專利名稱：使用n-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶的o-聯(lián)糖基化的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
本申請(qǐng)根據(jù)35U.S.C.§119(e)要求2007年6月4日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/941,926的優(yōu)先權(quán)，所述專利申請(qǐng)通過提及而以其整體合并入本文以用于所有目的。
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及通過糖基化來進(jìn)行肽修飾的領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及包含聚合物修飾基團(tuán)的肽綴合物，以及通過使用糖基化序列來制備經(jīng)糖基化的肽的方法，所述糖基化序列被GlcNAc轉(zhuǎn)移酶識(shí)別為底物。

背景技術(shù)：
施用糖基化的和非糖基化的多肽以引起特定生理學(xué)應(yīng)答是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中公知的。例如，純化的和重組的hGH都用于治療與hGH缺乏相關(guān)的病狀和疾病，如兒童中的侏儒癥。其他例子涉及已知具有抗病毒活性的干擾素，以及刺激白細(xì)胞產(chǎn)生的粒細(xì)胞集落刺激因子。
缺少可用于生產(chǎn)具有野生型糖基化模式的多肽的表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)限制了將此類多肽用作治療劑。本領(lǐng)域已知，不正確或不完全糖基化的肽可能是免疫原性的，這導(dǎo)致該肽的中和和/或變態(tài)反應(yīng)的形成。重組產(chǎn)生的糖肽的其他缺點(diǎn)包括亞最佳的功效和從血流中的快速清除。
一種解決在生產(chǎn)經(jīng)糖基化的肽治療劑方面所固有的問題的方法是在其表達(dá)后在體外修飾這些肽。多肽的表達(dá)后體外修飾已經(jīng)被用于修飾現(xiàn)有的聚糖結(jié)構(gòu)和將糖基部分附著至非糖基化的氨基酸殘基。已經(jīng)可以廣泛選擇重組真核生物糖基轉(zhuǎn)移酶，這使得在體外酶促合成具有定制的糖基化模式和糖基結(jié)構(gòu)的哺乳動(dòng)物糖綴合物成為可能。參見例如，美國專利號(hào)5,876,980；6,030,815；5,728,554；5,922,577；以及WO/9831826；US2003180835；和WO 03/031464。
此外，多肽已經(jīng)用一種或多種非糖修飾基團(tuán)例如水溶性聚合物來進(jìn)行衍生化。已經(jīng)被綴合至肽的示例性聚合物是聚(乙二醇)(“PEG”)。PEG-綴合(其增加多肽的分子大小)已被用于降低免疫原性和延長PEG-綴合的多肽保持在循環(huán)中的時(shí)間。例如，Davis等人的美國專利號(hào)4,179,337公開了偶聯(lián)至聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)的非免疫原性多肽，如酶和肽-激素。
將PEG和其衍生物附著至多肽的主要方法涉及通過氨基酸殘基的非特異性鍵合(參見例如，美國專利號(hào)4,088,538、美國專利號(hào)4,496,689、美國專利號(hào)4,414,147、美國專利號(hào)4,055,635和PCT WO87/00056)。另一種PEG-綴合方法涉及糖肽的糖基殘基的非特異性氧化(參見例如，WO 94/05332)。
在這些非特異性方法中，PEG以隨機(jī)且非特異性的方式加入到在多肽主鏈上的反應(yīng)性殘基上。該方法具有顯著缺點(diǎn)，包括終產(chǎn)物缺少同質(zhì)性，和經(jīng)修飾的多肽的生物學(xué)或酶活性可能會(huì)降低。因此，非常需要用于治療性肽的衍生化方法，其導(dǎo)致形成經(jīng)特異性地標(biāo)記的、可容易地表征的和基本上同質(zhì)的產(chǎn)物。
在體外通過使用酶可以產(chǎn)生經(jīng)特異性地修飾的、同質(zhì)的肽治療劑。不像用于將修飾基團(tuán)(例如合成的聚合物)附著至肽的非特異性方法，基于酶的合成具有區(qū)域選擇性和立體選擇性的優(yōu)點(diǎn)。用于合成經(jīng)標(biāo)記的肽的兩種主要類別的酶是糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，唾液酸轉(zhuǎn)移酶、寡糖基轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶)和糖苷酶。這些酶可以用于特異地附著糖，該糖可以隨后被改變以包含修飾基團(tuán)。備選地，糖基轉(zhuǎn)移酶和經(jīng)修飾的糖苷酶可以用于將經(jīng)修飾的糖直接轉(zhuǎn)移至肽主鏈(參見例如，美國專利6,399,336，和美國專利申請(qǐng)公開20030040037、20040132640、20040137557、20040126838和20040142856，它們各自通過提及而合并入本文)。組合了化學(xué)和酶促方法的方法也是已知的(參見例如，Yamamoto等人，Carbohydr.Res.305415-422(1998)，和美國專利申請(qǐng)公開20040137557，其通過提及而合并入本文)。
以幾種方法將碳水化合物連接至糖肽，其中N-連接至天冬酰胺和O-連接至絲氨酸和蘇氨酸對(duì)于重組糖蛋白治療劑是最相關(guān)的。在所有真核細(xì)胞的分泌型和細(xì)胞表面結(jié)合型糖蛋白上均發(fā)現(xiàn)O-聯(lián)糖基化。在通過O-聯(lián)糖基化產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)中具有很大的多樣性。通過存在于高爾基體中的數(shù)百種酶(糖基轉(zhuǎn)移酶)的催化活性而產(chǎn)生此類聚糖。多樣性存在于聚糖結(jié)構(gòu)水平上和存在于O-聚糖與蛋白質(zhì)主鏈附著的位置中。盡管具有高度的潛在多樣性，但是顯然O-聯(lián)糖基化是受高度調(diào)控的過程，其在多細(xì)胞生物中顯示出高度的保守性。
不幸的是，并不是所有的多肽都包含O-聯(lián)糖基化序列作為其氨基酸序列的一部分。此外，現(xiàn)有的糖基化序列對(duì)于將修飾基團(tuán)附著至多肽可能并不合適。例如，此類修飾可以引起經(jīng)修飾的多肽的生物活性的不希望的降低。因此，本領(lǐng)域需要允許精確地產(chǎn)生糖基化序列和能夠精確地指導(dǎo)對(duì)于那些位點(diǎn)的修飾的方法。本發(fā)明解決了這些和其他需求。
發(fā)明概述 本發(fā)明涉及多肽，優(yōu)選地具有治療價(jià)值的多肽的糖基化和修飾，所述多肽包含O-聯(lián)糖基化序列，所述O-聯(lián)糖基化序列是葡糖胺轉(zhuǎn)移酶(例如，GlcNAc轉(zhuǎn)移酶)的底物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽是包含O-聯(lián)糖基化序列的非天然存在的多肽，所述O-聯(lián)糖基化序列在相應(yīng)的親本多肽中不存在或者在相應(yīng)的親本多肽中的相同位置處不存在。
本發(fā)明描述了如下發(fā)現(xiàn)酶促糖綴合(glycoconjugation)和糖PEG化反應(yīng)可以特異地靶向多肽內(nèi)的某些O-聯(lián)糖基化序列。特別地，將葡糖胺部分(其任選地用聚合物修飾基團(tuán)來進(jìn)行衍生化)酶促轉(zhuǎn)移至多肽的氨基酸殘基。該氨基酸殘基是O-聯(lián)糖基化序列的一部分，所述O-聯(lián)糖基化序列被酶例如O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶(OGT)(在本文中也稱為GlcNAc轉(zhuǎn)移酶)識(shí)別為底物。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，可以將經(jīng)修飾的糖(其優(yōu)選地是經(jīng)修飾的葡糖胺部分)直接共價(jià)附著至多肽的氨基酸側(cè)鏈。出乎意料地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在該方法中所使用的某些糖基轉(zhuǎn)移酶不僅能將糖基殘基直接添加至多肽主鏈，而且最重要地，顯示出顯著的對(duì)于糖基供體分子(其被這些酶用作底物)的耐受性。例如，某些GlcNAc轉(zhuǎn)移酶能夠?qū)⑵咸前凡糠?其用聚合物修飾基團(tuán)進(jìn)行修飾)直接添加至所述多肽的氨基酸殘基。因而，在用經(jīng)修飾的糖殘基進(jìn)行糖綴合之前多肽的糖基化不是必需的，然而是可能的。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，催化糖綴合反應(yīng)(例如，糖PEG化)的糖基轉(zhuǎn)移酶可以使用細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)來產(chǎn)生。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，GlcNAc轉(zhuǎn)移酶)在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)。由于這些和其他優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明提供了多肽綴合物的時(shí)間和成本有效益的生產(chǎn)途徑，所述多肽綴合物包含修飾基團(tuán)，例如水溶性聚合物。
包含O-聯(lián)糖基化序列的多肽 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的O-糖基化序列存在于親本多肽(例如，野生型多肽)中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過突變將O-聯(lián)糖基化序列引入到親本多肽中。因此，本發(fā)明提供了非天然存在的多肽，其對(duì)應(yīng)于親本多肽并且具有包含至少一個(gè)本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列的氨基酸序列，所述O-聯(lián)糖基化序列在所述相應(yīng)的親本多肽中不存在或者在所述相應(yīng)的親本多肽中的相同位置處不存在。在一個(gè)實(shí)例中，每個(gè)O-聯(lián)糖基化序列是GlcNAc轉(zhuǎn)移酶的底物。在另一個(gè)實(shí)例中，O-聯(lián)糖基化序列包含作為選自式(I)-(VI)的成員的氨基酸序列 (B1)aP(B2)bUS(B3)c(I) (B1)aP(B2)bUT(B3)c(II) (B4)dPSZ(B5)e (III) (B4)dPTZ(B5)e (IV) (B6)fS(B7)gP(B8)h (V) (B6)fT(B7)gP(B8)h (VI)。
在式(I)至(VI)中，b和g是選自0至2的整數(shù)，并且a、c、d、e、f和h是選自0至5的整數(shù)。T是蘇氨酸，S是絲氨酸，P是脯氨酸，U是選自V、S、T、E、Q和不帶電荷的氨基酸的氨基酸，并且Z是選自P、E、Q、S、T和不帶電荷的氨基酸的氨基酸。B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7和B8各自是獨(dú)立地選自氨基酸的成員。
此外，本發(fā)明提供了分離的核酸，其編碼本發(fā)明的非天然存在的多肽。本發(fā)明進(jìn)一步提供了表達(dá)載體，以及包含上述核酸的細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供了非天然存在的多肽的文庫，其中所述文庫的每個(gè)成員包含至少一個(gè)本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列。還提供了制備和使用此類文庫的方法。
多肽綴合物 本發(fā)明進(jìn)一步提供了非天然存在的多肽和聚合物修飾基團(tuán)之間的共價(jià)綴合物，其中所述非天然存在的多肽對(duì)應(yīng)于親本多肽并且具有包含外源O-聯(lián)糖基化序列的氨基酸序列，所述外源O-聯(lián)糖基化序列在所述相應(yīng)的親本多肽中不存在或者在所述相應(yīng)的親本多肽中的相同位置處不存在。在一個(gè)實(shí)例中，所述O-聯(lián)糖基化序列是GlcNAc轉(zhuǎn)移酶的底物并且包含至少一個(gè)具有羥基的氨基酸殘基。所述聚合物修飾基團(tuán)通過糖基連接基團(tuán)在所述O-聯(lián)糖基化序列的所述羥基處共價(jià)附著至所述多肽。所述親本多肽優(yōu)選地為治療性多肽。
在示例性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽綴合物包含根據(jù)式(VII)的部分，其中q可以是0或1
在式(VII)中，w是選自0和4的整數(shù)。在一個(gè)實(shí)例中，w選自0和1。AA-O是從具有被羥基取代的側(cè)鏈的氨基酸(例如，絲氨酸或蘇氨酸)衍生而得的部分，其中所述氨基酸位于本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列內(nèi)。當(dāng)q為1時(shí)，所述氨基酸是所述多肽的內(nèi)部氨基酸，和當(dāng)q為0時(shí)，所述氨基酸是N-末端或C-末端氨基酸。Z＊是選自葡糖胺部分、葡糖胺模擬部分、包含葡糖胺部分的寡糖和包含葡糖胺模擬部分的寡糖的成員。X＊是選自聚合物修飾基團(tuán)和包含聚合物修飾基團(tuán)的糖基連接基團(tuán)的成員。在一個(gè)實(shí)例中，Z＊是葡糖胺部分(例如，GlcNAc或GlcNH)，和X＊是聚合物修飾基團(tuán)。
本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的共價(jià)綴合物和可藥用載體的藥物組合物。
經(jīng)修飾的糖核苷酸 本發(fā)明進(jìn)一步提供了具有根據(jù)式(XI)的結(jié)構(gòu)的化合物
其中，每個(gè)Q是獨(dú)立地選自H、負(fù)電荷和鹽抗衡離子(例如，陽離子)的成員。E是選自NH、O、S和CH2的成員。E1是選自O(shè)和S的成員。G是選自-CH2-和C＝A的成員，其中A是選自O(shè)、S和NR27的成員，其中R27是選自取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基和取代或未取代的雜環(huán)烷基的成員。R21、R22、R23和R24是獨(dú)立地選自H、OR25、SR25、NR25R26、NR25S(O)2R26、S(O)2NR25R26、NR25C(O)R26、C(O)NR25R26、C(O)OR25、?；?、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基和取代或未取代的雜環(huán)烷基的成員，其中R25和R26是獨(dú)立地選自H、?；?、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基和取代或未取代的雜環(huán)烷基的成員。在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，R21、R22、R23、R24和R27中的至少一個(gè)包含聚合物修飾基團(tuán)。
形成多肽綴合物的方法 本發(fā)明進(jìn)一步提供了形成多肽和聚合物修飾基團(tuán)之間的共價(jià)綴合物的方法，其中所述多肽包含O-聯(lián)糖基化序列(例如，外源O-聯(lián)糖基化序列)，所述O-聯(lián)糖基化序列包含有著具有羥基的側(cè)鏈的氨基酸殘基。所述O-聯(lián)糖基化序列是GlcNAc轉(zhuǎn)移酶的底物。所述聚合物修飾基團(tuán)通過葡糖胺連接基團(tuán)共價(jià)連接至所述多肽，所述葡糖胺連接基團(tuán)插入在所述多肽和所述修飾基團(tuán)之間并且共價(jià)連接至所述多肽和所述修飾基團(tuán)。所述方法包括下述步驟(i)在GlcNAc轉(zhuǎn)移酶存在下，使所述多肽與包含共價(jià)連接至聚合物修飾基團(tuán)的葡糖胺部分的葡糖胺供體相接觸，這在對(duì)于所述GlcNAc轉(zhuǎn)移酶將所述葡糖胺部分從所述葡糖胺供體轉(zhuǎn)移到所述O-聯(lián)糖基化序列的所述羥基上來說足夠的條件下進(jìn)行。示例性的葡糖胺部分包括GlcNAc和GlcNH。
根據(jù)下面的詳細(xì)描述，本發(fā)明的另外方面、優(yōu)點(diǎn)和目的將會(huì)是顯而易見的。
附圖簡述

