絲狀真菌宿主細胞，其中所述里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)包含或組成為SEQIDNO54的成熟多肽。11.權(quán)利要求1的絲狀真菌宿主細胞，其中所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)的直向同源物或變體選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO:56的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的氨基酸序列；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選至少高嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDN0:55的成熟多肽編碼序列，(ii)包含在SEQIDNO:55的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或者包含SEQIDNO55的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或者(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；(c)多肽，其由包含與SEQIDNO:55的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；(d)SEQIDNO56的成熟多肽中包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。12.權(quán)利要求1的絲狀真菌宿主細胞，其中所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)包含或組成為SEQIDNO56的成熟多肽。13.權(quán)利要求1-12中任一項的絲狀真菌宿主細胞，其進一步包含一個或多個(幾個)第四多核苷酸，其編碼選自下組的纖維素分解酶里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(CEL5A)、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(CEL12A)，和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(CEL45A)，和它們的直向同源物或變體。14.權(quán)利要求13的絲狀真菌宿主細胞，其中所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(CEL5A)的直向同源物或變體選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO:58的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的氨基酸序列；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中_高嚴緊條件下，和最優(yōu)選至少高嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO57的成熟多肽編碼序列，(ii)包含在SEQIDNO57的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或者包含SEQIDNO57的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或者(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈；(c)多肽，其由包含與SEQIDNO:57的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；和(d)SEQIDNO58的成熟多肽中包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。15.權(quán)利要求13的絲狀真菌宿主細胞，其中所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(CEL5A)包含或組成為SEQIDNO58的成熟多肽。16.權(quán)利要求13的絲狀真菌宿主細胞，其中所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(CEL12A)的直向同源物或變體選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO:60的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的氨基酸序列；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選至少高嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDN0:59的成熟多肽編碼序列，()包含在SEQIDNO59的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或者包含SEQIDNO59的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或者(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈；(c)多肽，其由包含與SEQIDNO:59的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；(d)SEQIDNO60的成熟多肽中包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。17.權(quán)利要求13的絲狀真菌宿主細胞，其中所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(CEL12A)是包含或組成為SEQIDNO60的成熟多肽。18.權(quán)利要求13的絲狀真菌宿主細胞，其中所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(CEL45A)的直向同源物或變體選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO:62的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的氨基酸序列；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選至少高嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDN0:61的成熟多肽編碼序列，()包含在SEQIDNO61的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或者包含SEQIDNO61的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或者(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈；(c)多肽，其由包含與SEQIDNO61的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；和(d)SEQIDNO:62的成熟多肽中包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。19.權(quán)利要求13的絲狀真菌宿主細胞，其中所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(CEL45A)是包含或組成為SEQIDNO61的成熟多肽。20.權(quán)利要求1的絲狀真菌宿主細胞，其產(chǎn)生纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，所述組合物包含SEQIDNO:8的成熟多肽的具有增強纖維素分解的活性的多肽；SEQIDN0:106的β-葡糖苷酶融合蛋白；SEQIDNO52的成熟多肽的里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)，SEQIDNO:54的成熟多肽的里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)JPSEQIDNO:56的成熟多肽的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)。21.權(quán)利要求1-20中任一項的絲狀真菌宿主細胞，其還產(chǎn)生選自下組的一個或多個(幾個)酶SEQIDNO58的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(CEL5A)，SEQIDNO62的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(CEL45A)，和SEQIDNO:60的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(CEL12A)。22.權(quán)利要求1-21中任一項的絲狀真菌宿主細胞，其還產(chǎn)生SEQIDNO64的成熟多肽的土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)纖維二糖水解酶。23.產(chǎn)生纖維素分解蛋白質(zhì)組合物的方法，其包含(a)在有益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求1-22中任一項的宿主細胞；和(b)回收所述多肽。24.通過權(quán)利要求23的方法獲得的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物。25.纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，其包含(a)具有增強纖維素分解的活性的多肽；(b)β-葡糖苷酶；和(c)一個或多個(幾個)選自下組的纖維素分解酶里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)，里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)，和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)，和它們的直向同源物或變體。26.