圖1是具有登錄號(hào)O15294的人OGT的示例性氨基酸序列(SEQID NO1)。
圖2是重組人OGT Δ176的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖3是重組人OGT Δ182的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO3)。
圖4是重組人OGT Δ182-His8的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
圖5是重組人OGT Δ382的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO5)。
圖6是重組人OGT Δ382-His8的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO6)。
圖7是重組His7-人OGT Δ382的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO7)。
圖8是重組的帶有MBP標(biāo)簽的人OGT Δ182的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO8)。
圖9是重組的帶有MBP標(biāo)簽的人OGT Δ382的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO9)。
圖10是因子VIII的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO10)。
圖11是因子VIII的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO11)。
圖12是示例性的因子VIII氨基酸序列，其中除去了B-結(jié)構(gòu)域(氨基酸殘基741-1648)(SEQ ID NO12)。本發(fā)明的示例性多肽包括其中缺失的B-結(jié)構(gòu)域被至少一個(gè)氨基酸殘基(B-結(jié)構(gòu)域替代序列)替代的那些多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，在Arg740和Glu1649之間的B-結(jié)構(gòu)域替代序列包含至少一個(gè)O-聯(lián)或N-聯(lián)糖基化序列。
圖13是B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII的示例性氨基酸序列(SEQ IDNO13)。
圖14是B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII的示例性氨基酸序列(SEQ IDNO14)。
圖15是B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII的示例性氨基酸序列(SEQ IDNO15)。
圖16展示了人OGT構(gòu)建體的細(xì)菌表達(dá)。通過SDS-PAGE來分析總細(xì)胞裂解物。重組OGT加有框。第一泳道分別代表分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物，和第二泳道留空。圖16A在W3110和trxB gor supp突變型大腸桿菌中表達(dá)不帶標(biāo)簽的人OGT Δ176(SEQ ID NO2)(圖16A，分別為泳道3和4)。圖16B在W3110和trxB gor supp突變型大腸桿菌中表達(dá)在C-末端帶有His8標(biāo)簽的OGT Δ382(SEQ ID NO6)(圖16B，分別為泳道3和4)、帶有His8標(biāo)簽的OGT Δ182(SEQ IDNO4，圖16B，泳道7)和在N-末端帶有His7標(biāo)簽的OGT Δ382(SEQID NO7，圖16B，泳道5和6)。
發(fā)明詳述 I.縮寫 PEG，聚(乙二醇)；m-PEG，甲氧基-聚(乙二醇)；PPG，聚(丙二醇)；m-PPG，甲氧基-聚(丙二醇)；Fuc，巖藻糖或巖藻糖基；Gal，半乳糖或半乳糖基；GalNAc，N-乙酰半乳糖胺或N-乙酰半乳糖胺基；Glc，葡萄糖或葡萄糖基；GlcNAc，N-乙酰葡糖胺或N-乙酰葡糖胺基；GlcNH，葡糖胺或葡糖胺基；Man，甘露糖或甘露糖基；ManAc，乙酸甘露糖胺或甘露糖胺基乙酸酯；Sia，唾液酸或唾液酸基；和NeuAc，N-乙酰神經(jīng)胺(N-acetylneuramine)或N-乙酰神經(jīng)胺基(N-acetylneuraminyl)。
II.定義 除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語一般具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。通常，在細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、有機(jī)化學(xué)以及核酸化學(xué)和雜交方面的本文所使用的命名以及實(shí)驗(yàn)室操作程序是本領(lǐng)域熟知并通常采用的那些。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于核酸和肽合成。所述技術(shù)和操作程序通常根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)方法和本文件中各處所提供的各種一般參考文獻(xiàn)(通常參見Sambrook等人，MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL，第2版(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，其通過提及而合并入本文)來進(jìn)行。下面所描述的分析和合成有機(jī)化學(xué)方面的本文所使用的命名以及實(shí)驗(yàn)室操作程序是本領(lǐng)域熟知并通常采用的那些。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或其修改形式用于化學(xué)合成和化學(xué)分析。
本文所描述的所有寡糖以下列方式進(jìn)行描述非還原糖的名稱或縮寫(即Gal)，接著是糖苷鍵的構(gòu)型(α或β)、環(huán)鍵(1或2)、參與該鍵的還原糖的環(huán)位置(2、3、4、6或8)，然后是還原糖的名稱或縮寫(即GlcNAc)。每種糖優(yōu)選是吡喃糖。標(biāo)準(zhǔn)糖生物學(xué)命名法的綜述參見例如Essentials of Glycobiology Varki等人(編輯)，CSHL Press(1999)。
寡糖被認(rèn)為具有還原端和非還原端，不論在還原端處的糖是否實(shí)際上為還原糖。
術(shù)語“糖基部分”是指衍生自糖殘基的任何基團(tuán)?！疤腔糠帧卑▎翁呛凸烟遣⑶野ā疤腔M部分”。
如本文所使用的，術(shù)語“糖基模擬部分”是指結(jié)構(gòu)上類似于糖基部分(例如，己糖或戊糖)的部分?！疤腔M部分”的實(shí)例包括這樣的部分，其中糖基部分的糖苷氧原子或環(huán)氧原子或者兩者已經(jīng)用鍵或另一原子(例如，硫)，或者另一部分例如含碳基團(tuán)(例如，CH2)或含氮基團(tuán)(例如，NH)替代。實(shí)例包括取代或未取代的環(huán)己基衍生物、環(huán)硫醚、環(huán)胺以及包含硫代糖苷鍵的部分，等等。“糖基模擬部分”的其他實(shí)例包括具有雙鍵的環(huán)結(jié)構(gòu)，以及其中環(huán)碳原子之一攜帶羰基或另一種雙鍵取代基(例如腙部分)的環(huán)結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)例中，“糖基模擬部分”在酶催化的反應(yīng)中轉(zhuǎn)移到多肽的氨基酸殘基或糖肽的糖基部分上。這可以例如通過下列方式來完成用離去基團(tuán)例如鹵素來活化“糖基模擬部分”。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，糖核苷酸的糖部分構(gòu)成了糖基模擬部分，并且通過使用糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，GlcNAc轉(zhuǎn)移酶)將該糖基模擬部分(其任選地用修飾基團(tuán)來進(jìn)行衍生化)從糖核苷酸(例如，經(jīng)修飾的糖核苷酸)酶促轉(zhuǎn)移到多肽的氨基酸上。術(shù)語“糖基模擬部分”中的詞匯“糖基”可以用描述了具體的糖部分的詞匯來替代，并且所得的術(shù)語是指在結(jié)構(gòu)上類似于該具體的糖部分的部分。例如，“GlcNAc模擬部分”是指類似于N-乙酰葡糖胺部分的“糖基模擬部分”。
術(shù)語“核酸”或“多核苷酸”指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)和其聚合物。除非特別限制，該術(shù)語包括含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述核酸具有與參考核酸相似的結(jié)合性質(zhì)并且以與天然存在的核苷酸相似的方式被代謝。除非另外指出，特定的核酸序列還含蓄地包括其經(jīng)保守修飾的變體(例如，簡并密碼子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互補(bǔ)序列以及明確指出的序列。具體地，可以通過下列方式來實(shí)現(xiàn)簡并密碼子取代產(chǎn)生其中一個(gè)或多個(gè)所選擇的(或所有)密碼子的第三個(gè)位置被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列(Batzer等人，Nucleic Acid Res.195081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.2602605-2608(1985)；和Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 891-98(1994))。術(shù)語核酸可以與基因、cDNA和由基因所編碼的mRNA互換使用。
術(shù)語“基因”是指參與產(chǎn)生多肽鏈的DNA區(qū)段。它可以包括編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域(前導(dǎo)區(qū)和非轉(zhuǎn)錄尾區(qū))以及各編碼區(qū)段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。
術(shù)語“分離的”，當(dāng)應(yīng)用于核酸或蛋白質(zhì)時(shí)，表示該核酸或蛋白質(zhì)基本上沒有在天然狀態(tài)下其所結(jié)合的其他細(xì)胞組分。其優(yōu)選處于同質(zhì)狀態(tài)，盡管它可以在無水或含水溶液中。通常使用分析化學(xué)技術(shù)例如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法來測(cè)定純度和同質(zhì)性。為存在于制劑中的主要種類的蛋白質(zhì)是基本上經(jīng)純化的。具體地，分離的基因是與位于該基因側(cè)翼并且編碼除目的基因之外的其他蛋白質(zhì)的開放閱讀框相分開的。術(shù)語“純化的”表示，核酸或蛋白質(zhì)在電泳凝膠中產(chǎn)生基本上一條帶。具體地，它表示，該核酸或蛋白質(zhì)為至少85％純的，更優(yōu)選至少95％純的，和最優(yōu)選至少99％純的。
術(shù)語“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以類似于天然存在的氨基酸的方式發(fā)揮功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些，以及后來進(jìn)行修飾的那些氨基酸，例如羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物是指具有與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)(即，結(jié)合至氫、羧基、氨基和R基團(tuán)的α碳)的化合物，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。此類類似物具有經(jīng)修飾的R基團(tuán)(例如，正亮氨酸)或經(jīng)修飾的肽主鏈，但是保留了與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)?！鞍被崮M物”是指這樣的化合物，所述化合物具有與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)但是以類似于天然存在的氨基酸的方式發(fā)揮功能。
術(shù)語“不帶電荷的氨基酸”是指不包含酸性官能團(tuán)(例如，-COOH)或堿性官能團(tuán)(例如，-NH2)的氨基酸。堿性氨基酸包括賴氨酸(K)和精氨酸(R)。酸性氨基酸包括天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。不帶電荷的氨基酸包括，例如甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)，以及包含-OH或-SH基團(tuán)的那些氨基酸(例如，蘇氨酸(T)、絲氨酸(S)、酪氨酸(Y)和半胱氨酸(C))。
本領(lǐng)域中有多種已知的方法允許在多肽鏈中以位點(diǎn)特異性方式摻入非天然氨基酸衍生物，參見例如，WO 02/086075。
在本文中，氨基酸可以通過公知的三字母符號(hào)或者通過IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission所推薦的單字母符號(hào)來表示。同樣地，核苷酸可以通過它們的所公認(rèn)的單字母代碼來表示。
“經(jīng)保守修飾的變體”應(yīng)用于氨基酸和核酸序列。關(guān)于特定核酸序列，“經(jīng)保守修飾的變體”是指編碼相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者當(dāng)核酸不編碼氨基酸序列時(shí)，是指基本上相同的序列。由于遺傳密碼的簡并性，大量功能上相同的核酸編碼任意給定的蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在由密碼子指定了丙氨酸的每個(gè)位置處，該密碼子可以被改變成任何所描述的相應(yīng)密碼子而不改變所編碼的多肽。此類核酸變異是“沉默變異”，其是經(jīng)保守修飾的變異中的一個(gè)種類。編碼多肽的本文中的每個(gè)核酸序列也描述了該核酸的每種可能的沉默變異。技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，核酸中的每個(gè)密碼子(除了AUG(其通常是甲硫氨酸的唯一密碼子)和TGG(其通常是色氨酸的唯一密碼子)之外)可以被修飾以產(chǎn)生功能上相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的每種沉默變異暗含在每個(gè)所描述的序列中。
對(duì)于氨基酸序列，技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，對(duì)核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列的獨(dú)個(gè)取代、缺失或添加(其在所編碼的序列中改變、添加或刪除單個(gè)氨基酸或者小百分比的氨基酸)是“經(jīng)保守修飾的變體”，其中該改變導(dǎo)致氨基酸被化學(xué)上相似的氨基酸取代。提供了功能上相似的氨基酸的保守取代表是本領(lǐng)域公知的。此類經(jīng)保守修飾的變體是除本發(fā)明的多態(tài)性變體、種間同源物和等位基因以外進(jìn)一步的，但不排除本發(fā)明的多態(tài)性變體、種間同源物和等位基因。
下面的八組中的每一組包含相互作為保守取代的氨基酸 1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)； 2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)； 3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)； 4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)； 5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)； 6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)； 7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；和 8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M) (參見例如，Creighton，Proteins(1984))。
“肽”是指這樣的聚合物，其中單體是氨基酸并且通過酰胺鍵連接在一起。本發(fā)明的肽的大小可以例如從兩個(gè)氨基酸到數(shù)百或數(shù)千個(gè)氨基酸變化。備選地，較大的肽被稱作“多肽”或“蛋白質(zhì)”。另外，非天然氨基酸，例如，β-丙氨酸、苯基甘氨酸、高精氨酸和高苯丙氨酸也包括在內(nèi)。不由基因編碼的氨基酸也可以用于本發(fā)明。此外，進(jìn)行修飾以包括反應(yīng)性基團(tuán)、糖基化序列、聚合物、治療性部分、生物分子等等的氨基酸也可以用于本發(fā)明。在本發(fā)明中所使用的所有氨基酸可以是D-或L-異構(gòu)體。L-異構(gòu)體通常是優(yōu)選的。另外，其他肽模擬物(peptidomimetics)也可用于本發(fā)明。如本文所使用的，“肽”是指糖基化的和未糖基化的肽。還包括被表達(dá)該肽的系統(tǒng)不完全糖基化的肽。一般性的綜述可參見，Spatola，A.F.，CHEMISTRY ANDBIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS，PEPTIDES AND PROTEINS，B.Weinstein，eds.，Marcel Dekker，New York，p.267(1983)。
在本申請(qǐng)中，氨基酸殘基根據(jù)它們與多肽的N-末端氨基酸(例如，N-末端甲硫氨酸)(其編號(hào)為“1”)的相對(duì)位置來進(jìn)行編號(hào)(通常以上標(biāo))。N-末端氨基酸可以是甲硫氨酸(M)，其編號(hào)為“1”。如果多肽的N-末端不以甲硫氨酸開始，那么與每個(gè)氨基酸殘基相關(guān)的編號(hào)可以容易地進(jìn)行調(diào)整以反映N-末端甲硫氨酸的缺失。應(yīng)當(dāng)理解，示例性多肽的N-末端可以以或不以甲硫氨酸開始。
術(shù)語“野生型多肽”是指天然存在的多肽，其任選地和天然地包含本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列。
術(shù)語“親本多肽”是指任何多肽，其氨基酸序列不包含本發(fā)明的“外源”O(jiān)-聯(lián)糖基化序列。然而，“親本多肽”可以包含一個(gè)或多個(gè)天然存在的(內(nèi)源的)O-聯(lián)糖基化序列。例如，野生型多肽可以包含O-聯(lián)糖基化序列PVS。術(shù)語“親本多肽”是指任何多肽，包括野生型多肽、融合多肽、合成多肽、重組多肽(例如，治療性多肽)以及其任何變體(例如，之前通過一次或多次氨基酸的替代、氨基酸的插入、氨基酸的刪除等等進(jìn)行了修飾)，只要此類修飾不等同于形成本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，親本多肽的氨基酸序列或者編碼親本多肽的核酸序列進(jìn)行了定義并可被公眾獲得。例如，親本多肽是野生型多肽并且該野生型多肽的氨基酸序列或核苷酸序列是公眾可獲得的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(例如，EMBL核苷酸序列數(shù)據(jù)庫、NCBIEntrez、ExPasy、Protein Data Bank等等)的一部分。在另一實(shí)例中，親本多肽不是野生型多肽但是被用作治療性多肽(即，經(jīng)批準(zhǔn)的藥物)，并且公眾可在科學(xué)出版物或?qū)＠蝎@得此類多肽的序列。在另外一個(gè)實(shí)例中，親本多肽的氨基酸序列或編碼親本多肽的核酸序列在本發(fā)明時(shí)可以被公眾獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，親本多肽是更大結(jié)構(gòu)的一部分。例如，親本多肽對(duì)應(yīng)于抗體的恒定區(qū)(Fc)或CH2結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域可以是完整抗體的一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，親本多肽不是具有未知序列的抗體。
術(shù)語“突變型多肽”或“多肽變體”是指這樣的多肽形式，其中所述多肽的氨基酸序列與它的對(duì)應(yīng)的野生型形式、天然存在的形式或任何其他親本形式不同。突變型多肽可以含有一個(gè)或多個(gè)突變，例如，替代、插入、缺失，等等，這導(dǎo)致形成突變型多肽。
術(shù)語“非天然存在的多肽”或“序列肽段多肽(sequonpolypeptide)”是指這樣的多肽變體，其在它的氨基酸序列中包含至少一個(gè)本發(fā)明的“外源O-聯(lián)糖基化序列”(在相應(yīng)的野生型形式或任何其他親本形式中不存在或者在相應(yīng)的野生型形式或任何其他親本形式中的相同位置處不存在的O-聯(lián)糖基化序列)，但是也可以包含一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源(例如，天然存在的)O-聯(lián)糖基化序列?！胺翘烊淮嬖诘亩嚯摹笨梢园粋€(gè)或多個(gè)本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列，并且另外還可以包含其他突變，例如替代、插入、刪除、截短等。
術(shù)語“外源O-聯(lián)糖基化序列”是指被引入親本多肽(例如，野生型多肽)的氨基酸序列中的本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列，其中所述親本多肽不包含O-聯(lián)糖基化序列或者在不同的位置處包含O-聯(lián)糖基化序列。在一個(gè)實(shí)例中，將O-聯(lián)糖基化序列引入不具有O-聯(lián)糖基化序列的野生型多肽中。在另一實(shí)例中，野生型多肽天然地在第一個(gè)位置處包含第一個(gè)O-聯(lián)糖基化序列。將第二個(gè)O-聯(lián)糖基化序列在第二個(gè)位置處引入該野生型多肽中。該修飾導(dǎo)致在第二個(gè)位置處具有“外源O-聯(lián)糖基化序列”的多肽。可以通過突變來將外源O-聯(lián)糖基化序列引入親本多肽中。備選地，可以通過化學(xué)合成來制備具有外源O-聯(lián)糖基化序列的多肽。
術(shù)語“對(duì)應(yīng)于親本多肽”(或者該術(shù)語的語法變化形式)用于描述本發(fā)明的序列肽段多肽，其中該序列肽段多肽的氨基酸序列與對(duì)應(yīng)的親本多肽的氨基酸序列之間的差異僅僅在于存在有至少一個(gè)本發(fā)明的外源O-聯(lián)糖基化序列。通常，序列肽段多肽和親本多肽的氨基酸序列顯示出高的同一性百分比。在一個(gè)實(shí)例中，“對(duì)應(yīng)于親本多肽”表示，序列肽段多肽的氨基酸序列與親本多肽的氨基酸序列具有至少約50％同一性、至少約60％同一性、至少約70％同一性、至少約80％同一性、至少約90％同一性、至少約95％同一性或至少約98％同一性。在另一實(shí)例中，編碼序列肽段多肽的核酸序列與編碼親本多肽的核酸序列具有至少約50％同一性、至少約60％同一性、至少約70％同一性、至少約80％同一性、至少約90％同一性、至少約95％同一性或至少約98％同一性。
術(shù)語“在親本多肽中引入(或加入等等)糖基化序列(例如，O-聯(lián)糖基化序列)”(或其語法變化形式)，或者“修飾親本序列”以包含糖基化序列(或者其語法變化形式)，并不必需表示親本多肽是這種轉(zhuǎn)化的物理起始材料，而是表示親本多肽提供了用于制備另一多肽的指導(dǎo)性氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)例中，“在親本多肽中引入糖基化序列”表示，通過合適的突變來修飾親本多肽的基因以產(chǎn)生編碼序列肽段多肽的核苷酸序列。在另一實(shí)例中，“在親本多肽中引入糖基化序列”表示，使用親本多肽序列作為指導(dǎo)，在理論上設(shè)計(jì)所得的多肽。然后通過化學(xué)或其他手段來產(chǎn)生所設(shè)計(jì)的多肽。
術(shù)語“先導(dǎo)多肽”是指包含至少一個(gè)本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列的非天然存在的多肽，其可以被有效地糖基化或糖PEG化。對(duì)于適合作為先導(dǎo)多肽的本發(fā)明的多肽，當(dāng)經(jīng)歷合適的反應(yīng)條件時(shí)，此類多肽被糖基化或糖PEG化，其反應(yīng)產(chǎn)率為至少約50％，優(yōu)選至少約60％，更優(yōu)選至少約70％，和更加優(yōu)選約80％、約85％、約90％或約95％。最優(yōu)選的是這樣的本發(fā)明的先導(dǎo)多肽，其可以以大于95％的反應(yīng)產(chǎn)率被糖基化或糖PEG化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，先導(dǎo)多肽以這樣的方式被糖基化或糖PEG化，即每個(gè)O-聯(lián)糖基化序列中僅一個(gè)氨基酸殘基被糖基化或糖PEG化(單糖基化)。
術(shù)語“文庫”是指不同多肽的集合，每個(gè)多肽對(duì)應(yīng)于共同的親本多肽。文庫中的每個(gè)多肽種類被稱作文庫的成員。優(yōu)選地，本發(fā)明的文庫代表了多肽的集合，其具有足夠的數(shù)目和多樣性以提供從中鑒定出先導(dǎo)多肽的群體。文庫包括至少兩種不同的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，文庫包括約2至約10個(gè)成員。在另一個(gè)實(shí)施方案中，文庫包括約10至約20個(gè)成員。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，文庫包括約20至約30個(gè)成員。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，文庫包括約30至約50個(gè)成員。在另一個(gè)實(shí)施方案中，文庫包括約50至約100個(gè)成員。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，文庫包括超過100個(gè)成員。文庫的成員可以是混合物的一部分或者可以相互分離。在一個(gè)實(shí)例中，文庫的成員為混合物的一部分，該混合物任選地包括其他組分。例如，至少兩種序列肽段多肽存在于一定體積的細(xì)胞培養(yǎng)液中。在另一實(shí)例中，文庫的成員各自分開地表達(dá)并且任選地進(jìn)行分離。分離的序列肽段多肽可以任選地包含在多孔容器中，其中每個(gè)孔含有不同類型的序列肽段多肽。
術(shù)語本發(fā)明的“CH2”結(jié)構(gòu)域意在描述免疫球蛋白重鏈恒定CH2結(jié)構(gòu)域。在定義免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域方面，參考一般的免疫球蛋白，特別是由Kabat E.A.(1978)Adv.Protein Chem.321-75描述的應(yīng)用于人IgG1的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。
術(shù)語“包含CH2結(jié)構(gòu)域的多肽”或“包含至少一個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域的多肽”意在包括完整的抗體分子、抗體片段(例如，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域)或融合蛋白(其包括等同于免疫球蛋白CH2區(qū)的區(qū)域)。
術(shù)語“多肽綴合物”是指這樣的本發(fā)明種類，其中多肽用本文所示的糖部分(例如，經(jīng)修飾的糖)進(jìn)行糖綴合。在代表性的實(shí)例中，所述多肽是具有在相應(yīng)的野生型或親本多肽中不存在的O-聯(lián)糖基化序列的非天然存在的多肽。
如本文所使用的，“接近脯氨酸殘基”或“與脯氨酸殘基接近”是指與脯氨酸殘基相距小于約10個(gè)氨基酸，優(yōu)選與脯氨酸殘基相距小于約9、8、7、6或5個(gè)氨基酸，更優(yōu)選與脯氨酸殘基相距小于4、3、2或1個(gè)殘基的氨基酸。“接近脯氨酸殘基”的氨基酸可以在脯氨酸殘基的C-或N-末端側(cè)上。
術(shù)語“唾液酸”是指九碳羧基化糖家族中的任何成員。唾液酸家族中的最常見的成員是N-乙酰神經(jīng)氨酸(2-酮-5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-D-甘油基-D-galactononulo吡喃糖-1-酮酸(通常簡寫為Neu5Ac、NeuAc或NANA)。該家族的第二個(gè)成員是N-羥乙酰-神經(jīng)氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙?；涣u基化。第三個(gè)唾液酸家族成員是2-酮-3-脫氧-nonulosonic酸(KDN)(Nadano等人(1986)J.Biol.Chem.26111550-11557；Kanamori等人，J.Biol.Chem.26521811-21819(1990))。還包括9-取代的唾液酸，例如9-O-C1-C6?；?Neu5Ac，如9-O-乳酰基-Neu5Ac或9-O-乙?；?Neu5Ac、9-脫氧-9-氟-Neu5Ac和9-疊氮基-9-脫氧-Neu5Ac。關(guān)于唾液酸家族的綜述，參見例如，Varki，Glycobiology 225-40(1992)；Sialic AcidsChemistry，Metabolism and Function，R.Schauer，Ed.(Springer-Verlag，NewYork(1992))。唾液酸化操作程序中唾液酸化合物的合成和使用公開在1992年10月1日公布的國際申請(qǐng)WO 92/16640中。
術(shù)語“葡糖胺”或“葡糖胺部分”是指這樣的任何糖基或糖基模擬部分，其中環(huán)取代基的相對(duì)立體化學(xué)與葡萄糖或N-乙酰葡糖胺中的相同。示例性的“葡糖胺部分”由式(VIIIa)來表示
其中，G、E、E1、R21、R22、R23和R24如下文對(duì)于式(VIII)所定義的。式(VIIIa)包括經(jīng)修飾的和未修飾的葡糖胺類似物。在式(VIIIa)中，R21、R22、R23、R24和R27任選地包含修飾基團(tuán)(例如，聚合物修飾基團(tuán))。環(huán)取代基R22、R23和R24中的一個(gè)或多個(gè)可以是鹵素。優(yōu)選的葡糖胺部分包括GlcNAc和GlcNH，其任選地用聚合物修飾基團(tuán)進(jìn)行修飾。
如本文所使用的，術(shù)語“經(jīng)修飾的糖”是指天然或非天然存在的碳水化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的方法，將“經(jīng)修飾的糖”酶促添加到多肽的氨基酸或者糖基殘基上。經(jīng)修飾的糖選自許多酶底物，包括但不限于糖核苷酸(單、二和三磷酸)、活化的糖(例如，糖基鹵化物、糖基甲磺酸酯)和既未活化也非核苷酸的糖?！敖?jīng)修飾的糖”用“修飾基團(tuán)”來共價(jià)官能化?？捎玫男揎椈鶊F(tuán)包括，但不限于，聚合物修飾基團(tuán)(例如，水溶性聚合物)、治療性部分、診斷性部分、生物分子等等。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾基團(tuán)不是天然存在的糖基部分(例如，天然存在的多糖)。修飾基團(tuán)優(yōu)選是非天然存在的。在一個(gè)實(shí)例中，“非天然存在的修飾基團(tuán)”是聚合物修飾基團(tuán)，其中至少一個(gè)聚合物部分是非天然存在的。在另一實(shí)例中，非天然存在的修飾基團(tuán)是經(jīng)修飾的碳水化合物。選擇用修飾基團(tuán)進(jìn)行官能化的位置，從而使得它不妨礙“經(jīng)修飾的糖”被酶促添加至多肽。“經(jīng)修飾的糖”也指任何糖基模擬部分，其用修飾基團(tuán)官能化并且是天然的或經(jīng)修飾的酶(例如糖基轉(zhuǎn)移酶)的底物。
如本文所使用的，術(shù)語“聚合物修飾基團(tuán)”是包含至少一個(gè)聚合物部分(聚合物)的修飾基團(tuán)。被添加至多肽的聚合物修飾基團(tuán)可以改變此類多肽的性質(zhì)，如例如它在身體中的生物利用率、生物活性或半壽期。示例性的聚合物包括水溶性和水不溶性聚合物。聚合物修飾基團(tuán)可以是線性或支化的，并且可以包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立選擇的聚合物部分，例如聚(亞烷基二醇)和其衍生物。在一個(gè)實(shí)例中，聚合物是非天然存在的。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，聚合物修飾基團(tuán)包括水溶性聚合物，例如，聚(乙二醇)和其衍生物(PEG、m-PEG)、聚(丙二醇)和其衍生物(PPG、m-PPG)等等。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚(乙二醇)或聚(丙二醇)具有基本上均勻分散的分子量。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物修飾基團(tuán)不是天然存在的多糖。
術(shù)語“水溶性(的)”是指在水中具有一定的可檢測(cè)程度的溶解度的部分。用于檢測(cè)和/或定量水溶性的方法是本領(lǐng)域公知的。示例性的水溶性聚合物包括肽、糖、聚(醚)、聚(胺)、聚(羧酸)等等。肽可以具有由單一氨基酸組成的混合序列，例如聚(賴氨酸)。示例性的多糖是聚(唾液酸)。示例性的聚(醚)是聚(乙二醇)，例如m-PEG。聚(乙烯亞胺)是示例性的聚胺，聚(丙烯酸)是代表性的聚(羧酸)。
水溶性聚合物的聚合物主鏈可以是聚(乙二醇)(即，PEG)。然而，應(yīng)該理解，其他相關(guān)的聚合物也適合用于實(shí)施本發(fā)明，并且術(shù)語PEG或聚(乙二醇)的使用在該方面意在是包括性的而不是排他性的。術(shù)語PEG包括以其任何形式的聚(乙二醇)，包括烷氧基PEG、雙官能PEG、多臂PEG、叉狀PEG、支化PEG、懸掛型PEG(即具有一個(gè)或多個(gè)懸掛在聚合物主鏈上的官能團(tuán)的PEG或相關(guān)聚合物)或者其中具有可降解的鍵的PEG。
聚合物主鏈可以是線性或支化的。支化的聚合物主鏈?zhǔn)潜绢I(lǐng)域普遍已知的。通常，支化的聚合物具有中央分枝核心部分和多個(gè)連接至該中央分枝核心的線性聚合物鏈。PEG通常以支化形式使用，其可以通過向各種多元醇例如甘油、季戊四醇和山梨糖醇中添加環(huán)氧乙烷來制備。中央分枝部分也可以衍生自幾種氨基酸，例如賴氨酸。支化的聚(乙二醇)可以表示為諸如R(-PEG-OH)m的通式，其中R代表核心部分，例如甘油或季戊四醇，和m代表臂的數(shù)目。多臂PEG分子，例如美國專利號(hào)5,932,462(該專利通過提及而以其整體合并入本文)中描述的那些，也可以用作聚合物主鏈。
許多其他聚合物也適合于本發(fā)明。具有2至約300個(gè)末端的非肽且水溶性的聚合物主鏈尤其可用于本發(fā)明。合適的聚合物的實(shí)例包括，但不限于，其他聚(亞烷基二醇)例如聚(丙二醇)(“PPG”)、乙二醇和丙二醇的共聚物等、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羥丙基甲基丙烯酰胺)、聚(α-羥基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉、聚(N-丙烯酰嗎啉)，如美國專利號(hào)5,629,384(該專利通過提及而以其整體合并入本文)中所描述的，以及其共聚物、三元共聚物和混合物。盡管聚合物主鏈的每條鏈的分子量可以變化，但是它通常在約100Da至約100,000Da，常常約5,000Da至約80,000Da的范圍內(nèi)。
術(shù)語“均勻分散的”是指這樣的聚合物，其中聚合物樣品中實(shí)質(zhì)比例的聚合物分子具有大約相同的分子量。
如本文所使用的，術(shù)語“糖綴合”是指經(jīng)修飾的糖種類與多肽(例如本發(fā)明的突變型人生長激素)的氨基酸或糖基殘基的由酶介導(dǎo)的綴合。在一個(gè)實(shí)例中，將經(jīng)修飾的糖共價(jià)附著至一個(gè)或多個(gè)修飾基團(tuán)。“糖綴合”的亞類別是“糖基-PEG化”或“糖-PEG化(glyco-PEGylation)”，其中經(jīng)修飾的糖的修飾基團(tuán)是聚(乙二醇)或其衍生物，例如烷基衍生物(例如，m-PEG)或具有反應(yīng)性官能團(tuán)的衍生物(例如，H2N-PEG、HOOC-PEG)。
術(shù)語“大規(guī)?！焙汀肮I(yè)規(guī)?！笨苫Q使用并且指這樣的反應(yīng)周期，所述反應(yīng)周期在單個(gè)反應(yīng)周期完成時(shí)產(chǎn)生至少約250mg，優(yōu)選至少約500mg，和更優(yōu)選至少約1g的糖綴合物。
術(shù)語“O-聯(lián)糖基化序列”或“序列肽段”是指包含具有羥基的氨基酸殘基(例如，絲氨酸或蘇氨酸)的任何氨基酸序列(例如，含有約3至約10個(gè)氨基酸，優(yōu)選約3至約9個(gè)氨基酸)。在一個(gè)實(shí)施方案中，O-聯(lián)糖基化序列是酶例如糖基轉(zhuǎn)移酶的底物，優(yōu)選地當(dāng)多肽的氨基酸序列的一部分時(shí)。在典型的實(shí)施方案中，所述酶通過修飾上述羥基(其被稱作“糖基化位點(diǎn)”)而將糖基部分轉(zhuǎn)移到O-聯(lián)糖基化序列上。本發(fā)明區(qū)分在野生型多肽或其任何其他親本形式中天然存在的O-聯(lián)糖基化序列(內(nèi)源O-聯(lián)糖基化序列)和“外源O-聯(lián)糖基化序列”。包含外源O-聯(lián)糖基化序列的多肽也可以稱作“序列肽段多肽”?？梢酝ㄟ^重組技術(shù)、化學(xué)合成或其他方法來修飾親本多肽的氨基酸序列以包含外源O-聯(lián)糖基化序列。
如本文所使用的，術(shù)語“糖基連接基團(tuán)”是指共價(jià)附著有修飾基團(tuán)(例如，PEG部分、治療性部分、生物分子)的糖基殘基；所述糖基連接基團(tuán)將修飾基團(tuán)連接至綴合物的其余部分。在本發(fā)明的方法中，“糖基連接基團(tuán)”變成共價(jià)附著至糖基化或未糖基化的多肽，從而將修飾基團(tuán)連接至多肽的氨基酸和/或糖基殘基。“糖基連接基團(tuán)”通常通過“經(jīng)修飾的糖”酶促附著至多肽的氨基酸和/或糖基殘基而衍生自“經(jīng)修飾的糖”。糖基連接基團(tuán)可以是糖衍生的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在修飾基團(tuán)-經(jīng)修飾的糖盒形成(例如，氧化→席夫堿形成→還原)期間被降解，或者糖基連接基團(tuán)可以是完整的?！巴暾奶腔B接基團(tuán)”是指衍生自這樣的糖基部分的連接基團(tuán)，在所述糖基部分中將修飾基團(tuán)連接至綴合物的其余部分的糖單體不被降解，例如被氧化(例如，通過偏過碘酸鈉)。通過添加糖基單位或者從親本糖結(jié)構(gòu)中除去一個(gè)或多個(gè)糖基單位，可以從天然存在的寡糖得到本發(fā)明的“完整的糖基連接基團(tuán)”?！疤腔B接基團(tuán)”可以包括糖基-模擬部分。例如，用于將經(jīng)修飾的糖添加至經(jīng)糖基化或非糖基化的多肽的糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，GlcNAc轉(zhuǎn)移酶)顯示出對(duì)于糖基-模擬底物(例如，經(jīng)修飾的糖，其中糖部分是糖基-模擬部分，例如GlcNAc-模擬部分)的耐受性。經(jīng)修飾的糖基-模擬糖的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致獲得具有糖基連接基團(tuán)的綴合物，所述糖基連接基團(tuán)是糖基-模擬部分。
如本文所使用的，術(shù)語“靶向性部分”是指將選擇性地定位于身體的特定組織或區(qū)域中的種類。所述定位由分子決定子的特異識(shí)別、靶向性試劑或綴合物的分子大小、離子相互作用、疏水相互作用等等介導(dǎo)。將試劑靶向特定組織或區(qū)域的其他機(jī)制是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。示例性的靶向性部分包括抗體、抗體片段、轉(zhuǎn)鐵蛋白、HS-糖蛋白、凝血因子、血清蛋白、β-糖蛋白、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO等等。
如本文所使用的，“治療性部分”意指可用于治療的任何試劑，包括但不限于，抗生素、抗炎劑、抗腫瘤藥物、細(xì)胞毒素和放射性試劑?！爸委熜圆糠帧卑ㄉ锘钚栽噭┑那绑w藥物，其中超過一個(gè)的治療性部分結(jié)合至載體的構(gòu)建體，例如多價(jià)試劑。治療性部分還包括蛋白質(zhì)和包含蛋白質(zhì)的構(gòu)建體。示例性的蛋白質(zhì)包括但不限于，促紅細(xì)胞生成素(EPO)、粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)、干擾素(例如，干擾素-α、-β、-γ)、白細(xì)胞介素(例如，白細(xì)胞介素II)、血清蛋白(例如，因子VII、VIIa、VIII、IX和X)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、促卵泡激素(FSH)和黃體生成素(LH)以及抗體融合蛋白(例如，腫瘤壞死因子受體(TNFR)/Fc結(jié)構(gòu)域融合蛋白)。
如本文所使用的，“抗腫瘤藥物”意指用于抗癌的任何試劑，包括但不限于，細(xì)胞毒素和諸如下列的試劑抗代謝物、烷化劑、蒽環(huán)類、抗生素、抗有絲分裂藥、丙卡巴肼、羥基脲、天冬酰胺酶、皮質(zhì)類固醇、干擾素和放射性試劑。在術(shù)語“抗腫瘤藥物”的范圍內(nèi)也包括具有抗腫瘤活性的肽(例如TNF-α)的綴合物。綴合物包括但不限于在治療性蛋白質(zhì)和本發(fā)明的糖蛋白之間形成的那些綴合物。代表性的綴合物是在PSGL-1和TNF-α之間形成的綴合物。
如本文所使用的，“細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性試劑”意指對(duì)細(xì)胞有害的任何試劑。實(shí)例包括紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、依米丁、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長春新堿、長春堿、秋水仙堿、多柔比星、柔紅霉素、二羥基蒽二酮(dihydroxyanthracenedione)、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、1-去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素以及其類似物或同源物。其他毒素包括，例如蓖麻毒蛋白、CC-1065和類似物、倍癌霉素。另外的其他毒素包括白喉毒素和蛇毒(例如，眼鏡蛇蛇毒)。
如本文所使用的，“放射性試劑”包括在診斷或破壞腫瘤方面有效的任何放射性同位素。實(shí)例包括但不限于，銦-111、鈷-60。此外，天然存在的放射性元素，例如鈾、鐳和釷(其通常表現(xiàn)為放射性同位素的混合物)是放射性試劑的合適的實(shí)例。金屬離子通常與有機(jī)螯合部分相螯合。
許多可用的螯合基團(tuán)、冠醚、穴狀配體等是本領(lǐng)域已知的，并且可以摻入本發(fā)明的化合物中(例如，EDTA、DTPA、DOTA、NTA、HDTA等等，以及它們的膦酸鹽類似物，如DTPP、EDTP、HDTP、NTP等等)。參見例如，Pitt等人，“The Design of Chelating Agents forthe Treatment of Iron Overload”，INORGANIC CHEMISTRY IN BIOLOGYAND MEDICINE；Martell，Ed.；American Chemical Society，Washington，D.C.，1980，pp.279-312；Lindoy，THE CHEMISTRY OF MACROCYCLICLIGAND COMPLEXES；Cambridge University Press，Cambridge，1989；Dugas，BIOORGANIC CHEMISTRY；Springer-Verlag，New York，1989，以及其中所含的參考文獻(xiàn)。
此外，允許將螯合劑、冠醚和環(huán)糊精附著至其他分子的許多途徑是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以得到的。參見例如，Meares等人，“Propertiesof In Vivo Chelate-Tagged Proteins and Polypeptides.”MODIFICATION OF PROTEINSFOOD，NUTRITIONAL，ANDPHARMACOLOGICAL ASPECTS”Feeney等人，Eds.，American ChemicalSociety，Washington，D.C.，1982，pp.370-387；Kasina等人，Bioconjugate Chem.，9108-117(1998)；Song等人，Bioconjugate Chem.，8249-255(1997)。
如本文所使用的，“可藥用載體”包括當(dāng)與綴合物相組合時(shí)保留該綴合物的活性并且優(yōu)選地不與受試者的免疫系統(tǒng)反應(yīng)的任何物質(zhì)?！翱伤幱幂d體”包括固體和液體，例如承載體、稀釋劑和溶劑。實(shí)例包括但不限于，任何標(biāo)準(zhǔn)藥物載體，例如磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水、乳液例如油/水乳液以及各種類型的濕潤劑。其他載體可以包括無菌溶液以及片劑(包括包衣片劑)和膠囊。通常，此類載體包含賦形劑，例如淀粉、乳、糖、某些類型的粘土、明膠、硬脂酸或其鹽、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、滑石、植物脂肪或油、樹膠、二元醇或者其他已知的賦形劑。此類載體可以還包括香料和顏色添加劑或其他成分。通過公知的常規(guī)方法來配制包含此類載體的組合物。
如本文所使用的，“施用”意指對(duì)受試者口服施用，作為栓劑施用，局部接觸、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、損害內(nèi)或皮下施用，通過吸入施用，或者植入緩釋裝置，例如微型滲透泵。施用通過任何途徑進(jìn)行，包括腸胃外和透粘膜(例如，口腔的、鼻的、陰道的、直腸的或經(jīng)皮的)，特別是通過吸入。腸胃外施用包括，例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、小動(dòng)脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、心室內(nèi)和顱內(nèi)施用。此外，當(dāng)進(jìn)行注射以用于治療腫瘤，例如誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)，可以直接施用至腫瘤和/或施用到腫瘤周圍的組織中。其他遞送方式包括但不限于，使用脂質(zhì)體制劑、靜脈內(nèi)輸注、透皮貼劑，等等。
術(shù)語“改善”是指在治療病理學(xué)狀態(tài)或病狀中任何成功的征候，包括任何客觀或主觀的參數(shù)，例如癥狀的減輕、緩解或減少或者患者身體或精神狀態(tài)的變好。癥狀的改善可以基于客觀或主觀的參數(shù)；包括身體檢查和/或精神病學(xué)評(píng)估的結(jié)果。
術(shù)語“治療”或“療法”是指對(duì)疾病或病狀的“治療”或“處理”，其包括預(yù)防疾病或病狀在傾向于患該疾病但是仍未經(jīng)歷或顯示該疾病癥狀的動(dòng)物中發(fā)生(預(yù)防性治療)、抑制疾病(減緩或阻止其發(fā)展)、提供疾病的癥狀或副作用的減輕(包括姑息療法)和解除疾病(使疾病消退)。
術(shù)語“有效量”或“對(duì)……有效的量”或“治療有效量”或任何語法上等價(jià)的術(shù)語是指當(dāng)施用于動(dòng)物或人以治療疾病時(shí)足夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)該疾病的治療的量。
術(shù)語“分離的”是指這樣的材料，其實(shí)質(zhì)上或基本上不含用于制備該材料的組分。對(duì)于本發(fā)明的肽綴合物，術(shù)語“分離的”是指這樣的材料，其實(shí)質(zhì)上或基本上不含在用于制備該肽綴合物的混合物中通常伴隨該材料的組分?！胺蛛x的”和“純的”可互換使用。通常，本發(fā)明的分離的肽綴合物具有優(yōu)選表示為一定范圍的純度水平。所述肽綴合物的純度范圍的下端為約60％、約70％或約80％，而純度范圍的上端為約70％、約80％、約90％或大于約90％。
當(dāng)肽綴合物大于約90％純時(shí)，它們的純度也優(yōu)選表示為范圍。純度范圍的下端為約90％、約92％、約94％、約96％或約98％。純度范圍的上端為約92％、約94％、約96％、約98％或約100％的純度。
通過任何本領(lǐng)域公認(rèn)的分析方法(例如，經(jīng)銀染的凝膠上的條帶強(qiáng)度、聚丙烯酰胺凝膠電泳、HPLC或類似方法)來測(cè)定純度。
如本文所使用的，“群體的基本上每個(gè)成員”描述本發(fā)明肽綴合物群體的特征，其中所選百分比的添加至肽的經(jīng)修飾的糖被添加至該肽上多個(gè)相同的接納體位點(diǎn)?！叭后w的基本上每個(gè)成員”是說在與經(jīng)修飾的糖相綴合的肽上的位點(diǎn)的“同質(zhì)性”，并且是指至少約80％、優(yōu)選至少約90％和更優(yōu)選至少約95％同質(zhì)的本發(fā)明綴合物。
“同質(zhì)性”是指在與經(jīng)修飾的糖相綴合的接納體部分群體中的結(jié)構(gòu)一致性。因此，在這樣的本發(fā)明肽綴合物(其中每個(gè)經(jīng)修飾的糖部分綴合至這樣的接納體位點(diǎn)，所述接納體位點(diǎn)具有和與每個(gè)其他經(jīng)修飾的糖相綴合的接納體位點(diǎn)相同的結(jié)構(gòu))中，所述肽綴合物被稱為約100％同質(zhì)的。同質(zhì)性通常表示為范圍。肽綴合物的同質(zhì)性范圍的下端為約50％、約60％、約70％或約80％，而純度范圍的上端為約70％、約80％、約90％或大于約90％。
當(dāng)肽綴合物大于或等于約90％同質(zhì)時(shí)，它們的同質(zhì)性也優(yōu)選表示為范圍。同質(zhì)性范圍的下端為約90％、約92％、約94％、約96％或約98％。純度范圍的上端為約92％、約94％、約96％、約98％或約100％的同質(zhì)性。通常，通過一種或多種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如液相色譜法-質(zhì)譜法(LC-MS)、基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDITOF)、毛細(xì)管電泳等，來測(cè)定肽綴合物的純度。
當(dāng)涉及糖肽種類時(shí)，“基本上均一的糖形”或“基本上均一的糖基化模式”是指被目的糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)糖基化的接納體部分的百分比。例如，在α1，2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的情況下，如果在本發(fā)明的肽綴合物中基本上所有的(如下文定義)Galβ1，4-GlcNAc-R及其唾液酸化的類似物均被巖藻糖基化，那么存在基本上均一的巖藻糖基化模式。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，起始材料可以含有糖基化的接納體部分(例如，巖藻糖基化的Galβ1，4-GlcNAc-R部分)。因此，計(jì)算出的糖基化百分比將包括通過本發(fā)明的方法糖基化的接納體部分，以及在起始材料中已經(jīng)被糖基化的那些接納體部分。
在“基本上均一的”上述定義中的術(shù)語“基本上”一般是指對(duì)于特定糖基轉(zhuǎn)移酶而言，至少約40％、至少約70％、至少約80％、或更優(yōu)選至少約90％、和更加優(yōu)選至少約95％的接納體部分被糖基化。
當(dāng)取代基由其從左至右書寫的常規(guī)化學(xué)式來指定時(shí)，它們同等地包括由將該結(jié)構(gòu)從右到左書寫而產(chǎn)生的化學(xué)上相同的取代基，例如，-CH2O-意在也敘述了-OCH2-。
除非另有說明，術(shù)語“烷基”自身或作為另一取代基的一部分，是指具有指定碳原子數(shù)(即，C1-C10是指1至10個(gè)碳)的直鏈或支鏈的或環(huán)狀的烴基或者其組合，其可以是完全飽和的、單或多不飽和的并且可以包括二價(jià)和多價(jià)基團(tuán)。飽和烴基的實(shí)例包括但不限于諸如下列的基團(tuán)甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，叔丁基，異丁基，仲丁基，環(huán)己基，(環(huán)己基)甲基，環(huán)丙基甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和異構(gòu)體，等等。不飽和烷基是具有一個(gè)或多個(gè)雙鍵或三鍵的烷基。不飽和烷基的實(shí)例包括但不限于，乙烯基、2-丙烯基、2-丁烯基、2-異戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基以及高級(jí)同系物和異構(gòu)體。除非另有說明，術(shù)語“烷基”還意味著包括下面更詳細(xì)定義的那些烷基衍生物，例如“雜烷基”。局限于碳?xì)浠衔锘鶊F(tuán)的烷基被稱作“同烷基(homoalkyl)”。
術(shù)語“亞烷基”自身或作為另一取代基的一部分，是指衍生自烷烴的二價(jià)基團(tuán)，例如但不限于-CH2CH2CH2CH2-，并且進(jìn)一步包括下面描述為“雜亞烷基”的那些基團(tuán)。通常，烷基(或亞烷基)將具有1至24個(gè)碳原子，在本發(fā)明中優(yōu)選的是具有10個(gè)或更少碳原子的那些基團(tuán)?！暗图?jí)烷基”或“低級(jí)亞烷基”是較短鏈的烷基或亞烷基，其通常具有8個(gè)或更少碳原子。
術(shù)語“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)以它們的常規(guī)含義使用，并且是指各自通過氧原子、氨基或硫原子附著至該分子的其余部分的那些烷基。
除非另有說明，術(shù)語“雜烷基”自身或與另一術(shù)語相組合地指穩(wěn)定的直鏈或支鏈的或者環(huán)狀的烴基或其組合，其由指定數(shù)目的碳原子和至少一個(gè)選自O(shè)、N、Si和S的雜原子組成，并且其中氮和硫原子可以任選地被氧化以及氮雜原子可以任選地被季銨化?？梢詫㈦s原子O、N和S及Si置于所述雜烷基的任何內(nèi)部位置處或者置于該烷基附著至該分子的其余部分的位置處。實(shí)例包括但不限于，-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多兩個(gè)雜原子可以是連續(xù)的，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。類似地，術(shù)語“雜亞烷基”自身或作為另一取代基的一部分，是指衍生自雜烷基的二價(jià)基團(tuán)，例如但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。對(duì)于雜亞烷基，雜原子也可以占據(jù)鏈末端之一或兩端(例如，亞烷基氧基、亞烷基二氧基、亞烷基氨基、亞烷基二氨基，等等)。另外，對(duì)于亞烷基和雜亞烷基連接基團(tuán)，連接基團(tuán)式的書寫方向并不意味著連接基團(tuán)的取向。例如，式-CO2R’-表示-C(O)OR’-和-OC(O)R’-兩者。
除非另有說明，術(shù)語“環(huán)烷基”和“雜環(huán)烷基”自身或與其他術(shù)語相組合地分別表示“烷基”和“雜烷基”的環(huán)狀形式。另外，對(duì)于雜環(huán)烷基，雜原子可以占據(jù)該雜環(huán)附著至該分子的其余部分的位置。環(huán)烷基的實(shí)例包括但不限于環(huán)戊基、環(huán)己基、1-環(huán)己烯基、3-環(huán)己烯基、環(huán)庚基等。雜環(huán)烷基的實(shí)例包括但不限于1-(1，2，5，6-四氫吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
除非另有說明，術(shù)語“鹵代”或“鹵素”自身或作為另一取代基的一部分，是指氟、氯、溴或碘原子。另外，諸如“鹵代烷基”的術(shù)語意味著包括單鹵代烷基和多鹵代烷基。例如，術(shù)語“鹵代(C1-C4)烷基”意味著包括但不限于，三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
除非另有說明，術(shù)語“芳基”是指多不飽和的芳香族取代基，其可以是單環(huán)或者稠合在一起或共價(jià)連接的多個(gè)環(huán)(優(yōu)選1-3個(gè)環(huán))。術(shù)語“雜芳基”是指包含1-4個(gè)選自N、O、S、Si和B的雜原子的芳基(或環(huán))，其中氮和硫原子任選地被氧化以及氮原子任選地被季銨化。雜芳基可以通過雜原子附著至該分子的其余部分。芳基和雜芳基的非限制性實(shí)例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-聯(lián)苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述各芳基和雜芳基環(huán)體系的取代基選自下述可接受的取代基。
簡言之，術(shù)語“芳基”，當(dāng)與其他術(shù)語組合使用時(shí)(例如芳氧基、芳硫氧基(arylthioxy)、芳基烷基)，包括如上定義的芳基和雜芳基環(huán)兩者。因此，術(shù)語“芳基烷基”意味著包括其中芳基附著至烷基的那些基團(tuán)(例如芐基、苯乙基、吡啶基甲基等)，包括其中碳原子(例如亞甲基)被例如氧原子代替的那些烷基(例如苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。
上述術(shù)語(例如“烷基”、“雜烷基”、“芳基”和“雜芳基”)各自意味著包括所述基團(tuán)的取代的和未取代的形式兩者。下面提供了每種類型的基團(tuán)的優(yōu)選取代基。
烷基和雜烷基(包括通常被稱為亞烷基、鏈烯基、亞雜烷基、雜鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基和雜環(huán)烯基的那些基團(tuán))的取代基通稱為“烷基取代基”，而且它們可以是選自但不限于以下的多種基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的雜環(huán)烷基、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-鹵素、-SiR’R”R’”、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R’”、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R’”)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2，數(shù)目從0至(2m’+1)，其中m’為此類基團(tuán)中碳原子的總數(shù)。R’、R”、R’”和R””各自優(yōu)選獨(dú)立地指氫、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基(例如被1-3個(gè)鹵素取代的芳基)、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基、或者芳基烷基。例如當(dāng)本發(fā)明的化合物包含超過一個(gè)R基團(tuán)時(shí)，獨(dú)立地選擇各個(gè)R基團(tuán)，當(dāng)存在超過一個(gè)R’、R”、R’”和R””基團(tuán)時(shí)，這些基團(tuán)也一樣選擇。當(dāng)R’和R”附著至同一個(gè)氮原子時(shí)，它們可以與該氮原子相組合以形成5-、6-或7-元環(huán)。例如，-NR’R”意味著包括但不限于1-吡咯烷基和4-嗎啉基。從取代基的上述論述中，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，術(shù)語“烷基”意味著包括這樣的基團(tuán)，所述基團(tuán)含有與除氫基團(tuán)之外的其他基團(tuán)例如鹵代烷基(例如-CF3和-CH2CF3)和?；?例如-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)結(jié)合的碳原子。
類似于對(duì)于烷基所描述的取代基，將芳基和雜芳基的取代基通稱為“芳基取代基”。所述取代基選自例如取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的雜環(huán)烷基、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-鹵素、-SiR’R”R’”、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R’”、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R’”)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、氟代(C1-C4)烷氧基和氟代(C1-C4)烷基，數(shù)目從0至該芳環(huán)體系上開放價(jià)的總數(shù)；并且其中R’、R”、R’”和R””優(yōu)選獨(dú)立地選自氫、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的雜芳基。例如當(dāng)本發(fā)明的化合物包含超過一個(gè)R基團(tuán)時(shí)，獨(dú)立地選擇各個(gè)R基團(tuán)，當(dāng)存在超過一個(gè)R’、R”、R’”和R””基團(tuán)時(shí)，這些基團(tuán)也一樣選擇。
在芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的取代基中的兩個(gè)可以任選地被式-T-C(O)-(CRR’)q-U-的取代基代替，其中T和U獨(dú)立地是-NR-、-O-、-CRR’-或單鍵，以及q是0-3的整數(shù)。備選地，在芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的取代基中的兩個(gè)可以任選地被式-A-(CH2)r-B-的取代基代替，其中A和B獨(dú)立地是-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-或單鍵，以及r是1-4的整數(shù)。如此形成的新環(huán)的單鍵之一可以任選地被雙鍵代替。備選地，在芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的取代基中的兩個(gè)可以任選地被式-(CRR’)s-X-(CR”R’”)d-的取代基代替，其中s和d獨(dú)立地是0-3的整數(shù)，以及X是-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR’-。取代基R、R’、R”和R’”優(yōu)選獨(dú)立地選自氫或者取代或未取代的(C1-C6)烷基。
如本文所使用的，術(shù)語“酰基”描述了含有羰基殘基的取代基，C(O)R。R的示例性種類包括H、鹵素、烷氧基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基和取代或未取代的雜環(huán)烷基 如本文所使用的，術(shù)語“稠合的環(huán)體系”是指至少兩個(gè)環(huán)，其中每個(gè)環(huán)與另一個(gè)環(huán)共有至少兩個(gè)原子。稠合的環(huán)體系可以包括芳族以及非芳族環(huán)?！俺砗系沫h(huán)體系”的實(shí)例是萘類、吲哚類、喹啉類、色烯類等等。
如本文所使用的，術(shù)語“雜原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、硅(Si)、硼(B)和磷(P)。
符號(hào)“R”是一般性縮寫，其代表選自下列的取代基取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基和取代或未取代的雜環(huán)烷基。
術(shù)語“可藥用鹽”包括活性化合物的鹽，取決于在本文所述的化合物上發(fā)現(xiàn)的特定取代基，所述鹽用相對(duì)無毒性的酸或堿來制備。當(dāng)本發(fā)明的化合物含有相對(duì)酸性的官能度時(shí)，可以通過使此類化合物的中性形式與足夠量的所希望的堿(純粹的或在合適的惰性溶劑中)接觸來獲得堿加成鹽?？伤幱脡A加成鹽的實(shí)例包括鈉、鉀、鈣、銨、有機(jī)氨基或鎂鹽，或者類似的鹽。當(dāng)本發(fā)明的化合物含有相對(duì)堿性的官能度時(shí)，可以通過使此類化合物的中性形式與足夠量的所希望的酸(純粹的或在合適的惰性溶劑中)接觸來獲得酸加成鹽?？伤幱盟峒映甥}的實(shí)例包括源自無機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸、碳酸氫根、磷酸、磷酸一氫根、磷酸二氫根、硫酸、硫酸氫根、氫碘酸或者亞磷酸等等的那些鹽，以及源自相對(duì)無毒的有機(jī)酸如乙酸、丙酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富馬酸、乳酸、扁桃酸、鄰苯二甲酸、苯磺酸、對(duì)甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸、甲磺酸等等的鹽。還包括氨基酸例如精氨酸等的鹽，和有機(jī)酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的鹽(參見例如，Berge等人，Journal of Pharmaceutical Science，661-19(1977))。本發(fā)明的某些具體化合物同時(shí)含有允許所述化合物轉(zhuǎn)化成堿或酸加成鹽的堿性和酸性官能度。
所述化合物的中性形式優(yōu)選通過使該鹽與堿或酸接觸并且以常規(guī)方式分離親本化合物來再生。所述化合物的親本形式在某些物理性質(zhì)，例如在極性溶劑中的溶解度方面與所述各種鹽形式不同，但是對(duì)于本發(fā)明的目的，所述鹽等同于所述化合物的親本形式。
除了鹽形式之外，本發(fā)明還提供了前體藥物形式的化合物。本文所述的化合物的前體藥物是在生理?xiàng)l件下容易經(jīng)歷化學(xué)改變以提供本發(fā)明化合物的那些化合物。此外，可以在離體環(huán)境中通過化學(xué)或生物化學(xué)方法將前體藥物轉(zhuǎn)化為本發(fā)明的化合物。例如，當(dāng)被置于具有合適的酶或化學(xué)試劑的透皮貼劑貯庫中時(shí)，前體藥物可以緩慢地轉(zhuǎn)化為本發(fā)明的化合物。
本發(fā)明的某些化合物可以以非溶劑化形式以及溶劑化形式(包括水合形式)存在。通常，溶劑化形式等同于非溶劑化形式，并且被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的某些化合物可以以多晶或無定形形式存在。通常，所有物理形式對(duì)于本發(fā)明所考慮的用途而言是等同的，并且旨在在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的某些化合物具有不對(duì)稱碳原子(光學(xué)中心)或雙鍵；外消旋物、非對(duì)映異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體和獨(dú)個(gè)異構(gòu)體被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
可以將本發(fā)明的化合物制備為單一的異構(gòu)體(例如，對(duì)映異構(gòu)體、順反異構(gòu)體、位置異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體)或制備為異構(gòu)體的混合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將所述化合物制備為基本上單一的異構(gòu)體。用于制備基本上異構(gòu)體純的化合物的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，可以通過下列方式來制備對(duì)映異構(gòu)體富集的混合物和純的對(duì)映異構(gòu)體化合物使用對(duì)映異構(gòu)體純的合成中間體，并結(jié)合使得在手性中心的立體化學(xué)保持不變或者導(dǎo)致其完全轉(zhuǎn)化的反應(yīng)。備選地，可以將沿著合成途徑的終產(chǎn)物或中間體拆分為單一的立體異構(gòu)體。用于轉(zhuǎn)化特定的手性中心或者使其保持不變的技術(shù)以及用于拆分立體異構(gòu)體混合物的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，并且完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員就具體情況而選擇合適方法的能力之內(nèi)。一般地，可參見，F(xiàn)urniss等人(eds.)，VOGEL’SENCYCLOPEDIA OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY 5TH ED.，Longman Scientific and Technical Ltd.，Essex，1991，pp.809-816；和Heller，Acc.Chem.Res.23128(1990)。
本文所使用的外消旋的、ambiscalemic和scalemic或?qū)τ钞悩?gòu)體純的化合物的圖形顯示來自Maehr，J.Chem.Ed.，62114-120(1985)實(shí)心且間斷的楔形用于表示手性元素的絕對(duì)構(gòu)型；波浪線表示否定了它所代表的鍵可以產(chǎn)生的任何立體化學(xué)暗示；實(shí)心且間斷的粗線是幾何描述符，其指出所顯示的相對(duì)構(gòu)型但是不暗示任何絕對(duì)立體化學(xué)；以及楔形輪廓和點(diǎn)線或虛線表示具有不確定的絕對(duì)構(gòu)型的對(duì)映異構(gòu)體純的化合物。
術(shù)語“對(duì)映異構(gòu)體過量”和“非對(duì)映異構(gòu)體過量”在本文中可互換使用。具有單個(gè)立體中心的化合物被稱作以“對(duì)映異構(gòu)體過量”存在，具有至少兩個(gè)立體中心的化合物被稱作以“非對(duì)映異構(gòu)體過量”存在。
本發(fā)明的化合物還可以在構(gòu)成此類化合物的一個(gè)或多個(gè)原子處含有非天然比例的原子同位素。例如，所述化合物可以用放射性同位素例如氚(3H)、氘(2D)、碘-125(125I)或碳-14(14C)來進(jìn)行放射性標(biāo)記。本發(fā)明化合物的所有同位素變化形式(不論是否為放射性的)意在被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
如本文所使用的，“反應(yīng)性官能團(tuán)”是指這樣的基團(tuán)，所述基團(tuán)包括但不限于，烯烴、炔、醇、酚、醚、氧化物、鹵化物、醛、酮、羧酸、酯、酰胺、氰酸鹽、異氰酸鹽、硫氰酸鹽、異硫氰酸鹽、胺、肼、腙、酰肼、重氮基、重氮化物(diazonium)、硝基、腈、硫醇、硫化物、二硫化物、亞砜、砜、磺酸、亞磺酸、縮醛、縮酮、酐、硫酸鹽、次磺酸、異腈、脒、酰亞胺、亞胺酸鹽、硝酮、羥胺、肟、異羥肟酸、硫代異羥肟酸、丙二烯類、原酸酯、亞硫酸鹽、烯胺、炔胺、脲、假脲、氨基脲、碳二亞胺、氨基甲酸酯、亞胺、疊氮化物、偶氮化合物、氧化偶氮化合物和亞硝基化合物。反應(yīng)性官能團(tuán)還包括用于制備生物綴合物的那些，例如N-羥基琥珀酰亞胺酯、馬來酰亞胺類等等。用于制備每一種這些官能團(tuán)的方法是本領(lǐng)域公知的，并且它們對(duì)于具體目的的應(yīng)用或修飾在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)(參見例如，Sandler和Karo，eds.ORGANIC FUNCTIONAL GROUPPREPARATIONS，Academic Press，San Diego，1989)。
“非共價(jià)蛋白質(zhì)結(jié)合基團(tuán)”是以聯(lián)合方式與完整的或變性的多肽相互作用的部分。該相互作用在生物環(huán)境中可以是可逆的或不可逆的。向本發(fā)明的螯合劑或絡(luò)合物中摻入“非共價(jià)蛋白質(zhì)結(jié)合基團(tuán)”給該試劑或絡(luò)合物提供了非共價(jià)方式與多肽相互作用的能力。示例性的非共價(jià)相互作用包括疏水-疏水和靜電相互作用。示例性的“非共價(jià)蛋白質(zhì)結(jié)合基團(tuán)”包括陰離子基團(tuán)，例如，磷酸鹽、硫代磷酸鹽、膦酸鹽、羧酸鹽、硼酸鹽、硫酸鹽、砜、磺酸鹽、硫代硫酸鹽和硫代磺酸鹽。
“糖基轉(zhuǎn)移酶截短”或“截短的糖基轉(zhuǎn)移酶”或者語法變化形式是指這樣的糖基轉(zhuǎn)移酶，其具有比天然存在的糖基轉(zhuǎn)移酶更少的氨基酸殘基，但是保留了某種酶促活性。截短的糖基轉(zhuǎn)移酶包括例如，截短的GnT1酶，截短的GalT1酶，截短的ST3GalIII酶，截短的GalNAc-T2酶，截短的Core-1-GalT1酶，約32至約90個(gè)氨基酸殘基(參見例如，人的酶)；截短的ST3Gal1酶，截短的ST6GalNAc-1酶和截短的GalNAc-T2酶。可以刪除任何數(shù)目的氨基酸殘基，只要該酶保留活性。在一些實(shí)施方案中，可以刪除結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域的一部分，例如，可以刪除信號(hào)-錨結(jié)構(gòu)域，而留下包含干區(qū)(stem region)和催化結(jié)構(gòu)域的截短；可以刪除信號(hào)-錨結(jié)構(gòu)域和干區(qū)的一部分，而留下包含剩余的干區(qū)和催化結(jié)構(gòu)域的截短；或者可以刪除信號(hào)-錨結(jié)構(gòu)域和干區(qū)，而留下包含催化結(jié)構(gòu)域的截短。糖基轉(zhuǎn)移酶截短也可以發(fā)生在該蛋白質(zhì)的C-末端。例如，一些GalNAcT酶，如GalNAc-T2，具有C-末端凝集素結(jié)構(gòu)域，其可以被刪除而不減少酶促活性。
“重折疊表達(dá)系統(tǒng)”是指具有氧化性細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的細(xì)菌或其他微生物，當(dāng)在該微生物中表達(dá)含有二硫鍵的蛋白質(zhì)時(shí)，所述微生物能夠以它們的正確/活性形式重折疊所述蛋白質(zhì)。實(shí)例包括基于大腸桿菌(E.coli)(例如，OrigamiTM(經(jīng)修飾的大腸桿菌trxB-/gor-)、Origami2TM等等)、假單胞菌(Pseudomonas)(例如，熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens))的系統(tǒng)。關(guān)于OrigamiTM技術(shù)的示例性參考文獻(xiàn)，參見例如，Lobel等人，Endocrine 2001，14(2)205-212；和Lobel等人，Protein Express.Purif.2002，25(1)124-133，這些參考文獻(xiàn)中的每一篇通過提及而合并入本文。
III.引言 本發(fā)明提供了包含一個(gè)或多個(gè)O-聯(lián)糖基化序列的多肽，其中每個(gè)糖基化序列是糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，GlcNAc轉(zhuǎn)移酶)的底物。所述酶催化糖基部分(例如，葡糖胺部分)從糖基供體分子(例如，UDP-GlcNAc)轉(zhuǎn)移到氨基酸側(cè)鏈的氧原子(糖基化位點(diǎn))上，其中所述氨基酸(例如，絲氨酸或蘇氨酸)是所述O-聯(lián)糖基化序列的一部分。在備選的實(shí)施方案中，所述氨基酸包含巰基(例如，半胱氨酸)而非羥基。
本發(fā)明還提供了多肽綴合物，其中經(jīng)修飾的糖部分直接(例如，通過糖PEG化反應(yīng))或間接(例如，通過間插性糖基殘基)附著至位于所述多肽內(nèi)的O-聯(lián)或S-聯(lián)糖基化序列。還提供了制備本發(fā)明的綴合物的方法。
本發(fā)明的糖基化和糖PEG化方法可以在摻入了O-聯(lián)或S-聯(lián)糖基化序列的任何多肽上實(shí)施。在一個(gè)實(shí)施方案中，將糖基化序列通過突變引入到親本多肽的氨基酸序列中，從而產(chǎn)生本發(fā)明的非天然存在的多肽。親本多肽可以是任何多肽。實(shí)例包括野生型多肽和已經(jīng)從它們的天然存在的對(duì)應(yīng)物進(jìn)行了修飾(例如，通過突變)而得的那些多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，親本多肽是治療性多肽，例如人生長激素(hGH)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)或治療性抗體。因此，本發(fā)明提供了在它們的氨基酸序列內(nèi)包含一個(gè)或多個(gè)糖基化序列的治療性多肽的綴合物，所述糖基化序列獨(dú)立地選自S-聯(lián)和O-聯(lián)糖基化序列。
在各種實(shí)例中，本發(fā)明的方法提供了具有延長的治療半壽期的多肽綴合物，所述延長的治療半壽期是由于例如降低的清除速率或者降低的被免疫或網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)攝取的速率而引起的。此外，本發(fā)明的方法提供了用于掩蔽肽上的抗原決定簇從而減小或消除針對(duì)該肽的宿主免疫應(yīng)答的方法。使用合適的經(jīng)修飾的糖將靶向性試劑選擇性地附著至肽也可以用于將肽靶向特定組織或細(xì)胞表面受體(其對(duì)于特定的靶向性試劑是特異的)。
另外，本發(fā)明的方法可以用于調(diào)節(jié)親本多肽的“生物學(xué)活性譜”。發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，使用本發(fā)明的方法將修飾基團(tuán)例如水溶性聚合物(例如，mPEG)共價(jià)附著至親本多肽可以不僅改變所得多肽種類的生物利用率、藥效動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、免疫原性、代謝穩(wěn)定性、生物分布和水溶性，而且可以導(dǎo)致不希望的治療活性降低或者導(dǎo)致所希望的治療活性增強(qiáng)。例如，前者以在造血?jiǎng)┐偌t細(xì)胞生成素(EPO)上觀察到。某些化學(xué)PEG化的EPO變體顯示出降低的促紅細(xì)胞生成活性，而同時(shí)保持了野生型多肽的組織保護(hù)性活性。此類結(jié)果描述于例如美國專利6,531,121；WO2004/096148，WO2006/014466，WO2006/014349，WO2005/025606和WO2002/053580中。可用于評(píng)估所選多肽的差別生物學(xué)活性的示例性細(xì)胞系概述于下面的表1中 表1用于各種多肽的生物學(xué)評(píng)估的細(xì)胞系 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽綴合物顯示出降低或增強(qiáng)的對(duì)于生物學(xué)靶蛋白(例如，受體)、天然配體或非天然配體例如抑制劑的結(jié)合親和力。例如，消除對(duì)一類特定受體的結(jié)合親和力可以減少或消除相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和下游生物學(xué)事件。因此，本發(fā)明的方法可以用于產(chǎn)生多肽綴合物，其具有與所述綴合物所衍生自的親本多肽相同、相似或不同的治療譜。本發(fā)明的方法可以用于鑒定具有特定的(例如改進(jìn)的)生物學(xué)功能的經(jīng)糖PEG化的治療劑以及“細(xì)調(diào)”任何治療性多肽或其他生物學(xué)活性多肽的治療譜。
IV.組合物 多肽 本發(fā)明提供了非天然存在的多肽，其對(duì)應(yīng)于親本多肽并具有包含至少一個(gè)本發(fā)明的外源O-聯(lián)糖基化序列的氨基酸序列，其中所述O-聯(lián)糖基化序列在所述非天然存在的多肽所衍生自的相應(yīng)親本多肽中不存在或者在所述非天然存在的多肽所衍生自的相應(yīng)親本多肽中的相同位置處不存在。
在一個(gè)實(shí)例中，由本發(fā)明提供的多肽的氨基酸序列包含O-聯(lián)糖基化序列，所述O-聯(lián)糖基化序列(當(dāng)作為多肽的一部分時(shí))是一種或多種野生型的、突變型的或截短的糖基轉(zhuǎn)移酶的底物。優(yōu)選的糖基轉(zhuǎn)移酶包括GlcNAc轉(zhuǎn)移酶。示例性的GlcNAc轉(zhuǎn)移酶由SEQ ID NOs1-9和228至230來表示。
在示例性的實(shí)施方案中，通過經(jīng)突變來改變親本多肽(例如，野生型多肽)的氨基酸序列而產(chǎn)生本發(fā)明的非天然存在的多肽。所得的多肽變體包含至少一個(gè)“O-聯(lián)糖基化序列”，所述O-聯(lián)糖基化序列在相應(yīng)的親本多肽中不存在或者在相應(yīng)的親本多肽中的相同位置處不存在。所述非天然存在的多肽的氨基酸序列可以包含天然存在的(內(nèi)源的)和非天然存在的(外源的)O-聯(lián)糖基化序列的組合，只要存在至少一個(gè)外源O-聯(lián)糖基化序列。
親本多肽可以是任何多肽。示例性的親本多肽包括野生型多肽及其片段以及從它們的天然存在的對(duì)應(yīng)物進(jìn)行修飾(例如，通過事先的突變或截短)而得的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽是治療性多肽，例如用作藥物試劑(即，經(jīng)批準(zhǔn)的藥物)的那些。多肽的非限制性選擇顯示在于2006年6月8日提交的美國專利申請(qǐng)10/552,896(其通過提及而合并入本文)的圖28中。因此，本發(fā)明提供了在它們的氨基酸序列內(nèi)包含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列的治療性多肽的糖綴合物。
示例性的親本和野生型多肽包括生長因子，例如肝細(xì)胞生長因子(HGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(例如，F(xiàn)GF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-19、FGF-20、FGF-21、FGF-22和FGF-23)、凝血因子(例如，因子V、因子VII、因子VIII、B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII、部分B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII、vWF-因子VIII融合物(例如，其具有全長的、B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII或部分B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII)、因子IX、因子X和因子XIII)、激素(例如，人生長激素(hGH)和促卵泡激素(FSH))以及細(xì)胞因子(例如，白細(xì)胞介素(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18)和干擾素(例如，INF-α、 INF-β、INF-γ))。
其他示例性的多肽包括酶，例如葡糖腦苷脂酶、α-半乳糖苷酶(例如，F(xiàn)abrazymeTM)、酸性-α-葡糖苷酶(酸性麥芽糖酶)、艾杜糖苷酸酶例如α-L-艾杜糖苷酸酶(例如，AldurazymeTM)、甲狀腺過氧化物酶(TPO)、β-葡糖苷酶(參見例如，在美國專利申請(qǐng)?zhí)?0/411,044中描述的酶)、芳基硫酸酯酶、天冬酰胺酶、α-葡糖神經(jīng)酰胺酶、鞘磷脂酶、丁酰膽堿酯酶、尿激酶和α-半乳糖苷酶A(參見例如，在美國專利號(hào)7,125,843中描述的酶)。
其他示例性的親本多肽包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白(例如，BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14、BMP-15)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白(例如，NT-3、NT-4、NT-5)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、生長分化因子(例如，GDF-5)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、馮維勒布蘭德因子(vWF)、vWF切割蛋白酶(vWF蛋白酶、vWF降解蛋白酶)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、α1-抗胰蛋白酶(ATT或α-1蛋白酶抑制劑)、組織型血纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)、蛭素、瘦蛋白、尿激酶、人DNA酶、胰島素、乙型肝炎表面蛋白(HbsAg)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、嵌合的白喉毒素-IL-2、胰高血糖素樣肽(例如，GLP-1和GLP-2)、抗凝血酶III(AT-III)、prokinetisin、CD4、α-CD20、腫瘤壞死因子受體(TNF-R)、P-選擇蛋白糖蛋白配體-1(PSGL-1)、補(bǔ)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白、依賴于糖基化的細(xì)胞粘著分子(GlyCAM)、神經(jīng)細(xì)胞粘著分子(N-CAM)、TNF受體-IgG Fc區(qū)融合蛋白、伸展蛋白-4、BDNF、β-2-微球蛋白、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、纖維蛋白原、GDF(例如，GDF-1、GDF-2、GDF-3、GDF-4、GDF-5、GDF-6-15)、GDNF和GLP-1。一些上面所列出的多肽的示例性氨基酸序列描述在美國專利號(hào)7,214,660中，所有這些均通過提及而合并入本文。
也在本發(fā)明范圍內(nèi)的是為抗體的多肽。術(shù)語“抗體”意在包括抗體片段(例如，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域)、單鏈抗體、Lama抗體、納米抗體(nano-bodies)等等。該術(shù)語還包括抗體融合蛋白，例如Ig嵌合體。優(yōu)選的抗體包括人源化的單克隆抗體或其片段。此類抗體的所有已知的同種型在本發(fā)明范圍內(nèi)。示例性的抗體包括針對(duì)生長因子，例如內(nèi)皮生長因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長因子(例如，針對(duì)VEGF-A的單克隆抗體，如雷珠單抗(LucentisTM))和成纖維細(xì)胞生長因子(例如，F(xiàn)GF-7、FGF-21和FGF-23)的抗體，以及針對(duì)它們各自受體的抗體。其他示例性的抗體包括抗TNF-α單克隆抗體(參見例如，美國專利申請(qǐng)?zhí)?0/411,043)，TNF受體-IgG Fc區(qū)融合蛋(例如，EnbrelTM)，抗HER2單克隆抗體(例如，HerceptinTM)，針對(duì)呼吸道合胞病毒的蛋白F的單克隆抗體(例如，SynagisTM)，針對(duì)TNF-α的單克隆抗體(例如，RemicadeTM)，針對(duì)糖蛋白例如IIb/IIIa的單克隆抗體(例如，ReoproTM)，針對(duì)CD20(例如，RituxanTM)、CD4和α-CD3的單克隆抗體，針對(duì)PSGL-1和CEA的單克隆抗體。任一上面所列多肽的任何經(jīng)修飾的(例如，經(jīng)突變的)形式也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
可以使用本領(lǐng)域已知和下文描述的方法來產(chǎn)生本發(fā)明的突變型多肽。
O-聯(lián)糖基化序列 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列天然存在于野生型多肽中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述O-聯(lián)糖基化序列不存在于親本多肽中或不存在于親本多肽中的相同位置處，并且通過突變或其他方法被引入到親本多肽中。本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列可以是任何短的氨基酸序列(例如，1至10個(gè)，優(yōu)選地約3至9個(gè)氨基酸殘基)，其包含有至少一個(gè)在其側(cè)鏈中具有羥基的氨基酸(例如，絲氨酸、蘇氨酸)。該羥基標(biāo)記出了糖基化位點(diǎn)。
每個(gè)本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列的糖基化效率取決于酶以及該糖基化序列的背景，尤其是糖基化位點(diǎn)周圍的多肽的三維結(jié)構(gòu)。
O-聯(lián)糖基化序列的定位 在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)作為多肽(例如，本發(fā)明的序列肽段多肽)的一部分時(shí)，O-聯(lián)或S-聯(lián)糖基化序列是糖基轉(zhuǎn)移酶的底物。在一個(gè)實(shí)例中，糖基化序列是GlcNAc轉(zhuǎn)移酶的底物。在另一個(gè)實(shí)例中，糖基化序列是經(jīng)修飾的酶(例如截短的GlcNAc轉(zhuǎn)移酶)的底物。在合適的糖基化反應(yīng)期間每個(gè)本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列被糖基化的效率可以取決于酶的類型和性質(zhì)，也可以取決于糖基化序列的背景，尤其是糖基化位點(diǎn)周圍的多肽的三維結(jié)構(gòu)。
一般地，可以在多肽的氨基酸序列內(nèi)的任何位置處引入O-聯(lián)糖基化序列。在一個(gè)實(shí)例中，在親本多肽的N-末端(即，第一個(gè)氨基酸之前或者緊接第一個(gè)氨基酸之后)引入糖基化序列(氨基末端突變體)。在另一個(gè)實(shí)例中，在親本多肽的氨基末端附近(例如，在N-末端的10個(gè)氨基酸殘基內(nèi))引入糖基化序列。在另一個(gè)實(shí)例中，糖基化序列位于親本多肽的C-末端緊接親本多肽最后一個(gè)氨基酸之后(羧基末端突變體)。在另外一個(gè)實(shí)例中，在親本多肽的C-末端附近(例如，在C-末端的10個(gè)氨基酸殘基內(nèi))引入糖基化序列。在另外一個(gè)實(shí)例中，O-聯(lián)糖基化序列位于親本多肽的N-末端和C-末端之間的任何位置(內(nèi)部突變體)。一般優(yōu)選的是，經(jīng)修飾的多肽是生物學(xué)上有活性的，即使生物活性從對(duì)應(yīng)的親本多肽的生物活性發(fā)生了改變。
影響序列肽段多肽的糖基化效率的一個(gè)重要因素是糖基化位點(diǎn)(例如，絲氨酸或蘇氨酸側(cè)鏈)對(duì)于糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，GlcNAc轉(zhuǎn)移酶)和其他反應(yīng)參與物(包括溶劑分子)的可接近性。如果糖基化序列位于三維多肽結(jié)構(gòu)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)域內(nèi)，那么糖基化將可能是無效率的。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在多肽的這樣的區(qū)域中引入糖基化序列，所述區(qū)域?qū)?yīng)于該多肽的溶劑暴露表面。示例性的多肽構(gòu)象是這樣的，即其中糖基化序列的羥基不是向內(nèi)的，與多肽的其他區(qū)域形成氫鍵。另一示例性的構(gòu)象是這樣的，即其中羥基不可能形成氫鍵。
在一個(gè)實(shí)例中，在親本蛋白質(zhì)的預(yù)先選擇的特定區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生糖基化序列。實(shí)際上，多肽主鏈的糖基化常常發(fā)生在該多肽的環(huán)區(qū)域內(nèi)并且通常不發(fā)生在螺旋或β-折疊片結(jié)構(gòu)內(nèi)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，通過在親本多肽的對(duì)應(yīng)于環(huán)結(jié)構(gòu)域的區(qū)域中引入O-聯(lián)糖基化序列來產(chǎn)生本發(fā)明的序列肽段多肽。
例如，蛋白質(zhì)BMP-7的晶體結(jié)構(gòu)在Ala72和Ala86之間以及在Ile96和Pro103之間含有兩個(gè)延伸的環(huán)區(qū)域。產(chǎn)生BMP-7突變體(其中O-聯(lián)糖基化序列被置于多肽序列的那些區(qū)域內(nèi))可以導(dǎo)致這樣的多肽，其中所述突變引起該多肽的最初三級(jí)結(jié)構(gòu)的很小的破壞或無破壞。
然而，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在位于β-折疊片或α-螺旋構(gòu)象內(nèi)的氨基酸位置處引入O-聯(lián)糖基化序列還可以導(dǎo)致在新引入的O-聯(lián)糖基化序列處被有效糖基化的序列肽段多肽。在β-折疊片或α-螺旋結(jié)構(gòu)域中引入O-聯(lián)糖基化序列可以引起多肽的結(jié)構(gòu)改變，這又使得可以有效糖基化(參見例如，于2007年7月23日提交的美國專利申請(qǐng)11/781,885，其通過提及而以其整體合并入本文以用于所有目的)。
蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)可以用于鑒定野生型或親本多肽的最適合于引入O-聯(lián)糖基化序列的那些結(jié)構(gòu)域，并且可以允許預(yù)先選擇有希望的修飾位點(diǎn)。
當(dāng)晶體結(jié)構(gòu)不可得時(shí)，多肽的氨基酸序列可以用于預(yù)先選擇有希望的修飾位點(diǎn)(例如，預(yù)測(cè)環(huán)結(jié)構(gòu)域?qū)Ζ?螺旋結(jié)構(gòu)域)。然而，即使多肽的三維結(jié)構(gòu)是已知的，結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)和酶/受體相互作用在溶液中也是可變的。因此，合適的突變位點(diǎn)的鑒定以及合適的糖基化序列的選擇可以涉及產(chǎn)生一些序列肽段多肽(例如，本發(fā)明的序列肽段多肽文庫)，以及使用合適的篩選方案(例如，本文所述的那些方案)就所希望的特征來測(cè)試那些變體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，親本多肽是抗體或抗體片段。在一個(gè)實(shí)例中，用本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列來修飾抗體或抗體片段的恒定區(qū)(例如，CH2結(jié)構(gòu)域)。在一個(gè)實(shí)例中，以這樣的方式引入O-聯(lián)糖基化序列，即使得天然存在的N-聯(lián)糖基化序列被替代或在功能上受損。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過CH2結(jié)構(gòu)域的所選區(qū)域來進(jìn)行序列肽段掃描，從而產(chǎn)生抗體文庫，每個(gè)抗體包含本發(fā)明的外源O-聯(lián)糖基化序列。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，使所得的多肽變體經(jīng)歷酶促糖基化反應(yīng)，從而向所引入的糖基化序列添加糖基部分?？梢跃退鼈兘Y(jié)合合適受體(例如，F(xiàn)c受體，如FcγRIIIa)的能力來分析被充分糖基化的那些變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)與親本抗體或其經(jīng)天然糖基化的形式相比較時(shí)，此類經(jīng)糖基化的抗體或抗體片段顯示出增加的與Fc受體的結(jié)合親和力。本發(fā)明的該方面進(jìn)一步描述在于2007年1月18日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)60/881,130(該專利申請(qǐng)的公開內(nèi)容以其整體合并入本文)中。所描述的修飾可以改變抗體的效應(yīng)子功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)糖基化的抗體變體顯示出降低的效應(yīng)子功能，例如降低的與存在于天然殺傷細(xì)胞表面上或存在于殺傷T-細(xì)胞表面上的受體的結(jié)合親和力。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，不將O-聯(lián)或S-聯(lián)糖基化序列引入親本多肽序列之內(nèi)，而是通過在該親本多肽的N-或C-末端處添加肽接頭片段來延伸親本多肽的序列，其中所述肽接頭片段包含本發(fā)明的O-聯(lián)或S-聯(lián)糖基化序列，例如“PVS”。肽接頭片段可以具有任何數(shù)目的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，肽接頭片段包含至少約5個(gè)、至少約10個(gè)、至少約15個(gè)、至少約20個(gè)、至少約30個(gè)、至少約50個(gè)或超過50個(gè)氨基酸殘基。肽接頭片段任選地包含內(nèi)部或末端氨基酸殘基，其具有反應(yīng)性官能團(tuán)，例如氨基(例如，賴氨酸)或巰基(例如，半胱氨酸)。此類反應(yīng)性官能團(tuán)可以用于將該多肽連接至另一部分，例如另一多肽、細(xì)胞毒素、小分子藥物或另一個(gè)本發(fā)明的修飾基團(tuán)。本發(fā)明的該方面進(jìn)一步描述在于2007年1月18日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)60/881,130(該專利申請(qǐng)的公開內(nèi)容以其整體合并入本文)中。在示例性的實(shí)施方案中，肽接頭片段包含賴氨酸殘基，其用作該接頭的分支點(diǎn)，例如賴氨酸的氨基用作該接頭的“臂”的附著點(diǎn)。在示例性的實(shí)施方案中，賴氨酸替代甲硫氨酸部分。在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，通過形成二硫鍵，用具有相同或不同結(jié)構(gòu)的另一個(gè)接頭片段來二聚化該接頭片段。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用本發(fā)明的肽接頭片段修飾的親本多肽是抗體或抗體片段。在根據(jù)該實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)例中，親本多肽是scFv。本文所述的方法可用于制備本發(fā)明的scFvs，其中scFv或接頭用糖基部分或者用通過糖基連接基團(tuán)附著至該肽的修飾基團(tuán)來進(jìn)行修飾。糖基化和糖綴合的示例性方法在例如PCT/US02/32263和美國專利申請(qǐng)?zhí)?0/411,012中給出，這些文獻(xiàn)中的每一篇通過提及而以其整體合并入本文。
發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)O-聯(lián)糖基化序列在糖基化位點(diǎn)(例如，絲氨酸或蘇氨酸殘基)附近包含脯氨酸(P)殘基時(shí)，糖基化是最有效的。在一個(gè)實(shí)施方案中，脯氨酸殘基在糖基化位點(diǎn)之前(被發(fā)現(xiàn)朝向糖基化位點(diǎn)的N-末端)。根據(jù)該實(shí)施方案的示例性的糖基化位點(diǎn)包括PVS、PB2VT和P(B2)2VT。通常，在脯氨酸殘基和糖基化位點(diǎn)之間存在有0至5個(gè)，優(yōu)選地0至4個(gè)，和更優(yōu)選地0至3個(gè)氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，脯氨酸殘基被發(fā)現(xiàn)朝向糖基化位點(diǎn)的C-末端。根據(jù)該實(shí)施方案的示例性的本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化位點(diǎn)包括SB7TP和SB7SP。
在一個(gè)實(shí)施方案中，某些氨基酸殘基被包括在O-聯(lián)糖基化序列中以調(diào)節(jié)經(jīng)突變的多肽在特定生物(例如大腸桿菌)中的表達(dá)能力，該多肽的蛋白水解穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)特征和/或其他性質(zhì)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列包含作為選自如下顯示的式(I)至(VI)的成員的氨基酸序列 (B1)aP(B2)bUS(B3)c(I) (B1)aP(B2)bUT(B3)c(II) (B4)dPSZ(B5)e (III) (B4)dPTZ(B5)e (IV) (B6)fS(B7)gP(B8)h (V) (B6)fT(B7)gP(B8)h (VI) 在式(I)至(VI)中，整數(shù)b和g獨(dú)立地選自0至2。整數(shù)a、c、d、e、f和h獨(dú)立地選自0至5。T是蘇氨酸，S是絲氨酸，和P是脯氨酸。U是選自V(纈氨酸)、S(絲氨酸)、T(蘇氨酸)、E(谷氨酸)、Q(谷氨酰胺)和不帶電荷的氨基酸的成員。Z是選自P、E、Q、S、T和不帶電荷的氨基酸的成員，并且B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7和B8各自是獨(dú)立地選自氨基酸的成員。
在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多糖包含作為選自下列式的成員的O-聯(lián)糖基化序列 (B1)aPVS(B3)c (SEQ ID NO16)； (B1)aPVT(B3)c (SEQ ID NO17)； (B1)aPSS(B3)c (SEQ ID NO18)； (B1)aPST(B3)c (SEQ ID NO19)； (B1)aPTS(B3)c (SEQ ID NO20)； (B1)aPB2VT(B3)c (SEQ ID NO21)； (B1)aPB2VS(B3)c (SEQ ID NO22)； (B1)aPKUT(B3)c(SEQ ID NO23)； (B1)aPKUS(B3)c(SEQ ID NO24)； (B1)aPQUT(B3)c(SEQ ID NO25)； (B1)aPQUS(B3)c(SEQ ID NO26)； (B1)aP(B2)2VS(B3)c(SEQ ID NO27)； (B1)aP(B2)2VT(B3)c(SEQ ID NO28)； (B1)aP(B2)2TS(B3)c(SEQ ID NO29)； (B1)aP(B2)2TT(B3)c(SEQ ID NO30)； (B4)dPTP(B5)e (SEQ ID NO31)； (B4)dPTE(B5)e (SEQ ID NO32)； (B4)dPSA(B5)e (SEQ ID NO33)； (B6)fSB7TP(B8)h (SEQ ID NO34)；和 (B6)fSB7SP(B8)h (SEQ ID NO35)， 其中，a、b、c、d、e、f、g、h、B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7和B8如上文所定義。
在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列包含作為選自下列的成員的氨基酸序列 PVS(SEQ ID NO36)、PVSG(SEQ ID NO37)、PVSGS(SEQ ID NO38)、VPVS(SEQ ID NO39)、VPVSG(SEQ ID NO40)、VPVSGS(SEQ ID NO41)、PVSR(SEQ ID NO42)、PVSRE(SEQ ID NO43)、PVSA(SEQ ID NO44)、PVSAS(SEQ ID NO45)、APVS(SEQ ID NO46)、APVSA(SEQ IDNO47)、APVSAS(SEQ ID NO48)、APVSS(SEQ ID NO49)、APVSSS(SEQ ID NO50)、PVSS(SEQ ID NO51)、PVSSA(SEQ ID NO52)、PVSSAP(SEQ ID NO53)、IPVS(SEQ ID NO54)、PVSR(SEQ ID NO55)、PVSRE(SEQ ID NO56)、IPVSR(SEQ ID NO57)、VPVS(SEQ IDNO58)、VPVSS(SEQ ID NO59)、VPVSSA(SEQ ID NO60)、RPVS(SEQID NO61)、RPVSS(SEQ ID NO62)、RPVSSA(SEQ ID NO63)、PVT(SEQ ID NO64)、PSS(SEQ ID NO65)、PSST(SEQ ID NO66)、PSSTA(SEQ ID NO67)、PPSS(SEQ ID NO68)、PPSST(SEQ ID NO69)、PSSG(SEQ ID NO70)、PSSGF(SEQ ID NO71)、SPST(SEQ ID NO72)、SPSTS(SEQ ID NO73)、SPSTSP(SEQ ID NO74)、SPSS(SEQ ID NO75)、SPSSG(SEQ ID NO76)、SPSSGF(SEQ ID NO77)、PST(SEQ ID NO78)、PSTS(SEQ ID NO79)、PSTST(SEQ ID NO80)、PSTV(SEQ ID NO81)、PSTVS(SEQ ID NO82)、PSVT(SEQ ID NO83)、PSVTI(SEQ ID NO84)、PSVS(SEQ ID NO85)、PAVT(SEQ ID NO86)、PAVTA(SEQ ID NO87)、PAVTAA(SEQ ID NO88)、KPAVT(SEQ ID NO89)、KPAVTA(SEQID NO90)、PAVS(SEQ ID NO91)、PQQS(SEQ ID NO92)、PQQSA(SEQID NO93)、PQQSAS(SEQ ID NO94)、PQQT(SEQ ID NO95)、PKGS(SEQ ID NO96)、PKGSR(SEQ ID NO97)、PKGT(SEQ ID NO98)、PKSS(SEQ ID NO99)、PKSSA(SEQ ID NO100)、PKSSAP(SEQ ID NO101)、PKST(SEQ ID NO102)、PADTS(SEQ ID NO103)、PADTSD(SEQID NO104)、PADTT(SEQ ID NO105)、PIKVT(SEQ ID NO106)、PIKVTE(SEQ ID NO107)、PIKVS(SEQ ID NO108)、SPST(SEQ ID NO109)、SPSTS(SEQ ID NO110)、SPTS(SEQ ID NO111)、SPTSP(SEQ IDNO112)、PTSP(SEQ ID NO113)、SPTSP(SEQ ID NO114)、SPSA(SEQID NO115)、SPSAK(SEQ ID NO116)、TSPS(SEQ ID NO117)、TSPSA(SEQ ID NO118)、LPTP(SEQ ID NO119)、LPTPP(SEQ ID NO120)、PTPP(SEQ ID NO121)、PTPPL(SEQ ID NO122)、VPTE(SEQ ID NO123)、VPTET(SEQ ID NO124)、PTE(SEQ ID NO125)、PTET(SEQ IDNO126)、TSETP(SEQ ID NO127)、ITSETP(SEQ ID NO128)、ASVSP(SEQ ID NO129)、SASVSP(SEQ ID NO130)、VETP(SEQ ID NO131)、VETPR(SEQ ID NO132)、ETPR(SEQ ID NO133)、ACTQ(SEQ ID NO134)、ACTQG(SEQ ID NO135)和CTQG(SEQ ID NO136)， 其中每個(gè)蘇氨酸(T)獨(dú)立地可以任選地被絲氨酸(S)替代，和每個(gè)絲氨酸獨(dú)立地可以任選地被蘇氨酸替代。
其他示例性的O-聯(lián)糖基化序列公開在T.M.Leavy和C.R.Bertozzi，Bioorg.Med.Chem.Lett.2007，173851-3854中，該文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過提及而以其整體合并入本文以用于所有目的。在一個(gè)實(shí)施方案中，O-聯(lián)糖基化序列包含下列氨基酸序列中的一個(gè)PIPVSRE、RIPVSRE、RIPVSRA、PIPVSRA、RIPVSRP、PIPVSRP、AIPVSRA和AIPVSRP。通常，以高效率進(jìn)行糖基化的O-聯(lián)糖基化序列和使得酶向每個(gè)糖基化序列只添加一個(gè)糖基殘基的O-聯(lián)糖基化序列是優(yōu)選的。
非天然存在的多肽 本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列可以是任何親本或野生型多肽的一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，以這樣的方式來使親本序列進(jìn)行突變，即使得O-聯(lián)糖基化序列插入到親本序列中，從而向親本多肽的氨基酸序列中添加全長和各自數(shù)目的氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，O-聯(lián)糖基化序列替代了親本多肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。在示例性的實(shí)施方案中，在親本肽中引入突變，使用一個(gè)或多個(gè)現(xiàn)有的氨基酸作為O-聯(lián)糖基化序列的一部分。例如，保持親本肽中的脯氨酸殘基并使緊接該脯氨酸之前和/或之后的那些氨基酸進(jìn)行突變，以產(chǎn)生本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列。在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，通過采用氨基酸插入和現(xiàn)有氨基酸替代的組合，產(chǎn)生O-聯(lián)糖基化序列。
突變型多肽文庫 用于鑒定多肽(其當(dāng)經(jīng)歷糖基化或糖PEG化反應(yīng)時(shí)被有效地糖基化或糖PEG化(例如，以滿意的產(chǎn)率))的一種策略是在親本多肽的氨基酸序列內(nèi)的各個(gè)不同位置(包括例如，β-折疊片結(jié)構(gòu)域和α-螺旋結(jié)構(gòu)域)處插入本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列，然后就它們作為糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，人GlcNAc轉(zhuǎn)移酶)的有效底物的能力來測(cè)試許多所得的序列肽段多肽。
因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了序列肽段多肽文庫，其包括多個(gè)不同的成員，其中該文庫的每個(gè)成員對(duì)應(yīng)于共同的親本多肽并且包含至少一個(gè)獨(dú)立選擇的本發(fā)明的外源O-聯(lián)或S-聯(lián)糖基化序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該文庫的每個(gè)成員包含相同的O-聯(lián)糖基化序列，它們各自在親本多肽內(nèi)的不同氨基酸位置處。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該文庫的每個(gè)成員包含不同的O-聯(lián)糖基化序列，但是在親本多肽內(nèi)的相同氨基酸位置處。本文描述了可與本發(fā)明的文庫組合使用的O-聯(lián)糖基化序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的文庫中使用的O-聯(lián)糖基化序列具有根據(jù)式(I)的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的文庫中使用的O-聯(lián)糖基化序列具有根據(jù)式(II)的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的文庫中使用的O-聯(lián)糖基化序列具有根據(jù)式(III)的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的文庫中使用的O-聯(lián)糖基化序列具有根據(jù)式(IV)的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的文庫中使用的O-聯(lián)糖基化序列具有根據(jù)式(V)的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的文庫中使用的O-聯(lián)糖基化序列具有根據(jù)式(VI)的氨基酸序列。
在其中文庫的每個(gè)成員具有共同的O-聯(lián)糖基化序列的一個(gè)實(shí)施方案中，親本多肽具有包括“m”個(gè)氨基酸的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)例中，序列肽段多肽文庫包括(a)第一種序列肽段多肽，其在親本多肽內(nèi)的第一個(gè)氨基酸位置(AA)n處具有O-聯(lián)糖基化序列，其中n是選自1至m的成員；和(b)至少一種額外的序列肽段多肽，其中在每個(gè)額外的序列肽段多肽中，在額外的氨基酸位置處引入O-聯(lián)糖基化序列，每個(gè)額外的氨基酸位置選自(AA)n+x和(AA)n-x，其中x是選自1至(m-n)的成員。例如，通過在第一個(gè)氨基酸位置處引入所選的O-聯(lián)糖基化序列來產(chǎn)生第一種序列肽段多肽。然后，可以通過在其定位進(jìn)一步朝向親本多肽的N-或C-末端的氨基酸位置處引入相同的O-聯(lián)糖基化序列來產(chǎn)生隨后的序列肽段多肽。
在該情況下，當(dāng)n-x是0(AA0)時(shí)，那么在緊接親本多肽的N-末端氨基酸之前引入糖基化序列。示例性的序列肽段多肽可以具有部分序列“PVSM1…”。
第一個(gè)氨基酸位置(AA)n可以在親本多肽的氨基酸序列內(nèi)的任何地方。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇第一個(gè)氨基酸位置(例如，在環(huán)結(jié)構(gòu)域的開始處)。
每個(gè)額外的氨基酸位置可以在親本多肽內(nèi)的任何地方。在一個(gè)實(shí)例中，序列肽段多肽文庫包括第二種序列肽段多肽，其在選自(AA)n+p和(AA)n-p的氨基酸位置處具有O-聯(lián)糖基化序列，其中p選自1至約10，優(yōu)選1至約8，更優(yōu)選1至約6，更加優(yōu)選1至約4，和最優(yōu)選1至約2。在一個(gè)實(shí)施方案中，序列肽段多肽文庫包括在氨基酸位置(AA)n處具有O-聯(lián)糖基化序列的第一種序列肽段多肽和在氨基酸位置(AA)n+1或(AA)n-1處具有O-聯(lián)糖基化序列的第二種序列肽段多肽。
在另一個(gè)實(shí)例中，每個(gè)額外的氨基酸位置緊鄰之前所選的氨基酸位置。在另外一個(gè)實(shí)例中，每個(gè)額外的氨基酸位置與之前所選的氨基酸位置準(zhǔn)確地相距1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸。
在親本多肽的“給定氨基酸位置”處引入O-聯(lián)或S-聯(lián)糖基化序列表示，從緊接給定氨基酸位置開始(朝向C-末端)，引入突變。引入可以通過完整插入(不替代任何現(xiàn)有的氨基酸)或者通過替代任何數(shù)目的現(xiàn)有氨基酸來進(jìn)行。
在示例性的實(shí)施方案中，通過在親本多肽的連續(xù)氨基酸位置處引入O-聯(lián)糖基化序列來產(chǎn)生序列肽段多肽文庫，每個(gè)所述氨基酸位置與之前所選的氨基酸位置緊鄰，從而經(jīng)過該氨基酸鏈而“掃描”糖基化序列，直至到達(dá)所希望的最終氨基酸位置。緊鄰是指進(jìn)一步朝向親本多肽的N-或C-末端正好一個(gè)氨基酸位置。例如，通過在氨基酸位置AAn處引入糖基化序列來產(chǎn)生第一種突變體。通過在氨基酸位置AAn+1處引入糖基化位點(diǎn)來產(chǎn)生文庫的第二個(gè)成員，通過在氨基酸位置AAn+2處引入糖基化位點(diǎn)來產(chǎn)生第三種突變體，等等。該步驟程序被稱作“序列肽段掃描”。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，序列肽段掃描可以涉及設(shè)計(jì)文庫，從而使得第一個(gè)成員在氨基酸位置(AA)n處具有糖基化序列，第二個(gè)成員在氨基酸位置(AA)n+2處具有糖基化序列、第三個(gè)成員在氨基酸位置(AA)n+4處具有糖基化序列，等等。同樣地，文庫的成員可以通過糖基化序列的其他策略性放置來表征。例如 A)成員1(AA)n；成員2(AA)n+3；成員3(AA)n+6；成員4(AA)n+9等等； B)成員1(AA)n；成員2(AA)n+4；成員3(AA)n+8；成員4(AA)n+12等等； C)成員1(AA)n；成員2(AA)n+5；成員3(AA)n+10；成員4(AA)n+15等等。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通過下列方式來產(chǎn)生第一個(gè)序列肽段多肽文庫經(jīng)過親本多肽的特定區(qū)域(例如，從特定環(huán)區(qū)域的開始處到該環(huán)區(qū)域的結(jié)束處)掃描所選的本發(fā)明O-聯(lián)或S-聯(lián)糖基化序列。然后，通過下列方式來產(chǎn)生第二個(gè)文庫經(jīng)過多肽的另一個(gè)區(qū)域掃描相同的糖基化序列，“跳過”位于所述第一個(gè)區(qū)域和所述第二個(gè)區(qū)域之間的那些氨基酸位置。該多肽鏈的不被考慮的部分可以例如對(duì)應(yīng)于對(duì)于生物活性重要的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者已知不適合于糖基化的該多肽序列的另一個(gè)區(qū)域。通過對(duì)多肽的另外的序列段進(jìn)行“序列肽段掃描”，可以產(chǎn)生任意數(shù)目的額外文庫。在示例性的實(shí)施方案中，通過下列方式來產(chǎn)生文庫經(jīng)過整個(gè)多肽掃描O-聯(lián)糖基化序列，其中在親本多肽內(nèi)的每個(gè)氨基酸位置處引入突變。
在一個(gè)實(shí)施方案中，文庫的成員是多肽混合物的一部分。例如，用多種表達(dá)載體感染細(xì)胞培養(yǎng)物，其中每種載體包含本發(fā)明的不同序列肽段多肽的核酸序列。在表達(dá)后，培養(yǎng)液可以含有多種不同的序列肽段多肽，并從而包括序列肽段多肽文庫。該技術(shù)可以用于確定文庫的哪個(gè)序列肽段多肽在給定的表達(dá)系統(tǒng)中被最有效地表達(dá)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，文庫的成員相互分離地存在。例如，可以分離上述混合物中的至少兩種序列肽段多肽。所分離的多肽一起代表了一個(gè)文庫。備選地，文庫的每個(gè)序列肽段多肽分開地表達(dá)，并且任選地分離所述序列肽段多肽。在另一個(gè)實(shí)例中，通過化學(xué)方法來合成文庫的每個(gè)成員并任選地進(jìn)行純化。
可以使用本文所描述的任何O-聯(lián)糖基化序列來產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的突變型多肽的文庫。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用作為選自下列的成員的O-聯(lián)糖基化序列來產(chǎn)生文庫 (B1)aPVS(B3)c； (B1)aPVT(B3)c； (B1)aPSS(B3)c； (B1)aPST(B3)c； (B1)aPTS(B3)c； (B1)aPB2VT(B3)c； (B1)aPB2VS(B3)c； (B1)aPKUT(B3)c； (B1)aPKUS(B3)c； (B1)aPQUT(B3)c； (B1)aPQUS(B3)c； (B1)aP(B2)2VS(B3)c； (B1)aP(B2)2VT(B3)c； (B1)aP(B2)2TS(B3)c； (B1)aP(B2)2TT(B3)c； (B4)dPTP(B5)e； (B4)dPTE(B5)e； (B4)dPSA(B5)e； (B6)fSB7TP(B8)h；和 (B6)fSB7SP(B8)h。
示例性的非天然存在的多肽 示例性的親本多肽是重組人BMP-7。選擇BMP-7作為示例性的親本多肽是為了舉例說明目的，并且不意在限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，任何親本多肽(例如，本文所示的那些)同樣適合于下面的示例性修飾。如此獲得的任何多肽變體落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的生物學(xué)活性BMP-7變體包括任何BMP-7多肽(部分的或完整的)，其包含至少一個(gè)不導(dǎo)致其生物活性基本上或完全喪失的修飾，如通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的功能測(cè)定法所測(cè)量的。下面的序列(140個(gè)氨基酸)代表全長BMP-7序列的生物學(xué)活性部分 M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO137) 基于上述親本多肽序列的示例性突變型BMP-7多肽在下面的表2至11中列出。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過考慮糖基轉(zhuǎn)移酶的底物要求，而產(chǎn)生突變型多肽。
在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，在野生型BMP-7氨基酸序列(SEQID NO137)中引入突變，以替代親本序列中相應(yīng)數(shù)目的氨基酸，從而得到含有與親本多肽相同數(shù)目的氨基酸殘基的突變型多肽。例如，用O-聯(lián)糖基化序列“脯氨酸-纈氨酸-絲氨酸”(PVS)直接取代三個(gè)正常在BMP-7中的氨基酸，然后將PVS序列朝向該多肽的C-末端順次移動(dòng)，從而提供了137個(gè)包含糖基化位點(diǎn)PVS的BMP-7類似物。根據(jù)該實(shí)施方案的示例性序列在下面的表2中列出。
表2包含140個(gè)氨基酸的突變型BMP-7多肽的示例性文庫，其中三個(gè)現(xiàn)有的氨基酸被O-聯(lián)糖基化序列“PVS”替代 在位置1處引入，替代3個(gè)現(xiàn)有的氨基酸 M1PVSSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO138) 在位置2處引入，替代3個(gè)現(xiàn)有的氨基酸 M1SPVSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO139) 在位置3處引入，替代3個(gè)現(xiàn)有的氨基酸 M1STPVSQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO140) 通過經(jīng)過整個(gè)序列“掃描”糖基化序列可以產(chǎn)生另外的BMP-7突變體。如此獲得的所有突變型BMP-7序列都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如此產(chǎn)生的最終突變型多肽具有下面的序列 在位置137處引入，替代3個(gè)現(xiàn)有的氨基酸 M1SSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACPVS(SEQ ID NO141) 在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，通過向親本序列添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸來將突變引入野生型BMP-7氨基酸序列(SEQ ID NO137)中。例如，將O-聯(lián)糖基化序列PVS添加至親本BMP-7序列，從而替代親本序列中的2、1或0個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)例中，將糖基化序列添加至親本序列的N-或C-末端。根據(jù)該實(shí)施方案的示例性序列在下面的表3中列出。
表3包含PVS的示例性BMP-7突變體(141至143個(gè)氨基酸) 在位置1處引入，不替代任何現(xiàn)有的氨基酸(完全插入) M1PVSSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO142) 在位置1處引入，替代1個(gè)現(xiàn)有的氨基酸(S) M1PVSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO143) 在位置1處引入，替代2個(gè)現(xiàn)有的氨基酸(ST) M1PVSGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO144) 在位置138處引入，替代2個(gè)現(xiàn)有的氨基酸(CH)，添加1個(gè)氨基酸 M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGPVS(SEQ ID NO145) 在位置139處引入，替代1個(gè)現(xiàn)有的氨基酸(H)，添加2個(gè)氨基酸 M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCPVS(SEQ ID NO146) 在位置140處引入，添加3個(gè)氨基酸 M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCHPVS(SEQ ID NO147) 在另一個(gè)實(shí)例中，通過向親本序列添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而在任何氨基酸位置處將O-聯(lián)糖基化序列引入該肽序列中。在該實(shí)例中，所添加的氨基酸殘基的最大數(shù)目相應(yīng)于所插入的糖基化序列的長度。在示例性的實(shí)施方案中，親本序列延伸正好一個(gè)氨基酸。例如，將O-聯(lián)糖基化序列PVS添加至親本BMP-7肽，從而替代2個(gè)正常存在于BMP-7中的氨基酸。根據(jù)該實(shí)施方案的示例性序列在下面的表4中列出。
表4包含141個(gè)氨基酸的突變型BMP-7多肽的示例性文庫，其中兩個(gè)現(xiàn)有的氨基酸被O-聯(lián)糖基化序列“PVS”替代 在位置1處引入，添加1個(gè)氨基酸，替代2個(gè)氨基酸(ST) M1PVSGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO148) 在位置2處引入，添加1個(gè)氨基酸，替代2個(gè)氨基酸(TG) M1SPVSSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDS SNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO149) 在位置3處引入，添加1個(gè)氨基酸，替代2個(gè)氨基酸(GS) M1STPVSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO150) 在位置4處引入，添加1個(gè)氨基酸，替代2個(gè)氨基酸(SK) M1STGPVSQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO151) 在位置5處引入，添加1個(gè)氨基酸，替代2個(gè)氨基酸(KQ) M1STGSPVSRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDS SNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO152) 通過以上述方式經(jīng)過整個(gè)序列“掃描”糖基化序列可以產(chǎn)生另外的BMP-7突變體。如此獲得的所有突變型BMP-7序列都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
另一個(gè)實(shí)例涉及向親本BMP-7肽添加O-聯(lián)糖基化序列(例如，PVS)，從而替代1個(gè)正常存在于BMP-7中的氨基酸(雙氨基酸插入)。根據(jù)該實(shí)施方案的示例性序列在下面的表5中列出。
表5包含PVS的BMP-7突變體的示例性文庫；替代一個(gè)現(xiàn)有的氨基酸(142個(gè)氨基酸) 在位置1處引入，添加2個(gè)氨基酸，替代1個(gè)氨基酸(S) M1PVSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO153) 在位置2處引入，添加2個(gè)氨基酸，替代1個(gè)氨基酸(T) M1SPVSGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO154) 在位置3處引入，添加2個(gè)氨基酸，替代1個(gè)氨基酸(G) M1STPVSSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO155) 在位置4處引入，添加2個(gè)氨基酸，替代1個(gè)氨基酸(S) M1STGPVSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO156) 在位置5處引入，添加2個(gè)氨基酸，替代1個(gè)氨基酸(K) M1STGSPVSQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO157) 通過以上述方式經(jīng)過整個(gè)序列“掃描”糖基化序列可以產(chǎn)生另外的BMP-7突變體。如此獲得的所有突變型BMP-7序列都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
另外一個(gè)實(shí)例涉及在親本BMP-7序列內(nèi)產(chǎn)生O-聯(lián)糖基化序列，其中不替代正常存在于BMP-7中的氨基酸，并且向親本肽內(nèi)的任何位置添加整個(gè)長度的糖基化序列(例如，PVS的三氨基酸插入)。根據(jù)該實(shí)施方案的示例性序列在下面的表6中列出。
表6包含PVS的BMP-7變體的示例性文庫；添加3個(gè)氨基酸(143個(gè)氨基酸) 在位置1處引入，添加3個(gè)氨基酸 M1PVSSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO142) 在位置2處引入，添加3個(gè)氨基酸 M1SPVSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO158) 在位置3處引入，添加3個(gè)氨基酸 M1STPVSGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO159) 在位置4處引入，添加3個(gè)氨基酸 M1STGPVSSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO160) 通過以上述方式經(jīng)過整個(gè)序列“掃描”糖基化序列可以產(chǎn)生另外的BMP-7突變體。如此獲得的所有突變型BMP-7序列都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
使用任一種本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列可以產(chǎn)生BMP-7突變體的模擬迭代(analogues iterations)。例如，可以使用SEQ ID NOs x至x中的任一種，而不是PVS。在一個(gè)實(shí)例中，可以使用序列PAVT(SEQID NO86)或PIKVS(SEQ ID NO108)，而不是PVS。在示例性的實(shí)施方案中，將PIKVS引入親本肽中，從而替代5個(gè)正常存在于BMP-7中的氨基酸。根據(jù)該實(shí)施方案的示例性序列在下面的表7中列出。
表7包含PIKVS的BMP-7突變體的示例性文庫；替代5個(gè)氨基酸(140個(gè)氨基酸) M1PIKVSQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO161) M1SPIKVSRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO162) M1STPIKVSSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO163) M1STGPIKVSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO164) M1STGSPIKVSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO165) 通過以上述方式經(jīng)過整個(gè)序列“掃描”糖基化序列可以產(chǎn)生另外的BMP-7突變體。如此獲得的所有突變型BMP-7序列都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在另一個(gè)實(shí)例中，在親本序列的N-或C-末端處或接近親本序列的N-或C-末端處向野生型BMP-7序列添加O-聯(lián)糖基化序列PIKVS，從而向野生型添加1至5個(gè)氨基酸。根據(jù)該實(shí)施方案的示例性序列在下面的表8中列出。
表8包含PIKVS的BMP-7突變體的示例性文庫(141-145個(gè)氨基酸) 氨基末端突變體 在位置1處引入，添加5個(gè)氨基酸 M1PIKVSSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO166) 在位置1處引入，添加4個(gè)氨基酸，替代1個(gè)氨基酸(S) M1PIKVSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO167) 在位置1處引入，添加3個(gè)氨基酸，替代2個(gè)氨基酸(ST) M1PIKVSGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO168) 在位置1處引入，添加2個(gè)氨基酸，替代3個(gè)氨基酸(STG) M1PIKVSSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO169) 在位置1處引入，添加1個(gè)氨基酸，替代4個(gè)氨基酸(STGS) M1PIKVSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO170) 羧基末端突變體 在位置140處引入，添加5個(gè)氨基酸 M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCHPIKVS(SEQ ID NO171) 在位置139處引入，添加4個(gè)氨基酸，替代1個(gè)氨基酸(H) M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCPIKVS(SEQ ID NO172) 在位置138處引入，添加3個(gè)氨基酸，替代2個(gè)氨基酸(CH) M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGPIKVS(SEQ ID NO173) 在位置137處引入，添加2個(gè)氨基酸，替代3個(gè)氨基酸(GCH) M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACPIKVS(SEQ ID NO174) 在位置136處引入，添加1個(gè)氨基酸，替代4個(gè)氨基酸(CGCH) M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRAPIKVS(SEQ ID NO175) 另外一個(gè)實(shí)例涉及向野生型BMP-7序列中插入O-聯(lián)糖基化序列TSETP(SEQ ID NO127)，從而向親本序列添加1至5個(gè)氨基酸。根據(jù)該實(shí)施方案的示例性序列在下面的表9中列出。
表9包含TSETP的BMP-7突變體的示例性文庫 插入一個(gè)氨基酸 M1TSETPKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO176) M1STSETPQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO177) M1STTSETPRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO178) M1STGTSETPSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO179) 通過以上述方式經(jīng)過整個(gè)序列“掃描”糖基化序列可以產(chǎn)生另外的BMP-7突變體。如此獲得的所有突變型BMP-7序列都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
插入兩個(gè)氨基酸 M1TSETPSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO180) M1STSETPKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO181) M1STTSETPQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO182) 通過以上述方式經(jīng)過整個(gè)序列“掃描”糖基化序列可以產(chǎn)生另外的BMP-7突變體。如此獲得的所有突變型BMP-7序列都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
插入三個(gè)氨基酸 M1TSETPGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO183) M1STSETPSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO184) M1STTSETPKQRS QNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO185) M1STGTSETPQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO186) 通過以上述方式經(jīng)過整個(gè)序列“掃描”糖基化序列可以產(chǎn)生另外的BMP-7突變體。如此獲得的所有突變型BMP-7序列都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
插入四個(gè)氨基酸 M1TSETPTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO187) M1STSETPGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO188) M1STTSETPSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO189) M1STGTSETPKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO190) 通過以上述方式經(jīng)過整個(gè)序列“掃描”糖基化序列可以產(chǎn)生另外的BMP-7突變體。如此獲得的所有突變型BMP-7序列都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
插入五個(gè)氨基酸 M1TSETPSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO191) M1STSETPTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO192) M1STTSETPGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO193) M1STGTSETPSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO194) 通過以上述方式經(jīng)過整個(gè)序列“掃描”糖基化序列可以產(chǎn)生另外的BMP-7突變體。如此獲得的所有突變型BMP-7序列都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
含有O-聯(lián)糖基化序列的突變型多肽的其他實(shí)例公開在于2005年8月22日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)60/710,401；和于2005年9月23日提交的60/720,030；WO2004/99231和WO2004/10327中，它們?yōu)榱怂心康耐ㄟ^提及而合并入本文。
為了鑒定親本肽內(nèi)用于O-聯(lián)糖基化序列的最佳位置(例如，就糖基化、糖PEG化和生物活性而言)，產(chǎn)生了各種突變體和然后就所希望的性質(zhì)進(jìn)行篩選(“序列肽段掃描”)。在示例性的實(shí)施方案中，突變位點(diǎn)沿著親本肽從預(yù)先選擇的肽區(qū)域的N-末端側(cè)朝向C-末端“移動(dòng)”(例如，每次一個(gè)氨基酸)。
在一個(gè)實(shí)例中，通過取代現(xiàn)有的氨基酸和/或通過插入來將O-聯(lián)糖基化序列(例如，PVS)置于所選肽區(qū)域內(nèi)所有可能的氨基酸位置處。根據(jù)該實(shí)施方案的示例性序列在下面的表10和表11中列出。
表10在A73和A82之間包含PVS的BMP-7突變體的示例性文庫 取代現(xiàn)有的氨基酸A73至A82 ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPKP103---(SEQ ID NO195) ---P73VSLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPKP103---(SEQ ID NO196) ---A73PVSNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPKP103---(SEQ ID NO197) ---A73FPVSSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPKP103---(SEQ ID NO198) ---A73FPPVSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPKP103---(SEQ ID NO199) ---A73FPLPVSMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPKP103---(SEQ ID NO200) ---A73FPLNPVSNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPKP103---(SEQ ID NO201) ---A73FPLNSPVSA82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPKP103---(SEQ ID NO202) ---A73FPLNSYPVS82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPKP103---(SEQ ID NO203) 表11在I95和P103之間包含PVS的BMP-7突變體的示例性文庫 取代現(xiàn)有的氨基酸I95至P103 ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFP95VSETVPKP103---(SEQ ID NO204) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95PVSTVPKP103---(SEQ ID NO205) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPVSVPKP103---(SEQ ID NO206) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPPVSPKP103---(SEQ ID NO207) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPEPVSKP103---(SEQ ID NO208) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETPVSP103---(SEQ ID NO209) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPVS103---(SEQ ID NO210) 在現(xiàn)有的氨基酸A73至A82之間插入(添加一個(gè)氨基酸) ---P73VSPLNSYMNA83TNHAIVQTLVHFI96NPETVPKP104---(SEQ IDNO211) ---A73PVSLNSYMNA83TNHAIVQTLVHFI96NPETVPKP104---(SEQ IDNO212) ---A73FPVSNSYMNA83TNHAIVQTLVHFI96NPETVPKP104---(SEQ IDNO213) ---A73FPPVSSYMNA83TNHAIVQTLVHFI96NPETVPKP104---(SEQ IDNO214) ---A73FPLPVSYMNA83TNHAIVQTLVHFI96NPETVPKP104---(SEQ IDNO215) ---A73FPLNPVSMNA83TNHAIVQTLVHFI96NPETVPKP104---(SEQ IDNO216) ---A73FPLNSPVSNA83TNHAIVQTLVHFI96NPETVPKP104---(SEQ ID NO217) ---A73FPLNSYPVSA83TNHAIVQTLVHFI96NPETVPKP104---(SEQ ID NO218) ---A73FPLNSYMPVS83TNHAIVQTLVHFI96NPETVPKP104---(SEQ ID NO219) 在現(xiàn)有的氨基酸I95至P103之間插入(添加一個(gè)氨基酸) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFP95VSPETVPKP104---(SEQ IDNO220) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95PVSETVPKP104---(SEQ IDNO221) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPVSTVPKP104---(SEQ IDNO222) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPPVSVPKP104---(SEQ IDNO223) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPEPVSPKP104---(SEQ IDNO224) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETPVSKP104---(SEQ IDNO225) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPVSP104---(SEQ IDNO226) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPPVS104---(SEQ IDNO227) 可以使用任一種其他本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列(例如SEQ IDNOs36-136)來進(jìn)行上面的取代和插入(例如表3-11的取代和插入)。如此獲得的所有突變型BMP-7序列都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，將一個(gè)或多個(gè)O-糖基化序列，例如上文所示的那些，插入到凝血因子例如因子VII、因子VIII或因子IX多肽中。如在BMP-7的情況下所給出，可以在用BMP-7例示的各種基序的任一種之中插入O-糖基化序列。例如，可以將O-糖基化序列插入到野生型序列中，而不替代任何對(duì)于野生型序列而言天然的氨基酸。在示例性的實(shí)施方案中，將O-糖基化序列插入在多肽的N-或C-末端處或者多肽的N-或C-末端附近。在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，在插入O-糖基化位點(diǎn)之前，除去一個(gè)或多個(gè)對(duì)于野生型多肽序列而言天然的氨基酸殘基。在另外一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)對(duì)于野生型序列而言天然的氨基酸殘基是O-糖基化序列的組分(例如，脯氨酸)并且O-糖基化序列包含野生型氨基酸。野生型氨基酸可以在O-糖基化序列的任一末端或者在O-糖基化序列的內(nèi)部。
此外，可以用本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列替代任何現(xiàn)有的N-聯(lián)糖基化序列。另外，可以在與一個(gè)或多個(gè)N-聯(lián)糖基化序列相鄰之處插入O-聯(lián)糖基化序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，O-聯(lián)糖基化序列的存在阻止了N-聯(lián)糖基化序列的糖基化。
在一個(gè)具體的實(shí)例中，所述多肽是因子VIII。因子VIII和因子VIII變體是本領(lǐng)域已知的。例如，美國專利號(hào)5,668,108描述了其中位置1241處的天冬氨酸被谷氨酸替代的因子VIII變體。美國專利號(hào)5,149,637描述了這樣的因子VIII變體，其包含糖基化的或非糖基化的C-末端級(jí)分；和美國專利號(hào)5,661,008描述了這樣的因子VIII變體，其包含通過至少3個(gè)氨基酸殘基而連接至氨基酸1649-2332的氨基酸1-740。因此，因子VIII的變體、衍生物、修飾物和復(fù)合物是本領(lǐng)域公知的，并且包括在本發(fā)明中。用于產(chǎn)生因子VIII的表達(dá)系統(tǒng)也是本領(lǐng)域公知的，并且包括原核和真核細(xì)胞，如在美國專利號(hào)5,633,150、5,804,420和5,422,250中所例示的。任何上面所討論的因子VIII序列都可以進(jìn)行修飾以包含本發(fā)明的外源O-聯(lián)或S-聯(lián)糖基化序列。
當(dāng)親本多肽是因子VIII時(shí)，根據(jù)上述任一基序，可以將O-聯(lián)糖基化序列插入到A-、B-或C-結(jié)構(gòu)域中。再次，根據(jù)上面的任一基序，可以將超過一個(gè)O-聯(lián)糖基化位點(diǎn)插入到單個(gè)結(jié)構(gòu)域或超過一個(gè)結(jié)構(gòu)域中。例如，可以將O-糖基化位點(diǎn)插入到A、B和C結(jié)構(gòu)域中的每一個(gè)，A和C結(jié)構(gòu)域，A和B結(jié)構(gòu)域，或者B和C結(jié)構(gòu)域之中。備選地，O-聯(lián)糖基化序列可以在A和B結(jié)構(gòu)域或者B和C結(jié)構(gòu)域的側(cè)翼。
在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，因子VIII多肽是B-結(jié)構(gòu)域缺失的(BDD)因子VIII多肽。在該實(shí)施方案中，可以將O-聯(lián)糖基化序列插入到連接因子VIII異二聚體的80Kd和90Kd亞基的肽接頭中。備選地，O-聯(lián)糖基化序列可以位于A結(jié)構(gòu)域和接頭或者C結(jié)構(gòu)域和接頭的側(cè)翼。如在上面在BMP-7的情況下所示的，可以插入O-聯(lián)糖基化序列，其中不替代現(xiàn)有的氨基酸，或者可以插入O-聯(lián)糖基化序列，其中替代親本多肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
在一個(gè)實(shí)例中，因子VIII是全長或野生型因子VIII多肽。全長因子VIII多肽的示例性氨基酸序列顯示在圖10(SEQ ID NO10)和11(SEQ ID NO11)中。在另外一個(gè)實(shí)例中，所述多肽是這樣的因子VIII多肽，其中B-結(jié)構(gòu)域包含比野生型或全長因子VIII的B-結(jié)構(gòu)域少的氨基酸殘基。那些因子VIII多肽稱為B-結(jié)構(gòu)域缺失的或部分B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠鑒定出在給定的因子VIII多肽內(nèi)的B-結(jié)構(gòu)域。B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII的示例性氨基酸序列包括在圖12-15(SEQ ID NOs12-15)中顯示的那些序列。另一個(gè)示例性的因子VIII序列公開在Sandberg等人，Seminars inHematology 38(2)4-12(2000)中，其公開內(nèi)容通過提及而合并入本文。
在進(jìn)一步的示例性實(shí)施方案中，親本多肽是hGH，并且根據(jù)任一上述基序來添加O-糖基化位點(diǎn)。
如對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是明顯的，包含超過一個(gè)本發(fā)明的突變型O-聯(lián)糖基化序列的多肽也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。可以引入額外的突變以允許調(diào)節(jié)多肽性質(zhì)，例如生物活性、代謝穩(wěn)定性(例如，降低的蛋白水解)、藥物代謝動(dòng)力學(xué)等等。
一旦制備了各種突變體，就可以例如使用GlcNAc轉(zhuǎn)移酶，來評(píng)估它們作為O-聯(lián)糖基化或糖PEG化的底物的能力?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的方法來檢測(cè)和定量成功的糖基化和/或糖PEG化，例如質(zhì)譜法(例如，MALDI-TOF或Q-TOF)、凝膠電泳(例如，與光密度分析法相組合)或色譜分析(例如，HPLC)。生物學(xué)測(cè)定法，例如酶抑制測(cè)定法、受體結(jié)合測(cè)定法和/或基于細(xì)胞的測(cè)定法，可以用于分析給定的多肽綴合物的生物活性。評(píng)估策略在下文中更詳細(xì)地描述(參見例如，“先導(dǎo)多肽的鑒定”)。選擇和/或開發(fā)可用于每種突變型多肽的化學(xué)和生物學(xué)評(píng)估的合適測(cè)定法系統(tǒng)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。
多肽綴合物 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在本發(fā)明的多肽(例如，突變型多肽)和所選的修飾基團(tuán)之間的綴合物，其中修飾基團(tuán)通過糖基連接基團(tuán)(例如，完整的糖基連接基團(tuán))而綴合至多肽。糖基連接基團(tuán)直接結(jié)合至本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列內(nèi)的氨基酸殘基，或者備選地，它通過一個(gè)或多個(gè)額外的糖基殘基而結(jié)合至O-聯(lián)糖基化序列。用于制備本發(fā)明的綴合物的方法在本文中和在美國專利號(hào)5,876,980；6,030,815；5,728,554；和5,922,577，以及WO 98/31826；WO2003/031464；WO2005/070138；WO2004/99231；WO2004/10327；WO2006/074279；和美國專利申請(qǐng)公開2003180835中給出，這些文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過提及而合并入本文以用于所有目的。
本發(fā)明的綴合物將通常對(duì)應(yīng)于下列的一般性結(jié)構(gòu)
其中，符號(hào)a、b、c、d和s代表正的非零整數(shù)；并且t為0或正整數(shù)。“修飾基團(tuán)”是聚合物部分(例如，水溶性聚合物，例如PEG)、治療劑、生物活性試劑、可檢測(cè)的標(biāo)記等等。接頭可以是一大批連接基團(tuán)中的任一種(下文)。備選地，接頭可以是單鍵。肽的身份沒有限制。
示例性的肽綴合物包括O-聯(lián)葡糖胺殘基(例如，GlcNAc或GlcNH)。在一個(gè)實(shí)施方案中，葡糖胺部分自身用修飾基團(tuán)衍生化并代表糖基連接基團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將額外的糖基殘基附著至與肽結(jié)合的葡糖胺部分。例如，向第一個(gè)葡糖胺部分添加另一個(gè)GlcNAc或GlcNH，Gal或Sia殘基，這些各自可以作為糖基連接基團(tuán)。在代表性的實(shí)施方案中，O-聯(lián)糖基殘基是選自經(jīng)修飾的葡糖胺模擬部分的成員GlcNAc-X＊、GlcNH-X＊、Glc-X＊、GlcNAc-GlcNAc-X＊、GlcNAc-GlcNH-X＊、GlcNH-GlcNAc-X＊、GlcNAc-Gal-X＊、GlcNH-Gal-X＊、GlcNAc-Sia-X＊、GlcNH-Sia-X＊、GlcNAc-Gal-Sia-X＊、GlcNH-Gal-Sia-X＊、GlcNAc-GlcNAc-Gal-Sia-X＊、GlcNAc-GlcNAc-Man-X＊、GlcNAc-GlcNAc-Man(Man)2(任選地包含一個(gè)或多個(gè)修飾基團(tuán))或GlcNAc-Gal-Gal-Sia-X＊，其中X＊是修飾基團(tuán)。在上面的實(shí)例中，每個(gè)GlcNAc獨(dú)立地可以任選地用GlcNH替代。
在示例性的實(shí)施方案中，所述多肽是包含本發(fā)明的外源O-聯(lián)糖基化序列的非天然存在的多肽。所述多肽優(yōu)選地用葡糖胺部分在糖基化序列內(nèi)進(jìn)行O-糖基化。使用已知向GlcNAc或GlcNH進(jìn)行添加的糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、葡糖基轉(zhuǎn)移酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶和GlcNAc轉(zhuǎn)移酶)，可以將額外的糖殘基添加至所得的O-聯(lián)葡糖胺部分。這些方法一起可以導(dǎo)致獲得包含兩個(gè)或更多個(gè)糖殘基的糖基結(jié)構(gòu)。
修飾基團(tuán)通過糖基連接基團(tuán)而共價(jià)附著至多肽，所述糖基連接基團(tuán)插入在所述多肽和所述修飾基團(tuán)之間。糖基連接基團(tuán)共價(jià)附著至多肽的氨基酸殘基或糖肽的糖基殘基。如本文所討論的，修飾基團(tuán)基本上是可以附著至糖基或糖基模擬部分的任何種類，這導(dǎo)致“經(jīng)修飾的糖”?？梢詫⒔?jīng)修飾的糖摻入到由合適的轉(zhuǎn)移酶所識(shí)別的糖基供體(例如，經(jīng)修飾的糖核苷酸)中，所述轉(zhuǎn)移酶將該經(jīng)修飾的糖附加到多肽或糖肽上。
示例性的修飾基團(tuán)選自糖苷的(例如，葡聚糖、聚唾液酸)和非糖苷的修飾基團(tuán)，并且包括聚合物(例如，PEG)和多肽(例如，酶、抗體、抗原等)。示例性的非糖苷的修飾基團(tuán)選自線性和支化的，并且可以包含一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立選擇的聚合物部分，例如聚(亞烷基二醇)和其衍生物。在示例性的實(shí)施方案中，修飾基團(tuán)是水溶性聚合物基團(tuán)，例如，聚(乙二醇)和其衍生物(PEG、m-PEG)或者聚(丙二醇)和其衍生物(PPG、m-PPG)等等。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚(乙二醇)或聚(丙二醇)具有基本上均勻分散的分子量。額外的修飾基團(tuán)在下文中描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，將糖基連接基團(tuán)共價(jià)連接至至少一個(gè)聚合物的、非糖苷的修飾基團(tuán)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了多肽綴合物，其在它們的取代模式方面是高度同質(zhì)的。使用本發(fā)明的方法，可能形成這樣的肽綴合物，其中在本發(fā)明的綴合物群體中基本上所有經(jīng)修飾的糖部分都附著至結(jié)構(gòu)上相同的氨基酸或糖基殘基。因此，在示例性的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了多肽綴合物，其包含通過糖基連接基團(tuán)而共價(jià)結(jié)合至該多肽的O-聯(lián)糖基化序列內(nèi)的氨基酸殘基(例如，蘇氨酸)的一個(gè)或多個(gè)水溶性聚合物部分。在一個(gè)實(shí)例中，每個(gè)具有與之附著的糖基連接基團(tuán)的氨基酸殘基都具有相同的結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，水溶性聚合物部分的群體的基本上每個(gè)成員都通過糖基連接基團(tuán)而結(jié)合至多肽的糖基殘基，并且其上附著了糖基連接基團(tuán)的肽的每個(gè)糖基殘基具有相同的結(jié)構(gòu)。
因此，本發(fā)明提供了非天然存在的多肽和聚合物修飾基團(tuán)之間的共價(jià)綴合物，其中所述多肽對(duì)應(yīng)于親本多肽。所述非天然存在的多肽的氨基酸序列包含至少一個(gè)在相應(yīng)的親本多肽中不存在或者在相應(yīng)的親本多肽中的相同位置處不存在的外源O-聯(lián)糖基化序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述O-聯(lián)糖基化序列是GlcNAc轉(zhuǎn)移酶的底物。在一個(gè)實(shí)例中，所述O-聯(lián)糖基化序列包含具有羥基的氨基酸殘基(例如，絲氨酸或蘇氨酸)，并且所述聚合物修飾基團(tuán)通過糖基連接基團(tuán)在所述O-聯(lián)糖基化序列的所述羥基處共價(jià)連接至所述多肽。
在示例性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的綴合物具有根據(jù)式(VII)的結(jié)構(gòu)，其中w是選自0和1的整數(shù)，和q是選自0和1的整數(shù)
在式(VII)中，AA-O是從具有被羥基取代的側(cè)鏈的氨基酸殘基(例如，絲氨酸或蘇氨酸)衍生而得的部分，其中所述氨基酸位于本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列內(nèi)。當(dāng)q是1時(shí)，所述氨基酸是所述多肽的內(nèi)部氨基酸，和當(dāng)q為0時(shí)，所述氨基酸是N-末端或C-末端氨基酸。Z＊是選自葡糖胺部分、葡糖胺模擬部分、包含葡糖胺部分的寡糖和包含葡糖胺模擬部分的寡糖的成員。X＊是選自聚合物修飾基團(tuán)和包含聚合物修飾基團(tuán)的糖基連接基團(tuán)的成員。在一個(gè)實(shí)例中，Z＊是葡糖胺部分，和X＊是聚合物修飾基團(tuán)。
在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，X＊是聚合物修飾基團(tuán)。在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，Z＊是選自下列的成員GlcNAc，GlcNH，Glc，GlcNAc-Fuc，GlcNAc-GlcNAc，GlcNH-GlcNH，GlcNAc-GlcNH，GlcNH-GlcNAc，GlcNAc-Gal，GlcNH-Gal，GlcNAc-Sia，GlcNH-Sia，GlcNAc-Gal-Sia，GlcNH-Gal-Sia，GlcNAc-GlcNAc-Gal-Sia，GlcNH-GlcNH-Gal-Sia，GlcNAc-GlcNH-Gal-Sia，GlcNH-GlcNAc-Gal-Sia，GlcNAc-GlcNAc-Man，GlcNAc-GlcNAc-Man(Man)2，GlcNAc-Gal-Gal-Sia以及GlcNAc、GlcNH、Gal、Glc、Man、Fuc和Sia的其他組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，X＊是聚合物修飾基團(tuán)，和Z＊是選自GlcNAc和GlcNH的成員。
糖基連接基團(tuán) 當(dāng)插入在多肽和修飾基團(tuán)之間時(shí)，經(jīng)修飾的糖的糖組分變成“糖基連接基團(tuán)”。在示例性的實(shí)施方案中，從單糖或寡糖形成糖基連接基團(tuán)，所述單糖或寡糖在用修飾基團(tuán)進(jìn)行修飾后，是合適的糖基轉(zhuǎn)移酶的底物。在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，從糖基模擬部分形成糖基連接基團(tuán)。本發(fā)明的多肽綴合物可以包含單價(jià)或多價(jià)的糖基連接基團(tuán)(即單和多觸角結(jié)構(gòu))。因此，本發(fā)明的綴合物包含這樣的種類，其中所選的部分通過單價(jià)糖基連接基團(tuán)而附著至肽。本發(fā)明還包括這樣的綴合物，其中超過一個(gè)修飾基團(tuán)通過多價(jià)連接基團(tuán)而附著至多肽。
在示例性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的共價(jià)綴合物包含根據(jù)式(VIII)的部分
在式(VIII)中，G是選自-CH2-和C＝A的成員，其中A是選自O(shè)、S和NR28的成員，其中R28是選自取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基和取代或未取代的雜環(huán)烷基的成員。E是選自O(shè)、S、NR27和CH2的成員，其中R27是選自取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基和取代或未取代的雜環(huán)烷基的成員。E1是選自O(shè)和S的成員。R21、R22、R23和R24是獨(dú)立地選自H、OR25、SR25、NR25R26、NR25S(O)2R26、S(O)2NR25R26、NR25C(O)R26、C(O)NR25R26、C(O)OR25、酰基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基和取代或未取代的雜環(huán)烷基的成員，其中R25和R26是獨(dú)立地選自H、?；⑷〈蛭慈〈耐榛?、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的雜環(huán)烷基和修飾基團(tuán)的成員。優(yōu)選地，R21、R22、R23、R24、R27和R28中的至少一個(gè)包含聚合物修飾基團(tuán)。
在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的共價(jià)綴合物包含根據(jù)式(IX)的部分
其中X＊是選自線性和支化的聚合物修飾基團(tuán)；La是選自鍵和接頭基團(tuán)的成員，和R28是選自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的雜環(huán)烷基的成員。
在另外一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的共價(jià)綴合物包含根據(jù)式(X)的部分
在一個(gè)實(shí)例中，修飾基團(tuán)包含作為選自下列的成員的部分
其中p和p1是獨(dú)立地選自1至20的整數(shù)。每個(gè)n是獨(dú)立地選自1至5000的整數(shù)，和m是1-5的整數(shù)。R1是選自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的雜環(huán)烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、-NR12R13、-OR12和-SiR12R13的成員，其中R12和R13是獨(dú)立地選自取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的雜環(huán)烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的雜芳基的成員。在一個(gè)實(shí)例中，R1是選自O(shè)H和OR12的成員，其中R12是選自C1、C2、C3、C4、C5和C6烷基的成員。在另一個(gè)實(shí)例中，R1是選自O(shè)H和OMe的成員。
在一個(gè)實(shí)例中，修飾基團(tuán)X＊是支化的并且包含至少兩個(gè)聚合物部分。示例性的經(jīng)修飾的糖提供在下面