權(quán)利要求25的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，其中具有增強纖維素分解的活性的多肽選自下組(a)包含[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]禾口[Fff]-[TF]-K-[AIV]的具有增強纖維素分解的活性的多肽，其中X是任何氨基酸，X(4，5)是4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，并且X(4)是4個鄰接位置上的任何氨基酸；和(b)包含[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-χ(3)-A-[HNQ]的具有增強纖維素分解的活性的多肽，其中χ是任何氨基酸，χ(4，5)是4或5個鄰接位置上的任何氨基酸，并且χ(3)是3個鄰接位置上的任何氨基酸；其中包含[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]禾口[Fff]-[TF]-K-[AIV]的具有增強纖維素分解的活性的多肽還包含H-X(l,2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]，[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，或H-X(l,2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]禾口[EQ]-Χ—Υ—Χ(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，其中X是任何氨基酸，X(l,2)是1個位置或2個鄰接位置上的任何氨基酸，X(3)是3個鄰接位置上的任何氨基酸，并且X(2)是2個鄰接位置上的任何氨基酸。27.權(quán)利要求25的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，其中具有增強纖維素分解的活性的多肽選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDN0:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8，或SEQIDNO:10，SEQIDNO:12，或SEQIDNO:14的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的氨基酸序列；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選至少高嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO=USEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11，或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列，()包含在SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO5或SEQIDNO11的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或者包含SEQIDNO:7、SEQIDNO:9，或SEQIDNO13的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或者(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈；(c)多肽,其由包含與SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDNO5,SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDN0:11，或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；(d)SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDNO:8，或SEQIDNO:10、SEQIDN0:12，或SEQIDNO:14的成熟多肽中包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體；和(e)具有增強纖維素分解的活性的多肽，所述多肽包含或組成為SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8，或SEQIDNO:10、SEQIDNO12，或SEQIDNO14的成熟多肽；或者其具有增強纖維素分解的活性的片段。28.權(quán)利要求25的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，其中所述β-葡糖苷酶是葡糖苷酶融合蛋白。29.權(quán)利要求28的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，其中所述葡糖苷酶融合蛋白包含(a)包含信號肽的第一氨基酸序列；(b)至少包含內(nèi)切葡聚糖酶的催化域的第二氨基酸序列；和(c)至少包含葡糖苷酶的催化域的第三氨基酸序列；其中第一氨基酸序列的C-末端以符合讀框的方式連接至第二氨基酸序列的N-末端，并且第二氨基酸序列的C-末端以符合讀框的方式連接至第三氨基酸序列的N-末端。30.權(quán)利要求29的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，其中所述葡糖苷酶融合蛋白包含或組成為SEQIDNO103或SEQIDNO:105。31.權(quán)利要求25的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，其中所述里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)的直向同源物或變體選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO52的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的氨基酸序列；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選至少高嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDN0:51的成熟多肽編碼序列，()包含在SEQIDNO51的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或者包含SEQIDNO51的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或者(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈；(c)多肽，其由包含與SEQIDN0:51的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；和(d)SEQIDNO52的成熟多肽中包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。32.權(quán)利要求25的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，其中所述里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)包含或組成為SEQIDNO52的成熟多肽。33.權(quán)利要求25的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，其中所述里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)的直向同源物或變體選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO54的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的氨基酸序列；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選至少高嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDN0:53的成熟多肽編碼序列，()包含在SEQIDNO53的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或者包含SEQIDNO53的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或者(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈；(c)多肽，其由包含與SEQIDNO:53的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；和(d)SEQIDNO:54的成熟多肽中包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。34.權(quán)利要求25的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，其中所述里氏木霉纖維二糖水解酶IKCEL6A)包含或組成為SEQIDNO54的成熟多肽。35.權(quán)利要求25的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，其中所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)的直向同源物或變體選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO:56的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的氨基酸序列；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選至少高嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDN0:55的成熟多肽編碼序列，()包含在SEQIDNO:55的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或者包含SEQIDNO55的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或者(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；(c)多肽，其由包含與SEQIDNO:55的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；和(d)SEQIDNO56的成熟多肽中包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。36.權(quán)利要求25的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，其中所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)包含或組成為SEQIDNO56的成熟多肽。