其中R1和R2是獨(dú)立地選自O(shè)H和OMe的成員，和p是1至20的整數(shù)。
修飾基團(tuán) 本發(fā)明的修飾基團(tuán)可以是任何化學(xué)部分。示例性的修飾基團(tuán)在下文討論?？梢跃退鼈兏淖兘o定多肽的性質(zhì)(例如，生物學(xué)或物理化學(xué)性質(zhì))的能力來選擇修飾基團(tuán)。通過使用修飾基團(tuán)可以改變的示例性多肽性質(zhì)包括但不限于，藥物代謝動(dòng)力學(xué)、藥效動(dòng)力學(xué)、代謝穩(wěn)定性、生物分布、水溶性、親脂性、組織靶向能力和治療活性譜。優(yōu)選的修飾基團(tuán)是這樣的修飾基團(tuán)，其改良經(jīng)修飾的多肽的藥效動(dòng)力學(xué)和藥物代謝動(dòng)力學(xué)(當(dāng)與相應(yīng)的未修飾的多肽相比較時(shí))。其他修飾基團(tuán)可以用于產(chǎn)生這樣的多肽，所述多肽可用于診斷應(yīng)用或體外生物學(xué)測(cè)定法系統(tǒng)。
例如，用聚乙二醇(PEG)部分可以增強(qiáng)治療性糖肽的體內(nèi)半壽期。用PEG對(duì)多肽進(jìn)行化學(xué)修飾(PEG化)增加它們的分子大小并且通常減小表面-和官能團(tuán)-可接近性，每種都取決于附著至多肽的PEG部分的數(shù)目和大小。通常，該修飾導(dǎo)致血漿半壽期和蛋白水解穩(wěn)定性的改良，以及免疫原性和肝攝取的減小(Chaffee等人J.Clin.Invest.891643-1651(1992)；Pyatak等人Res.Commun.Chem.PatholPharmacol.29113-127(1980))。例如，據(jù)報(bào)道，白細(xì)胞介素-2的PEG化增強(qiáng)了它的體內(nèi)抗腫瘤效力(Katre等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA.841487-1491(1987))，并且源自單克隆抗體A7的F(ab’)2的PEG化改良了其腫瘤定位(Kitamura等人Biochem.Biophys.Res.Commun.281387-1394(1990))。
在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于未衍生化的親本多肽的體內(nèi)半壽期而言，通過本發(fā)明的方法用PEG部分進(jìn)行衍生化的肽的體內(nèi)半壽期得到了增加。多肽體內(nèi)半壽期的增加可以表示為相對(duì)于親本多肽的增加百分比范圍。增加百分比范圍的下端為約40％、約60％、約80％、約100％、約150％或約200％。范圍的上端為約60％、約80％、約100％、約150％或大于約250％。
水溶性聚合物修飾基團(tuán) 在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾基團(tuán)是選自線性和支化的聚合物修飾基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)例中，修飾基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)聚合物部分，其中每個(gè)聚合物部分獨(dú)立地進(jìn)行選擇。
許多水溶性聚合物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且可用于實(shí)施本發(fā)明。術(shù)語“水溶性聚合物”包括下列種類例如糖類(例如，葡聚糖、直鏈淀粉、透明質(zhì)酸、聚(唾液酸)、乙酰肝素類、肝素類，等等)；聚(氨基酸)，例如聚(天冬氨酸)和聚(谷氨酸)；核酸；合成聚合物(例如，聚(丙烯酸)，聚(醚)，例如聚(乙二醇)；肽，蛋白質(zhì)等等。本發(fā)明可以用任何水溶性聚合物來實(shí)施，唯一的限制是所述聚合物必須包含綴合物的其余部分的附著點(diǎn)。
使用修飾基團(tuán)的反應(yīng)性衍生物(例如，反應(yīng)性PEG類似物)將修飾基團(tuán)附著至一個(gè)或多個(gè)多肽部分在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明不受反應(yīng)性類似物的身份的限制。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，修飾基團(tuán)是PEG或PEG類似物。聚(乙二醇)的許多經(jīng)活化的衍生物可以通過商業(yè)途徑獲得，并且描述在文獻(xiàn)中。選擇和(如果需要)合成合適的經(jīng)活化的PEG衍生物(其用于制備在本發(fā)明中可使用的底物)完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。參見，Abuchowski等人Cancer Biochem.Biophys.，7175-186(1984)；Abuchowski等人，J.Biol.Chem.，2523582-3586(1977)；Jackson等人，Anal.Biochem.，165114-127(1987)；Koide等人，Biochem Biophys.Res.Commun.，111659-667(1983)，三氟乙磺酸酯(Nilsson等人，Methods Enzymol.，10456-69(1984)；Delgado等人，Biotechnol.Appl.Biochem.，12119-128(1990))；N-羥基琥珀酰亞胺衍生的活性酯類(Buckmann等人，Makromol.Chem.，1821379-1384(1981)；Joppich等人，Makromol.Chem.，1801381-1384(1979)；Abuchowski等人，Cancer Biochem.Biophys.，7175-186(1984)；Katre等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，841487-1491(1987)；Kitamura等人，Cancer Res.，514310-4315(1991)；Boccu等人，Z.Naturforsch.，38C94-99(1983))；碳酸酯類(Zalipsky等人，Poly(ethylene glycol)ChemistryBiotechnical and Biomedical Applications，Harris，Ed.，Plenum Press，New York，1992，pp.347-370；Zalipsky等人，Biotechnol.Appl.Biochem.，15100-114(1992)；Veronese等人，Appl.Biochem.Biotech.，11141-152(1985))；咪唑基甲酸酯類(Beauchamp等人，Anal.Biochem.，13125-33(1983)；Berger等人，Blood，711641-1647(1988))；4-聯(lián)硫基吡啶類(Woghiren等人，Bioconjugate Chem.，4314-318(1993))；異氰酸酯類(Byun等人，ASAIO Journal，M649-M-653(1992))和環(huán)氧化物(美國專利號(hào)4,806,595，頒發(fā)給Noishiki等人，(1989))。其他連接基團(tuán)包括氨基和活化的PEG之間的氨基甲酸乙酯連接。參見，Veronese等人，Appl.Biochem.Biotechnol.，11141-152(1985)。
用于活化聚合物的方法可以在WO 94/17039、美國專利號(hào)5,324,844、WO 94/18247、WO 94/04193、美國專利號(hào)5,219,564、美國專利號(hào)5,122,614、WO 90/13540、美國專利號(hào)5,281,698以及WO93/15189中找到，和關(guān)于經(jīng)活化的聚合物和肽之間的綴合，所述肽例如為凝固因子VIII(WO 94/15625)、血紅蛋白(WO 94/09027)、載氧分子(美國專利號(hào)4,412,989)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人，App.Biochem.Biotech.11141-45(1985))。
可用于本發(fā)明的經(jīng)活化的PEG分子以及制備那些試劑的方法是本領(lǐng)域已知的，并且描述于例如WO04/083259中。
適合于活化用于制備本文所示化合物的線性PEG的活化基團(tuán)或離去基團(tuán)包括但不限于下列種類
示例性的水溶性聚合物是這樣的聚合物，其中聚合物樣品中實(shí)質(zhì)比例的聚合物分子具有大約相同的分子量；此類聚合物是“均勻分散的”。
通過提及聚(乙二醇)綴合物來進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明。關(guān)于PEG的官能化和綴合的一些綜述和專著是可得的。參見例如，Harris，Macronol.Chem.Phys.C25325-373(1985)；Scouten，Methods inEnzymology 13530-65(1987)；Wong等人，Enzyme Microb.Technol.14866-874(1992)；Delgado等人，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems 9249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6150-165(1995)；和Bhadra等人，Pharmazie，575-29(2002)。使用反應(yīng)性分子來制備反應(yīng)性PEG分子和形成綴合物的途徑是本領(lǐng)域已知的。例如，美國專利號(hào)5,672,662公開了聚合物酸的活性酯的水溶性且可分離的綴合物，所述聚合物酸選自線性或支化的聚(環(huán)氧烷)、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)和聚(丙烯酰嗎啉)。
美國專利號(hào)6,376,604提出了通過將聚合物的末端羥基與二(1-苯并三唑基)碳酸酯在有機(jī)溶劑中進(jìn)行反應(yīng)來制備水溶性且非肽聚合物的水溶性1-苯丙三唑基碳酸酯的方法。將活性酯用于與生物學(xué)活性試劑例如多肽一起形成綴合物。
WO 99/45964描述了包含生物學(xué)活性試劑和經(jīng)活化的水溶性聚合物的綴合物，所述聚合物包含聚合物主鏈，所述聚合物主鏈具有至少一個(gè)通過穩(wěn)定的連接而連接至聚合物主鏈的末端，其中至少一個(gè)末端包含分支部分，所述分支部分具有連接至該分支部分的近側(cè)反應(yīng)性基團(tuán)，其中所述生物學(xué)活性試劑連接至所述近側(cè)反應(yīng)性基團(tuán)中的至少一個(gè)。其他支化的聚(乙二醇)描述于WO 96/21469中，美國專利號(hào)5,932,462描述了用支化的PEG分子形成的綴合物，所述支化的PEG分子包含含有反應(yīng)性官能團(tuán)的支化末端。游離的反應(yīng)性基團(tuán)可以用于與生物學(xué)活性種類例如多肽反應(yīng)，從而在聚(乙二醇)和生物學(xué)活性種類之間形成綴合物。美國專利號(hào)5,446,090描述了雙官能PEG接頭以及它在形成在每個(gè)PEG接頭末端具有多肽的綴合物中的用途。
包含可降解的PEG連接的綴合物描述于WO 99/34833；和WO99/14259，以及美國專利號(hào)6,348,558中。此類可降解的連接可應(yīng)用于本發(fā)明。
上面給出的聚合物活化的本領(lǐng)域公認(rèn)的方法可用于本發(fā)明的情況，從而形成本文所示的支化的聚合物，并且還可用于將這些支化的聚合物綴合至其他種類，例如糖、糖核苷酸等等。
示例性的水溶性聚合物是聚(乙二醇)，例如甲氧基-聚(乙二醇)。用于本發(fā)明的聚(乙二醇)不限于任何具體的形式或分子量范圍。對(duì)于非支化的聚(乙二醇)分子，分子量優(yōu)選為500至100,000。優(yōu)選使用2000-60,000，更優(yōu)選約5,000至約40,000的分子量。
用于本發(fā)明的示例性的聚(乙二醇)分子包括但不限于，具有下式的那些
其中，R8是H、OH、NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的雜環(huán)烷基、取代或未取代的雜烷基，例如縮醛、OHC-、H2N-(CH2)q-、HS-(CH2)q或-(CH2)qC(Y)Z1。指數(shù)“e”表示1至2500的整數(shù)。指數(shù)b、d和q獨(dú)立地表示0至20的整數(shù)。符號(hào)Z和Z1獨(dú)立地表示OH，NH2，離去基團(tuán)，例如咪唑，對(duì)硝基苯基，HOBT，四唑，鹵化物，S-R9，經(jīng)活化的酯的醇部分；-(CH2)pC(Y1)V，或-(CH2)pU(CH2)sC(Y1)v。符號(hào)Y表示H(2)、＝O、＝S、＝N-R10。符號(hào)X、Y、Y1、A1和U獨(dú)立地表示部分O、S、N-R11。符號(hào)V表示OH、NH2、鹵素、S-R12、經(jīng)活化的酯的醇組分、經(jīng)活化的酰胺的胺組分、糖核苷酸和蛋白質(zhì)。指數(shù)p、q、s和v是獨(dú)立地選自0至20的整數(shù)的成員。符號(hào)R9、R10、R11和R12獨(dú)立地表示H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜環(huán)烷基和取代或未取代的雜芳基。
可用于形成本發(fā)明綴合物的聚(乙二醇)是線性的或支化的。適合用于本發(fā)明的支化的聚(乙二醇)分子包括但不限于，下式描述的那些
其中，R8和R8’是獨(dú)立地選自上面對(duì)于R8所定義的基團(tuán)的成員。A1和A2是獨(dú)立地選自上面對(duì)于A1所定義的基團(tuán)的成員。指數(shù)e、f、o和q如上所述。Z和Y如上所述。X1和X1’是獨(dú)立地選自S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O、OC(O)NH的成員。
在其他示例性的實(shí)施方案中，支化的PEG基于半胱氨酸、絲氨酸或二賴氨酸核心。在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，聚(乙二醇)分子選自下列的結(jié)構(gòu)
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，聚(乙二醇)是附著有超過一個(gè)PEG部分的支化的PEG。支化的PEG的實(shí)例描述于下列文獻(xiàn)中美國專利號(hào)5,932,462；美國專利號(hào)5,342,940；美國專利號(hào)5,643,575；美國專利號(hào)5,919,455；美國專利號(hào)6,113,906；美國專利號(hào)5,183,660；WO 02/09766；Kodera Y.，Bioconjugate Chemistry 5283-288(1994)；和Yamasaki等人，Agric.Biol.Chem.，522125-2127，1998。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，支化的PEG的每個(gè)聚(乙二醇)的分子量小于或等于40,000道爾頓。
代表性的聚合物修飾部分包含基于含有側(cè)鏈的氨基酸例如絲氨酸、半胱氨酸、賴氨酸以及小肽例如lys-lys的結(jié)構(gòu)。示例性的結(jié)構(gòu)包括
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，二賴氨酸結(jié)構(gòu)中的游離胺也可以通過酰胺或氨基甲酸乙酯鍵用PEG部分進(jìn)行PEG化。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物修飾部分是基于三賴氨酸肽的支化的PEG部分。該三賴氨酸可以被單-、二-、三-或四-PEG化。根據(jù)該實(shí)施方案的示例性種類具有下式
其中，指數(shù)e、f和f’是1至2500的獨(dú)立選擇的整數(shù)；和指數(shù)q、q’和q”是1至20的獨(dú)立選擇的整數(shù)。
如對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是明顯的，用于本發(fā)明的支化的聚合物包括上述專題中的變化形式。例如，上面所示的二賴氨酸-PEG綴合物可以包括三個(gè)聚合物亞單位，第三個(gè)亞單位鍵合到上面結(jié)構(gòu)中顯示為未修飾的α-胺。類似地，使用以所希望的方式用標(biāo)記有聚合物修飾部分的3或4個(gè)聚合物亞單位進(jìn)行官能化的三賴氨酸在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
可用于形成具有支化的修飾基團(tuán)(其包含一個(gè)或多個(gè)聚合物部分(例如，PEG))的多肽綴合物的示例性前體具有下式
在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)該式的支化的聚合物種類是基本上純的水溶性聚合物。X3’是包含可電離的官能團(tuán)(例如，OH、COOH、H2PO4、HSO3、NH2和其鹽等等)或其他反應(yīng)性官能團(tuán)(例如，下文)的部分。C是碳。X5是非反應(yīng)性基團(tuán)(例如，H、CH3、OH等等)。在一個(gè)實(shí)施方案中，X5優(yōu)選地不是聚合物部分。R16和R17獨(dú)立地選自非反應(yīng)性基團(tuán)(例如，H、未取代的烷基、未取代的雜烷基)和聚合物臂(例如，PEG)。X2和X4是優(yōu)選在生理?xiàng)l件下基本上不具有反應(yīng)性的連接片段。X2和X4獨(dú)立地進(jìn)行選擇。示例性的接頭既不包含芳香族部分也不包含酯部分。備選地，這些連接可以包含被設(shè)計(jì)成在生理學(xué)相關(guān)條件下降解的一個(gè)或多個(gè)部分，例如酯、二硫化物，等等。X2和X4將聚合物臂R16和R17連接至C。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)X3’與接頭、糖或接頭-糖盒上的具有互補(bǔ)反應(yīng)性的反應(yīng)性官能團(tuán)反應(yīng)時(shí)，X3’被轉(zhuǎn)化為連接片段的組分。
包括X2和X4的示例性連接片段獨(dú)立地進(jìn)行選擇，并且包括S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O、和OC(O)NH、CH2、CH2S、CH2O、CH2CH2O、CH2CH2S、(CH2)oO、(CH2)oS或(CH2)oY’-PEG，其中Y’為S、NH、NHC(O)、C(O)NH、NHC(O)O、OC(O)NH或O，和o為1至50的整數(shù)。在示例性的實(shí)施方案中，連接片段X2和X4是不同的連接片段。
在示例性的實(shí)施方案中，上述前體之一或其活化的衍生物與糖、活化的糖或糖核苷酸反應(yīng)并從而結(jié)合至糖、活化的糖或糖核苷酸，所述反應(yīng)是通過X3’和糖部分上的具有互補(bǔ)反應(yīng)性的基團(tuán)例如胺之間的反應(yīng)來進(jìn)行的。備選地，根據(jù)下面的方案2，X3’與接頭La的前體上的反應(yīng)性官能團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。
方案2
在示例性的實(shí)施方案中，修飾基團(tuán)衍生自天然或非天然的氨基酸、氨基酸類似物或氨基酸模擬物，或者從一種或多種這些種類形成的小肽。例如，在本發(fā)明化合物中發(fā)現(xiàn)的某些支化的聚合物具有下列通式
在該實(shí)例中，通過支化的聚合物修飾部分的前體上的反應(yīng)性官能團(tuán)(例如X3’)和糖部分或接頭前體上的反應(yīng)性官能團(tuán)之間的反應(yīng)來形成連接片段C(O)La。例如，當(dāng)X3’是羧酸時(shí)，它可以被活化并直接結(jié)合至從氨基-糖(例如Sia、GalNH2、GlcNH2、ManNH2等等)上懸掛出的胺基團(tuán)，從而形成酰胺。另外的示例性的反應(yīng)性官能團(tuán)和活化的前體在下文描述。所述符號(hào)具有與上面所討論的相同的身份。
在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，La是具有下列結(jié)構(gòu)的連接部分
其中，Xa和Xb是獨(dú)立選擇的連接片段，并且L1選自鍵、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的雜烷基。
Xa和Xb的示例性種類包括S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、C(O)NH和NHC(O)O、和OC(O)NH。
在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，X4是結(jié)合至R17的肽鍵，R17是氨基酸、二肽(例如，Lys-Lys)或三肽(例如，Lys-Lys-Lys)，其中α-胺部分和/或側(cè)鏈雜原子用聚合物修飾部分進(jìn)行修飾。
上面給出的本發(fā)明的實(shí)施方案通過參考如下種類來進(jìn)一步舉例說明，在所述種類中，聚合物是水溶性聚合物，特別是聚(乙二醇)(“PEG”)，例如甲氧基-聚(乙二醇)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，下面部分中的焦點(diǎn)是為了清楚地舉例說明，并且使用PEG作為示例性聚合物而給出的各種基序同樣可應(yīng)用于其中利用除PEG之外的其他聚合物的種類。
在本發(fā)明中使用任何分子量例如1kDa、2kDa、5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa、55kDa、60kDa、65kDa、70kDa、75kDa和80kDa的PEG。
在其他示例性的實(shí)施方案中，多肽綴合物包含選自下列的部分
在上面的式中的每一個(gè)中，指數(shù)e和f獨(dú)立地選自1至2500的整數(shù)。在進(jìn)一步的示例性實(shí)施方案中，選擇e和f以提供為約1kDa、2kDa、5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa、55kDa、60kDa、65kDa、70kDa、75kDa和80kDa的PEG部分。符號(hào)Q表示取代或未取代的烷基(例如，C1-C6烷基，例如甲基)、取代或未取代的雜烷基或H。
其他支化的聚合物具有基于二賴氨酸(Lys-Lys)肽的結(jié)構(gòu)，例如
和基于三賴氨酸肽(Lys-Lys-Lys)的結(jié)構(gòu)，例如
在上面的圖式中的每一個(gè)中，指數(shù)e、f、f’和f”表示獨(dú)立地選自1至2500的整數(shù)。指數(shù)q、q’和q”表示獨(dú)立地選自1至20的整數(shù)。
在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的綴合物包含為選自下列的成員的式
其中，Q是選自H和取代或未取代的C1-C6烷基的成員。指數(shù)e和f是獨(dú)立地選自1至2500的整數(shù)，和指數(shù)q是選自0至20的整數(shù)。
在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的綴合物包含為選自下列的成員的式
其中，Q是選自H和取代或未取代的C1-C6烷基的成員，優(yōu)選Me。指數(shù)e、f和f’是獨(dú)立地選自1至2500的整數(shù)，以及q和q’是獨(dú)立地選自1至20的整數(shù)。
在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的綴合物包含根據(jù)下式的結(jié)構(gòu)
其中，指數(shù)m和n是獨(dú)立地選自0至5000的整數(shù)。指數(shù)j和k是獨(dú)立地選自0至20的整數(shù)。A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10和A11是獨(dú)立地選自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的雜環(huán)烷基、取代或未取代的雜芳基、-NA12A13、-OA12和-SiA12A13的成員。A12和A13是獨(dú)立地選自取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的雜環(huán)烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的雜芳基的成員。
在根據(jù)上式的一個(gè)實(shí)施方案中，支化的聚合物具有根據(jù)下式的結(jié)構(gòu)
在示例性的實(shí)施方案中，A1和A2是獨(dú)立地選自-OCH3和OH的成員。
在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，接頭La是選自氨基甘氨酸衍生物的成員。根據(jù)該實(shí)施方案的示例性的聚合物修飾基團(tuán)具有根據(jù)下式的結(jié)構(gòu)
在一個(gè)實(shí)例中，A1和A2是獨(dú)立地選自O(shè)CH3和OH的成員。根據(jù)該實(shí)例的示例性的聚合物修飾基團(tuán)包括
在每個(gè)上面的實(shí)施方案(其中修飾基團(tuán)包含立體中心，例如，包含氨基酸接頭或基于甘油的接頭的那些)中，立體中心可以是外消旋的或者確定的。在一個(gè)實(shí)施方案(其中此類立體中心是確定的)中，它具有(S)構(gòu)型。在另一個(gè)實(shí)施方案中，立體中心具有(R)構(gòu)型。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，支化的聚合物的一個(gè)或多個(gè)m-PEG臂可以用具有不同末端(例如，OH、COOH、NH2、C2-C10-烷基等等)的PEG部分來代替。此外，上面的結(jié)構(gòu)容易地通過在α-碳原子和側(cè)鏈的官能團(tuán)之間插入烷基接頭(或者除去碳原子)來進(jìn)行修飾。因此，“同型(homo)”衍生物和高級(jí)同系物，以及低級(jí)同系物在用于本發(fā)明的支化PEG的核心的范圍內(nèi)。
通過諸如在下面方案3中給出的方法可以容易地制備本文所示的支化的PEG種類 方案3支化的PEG種類的制備
其中，Xa是O或S，并且r是1至5的整數(shù)。指數(shù)e和f是1至2500的獨(dú)立選擇的整數(shù)。
因而，根據(jù)方案3，將天然或非天然的氨基酸與活化的m-PEG衍生物接觸，在甲苯磺酸酯的情況中，通過使側(cè)鏈雜原子Xa烷基化而形成1。使單官能化的m-PEG氨基酸與反應(yīng)性m-PEG衍生物一起經(jīng)歷N-酰化條件，從而裝配出支化的m-PEG 2。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到的，甲苯磺酸酯離去基團(tuán)可以用任何合適的離去基團(tuán)例如鹵素、甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯等來代替。類似地，用于使胺?；姆磻?yīng)性碳酸酯可以用活性酯例如N-羥基琥珀酰亞胺等來代替，或者該酸可以用脫水劑例如二環(huán)己基碳二亞胺、羰基二咪唑等在原位活化。
在示例性的實(shí)施方案中，修飾基團(tuán)是PEG部分，然而，任何修飾基團(tuán)，例如水溶性聚合物、水不溶性聚合物、治療性部分等可以通過合適的連接而摻入糖基部分中。通過酶學(xué)方法、化學(xué)方法或其組合來形成經(jīng)修飾的糖，從而產(chǎn)生經(jīng)修飾的糖。在示例性的實(shí)施方案中，所述糖在任何位置被活性胺取代，所述位置允許修飾部分的附著，然而仍然允許該糖用作能夠?qū)⒔?jīng)修飾的糖偶聯(lián)至G-CSF多肽的酶的底物。在示例性的實(shí)施方案中，當(dāng)半乳糖胺為所述經(jīng)修飾的糖時(shí)，胺部分附著至6-位的碳原子。
水不溶性聚合物 在另一個(gè)實(shí)施方案中，類似于上面討論的那些，經(jīng)修飾的糖包含水不溶性聚合物，而不是水溶性聚合物。本發(fā)明的綴合物也可以包含一種或多種水不溶性聚合物。本發(fā)明的該實(shí)施方案通過使用綴合物作為載體來舉例說明，使用該載體以受控的方式遞送治療性多肽。聚合物藥物遞送系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的。參見例如，Dunn等人，Eds.Polymeric Drugs And Drug Delivery Systems，ACS Symposium SeriesVol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，實(shí)質(zhì)上任何已知的藥物遞送系統(tǒng)均可應(yīng)用于本發(fā)明的綴合物。
代表性的水不溶性聚合物包括但不限于，聚膦嗪、聚(乙烯醇)、聚酰胺、聚碳酸酯、聚亞烷基(polyalkylenes)、聚丙烯酰胺、聚亞烷基二醇、聚環(huán)氧烷、聚亞烷基對(duì)苯二甲酸酯、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚鹵乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸異丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸異癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸異丙酯)、聚(丙烯酸異丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(環(huán)氧乙烷)、聚(對(duì)苯二甲酸乙二醇酯)、聚(乙酸乙烯酯)、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、普流羅尼克類(pluronics)和聚乙烯基苯酚以及其共聚物。
用于本發(fā)明綴合物的經(jīng)合成修飾的天然聚合物包括但不限于，烷基纖維素、羥烷基纖維素、纖維素醚、纖維素酯和硝酸纖維素。廣泛類別的經(jīng)合成修飾的天然聚合物中特別優(yōu)選的成員包括但不限于，甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丁基甲基纖維素、乙酸纖維素、丙酸纖維素、乙酸丁酸纖維素、乙酸鄰苯二甲酸纖維素、羧甲基纖維素、三乙酸纖維素、硫酸纖維素鈉鹽以及丙烯酸和甲基丙烯酸酯與藻酸的聚合物。
本文討論的這些和其他聚合物可以容易地從商業(yè)來源例如SigmaChemical Co.(St.Louis，MO.)、Polysciences(Warrenton，PA.)、Aldrich(Milwaukee，WI.)、Fluka(Ronkonkoma，NY)和BioRad(Richmond，CA)獲得，或者使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從獲自這些供應(yīng)商的單體來合成。
用于本發(fā)明綴合物的代表性的生物可降解聚合物包括但不限于，聚丙交酯、聚乙交酯及其共聚物、聚(對(duì)苯二甲酸乙二醇酯)、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己內(nèi)酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚酐、聚原酸酯、其共混物和共聚物。特別有用的是形成凝膠的組合物，例如包含膠原、普流羅尼克類等的那些。
用于本發(fā)明的聚合物包括“雜合”聚合物，其包含在它們的結(jié)構(gòu)的至少一部分內(nèi)具有生物可吸收分子的水不溶性物質(zhì)。此類聚合物的實(shí)例是包含水不溶性共聚物的聚合物，所述共聚物的每條聚合物鏈具有生物可吸收區(qū)域、親水性區(qū)域和多個(gè)可交聯(lián)官能團(tuán)。
對(duì)于本發(fā)明的目的，“水不溶性物質(zhì)”包括基本上不溶于水或含水環(huán)境的物質(zhì)。因此，盡管共聚物的某些區(qū)域或鏈段可以是親水性的或者甚至水溶性的，但是聚合物分子(作為整體)在水中沒有任何顯著程度的溶解。
對(duì)于本發(fā)明的目的，術(shù)語“生物可吸收分子”包含能夠由身體進(jìn)行代謝或分解和吸收和/或通過正常排泄途徑消除的區(qū)域。此類代謝物或分解產(chǎn)物優(yōu)選地對(duì)身體是基本上無毒的。
生物可吸收區(qū)域可以是疏水性的或親水性的，只要該共聚物組合物作為整體不變得水溶性。因此，基于聚合物作為整體保持水不溶性的優(yōu)先情況來選擇生物可吸收區(qū)域。因此，選擇生物可吸收區(qū)域和親水性區(qū)域的相對(duì)性質(zhì)，即生物可吸收區(qū)域和親水性區(qū)域所包含的官能團(tuán)的種類，以及生物可吸收區(qū)域和親水性區(qū)域的相對(duì)比例，以確保可用的生物可吸收組合物保持水不溶性。
示例性的可吸收的聚合物包括，例如合成產(chǎn)生的聚(α-羥基-羧酸)/聚氧化烯的可吸收的嵌段共聚物(參見，Cohn等人，美國專利號(hào)4,826,945)。這些共聚物不是交聯(lián)的并且是水溶性的，從而使得身體可以排泄出經(jīng)降解的嵌段共聚物組合物。參見Younes等人，J Biomed.Mater.Res.211301-1316(1987)；和Cohn等人，J Biomed.Mater.Res.22993-1009(1988)。
目前優(yōu)選的生物可吸收聚合物包括選自下列的一種或多種組分聚酯、聚羥基酸、聚內(nèi)酯、聚酰胺、聚(酯-酰胺)、聚氨基酸、聚酐、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚膦嗪、聚磷酸酯、聚硫酯、多糖及其混合物。更優(yōu)選地，生物可吸收聚合物包括聚羥基酸組分。在聚羥基酸中，優(yōu)選聚乳酸、聚乙醇酸、聚己酸、聚丁酸、聚戊酸以及其共聚物和混合物。
除了形成在體內(nèi)被吸收(“生物吸收”)的片段外，用于本發(fā)明方法的優(yōu)選的聚合物包衣也可以形成可排泄和/或可代謝的片段。
本發(fā)明中還可以使用高級(jí)共聚物。例如，Casey等人，美國專利號(hào)4,438,253(于1984年3月20日頒發(fā))公開了從聚(乙醇酸)和具有羥基末端的聚(亞烷基二醇)的酯交換產(chǎn)生的三嵌段共聚物。此類組合物被公開用作可吸收的單絲縫合線。通過向共聚物結(jié)構(gòu)中摻入芳香族原碳酸酯，例如原碳酸四對(duì)甲苯酯來控制此類組合物的柔韌性。
也可以利用其他基于乳酸和/或乙醇酸的聚合物。例如，Spinu，美國專利號(hào)5,202,413(于1993年4月13日頒發(fā))公開了生物可降解多嵌段共聚物，其具有順序排列的聚丙交酯和/或聚乙交酯嵌段，通過丙交酯和/或乙交酯開環(huán)聚合至低聚二醇或二胺殘基上，接著用雙官能化合物例如二異氰酸酯、二酰氯或二氯硅烷進(jìn)行鏈延伸來產(chǎn)生。
可用于本發(fā)明的包衣的生物可吸收區(qū)域可以被設(shè)計(jì)成可水解和/或可酶促切割的。對(duì)于本發(fā)明的目的，“可水解切割的”是指共聚物，尤其是生物可吸收區(qū)域在水或含水環(huán)境中對(duì)于水解的易感性。類似地，如本文所使用的，“可酶促切割的”是指共聚物，尤其是生物可吸收區(qū)域?qū)τ趦?nèi)源或外源酶切割的易感性。
當(dāng)置于身體中時(shí)，親水性區(qū)域可以被加工成可排泄和/或可代謝的片段。因此，親水性區(qū)域可以包括，例如聚醚、聚環(huán)氧烷、多元醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚烷基噁唑啉、多糖、碳水化合物、肽、蛋白質(zhì)以及其共聚物和混合物。此外，親水性區(qū)域還可以是例如聚環(huán)氧烷。此類聚環(huán)氧烷可以包括，例如聚環(huán)氧乙烷、聚環(huán)氧丙烷以及其混合物和共聚物。
作為水凝膠的組分的聚合物也可以用于本發(fā)明。水凝膠是能夠吸收相對(duì)大量的水的聚合物材料。形成水凝膠的化合物的實(shí)例包括但不限于，聚丙烯酸、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷、明膠、角叉菜聚糖和其他多糖、羥基亞乙基甲基丙烯酸(HEMA)以及其衍生物，等等?？梢援a(chǎn)生穩(wěn)定的、生物可降解的和生物可吸收的水凝膠。此外，水凝膠組合物可以包括顯示出一種或多種這些性質(zhì)的亞單位。
其完整性可以通過交聯(lián)來進(jìn)行控制的生物相容的水凝膠組合物是已知的，并且目前優(yōu)選用于本發(fā)明的方法中。例如，Hubbell等人，美國專利號(hào)5,410,016(于1995年4月25日頒發(fā))和5,529,914(于1996年6月25日頒發(fā))公開了水溶性系統(tǒng)，其是交聯(lián)的嵌段共聚物，該共聚物具有夾在兩個(gè)水解不穩(wěn)定的延長部分之間的水溶性中心嵌段鏈段。此類共聚物進(jìn)一步用可光聚合的丙烯酸酯官能度進(jìn)行封端。當(dāng)交聯(lián)時(shí)，這些系統(tǒng)變成水凝膠。此類共聚物的水溶性中心嵌段包含聚(乙二醇)；而水解不穩(wěn)定的延長部分可以是聚(α-羥基酸)，例如聚乙醇酸或聚乳酸。參見Sawhney等人，Macromolecules 26581-587(1993)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝膠是熱致可逆的凝膠。包含諸如下列組分的熱致可逆的凝膠目前是優(yōu)選的普流羅尼克類、膠原、明膠、透明質(zhì)酸、多糖、聚氨酯水凝膠、聚氨酯-脲水凝膠及其組合。
在另外一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的綴合物包含脂質(zhì)體的組分?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(例如，在Eppstein等人，美國專利號(hào)4,522,811(于1985年6月11日頒發(fā))所描述的)來制備脂質(zhì)體。例如，可以通過下列方式來制備脂質(zhì)體制劑將合適的脂質(zhì)(例如，硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰膽堿、花生酰(arachadoyl)磷脂酰膽堿和膽固醇)溶解在無機(jī)溶劑中，然后蒸發(fā)所述無機(jī)溶劑，從而在容器表面上留下干燥脂質(zhì)的薄膜。然后向容器中引入活性化合物或其可藥用鹽的水溶液。然后用手旋動(dòng)容器以從容器側(cè)面釋放脂質(zhì)物質(zhì)并分散脂質(zhì)聚集體，從而形成脂質(zhì)體懸浮液。
為了舉例而提供上述微粒和制備微粒的方法，并且它們并不意在限定用于本發(fā)明的微粒的范圍。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言明顯的是，通過不同方法制造的一大批微粒可用于本發(fā)明。
上面在直連和支化的水溶性聚合物情況下所討論的結(jié)構(gòu)形式一般也可應(yīng)用于水不溶性聚合物。因此，例如，半胱氨酸、絲氨酸、二賴氨酸和三賴氨酸分枝核心可以用兩個(gè)水不溶性聚合物部分來官能化。用于產(chǎn)生這些種類的方法一般與用于產(chǎn)生水溶性聚合物的那些方法非常相似。
其他修飾基團(tuán) 本發(fā)明還提供了類似于上面所描述的那些的綴合物，其中多肽通過糖基連接基團(tuán)而綴合至治療性部分、診斷性部分、靶向性部分、毒素部分等等。上述部分中的每一種可以是小分子、天然聚合物(例如，多肽)或合成聚合物。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的綴合物，其由于存在作為該綴合物的組分的靶向性試劑而選擇性地定位于特定組織中。在示例性的實(shí)施方案中，所述靶向性試劑是蛋白質(zhì)。示例性的蛋白質(zhì)包括轉(zhuǎn)鐵蛋白(腦、血池)，HS-糖蛋白(骨、腦、血池)，抗體(腦、具有抗體特異性抗原的組織、血池)，凝血因子V-XII(受損的組織、血塊、癌癥、血池)，血清蛋白，例如α-酸性糖蛋白，胎球蛋白，α-胎兒蛋白(腦、血池)，β2-糖蛋白(肝臟、動(dòng)脈粥樣硬化斑、腦、血池)，G-CSF，GM-CSF，M-CSF和EPO(免疫刺激、癌癥、血池、紅細(xì)胞過量產(chǎn)生、神經(jīng)保護(hù))，白蛋白(半壽期增加)，IL-2和IFN-α。
在示例性的靶向綴合物中，將干擾素-α2β(IFN-α2β)通過雙官能接頭綴合至轉(zhuǎn)鐵蛋白，所述雙官能接頭在PEG部分的每個(gè)末端包含糖基連接基團(tuán)(方案1)。例如，PEG接頭的一個(gè)末端用附著至轉(zhuǎn)鐵蛋白的完整唾液酸接頭進(jìn)行官能化，和另一末端用附著至IFN-α2β的完整C-聯(lián)Man接頭進(jìn)行官能化。
生物分子 在另一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的糖攜帶有生物分子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，生物分子是功能性蛋白質(zhì)、酶、抗原、抗體、肽、核酸(例如，單核苷酸或核苷、寡核苷酸、多核苷酸以及單鏈或更高鏈的核酸)、凝集素、受體或其組合。
優(yōu)選的生物分子是基本上不發(fā)熒光的，或者發(fā)出如此少量的熒光從而使得它們不適合在測(cè)定法中用作熒光標(biāo)記物。此外，通常優(yōu)選使用不是糖類的生物分子。該優(yōu)選情況的一個(gè)例外是使用通過共價(jià)附著另一實(shí)體(例如，PEG、生物分子、治療性部分、診斷性部分等)而進(jìn)行修飾的天然存在的糖。在示例性的實(shí)施方案中，通過本發(fā)明的方法將糖部分(其是生物分子)綴合至接頭臂并隨后將該糖-接頭臂盒綴合至多肽。
可用于實(shí)施本發(fā)明的生物分子可以來自任何來源。生物分子可以分離自天然來源或者它們可以通過合成方法來產(chǎn)生。多肽可以是天然多肽或突變的多肽。可以通過化學(xué)誘變、位點(diǎn)定向誘變或者其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的誘導(dǎo)突變的方法來實(shí)現(xiàn)突變。可用于實(shí)施本發(fā)明的多肽包括，例如酶、抗原、抗體和受體?？贵w可以是多克隆的或單克隆的；完整的或者片段。多肽可以任選是定向進(jìn)化程序的產(chǎn)物。
天然來源的和合成的多肽和核酸可用于本發(fā)明；這些分子可以通過任何可利用的反應(yīng)性基團(tuán)而附著至糖殘基組分或者交聯(lián)劑。例如，多肽可以通過反應(yīng)性胺、羧基、巰基或羥基來進(jìn)行附著。反應(yīng)性基團(tuán)可以位于多肽末端或者多肽鏈的內(nèi)部位點(diǎn)。核酸可以通過堿基上的反應(yīng)性基團(tuán)(例如，環(huán)外胺)或者糖部分上的可利用的羥基(例如，3’-或5’-羥基)來進(jìn)行附著。肽和核酸鏈可以在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處進(jìn)一步衍生化以允許合適的反應(yīng)性基團(tuán)附著至鏈上。參見Chrisey等人Nucleic Acids Res.243031-3039(1996)。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，選擇生物分子以將通過本發(fā)明方法進(jìn)行修飾的多肽導(dǎo)向特定組織，從而相對(duì)于遞送到該組織的未衍生化的多肽的量而言增強(qiáng)該多肽向該組織的遞送。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在所選時(shí)間段內(nèi)遞送到特定組織的經(jīng)衍生化的多肽的量通過衍生化而增加至少約20％，更優(yōu)選至少約40％，和更加優(yōu)選至少約100％。目前，用于靶向應(yīng)用的優(yōu)選生物分子包括抗體、激素和細(xì)胞表面受體的配體。
在更加進(jìn)一步的示例性實(shí)施方案中，提供了具有生物素的綴合物。因此，例如，通過附著攜帶有一個(gè)或多個(gè)修飾基團(tuán)的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白部分來制作選擇性生物素化的多肽。
治療性部分 在另一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的糖包含治療性部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，在治療性部分和生物分子類別之間存在重疊；許多生物分子具有治療性質(zhì)或潛力。
治療性部分可以是已經(jīng)被接受用于臨床使用的試劑，或者它們可以是這樣的藥物，所述藥物的使用是試驗(yàn)性的或者所述藥物的活性或作用機(jī)制還在研究中。治療性部分可以在給定疾病狀態(tài)中具有經(jīng)證明的作用，或者可以僅僅假設(shè)在給定疾病狀態(tài)中顯示出所希望的作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療性部分是化合物，所述化合物正在就其與所選組織相互作用的能力而進(jìn)行篩選?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的治療性部分包括來自具有各種藥理學(xué)活性的寬范圍藥物類別的藥物。優(yōu)選的治療性部分是基本上不發(fā)熒光的，或者發(fā)出如此少量的熒光從而使得它們不適合在測(cè)定法中用作熒光標(biāo)記物。此外，一般優(yōu)選使用不是糖的治療性部分。該優(yōu)選情況的一個(gè)例外是使用通過共價(jià)附著另一實(shí)體(例如PEG、生物分子、治療性部分、診斷性部分等)而進(jìn)行修飾的糖。在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，通過本發(fā)明的方法將治療性糖部分綴合至接頭臂并隨后將該糖-接頭臂盒綴合至多肽。
用于將治療劑和診斷劑綴合至各種其他種類的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。參見例如，Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；和Dunn等人，Eds.POLYMERICDRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，ACS Symposium Series Vol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991。
在示例性的實(shí)施方案中，治療性部分通過在所選條件下被切割的連接而附著至經(jīng)修飾的糖。示例性的條件包括但不限于，所選的pH(例如，胃、腸、胞吞液泡)、活性酶的存在(例如，酯酶、還原酶、氧化酶)、光、熱等等。許多可切割的基團(tuán)是本領(lǐng)域已知的。參見例如，Jung等人，Biochem.Biophys.Acta，761152-162(1983)；Joshi等人，J.Biol.Chem.，26514518-14525(1990)；Zarling等人，J.Immunol.，124913-920(1980)；Bouizar等人，Eur.J.Biochem.，155141-147(1986)；Park等人，J.Biol.Chem.，261205-210(1986)；Browning等人，J.Immunol.，1431859-1867(1989)。
可用的治療性部分的類別包括，例如非類固醇抗炎藥物(NSAIDS)。NSAIDS可以例如選自下面的類別(例如，丙酸衍生物、乙酸衍生物、滅酸衍生物、聯(lián)苯羧酸衍生物和昔康類)；類固醇抗炎藥物，包括氫化可的松等等；抗組胺藥(例如，氯苯那敏、曲普利啶)；止咳藥(例如，右美沙芬、可待因、卡拉美芬和噴托維林)；止癢藥(例如，甲地嗪和阿利馬嗪)；抗膽堿能藥(例如，東莨菪堿、阿托品、后馬托品、左旋多巴)；止吐藥和止惡心藥(例如，賽克力嗪、美克洛嗪、氯丙嗪、布克力嗪)；減食欲藥(例如，芐非他明、芬特明、對(duì)氯苯丁胺、芬氟拉明)；中樞興奮藥(例如，苯丙胺、去氧麻黃堿、右苯丙胺和哌甲酯)；抗心律不齊藥(例如，普萘洛爾、普魯卡因胺、丙吡胺、奎尼丁、恩卡尼)；β-腎上腺素能阻斷藥(例如，美托洛爾、醋丁洛爾、倍他洛爾、拉貝洛爾和噻嗎洛爾)；強(qiáng)心藥(例如，米力農(nóng)、氨力農(nóng)和多巴酚丁胺)；抗高血壓藥(例如，依那普利、可樂定、肼屈嗪、米諾地爾、胍那決爾、胍乙啶)；利尿藥(例如，阿米洛利和氫氯噻嗪)；血管舒張藥(例如，地爾硫

胺碘酮、異克舒令、布酚寧、妥拉唑林和維拉帕米)；血管收縮藥(例如，雙氫麥角胺、麥角胺和二甲麥角新堿)；抗?jié)兯?例如，雷尼替丁和西咪替丁)；麻醉藥(例如，利多卡因、布比卡因、氯普魯卡因、地布卡因)；抗抑郁藥(例如，丙咪嗪、地昔帕明、阿米替林、去甲替林)；安定藥和鎮(zhèn)靜藥(例如，氯氮

貝那替秦、苯喹胺、氟西泮、羥嗪、洛沙平和丙嗪)；抗精神病藥(例如，氯普噻噸、氟奮乃靜、氟哌啶醇、嗎茚酮、硫利達(dá)嗪和三氟拉嗪)；抗微生物藥(抗細(xì)菌、抗真菌、抗原生動(dòng)物和抗病毒藥物)。
優(yōu)選摻入本組合物的抗微生物藥物包括，例如下列藥物的可藥用鹽β-內(nèi)酰胺類藥物、喹諾酮類藥物、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、四環(huán)素、紅霉素、阿米卡星、三氯生、多西環(huán)素、卷曲霉素、氯己定、金霉素、土霉素、克林霉素、乙胺丁醇、異硫羰酸己脒定、甲硝唑、噴他脒、慶大霉素、卡那霉素、林可霉素(lineomycin)、甲烯土霉素、烏洛托品、米諾環(huán)素、新霉素、乙基西梭霉素、巴龍霉素、鏈霉素、妥布霉素、咪康唑和金剛烷胺。
用于實(shí)施本發(fā)明的其他藥物部分包括抗腫瘤藥(例如，抗雄激素藥(例如，亮丙立德或氟他胺)、殺細(xì)胞劑(例如，阿霉素、多柔比星、紫杉醇、環(huán)磷酰胺、白消安、順鉑、β-2-干擾素)、抗雌激素藥(例如，他莫昔芬)、抗代謝物(例如，氟尿嘧啶、氨甲蝶呤、巰基嘌呤、硫代烏嘌呤)。該類別中還包括用于診斷和治療的基于放射性同位素的試劑，和綴合的毒素，例如蓖麻毒蛋白、格爾德霉素、美登素、CC-1065、倍癌霉素、刺孢霉素及其相關(guān)的結(jié)構(gòu)和類似物。
治療性部分也可以是激素(例如，甲羥孕酮、雌二醇、亮丙立德、甲地孕酮、奧曲肽或促生長素抑制素)；肌肉松弛藥(例如，桂美君、環(huán)苯扎林、黃酮哌酯、奧芬那君、罌粟堿、美貝維林、異達(dá)維林、利托君、地芬諾酯、丹曲林和阿珠莫林)；解痙藥；骨活性藥物(例如，二膦酸鹽和膦?；榛戊⑺猁}藥物化合物)；內(nèi)分泌調(diào)節(jié)藥物(例如，避孕藥(例如，炔諾醇、炔雌醇、炔諾酮、美雌醇、去氧孕烯、甲羥孕酮)、糖尿病調(diào)節(jié)劑(例如，格列本脲或氯磺丙脲)、同化激素類藥(例如，睪內(nèi)酯或司坦唑醇)、雄激素類(例如，甲睪酮、睪酮或氟甲睪酮)、抗利尿藥(例如，去氨加壓素)和降鈣素)。
也可以用于本發(fā)明的是雌激素類(例如，己烯雌酚)、糖皮質(zhì)激素類(例如，曲安西龍、倍他米松，等等)和孕激素類(例如，炔諾酮、炔諾醇、炔諾酮、左炔諾孕酮)；甲狀腺劑(例如，碘塞羅寧或左甲狀腺素)或抗甲狀腺劑(例如，甲巰咪唑)；抗高催乳素血癥藥物(例如，卡麥角林)；激素抑制劑(例如，達(dá)那唑或戈舍瑞林)，催產(chǎn)藥(例如，甲麥角新堿或催產(chǎn)素)和前列腺素類(例如，米索前列醇、前列地爾或地諾前列酮)。
其他有用的修飾基團(tuán)包括免疫調(diào)節(jié)藥物(例如，抗組織胺藥，肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑，例如洛度沙胺和/或色甘酸鈉(cromolyn)，類固醇(例如，曲安西龍、beclomethazone、可的松、地塞米松、潑尼松龍、甲潑尼龍、丙酸倍氯米松(beclomethasone)或氯倍他索)，組胺H2拮抗劑(例如，法莫替丁、西咪替丁、雷尼替丁)，免疫抑制劑(例如，硫唑嘌呤、環(huán)孢菌素)，等等。還可以使用具有抗炎活性的基團(tuán)，如舒林酸、依托度酸、酮洛芬和酮咯酸。用于本發(fā)明的其他藥物對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是明顯的。
經(jīng)修飾的糖核苷酸 在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的糖核苷酸用于向肽添加經(jīng)修飾的糖。以它們的修飾形式在本發(fā)明中使用的示例性的糖核苷酸包括核苷酸一磷酸、二磷酸或三磷酸或其類似物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的糖核苷酸選自UDP-糖苷、CMP-糖苷和GDP糖苷。更加優(yōu)選地，經(jīng)修飾的糖核苷酸選自UDP-半乳糖、UDP-半乳糖胺、UDP-葡萄糖、UDP-葡糖胺、GDP-甘露糖、GDP-巖藻糖、CMP-唾液酸和CMP-NeuAc。糖核苷酸的N-乙酰基胺衍生物也可用于本發(fā)明的方法中。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中可使用的經(jīng)修飾的糖核苷酸是UDP-糖，其中糖部分是選自葡糖胺部分和葡糖胺模擬部分的成員。因此，在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有根據(jù)式(XI)的結(jié)構(gòu)的化合物
其中每個(gè)Q是獨(dú)立地選自H、負(fù)電荷和鹽抗衡離子(例如，Na、K、Li、Mg、Mn、Fe)的成員。E是選自O(shè)、S和CH2的成員。G是選自-CH2-和C＝A的成員，其中A是選自O(shè)、S和NR27的成員，其中R27是選自取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基和取代或未取代的雜環(huán)烷基的成員。E1是選自O(shè)和S的成員。R21、R22、R23和R24是獨(dú)立地選自H、OR25、SR25、NR25R26、NR25S(O)2R26、S(O)2NR25R26、NR25C(O)R26、C(O)NR25R26、C(O)OR25、?；⑷〈蛭慈〈耐榛?、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基和取代或未取代的雜環(huán)烷基的成員，其中R25和R26是獨(dú)立地選自H、?；⑷〈蛭慈〈耐榛?、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的雜環(huán)烷基的成員。在示例性的實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的糖核苷酸具有根據(jù)式(XIa)或(XIb)的結(jié)構(gòu)
在根據(jù)上述實(shí)施方案中任一個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)例中，R21、R22、R23和R24中的至少一個(gè)包含聚合物修飾基團(tuán)。在根據(jù)上述實(shí)施方案(例如式(XI)、(XIa)和(XIb))中任一個(gè)實(shí)施方案的另一個(gè)實(shí)例中，E和E1都是氧(O)。在另外一個(gè)實(shí)例中，經(jīng)修飾的糖核苷酸是經(jīng)修飾的UDP-GlcNAc或經(jīng)修飾的GlcNH。在進(jìn)一步的實(shí)例中，經(jīng)修飾的UDP-GlcNAc或經(jīng)修飾的GlcNH在2-或6-位處用聚合物修飾基團(tuán)進(jìn)行修飾。
在一個(gè)實(shí)例中，經(jīng)修飾的糖核苷酸的糖部分用包含水溶性聚合物例如聚(環(huán)氧烷)部分(例如，PEG或PPG)或其衍生物的聚合物修飾基團(tuán)進(jìn)行修飾。示例性的經(jīng)修飾的糖核苷酸攜帶通過糖上的胺部分進(jìn)行修飾的糖基部分或糖基模擬部分。例如，糖基胺(沒有修飾基團(tuán))可以酶促綴合至肽(或者其他種類)，并且游離的胺部分隨后綴合至所希望的修飾基團(tuán)。備選地，經(jīng)修飾的糖核苷酸可以用作酶的底物，所述酶將經(jīng)修飾的糖轉(zhuǎn)移至多肽上的糖基接納體。
在下面的討論中，給出了許多可用于實(shí)施本發(fā)明的經(jīng)修飾的糖核苷酸的具體實(shí)例。在示例性的實(shí)施方案中，將葡萄糖、葡萄糖模擬部分、葡糖胺部分、葡糖胺模擬部分或任何其衍生物用作在其上附著修飾基團(tuán)的糖部分。關(guān)于葡糖胺衍生物的討論的焦點(diǎn)僅僅是為了清楚地舉例說明，而不應(yīng)當(dāng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，可以以與本文給出的實(shí)例類似的方式來活化和衍生化各種其他糖部分。例如，許多方法可以用于修飾半乳糖、唾液酸、葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺和巖藻糖等糖底物，其可以通過公認(rèn)的方法容易地進(jìn)行修飾。參見例如，Elhalabi等人，Curr.Med.Chem.693(1999)；和Schafer等人，J.Org.Chem.6524(2000)。
在示例性的實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的糖核苷酸基于葡糖胺部分。如方案3和方案4中所顯示的，可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法在2-或6-位處修飾葡糖胺或N-乙酰葡糖胺。
方案3示例性的經(jīng)修飾的糖核苷酸的制備
在上面的方案3中，指數(shù)n表示0至5000，優(yōu)選10至2500，和更優(yōu)選10至1200的整數(shù)。La是鍵或接頭基團(tuán)，和X＊是選自線性和支化的聚合物修飾基團(tuán)。符號(hào)“A”表示活化基團(tuán)，例如鹵代、活化的酯(例如，N-羥基琥珀酰亞胺酯)的組分、碳酸酯(例如，碳酸對(duì)硝基苯酯)的組分等等。Q是H、負(fù)電荷或鹽抗衡離子(例如，Na+)。在方案3中，首先將GlcNAc部分的伯羥基氧化成醛基(例如，使用氧化酶，例如葡糖氧化酶)，其通過還原性胺化而進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化為胺。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，通過該方法和類似方法可以容易地制備其他PEG-酰胺核苷酸糖。
在其他示例性的實(shí)施方案中，用諸如氨基甲酸乙酯或脲的基團(tuán)替代所述酰胺部分。
方案4示例性的經(jīng)修飾的糖核苷酸的制備
在方案4中，用受保護(hù)的氨基酸(例如，甘氨酸)衍生物的經(jīng)活化的酯來處理葡糖胺1，從而形成受保護(hù)的氨基酸酰胺加合物2。將化合物2轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的UDP衍生物，例如通過酶(例如UDP-Glc-合成酶)的作用，接著進(jìn)行UDP衍生物的催化氫化，從而產(chǎn)生化合物3。將甘氨酸側(cè)鏈的氨基用于進(jìn)行聚合物修飾基團(tuán)(例如，PEG或PPG)的附著，所述附著通過使化合物3與經(jīng)活化的(m-)PEG衍生物(例如，PEG-C(O)NHS)反應(yīng)來進(jìn)行，從而產(chǎn)生化合物4。備選地，化合物3可以與(m-)PPG衍生物(例如，PPG-C(O)NHS)進(jìn)行反應(yīng)，從而提供相應(yīng)的PPG類似物。胺反應(yīng)性PEG和PPG類似物可通過商業(yè)途徑獲得，或者它們可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員容易得到的方法來制備。
用于實(shí)施本發(fā)明的經(jīng)修飾的糖核苷酸的糖部分可以在下面的式(XIIa)和(XIIb)中所圖示的任何位置處用聚合物修飾基團(tuán)進(jìn)行修飾

其中A和Q如上文定義。
在式(XIIa)和(XIIb)中，X1、X2、X3和X4是獨(dú)立選擇的連接基團(tuán)，優(yōu)選地選自單鍵、-O-、-NRe-、-S-和-CH2-，其中每個(gè)Re是獨(dú)立地選自Ra、Rb、Rc和Rd的成員。符號(hào)Ra、Rb、Rc和Rd獨(dú)立地選自H、?；?例如，乙?；?、修飾基團(tuán)(例如，聚合物修飾基團(tuán)、治療性部分、生物分子，等等)和結(jié)合至修飾基團(tuán)的接頭。
在上述結(jié)構(gòu)中，Ra、Rb、Rc和Rd中的至少一個(gè)包含修飾基團(tuán)，例如聚合物修飾基團(tuán)。位置2和6對(duì)于用聚合物修飾基團(tuán)來修飾糖部分來說是特別優(yōu)選的。在式(XIIb)中，A是O、S、NRf，其中Rf是選自H，Ra，Rb，Rc和Rd，取代或未取代的烷基，取代或未取代的雜烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的雜芳基，取代或未取代的環(huán)烷基和取代或未取代的雜環(huán)烷基的成員。
在一個(gè)實(shí)例中，Ra、Rb、Rc和Rd中的至少一個(gè)包含摻入了至少一個(gè)聚(環(huán)氧烷)部分(例如，PEG或PPG部分)的聚合物修飾基團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)例中，Ra、Rb、Rc和Rd中的至少一個(gè)包含選自下列的部分PEG、PPG、?；?PEG、酰基-PPG、烷基-PEG、?；?烷基-PEG、氨基甲?；?PEG、氨基甲酰基-PPG、芳基-PEG、?；?芳基-PEG、芳基-PPG、?；?芳基-PPG、甘露糖-6-磷酸、肝素、乙酰肝素、SLex、甘露糖、軟骨素、角質(zhì)素、皮膚素、白蛋白、多肽(例如，本文公開的那些中的任一種)、肽等等(例如，F(xiàn)GF、VFGF、整聯(lián)蛋白)。
下面的表12給出了用修飾基團(tuán)例如聚合物修飾基團(tuán)(例如，水溶性修飾基團(tuán)，例如PEG或PPG部分)進(jìn)行衍生化的經(jīng)修飾的糖核苷酸的代表性實(shí)例。表12的某些化合物通過方案3的方法來制備。其他衍生物通過本領(lǐng)域公認(rèn)的方法來制備。參見例如，Keppler等人，Glycobiology 1111R(2001)；和Charter等人，Glycobiology 101049(2000)。
表12用聚合物修飾基團(tuán)進(jìn)行衍生化的糖核苷酸的實(shí)例
在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，聚合物修飾基團(tuán)是支化的PEG，例如，本文所給出的那些種類中的一種。根據(jù)該實(shí)施方案的舉例說明性的經(jīng)修飾的糖核苷酸或多肽綴合物包含選自下列的部分
其中X4是鍵或O，和J是S或O。
示例性的經(jīng)修飾的糖核苷酸具有選自下列的結(jié)構(gòu)

其中X4是鍵或O，J是S或O，和y是0或1。
其他示例性的經(jīng)修飾的糖核苷酸具有選自下列的結(jié)構(gòu)

其中Q如上文定義，和p是選自0至50的整數(shù)。
其他示例性的經(jīng)修飾的糖核苷酸具有選自下列的結(jié)構(gòu)

活化的糖 在其他實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的糖是活化的糖?？捎糜诒景l(fā)明的經(jīng)活化的、經(jīng)修飾的糖通常是被合成改變以包含離去基團(tuán)的糖苷。在一個(gè)實(shí)例中，在酶促反應(yīng)中使用活化的糖以將活化的糖轉(zhuǎn)移到肽或糖肽上的接納體上。在另一個(gè)實(shí)例中，通過化學(xué)方法將活化的糖添加至肽或糖肽?！半x去基團(tuán)”(或活化基團(tuán))指那些部分，其在酶調(diào)節(jié)的親核取代反應(yīng)中容易被置換，或者備選地，在利用親核反應(yīng)參與物(例如，攜帶巰基的糖基部分)的化學(xué)反應(yīng)中被替代。為每種類型的反應(yīng)選擇合適的離去基團(tuán)在技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。許多活化的糖是本領(lǐng)域已知的。參見例如，Vocadlo等人，CARBOHYDRATE CHEMISTRY ANDBIOLOGY，Vol.2，Ernst等人Ed.，Wiley-VCH VerlagWeinheim，Germany，2000；Kodama等人，Tetrahedron Lett.346419(1993)；Lougheed等人，J.Biol.Chem.27437717(1999)。
離去基團(tuán)的實(shí)例包括鹵素(例如，氟、氯、溴)、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯，等等。用于在酶介導(dǎo)的反應(yīng)中使用的優(yōu)選的離去基團(tuán)是在立體上不顯著阻礙糖苷向接納體的酶促轉(zhuǎn)移的那些離去基團(tuán)。因此，活化的糖苷衍生物的優(yōu)選實(shí)施方案包括糖基氟和糖基甲磺酸酯，糖基氟是特別優(yōu)選的。在糖基氟中，最優(yōu)選的是α-半乳糖基氟、α-甘露糖基氟、α-葡糖基氟、α-巖藻糖基氟、α-木糖基氟、α-唾液酸基氟、α-N-乙酰葡糖胺基氟、α-N-乙酰半乳糖胺基氟、β-半乳糖基氟、β-甘露糖基氟、β-葡糖基氟、β-巖藻糖基氟、β-木糖基氟、β-唾液酸基氟、β-N-乙酰葡糖胺基氟和β-N-乙酰半乳糖胺基氟。對(duì)于非酶促的親核取代，可以使用這些和其他離去基團(tuán)。例如，活化的供體糖苷可以是二硝基苯基(DNP)或溴代-糖苷。
作為舉例說明，可以通過下列方式來從游離糖制備糖基氟首先乙?；?，然后用HF/吡啶處理所述糖部分。這產(chǎn)生受保護(hù)的(乙?；?糖基氟的熱力學(xué)上最穩(wěn)定的端基異構(gòu)體(即，α-糖基氟)。如果希望較不穩(wěn)定的端基異構(gòu)體(即，β-糖基氟)，那么可以通過下列方式來制備用HBr/HOAc或用HCl來轉(zhuǎn)化過乙酰化的糖從而產(chǎn)生端基異構(gòu)的溴化物或氯化物。該中間體與氟化物鹽例如氟化銀反應(yīng)，從而產(chǎn)生糖基氟。乙酰化的糖基氟可以通過與在甲醇中的溫和的(催化性的)堿(例如，NaOMe/MeOH)反應(yīng)來去保護(hù)。此外，許多糖基氟可以通過商業(yè)途徑獲得。
使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法可以制備其他活化的糖基衍生物。例如，可以通過下列方式來制備糖基甲磺酸酯用甲磺酰氯處理糖的完全芐基化的半縮醛形式，隨后催化氫化以除去芐基。
在進(jìn)一步的示例性實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的糖是具有觸角結(jié)構(gòu)的寡糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述觸角的一個(gè)或多個(gè)末端攜帶有修飾部分。當(dāng)超過一個(gè)的修飾部分附著至具有觸角結(jié)構(gòu)的寡糖時(shí)，該寡糖可用于“擴(kuò)增”修飾部分；每個(gè)綴合至肽的寡糖單位將多個(gè)拷貝的修飾基團(tuán)附著至肽。在上面的圖式中所示的本發(fā)明典型綴合物的一般結(jié)構(gòu)包括多價(jià)種類，其是由于利用觸角結(jié)構(gòu)來制備本發(fā)明的綴合物而產(chǎn)生的。許多觸角糖結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域已知的，并且可以用它們來實(shí)施本方法，而沒有限制。
經(jīng)修飾的糖的制備 一般地，通過使用反應(yīng)性官能團(tuán)在糖部分和修飾基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵，所述反應(yīng)性官能團(tuán)通常通過連接過程而被轉(zhuǎn)化成新的有機(jī)官能團(tuán)或者非反應(yīng)性種類。為了形成該鍵，修飾基團(tuán)和糖部分?jǐn)y帶互補(bǔ)的反應(yīng)性官能團(tuán)。反應(yīng)性官能團(tuán)可以位于糖部分上的任何位置。
可用于實(shí)施本發(fā)明的反應(yīng)性基團(tuán)和反應(yīng)類別一般地是生物綴合物化學(xué)領(lǐng)域中公知的那些。用反應(yīng)性糖部分可得的目前有利的反應(yīng)類別是在相對(duì)溫和的條件下進(jìn)行的那些。這些反應(yīng)包括但不限于親核取代(例如，胺和醇與酰鹵、活性酯的反應(yīng))、親電取代(例如，烯胺反應(yīng))和與碳-碳和碳-雜原子多重鍵加成(例如，邁克爾反應(yīng)、第爾斯-阿爾德加成)。這些和其他有用的反應(yīng)在下列文獻(xiàn)中討論例如March，ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY，第3版，John Wiley & Sons，NewYork，1985；Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；和Feeney等人，MODIFICATION OF PROTEINS；Advances in Chemistry Series，Vol.198，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982。
反應(yīng)性官能團(tuán) 從糖核心或修飾基團(tuán)上懸掛出的可用的反應(yīng)性官能團(tuán)包括，但不限于 (a)羧基和其各種衍生物，包括但不限于，N-羥基琥珀酰亞胺酯、N-羥基苯并三唑酯、?；u、?；溥蝾悺⒘蝓?、對(duì)硝基苯酯、烷基、鏈烯基、炔基和芳香族酯； (b)羥基，其可以被轉(zhuǎn)化成例如酯、醚、醛等等； (c)鹵代烷基，其中該鹵化物可以以后用親核基團(tuán)例如胺、羧酸根陰離子、硫羥基陰離子、碳負(fù)離子或醇鹽離子置換，從而導(dǎo)致在該鹵素原子的官能團(tuán)處共價(jià)附著新的基團(tuán)； (d)親二烯基團(tuán)，其能夠參與第爾斯-阿爾德反應(yīng)，例如馬來酰亞氨基； (e)醛和酮基團(tuán)，從而可能通過形成羰基衍生物例如亞胺、腙、縮氨基脲或肟，或者通過諸如格利雅加成或烷基鋰加成的機(jī)制來進(jìn)行隨后的衍生化； (f)磺酰鹵基團(tuán)，其用于隨后與例如胺反應(yīng)從而形成磺酰胺； (g)硫羥基，其可以例如轉(zhuǎn)化為二硫化物或者與酰鹵反應(yīng)； (h)胺或巰基，其可以例如被?；?、烷基化或氧化； (i)鏈烯烴，其可以經(jīng)歷例如環(huán)加成、?；?、邁克爾加成，等等；和 (j)環(huán)氧化物，其可以例如與胺和羥基化合物反應(yīng)。
可以如此選擇反應(yīng)性官能團(tuán)，從而它們不參與或者干擾對(duì)于裝配反應(yīng)性糖核心或者修飾基團(tuán)而言所必需的反應(yīng)。備選地，可以在保護(hù)基存在下保護(hù)反應(yīng)性官能團(tuán)免于參與所述反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解如何保護(hù)具體的官能團(tuán)，從而使得它不干擾所選的一組反應(yīng)條件?？捎玫谋Ｗo(hù)基的實(shí)例參見例如，Greene等人，PROTECTIVE GROUPS INORGANIC SYNTHESIS，John Wiley & Sons，New York，1991。
交聯(lián)基團(tuán) 用于本發(fā)明方法的經(jīng)修飾的糖的制備包括將修飾基團(tuán)附著至糖殘基并形成穩(wěn)定的加合物，其是糖基轉(zhuǎn)移酶的底物。糖和修飾基團(tuán)可以通過零級(jí)或高級(jí)交聯(lián)劑進(jìn)行偶聯(lián)。可以用于將修飾基團(tuán)附著至碳水化合物部分的示例性雙官能化合物包括，但不限于，雙官能聚(乙二醇)、聚酰胺、聚醚、聚酯等等。用于將碳水化合物連接至其他分子的一般方法是本領(lǐng)域已知的。參見例如，Lee等人，Biochemistry 281856(1989)；Bhatia等人，Anal.Biochem.178408(1989)；Janda等人，J.Am.Chem.Soc.1128886(1990)；和Bednarski等人，WO 92/18135。在下面的討論中，將反應(yīng)性基團(tuán)對(duì)待為在新生經(jīng)修飾的糖的糖部分上是良性的。討論的焦點(diǎn)是為了清楚地舉例說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，該討論也與修飾基團(tuán)上的反應(yīng)性基團(tuán)相關(guān)。
使用各種試劑，以分子內(nèi)化學(xué)交聯(lián)來修飾經(jīng)修飾的糖的組分(交聯(lián)試劑和交聯(lián)程序的綜述見Wold，F(xiàn).，Meth.Enzymol.25623-651，1972；Weetall，H.H.和Cooney，D.A.，Enzymes as Drugs.(Holcenberg和Roberts，eds.)pp.395-442，Wiley，New York，1981；Ji，T.H.，Meth.Enzymol.91580-609，1983；Mattson等人，Mol.Biol.Rep.17167-183，1993，它們都通過提及而合并入本文)。優(yōu)選的交聯(lián)試劑源自各種零長度的、同雙官能的和異雙官能的交聯(lián)試劑。零長度的交聯(lián)試劑包括直接綴合兩個(gè)固有的化學(xué)基團(tuán)而不引入外來物質(zhì)。催化二硫鍵形成的試劑屬于該類別。另一個(gè)實(shí)例是誘導(dǎo)羧基和伯氨基的縮合從而形成酰胺鍵的試劑，例如碳二亞胺、氯甲酸乙酯、伍德瓦德試劑K(2-乙基-5-苯基異噁唑鎓-3′-磺酸鹽)和羰基二咪唑。除了這些化學(xué)試劑外，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(谷氨?；?肽γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶；EC 2.3.2.13)可以用作零長度的交聯(lián)試劑。該酶在蛋白質(zhì)結(jié)合的谷氨酰胺酰基殘基的羧酰胺基團(tuán)處催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，通常使用伯氨基作為底物。優(yōu)選的同和異雙官能試劑分別含有兩個(gè)相同或兩個(gè)不同的位點(diǎn)，其可以對(duì)于氨基、巰基、胍基、吲哚或非特異性基團(tuán)是反應(yīng)性的。
除了使用位點(diǎn)特異性反應(yīng)性部分外，本發(fā)明還考慮使用非特異性反應(yīng)性基團(tuán)來將糖連接至修飾基團(tuán)。
示例性的非特異性交聯(lián)劑包括在黑暗中完全惰性的光可活化的基團(tuán)，其在吸收合適能量的光子后轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性種類。在一個(gè)實(shí)施方案中，光可活化的基團(tuán)選自在加熱或光解疊氮化物后產(chǎn)生的氮賓的前體。缺電子的氮賓是極具反應(yīng)性的并且可以與各種化學(xué)鍵反應(yīng)，所述化學(xué)鍵包括N-H、O-H、C-H和C＝C。盡管可以使用三種類型的疊氮化物(芳基、烷基和?；苌?，但是目前為芳基疊氮化物。在光解后芳基疊氮化物與N-H和O-H鍵的反應(yīng)性比與C-H鍵更好。缺電子的芳基氮賓快速環(huán)擴(kuò)張從而形成脫氫氮雜