37.權(quán)利要求25-36中任一項的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，其進一步包含一個或多個(幾個)第四多核苷酸，其編碼選自下組的纖維素分解酶里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(CEL5A)、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(CEL12A)，和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(CEL45A)，和它們的直向同源物或變體。38.權(quán)利要求37的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，其中所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IKCEL5A)的直向同源物或變體選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO58的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的氨基酸序列；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選至少高嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDN0:57的成熟多肽編碼序列，()包含在SEQIDNO57的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或者包含SEQIDNO57的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或者(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；(c)多肽，其由包含與SEQIDNO:57的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；和(d)SEQIDNO58的成熟多肽中包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。39.權(quán)利要求37的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，其中所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IKCEL5A)包含或組成為SEQIDNO58的成熟多肽。40.權(quán)利要求37的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，其中所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IIKCEL12A)的直向同源物或變體選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO:60的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的氨基酸序列；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選至少高嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDN0:59的成熟多肽編碼序列，(ii)包含在SEQIDNO:59的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或者包含SEQIDNO59的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或者(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈；(c)多肽，其由包含與SEQIDNO:59的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；(d)SEQIDNO60的成熟多肽中包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。41.權(quán)利要求37的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，其中所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IIKCEL12A)是包含或組成為SEQIDNO60的成熟多肽。42.權(quán)利要求37的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，其中所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(CEL45A)的直向同源物或變體選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO:62的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的氨基酸序列；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在優(yōu)選至少中嚴緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴緊條件下，并且最優(yōu)選至少高嚴緊條件下與以下雜交(i)SEQIDN0:61的成熟多肽編碼序列，()包含在SEQIDNO61的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或者包含SEQIDNO61的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或者(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈；(c)多肽，其由包含與SEQIDNO:61的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少85%，最優(yōu)選至少90%，并且甚至最優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼；和(d)SEQIDNO62的成熟多肽中包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。43.權(quán)利要求37的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，其中里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(CEL45A)是包含或組成為SEQIDNO61的成熟多肽。44.權(quán)利要求25的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，其包含SEQIDNO:8的成熟多肽的具有增強纖維素分解的活性的多肽；SEQIDNO:106的β-葡糖苷酶融合蛋白；SEQIDΝ0:52的成熟多肽的里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)，SEQIDNO:54的成熟多肽的里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)，和SEQIDNO56的成熟多肽的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)。45.權(quán)利要求25-44中任一項的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，其進一步包含選自下組的一個或多個(幾個)酶SEQIDNO:58的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(CEL5A)，SEQIDN0:62的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(CEL45A)，和SEQIDNO60的里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(CEL12A)。46.權(quán)利要求25-45中任一項的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物，其進一步包含SEQIDNO64的成熟多肽的土生梭孢霉纖維二糖水解酶。47.用于降解或轉(zhuǎn)化含纖維素材料的方法，其包括用有效量的權(quán)利要求25-46中任一項的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物處理所述含纖維素材料。48.權(quán)利要求47的方法，其進一步包括用有效量的選自下組的一種或多種(幾種)酶處理含纖維素材料半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、過氧化物酶，或它們的混合物。49.權(quán)利要求47或48的方法，其進一步包括回收降解的含纖維素材料。50.用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括(a)用有效量的權(quán)利要求25-46中任一項的纖維素分解蛋白質(zhì)組合物糖化含纖維素材料；(b)用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵步驟(a)的經(jīng)糖化的含纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(c)從發(fā)酵回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。51.權(quán)利要求50的方法，其進一步包括用有效量的選自下組的一種或多種(幾種)酶處理所述含纖維素材料半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、過氧化物酶，或它們的混合物。全文摘要本發(fā)明涉及用于降解或轉(zhuǎn)化含纖維素材料的纖維素分解組合物，和產(chǎn)生與使用所述組合物的方法。所述組合物包含(a)具有增強纖維素分解的活性的多肽(b)β-葡糖苷酶和(c)選自下組的一個或多個纖維素分解酶里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I，和它們的變體。文檔編號C12P7/06GK101970651SQ200880101371公開日2011年2月9日申請日期2008年5月30日優(yōu)先權(quán)日2007年5月31日發(fā)明者喬爾·徹里,基思·麥克法蘭,桑德拉·梅里諾,薩拉·泰特申請人:諾維信股份有限公司