，其傾向于與親核體反應(yīng)，而不是形成C-H插入產(chǎn)物。通過在環(huán)中吸電子取代基例如硝基或羥基的存在可以增加芳基疊氮化物的反應(yīng)性。此類取代基將芳基疊氮化物的最大吸收推向更長的波長。未取代的芳基疊氮化物具有在260-280nm范圍內(nèi)的最大吸收，而羥基和硝基芳基疊氮化物吸收305nm外的大量光。因此，羥基和硝基芳基疊氮化物是最優(yōu)選的，因?yàn)榕c未取代的芳基疊氮化物相比，它們?cè)试S使用對(duì)于親和組分的有害性更低的光解條件。
在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，為接頭基團(tuán)提供可以被切割從而從糖殘基釋放出修飾基團(tuán)的基團(tuán)。許多可切割的基團(tuán)是本領(lǐng)域已知的。參見例如，Jung等人，Biochem.Biophys.Acta 761152-162(1983)；Joshi等人，J.Biol.Chem.26514518-14525(1990)；Zarling等人，J.Immunol.124913-920(1980)；Bouizar等人，Eur.J.Biochem.155141-147(1986)；Park等人，J.Biol.Chem.261205-210(1986)；Browning等人，J.Immunol.1431859-1867(1989)。此外，寬范圍的可切割的雙官能(同和異雙官能)接頭基團(tuán)可以通過商業(yè)途徑從供應(yīng)商例如Pierce獲得。
用光、熱或者試劑例如硫醇、羥胺、堿、高碘酸鹽等等可以切割示例性的可切割部分。此外，作為對(duì)于被胞吞而作出的應(yīng)答，某些優(yōu)選的基團(tuán)在體內(nèi)被切割(例如，順烏頭?；?；參見，Shen等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1021048(1991))。優(yōu)選的可切割基團(tuán)包括可切割的部分，其是選自二硫化物、酯、酰亞胺、碳酸酯、硝基芐基、苯甲酰甲基和苯偶姻基團(tuán)的成員。
附著至本文公開的綴合物的示例性部分包括，但不限于，PEG衍生物(例如，烷基-PEG、酰基-PEG、?；?烷基-PEG、烷基-?；?PEG、氨基甲酰基-PEG、芳基-PEG)、PPG衍生物(例如，烷基-PPG、?；?PPG、?；?烷基-PPG、烷基-?；?PPG、氨基甲?；?PPG、芳基-PPG)、治療性部分、診斷性部分、甘露糖-6-磷酸、肝素、乙酰肝素、SLex、甘露糖、甘露糖-6-磷酸、唾液酸基Lewis X、FGF、VFGF、蛋白質(zhì)、軟骨素、角質(zhì)素、皮膚素、白蛋白、整聯(lián)蛋白、觸角寡糖、肽等等。將各種修飾基團(tuán)綴合至糖部分的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易得到的(POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMISTRYBIOTECHNICAL ANDBIOMEDICAL APPLICATIONS，J.Milton Harris，Ed.，Plenum Pub.Corp.，1992；POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMICAL AND BIOLOGICALAPPLICATIONS，J.Milton Harris，Ed.，ACS Symposium Series No.680，American Chemical Society，1997；Hermanson，BIOCONJUGATETECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；和Dunn等人，Eds.POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，ACS SymposiumSeries Vol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991)。
示例性的策略涉及通過使用異雙官能交聯(lián)劑SPDP(n-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基聯(lián)硫基)丙酸酯)來將受保護(hù)的巰基摻入到糖上，然后使巰基去保護(hù)，以與修飾基團(tuán)上的另一巰基形成二硫鍵。
如果SPDP有害地影響經(jīng)修飾的糖作為糖基轉(zhuǎn)移酶底物的能力，那么使用一大批其他交聯(lián)劑之一，例如2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷(2-iminothiolane)或者S-乙?；虼宜酦-琥珀酰亞胺基酯(SATA)以形成二硫鍵。2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷與伯胺反應(yīng)，立即將未受保護(hù)的巰基摻入到含胺的分子上。SATA也與伯胺反應(yīng)，但是摻入受保護(hù)的巰基，其在后來用羥胺進(jìn)行脫乙酰化從而產(chǎn)生游離的巰基。在每種情況中，所摻入的巰基與其他巰基或者受保護(hù)的巰基(像SPDP)自由反應(yīng)，形成所需的二硫鍵。
上述策略是用于本發(fā)明的示例性的而非限制性的接頭。可利用其他交聯(lián)劑，其可在將修飾基團(tuán)與肽交聯(lián)的不同策略中使用。例如，TPCH(S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸酰肼)和TPMPH(S-(2-硫代吡啶基)巰基-丙酰肼)與之前通過溫和的高碘酸鹽處理而氧化的碳水化合物部分反應(yīng)，從而在交聯(lián)劑的酰肼部分和由高碘酸鹽產(chǎn)生的醛之間形成腙鍵。TPCH和TPMPH在糖上引入由2-吡啶基硫酮保護(hù)的巰基，其可以用DTT去保護(hù)，然后用于綴合，例如在組分之間形成二硫鍵。
如果發(fā)現(xiàn)二硫鍵對(duì)于產(chǎn)生穩(wěn)定的經(jīng)修飾的糖是不合適的，那么可以使用在組分之間摻入更穩(wěn)定的鍵的其他交聯(lián)劑。異雙官能交聯(lián)劑GMBS(N-γ-馬來酰亞氨基丁酰氧基)琥珀酰亞胺)和SMCC(琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞氨基-甲基)環(huán)己烷)與伯胺反應(yīng)，從而在該組分上引入馬來酰亞胺基團(tuán)。該馬來酰亞胺基團(tuán)隨后可以與另一組分上的巰基(其可以通過先前所提及的交聯(lián)劑而引入)反應(yīng)，從而在組分之間形成穩(wěn)定的硫醚鍵。如果組分之間的位阻干擾組分的活性或者干擾經(jīng)修飾的糖作為糖基轉(zhuǎn)移酶的能力，那么可以使用這樣的交聯(lián)劑，其在組分之間引入長的間隔臂，并且包括一些先前提及的交聯(lián)劑(例如SPDP)的衍生物。因此，存在大量可用的合適交聯(lián)劑；每一種根據(jù)其對(duì)于最佳的肽綴合物和經(jīng)修飾的糖產(chǎn)生所具有的影響來進(jìn)行選擇。
使用各種試劑，以分子內(nèi)化學(xué)交聯(lián)來修飾經(jīng)修飾的糖的組分(交聯(lián)試劑和交聯(lián)程序的綜述見Wold，F(xiàn).，Meth.Enzymol.25623-651，1972；Weetall，H.H.和Cooney，D.A.，Enzymes as Drugs.(Holcenberg和Roberts，eds.)pp.395-442，Wiley，New York，1981；Ji，T.H.，Meth.Enzymol.91580-609，1983；Mattson等人，Mol.Biol.Rep.17167-183，1993，它們都通過提及而合并入本文)。優(yōu)選的交聯(lián)試劑源自各種零長度的、同雙官能的和異雙官能的交聯(lián)試劑。零長度的交聯(lián)試劑包括直接綴合兩個(gè)固有的化學(xué)基團(tuán)而不引入外來物質(zhì)。催化二硫鍵形成的試劑屬于該類別。另一個(gè)實(shí)例是誘導(dǎo)羧基和伯氨基的縮合從而形成酰胺鍵的試劑，例如碳二亞胺、氯甲酸乙酯、伍德瓦德試劑K(2-乙基-5-苯基異噁唑鎓-3′-磺酸鹽)和羰基二咪唑。除了這些化學(xué)試劑外，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(谷氨?；?肽γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶；EC 2.3.2.13)可以用作零長度的交聯(lián)試劑。該酶在蛋白質(zhì)結(jié)合的谷氨酰胺?；鶜埢聂弱０坊鶊F(tuán)處催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，通常使用伯氨基作為底物。優(yōu)選的同和異雙官能試劑分別含有兩個(gè)相同或兩個(gè)不同的位點(diǎn)，其可以對(duì)于氨基、巰基、胍基、吲哚或非特異性基團(tuán)是反應(yīng)性的。
交聯(lián)試劑中優(yōu)選的特異性位點(diǎn) 1.氨基-反應(yīng)性基團(tuán) 在一個(gè)實(shí)施方案中，交聯(lián)劑上的位點(diǎn)是氨基-反應(yīng)性基團(tuán)。氨基-反應(yīng)性基團(tuán)的可用的非限制性實(shí)例包括N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯、亞氨酸酯、異氰酸酯、酰鹵、芳基疊氮化物、對(duì)硝基苯酯、醛和磺酰氯。
NHS酯優(yōu)先與經(jīng)修飾的糖組分的伯(包括芳香族)氨基反應(yīng)。已知組氨酸的咪唑基團(tuán)與伯胺競爭反應(yīng)，但是反應(yīng)產(chǎn)物是不穩(wěn)定和容易水解的。該反應(yīng)涉及在NHS酯的酸性羧基上胺的親核攻擊，從而形成酰胺，釋放出N-羥基琥珀酰亞胺。因而，失去原始氨基的正電荷。
亞氨酸酯是與經(jīng)修飾的糖組分的胺基團(tuán)反應(yīng)的最特異的酰化試劑。在7至10的pH下，亞氨酸酯僅與伯胺反應(yīng)。伯胺親核攻擊亞氨酸酯從而產(chǎn)生中間體，該中間體在高pH下分解成脒或者在低pH下分解成新的亞氨酸酯。該新的亞氨酸酯可以與另一伯胺反應(yīng)，從而交聯(lián)兩個(gè)氨基，這是被認(rèn)為是單官能的亞氨酸酯進(jìn)行雙官能反應(yīng)的情形。與伯胺反應(yīng)的主要產(chǎn)物是脒，其是比原始的胺更強(qiáng)的堿。因此，保留原始氨基的正電荷。
異氰酸酯(和異硫氰酸酯)與經(jīng)修飾的糖組分的伯胺反應(yīng)，從而形成穩(wěn)定的鍵。它們與巰基、咪唑和酪氨酰基團(tuán)反應(yīng)，從而得到相對(duì)不穩(wěn)定的產(chǎn)物。
酰疊氮也用作氨基-特異性試劑，其中親和組分的親核胺在弱堿性條件例如pH 8.5下攻擊酸性羧基。
芳基鹵例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯優(yōu)先與經(jīng)修飾的糖組分的氨基和酪氨酸酚基反應(yīng)，但是也與巰基和咪唑基團(tuán)反應(yīng)。
單和二羧酸的對(duì)硝基苯酯也是可用的氨基-反應(yīng)性基團(tuán)。盡管試劑特異性不是非常高，但是α-和ε-氨基看起來最快地進(jìn)行反應(yīng)。
醛例如戊二醛與經(jīng)修飾的糖的伯胺反應(yīng)。盡管在氨基與醛反應(yīng)后形成不穩(wěn)定的席夫堿，但是戊二醛能夠以穩(wěn)定的交聯(lián)來修飾經(jīng)修飾的糖。在pH 6-8(典型交聯(lián)條件的pH)下，環(huán)狀聚合物經(jīng)歷脫水，從而形成α-β不飽和醛聚合物。然而，當(dāng)與另一雙鍵共軛時(shí)，席夫堿是穩(wěn)定的。這兩個(gè)雙鍵的共振相互作用阻止了席夫鍵的水解。此外，高局部濃度下的胺可以攻擊該烯屬雙鍵，從而形成穩(wěn)定的邁克爾加成產(chǎn)物。
芳香族磺酰氯與經(jīng)修飾的糖組分的各個(gè)位點(diǎn)反應(yīng)，但是與氨基的反應(yīng)是最主要的，其導(dǎo)致穩(wěn)定的磺酰胺鍵。
2.巰基-反應(yīng)性基團(tuán) 在另一實(shí)施方案中，所述位點(diǎn)是巰基-反應(yīng)性基團(tuán)。巰基-反應(yīng)性基團(tuán)的可用的非限制性實(shí)例包括馬來酰亞胺類、烷基鹵、吡啶基二硫化物類和硫代鄰苯二甲酰亞胺類。
馬來酰亞胺類優(yōu)先與經(jīng)修飾的糖組分的巰基反應(yīng)，從而形成穩(wěn)定的硫醚鍵。它們也可以以低得多的速率與伯胺基和組氨酸的咪唑基團(tuán)反應(yīng)。然而，在pH7下，可以將馬來酰亞胺基團(tuán)認(rèn)為是巰基-特異性基團(tuán)，因?yàn)樵谠損H下，簡單硫醇的反應(yīng)速率是相應(yīng)胺的1000倍。
烷基鹵與巰基、硫化物、咪唑類和氨基反應(yīng)。然而，在中性到弱堿性pH下，烷基鹵主要與巰基反應(yīng)從而形成穩(wěn)定的硫醚鍵。在較高pH下，有利于與氨基的反應(yīng)。
吡啶基二硫化物類通過二硫鍵交換而與游離的巰基反應(yīng)，從而得到混合的二硫化物。因而，吡啶基二硫化物類是最特異的巰基-反應(yīng)性基團(tuán)。
硫代鄰苯二甲酰亞胺類與游離巰基反應(yīng)，從而形成二硫化物。
3.羧基-反應(yīng)性殘基 在另一個(gè)實(shí)施方案中，將溶于水和有機(jī)溶劑中的碳二亞胺用作羧基-反應(yīng)試劑。這些化合物與游離羧基反應(yīng)，從而形成假脲，其然后偶聯(lián)至可用的胺，產(chǎn)生酰胺鍵。教導(dǎo)了如何用碳二亞胺來修飾羧基(Yamada等人，Biochemistry 204836-4842，1981)。
交聯(lián)試劑中優(yōu)選的非特異性位點(diǎn) 除了使用位點(diǎn)特異性反應(yīng)性部分外，本發(fā)明還考慮使用非特異性反應(yīng)性基團(tuán)來將糖連接至修飾基團(tuán)。
示例性的非特異性交聯(lián)劑包括在黑暗中完全惰性的光可活化的基團(tuán)，其在吸收合適能量的光子后轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性種類。在一個(gè)實(shí)施方案中，光可活化的基團(tuán)選自在加熱或光解疊氮化物后產(chǎn)生的氮賓的前體。缺電子的氮賓是極具反應(yīng)性的并且可以與各種化學(xué)鍵反應(yīng)，所述化學(xué)鍵包括N-H、O-H、C-H和C＝C。盡管可以使用三種類型的疊氮化物(芳基、烷基和酰基衍生物)，但是目前為芳基疊氮化物。在光解后芳基疊氮化物與N-H和O-H鍵的反應(yīng)性比與C-H鍵更好。缺電子的芳基氮賓快速環(huán)擴(kuò)張從而形成脫氫氮雜

其傾向于與親核體反應(yīng)，而不是形成C-H插入產(chǎn)物。通過在環(huán)中吸電子取代基例如硝基或羥基的存在可以增加芳基疊氮化物的反應(yīng)性。此類取代基將芳基疊氮化物的最大吸收推向更長的波長。未取代的芳基疊氮化物具有在260-280nm范圍內(nèi)的最大吸收，而羥基和硝基芳基疊氮化物吸收305nm外的大量光。因此，羥基和硝基芳基疊氮化物是最優(yōu)選的，因?yàn)榕c未取代的芳基疊氮化物相比，它們?cè)试S使用對(duì)于親和組分的有害性更低的光解條件。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，光可活化的基團(tuán)選自氟化的芳基疊氮化物。氟化的芳基疊氮化物的光解產(chǎn)物是芳基氮賓，它們都以高效率經(jīng)歷該基團(tuán)的特征性反應(yīng)，包括C-H鍵插入(Keana等人，J.Org.Chem.553640-3647，1990)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，光可活化的基團(tuán)選自二苯酮?dú)埢?。二苯酮試劑通常給出比芳基疊氮化物試劑更高的交聯(lián)產(chǎn)率。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，光可活化的基團(tuán)選自重氮化合物，其在光解后形成缺電子的卡賓。這些卡賓經(jīng)歷各種反應(yīng)，包括插入C-H鍵中、與雙鍵(包括芳香族系統(tǒng))加成、氫吸引和配位到親核中心從而得到碳離子。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，光可活化的基團(tuán)選自重氮基丙酮酸酯。例如，重氮基丙酮酸對(duì)硝基苯酯的對(duì)硝基苯酯與脂肪族胺反應(yīng)，從而得到重氮基丙酮酸酰胺，其經(jīng)歷紫外線光解而形成醛。經(jīng)光解的經(jīng)重氮基丙酮酸酯修飾的親和組分將像甲醛或戊二醛一樣進(jìn)行反應(yīng)，從而形成交聯(lián)。
同雙官能試劑 1.與伯胺具有反應(yīng)性的同雙官能交聯(lián)劑 胺-反應(yīng)性交聯(lián)劑的合成、性質(zhì)和應(yīng)用在文獻(xiàn)中作了商業(yè)上的描述(交聯(lián)程序和試劑的綜述見上文)。許多試劑是可得的(例如，PierceChemical Company，Rockford，Ill.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR.)。
同雙官能NHS酯的優(yōu)選的非限制性實(shí)例包括戊二酸二琥珀酰亞胺基酯(DSG)、辛二酸二琥珀酰亞胺基酯(DSS)、辛二酸二(磺基琥珀酰亞胺基)酯(BS)、酒石酸二琥珀酰亞胺基酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亞胺基酯(sulfo-DST)、二-2-(琥珀酰亞氨基氧基羰基氧基)乙基砜(BSOCOES)、二-2-(磺基琥珀酰亞氨基氧基羰基氧基)乙基砜(sulfo-BSOCOES)、二(琥珀酰亞胺基琥珀酸)乙二醇酯(EGS)、二(磺基琥珀酰亞胺基琥珀酸)乙二醇酯(sulfo-EGS)、聯(lián)硫基雙(琥珀酰亞胺基丙酸酯(DSP)和聯(lián)硫基雙(磺基琥珀酰亞胺基丙酸酯(sulfo-DSP)。同雙官能亞氨酸酯的優(yōu)選的非限制性實(shí)例包括丙二酰亞氨酸二甲酯(DMM)、琥珀酰亞氨酸二甲酯(DMSC)、己二酰亞氨酸二甲酯(DMA)、庚二酰亞氨酸二甲酯(DMP)、辛二酰亞氨酸二甲酯(DMS)、3，3′-氧聯(lián)二丙酰亞氨酸二甲酯(DODP)、3，3′-(亞甲基二氧基)二丙酰亞氨酸二甲酯(DMDP)、3，3′-(二亞甲基二氧基)二丙酰亞氨酸二甲酯(DDDP)、3，3′-(四亞甲基二氧基)二丙酰亞氨酸二甲酯(DTDP)和3，3′-聯(lián)硫基二丙酰亞氨酸二甲酯(DTBP)。
同雙官能異硫氰酸酯的優(yōu)選的非限制性實(shí)例包括對(duì)苯撐二異硫氰酸酯(DITC)，和4，4′-二異硫氰基-2，2′-二磺酸茋(DIDS)。
同雙官能異氰酸酯的優(yōu)選的非限制性實(shí)例包括二甲苯-二異氰酸酯、甲苯-2，4-二異氰酸酯、甲苯-2-異氰酸酯-4-異硫氰酸酯、3-甲氧基二苯基甲烷-4，4′-二異氰酸酯、2，2′-二羧基-4，4′-偶氮苯基二異氰酸酯和六亞甲基二異氰酸酯。
同雙官能芳基鹵的優(yōu)選的非限制性實(shí)例包括1，5-二氟-2，4-二硝基苯(DFDNB)和4，4′-二氟-3，3′-二硝基苯基-砜。
同雙官能脂肪族醛試劑的優(yōu)選的非限制性實(shí)例包括乙二醛、丙二醛和戊二醛。
同雙官能酰化試劑的優(yōu)選的非限制性實(shí)例包括二羧酸的硝基苯酯。
同雙官能芳香族磺酰氯的優(yōu)選的非限制性實(shí)例包括苯酚-2，4-二磺酰氯和α-萘酚-2，4-二磺酰氯。
另外的氨基-反應(yīng)性同雙官能試劑的優(yōu)選的非限制性實(shí)例包括赤蘚醇二碳酸酯，其與胺反應(yīng)而生成雙氨基甲酸酯。
2.與游離的巰基具有反應(yīng)性的同雙官能交聯(lián)劑 此類試劑的合成、性質(zhì)和應(yīng)用描述于文獻(xiàn)中(交聯(lián)程序和試劑的綜述見上文)。這些試劑中的許多是通過商業(yè)途徑可獲得的(例如，Pierce Chemical Company，Rockford，Ill.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。
同雙官能馬來酰亞胺類的優(yōu)選的非限制性實(shí)例包括雙馬來酰亞氨基己烷(BMH)、N，N′-(1，3-亞苯基)雙馬來酰亞胺、N，N′-(1，2-亞苯基)雙馬來酰亞胺、偶氮苯基二馬來酰亞胺和二(N-馬來酰亞氨基甲基)醚。
同雙官能吡啶基二硫化物類的優(yōu)選的非限制性實(shí)例包括1，4-二-3′-(2′-吡啶基聯(lián)硫基)丙酰氨基丁烷(DPDPB)。
同雙官能烷基鹵的優(yōu)選的非限制性實(shí)例包括2，2′-二羧基-4，4′-二碘代乙酰氨基偶氮苯、α，α′-二碘代-對(duì)二甲苯磺酸、α，α′-二溴代-對(duì)二甲苯磺酸、N，N′-二(b-溴乙基)芐胺、N，N′-二(溴代乙酰基)苯肼和1，2-二(溴代乙酰基)氨基-3-苯基丙烷。
3.同雙官能光可活化的交聯(lián)劑 此類試劑的合成、性質(zhì)和應(yīng)用描述于文獻(xiàn)中(交聯(lián)程序和試劑的綜述見上文)。這些試劑中的一些是通過商業(yè)途徑可獲得的(例如，Pierce Chemical Company，Rockford，Ill.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。
同雙官能光可活化的交聯(lián)劑的優(yōu)選的非限制性實(shí)例包括二-β-(4-疊氮基水楊酰氨基)乙基二硫化物(BASED)、二-N-(2-硝基-4-疊氮基苯基)-胱胺-S，S-二氧化物(DNCO)和4，4′-聯(lián)硫基二苯基疊氮化物。
異雙官能試劑 1.具有吡啶基二硫化物部分的氨基-反應(yīng)性異雙官能試劑 此類試劑的合成、性質(zhì)和應(yīng)用描述于文獻(xiàn)中(交聯(lián)程序和試劑的綜述見上文)。這些試劑中的許多是通過商業(yè)途徑可獲得的(例如，Pierce Chemical Company，Rockford，Ill.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。
具有吡啶基二硫化物部分和氨基-反應(yīng)性NHS酯的異雙官能試劑的優(yōu)選的非限制性實(shí)例包括N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基聯(lián)硫基)丙酸酯(SPDP)、6-3-(2-吡啶基聯(lián)硫基)丙酰氨基己酸琥珀酰亞胺基酯(LC-SPDP)、6-3-(2-吡啶基聯(lián)硫基)丙酰氨基己酸磺基琥珀酰亞胺基酯(sulfo-LCSPDP)、4-琥珀酰亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基聯(lián)硫基)甲苯(SMPT)和6-α-甲基-α-(2-吡啶基聯(lián)硫基)甲苯甲酰氨基己酸磺基琥珀酰亞胺基酯(sulfo-LC-SMPT)。
2.具有馬來酰亞胺部分的氨基-反應(yīng)性異雙官能試劑 此類試劑的合成、性質(zhì)和應(yīng)用描述于文獻(xiàn)中。具有馬來酰亞胺部分和氨基-反應(yīng)性NHS酯的異雙官能試劑的優(yōu)選的非限制性實(shí)例包括馬來酰亞胺基乙酸琥珀酰亞胺基酯(AMAS)、3-馬來酰亞胺基丙酸琥珀酰亞胺基酯(BMPS)、N-γ-馬來酰亞氨基丁酰氧基琥珀酰亞胺酯(GMBS)、N-γ-馬來酰亞氨基丁酰氧基磺基琥珀酰亞胺酯(sulfo-GMBS)、6-馬來酰亞胺基己酸琥珀酰亞胺基酯(EMCS)、3-馬來酰亞胺基苯甲酸琥珀酰亞胺基酯(SMB)、間-馬來酰亞氨基苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)、間-馬來酰亞氨基苯甲酰基-N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯(sulfo-MBS)、4-(N-馬來酰亞氨基甲基)-環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺基酯(SMCC)、4-(N-馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亞胺基酯(sulfo-SMCC)、4-(對(duì)-馬來酰亞氨基苯基)丁酸琥珀酰亞胺基酯(SMPB)和4-(對(duì)-馬來酰亞氨基苯基)丁酸磺基琥珀酰亞胺基酯(sulfo-SMPB)。
3.具有烷基鹵部分的氨基-反應(yīng)性異雙官能試劑 此類試劑的合成、性質(zhì)和應(yīng)用描述于文獻(xiàn)中。具有烷基鹵部分和氨基-反應(yīng)性NHS酯的異雙官能試劑的優(yōu)選的非限制性實(shí)例包括N-琥珀酰亞胺基-(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、磺基琥珀酰亞胺基-(4-碘代乙?；?氨基苯甲酸酯(sulfo-SIAB)、琥珀酰亞胺基-6-(碘代乙?；?氨基己酸酯(SIAX)、琥珀酰亞胺基-6-(6-((碘代乙酰基)-氨基)己?；被?己酸酯(SIAXX)、琥珀酰亞胺基-6-(((4-(碘代乙?；?-氨基)-甲基)-環(huán)己烷-1-羰基)氨基己酸酯(SIACX)和琥珀酰亞胺基-4((碘代乙酰基)-氨基)甲基環(huán)己烷-1-羧酸酯(SIAC)。
具有氨基-反應(yīng)性NHS酯和烷基二鹵部分的異雙官能試劑的一個(gè)實(shí)例是2，3-二溴代丙酸N-羥基琥珀酰亞胺基酯(SDBP)。SDBP通過綴合其氨基而向親和組分中引入分子內(nèi)交聯(lián)。而二溴代丙?；糠謱?duì)伯胺基的反應(yīng)性通過反應(yīng)溫度來控制(McKenzie等人，Protein Chem.7581-592(1988))。
具有烷基鹵部分和氨基-反應(yīng)性對(duì)硝基苯酯部分的優(yōu)選的非限制性實(shí)例包括碘代乙酸對(duì)硝基苯酯(NPIA)。
其他交聯(lián)劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見例如，Pomato等人，美國專利號(hào)5,965,106。為具體反應(yīng)選擇合適的交聯(lián)劑在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。
可切割的接頭基團(tuán) 在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，為接頭基團(tuán)提供可以被切割從而從糖殘基釋放出修飾基團(tuán)的基團(tuán)。許多可切割的基團(tuán)是本領(lǐng)域已知的。參見例如，Jung等人，Biochem.Biophys.Acta 761152-162(1983)；Joshi等人，J.Biol.Chem.26514518-14525(1990)；Zarling等人，J.Immunol.124913-920(1980)；Bouizar等人，Eur.J.Biochem.155141-147(1986)；Park等人，J.Biol.Chem.261205-210(1986)；Browning等人，J.Immunol.1431859-1867(1989)。此外，寬范圍的可切割的雙官能(同和異雙官能)接頭基團(tuán)可以通過商業(yè)途徑從供應(yīng)商例如Pierce獲得。
用光、熱或者試劑例如硫醇、羥胺、堿、高碘酸鹽等等可以切割示例性的可切割部分。此外，作為對(duì)于被胞吞而作出的應(yīng)答，某些優(yōu)選的基團(tuán)在體內(nèi)被切割(例如，順烏頭酰基；參見，Shen等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1021048(1991))。優(yōu)選的可切割基團(tuán)包括可切割的部分，其是選自二硫化物、酯、酰亞胺、碳酸酯、硝基芐基、苯甲酰甲基和苯偶姻基團(tuán)的成員。
根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案包括
和這些種類的碳酸酯和活性酯，例如
本發(fā)明的示例性綴合物 在示例性的實(shí)施方案中，所述多肽是干擾素。干擾素是抗病毒糖蛋白，其在人類中在用病毒或雙鏈RNA誘導(dǎo)后由人初級(jí)成纖維細(xì)胞分泌。有益的是，干擾素作為治療劑，例如抗病毒劑(例如，乙型和丙型肝炎)、抗腫瘤劑(例如，肝細(xì)胞癌)，和用于治療多發(fā)性硬化。關(guān)于與干擾素-α相關(guān)的參考文獻(xiàn)，參見Asano等人，Eur.J.Cancer，27(Suppl 4)S21-S25(1991)；Nagy等人，Anticancer Research，8(3)467-470(1988)；Dron等人，J.Biol.Regul.Homeost.Agents，3(1)13-19(1989)；Habib等人，Am.Surg.，67(3)257-260(3/2001)；和Sugyiama等人，Eur.J.Biochem.，217921-927(1993)。討論干擾素-β的參考文獻(xiàn)，參見例如，Yu等人，J.Neuroimmunol.，64(1)91-100(1996)；Schmidt，J.，J.Neurosci.Res.，65(1)59-67(2001)；Wender等人，F(xiàn)olia Neuropathol.，39(2)91-93(2001)；Martin等人，SpringerSemin.Immunopathol.，18(1)1-24(1996)；Takane等人，J.Pharmacol.Exp.Ther，294(2)746-752(2000)；Sburlati等人，Biotechnol.Prog.，14189-192(1998)；Dodd等人，Biochimica et Biophysica Acta，787183-187(1984)；Edelbaum等人，J.Interferon Res.，12449-453(1992)；Conradt等人，J.Biol.Chem.，262(30)14600-14605(1987)；Civas等人，Eur.J.Biochem.，173311-316(1988)；Demolder等人，J.Biotechnol.，32179-189(1994)；Sedmak等人，J.Interferon Res.，9(Suppl 1)S61-S65(1989)；Kagawa等人，J.Biol.Chem.，263(33)17508-17515(1988)；Hershenson等人，美國專利號(hào)4,894,330；Jayaram等人，J.Interferon Res.，3(2)177-180(1983)；Menge等人，Develop.Biol.Standard.，66391-401(1987)；Vonk等人，J.InterferonRes.，3(2)169-175(1983)；和Adolf等人，J.Interferon Res.，10255-267(1990)。
在示例性的干擾素綴合物中，將干擾素α，例如干擾素α2b和2a，通過完整的糖基接頭綴合至水溶性聚合物。
在進(jìn)一步的示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)的綴合物。G-CSF是刺激中性白細(xì)胞生成性祖細(xì)胞增殖、分化和激活成功能上成熟的嗜中性粒細(xì)胞的糖蛋白。注射的G-CSF從身體中快速清除。參見例如，Nohynek等人，CancerChemother.Pharmacol.，39259-266(1997)；Lord等人，Clinical CancerResearch，7(7)2085-2090(07/2001)；Rotondaro等人，MolecularBiotechnology，11(2)117-128(1999)；和

等人，Bone MarrowTransplantation，28259-264(2001)。
本發(fā)明包括用于修飾GM-CSF的方法。GM-CSF在本領(lǐng)域公知為由激活的T-細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。GM-CSF主要作用于骨髓從而增加炎性白細(xì)胞的產(chǎn)生，并進(jìn)一步作為內(nèi)分泌激素以起始在炎癥功能期間消耗的嗜中性粒細(xì)胞的補(bǔ)充。此外，GM-CSF是巨噬細(xì)胞激活因子并且促進(jìn)朗格漢斯細(xì)胞分化成樹突細(xì)胞。像G-CSF一樣，GM-CSF也在化療后的骨髓更換中具有臨床應(yīng)用。
核酸 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的非天然存在的多肽的分離的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸是表達(dá)載體的一部分。在另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的核酸的細(xì)胞。示例性的細(xì)胞包括宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌的各種菌株、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如CHO細(xì)胞。
藥物組合物 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含至少一種本發(fā)明的多肽或多肽綴合物和可藥用載體。在示例性的實(shí)施方案中，該藥物組合物包含水溶性聚合物(例如，非天然存在的水溶性聚合物)和本發(fā)明的糖基化或非糖基化的多肽之間的共價(jià)綴合物，以及可藥用載體。示例性的水溶性聚合物包括聚(乙二醇)和甲氧基-聚(乙二醇)。備選地，將多肽綴合至除聚(乙二醇)衍生物之外的其他修飾基團(tuán)，例如治療性部分或生物分子。
本發(fā)明的多肽綴合物具有寬范圍的藥物學(xué)應(yīng)用。例如，糖綴合的促紅細(xì)胞生成素(EPO)可用于治療全身性貧血、再生障礙性貧血、化學(xué)誘導(dǎo)的損傷(例如骨髓損傷)、慢性腎衰竭、腎炎和地中海貧血。經(jīng)修飾的EPO可以進(jìn)一步用于治療神經(jīng)病學(xué)病癥，例如腦/脊柱損傷、多發(fā)性硬化和阿爾茨海默病。
第二個(gè)實(shí)例是干擾素-α(IFN-α)，其可以用于治療AIDS和乙型或丙型肝炎，由各種病毒例如人乳頭瘤病毒(HBV)、冠狀病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、單純皰疹病毒(HSV)和水痘帶狀皰疹病毒(VZV)引起的病毒感染，癌癥例如多毛細(xì)胞白血病、AIDS相關(guān)的卡波西肉瘤、惡性黑素瘤、濾泡型非霍奇金淋巴瘤、費(fèi)城染色體(Ph)-陽性、慢性期髓性白血病(CML)、腎癌、骨髓瘤、慢性髓性白血病、頭和頸癌、骨癌，以及宮頸上皮結(jié)構(gòu)不良和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的病癥例如多發(fā)性硬化。此外，根據(jù)本發(fā)明方法進(jìn)行修飾的IFN-α可用于治療各種各樣的其他疾病和病狀，例如舍格倫綜合征(自身免疫疾病)、貝赫切特病(自身免疫炎性疾病)、纖維肌痛(骨骼肌疼痛/疲勞病癥)、口瘡性潰瘍(復(fù)發(fā)性口潰瘍)、慢性疲勞綜合征和肺纖維化。
另一個(gè)實(shí)例是干擾素-β，其可用于治療CNS病癥，例如多發(fā)性硬化(復(fù)發(fā)性/弛張性的或者慢性進(jìn)行性的)，AIDS和乙型或丙型肝炎，由各種病毒例如人乳頭瘤病毒(HBV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、單純皰疹病毒(HSV)和水痘帶狀皰疹病毒(VZV)引起的病毒感染，耳科感染，骨骼肌感染，以及癌癥，包括乳腺癌、腦癌、結(jié)腸直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、頭和頸癌、基底細(xì)胞癌、宮頸上皮結(jié)構(gòu)不良、黑素瘤、皮膚癌和肝癌。根據(jù)本發(fā)明方法進(jìn)行修飾的IFN-β還可用于治療其他疾病和病狀，例如移植排斥(例如骨髓移植)、亨廷頓舞蹈病、結(jié)腸炎、腦炎癥、肺纖維化、黃斑變性、肝硬化和角膜結(jié)膜炎。
粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)是另一個(gè)實(shí)例。根據(jù)本發(fā)明方法進(jìn)行修飾的G-CSF可以在用于治療癌癥的化療中用作輔助劑，和用于預(yù)防或減輕與某些醫(yī)學(xué)操作程序相關(guān)的病狀或并發(fā)癥，例如化學(xué)誘導(dǎo)的骨髓損傷；白細(xì)胞減少(全身性)；化學(xué)誘導(dǎo)的熱性中性白細(xì)胞減少；與骨髓移植相關(guān)的中性白細(xì)胞減少；和嚴(yán)重的慢性中性白細(xì)胞減少。經(jīng)修飾的G-CSF還可以用于移植；外周血細(xì)胞活動(dòng)化；使外周血祖細(xì)胞活動(dòng)化以收集在將接受重度骨髓抑制性或骨髓抑制性化療的患者中；以及減少中性白細(xì)胞減少、發(fā)熱、抗生素使用、在急性粒細(xì)胞白血病(AML)的誘導(dǎo)/鞏固治療后住院的持續(xù)時(shí)間?？梢杂媒?jīng)修飾的G-CSF治療的其他病狀或病癥包括哮喘和過敏性鼻炎。
作為一個(gè)另外的實(shí)例，根據(jù)本發(fā)明方法進(jìn)行修飾的人生長激素(hGH)可用于治療生長相關(guān)的病狀，例如侏儒癥、兒童和成人中的身材矮小癥、惡病質(zhì)/肌肉萎縮(muscle wasting)、全身性肌萎縮和性染色體異常(例如，特納綜合征)?？梢允褂媒?jīng)修飾的hGH來治療的其他病狀包括短腸綜合征、脂肪營養(yǎng)不良、骨質(zhì)疏松癥、尿毒癥、燒傷、女性不孕癥、骨再生、全身性糖尿病、II型糖尿病、骨關(guān)節(jié)炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和失眠癥。此外，經(jīng)修飾的hGH還可以用于促進(jìn)各種過程，例如一般性組織再生、骨再生和傷口愈合，或者用作疫苗輔助劑。
本發(fā)明的藥物組合物適合于在各種藥物遞送系統(tǒng)中使用。用于本發(fā)明的合適的制劑可在Remington′s Pharmaceutical Sciences，MacePublishing Company，Philadelphia，PA，第17版(1985)中找到。藥物遞送方法的簡要綜述可參見Langer，Science 2491527-1533(1990)。
可以配制藥物組合物以用于任何合適方式的施用，包括例如，局部、口服、鼻、靜脈內(nèi)、顱內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或肌內(nèi)施用。對(duì)于腸胃外施用，例如皮下注射，載體優(yōu)選包括水、鹽水、醇、脂肪、蠟或緩沖劑。對(duì)于口服施用，可以使用任一種上述載體或固體載體，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂。生物可降解的基質(zhì)，例如微球(例如聚乳酸酯、聚乙醇酸酯)，可以用作本發(fā)明藥物組合物的載體。合適的生物可降解的微球例如公開于美國專利號(hào)4,897,268和5,075,109中。
通常，皮下或腸胃外例如靜脈內(nèi)施用藥物組合物。因而，本發(fā)明提供了用于腸胃外施用的組合物，其包含溶解或懸浮在可接受的載體，優(yōu)選水性載體(例如，水、經(jīng)緩沖的水、鹽水、PBS等等)中的化合物。所述組合物還可以含有去污劑，例如Tween 20和Tween 80；穩(wěn)定劑，例如甘露醇、山梨糖醇、蔗糖和海藻糖；和防腐劑，例如EDTA和間甲酚。所述組合物可以含有為了接近生理?xiàng)l件而所需的可藥用輔助物質(zhì)，例如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張度調(diào)節(jié)劑、潤濕劑、去污劑，等等。
這些組合物可以通過常規(guī)滅菌技術(shù)來進(jìn)行滅菌，或者可以過濾除菌。所得的水溶液可以進(jìn)行包裝以就這樣使用，或者進(jìn)行凍干，并在施用前將凍干制劑與無菌水性載體相組合。制劑的pH通常為3至11，更優(yōu)選5至9，和最優(yōu)選7至8。
在一些實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明的糖肽摻入到從標(biāo)準(zhǔn)的形成小泡的脂質(zhì)形成的脂質(zhì)體中。各種方法可用于制備脂質(zhì)體，如Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)，美國專利號(hào)4,235,871、4,501,728和4,837,028中所描述的。使用各種靶向性試劑(例如，本發(fā)明的唾液酸基半乳糖苷)來對(duì)脂質(zhì)體實(shí)施靶向是本領(lǐng)域公知的(參見例如，美國專利號(hào)4,957,773和4,603,044)。
可以使用用于將靶向性試劑偶聯(lián)至脂質(zhì)體的標(biāo)準(zhǔn)方法。這些方法通常涉及向脂質(zhì)體中摻入脂質(zhì)組分，例如磷脂酰乙醇胺，其可以被活化以用于附著靶向性試劑，或者摻入衍生化的親脂性化合物，例如本發(fā)明的用脂質(zhì)衍生化的糖肽。
靶向機(jī)制通常要求，靶向性試劑以這樣的方式位于脂質(zhì)體的表面上，從而使得靶向部分可用于與靶標(biāo)例如細(xì)胞表面受體相互作用。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，在形成脂質(zhì)體之前將本發(fā)明的碳水化合物附著至脂質(zhì)分子(例如，分別用長鏈烷基鹵或脂肪酸對(duì)存在于碳水化合物上的羥基進(jìn)行烷基化或?；?。備選地，脂質(zhì)體可以這樣進(jìn)行制備形成膜時(shí)首先將銜接體部分摻入膜中。所述銜接體部分必須具有親脂性部分，其牢固地包埋并錨定在膜中。它必須還具有反應(yīng)性部分，其在脂質(zhì)體的水性表面上是化學(xué)上可用的。如此選擇反應(yīng)性部分，從而使得它在化學(xué)上適合于與后來添加的靶向性試劑或碳水化合物形成穩(wěn)定的化學(xué)鍵。在一些情況下，可能將靶向性試劑直接附著至銜接體分子，但是在大多數(shù)情況下，更合適的是使用第三種分子作為化學(xué)橋，從而將在膜中的銜接體分子與從小泡表面上三維地伸出的靶向性試劑或碳水化合物相連接。
通過本發(fā)明方法制備的化合物還可以用作診斷試劑。例如，經(jīng)標(biāo)記的化合物可以用于在被懷疑患有炎癥的患者中定位炎癥或腫瘤轉(zhuǎn)移區(qū)域。對(duì)應(yīng)該用途，化合物可以用125I、14C或氚進(jìn)行標(biāo)記。
V.方法 鑒定作為糖基轉(zhuǎn)移酶的底物的突變型多肽 用于鑒定當(dāng)進(jìn)行糖基化反應(yīng)時(shí)以令人滿意的產(chǎn)率被糖基化的突變型多肽的一種策略是制備非天然存在的(即突變型)多肽的文庫，其中每個(gè)突變型多肽包含至少一個(gè)本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列，并就其用作糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，GlcNAc轉(zhuǎn)移酶)的有效底物的能力來測(cè)試每個(gè)突變型多肽。通過經(jīng)突變?cè)谟H本多肽的氨基酸序列內(nèi)的不同位置處產(chǎn)生所選的本發(fā)明O-聯(lián)糖基化序列，可以產(chǎn)生突變型多肽文庫。
突變型多肽文庫 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生突變型多肽文庫的方法，其中突變型多肽衍生自野生型或親本多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，親本多肽具有包含m個(gè)氨基酸的氨基酸序列。氨基酸序列內(nèi)的每個(gè)氨基酸位置由(AA)n表示，其中n是選自1至m的成員。產(chǎn)生突變型多肽文庫的示例性方法包括下列步驟(i)通過在親本多肽內(nèi)的第一個(gè)氨基酸位置(AA)n處引入本發(fā)明的突變型O-聯(lián)糖基化序列而產(chǎn)生突變型多肽；(ii)通過以所希望的次數(shù)重復(fù)步驟(i)而產(chǎn)生至少一種額外的突變型多肽，其中在第二個(gè)氨基酸位置處引入相同的突變型O-聯(lián)糖基化序列，該第二個(gè)氨基酸位置選自(AA)n+x和(AA)n-x的成員，其中x是選自1至(m-n)的成員。該方法的實(shí)施方案在上文中作了描述。在示例性的實(shí)施方案中，通過“序列肽段掃描”來產(chǎn)生突變型多肽文庫。
先導(dǎo)多肽的鑒定 在產(chǎn)生了突變型多肽文庫后，可能希望在文庫成員中選擇出這樣的突變體，所述多肽當(dāng)進(jìn)行酶促糖基化和/或糖PEG化反應(yīng)時(shí)被有效地糖基化和/或糖PEG化。將被發(fā)現(xiàn)被有效地糖基化和/或糖PEG化的突變型多肽稱作“先導(dǎo)多肽”。在示例性的實(shí)施方案中，酶促糖基化或糖PEG化反應(yīng)的產(chǎn)率用于選擇一種或多種先導(dǎo)多肽。在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，先導(dǎo)多肽的酶促糖基化或糖PEG化產(chǎn)率為約10％至約100％，優(yōu)選約30％至約100％，更優(yōu)選約50％至約100％，和最優(yōu)選約70％至約100％。任選地，通過使經(jīng)糖基化的先導(dǎo)多肽進(jìn)行另一酶促糖基化或糖PEG化反應(yīng)來進(jìn)一步評(píng)估可被有效地糖基化的先導(dǎo)多肽。
因此，本發(fā)明提供了用于鑒定先導(dǎo)多肽的方法。示例性的方法包括下列步驟(i)產(chǎn)生本發(fā)明的突變型多肽文庫(例如，根據(jù)本發(fā)明的方法)；(ii)使所述文庫的至少一個(gè)成員進(jìn)行酶促糖基化反應(yīng)(或任選地，酶促糖PEG化反應(yīng))，從而將糖基部分從糖基供體分子轉(zhuǎn)移到所述突變型O-聯(lián)糖基化序列中的至少一個(gè)上，其中所述糖基部分任選地用修飾基團(tuán)進(jìn)行衍生化；和(iii)對(duì)于文庫的至少一個(gè)成員，測(cè)量酶促糖基化或糖PEG化反應(yīng)的產(chǎn)率。
被轉(zhuǎn)移的糖基部分可以是任何糖基部分，包括單糖和寡糖以及糖基模擬基團(tuán)。在示例性的實(shí)施方案中，在最初的糖基化反應(yīng)中被添加至突變型多肽的糖基部分是GalNAc部分?？梢允褂煤罄^的糖基化反應(yīng)以向所得的GalNAc-多肽添加額外的糖基殘基(例如，Gal)。修飾基團(tuán)可以是本發(fā)明的任何修飾基團(tuán)，包括水溶性聚合物，例如mPEG。
用于產(chǎn)生突變型多肽(包括任何先導(dǎo)多肽)的方法是本領(lǐng)域已知的。示例性的方法描述在本文中。該方法可以包括一個(gè)或多個(gè)下列步驟(iv)產(chǎn)生包含對(duì)應(yīng)于突變型多肽的核酸序列的表達(dá)載體；(v)用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；(vi)在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述突變型多肽；和(vii)分離所述突變型多肽。目的突變型多肽(例如，所選的先導(dǎo)多肽)可以以工業(yè)規(guī)模進(jìn)行表達(dá)(例如，導(dǎo)致分離出超過250mg，優(yōu)選超過500mg的蛋白質(zhì))。
在示例性的實(shí)施方案中，使突變型多肽文庫的每個(gè)成員進(jìn)行酶促糖基化反應(yīng)。例如，每種突變型多肽分開地進(jìn)行糖基化反應(yīng)，并且對(duì)于一種或多種所選的反應(yīng)條件，測(cè)定糖基化反應(yīng)的產(chǎn)率。
在示例性的實(shí)施方案中，在進(jìn)一步的加工例如糖基化和/或糖PEG化之前，純化文庫的一種或多種突變型多肽。
在另一個(gè)實(shí)例中，可以合并幾組突變型多肽，并使所得的突變型多肽混合物進(jìn)行糖基化或糖PEG化反應(yīng)。在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，使含有文庫的所有成員的混合物進(jìn)行糖基化反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)該實(shí)施方案，可以以少于化學(xué)計(jì)算量的量(相對(duì)于存在的糖基化位點(diǎn))將糖基供體試劑添加入糖基化反應(yīng)混合物中，從而產(chǎn)生其中突變型多肽競爭作為酶的底物的環(huán)境。然后，可以例如通過質(zhì)譜分析來鑒定作為酶的底物的那些突變型多肽，事先進(jìn)行或不進(jìn)行經(jīng)糖基化的混合物的分離或純化。該相同方法可以用于這樣的一組突變型多肽，其中每個(gè)突變型多肽含有不同的本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列。
可用于就其用作GlcNAc轉(zhuǎn)移酶的底物的能力來篩選多肽的示例性測(cè)定法描述于T.M.Leavy和C.R.Bertozzi，Bioorg.Med.Chem.Lett.2007，173851-3854中，該文獻(xiàn)通過提及而以其整體合并入本文以用于所有目的?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何合適的方法來測(cè)定酶促糖基化反應(yīng)產(chǎn)率。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用質(zhì)譜法(例如，MALDI-TOF)或凝膠電泳來區(qū)分經(jīng)糖基化的多肽和未反應(yīng)的(例如，非糖基化的)多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用HPLC來測(cè)定糖基化的程度。為此目的，也可以使用核磁共振技術(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用多孔平板(例如，96-孔平板)來平行地進(jìn)行許多糖基化反應(yīng)。該平板可以任選地在每個(gè)孔的底部裝備分離或過濾介質(zhì)(例如，凝膠過濾膜)。在通過質(zhì)譜法或其他方法進(jìn)行分析之前，可以使用旋轉(zhuǎn)來預(yù)處理每個(gè)樣品。
宿主細(xì)胞內(nèi)的糖基化 作為本發(fā)明突變型多肽的一部分的突變型O-聯(lián)糖基化序列的最初的糖基化也可以在其中表達(dá)所述多肽的宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)生。該技術(shù)例如描述在于2006年9月6日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/842,926中，其通過提及而以其整體合并入本文。宿主細(xì)胞可以是原核微生物，例如大腸桿菌或假單胞菌菌株。在示例性的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是trxB gor supp突變型大腸桿菌細(xì)胞。
在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，通過下列方式來完成細(xì)胞內(nèi)糖基化在宿主細(xì)胞中共表達(dá)所述多肽和“活性核苷酸糖多肽糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白”(例如，可溶的活性真核生物N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶)，并且在允許糖部分在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移至糖基化序列的條件下使所述宿主細(xì)胞進(jìn)行生長。在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，其中表達(dá)突變型多肽的微生物具有細(xì)胞內(nèi)氧化環(huán)境。所述微生物可以被遺傳修飾，從而具有細(xì)胞內(nèi)氧化環(huán)境。細(xì)胞內(nèi)糖基化不限于轉(zhuǎn)移單個(gè)糖基殘基。可以通過共表達(dá)所需的酶和存在各自的糖基供體，而順次添加幾個(gè)糖基殘基。該方法也可以用于以商業(yè)規(guī)模產(chǎn)生突變型多肽。
用于確定突變型多肽是否在宿主細(xì)胞中在突變型O-聯(lián)糖基化序列內(nèi)被有效地糖基化的方法是可得的。例如，通過質(zhì)譜法來分析細(xì)胞裂解物(在一個(gè)或多個(gè)純化步驟后)，以測(cè)量糖基化的和非糖基化的突變型多肽之間的比例。在另一個(gè)實(shí)例中，通過凝膠電泳來分析細(xì)胞裂解物，從而將糖基化的肽與非糖基化的肽分開。
先導(dǎo)多肽的進(jìn)一步評(píng)估 在其中最初的篩選程序涉及使用未修飾的糖基部分來進(jìn)行酶促糖基化(例如，通過GalNAc-T2來轉(zhuǎn)移GalNAc部分)的一個(gè)實(shí)施方案中，可以就其作為有效底物的能力來進(jìn)一步評(píng)估所選的先導(dǎo)多肽，以用于例如通過另一酶促反應(yīng)或化學(xué)修飾來進(jìn)行進(jìn)一步的修飾。在示例性的實(shí)施方案中，隨后的“篩選”涉及使經(jīng)糖基化的先導(dǎo)多肽進(jìn)行另一糖基化(例如，添加Gal)和/或PEG化反應(yīng)。
PEG化反應(yīng)可以例如是化學(xué)PEG化反應(yīng)或酶促糖PEG化反應(yīng)。為了鑒定被有效地糖PEG化的先導(dǎo)多肽，使至少一種先導(dǎo)多肽(任選地事先經(jīng)糖基化)進(jìn)行PEG化反應(yīng)并測(cè)定該反應(yīng)的產(chǎn)率。在一個(gè)實(shí)例中，測(cè)定每種先導(dǎo)多肽的PEG化產(chǎn)率。在示例性的實(shí)施方案中，PEG化反應(yīng)的產(chǎn)率為約10％至約100％，優(yōu)選約30％至約100％，更優(yōu)選約50％至約100％，和最優(yōu)選約70％至約100％?？梢允褂眠m合于多肽分析的本領(lǐng)域已知的任何分析方法來測(cè)定PEG化產(chǎn)率，所述分析方法例如為質(zhì)譜法(例如，MALDI-TOF、Q-TOF)、凝膠電泳(例如，與用于定量的方法例如光密度測(cè)定法相組合)、NMR技術(shù)以及色譜方法，例如HPLC(使用可用于分開所分析的多肽的PEG化和非PEG化的種類的合適柱材料)。如上面關(guān)于糖基化所描述的，可以使用多孔平板(例如，96-孔平板)來平行地進(jìn)行許多PEG化反應(yīng)。該平板可以任選地在每個(gè)孔的底部裝備分離或過濾介質(zhì)(例如，凝膠過濾膜)。在通過質(zhì)譜法或其他方法進(jìn)行分析之前，可以使用旋轉(zhuǎn)和重構(gòu)來預(yù)處理每個(gè)樣品。
在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，在下述的“單罐反應(yīng)”中發(fā)生突變型多肽的糖基化和糖PEG化。在一個(gè)實(shí)例中，將突變型多肽與第一種酶(例如，GalNAc-T2)和合適的供體分子(例如，UDP-GalNAc)接觸。將該混合物溫育合適的時(shí)間，隨后加入第二種酶(例如，Core-1-GalT1)和第二種糖基供體(例如，UDP-Gal)?？梢砸栽摲绞竭M(jìn)行任何次數(shù)的額外的糖基化/糖PEG化反應(yīng)。備選地，可以將超過一種的酶和超過一種的糖基供體與突變型多肽接觸，以在一個(gè)反應(yīng)步驟中添加超過一個(gè)的糖基殘基。例如，將突變型多肽與3種不同的酶(例如，GalNAc-T2、Core-1-GalT1和ST3Gal1)和三種不同的糖基供體部分(例如，UDP-GalNAc、UDP-Gal和CMP-SA-PEG)在合適的緩沖液系統(tǒng)中接觸，以產(chǎn)生經(jīng)糖PEG化的突變型多肽，例如多肽-GalNAc-Gal-SA-PEG(參見實(shí)施例4.6)。可以使用上述方法來測(cè)定總產(chǎn)率。
多肽綴合物的形成 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在修飾基團(tuán)和多肽之間形成共價(jià)綴合物的方法。在糖基化的或非糖基化的多肽和各種不同種類例如水溶性聚合物、治療性部分、生物分子、診斷性部分、靶向性部分等等之間形成本發(fā)明的多肽綴合物。將所述聚合物、治療性部分或生物分子通過糖基連接基團(tuán)而綴合至所述肽，所述糖基連接基團(tuán)插入在所述多肽和所述修飾基團(tuán)(例如，水溶性聚合物)之間并且共價(jià)連接至所述多肽和所述修飾基團(tuán)。經(jīng)修飾的糖的糖部分優(yōu)選選自核苷酸糖、活化的糖和既不是核苷酸也沒有活化的糖。
在示例性的實(shí)施方案中，通過將經(jīng)修飾的糖酶促附著至多肽而形成多肽綴合物。與已知的化學(xué)和酶促的肽精細(xì)制作策略不同，本發(fā)明的方法使得可能裝配具有基本上均一的衍生化模式的肽和糖肽。用于本發(fā)明的酶一般對(duì)于肽的特定氨基酸殘基或者氨基酸殘基的組合而言是選擇性的。本發(fā)明的方法還為大規(guī)模生產(chǎn)經(jīng)修飾的肽和糖肽提供了實(shí)際手段。
例用酶例如糖基轉(zhuǎn)移酶的極佳的選擇性，本方法提供了在一個(gè)或多個(gè)特定位置處攜帶有修飾基團(tuán)的多肽。因此，根據(jù)本發(fā)明，將經(jīng)修飾的糖直接附著至在多肽鏈內(nèi)的O-聯(lián)糖基化序列，或者備選地，將經(jīng)修飾的糖附加在糖肽的碳水化合物部分上。這樣的肽也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，在所述多肽中，經(jīng)修飾的糖結(jié)合至經(jīng)糖基化的位點(diǎn)和直接結(jié)合至多肽主鏈的氨基酸殘基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將經(jīng)修飾的葡糖胺部分直接添加至本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列的氨基酸側(cè)鏈，優(yōu)選地通過GlcNAc轉(zhuǎn)移酶的作用。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了形成多肽和修飾基團(tuán)(例如，聚合物修飾基團(tuán)，其任選地是水溶性的)之間的共價(jià)綴合物的方法，其中所述多肽包含O-聯(lián)糖基化序列，所述O-聯(lián)糖基化序列包含具有羥基的氨基酸殘基。作為該多肽的一部分的所述O-聯(lián)糖基化序列是葡糖胺轉(zhuǎn)移酶(例如，GlcNAc轉(zhuǎn)移酶)的底物。所述聚合物修飾基團(tuán)通過葡糖胺連接基團(tuán)共價(jià)連接至所述多肽，所述葡糖胺連接基團(tuán)插入在所述多肽和所述修飾基團(tuán)之間并且共價(jià)連接至所述多肽和所述修飾基團(tuán)。示例性的方法包括(i)在葡糖胺供體為其底物的糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，人GlcNAc轉(zhuǎn)移酶)存在下，使多肽與葡糖胺供體相接觸，所述葡糖胺供體包含共價(jià)連接至聚合物修飾基團(tuán)的葡糖胺部分或葡糖胺模擬部分。所述反應(yīng)在對(duì)于所述糖基轉(zhuǎn)移酶將所述葡糖胺部分或葡糖胺模擬部分從所述葡糖胺供體轉(zhuǎn)移到所述O-聯(lián)糖基化序列的所述羥基上來說足夠的條件下進(jìn)行。
形成本發(fā)明的多肽綴合物的另一個(gè)示例性方法包括下列步驟(i)重組產(chǎn)生包含本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列的多肽，和(ii)將葡糖胺部分或葡糖胺模擬部分從葡糖胺供體(例如，摻入了GlcNAc或GlcNAc-模擬部分的經(jīng)修飾的糖核苷酸)酶促轉(zhuǎn)移到氨基酸側(cè)鏈的羥基上，其中所述氨基酸是所述O-聯(lián)糖基化序列的一部分。
在上面的方法中，所述葡糖胺部分也可以是葡糖胺模擬部分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述葡糖胺轉(zhuǎn)移酶是GlcNAc轉(zhuǎn)移酶。優(yōu)選地，所述葡糖胺轉(zhuǎn)移酶是重組的酶。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中所使用的GlcNAc轉(zhuǎn)移酶在細(xì)菌宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中所使用的多肽是天然地包含O-聯(lián)糖基化序列的野生型多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽是本發(fā)明的非天然存在的多肽，其衍生自親本多肽，在所述親本多肽中通過突變而引入了至少一個(gè)O-聯(lián)糖基化序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中所使用的葡糖胺供體具有根據(jù)式(XI)的結(jié)構(gòu)(其如本文上面所描述)，不同之處在于，所述供體不需要摻入修飾基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在式(XI)中，E和E1都是氧。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述葡糖胺供體選自經(jīng)修飾或未修飾的UDP-GlcNAc和經(jīng)修飾或未修飾的UDP-GlcNH。
糖基化或糖修飾步驟可以分開地進(jìn)行，或者在“單罐”反應(yīng)中使用多種酶和糖基供體組合進(jìn)行。例如，可以在單個(gè)容器中合并用于從所表達(dá)的多肽上修剪掉不想要的糖基殘基的糖苷酶和一種或多種糖基轉(zhuǎn)移酶以及各自的糖基供體分子。另一個(gè)實(shí)例涉及順次添加每種酶和合適的糖基供體，并以“單罐”模式進(jìn)行該反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，添加的時(shí)間點(diǎn)被對(duì)于每種酶進(jìn)行所希望的酶促反應(yīng)而言必需的反應(yīng)時(shí)間所隔斷。上述方法的組合也可以用于制備本發(fā)明的化合物。
本發(fā)明還提供了手段以向肽添加(或除去)一個(gè)或多個(gè)所選的糖基殘基，之后將經(jīng)修飾的糖綴合至肽的至少一個(gè)所選的糖基殘基上。例如，當(dāng)希望將經(jīng)修飾的糖綴合至不存在于肽上或不以所希望的量存在的所選糖基殘基時(shí)，本實(shí)施方案是有用的。因此，在將經(jīng)修飾的糖偶聯(lián)至肽之前，通過酶促或化學(xué)偶聯(lián)將所選的糖基殘基綴合至所述肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在綴合經(jīng)修飾的糖之前，通過從糖肽上除去碳水化合物殘基來改變?cè)撎请牡奶腔Ｊ?。參見例如，WO 98/31826。
通過化學(xué)或酶促方法來完成存在于糖肽上的任何碳水化合物部分的添加或除去。優(yōu)選地，通過將多肽暴露于三氟甲磺酸或等同的化合物來進(jìn)行化學(xué)去糖基化。該處理導(dǎo)致除了連接性糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大多數(shù)或所有糖的切割，而使該肽保持完整?；瘜W(xué)去糖基化由Hakimuddin等人，Arch.Biochem.Biophys.25952(1987)和Edge等人，Anal.Biochem.118131(1981)進(jìn)行了描述。通過使用由Thotakura等人，Meth.Enzymol.138350(1987)所描述的各種內(nèi)切和外切糖苷酶可以實(shí)現(xiàn)多肽變體上碳水化合物部分的酶促切割。
通過任何本領(lǐng)域公認(rèn)的方法來進(jìn)行糖基部分的化學(xué)添加。優(yōu)選地，使用本文所述方法的修正形式(其中用天然糖基單位代替在本發(fā)明中使用的經(jīng)修飾的糖)來實(shí)現(xiàn)糖部分的酶促添加。用于添加糖部分的其他方法公開在美國專利號(hào)5,876,980；6,030,815；5,728,554和5,922,577中。用于本發(fā)明的示例性方法描述在于1987年9月11日公布的WO87/05330中以及在Aplin和Wriston，CRC CRIT.REV.BIOCHEM.，pp.259-306(1981)中。
包含兩個(gè)或更多多肽的多肽綴合物 還提供了包含通過接頭臂連接在一起的兩個(gè)或更多多肽的綴合物，即多功能綴合物；至少一個(gè)肽被O-糖基化或者包含突變型O-聯(lián)糖基化序列。本發(fā)明的多功能綴合物可以包含兩個(gè)或更多拷貝的相同肽或者具有不同結(jié)構(gòu)和/或性質(zhì)的各種不同肽的集合。在根據(jù)該實(shí)施方案的示例性綴合物中，兩個(gè)肽之間的接頭通過O-聯(lián)糖基殘基，例如O-聯(lián)糖基完整糖基連接基團(tuán)，而附著至所述肽中的至少一個(gè)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于通過連接基團(tuán)來連接兩個(gè)或更多肽的方法。連接基團(tuán)可以具有任何有用的結(jié)構(gòu)并且可以選自直鏈和支鏈結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，附著至肽的接頭的每個(gè)末端包含經(jīng)修飾的糖(即，新生的完整糖基連接基團(tuán))。
在本發(fā)明的示例性方法中，兩個(gè)肽通過包含PEG接頭的接頭部分而連接在一起。該構(gòu)建體符合上面圖式中給出的一般結(jié)構(gòu)。如本文所述，本發(fā)明的構(gòu)建體包含兩個(gè)完整的糖基連接基團(tuán)(即，s+t＝1)。聚焦于包含兩個(gè)糖基基團(tuán)的PEG接頭是為了清楚的目的，并不應(yīng)當(dāng)被解釋為限制了用于在本發(fā)明的該實(shí)施方案中使用的接頭臂的身份。
因此，PEG部分在第一個(gè)末端處用第一糖基單位進(jìn)行官能化，并在第二個(gè)末端處用第二糖基單位進(jìn)行官能化。所述第一和第二糖基單位優(yōu)選是不同的轉(zhuǎn)移酶的底物，從而允許第一個(gè)和第二個(gè)肽分別正交附著至所述第一和第二糖基單位。在實(shí)踐中，將(糖基)1-PEG-(糖基)2接頭與第一種肽和第一種轉(zhuǎn)移酶(所述第一糖基單位是其底物)接觸，從而形成(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2。然后，任選地從反應(yīng)混合物中除去轉(zhuǎn)移酶和/或未反應(yīng)的肽。向該(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2綴合物添加第二種肽和第二種轉(zhuǎn)移酶(所述第二糖基單位是其底物)，從而形成(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2-(肽)2；所述糖基殘基中的至少一個(gè)是直接或間接地O-聯(lián)的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，上面所概述的方法也可應(yīng)用于在超過兩個(gè)的肽之間形成綴合物，例如通過使用支化的PEG、樹枝狀聚合物、聚(氨基酸)、多糖等等。
上述過程可以如所希望的進(jìn)行許多循環(huán)，并且不限于用單個(gè)接頭在兩個(gè)肽之間形成綴合物。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，用肽使在PEG(或其他)接頭的末端處的完整糖基連接基團(tuán)官能化的反應(yīng)可以在同一個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)進(jìn)行，或者它們可以以逐步的方式進(jìn)行。當(dāng)反應(yīng)以逐步的方式進(jìn)行時(shí)，將在每步產(chǎn)生的綴合物任選地從一種或多種反應(yīng)組分(例如，酶、肽)中純化出來。
將經(jīng)修飾的糖酶促綴合至肽 將經(jīng)修飾的糖綴合至糖基化或非糖基化的肽，其中使用合適的酶來介導(dǎo)該綴合。優(yōu)選地，選擇修飾的供體糖、酶和接納體肽的濃度，從而使得糖基化反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行，直到接納體被耗盡。
使用糖基轉(zhuǎn)移酶來合成所希望的寡糖結(jié)構(gòu)的許多方法是已知的并且通?？蓱?yīng)用于本發(fā)明。示例性的方法例如描述于下列文獻(xiàn)中WO96/32491和Ito等人，Pure Appl.Chem.65753(1993)，以及美國專利號(hào)5,352,670、5,374,541和5,545,553。
使用單種酶(例如，糖基轉(zhuǎn)移酶)或者糖基轉(zhuǎn)移酶與任選地一種或多種糖苷酶的組合來實(shí)施本發(fā)明。例如，可以使用葡糖胺轉(zhuǎn)移酶和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的組合。在使用超過一種酶的那些實(shí)施方案中，優(yōu)選地將酶和底物合并在最初的反應(yīng)混合物中，或者一旦第一個(gè)酶促反應(yīng)完成或者接近完成，就將用于第二個(gè)酶促反應(yīng)的酶和試劑加入反應(yīng)介質(zhì)中。通過在單個(gè)容器中依次進(jìn)行兩個(gè)酶促反應(yīng)，總產(chǎn)率相對(duì)于其中分離出中間體種類的程序而言得到了提高。此外，減少了多余的溶劑和副產(chǎn)物的清除和處置。
本發(fā)明綴合物的O-聯(lián)糖基部分通常以附著至肽的葡糖胺部分為起始。葡糖胺轉(zhuǎn)移酶家族中的任何成員(例如，在本文中所描述的GlcNAc轉(zhuǎn)移酶，例如SEQ ID NOs1-9和228至230)可以用于將葡糖胺部分結(jié)合至肽(參見例如，Hassan H，Bennett EP，Mandel U，Hollingsworth MA和Clausen H(2000)；Control of Mucin-TypeO-GlycosylationO-Glycan Occupancy is Directed by SubstrateSpecificities of Polypeptide GalNAc-Transferases；Eds.Ernst，Hart和Sinay；Wiley-VCH chapter″Carbohydrates in Chemistry and Biology-a Comprehension Handbook″，273-292)。GlcNAc部分自身可以是糖基連接基團(tuán)，并用修飾基團(tuán)來進(jìn)行衍生化。備選地，使用一種或多種酶和一種或多種合適的糖基供體底物來擴(kuò)建糖基殘基。那么，可以將經(jīng)修飾的糖添加至延伸的糖基部分。
所述酶通常通過與內(nèi)切聚糖酶水解步驟的逆反應(yīng)類似的合成步驟來催化該反應(yīng)。在這些實(shí)施方案中，糖基供體分子(例如，所希望的寡糖或單糖結(jié)構(gòu))含有離去基團(tuán)，并且通過將供體分子添加至在蛋白質(zhì)上的GlcNAc殘基而持續(xù)進(jìn)行該反應(yīng)。例如，離去基團(tuán)可以是鹵素，例如氟化物。在其他實(shí)施方案中，離去基團(tuán)是Asn，或Asn-肽部分。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，修飾在糖基供體分子上的GlcNAc殘基。例如，GlcNAc殘基可以包含1，2噁唑啉部分。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生本發(fā)明綴合物的每種酶以催化量存在。特定酶的催化量依據(jù)該酶的底物的濃度以及反應(yīng)條件例如溫度、時(shí)間和pH值而變。在預(yù)選的底物濃度和反應(yīng)條件下測(cè)定給定酶的催化量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
施行上述方法所處的溫度可以為從剛剛高于冰點(diǎn)到大多數(shù)敏感的酶變性的溫度。優(yōu)選的溫度范圍是約0℃至約55℃，和更優(yōu)選約20℃至約32℃。在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，在升高的溫度下使用嗜熱的酶來進(jìn)行本發(fā)明方法的一個(gè)或多個(gè)組成部分。
讓反應(yīng)混合物保持足夠使接納體被糖基化的一段時(shí)間，從而形成所希望的綴合物。數(shù)小時(shí)后通?？梢詸z測(cè)到一些綴合物，通常在24小時(shí)或更短時(shí)間內(nèi)獲得可回收的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，反應(yīng)速率取決于許多可變因素(例如，酶濃度、供體濃度、接納體濃度、溫度、溶劑體積)，它們對(duì)于所選的系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化。
本發(fā)明還提供了經(jīng)修飾的肽的工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)。如本文所使用的，工業(yè)規(guī)模通常產(chǎn)生至少約250mg，優(yōu)選至少約500mg，和更優(yōu)選至少約1g完成的純化的綴合物，優(yōu)選在單次反應(yīng)循環(huán)后，即所述綴合物不是來自相同的連續(xù)重復(fù)的合成循環(huán)的反應(yīng)產(chǎn)物的組合。
在下面的討論中，通過將經(jīng)修飾的唾液酸部分綴合至經(jīng)糖基化的肽來舉例說明本發(fā)明。該示例性的經(jīng)修飾的唾液酸用(m-)PEG進(jìn)行標(biāo)記。下面關(guān)于經(jīng)PEG修飾的唾液酸和經(jīng)糖基化的肽的使用的討論焦點(diǎn)是為了清楚地舉例說明，而并不意在暗示本發(fā)明局限于這兩種配偶體的綴合。技術(shù)人員理解，該討論通常可應(yīng)用于添加除唾液酸之外的其他經(jīng)修飾的糖基部分。此外，該討論同樣可應(yīng)用于用除PEG之外的其他試劑(包括其他水溶性聚合物、治療性部分和生物分子)來修飾糖基單位。
酶促方法可用于在肽或糖肽上選擇性地引入修飾基團(tuán)(例如，mPEG或mPPG)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法利用包含修飾基團(tuán)的經(jīng)修飾的糖與合適的糖基轉(zhuǎn)移酶或糖合酶(glycosynthase)的組合。通過選擇將會(huì)產(chǎn)生所希望的碳水化合物連接的糖基轉(zhuǎn)移酶和利用經(jīng)修飾的糖作為供體底物，可以將修飾基團(tuán)直接引入到肽主鏈上，引入到糖肽的現(xiàn)有糖殘基上，或者引入到被添加至肽的糖殘基上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法利用經(jīng)修飾的糖，其攜帶被掩蔽的反應(yīng)性官能團(tuán)，該官能團(tuán)在經(jīng)修飾的糖轉(zhuǎn)移到肽或糖肽上后可以用于附著修飾基團(tuán)。
在示例性的實(shí)施方案中，通過GalNAc轉(zhuǎn)移酶的作用將GalNAc殘基添加至O-聯(lián)糖基化序列。Hassan H，Bennett EP，Mandel U，Hollingsworth MA和Clausen H(2000)，Control of Mucin-TypeO-glycosylationO-Glycan Occupancy is Directed by SubstrateSpecificities of Polypeptide GalNAc-Transferases(Eds.Ernst，Hart和Sinay)，Wiley-VCH chapter″Carbohydrates in Chemistry andBiology-a Comprehension Handbook″，第273-292頁。該方法包括將待修飾的肽與含有合適量的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和合適的半乳糖基供體的反應(yīng)混合物一起進(jìn)行溫育。允許該反應(yīng)基本上進(jìn)行到完成，或者備選地，當(dāng)加入預(yù)選量的半乳糖殘基時(shí)該反應(yīng)被終止。用于裝配所選的糖接納體的其他方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是明顯的。
在下面的討論中，通過使用附著有水溶性聚合物的經(jīng)修飾的糖來舉例說明本發(fā)明的方法。討論的焦點(diǎn)是為了清楚地舉例說明。技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，該討論同樣與其中經(jīng)修飾的糖攜帶有治療性部分、生物分子等的那些實(shí)施方案相關(guān)。
在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，經(jīng)由經(jīng)修飾的GlcNAc或GlcNH殘基、半乳糖基(Gal)殘基、巖藻糖基殘基(Fuc)、唾液酸基殘基(Sia)或甘露糖基(Man)殘基將水溶性聚合物添加至GlcNAc殘基。備選地，可以將未修飾的糖基殘基添加至末端GlcNAc殘基。
在更進(jìn)一步的實(shí)例中，使用經(jīng)修飾的GlcNAc、Gal、Sia、Fuc或Man部分和合適的轉(zhuǎn)移酶將水溶性聚合物(例如，PEG)添加到末端GlcNAc殘基上。
在更進(jìn)一步的方法中，掩蔽的反應(yīng)官能團(tuán)存在于被轉(zhuǎn)移的糖基殘基上。掩蔽的反應(yīng)性基團(tuán)優(yōu)選地不受用于將經(jīng)修飾的糖附著至肽的條件的影響。在將經(jīng)修飾的糖共價(jià)附著至肽后，除去掩蔽物，并通過在經(jīng)修飾的糖殘基上的未掩蔽的反應(yīng)性基團(tuán)與反應(yīng)性修飾基團(tuán)的反應(yīng)，將肽綴合至修飾基團(tuán)，例如水溶性聚合物(例如，PEG或PPG)。
在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，通過使用已知將糖殘基轉(zhuǎn)移至肽主鏈上的O-聯(lián)糖基化序列的糖基轉(zhuǎn)移酶，來將經(jīng)修飾的糖直接添加至肽主鏈。可用于實(shí)施本發(fā)明的示例性糖基轉(zhuǎn)移酶包括，但不限于，GlcNAc轉(zhuǎn)移酶等。該方法的使用允許將經(jīng)修飾的糖直接添加到缺少任何碳水化合物的肽上。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的糖核苷酸是經(jīng)修飾的UDP-葡糖胺，和糖基轉(zhuǎn)移酶是GlcNAc轉(zhuǎn)移酶。該示例性的實(shí)施方案在下面的方案5中給出。
方案5將示例性的經(jīng)修飾的糖轉(zhuǎn)移到多肽的氨基酸殘基上
在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，將糖肽綴合至靶向性試劑，例如，轉(zhuǎn)鐵蛋白(以將肽遞送穿過血腦屏障，并至內(nèi)體)，肉堿(以將肽遞送到肌細(xì)胞；參見例如，LeBorgne等人，Biochem.Pharmacol.591357-63(2000))，和膦酸例如二膦酸(以將肽靶向骨和其他含鈣組織；參見例如，Modern Drug Discovery，2002年8月，第10頁)?？捎糜诎邢虻钠渌噭?duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是明顯的。例如，葡萄糖、谷氨酰胺和IGF也可用于靶向肌肉。
通過本文討論的或本領(lǐng)域已知的任何方法來綴合靶向性部分和治療性肽。技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，除了上面所示的那些之外的其他肽也可以如本文所述的進(jìn)行衍生化。示例性的肽在共同待決的共有的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/328,523(2001年10月10日提交)的附錄中給出。
在示例性的實(shí)施方案中，靶向性試劑和治療性肽通過接頭部分而偶聯(lián)。在該實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法，將治療性肽或靶向性試劑中的至少一個(gè)經(jīng)由完整的糖基連接基團(tuán)而偶聯(lián)至接頭部分。在示例性的實(shí)施方案中，接頭部分包括聚(醚)，例如聚(乙二醇)。在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，接頭部分包括至少一個(gè)在體內(nèi)降解的鍵，從而在將綴合物遞送到身體的所靶向的組織或區(qū)域后，從靶向性試劑上釋放出治療性肽。
在另外一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，通過改變治療性部分上的糖形而不將治療性肽綴合至靶向性部分，來改變治療性部分的體內(nèi)分布。例如，通過用唾液酸(或其衍生物)來帽化糖基基團(tuán)的末端半乳糖部分，可以避免治療性肽被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取。
酶 糖基轉(zhuǎn)移酶 待用于本發(fā)明的糖基轉(zhuǎn)移酶可以是任一種，只要它可以利用經(jīng)修飾的糖作為糖供體。此類酶的實(shí)例包括Leloir途徑糖基轉(zhuǎn)移酶，例如半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、木糖基轉(zhuǎn)移酶、葡糖苷酸基轉(zhuǎn)移酶等等。
對(duì)于涉及糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)的酶促糖合成，可以從任何來源克隆或分離糖基轉(zhuǎn)移酶。許多經(jīng)克隆的糖基轉(zhuǎn)移酶以及它們的多核苷酸序列是已知的。糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列和編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列(從其可以推導(dǎo)出氨基酸序列)可在各種公眾可得的數(shù)據(jù)庫中找到，包括GenBank、Swiss-Prot、EMBL等等。
可用于本發(fā)明方法的糖基轉(zhuǎn)移酶包括但不限于，半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、葡糖基轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶、葡糖苷酸基轉(zhuǎn)移酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移酶和寡糖基轉(zhuǎn)移酶。合適的糖基轉(zhuǎn)移酶包括從真核生物中以及從原核生物中獲得的那些。
編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA可以通過化學(xué)合成而獲得，通過篩選來自合適細(xì)胞或細(xì)胞系培養(yǎng)物的mRNA的反轉(zhuǎn)錄物而獲得，通過篩選來自合適細(xì)胞的基因組文庫而獲得，或者通過這些程序的組合而獲得。mRNA或基因組DNA的篩選可以用從糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列產(chǎn)生的寡核苷酸探針來進(jìn)行。探針可以根據(jù)已知的程序用可檢測(cè)基團(tuán)例如熒光基團(tuán)、放射性原子或化學(xué)發(fā)光基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記，并用于常規(guī)的雜交測(cè)定法中。備選地，可以使用從糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列產(chǎn)生的PCR寡核苷酸引物，通過采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)程序來獲得糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列(參見例如，Mullis等人的美國專利號(hào)4,683,195和Mullis的美國專利號(hào)4,683,202)。
可以在用含有編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中合成糖基轉(zhuǎn)移酶。載體用于擴(kuò)增編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA和/或表達(dá)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA。表達(dá)載體是可復(fù)制的DNA構(gòu)建體，其中編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA序列有效地連接至合適的控制序列，所述控制序列能夠?qū)崿F(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶在合適宿主中的表達(dá)。對(duì)于此類控制序列的需要將依據(jù)所選的宿主和所選的轉(zhuǎn)化方法而變。一般地，控制序列包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，用于控制轉(zhuǎn)錄的任選的操縱基因序列，編碼合適的mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列，以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。擴(kuò)增載體不需要表達(dá)控制結(jié)構(gòu)域。所有所需要的是在宿主中復(fù)制的能力，這通常由復(fù)制起點(diǎn)來賦予，和有助于識(shí)別轉(zhuǎn)化體的選擇基因。
在示例性的實(shí)施方案中，本發(fā)明利用原核生物的酶。此類糖基轉(zhuǎn)移酶包括參與脂寡糖(LOS)合成的酶，所述脂寡糖由許多革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)生(Preston等人，Critical Reviews in Microbiology 23(3)139-180(1996))。此類酶包括但不限于，諸如大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的物種的rfa操縱子的蛋白質(zhì)，包括β1，6半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和β1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(參見，例如EMBL登錄號(hào)M80599和M86935(大腸桿菌)；EMBL登錄號(hào)S56361(鼠傷寒沙門氏菌))，葡糖基轉(zhuǎn)移酶(Swiss-Prot登錄號(hào)P25740(大腸桿菌))，β1，2-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(rfaJ)(Swiss-Prot登錄號(hào)P27129(大腸桿菌)和Swiss-Prot登錄號(hào)P19817(鼠傷寒沙門氏菌))，和β1，2-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶(rfaK)(EMBL登錄號(hào)U00039(大腸桿菌))。氨基酸序列已知的其他糖基轉(zhuǎn)移酶包括由諸如rfaB(其已經(jīng)在諸如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸沙門氏菌(Salmonella enterica)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium leprosum)的生物中得到表征)的操縱子所編碼的那些，以及由銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的rh1操縱子所編碼的那些。
也適合用于本發(fā)明的是參與產(chǎn)生這樣的結(jié)構(gòu)的糖基轉(zhuǎn)移酶，所述結(jié)構(gòu)包含乳-N-新四糖(lacto-N-neotetraose)，D-半乳糖基-β-1，4-N-乙?；?D-葡糖胺基-β-1，3-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖，和Pk血型三糖序列，D-半乳糖基-α-1，4-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖，它們已經(jīng)在粘膜病原體淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonnorhoeae)和腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)的LOS中得到了鑒定(Scholten等人，J.Med.Microbiol.41236-243(1994))。來自腦膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌的基因(其編碼參與這些結(jié)構(gòu)的生物合成的糖基轉(zhuǎn)移酶)已經(jīng)從腦膜炎奈瑟氏球菌免疫型L3和L1(Jennings等人，Mol.Microbiol.18729-740(1995))和淋病奈瑟氏球菌突變體F62(Gotshlich，J.Exp.Med.1802181-2190(1994))中鑒定出來。在腦膜炎奈瑟氏球菌中，由三個(gè)基因即lgtA、lgtB和lgE組成的基因座編碼糖基轉(zhuǎn)移酶，該酶是添加乳-N-新四糖鏈中的最后三個(gè)糖所必需的(Wakarchuk等人，J.Biol.Chem.27119166-73(1996))。最近，證明了lgtB和lgtA基因產(chǎn)物的酶活性，這提供了所提出的它們的糖基轉(zhuǎn)移酶功能的第一個(gè)直接證據(jù)(Wakarchuk等人，J.Biol.Chem.271(45)28271-276(1996))。在淋病奈瑟氏球菌中，存在兩個(gè)額外的基因，即lgtD和lgtC，lgtD向乳-N-新四糖結(jié)構(gòu)的末端半乳糖的3位添加β-D-GalNAc，lgtC向截短的LOS的乳糖元件添加末端α-D-Gal，從而產(chǎn)生Pk血型抗原結(jié)構(gòu)(Gotshlich(1994)，同上)。在腦膜炎奈瑟氏球菌中，分開的免疫型L1也表達(dá)Pk血型抗原并且已經(jīng)顯示出攜帶lgtC基因(Jennings等人，(1995)，同上)。奈瑟氏球菌糖基轉(zhuǎn)移酶和相關(guān)的基因還描述于USPN 5,545,553(Gotschlich)中。還已經(jīng)表征了來自幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)的α1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的基因(Martin等人，J.Biol.Chem.27221349-21356(1997))?？漳c彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)的糖基轉(zhuǎn)移酶也可用于本發(fā)明(參見例如，http://afmb.cnrs-mrs.fr/～pedro/CAZY/gtf_42.html)。
(a)N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶 在一些實(shí)施方案中，糖基轉(zhuǎn)移酶是N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶，例如尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺多肽β-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶，其例如描述在Kreppel等人，J.Biol.Chem.1997，2729308-9315和Lubas等人，J.Biol.Chem.1997，2729316-9324中。其他示例性的GlcNAc轉(zhuǎn)移酶公開在Kreppel，L.和G.Hart，J.Biol.Chem.1999，27432015-32022；Lubas，W.和J.Hanover，J.Biol.Chem.2000，27510983-10988；Hanover，J.等人，Arch.Biochem.Biophys.2003，409287-297；Gross，B.，Kraybill，B.和S.Walker，J.Am.Chem.Soc.2005，12714588-14589；和Gross，B.，Swoboda，J.和S.Walker，J.Am.Chem.Soc.2008，130440-441中，這些文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過提及而以其整體合并入本文。示例性的葡糖胺轉(zhuǎn)移酶包括GnT-I至GnT-VI。在本發(fā)明的方法中有用的GlcNAc轉(zhuǎn)移酶的示例性的氨基酸序列例如顯示在圖1至9(SEQ ID NOs1至9)中和下文(SEQ ID NOs228至230)中。
人GlcNAc轉(zhuǎn)移酶同種型1(NP858058)的序列 (SEQ ID NO228) MASSVGNVADSTEPTKRMLSFQGLAELAHREYQAGDFEAAERHCMQLWRQEPDNTGVLLLLSSIHFQCRRLDRSAHFSTLAIKQNPLLAEAYSNLGNVYKERGQLQEAIEHYRHALRLKPDFIDGYINLAAALVAAGDMEGAVQAYVSALQYNPDLYCVRSDLGNLLKALGRLEEAKACYLKAIETQPNFAVAWSNLGCVFNAQGEIWLAIHHFEKAVTLDPNFLDAYINLGNVLKEARIFDRAVAAYLRALSLSPNHAVVHGNLACVYYEQGLIDLAIDTYRRAIELQPHFPDAYCNLANALKEKGSVAEAEDCYNTALRLCPTHADSLNNLANIKREQGNIEEAVRLYRKALEVFPEFAAAHSNLASVLQQQGKLQEALMHYKEAIRISPTFADAYSNMGNTLKEMQDVQGALQCYTRAIQINPAFADAHSNLASIHKDSGNIPEAIASYRTALKLKPDFPDAYCNLAHCLQIVCDWTDYDERMKKLVSIVADQLEKNRLPSVHPHHSMLYPLSHGFRKAIAERHGNLCLDKINVLHKPPYEHPKDLKLSDGRLRVGYVSSDFGNHPTSHLMQSIPGMHNPDKFEVFCYALSPDDGTNFRVKVMAEANHFIDLSQIPCNGKAADRIHQDGIHILVNMNGYTKGARNELFALRPAPIQAMWLGYPGTSGALFMDYIITDQETSPAEVAEQYSEKLAYMPHTFFIGDHANMFPHLKKKAVIDFKSNGHIYDNRIVLNGIDLKAFLDSLPDVKIVKMKCPDGGDNADSSNTALNMPVIPMNTIAEAVIEMINRGQIQITINGFSISNGLATTQINNKAATGEEVPRTIIVTTRSQYGLPEDAIVYCNFNQLYKIDPSTLQMWANILKRVPNSVLWLLRFPAVGEPNIQQYAQNMGLPQNRIIFSPVAPKEEHVRRGQLADVCLDTPLCNGHTTGMDVLWAGTPMVTMPGETLASRVAASQLTCLGCLELIAKNRQEYEDIAVKLGTDLEYLKKVRGKVWKQRISSPLFNTKQYTMELERLYLQMWEHYAAGNKPDHMIKPVEVTESA 人GlcNAc轉(zhuǎn)移酶同種型2(NP858059)的序列 (SEQ ID NO229) MASSVGNVADSTGLAELAHREYQAGDFEAAERHCMQLWRQEPDNTGVLLLLSSIHFQCRRLDRSAHFSTLAIKQNPLLAEAYSNLGNVYKERGQLQEAIEHYRHALRLKPDFIDGYINLAAALVAAGDMEGAVQAYVSALQYNPDLYCVRSDLGNLLKALGRLEEAKACYLKAIETQPNFAVAWSNLGCVFNAQGEIWLAIHHFEKAVTLDPNFLDAYINLGNVLKEARIFDRAVAAYLRALSLSPNHAVVHGNLACVYYEQGLIDLAIDTYRRAIELQPHFPDAYCNLANALKEKGSVAEAEDCYNTALRLCPTHADSLNNLANIKREQGNIEEAVRLYRKALEVFPEFAAAHSNLASVLQQQGKLQEALMHYKEAIRISPTFADAYSNMGNTLKEMQDVQGALQCYTRAIQINPAFADAHSNLASIHKDSGNIPEAIASYRTALKLKPDFPDAYCNLAHCLQIVCDWTDYDERMKKLVSIVADQLEKNRLPSVHPHHSMLYPLSHGFRKAIAERHGNLCLDKINVLHKPPYEHPKDLKLSDGRLRVGYVSSDFGNHPTSHLMQSIPGMHNPDKFEVFCYALSPDDGTNFRVKVMAEANHFIDLSQIPCNGKAADRIHQDGIHILVNMNGYTKGARNELFALRPAPIQAMWLGYPGTSGALFMDYIITDQETSPAEVAEQYSEKLAYMPHTFFIGDHANMFPHLKKKAVIDFKSNGHIYDNRIVLNGIDLKAFLDSLPDVKIVKMKCPDGGDNADSSNTALNMPVIPMNTIAEAVIEMINRGQIQITINGFSISNGLATTQINNKAATGEEVPRTIIVTTRSQYGLPEDAIVYCNFNQLYKIDPSTLQMWANILKRVPNSVLWLLRFPAVGEPNIQQYAQNMGLPQNRIIFSPVAPKEEHVRRGQLADVCLDTPLCNGHTTGMDVLWAGTPMVTMPGETLASRVAASQLTCLGCLELIAKNRQEYEDIAVKLGTDLEYLKKVRGKVWKQRISSPLFNTKQYTMELERLYLQMWEHYAAGNKPDHMIKPVEVTESA 人GlcNAc轉(zhuǎn)移酶同種型CRA_a(EAX05285 CH47l132.2)的序列 (SEQ ID NO230) MLQGHFWLVREGIMISPSSPPPPNLFFFPLQIFPFPFTSFPSHLLSLTPPKACYLKAIETQPNFAVAWSNLGCVFNAQGEIWLAIHHFEKAVTLDPNFLDAYINLGNVLKEARIFDRAVAAYLRALSLSPNHAVVHGNLACVYYEQGLIDLAIDTYRRAIELQPHFPDAYCNLANALKEKGSVAEAEDCYNTALRLCPTHADSLNNLANIKREQGNIEEAVRLYRKALEVFPEFAAAHSNLASVLQQQGKLQEALMHYKEAIRISPTFADAYSNMGNTLKEMQDVQGALQCYTRAIQINPAFADAHSNLASIHKDSGNIPEAIASYRTALKLKPDFPDAYCNLAHCLQIVCDWTDYDERMKKLVSIVADQLEKNRLPSVHPHHSMLYPLSHGFRKAIAERHGNLCLDKINVLHKPPYEHPKDLKLSDGRLRVGYVSSDFGNHPTSHLMQSIPGMHNPDKFEVFCYALSPDDGTNFRVKVMAEANHFIDLSQIPCNGKAADRIHQDGIHILVNMNGYTKGARNELFALRPAPIQAMWLGYPGTSGALFMDYIITDQETSPAEVAEQYSEKLAYMPHTFFIGDHANMFPHLKKKAVIDFKSNGHIYDNRIVLNGIDLKAFLDSLPDVKIVKMKCPDGGDNADSSNTALNMPVIPMNTIAEAVIEMINRGQIQITINGFSISNGLATTQINNKAATGEEVPRTIIVTTRSQYGLPEDAIVYCNFNQLYKIDPSTLQMWANILKRVPNSVLWLLRFPAVGEPNIQQYAQNMGLPQNRIIFSPVAPKEEHVRRGQLADVCLDTPLCNGHTTGMDVLWAGTPMVTMPGETLASRVAASQLTCLGCLELIAKNRQEYEDIAVKLGTDLEYLKKVRGKVWKQRISSPLFNTKQYTMELERLYLQMWEHYAAGNKPDHMIKPVEVTESA 其他葡糖胺轉(zhuǎn)移酶，例如來源于其他生物諸如其他哺乳動(dòng)物(例如，鼠類、牛、豬、大鼠)、昆蟲(果蠅屬物種(Drosophila sp.))、酵母(例如，假絲酵母屬物種(Candida sp.))、細(xì)菌(例如，大腸桿菌)和秀麗隱桿線蟲(C.elegans)的那些葡糖胺轉(zhuǎn)移酶在本發(fā)明的方法內(nèi)也是有用的。此外，上述葡糖胺轉(zhuǎn)移酶(SEQ ID NOs228至230)或任何其他葡糖胺轉(zhuǎn)移酶的任何突變的或截短的形式在本發(fā)明的方法內(nèi)也是有用的。在一個(gè)實(shí)施方案中，GlcNAc轉(zhuǎn)移酶缺少一個(gè)或多個(gè)三十四肽重復(fù)(TPR，tetratricopeptide repeat)結(jié)構(gòu)域。特別優(yōu)選的是能夠每O-聯(lián)糖基化序列只添加一個(gè)葡糖胺部分的那些酶，和對(duì)于本發(fā)明的特定的O-聯(lián)糖基化序列來說基本上特異性的那些酶。
(b)GalNAc轉(zhuǎn)移酶 O-聯(lián)糖基化中的第一步可以通過UDP-GalNAc多肽N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶(GalNAc-轉(zhuǎn)移酶)大家族中的一個(gè)或多個(gè)成員來催化，它們通常將GalNAc轉(zhuǎn)移至絲氨酸和蘇氨酸接納體位點(diǎn)(Hassan等人，J.Biol.Chem.27538197-38205(2000))。迄今已經(jīng)鑒定和表征了哺乳動(dòng)物GalNAc-轉(zhuǎn)移酶家族的12個(gè)成員(Schwientek等人，J.Biol.Chem.27722623-22638(2002))，并且已經(jīng)從基因組數(shù)據(jù)庫的分析中預(yù)測(cè)出了該基因家族的幾個(gè)另外的推定的成員。GalNAc-轉(zhuǎn)移酶同種型具有不同的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)并且顯示出在時(shí)間和空間上有差別的表達(dá)模式，這暗示它們具有不同的生物學(xué)功能(Hassan等人，J.Biol.Chem.27538197-38205(2000))。GalNAc-轉(zhuǎn)移酶的序列分析已經(jīng)導(dǎo)致這樣的假設(shè)，即這些酶含有兩個(gè)不同的亞基中心催化單位和C-末端單位，該C-末端單位與植物凝集素蓖麻毒蛋白具有序列相似性，被稱作“凝集素結(jié)構(gòu)域”(Hagen等人，J.Biol.Chem.2746797-6803(1999)；Hazes，Protein Eng.101353-1356(1997)；Breton等人，Curr.Opin.Struct.Biol.9563-571(1999))。涉及所選保守殘基的位點(diǎn)特異性誘變的先前實(shí)驗(yàn)證實(shí)，催化結(jié)構(gòu)域中的突變消除了催化活性。相反地，“凝集素結(jié)構(gòu)域”中的突變對(duì)于GalNAc-轉(zhuǎn)移酶同種型GalNAc-T1的催化活性沒有顯著影響(Tenno等人，J.Biol.Chem.277(49)47088-96(2002))。因此，認(rèn)為C-末端“凝集素結(jié)構(gòu)域”沒有功能，并且在GalNAc-轉(zhuǎn)移酶的酶促功能中不起作用(Hagen等人，J.Biol.Chem.2746797-6803(1999))。
沒有展示出表觀GalNAc-糖肽特異性的多肽GalNAc-轉(zhuǎn)移酶也似乎受它們的推定的凝集素結(jié)構(gòu)域的調(diào)節(jié)(PCT WO 01/85215 A2)。近來，發(fā)現(xiàn)GalNAc-T1推定的凝集素結(jié)構(gòu)域中的突變，類似于以前在GalNAc-T4中分析的那些突變(Hassan等人，J.Biol.Chem.27538197-38205(2000))，以類似于GalNAc-T4的方式調(diào)節(jié)該酶的活性。因此，盡管野生型GalNAc-T1向具有多個(gè)接納體位點(diǎn)的肽底物添加多個(gè)連續(xù)的GalNAc殘基，但是突變的GalNAc-T1不能向相同底物添加超過一個(gè)的GalNAc殘基(Tenno等人，J.Biol.Chem.277(49)47088-96(2002))。更近來，測(cè)定了鼠GalNAc-T1(Fritz等人，PNAS2004，101(43)15307-15312)以及人類GalNAc-T2(Fritz等人，J.Biol.Chem.2006，281(13)8613-8619)的x射線晶體結(jié)構(gòu)。人GalNAc-T2結(jié)構(gòu)揭示了在催化性結(jié)構(gòu)域和凝集素結(jié)構(gòu)域之間的出乎意料的柔韌性，并且暗示了被GalNAc-T2用于捕獲糖基化的底物的新機(jī)制。對(duì)于缺少凝集素結(jié)構(gòu)域的GalNAc-T2的動(dòng)力學(xué)分析證實(shí)了該結(jié)構(gòu)域在作用于糖肽底物中的重要性。然而，除去凝集素結(jié)構(gòu)域沒有顯著地影響對(duì)于非糖基化的底物的酶活性。因此，缺少凝集素結(jié)構(gòu)域的截短的人GalNAc-T2酶可用于肽底物的糖基化，其中所得的單糖基化的多肽的進(jìn)一步糖基化不是所希望的。
最近的證據(jù)證明，一些GalNAc-轉(zhuǎn)移酶對(duì)于部分地GalNAc-糖基化的糖肽顯示出獨(dú)特的活性。至少三種GalNAc-轉(zhuǎn)移酶同種型(GalNAc-T4、-T7和-T10)的催化作用選擇性地作用于對(duì)應(yīng)于粘蛋白串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)域的糖肽，其中僅僅一些簇集的潛在糖基化序列已被其他GalNAc-轉(zhuǎn)移酶GalNAc糖基化(Bennett等人，F(xiàn)EBS Letters 460226-230(1999)；Ten Hagen等人，J.Biol.Chem.27617395-17404(2001)；Bennett等人，J.Biol.Chem.27330472-30481(1998)；TenHagen等人，J.Biol.Chem.27427867-27874(1999))。除了以前利用的那些以外，GalNAc-T4和-T7識(shí)別不同的GalNAc-糖基化的肽并且催化將GalNAc轉(zhuǎn)移至接納體底物位點(diǎn)。預(yù)測(cè)此類GalNAc-轉(zhuǎn)移酶活性的一個(gè)功能是代表了在具有高密度O-聯(lián)糖基化的糖蛋白中O-聚糖占有密度的控制步驟。
其一個(gè)實(shí)例是癌癥相關(guān)的粘蛋白MUC1的糖基化。MUC1含有20個(gè)殘基(HGV

APD

RPAPG

APPA)的串聯(lián)重復(fù)O-聯(lián)糖基化的區(qū)域，其具有5個(gè)潛在的O-聯(lián)糖基化序列。GalNAc-T1、-T2和-T3可以起始MUC1串聯(lián)重復(fù)的糖基化，并且可以僅在三個(gè)位點(diǎn)處摻入(HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA(SEQ ID NO231)，GalNAc附著位點(diǎn)加有下劃線)。GalNAc-T4是獨(dú)特的，因?yàn)樗瞧耔b定的可以完成下列功能的唯一的GalNAc-轉(zhuǎn)移酶同種型將O-聯(lián)聚糖附著至乳腺癌相關(guān)的粘蛋白MUC1的20個(gè)氨基酸的串聯(lián)重復(fù)序列中所有5個(gè)接納位點(diǎn)。GalNAc-T4將GalNAc轉(zhuǎn)移至GalNAc4TAP24糖肽(TAPPAHGVT

APD

RPAPGSTAPP(SEQ ID NO232)，獨(dú)特的GalNAc-T4附著位點(diǎn)以粗體表示)上不被其他GalNAc-轉(zhuǎn)移酶同種型使用的至少兩個(gè)位點(diǎn)(Bennett等人，J.Biol.Chem.27330472-30481(1998))?；钚?，例如由GalNAc-T4所展示出的活性，似乎是產(chǎn)生由癌細(xì)胞表達(dá)的MUC1的糖形所必需的，其中所有潛在位點(diǎn)都被糖基化(Muller等人，J.Biol.Chem.27418165-18172(1999))。來自哺乳期乳腺的正常MUC1具有約2.6個(gè)O-聯(lián)聚糖/重復(fù)(Muller等人，J.Biol.Chem.27224780-24793(1997))，和源自癌細(xì)胞系T47D的MUC1具有4.8個(gè)O-聯(lián)聚糖/重復(fù)(Muller等人，J.Biol.Chem.27418165-18172(1999))。因此，MUC1的癌癥相關(guān)的形式與更高密度的O-聯(lián)聚糖占有相關(guān)，并且這通過與GalNAc-T4相同或相似的GalNAc-轉(zhuǎn)移酶活性來完成。另一種酶，GalNAc-T11，例如描述在T.Schwientek等人，J.Biol.Chem.2002，277(25)22623-22638中。
通過遺傳工程從經(jīng)克隆的基因產(chǎn)生蛋白質(zhì)如酶GalNAc TI-XX是公知的。參見例如，美國專利號(hào)4,761,371。一種方法涉及收集足夠的樣品，然后通過N-末端測(cè)序來測(cè)定該酶的氨基酸序列。然后將該信息用于分離編碼全長(膜結(jié)合的)轉(zhuǎn)移酶的cDNA克隆，其在昆蟲細(xì)胞系Sf9中表達(dá)后導(dǎo)致合成具有完全活性的酶。然后，通過使用下列方式來測(cè)定該酶的接納體特異性半定量分析16種不同蛋白質(zhì)中在已知的糖基化序列周圍的氨基酸，接著進(jìn)行合成的肽的體外糖基化研究。該工作已經(jīng)證明，某些氨基酸殘基在糖基化的肽區(qū)段中過度呈現(xiàn)，并且在糖基化的絲氨酸和蘇氨酸殘基周圍特定位置中的殘基可以具有相比于其他氨基酸部分而言更顯著的對(duì)于接納體效率的影響。
因?yàn)橐呀?jīng)證明GalNAc轉(zhuǎn)移酶的突變可以用于產(chǎn)生與由野生型酶所產(chǎn)生的那些不同的糖基化模式，所以在制備本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化的多肽中利用一種或多種突變型或截短的GalNAc轉(zhuǎn)移酶在本發(fā)明的范圍內(nèi)。GalNAc-T2蛋白質(zhì)的催化結(jié)構(gòu)域和截短突變體描述于例如于2004年6月3日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)60/576,530；和于2004年8月3日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)60/598584中，這兩篇文獻(xiàn)通過提及而合并入本文以用于所有目的。還可以通過與已知的糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行比對(duì)來鑒定催化結(jié)構(gòu)域。截短的GalNAc-T2酶，例如人GalNAc-T2(Δ51)、人GalNAc-T2(Δ51Δ445)，以及獲得這些酶的方法也描述于WO 06/102652(PCT/US06/011065，于2006年3月24日提交)和PCT/US05/00302(于2005年1月6日提交)中，它們通過提及而合并入本文以用于所有目的。
(c)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶 在一些實(shí)施方案中，用于本發(fā)明方法中的糖基轉(zhuǎn)移酶是巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。示例性的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶包括將L-巖藻糖從GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)移至接納體糖的羥基位置的酶。將非核苷酸糖轉(zhuǎn)移至接納體的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶也可用于本發(fā)明。
在一些實(shí)施方案中，接納體糖是例如在寡糖糖苷中Galβ(1→3，4)GlcNAcβ-基團(tuán)中的GlcNAc。對(duì)于該反應(yīng)而言合適的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶包括最初從人乳中得到表征的Galβ(1→3，4)GlcNAcβ1-α(1→3，4)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FTIII E.C.No.2.4.1.65)(參見Palcic等人，Carbohydrate Res.1901-11(1989)；Prieels等人，J.Biol.Chem.25610456-10463(1981)；和Nunez等人，Can.J.Chem.592086-2095(1981))，和在人血清中發(fā)現(xiàn)的Galβ(1→4)GlcNAcβ-α巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FTIV、FTV、FTVI)。還已經(jīng)表征了FTVII(E.C.No.2.4.1.65)——一種唾液酸基α(2→3)Galβ((1→3)GlcNAcβ巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。還已經(jīng)表征了重組形式的Galβ(1→3，4)GlcNAcβ-α(1→3，4)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(參見，Dumas等人，Bioorg.Med.Letters 1425-428(1991)；和Kukowska-Latallo等人，Genes and Development 41288-1303(1990))。其他示例性的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶包括例如α1，2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.No.2.4.1.69)?？梢酝ㄟ^在Mollicone等人，Eur.J.Biochem.191169-176(1990)或者美國專利號(hào)5,374,655中所描述的方法來進(jìn)行酶促巖藻糖基化。用于產(chǎn)生巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞也將包括用于合成GDP-巖藻糖的酶系統(tǒng)。
(d)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶 在另一組實(shí)施方案中，糖基轉(zhuǎn)移酶是半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。示例性的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶包括α(1，3)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.No.2.4.1.151，參見例如，Dabkowski等人，Transplant Proc.252921(1993)和Yamamoto等人Nature 345229-233(1990)，牛的(GenBank j04989，Joziasse等人，J.Biol.Chem.26414290-14297(1989))，鼠的(GenBank m26925；Larsen等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 868227-8231(1989))，豬的(GenBank L36152；Strahan等人，Immunogenetics 41101-105(1995))。另一種合適的α1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶是參與血型B抗原合成的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.1.37，Yamamoto等人，J.Biol.Chem.2651146-1151(1990)(人的))。也適于實(shí)施本發(fā)明的是可溶形式的α1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，例如由Cho，S.K.和Cummings，R.D.(1997)J.Biol.Chem.，272，13622-13628所報(bào)道的那種。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，半乳糖基轉(zhuǎn)移酶是β(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，例如Core-1-GalT1。已經(jīng)描述了人Core-1-β1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(參見例如，Ju等人，J.Biol.Chem.2002，277(1)178-186)。黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)酶描述于Correia等人，PNAS 2003，100(11)6404-6409；和Muller等人，F(xiàn)EBS J.2005，272(17)4295-4305中。另外的Core-1-β3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，包括其截短形式，公開在WO/0144478和于2006年9月6日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/842,926中。在示例性的實(shí)施方案中，β(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶是選自由PubMed登錄號(hào)AAF52724(CG9520-PC的轉(zhuǎn)錄物)所描述的酶和其經(jīng)修飾的形式，例如為在細(xì)菌中表達(dá)而進(jìn)行密碼子優(yōu)化的那些變化形式。示例性的可溶性Core-1-GalT1(Core-1-GalT1Δ31)酶的序列顯示在下面 Core-1-GαlT1Δ31的序列 (SEQ ID NO233) GFCLAELFVYSTPERSEFMPYDGHRHGDVNDAHHSHDMMEMSGPEQDVGGHEHVHENSTIAERLYSEVRVLCWIMTNPSNHQKKARHVKRTWGKRCNKLIFMSSAKDDELDAVALPVGEGRNNLWGKTKEAYKYIYEHHTNDADWFLKADDDTYTIVENMRYMLYPYSPETPVYFGCKFKPYVKQGYMSGGAGYVLSREAVRRFVVEALPNPKLCKSDNSGAEDVEIGKCLQNVNVLAGDSRDSNGRGRFFPFVPEHHLIPSHTDKKFWYWQYIFYKTDEGLDCCSDNAISFHYVSPNQMYVLDYLIYHLRPYGIINTPDALPNKLAVGELMPEIKEQATESTSDGVSKRSAETKTQ 也適合用于本發(fā)明方法的是β(1，4)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，其包括例如EC 2.4.1.90(LacNAc合成酶)和EC 2.4.1.22(乳糖合成酶)(牛的(D′Agostaro等人，Eur.J.Biochem.183211-217(1989))，人的(Masri等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.157657-663(1988))，鼠的(Nakazawa等人，J.Biochem.104165-168(1988))，以及E.C.2.4.1.38和神經(jīng)酰胺半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.1.45，Stahl等人，J.Neurosci.Res.38234-242(1994))。其他合適的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶包括例如，α1，2半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(來自例如，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，Chapell等人，Mol.Biol.Cell 5519-528(1994))。
(e)唾液酸轉(zhuǎn)移酶 唾液酸轉(zhuǎn)移酶是可用于本發(fā)明的重組細(xì)胞和反應(yīng)混合物的另一類型的糖基轉(zhuǎn)移酶。產(chǎn)生重組唾液酸轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞將也產(chǎn)生CMP-唾液酸，其是用于唾液酸轉(zhuǎn)移酶的唾液酸供體。適合用于本發(fā)明的唾液酸轉(zhuǎn)移酶的實(shí)例包括ST3Gal III(例如，大鼠或人ST3Gal III)、ST3GalIV、ST3Gal I、ST6Gal I、ST3Gal V、ST6Gal II、ST6GalNAc I、ST6GalNAc II和ST6GalNAc III(本文所使用的唾液酸轉(zhuǎn)移酶命名如Tsuji等人，Glycobiology 6v-xiv(1996)中所描述)。被稱作α(2，3)唾液酸轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.99.6)的示例性α(2，3)唾液酸轉(zhuǎn)移酶將唾液酸轉(zhuǎn)移至Galβ1→3Glc二糖或糖苷的非還原性末端Gal。參見，Van den Eijnden等人，J.Biol.Chem.2563159(1981)；Weinstein等人，J.Biol.Chem.25713845(1982)；和Wen等人，J.Biol.Chem.26721011(1992)。另一個(gè)示例性的α2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.99.4)將唾液酸轉(zhuǎn)移至該二糖或糖苷的非還原性末端Gal。參見，Rearick等人，J.Biol.Chem.2544444(1979)；和Gillespie等人，J.Biol.Chem.26721004(1992)。其他示例性的酶包括Gal-β-1，4-GlcNAcα-2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶(參見，Kurosawa等人Eur.J.Biochem.219375-381(1994))。
優(yōu)選地，為了糖基化糖肽的碳水化合物，唾液酸轉(zhuǎn)移酶將能夠?qū)⑼僖核徂D(zhuǎn)移至序列Galβ1，4GlcNAc-，其是在完全唾液酸化的碳水化合物結(jié)構(gòu)上最常見的處于末端唾液酸之下的倒數(shù)第二的序列(參見，下表13)。
表13使用Galβ1，4GlcNAc序列作為接納體底物的唾液酸轉(zhuǎn)移酶 1)Goochee等人，Bio/Technology91347-1355(1991) 2)Yamamoto等人，J.Biochem.120104-110(1996) 3)Gilbert等人，J.Biol.Chem.27128271-28276(1996) 可用于所要求保護(hù)的方法中的唾液酸轉(zhuǎn)移酶的一個(gè)實(shí)例是ST3Gal III，其也被稱作α(2，3)唾液酸轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.99.6)。該酶催化將唾液酸轉(zhuǎn)移至Galβ1，3GlcNAc或Galβ1，4GlcNAc糖苷的Gal(參見，例如，Wen等人，J.Biol.Chem.26721011(1992)；Van den Eijnden等人，J.Biol.Chem.2563159(1991))，并且負(fù)責(zé)糖肽中天冬酰胺-聯(lián)寡糖的唾液酸化。將唾液酸連接至Gal，在兩個(gè)糖之間形成α-連接。所述糖之間的鍵合(連接)在NeuAc的2-位和Gal的3-位之間。該特定的酶可以分離自大鼠肝臟(Weinstein等人，J.Biol.Chem.25713845(1982))；人cDNA(Sasaki等人(1993)J.Biol.Chem.26822782-22787；Kitagawa & Paulson(1994)J.Biol.Chem.2691394-1401)和基因組(Kitagawa等人(1996)J.Biol.Chem.271931-938)DNA序列是已知的，這有助于通過重組表達(dá)來產(chǎn)生該酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所要求保護(hù)的唾液酸化方法使用大鼠ST3GalIII。
用于本發(fā)明的其他示例性唾液酸轉(zhuǎn)移酶包括從空腸彎曲桿菌中分離的那些，包括α(2，3)。參見例如，WO99/49051。
表13中列出的那些其他唾液酸轉(zhuǎn)移酶也可在用于唾液酸化商業(yè)上重要的糖肽的經(jīng)濟(jì)且有效的大規(guī)模方法中使用。作為用于發(fā)現(xiàn)這些其他酶的效用的簡單測(cè)試，將各種不同量的每種酶(1-100mU/mg蛋白質(zhì))與脫唾液酸-α1AGP(1-10mg/ml)反應(yīng)，以比較相對(duì)于牛ST6GalI、ST3Gal III或這兩種唾液酸轉(zhuǎn)移酶而言目的唾液酸轉(zhuǎn)移酶唾液酸化糖肽的能力。備選地，其他糖肽或者從肽主鏈上酶促釋放出的N-聯(lián)寡糖可以代替脫唾液酸-α1AGP而用于該評(píng)估。能夠比ST6Gal I更有效地唾液酸化糖肽的N-聯(lián)寡糖的唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以在用于肽唾液酸化的實(shí)際的大規(guī)模方法中使用(如本公開中對(duì)于ST3Gal III所舉例說明的)。其他示例性的唾液酸轉(zhuǎn)移酶顯示在圖10中。
融合蛋白 在其他示例性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法利用融合蛋白，其具有超過一種的參與所希望的糖肽綴合物合成的酶促活性。所述融合多肽可以例如由與附屬酶的催化活性結(jié)構(gòu)域相連接的糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性結(jié)構(gòu)域組成。附屬酶催化結(jié)構(gòu)域可以例如催化在形成作為用于該糖基轉(zhuǎn)移酶的供體的核苷酸糖中的步驟，或者催化參與糖基轉(zhuǎn)移酶循環(huán)的反應(yīng)。例如，編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸可以按閱讀框連接至編碼參與核苷酸糖合成的酶的多核苷酸。那么，所得的融合蛋白不僅催化核苷酸糖的合成，而且將糖部分轉(zhuǎn)移至接納體分子。融合蛋白可以是連接入一個(gè)可表達(dá)的核苷酸序列中的兩個(gè)或更多個(gè)循環(huán)酶(cycleenzymes)。在其他實(shí)施方案中，融合蛋白包含兩種或更多種糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性結(jié)構(gòu)域。參見例如，5,641,668。利用各種合適的融合蛋白，可以容易地設(shè)計(jì)和制備本發(fā)明的經(jīng)修飾的糖肽(參見例如，于1999年6月24日作為WO 99/31224公布的PCT專利申請(qǐng)PCT/CA98/01180)。
固定化的酶 除了細(xì)胞結(jié)合的酶外，本發(fā)明還提供使用固定在固體和/或可溶性支持物上的酶。在示例性的實(shí)施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明方法通過完整的糖基接頭而綴合至PEG的糖基轉(zhuǎn)移酶。該P(yáng)EG-接頭-酶綴合物任選地附著至固體支持物。在本發(fā)明的方法中使用由固體支持的酶簡化了反應(yīng)混合物的制備和反應(yīng)產(chǎn)物的純化，并且還使得能夠容易地回收酶。所述糖基轉(zhuǎn)移酶綴合物用于本發(fā)明的方法中。酶和支持物的其他組合對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是明顯的。
肽綴合物的純化 通過本文上面所描述的方法產(chǎn)生的多肽綴合物可以不純化而進(jìn)行使用。然而，通常優(yōu)選回收此類產(chǎn)物。用于純化經(jīng)糖基化的糖的標(biāo)準(zhǔn)公知技術(shù)為例如薄層或厚層色譜法、柱色譜法、離子交換色譜法或者膜過濾。優(yōu)選使用膜過濾，更優(yōu)選利用反滲透膜的膜過濾，或者一種或多種柱色譜技術(shù)，如在下文中和在本文引用的文獻(xiàn)中所討論的。例如，其中膜具有約3000至約10,000的分子量截止值的膜過濾可用于除去蛋白質(zhì)例如糖基轉(zhuǎn)移酶。然后可以使用納米過濾或者反滲透來除去鹽和/或純化產(chǎn)物糖(參見，例如，WO 98/15581)。納米濾膜是一類反滲透膜，取決于所使用的膜，納米濾膜讓單價(jià)鹽通過但是截留多價(jià)鹽和大于約100至約2,000道爾頓的不帶電荷的溶質(zhì)。因此，在典型的應(yīng)用中，通過本發(fā)明的方法制備的糖將被保留在膜中，和污染性鹽將穿過膜。
如果在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生經(jīng)修飾的糖蛋白，那么作為第一步，例如通過離心或超濾除去顆粒狀碎屑，包括細(xì)胞和細(xì)胞碎片。任選地，可以用商購可得的蛋白質(zhì)濃縮濾器來濃縮蛋白質(zhì)，接著通過一個(gè)或多個(gè)色譜法步驟來分開多肽變體與其他雜質(zhì)，所述色譜法步驟例如為免疫親和色譜法、離子交換色譜法(例如，在二乙基氨基乙基(DEAE)或含有羧甲基或磺丙基的基質(zhì)上)、羥基磷灰石色譜法和疏水相互作用色譜法(HIC)。示例性的固定相包括Blue-Sepharose、CM Blue-Sepharose、MONO-Q、MONO-S、兵豆凝集素-Sepharose、WGA-Sepharose、ConA-Sepharose、Ether Toyopearl、Butyl Toyopearl、Phenyl Toyopearl、SP-Sepharose或A蛋白Sepharose。
其他色譜技術(shù)包括SDS-PAGE色譜法、二氧化硅色譜法、色譜聚焦、反相HPLC(例如，具有附加的脂肪族基團(tuán)的硅膠)、凝膠過濾(使用例如Sephadex分子篩或大小排阻色譜法)、在選擇性地結(jié)合所述多肽的柱上的色譜法、和乙醇或硫酸銨沉淀。
培養(yǎng)產(chǎn)生的經(jīng)修飾的糖肽通常通過下列方式來進(jìn)行分離最初從細(xì)胞、酶等中進(jìn)行提取，隨后進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)濃縮、鹽析、水性離子交換或者大小排阻色譜法步驟，例如SP Sepharose。另外，可以通過親和色譜法來純化經(jīng)修飾的糖蛋白。HPLC也可以用于一個(gè)或多個(gè)純化步驟。
蛋白酶抑制劑，例如甲基磺酰氟(PMSF)可以被包括在任一前述步驟中以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止外來污染物的生長。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，首先使用商購可得的蛋白質(zhì)濃縮濾器，例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元來濃縮來自產(chǎn)生本發(fā)明的經(jīng)修飾的糖肽的系統(tǒng)的上清液。在該濃縮步驟后，可以將濃縮物施加至合適的純化基質(zhì)。例如，合適的親和基質(zhì)可以包含所述肽的配體、結(jié)合至合適支持物的凝集素或抗體分子。備選地，可以使用陰離子交換樹脂，例如具有側(cè)DEAE基團(tuán)的基質(zhì)或基材。合適的基質(zhì)包括丙烯酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或者其他類型的常用于蛋白質(zhì)純化的基質(zhì)。備選地，可以使用陽離子交換步驟。合適的陽離子交換劑包括含有磺丙基或羧甲基的各種不溶性基質(zhì)。特別優(yōu)選的是磺丙基。
最后，一個(gè)或多個(gè)使用疏水性RP-HPLC介質(zhì)(例如具有側(cè)甲基或其他脂肪族基團(tuán)的硅膠)的RP-HPLC步驟，可以用于進(jìn)一步純化多肽變體組合物。前述純化步驟中的一些或所有步驟(以各種組合)也可以用于提供同質(zhì)的經(jīng)修飾的糖蛋白。
由大規(guī)模發(fā)酵產(chǎn)生的本發(fā)明的經(jīng)修飾的糖肽可以通過類似于Urdal等人，J.Chromatog.296171(1984)所公開的方法來純化。該參考文獻(xiàn)描述了用于在制備型HPLC柱上純化重組人IL-2的兩個(gè)相繼的RP-HPLC步驟。備選地，可以使用諸如親和色譜法的技術(shù)來純化經(jīng)修飾的糖蛋白。
肽編碼序列的獲得 一般的重組技術(shù) 通過突變或多肽的完全化學(xué)合成來改變對(duì)應(yīng)的親本多肽的氨基酸序列，可以產(chǎn)生出摻入了本發(fā)明的O-聯(lián)糖基化序列的突變型多肽。優(yōu)選通過DNA水平上的變化來改變肽氨基酸序列，特別是通過在預(yù)先選擇的堿基處突變編碼所述肽的DNA序列以產(chǎn)生將會(huì)翻譯成所希望的氨基酸的密碼子。優(yōu)選使用本領(lǐng)域已知的方法來進(jìn)行DNA突變。
本發(fā)明依賴于重組遺傳學(xué)領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。公開了用于本發(fā)明的一般方法的基礎(chǔ)教科書包括Sambrook和Russell，MolecularCloning，A Laboratory Manual(第3版2001)；Kriegler，Gene Transferand ExpressionA Laboratory Manual(1990)；和Ausubel等人，eds.，Current Protocols in Molecular Biology(1994)。
核酸大小以千堿基(kb)或堿基對(duì)(bp)給出。這些是來自瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠電泳、來自經(jīng)測(cè)序的核酸或來自公開的DNA序列的估計(jì)值。對(duì)于蛋白質(zhì)，大小以千道爾頓(kDa)或氨基酸殘基數(shù)給出。從凝膠電泳、從經(jīng)測(cè)序的蛋白質(zhì)、從衍生的氨基酸序列、或從公開的蛋白質(zhì)序列估計(jì)蛋白質(zhì)大小。
不能商購得到的寡核苷酸可以化學(xué)合成，例如，根據(jù)首次由Beaucage & Caruthers，Tetrahedron Lett.221859-1862(1981)描述的固相亞磷酰胺三酯方法，使用自動(dòng)合成儀，如Van Devanter等人，Nucleic Acids Res.126159-6168(1984)中所描述的。也可以化學(xué)合成完整基因。使用任何本領(lǐng)域公認(rèn)的策略來進(jìn)行寡核苷酸的純化，例如非變性丙烯酰胺凝膠電泳或陰離子交換HPLC，如Pearson & Reanier，J.Chrom.255137-149(1983)中所描述的。
經(jīng)克隆的野生型肽基因、編碼突變型肽的多核苷酸和合成的寡核苷酸的序列可以在克隆后進(jìn)行驗(yàn)證，例如使用Wallace等人，Gene 1621-26(1981)的用于對(duì)雙鏈模板進(jìn)行測(cè)序的鏈終止方法。
在示例性的實(shí)施方案中，通過改組多核苷酸來添加糖基化序列?？梢杂肈NA改組方案來調(diào)節(jié)編碼候選肽的多核苷酸。DNA改組是一種遞歸重組和突變的方法，其通過相關(guān)基因的庫的隨機(jī)片段化，接著經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)樣的過程對(duì)所述片段進(jìn)行重裝配來進(jìn)行。參見，例如，Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9110747-10751(1994)；Stemmer，Nature 370389-391(1994)；和美國專利號(hào)5,605,793、5,837,458、5,830,721和5,811,238。
野生型肽編碼序列的克隆和亞克隆 許多編碼野生型肽的多核苷酸序列已被測(cè)定并且可以從供應(yīng)商處得到，例如，人生長激素，例如GenBank登錄號(hào)NM 000515、NM002059、NM 022556、NM 022557、NM 022558、NM 022559、NM022560、NM 022561和NM 022562。
人類基因組研究的快速進(jìn)步已經(jīng)使得這一的克隆方法成為可能，其中可以在人類DNA序列數(shù)據(jù)庫中搜索與已知的核苷酸序列(例如，編碼以前鑒定的肽的核苷酸序列)具有某一序列同源性百分比的任何基因區(qū)段。隨后，可以通過化學(xué)合成和/或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)例如重疊延伸方法來獲得任何如此鑒定出的DNA序列。對(duì)于短序列，完全的從頭合成可能是足夠的；而為了獲得更大的基因，則可能必需使用合成探針從人cDNA或基因組文庫中進(jìn)一步分離全長編碼序列。
備選地，可以使用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從人cDNA或基因組DNA文庫中分離出編碼肽的核酸序列，其中基于同源性的引物可以通常源自已知的編碼肽的核酸序列。對(duì)于該目的最常使用的技術(shù)描述于標(biāo)準(zhǔn)教科書中，例如Sambrook和Russell，同上。
可以商購獲得或者可以構(gòu)建適合于獲得野生型肽的編碼序列的cDNA文庫。分離mRNA、通過逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA、將cDNA連接入重組載體中、轉(zhuǎn)染入重組宿主中以用于增殖、篩選和克隆的一般方法是公知的(參見，例如，Gubler和Hoffman，Gene，25263-269(1983)；Ausubel等人，同上)。在通過PCR獲得經(jīng)擴(kuò)增的核苷酸序列區(qū)段后，該區(qū)段可進(jìn)一步用作探針以從cDNA文庫中分離出編碼野生型肽的全長多核苷酸序列。合適程序的一般性描述可以在Sambrook和Russell(同上)中找到。
可以按照類似的程序從人基因組文庫中獲得編碼野生型肽的全長序列，例如上述GenBank登錄號(hào)中的任一個(gè)。人類基因組文庫是商購可得的，或者可以根據(jù)各種本領(lǐng)域公認(rèn)的方法來構(gòu)建。一般地，為了構(gòu)建基因組文庫，首先從可能發(fā)現(xiàn)肽的組織中提取DNA。然后，將DNA進(jìn)行機(jī)械剪切或酶促消化以產(chǎn)生長度為約12-20kb的片段。然后，通過梯度離心將所述片段與具有不希望的大小的多核苷酸片段分開，并插入噬菌體λ載體中。這些載體和噬菌體在體外進(jìn)行包裝。通過在Benton和Davis，Science，196180-182(1977)中所描述的噬菌斑雜交來分析重組噬菌體。如Grunstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，723961-3965(1975)所描述的，進(jìn)行菌落雜交。
基于序列同源性，可以設(shè)計(jì)簡并寡核苷酸作為引物組，并在合適的條件下進(jìn)行PCR(參見，例如，White等人，PCR ProtocolsCurrentMethods and Applications，1993；Griffin和Griffin，PCR Technology，CRC Press Inc.1994)，以從cDNA或基因組文庫中擴(kuò)增核苷酸序列區(qū)段。通過使用擴(kuò)增的區(qū)段作為探針，獲得編碼野生型肽的全長核酸。
在獲得編碼野生型肽的核酸序列后，可以將編碼序列亞克隆入載體，例如表達(dá)載體中，從而可以從所得的構(gòu)建體產(chǎn)生重組的野生型肽。隨后，可以對(duì)野生型肽編碼序列進(jìn)行進(jìn)一步修飾，例如核苷酸取代，以改變分子的特征。
向肽序列中引入突變 從編碼性多核苷酸序列中，可以確定出野生型肽的氨基酸序列。隨后，可以通過在氨基酸序列中的各個(gè)位置處引入額外的糖基化序列來修飾該氨基酸序列以改變?cè)摰鞍踪|(zhì)的糖基化模式。
一些類型的蛋白質(zhì)糖基化序列是本領(lǐng)域公知的。例如，在真核生物中，N-聯(lián)糖基化發(fā)生在共有序列Asn-Xaa-Ser/Thr的天冬酰胺上，其中Xaa是除了脯氨酸之外的任意氨基酸(Kornfeld等人，Ann RevBiochem 54631-664(1985)；Kukuruzinska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 842145-2149(1987)；Herscovics等人，F(xiàn)ASEB J 7540-550(1993)；和Orlean，Saccharomyces Vol.3(1996))。O-聯(lián)糖基化發(fā)生在絲氨酸或蘇氨酸殘基處(Tanner等人，Biochim.Biophys.Acta.90681-91(1987)；和Hounsell等人，Glycoconj.J.1319-26(1996))。通過將糖基磷脂酰肌醇連接至蛋白質(zhì)的羧基末端的羧基而形成其他糖基化模式(Takeda等人，Trends Biochem.Sci.20367-371(1995)；和Udenfriend等人，Ann.Rev.Biochem.64593-591(1995))?；谠撝R(shí)，因而可以向野生型肽序列中引入合適的突變以形成新的糖基化序列。
盡管直接修飾肽序列內(nèi)的氨基酸殘基可能適合于引入新的N-聯(lián)或O-聯(lián)糖基化序列，但是更經(jīng)常通過突變編碼肽的多核苷酸序列來完成新的糖基化序列的引入。這可以通過使用任何已知的誘變方法來完成，所述誘變方法中的一些在下文討論。
在本領(lǐng)域中建立和描述了各種產(chǎn)生突變的方法。參見，例如，Zhang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，944504-4509(1997)；和Stemmer，Nature，370389-391(1994)。這些程序可以分開地或相組合地使用以產(chǎn)生一組核酸的變體，并因而產(chǎn)生所編碼的多肽的變體。用于誘變、文庫構(gòu)建和其他產(chǎn)生多樣性的方法的試劑盒是可通過商業(yè)途徑獲得的。
產(chǎn)生多樣性的突變方法包括例如，位點(diǎn)定向誘變(Botstein和Shortle，Science，2291193-1201(1985))，使用含有尿嘧啶的模板的誘變(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488-492(1985))，寡核苷酸指導(dǎo)的誘變(Zoller和Smith，Nucl.Acids Res.，106487-6500(1982))，硫代磷酸酯修飾的DNA誘變(Taylor等人，Nucl.Acids Res.，138749-8764和8765-8787(1985))，和使用缺口雙鏈體DNA的誘變(Kramer等人，Nucl.Acids Res.，129441-9456(1984))。
用于產(chǎn)生突變的其他方法包括，點(diǎn)錯(cuò)配修復(fù)(Kramer等人，Cell，38879-887(1984))，使用修復(fù)缺陷的宿主株系的誘變(Carter等人，Nucl.Acids Res.，134431-4443(1985))，缺失誘變(Eghtedarzadeh和Henikoff，Nucl.Acids Res.，145115(1986))，限制-選擇和限制-純化(Wells等人，Phil.Trans.R.Soc.Lond.A，317415-423(1986))，通過全基因合成的誘變(Nambiar等人，Science，2231299-1301(1984))，雙鏈斷裂修復(fù)(Mandecki，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，837177-7181(1986))，通過多核苷酸鏈終止方法的誘變(美國專利號(hào)5,965,408)，和易錯(cuò)PCR(Leung等人，Biotechniques，111-15(1989))。
為了宿主生物中的偏愛密碼子使用而修飾核酸 可以進(jìn)一步改變編碼突變型肽的多核苷酸序列以與特定宿主的偏愛密碼子使用相符。例如，一種菌株的細(xì)菌細(xì)胞的偏愛密碼子使用可以用于得到這樣的多核苷酸，其編碼本發(fā)明的突變型肽并且包括該菌株喜歡的密碼子。通過將由宿主細(xì)胞所表達(dá)的大量基因中偏愛密碼子使用頻率進(jìn)行平均，可以計(jì)算出該宿主細(xì)胞所展示出的偏愛密碼子使用頻率(例如，計(jì)算服務(wù)可以從Kazusa DNA Research Institute，Japan的網(wǎng)站得到)。該分析優(yōu)選地限于被宿主細(xì)胞高水平表達(dá)的基因。例如，美國專利號(hào)5,824,864提供了雙子葉植物和單子葉植物所展示出的高水平表達(dá)的基因的密碼子使用頻率。
在修飾完成時(shí)，通過測(cè)序來驗(yàn)證突變型肽的編碼序列，然后亞克隆到合適的表達(dá)載體中以便用于以與野生型肽相同的方式重組產(chǎn)生。
突變型多肽的表達(dá) 在示例性的實(shí)施方案中，通過本發(fā)明的方法進(jìn)行修飾的多肽在原核細(xì)胞(例如，大腸桿菌)、真核細(xì)胞(包括酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，CHO細(xì)胞))或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中產(chǎn)生。
在序列驗(yàn)證后，取決于編碼本文所公開的多肽的多核苷酸序列，可以使用重組遺傳學(xué)領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)來產(chǎn)生本發(fā)明的突變型肽。
表達(dá)系統(tǒng) 為了獲得編碼本發(fā)明的突變型肽的核酸的高水平表達(dá)，通常將編碼突變型肽的多核苷酸亞克隆到表達(dá)載體中，該表達(dá)載體包含用于指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子和用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。合適的細(xì)菌啟動(dòng)子是本領(lǐng)域公知的，并且描述于例如Sambrook和Russell(同上)以及Ausubel等人(同上)中。用于表達(dá)野生型或突變型肽的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)例如可以在大腸桿菌、芽孢桿菌屬物種(Bacillus sp.)、沙門氏菌屬(Salmonella)、柄桿菌屬(Caulobacter)等中得到。用于此類表達(dá)系統(tǒng)的試劑盒是商購可得的。哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母和昆蟲細(xì)胞的真核生物表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域公知的，并且也是商購可得的。在一個(gè)實(shí)施方案中，真核生物表達(dá)載體是腺病毒載體、腺伴隨病毒載體或者逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
用于指導(dǎo)異源核酸表達(dá)的啟動(dòng)子取決于具體應(yīng)用。任選地，啟動(dòng)子與異源轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離和它在天然背景中與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離大致相同。然而，如本領(lǐng)域已知的，可以允許該距離有一定的改變而不喪失啟動(dòng)子功能。
除了啟動(dòng)子外，表達(dá)載體通常包含轉(zhuǎn)錄單位或表達(dá)盒，其含有對(duì)于突變型肽在宿主細(xì)胞中表達(dá)而言所需的所有另外的元件。因此，典型的表達(dá)盒包含與編碼突變型肽和對(duì)于轉(zhuǎn)錄物有效聚腺苷酸化而言所需的信號(hào)的核酸序列有效連接的啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和翻譯終止。編碼肽的核酸序列通常連接至可切割的信號(hào)肽序列以促進(jìn)經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞對(duì)于該肽的分泌。此類信號(hào)肽尤其包括來自組織纖溶酶原激活物、胰島素和神經(jīng)元生長因子以及煙芽夜蛾(Heliothis virescens)的保幼激素酯酶的信號(hào)肽。該盒的另外的元件可以包括增強(qiáng)子，和如果將基因組DNA用作結(jié)構(gòu)基因，還包括具有功能性剪接供體和接納體位點(diǎn)的內(nèi)含子。
除了啟動(dòng)子序列外，表達(dá)盒還應(yīng)當(dāng)包含結(jié)構(gòu)基因下游的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)以提供有效終止。終止區(qū)可以從與啟動(dòng)子序列相同的基因獲得，或者可以從不同的基因獲得。
用于將遺傳信息轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中的具體表達(dá)載體不是特別關(guān)鍵的?？梢允褂糜糜谠谡婧嘶蛟思?xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的任何常規(guī)載體。標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌表達(dá)載體包括質(zhì)粒例如基于pBR322的質(zhì)粒，pSKF，pET23D，和融合表達(dá)系統(tǒng)例如GST和LacZ。也可以將附加表位(epitope tag)添加至重組蛋白質(zhì)以提供方便的分離方法，例如c-myc。
包含來自真核生物病毒的調(diào)節(jié)元件的表達(dá)載體通常用于真核表達(dá)載體中，例如SV40載體、乳頭瘤病毒載體和源自EB病毒的載體。其他示例性的真核生物載體包括pMSG，pAV009/A+，pMTO10/A+，pMAMneo-5，桿狀病毒pDSVE，和任何其他這樣的載體，所述載體允許蛋白質(zhì)在SV40早期啟動(dòng)子、SV40晚期啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、鼠乳腺腫瘤病毒啟動(dòng)子、勞斯肉瘤病毒啟動(dòng)子、多角體蛋白啟動(dòng)子或顯示出對(duì)于在真核細(xì)胞中表達(dá)而言有效的其他啟動(dòng)子的指導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)。
在一些示例性的實(shí)施方案中，表達(dá)載體選自pCWin1、pCWin2、pCWin2/MBP、pCWin2-MBP-SBD(pMS39)和pCWin2-MBP-MCS-SBD(pMXS39)，在2004年4月9日提交的共有的美國專利申請(qǐng)中公開的，該專利申請(qǐng)通過提及而合并入本文。
一些表達(dá)系統(tǒng)具有提供基因擴(kuò)增的標(biāo)記物，例如胸苷激酶、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶和二氫葉酸還原酶。備選地，不涉及基因擴(kuò)增的高產(chǎn)率表達(dá)系統(tǒng)也是合適的，如昆蟲細(xì)胞中的桿狀病毒載體，其中編碼突變型肽的多核苷酸序列處于多角體蛋白啟動(dòng)子或其他強(qiáng)的桿狀病毒啟動(dòng)子的指導(dǎo)下。
通常包含在表達(dá)載體中的元件還包括在大腸桿菌中發(fā)揮功能的復(fù)制子，編碼抗生素抗性以允許選擇含有重組質(zhì)粒的細(xì)菌的基因，和允許插入真核生物序列的在質(zhì)粒的非必需區(qū)域中的獨(dú)特限制酶切位點(diǎn)。所選擇的具體抗生素抗性基因不是關(guān)鍵的，本領(lǐng)域已知的許多抗性基因中的任何一種均是合適的。如果需要，任選地如此選擇原核生物序列，即使得它們不干擾真核細(xì)胞中DNA的復(fù)制。
當(dāng)希望獲得重組蛋白質(zhì)(例如，本發(fā)明的hgh突變體)的周質(zhì)表達(dá)時(shí)，表達(dá)載體進(jìn)一步包含編碼分泌信號(hào)(例如大腸桿菌OppA(周質(zhì)寡肽結(jié)合蛋白)分泌信號(hào)或其修飾形式)的序列，該序列直接連接至待表達(dá)的蛋白質(zhì)的編碼序列的5’。該信號(hào)序列指導(dǎo)在細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)通過細(xì)胞膜進(jìn)入周質(zhì)空間。表達(dá)載體可以進(jìn)一步包含信號(hào)肽酶1的編碼序列，當(dāng)重組蛋白質(zhì)進(jìn)入周質(zhì)空間時(shí)，所述信號(hào)肽酶1能夠酶促切割信號(hào)序列。關(guān)于重組蛋白質(zhì)的周質(zhì)產(chǎn)生的更詳細(xì)的描述可以在例如Gray等人，Gene 39247-254(1985)，美國專利號(hào)6,160,089和6,436,674中找到。
如上文所討論的，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，可以對(duì)任何野生型或突變型肽或者其編碼序列進(jìn)行各種保守取代而仍然保留該肽的生物活性。此外，還可以修飾多核苷酸編碼序列以適應(yīng)特定表達(dá)宿主中的偏愛密碼子使用而不改變所得的氨基酸序列。
轉(zhuǎn)染方法 將標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染方法用于產(chǎn)生表達(dá)大量突變型肽的細(xì)菌、哺乳動(dòng)物、酵母或昆蟲細(xì)胞系，然后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來純化所述突變型肽(參見例如，Colley等人，J.Biol.Chem.26417619-17622(1989)；Guide toProtein Purification，in Methods in Enzymology，vol.182(Deutscher，ed.，1990))。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來進(jìn)行真核和原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(參見例如，Morrison，J.Bact.132349-351(1977)；Clark-Curtiss & Curtiss，Methods in Enzymology 101347-362(Wu等人，eds，1983))。
可以使用任何公知的用于將外源核苷酸序列引入宿主細(xì)胞中的程序。這些程序包括使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染、Polybrene、原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體、顯微注射、原生質(zhì)載體(plasma vector)、病毒載體和任何其他公知的用于將經(jīng)克隆的基因組DNA、cDNA、合成的DNA或其他外源遺傳物質(zhì)引入宿主細(xì)胞中的方法(參見，例如，Sambrook和Russell，同上)。唯一必需的是，所使用的具體遺傳工程程序能夠成功地將至少一個(gè)基因引入能夠表達(dá)突變型肽的宿主細(xì)胞中。
檢測(cè)突變型肽在宿主細(xì)胞中的表達(dá) 在將表達(dá)載體引入合適的宿主細(xì)胞后，在有利于突變型肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。然后，就該重組多肽的表達(dá)來篩選細(xì)胞，所述重組多肽隨后用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)物中回收(參見，例如，Scopes，Protein PurificationPrinciples and Practice(1982)；美國專利號(hào)4,673,641；Ausubel等人，同上；和Sambrook和Russell，同上)。
幾種用于篩選基因表達(dá)的一般方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。首先，可以在核酸水平上檢測(cè)基因表達(dá)。通常使用各種利用核酸雜交技術(shù)來進(jìn)行特異DNA和RNA測(cè)量的方法(例如，Sambrook和Russell，同上)。一些方法涉及電泳分離(例如，用于檢測(cè)DNA的Southern印跡和用于檢測(cè)RNA的Northern印跡)，但是也可以不用電泳來進(jìn)行DNA或RNA的檢測(cè)(例如，通過斑點(diǎn)印跡)。使用序列特異性引物，通過PCR或RT-PCR也可以檢測(cè)在經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中編碼突變型肽的核酸的存在。
其次，可以在多肽水平上檢測(cè)基因表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)地使用各種免疫學(xué)測(cè)定法來測(cè)量基因產(chǎn)物的水平，特別是使用與本發(fā)明的突變型肽特異性地反應(yīng)的多克隆或單克隆抗體(例如，Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，Chapter 14，Cold SpringHarbor，1988；Kohler和Milstein，Nature，256495-497(1975))。此類技術(shù)需要通過選擇對(duì)突變型肽和其抗原性部分具有高特異性的抗體來進(jìn)行抗體制備。產(chǎn)生多克隆和單克隆抗體的方法是成熟的，并且它們的描述可以在文獻(xiàn)中找到，參見例如，Harlow和Lane，同上；Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.，6511-519(1976)。關(guān)于制備針對(duì)本發(fā)明突變型肽的抗體和施行用于檢測(cè)突變型肽的免疫學(xué)測(cè)定法的更詳細(xì)描述在后面的部分中提供。
純化重組產(chǎn)生的突變型多肽 一旦證實(shí)了重組突變型肽在經(jīng)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中的表達(dá)，那么就以合適的規(guī)模培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以便純化所述重組多肽。
1.從細(xì)菌中純化 當(dāng)通過經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌大量重組產(chǎn)生本發(fā)明的突變型肽(通常在啟動(dòng)子誘導(dǎo)后，盡管表達(dá)可以是誘導(dǎo)型的)時(shí)，蛋白質(zhì)可以形成不溶性聚集體。存在有幾種適于純化蛋白質(zhì)內(nèi)含體的方案。例如，聚集體蛋白質(zhì)(下文中稱作內(nèi)含體)的純化通常包括通過破壞細(xì)菌細(xì)胞，例如通過在約100-150μg/ml溶菌酶和0.1％Nonidet P40(一種非離子型去污劑)的緩沖液中進(jìn)行溫育，來提取、分離和/或純化內(nèi)含體?？梢允褂肞olytron研磨器(Brinkman Instruments，Westbury，NY)來研磨細(xì)菌懸浮液。備選地，可以在冰上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行超聲處理。裂解細(xì)菌的備選方法描述在Ausubel等人以及Sambrook和Russell(都同上)中，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是明顯的。
一般地，離心細(xì)胞懸浮液，并將含有內(nèi)含體的粒狀沉淀重懸浮在緩沖液中，該緩沖液不溶解但是洗滌內(nèi)含體，例如，20mM Tris-HCl(pH 7.2)，1mM EDTA，150mM NaCl和2％Triton-X 100(一種非離子型去污劑)。必需重復(fù)洗滌步驟以除去盡可能多的細(xì)胞碎片?？梢詫⑹Ｓ嗟膬?nèi)含體的粒狀沉淀重懸浮在合適的緩沖液(例如，20mM磷酸鈉，pH 6.8，150mM NaCl)中。其他合適的緩沖液對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是明顯的。
在洗滌步驟后，通過添加既是強(qiáng)的氫接納體又是強(qiáng)的氫供體的溶劑(或者幾種溶劑的組合，每種溶劑具有這些性質(zhì)之一)來溶解內(nèi)含體。然后，可以通過用相容的緩沖液稀釋或透析來使形成內(nèi)含體的蛋白質(zhì)復(fù)性。合適的溶劑包括但不限于，尿素(約4M至約8M)、甲酰胺(至少約80％，基于體積/體積)和鹽酸胍(約4M至約8M)。一些能夠溶解形成聚集體的蛋白質(zhì)的溶劑，例如SDS(十二烷基硫酸鈉)和70％甲酸對(duì)于在該程序中的使用可能是不合適的，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)可能被不可逆地變性，伴隨著免疫原性和/或活性的缺乏。盡管鹽酸胍和類似的試劑是變性劑，但是該變性不是不可逆的，并且當(dāng)除去(例如通過透析)或稀釋所述變性劑時(shí)可以發(fā)生復(fù)性，從而允許再次形成免疫學(xué)和/或生物學(xué)上有活性的目的蛋白質(zhì)。在溶解后，可以通過標(biāo)準(zhǔn)分離技術(shù)來分開所述蛋白質(zhì)與其他細(xì)菌蛋白質(zhì)。關(guān)于從細(xì)菌內(nèi)含體中純化重組肽的進(jìn)一步描述，參見例如，Patra等人，Protein Expressionand Purification 18182-190(2000)。
備選地，可能從細(xì)菌周質(zhì)中純化重組多肽，例如突變型肽。當(dāng)重組蛋白質(zhì)被輸出到細(xì)菌的周質(zhì)中時(shí)，除了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法之外，可以通過冷滲壓震擾來分離細(xì)菌的周質(zhì)級(jí)分(參見例如，Ausubel等人，同上)。為了從周質(zhì)中分離重組蛋白質(zhì)，離心細(xì)菌細(xì)胞從而形成粒狀沉淀。將粒狀沉淀重懸浮在含有20％蔗糖的緩沖液中。為了裂解細(xì)胞，將細(xì)菌離心，并將粒狀沉淀重懸浮在冰冷的5mMMgSO4中并在冰浴中保持約10分鐘。離心細(xì)胞懸浮液，并且倒出并保存上清液。可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)分離技術(shù)來分開存在于上清液中的重組蛋白質(zhì)與宿主蛋白質(zhì)。
2.用于純化的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分離技術(shù) 當(dāng)重組多肽例如本發(fā)明的突變型肽在宿主細(xì)胞中以可溶形式表達(dá)時(shí)，其純化可以按照標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化程序，例如下文所描述的那些來進(jìn)行，或者純化可以使用別處公開的方法，例如PCT
發(fā)明者S·德弗利斯 申請(qǐng)人:諾和諾德公司